СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО ПРЕПАРАТА ИЗ БРУЦЕЛЛ В L-ФОРМЕ Российский патент 2011 года по МПК A61K39/10 G01N33/531 

Изобретение относиться к области медицины и ветеринарии, а именно к микробиологии и иммунологии, и может быть использовано в производстве медицинских и ветеринарных иммунобиологических препаратов.

Персистенция L-форм бруцелл в организме человека и животных с последующей реверсией в типичную форму может быть одной из причин непрогнозируемых эпизоотолого-эпидемиологических осложнений. При выявлении неманифестных очагов инфекции и расшифровки атипично протекающих форм заболевания у людей решающее значение имеют наиболее информативные методы лабораторной диагностики бруцеллеза. До настоящего времени не производятся тест-системы для диагностики бруцеллеза, обусловленного L-формами возбудителя. Поэтому разработка таких тест-систем с использованием специфических препаратов из L-форм бруцелл является актуальной.

Целью изобретения является разработка способа получения антигенного препарата из бруцелл в L-форме, пригодного для создания на его основе иммунобиологических препаратов для определения антител против бруцелл в L-форме в сыворотках крови людей и животных.

Поставленная цель достигается тем, что культивируют клетки штамма Brucella abortus И-206 в L-форме на плотной питательной среде для культивирования бруцелл в L-форме при 37°C в течение 3-5 суток. Микробную суспензию смывают забуференным 0,9% раствором хлорида натрия (pH 7,2±0,2) и инактивируют добавлением 2,5% (об./об.) формалина, после чего выдерживают сутки при 37°C. После контроля специфической стерильности готовят суспензию бруцелл по стандарту мутности бактериальных взвесей 10 ед. ГИСК в концентрации, составляющей 4,5·10¹⁰-5·10¹⁰ м.к. в мл. Далее суспензию подвергают термообработке на водяной бане при 100°C в течение 45-50 минут. После остывания суспензию центрифугируют при 7000 об/мин в течение 50-60 мин. Надосадочную жидкость отделяют, разливают в стеклянные ампулы по 1 мл и лиофильно высушивают.

В доступной литературе авторами не найдены способы получения антигенного препарата из бруцелл в L-форме. Предлагаемое техническое решение основано на том, что для получения препарата используется штамм бруцеллезного микроба Brucella abortus И-206 в L-форме. Данный штамм культивируют на плотной питательной среде для культивирования бруцелл в L-форме при 37°C в течение 3-5 суток. Микробную суспензию смывают с плотной питательной среды забуференным 0,9% раствором хлорида натрия (pH 7,2±0,2) и инактивируют добавлением 2,5% (об./об.) формалина, после чего выдерживают сутки при 37°C. После контроля специфической стерильности готовят суспензию бруцелл по стандарту мутности бактериальных взвесей 10 ед. ГИСК в концентрации, составляющей 4,5·10¹⁰-5·10¹⁰ м.к. в мл. Далее суспензию подвергают термообработке на водяной бане при 100°C в течение 45-50 минут. После остывания суспензию центрифугируют при 7000 об/мин в течение 50-60 мин. Надосадочную жидкость отделяют, разливают в стеклянные ампулы по 1 мл, лиофильно высушивают и запаивают.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения "новизна".

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается от технических решений в данной и смежных областях. Предлагаемые режимы позволяют достичь поставленной цели - получить высокоспецифичный и активный препарат из бруцелл в L-форме, пригодный для создания на его основе иммунобиологических препаратов для определения антител против бруцелл в L-форме в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных.

Данный способ получения препарата из бруцелл в L-форме может быть использован при производстве иммунобиологических препаратов, используемых в медицинской и ветеринарной практике.

Таким образом, предлагаемый способ получения антигенного препарата соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".

Способ осуществляется следующим образом: культивируют клетки штамма Brucella abortus И-206 в L-форме на плотной питательной среде для культивирования бруцелл в L-форме при 37°C в течение 3-5 суток. Штамм Brucella abortus И-206 в L-форме находится в коллекции музея живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора.

Питательная среда для культивирования бруцелл в L-форме содержит следующие компоненты (мас.%): агар-агар 1,2, натрия хлорид 0,1, магния сульфат 0,05, сахарозу 10, глицерин 1,0, нормальную лошадиную сыворотку 10, бициллин - 3 (5-9)·10³ ЕД/мл, печеночный настой - остальное.

Микробную суспензию смывают 0,9% раствором хлорида натрия, забуференного фосфатно-кислыми солями натрия и калия (двузамещенным фосфатно-кислым натрием и однозамещенным фосфатно-кислым калием), pH 7,2±0,2 и инактивируют добавлением 2,5% (об./об.) формалина, после чего выдерживают сутки при 37°C. После контроля специфической стерильности готовят суспензию бруцелл, используя 0,9% забуференный фосфатно-кислыми солями натрия и калия (двузамещенным фосфатно-кислым натрием и однозамещенным фосфатно-кислым калием) раствор хлорида натрия, pH 7,2±0,2, по стандарту мутности бактериальных взвесей 10 ед. ГИСК в концентрации, составляющей 4,5·10¹⁰-5·10¹⁰ м.к. в мл. Далее суспензию подвергают термообработке на водяной бане при 100°C в течение 45-50 минут. После остывания суспензию центрифугируют при 7000 об/мин в течение 50-60 мин. Надосадочную жидкость отделяют, разливают в стеклянные ампулы по 1 мл, лиофильно высушивают, после чего ампулы запаивают.

В 1 мл полученного предлагаемым способом препарата содержание белка составило 603,2-648,6 мкг, углеводов - 785-844,1 мкг, суммарных нуклеиновых кислот 9,5-10,2 мкг. ДСН-электрофорез в препарате, переосажденном этанолом, показал наличие 11 компонентов, окрашиваемых белковым красителем Кумасси ярко-синим R-250, из которых - два мажорных полипептида с мол. массами 62,8-67,5 и 69,3-74,5 кДа. Для создания суспензионной эритроцитарной тест-системы для РПГА препарат в количестве 7500 (150,8 мкг белка) и 10000 мкг (162,2 мкг белка) конъюгировали с 1 мл 5% эритроцитами барана.

Полученный препарат проверяли на специфичность и активность в реакциях кольцепреципитации (РК), иммунодиффузии в геле (РИД) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

Активность препарата в реакции кольцепреципитации с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме определяли образованием специфического кольца на границе препарата и сыворотки (положительная реакция) при разведении препарата до 1:160. Неразведенный препарат положительно реагировал со специфической антисывороткой против бруцелл в L-форме, разведенной до 1:10. В РИД в геле препарат при нагрузке на лунку 2-3 мг давал положительную реакцию с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме до разведения 1:8-1:16 соответственно. РПГА с гомологичной сывороткой была положительной до разведения 1:12800.

Специфичность препарата определяли с гипериммунными сыворотками против бруцелл и некоторых бактерий, имеющими с ними общие антигенные детерминанты и дающими перекрестные реакции: бруцеллезной против исходного штамма в S-форме, холерной диагностической «O», туляремийной диагностической. Специфическое взаимодействие препарата в РК и РИД с указанными сыворотками отсутствует, в РПГА отмечено слабое взаимодействие с поливалентной бруцеллезной сывороткой (S) до разведения 1:200, что свидетельствует о его высокой специфичности.

Полученный по предлагаемому способу препарат использовали для исследования сывороток крови больных хроническим бруцеллезом людей. В РК в 4,7% случаев получили положительные результаты, отмечены положительные реакции в РПГА до титров 1:800-1:1600, свидетельствующие о наличии в их сыворотках крови антител против бруцелл в L-форме.

Пример 1.

Клетки штамма Brucella abortus И-206 в L-форме выращивали на плотной питательной среде для культивирования бруцелл в L-форме при 37°C в течение 3 суток, при этом питательная среда содержала бициллин - 3 в количестве 5·10³ ЕД/мл. Микробную суспензию смывали забуференным 0,9% раствором хлорида натрия pH 7,0 и инактивировали добавлением 2,5% (об./об.) формалина, после чего выдерживали сутки при 37°C. После контроля специфической стерильности готовили суспензию бруцелл, используя забуференный 0,9% раствор хлорида натрия pH 7,0, по стандарту мутности бактериальных взвесей 10 ед. ГИСК в концентрации, составляющей 4,5-10¹⁰ м.к./мл. Далее бактериальную суспензию подвергали термообработке на водяной бане при 100°C в течение 45 минут. После остывания суспензию центрифугировали при 7000 об/мин в течение 50 мин. Надосадочную жидкость отделяли, разливали в стеклянные ампулы по 1 мл и лиофильно высушивали.

В 1 мл полученного препарата содержание белка составило 603,2 мкг, углеводов - 785 мкг, суммарных нуклеиновых кислот 9,5 мкг. ДСН-электрофорез в препарате, переосажденном этанолом, показал наличие 11 компонентов, окрашиваемых белковым красителем Кумасси ярко-синим R-250, из которых два мажорных полипептида с мол. массами 62,8 и 69,3 кДа. Для создания суспензионной эритроцитарной тест-системы для РПГА препарат в количестве 7500 мкг (150,8 мкг белка) конъюгировали с 1 мл 5% эритроцитами барана.

Полученный препарат проверяли на специфичность и активность в реакциях кольцепреципитации (РК), иммунодиффузии в геле (РИД) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

Положительную реакцию препарата в РК с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме регистрировали при разведении препарата до 1:160. Неразведенный препарат положительно реагировал со специфической антисывороткой против бруцелл в L-форме, разведенной до 1:10. В РИД в геле препарат при нагрузке на лунку 2 мг давал положительную реакцию с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме до разведения 1:8. РПГА с гомологичной сывороткой была положительной до разведения 1:12800.

Специфичность препарата определяли с гипериммунными сыворотками против бруцелл и некоторых бактерий, имеющими с ними общие антигенные детерминанты и дающими перекрестные реакции: бруцеллезной против исходного штамма в S-форме, холерной диагностической «О», туляремийной диагностической. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии специфического взаимодействия препарата в РК и РИД с указанными сыворотками, в РПГА отмечено слабое взаимодействие с поливалентной бруцеллезной сывороткой (S) до разведения 1:200, что свидетельствует об его высокой специфичности.

Пример 2.

Клетки штамма Brucella abortus И-206 в L-форме выращивали на плотной питательной среде для культивирования бруцелл в L-форме при 37°C в течение 5 суток, при этом питательная среда содержала бициллин - 3 в количестве 9·10³ ЕД/мл. Микробную суспензию смывали забуференным 0,9% раствором хлорида натрия pH 7,4 и инактивировали добавлением 2,5% (об./об.) формалина, после чего выдерживали сутки при 37°C. После контроля специфической стерильности готовили суспензию бруцелл, используя забуференный 0,9% раствор хлорида натрия pH 7,4, по стандарту мутности бактериальных взвесей 10 ед. ГИСК в концентрации, составляющей 5·10¹⁰ м.к./мл. Далее бактериальную суспензию подвергали термообработке на водяной бане при 100°C в течение 50 минут. После остывания суспензию центрифугировали при 7000 об/мин в течение 60 мин. Надосадочную жидкость отделяли, разливали в стеклянные ампулы по 1 мл и лиофильно высушивали.

В 1 мл полученного препарата содержание белка составило 648,6 мкг, углеводов - 844,1 мкг, суммарных нуклеиновых кислот 10,2 мкг. ДСН-электрофорез в препарате, переосажденном этанолом, показал наличие 11 компонентов, окрашиваемых белковым красителем Кумасси ярко-синим R-250, из которых два мажорных полипептида с мол. массами 67,5 и 74,5 кДа. Для создания суспензионной эритроцитарной тест-системы для РПГА препарат в количестве 10000 мкг (162,2 мкг белка) конъюгировали с 1 мл 5% эритроцитами барана.

Полученный препарат проверяли на специфичность и активность в реакциях кольцепреципитации (РК), иммунодиффузии в геле (РИД) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА)

Положительная реакция препарата в РК с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме регистрировалась при разведении препарата до 1:160. Неразведенный препарат положительно реагировал со специфической антисывороткой против бруцелл в L-форме, разведенной до 1:10. В РИД в геле препарат при нагрузке на лунку 3 мг давал положительную реакцию с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме до разведения 1:16. РПГА с гомологичной сывороткой была положительной до разведения 1:12800.

Специфичность препарата определяли с гипериммунными сыворотками против бруцелл и некоторых бактерий, имеющими с ними общие антигенные детерминанты и дающими перекрестные реакции: бруцеллезной против исходного штамма в S-форме, холерной диагностической «О», туляремийной диагностической. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии специфического взаимодействия препарата в РК и РИД с указанными сыворотками, в РПГА отмечено слабое взаимодействие с поливалентной бруцеллезной сывороткой (S) до разведения 1:200, что свидетельствует о высокой специфичности полученного препарата.

Таким образом, предлагаемый способ получения антигенного препарата технологичен при производстве, не требует использования дорогостоящих приборов и оборудования и позволяет получать препарат, который обладает высокой специфичностью, активностью, что позволяет создавать на его основе иммунобиологические препараты и тест-системы для определения антител в сыворотках крови людей и животных против бруцелл в L-форме.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к микробиологии и иммунологии. Способ включает культивирование штамма Brucella abortus И-206 в L-форме на плотной питательной среде для бруцелл в L-форме при 37°С в течение 3-5 суток. Затем смывают микробную массу забуференным 0,9% раствором хлорида натрия с pH 7,2±0,2 и инактивируют ее добавлением 2,5% формалина. Выдерживают бактериальную суспензию сутки при 37°С и контролируют специфическую стерильность. Доводят бактериальную суспензию до концентрации 4,5·10¹⁰-5·10¹⁰ м.к. в мл забуференным 0,9% раствором хлорида натрия (pH 7,2±0,2) и проводят термообработку суспензии на водяной бане при 100°С в течение 45-50 минут. Центрифугируют суспензию при 7000 об/мин в течение 50-60 мин, отделяют и лиофилизируют надосадочную жидкость. Способ позволяет получить препарат, обладающий высокой специфичностью и активностью, пригодный для создания на его основе иммунобиологических препаратов и тест-системы для определения антител против бруцелл в L-форме в сыворотках крови людей и животных. Способ технологичен, доступен, не требует использования дорогостоящих приборов и оборудования.

1. Способ получения антигенного препарата из бруцелл в L-форме, включающий культивирование штамма Brucella abortus И-206 в L-форме на плотной питательной среде для бруцелл в L-форме при 37°С в течение 3-5 суток, смывание микробной массы забуференным 0,9%-ным раствором хлорида натрия с pH 7,2±0,2, инактивацию добавлением 2,5%-ного формалина, выдерживание бактериальной суспензии сутки при 37°С, контроль специфической стерильности, доведение бактериальной суспензии до концентрации 4,5·10¹⁰-5·10¹⁰ м.к. в мл забуференным 0,9%-ным раствором хлорида натрия (pH 7,2±0,2), проведение термообработки суспензии на водяной бане при 100°С в течение 45-50 мин, центрифугирование суспензии при 7000 об/мин в течение 50-60 мин, отделение и лиофилизацию надосадочной жидкости.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после отделения надосадочную жидкость разливают по 1 мл.