Применение конъюгатов глицирризиновой кислоты с аминокислотами в качестве ингибиторов флавивирусов Денге 2 и Зика Российский патент 2024 года по МПК C07J63/00 C07K5/06 A61K31/56 A61K31/7016 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно, к средствам с противовирусной активностью, представляющим собой коньюгаты глицирризиновой кислоты (ГК) (1) с аминокислотами формулы (2-9), предназаченным для использования в качестве ингибиторов вирусов Денге 2 и 3ика.

Соединения формулы (2-9) являются коньюгатами ГК с L-изолейцином (Ile) (2) [Baltina L.A., Yan-Ting Tasib, Su-Hua Huang, Hsueh-Chou Lai, Baltina Lia A., Svetlana F. Petrova, Marat S. Yunusov, Cheng-Wen Lin. Glycyrrhizic acid derivatives as Dengue virus inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2019, 29, 126645; https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2019.126645], метиловым эфиром L-тирозина (TyrOMe) (3) [Baltina L.A., Zarubaev V.V., Baltina L.A., Orshanskaya I.A., Fairushina A.I., Kiselev O.I., Yunusov M.S. Glycyrrhizic acid derivatives as influenza A/H1N1 virus inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2015, 25, 1742-1746; http://dx.doi.ore/10.1016/j.bmcl.2015.02.074], метиловым эфиром D-валина (D-ValOMe) (4), этиловым эфиром L-фенилаланина (PheOEt) (5), этиловым эфиром L-лейцина (LeuOEt) (6), α-метиловым эфиром L-глутаминовой кислоты (GluOMe) (7), ε-N-карбобензокси-Е-лизином (LysZ) (8) [Baltina L.A., Kondratenko R.M., Baltina L.A., Plyasunova О.A., Galin F.Z., Tolstikov G.A.. Synthesis of Glycyrrhizic acid conjugates containing L.-lysine. // Chem. Nat. Compd., 2006, 42 (5), 543-548], метиловым эфиром L-лейцин-тирозина (Leu-TyrOMe) (9), которые ингибируют цитопатический эффект и инфекционность вирусов Денге 2 и Зика in vitro. Коньюгаты ГК (2-9) предлагаются для использования в качестве противовирусных агентов для лечения особо опасных флавивирусных инфекций, вызываемых патогенными вирусами Денге и Зика.

Поиск новых противовирусных препаратов является одной из наиболее актуальных проблем современной медицинской химии и вирусологии, связанной с распространенностью ряда социально опасных вирусных инфекций, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусные гепатиты В и С, и существующей глобальной угрозой распространения новых вирусных инфекций, таких как грипп A/H1N1, лихорадки Эбола, Денге, Зика, Западного Нила, Крымского Конго, и другие. Глобальной угрозой для человечества являются флавивирусы, распространяемые комарами Aedes sps., в том числе вирусы Денге и Зика, которые в последние годы вызвали эпидемии в странах Азии, Карибского бассейна, Центральной и Южной Америки, против которых нет лицензированных вакцин или специфической постинфекционной терапии [Daep С.A., Muñoz-Jordán J.L., Eugenin Е.А. Flaviviruses, an expanding threat in public health: focus on dengue, West Nile, and Japanese encephalitis virus. // J. Neurovirol., 2014, 20, 539-560; Zanluca C., Duarte dos Santos C.D. Zika virus - an overview. // Microbes and Infections, 2016, 18, 295-301]. Вирусы Денге и Зика принадлежат к семейству Flaviviridae рода Flavivirus (flaviviruses), в состав которого входит более 100 вирусов [Dengue: guedelines for diagnosis, treatment, prevention and control. Geneva: World Health Organization, 2009; Zanluca C., Duarte dos Santos C.D. Zika virus - an overview. // Microbes and Infections, 2016, 18, 295-301].

Вирус Денге является одним из наиболее географически распространенных флавивирусов, который представляет угрозу здоровью населения более чем в 100 странах мира. Число случаев инфекции Денге в мире ежегодно составляет 50-100 миллионов человек. Во всем мире 1 из 100 человек заражаются вирусом Денге каждый год [Guzman M.G., Halstead S.B., Artsob Н., Buchy P., Farrar J., Gubler D.J., Hunsperger E., Kroeger A., Margolis H.S., Martinez E., Nathan M.B., Pelegrino J.L., Simmons C., Yoksan S., Peling R.W. Dengue: a continuing global threat. // Nature Rev. Microbiology, 2010, (12), S7-S16]. В последние годы количество случаев заражения Денге в азиатских странах увеличилось более чем на 70%. Эпидемия Денге является серьезной проблемой общественного здравоохранения в Индонезии, Малайзии, Шри-Ланке, Таиланде, Камбодже, на Филиппинах, во Вьетнаме, Индии, Тайване, где инфекция Денге является одной из основных причин госпитализации и смерти детей. Общий ежегодный экономический ущерб от лихорадки Денге в Северной и Южной Америке и Азии составляет приблизительно от 587 до 1,8 млрд. долларов США (http://lifestyle.mb.com.ph/2017/03/14/war-against-dengue/; Gubler D.J. Dengue, urbanization and globalization: the unholy trinity of the 21^st century. // Trop. Med. Health, 2011, 39, 3-11]. Число вспышек инфекции Денге в последние годы на Тайване увеличилось более чем в 30 раз по сравнению с данными за последние 50 лет, что является серьезной проблемой общественного здравоохранения этой страны. В последние годы количество импортированных случаев лихорадки Денге в России также резко возросло в результате выезда людей в Юго-Восточную Азию [Pukhovskaya NM, Morozova OV, Bakhmetyeva SV, Zdanovskaya NI, Belozerova NB, Pochinkova NA, Ivanov LI. Molecular Typing of Imported Dengue Virus (DENV) Isolates from Patients in the Far East of Russia // J. Virol. Emerg. Dis., 2015, 1 (1): doi: http://dx.doi.org/10.16966/jved.101]. В связи с расширением географического распространения вируса Денге Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила его главной вирусной угрозой для человечества [Dengue: guedelines for diagnosis, treatment, prevention and control. Geneva: World Health Organization, 2009].

По своей антигенной структуре вирус Денге близок к вирусу желтой лихорадки и разделен на четыре серотипа (Денге 1, Денге 2, Денге 3, Денге 4), которые вызывают лихорадку Денге, геморрагическую лихорадку Денге и синдром шока Денге, приводящие к параличам и смерти. Заражение одним серотипом вируса обеспечивает долговременную устойчивость к этому серотипу, но не приводит к развитию иммунитета от других серотипов [Simmons С.P., Farrar J.J., Chau N., Wills В. Dengue. // The New Engl. J. Med., 2012, 366, 1423-1432]. Проникновение вирусных частиц в клетку-хозяина представляет собой первую стадию инфекции, доступную для химиотерапевтических агентов. В настоящее время нет лицензированных вакцин и специальной химиотерапии для этой инфекции, хотя ведущие фармацевтические компании активно работают над тетравакцинами для защиты от лихорадки Денге, но они еще далеки от завершения. [Halstead S.B. Dengue vaccine development: a 75% solution? // Lancet, 2012, 380, 1535-1536].

В феврале 2016 года ВОЗ объявила о новой вирусной угрозе для человечества, вызванной вирусом Зика, распространяемым комарами Aedes sps., родственной с флавивирусами желтой лихорадки, Денге и Западного Нила [http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2016/1st-emergency-committee-zika; Weaver S.C., Costa F., Garcia-Blanco M.A., Ko A.I., Ribeiro G.S., Saade G., Shi P.-Y., Vasilakis N. Zika virus: History, emergence, biology, and prospects for control. // Antiviral Res., 2016, 130, 69-80]. В первые 60 лет после открытия (1947 г.), вирус Зика был географически локализован, и случаи заражения людей происходили спорадически только в Африке и Азии [Musso D., Nilles E.J., Cao-Lormeau V.-M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. // Clin. Microbiology and Infection, 2014, 20, O595-O596]. В 2007 году была зафиксирована первая крупная вспышка инфекции Зика в Микронезии, которая охватила более 70% населения [Chan J.F.W., Choi G.K.Y., Yip C.C.Y., Cheng V.C.C., Yen K.-W. Zika fever and congenital Zika syndrome: An unexpected emerging arboviral disease. // J. Infection, 2016, 72, 507-524]. Впоследствии инфекция Зика была зарегистрирована в Камбодже, на Филиппинах и в Таиланде в 2010-2014 гг. [Zanluca С., Duarte dos Santos C.D. Zika virus - an overview. // Microbes and Infections, 2016, 18, 295-301]. В конце 2015 года в Бразилии произошла крупная эпидемия Зика с 400000 случаев инфекции. Из Бразилии вирус Зика распространился в другие страны американского континента [Bogoch I., Brady О.J., Kraemer M.U.G., German M., Creatore M.I., Kulkarni M.A., Brownstein J.S., Mekaru S.R., Hay S.I., Groot E., Watts A., Khan K. Anticipating the international spread of Zika virus from Brazil. // www.thelancet.com., 2016, 387, 335-336; Petersen E., Wilson M.E., Touch S., McCloskey В., Mwaba P., Bates M., Dar O., Mattes F., Kidd M., Ippolito G., Azhar E.I., Zumla A. Rapid Spread of Zika virus in the Americas - Implications for Public Health Preparedness for Mass Gatherings at the 2016 Brazil Olympic Games. // Int. J. Infection Dis., 2016, 44, 11-15]. В 2015-2016 годах случаи инфекции Зика были зарегистрированы в 69 странах и территориях [http://ecdc.europa.eu/en/press/news/]. Инфекция Зика сопровождается серьезными неврологическими осложнениями, такими как синдром Гийена-Барра [Bogoch I., Brady O.J., Kraemer М.U.G., German М., Creatore M.I., Kulkarni M.A., Brownstein J.S., Mekaru S.R., Hay S.I., Groot E., Watts A., Khan K. Anticipating the international spread of Zika virus from Brazil. // www.thelancet.com., 2016, 387, 335-336] и особенно опасна для беременных женщин, так как может привести к врожденным порокам развития плода и микроцефалии [Mlakar J., Korva М., Tul N., Popović M., Poljšak-Prijatelj M., Mraz J., Kolenc M.. Resman Rus K., Vesnaver Vipotnik Т., Fabian Vodušek V., Vizjak A., Pižem J., Petrovec M., Avšič Županc T. Zika Virus Associated with Microcephaly. // N. Engl. J. Med., 2016 Feb 10. [Epub ahead of print]. В настоящее время установлено, что вирус Зика может передаваться перинатально во время родов, через грудное молоко, вирус обнаруживается в сперме и может передаваться половым путем. Распространение вируса Зика возможно через банки крови, поскольку большинство инфицированных (80%) вирусом Зика являются бессимптомными носителями вируса и могут быть донорами крови [Weaver S.C., Costa F., Garcia-Blanco M.A., Ko A.I., Ribeiro G.S., Saade G., Shi P.-Y., Vasilakis N. Zika virus: History, emergence, biology, and prospects for control. // Antiviral Res., 2016, 130, 69-80]. Лицензированных вакцин или специфических противовирусных средств терапии инфекции Зика в настоящее время не существует. На сегодняшний день в США продолжаются клинические испытания вакцины против Зика, разработанной в Национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID NIH) [http://www.nih.gov/news-events/news-releases/phase-2-zika-vaccine-trial-begins-us-central-south-america]. Таким образом, вирусы Денге и Зика имеют много общих характеристик, и оба вируса распространяются комарами Aedes sps. В настоящее время не существует противовирусных препаратов для специфической терапии вирусных инфекций Денге и Зика, и лечение является только поддерживающим. Поэтому актуальность поиска и разработки таких средств очевидна, и все исследования, направленные на разработку противовирусных препаратов этого типа, являются приоритетными в здравоохранении большинства стран и рекомендованы ВОЗ.

Одним из приоритетных направлений в разработке противовирусных препаратов является использование в качестве платформ природных соединений с установленной противовирусной активностью и новым механизмом противовирусного действия. Несмотря на конкуренцию с другими лекарственными средствами, природные соединения и их модификанты продолжают уверенно обеспечивать появление новых перспективных клинических кандидатов для лечения вирусных, бактериальных и грибковых инфекций [Martinez J.P., Sasse F., Bronstrup M., Diez J., Meyerhans A. Antiviral drug discovery: broad-spectrum drugs from nature. // Nat. Prod. Rep., 2015, 32, 29-48]. Оптимизация структуры и химическая модификация лидирующих природных соединений с уже известной противовирусной активностью может привести к появлению новых соединений-лидеров и кандидатов для доклинических и клинических исследований [M.S. Butler, А.А.В. Robertson, M.A. Cooper. Natural product and natural product derived drugs in clinical trials. // Nat. Prod. Rep., 2014, 31(11), 1612-1661].

Глицирризиновая кислота (ГК) (1), выделенная из корней солодки голой и уральской (Glycyrrhiza glabra L., Gl. uralensis Fisher), является одним из лидирующих природных тритерпеновых гликозидов, перспективных в качестве основы для создания новых противовирусных препаратов [Pompei R., Laconi S., Ingianni A. Antiviral properties of Glycyrrhizic acid and its semisynthetic derivatives // Mini-Rev Med. Chem., 2009, 9, 996-1001]. ГК ингибирует ряд ДНК- и РНК-вирусов (Vaccinia, New Castle, Varicella zoster, Herpes simplex type 1, Herpes В), вирусы гриппа, цитомегаловирусы, вирусы гепатита В и С. Обнаружено ингибирующее действие ГК на новые SARS-коронавирусы и вирус Эпштейна-Барра [Lin J.С., Cherng J.M., Hung M.S., Baltina L.A., Baltina L.A., Kondratenko R.M. Inhibitory effects of some derivatives of Glycyrrhizic acid against Epstein-Barr virus infection: Structure-activity relationships. // Antiviral Res., 2008, 79, 6-11; Hoever H., Baltina L.A., Nichaelis M., Kondratenko R.M., Baltina L.A., Tolstikov G.A., Doerr H.W., Cinatl J. Antiviral activity of Glycyrrhizic acid derivatives against SARS-Coronavirus. // J. Med. Chem., 2005, 48, 1256-1259]. ГК используется в клинике для лечения хронических вирусных гепатитов В и С в Японии и Китае (препараты SNMC, Glycyrrhizin Ingecpion Injection, Glycyrrhizin Ingecpion Tablets) [Sato H., Goto W., Yamamura J., Kurokava M., Kageyama S., Takahara Т., Watanabe A., Shiraki K. Therapeutic basis of glycyrrhizin in chronic hepatitis B. // Antiviral Res., 1996, 30, 171-177; Matsumoto Y., Matsuura Т., Aoyagi H., Matsuda M., Hmwe S.s., Date T., Watanabe N., Watashi K., Suzuki R., Ichinose S., Wake K., Suzuki T., Miyamura Т., Wakita Т., Aizaki H. Antiviral activity of Glycyrrhizin against hepatitis С virus in vitro. // PLOS ONE, 2013, 8, 1-10]. ГК ингибирует вирус иммунодефицита человека ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 и подходит для длительной терапии (более 20 лет) ВИЧ-инфицированных пациентов, в том числе в сочетании с другими анти-ВИЧ препаратами [Ito М., Sato А., Hirabayashi K., Tanabe F., Shigeta Sh., Baba М., De Clerq E., Nakashima H., Yamamoto N. Mechanism of inhibitory effect of glycyrrhizin on replication of human immunodeficiency virus (HIV). //Antiviral Res., 1988, 10, 289-298; De Clerq E. Current lead natural products for the chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) infection. // Med. Res. Rev., 2000, 20, 323-349]. Химическая модификация ГК является перспективным путем получения новых противовирусных агентов [Baltina L.A., Kondratenko R.M., Baltina L.A. (jr.), Plyasunova O.A., Pokrovskyi A.G., Tolstikov G.A. Prospects for the creation of new antiviral drugs based on Glycyrrhizic acid and its derivatives. Pharm. Chem. J., 2009, 43, 539-548]. ГК и его производные составляют первую группу веществ, которые ингибируют вирус Марбург, вызывающий острую геморрагическую лихорадку с высокой смертностью [Покровский А.Г., Беланов Е.Ф., Волков Г.Н., Плясунова О.А., Толстиков Г.А. Ингибирование размножения вируса Марбург глицирризиновой кислотой и ее производными. // Доклады РАН, 1995, 344, 709-711]. ГК ингибирует высокопатогенный вирус гриппа H5N1 [Michaelis М., Geiler J., Naczk P., Sithisarn P., Ogbomo H., Altenbrandt В., Leutz A., Doerr HW., Cinatl J Jr. Glycyrrhizin inhibits highly pathogenic H5N1 influenza A virus-induced pro-inflammatory cytokine and chemokine expression in human macrophages // Med. Microbiol. Immunol, 2010, 199 (4), 291-297]. Обнаружено ингибирующее действие производных ГК in vitro на вирус гриппа A/H1N1 [Baltina L.A., Zarubaev V.V., Baltina L.A., Orshanskaya I.A., Fairushina A.I., Kiselev O.I., Yunusov M.S. Glycyrrhizic acid derivatives as influenza A/H1N1 virus inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2015, 25, 1742-1746]. ГК также представляет интерес в качестве основы для получения потенциальных ингибиторов патогенных флавивирусов, поскольку сообщалось о способности ГК ингибировать вирусы Денге и желтой лихорадки в высоких нетоксичных концентрациях [Crance, J.М.; Scaramozzino, N.; Jouan, A.; Garin, D. Interferon, Ribavirin, 6-Azauridine and Glycyrrhizin; Antiviral Compounds Active against Pathogenic Flaviviruses. // Antiviral Res. 2003, 58, 73-77]. Противовирусная активность ГК и его производных связана со способностью потенцировать продукцию гамма-интерферона in vitro и in vivo [Baltina L.A., Kondratenko R.M., Baltina L.A. (jr.), Plyasunova O.A., Pokrovskyi A.G., Tolstikov G.A. Prospects for the creation of new antiviral drugs based on Glycyrrhizic acid and its derivatives. // Pharm. Chem. J., 2009, 43, 539-548].

Уникальным свойством ГК является ее способность ингибировать вирусы на начальных этапах цикла репликации; следовательно, ГК не влияет на процессы реализации генетической информации вирусов и не вызывает развития резистентности. ГК пригодна для профилактики практически любых инфекций, имеет низкую токсичность для млекопитающих (острая токсичность LD50 5000 мг/кг), обладает высокой биодоступностью и метаболизируется в желудочно-кишечном тракте и печени, как кортикостероидные гормоны [Толстиков Г.А., Болтина Л.А., Гранкина В.П., Кондратенко P.M., Толстикова Т.Г. Солодка: биоразнообразие, химия, медицинские применения. Новосибирск: Академическое издательство "Гео", 2007. 311 с.]. Кроме того, известно, что ГК уменьшает мембранный транспорт и сиалилирование поверхностного антигена вируса гепатита В, а также ингибирует ферменты фосфорилирования вируса везикулярного стоматита [Fiore С, Eisenhut М, Krausse R, Ragazzi Е, Pellati D, Armanini D, Bielenberg J. Antiviral effects of Glycyrrhiza species. // Phytother. Res., 2008, 22 (2), 141-148].

Задача, на решение которой направлено заявленное техническое решение заключается в расширении арсенала лекарственных средств на основе производных ГК для лечения особо опасных флавивирусных инфекций, таких как лихорадки Денге 2 и Зика. Поставленная задача решается средствами, представляющими собой коньюгаты ГК формулы (2-9), проявляющими противовирусную активность в отношении вирусов Денге 2 и Зика. В качестве препарата сравнения в заявленном техническом решении использовалась ГК (1) высокой степени чистоты (96%), которая была получена по методике [Kondratenko R.M., Baltina L.A., Mustafina S.R., Makarova N.V. Nasyrov Kh.M.; Tolstikov G.A. Crystalline Glycyrrhizic acid synthesized from commercial glycyrrham. Immunomodulant properties of high-purity Glycyrrhizic acid. // Pharm. Chem. J., 2001, 35, 101-104]. Синтез конъюгата ГК (2), содержащего три остатка L-изолейцина (Ile), провели с использованием N-гидроксибензотриазола и N,N'-дициклогексилкарбодиимида согласно способу [Baltina, L.A., Ryzhova, S.A., Vasil'eva E.V., Tolstikov G.A. Transformations of Glycyrrhizic acid. VIII. Synthesis of immunomodulating glycopeptides using tert-butyl esters of amino acids.// Russ. J. Bioorg. Chem., 1994, 20, 778-785]. Синтез коньюгатов (3-8) осуществляли конденсацией ГК с гидрохлоридами метиловых эфиров L-тирозина и D-валина, этиловых эфиров L-фенилаланина и L-лейцина, α-метилового, γ-трет-бутилового эфира L- глутаминовой кислоты и трет-бутилового эфира ε-N-карбобензокси (Z)-L-лизина с использованием N-гидроксисукцинимида и N,N'-дициклогексилкарбодиимида в тетрагидрофуране или диоксане в присутствии третичного основания (триэтиламин, N-этилморфолин) по методике [Baltina L.A. (jr.), Kondratenko R.M., Baltina L.A., Baschenko N.Z., Plyasunova O.A. Synthesis and biological activity of new Glycyrrhizic acid conjugates with amino acids and dipeptides. // Russian J. Bioorg. Chem., 2009, 35(4), 510-517]. Синтез дипептидного конъюгата ГК (9) провели в несколько этапов. Сначала получали защищенный дипептид BocLeu-TyrOMe, который деблокировали трифторуксусной кислотой (CF₃COOH) и образующийся CF₃COOH•Leu-TyrOMe конденсировали с ГК с помощью реагента Вудворда K. Конъюгаты ГК (5), (6) и (9) были синтезированы впервые, их структуры подтверждены спектрами ЯМР ¹³С и элементным анализом. Все синтезированные производные ГК имели чистоту 95% и выше согласно ВЭЖХ анализу.

Впервые изучены противовирусные свойства конъюгатов ГК (2-9) по отношению к вирусам Денге 2 и Зика в Китайском медицинском университете (г. Тайчунг, Тайвань) под руководством проф. Чэнь-Вэнь Лин (Cheng-Wen Lin). В качестве препарата сравнения использовали ГК (1) (96%).

Противовирусная активность коньюгатов глицирризиновой кислоты (2-9) в отношении вируса Денге 2

Цитотоксичность и противовирусную активность коньюгатов ГК (2-9) исследовали в культуре клеток Vero Е6 в поддерживающей модифицированной среде Дульбеко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM). Оценка цитотоксичности соединений проводилась в культуре клеток Vero Е6 в тесте МТТ с использованием тетратиазолилового красителя - желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) после 96 ч инкубации с исследуемыми соединениями в 96-луночных планшетах согласно [Lien J.C., Wang C.Y., Lai H.С., Lu C.Y., Lin Y.F., Gao G.Y., Chen K.С., Huang A.C., Huang S.H., Lin C.W. Structure analysis and antiviral activity of CW-33 analogues against Japanese encephalitis virus. // Sci. Rep., 2018, Nov 9; 8(1), 16595]. Цитотоксическая концентрация или концентрация, вызывающая 50% гибели клеток (СС50), вычислялась с помощью компьютерной программы Джон Spouge, (NCBI, NIH). Установлено, что исследованные коньюгаты ГК (2-9) не оказывают токсического действия на клетки Vero Е6, так как СС50 исследованных соединений составила 50 мкМ и выше.

Для качественной характеристики противовирусной активности проведено скрининговое исследование коньюгатов ГК (2-9) по ингибированию цитопатического эффекта (СРЕ), индуцированного вирусом Денге 2, в культуре клеток Vero Е6. Клетки инфицировали вирусом Денге 2 (множественность инфекции - MOI 0.01) и одновременно добавляли исследуемые вещества в различных концентрациях (0.1, 1.0, 10, 20, 50 мкМ). После инкубации (96 ч) инфицированные клетки фотографировали под микроскопом, используя контрастную микроскопию с обращенной фазой. Микроскопические фотографии показали, что препарат сравнения - ГК (1) и ее коньюгаты (2-6) и (8,9) оказывают выраженное ингибирующее действие, снижая СРЕ вируса Денге 2 в инфицированных клетках в зависимости от концентрации. Соединение (7) имело слабовыраженную активность по ингибированию СРЕ вируса Денге 2. Данные по активности представлены в таблице и на фиг. 1-7, активные соединения обозначены знаками «+++» и «++».

Для количественной характеристики противовирусного действия и определения значений 50% ингибирующих концентраций (IC50) был проведен количественный анализ ингибирующего действия препарата сравнения ГК (1) и ее коньюгатов (2-9) в тесте инфекционности вируса Денге 2 in vitro иммунофлуоресцентным методом с использованием анти-Денге антител NS4B (NS4B - неструктурный белок вируса 4 В). Инфекционность вируса определялась как соотношение NS4B позитивных клеток к общему количеству клеток, окрашенных 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в каждой лунке инфицированных клеток после 96 ч инкубации. Установлено, что ГК и ее коньюгаты (2-6) и (8, 9), показавшие высокую ингибирующую в тесте СРЕ, также существенно снижали процент NS4B-положительных клеток в зависимости от концентрации, что указывает на способность этих соединений ингибировать инфекционность вируса Денге 2 в клетках Vero Е6. Ингибирующая эффективность в тесте инфекционности вируса Денге 2 в концентрации 10 мкМ составила для коньюгатов ГК с Ile (2) - 95%, с TyrOMe (3) - 85%, PheOEt (5) - 88%, LeuOEt (6) - 98%, LysZ (8) - 75.8%, Leu-TyrOMe (9) - 94% и была выше таковой, чем у препарата сравнения ГК (1) (70.5%) (таблица).

Значения 50% ингибирующей концентрации (IC50) в тесте инфекционности вируса Денге 2 составили 1.73 мкМ для коньюгата ГК с Ile (2), 1.63 мкМ для коньюгата ГК с TyrOMe (3), 0.49 мкМ для коньюгата ГК с D-ValOMe (4), 0.17 мкМ для коньюгата ГК с PheOEt (5), 0.27 мкМ для коньюгата ГК с LeuOEt (6), 2.75 мкМ для коньюгата ГК с LysZ (8) и 0.34 мкМ для коньюгата ГК с LeuTyrOMe (9), соответственно (таблица). Таким образом, коньюгаты ГК (2-6, 8,9) являются высокоэффективными ингибиторами инфекционности вируса Денге 2, превосходящими по активности препарат сравнения ГК (1) (IC50 8.1 мкМ). Соединениями-лидерами, с наиболее высокой эффективностью ингибирующими вирус Денге 2 (IC50<1 мкМ), являются коньюгаты ГК с D-ValOMe (4), PheOEt (5), LeuOEt (6) и Leu-TyrOMr (9), IC50 которых в 12.2-47.6 раз ниже, чем у природного гликозида.

Противовирусные свойства активных в отношении вируса Денге 2 коньюгатов ГК (3-5) были также исследованы в культуре эпителиальных клеток легкого человека А549 (фиг. 8). Установлено, что коньюгаты ГК (3-5) ингибируют цитопатический эффект вируса Денге 2, в зависимости от концентрации и снижают инфекционность вируса (процент NS4B-позитивных клеток) в клетках А549. Значения IC50 в данной культуре клеток составили для коньюгата ГК с TyrOMe (3) 0.01 мкМ, для коньюгата ГК с D-ValOMe (4) 0.12 мкМ и для коньюгата ГК с PheOEt (5) 1.57 мкМ, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о том, что коньюгаты ГК (3-5) проявляют высокую противовирусную активность в отношении Денге 2 независимо от типа клеток. Коньюгат ГК с TyrOMe (3) является наиболее высокоактивным соединением (IC50 0.01 мкМ).

С целью выяснения ингибирующего влияния исследуемых коньюгатов (2-9) на репродукцию вируса Денге 2 in vitro был проведен анализ выхода вируса Денге 2 в культивируемых средах инфицированных клеток с определением TCID50 (средняя инфекционная доза для культуры) (фиг. 9). Коньюгаты ГК с TyrOMe (3) и PheOEt (5) показали высокую ингибирующую активность, снижая выход вируса более чем на 90% при концентрации 0.1 мкМ и на 99% при концентрации 10 мкМ по сравнению с инфицированными клетками без препаратов. Коньюгат ГК (4) также значительно снижал выход вируса (более чем на 85% при концентрации 0.1 мкМ).

Для исследования ингибирующего действия коньюгатов ГК на репликационный цикл вируса Денге 2 дополнительно был проведен анализ противовирусного действия коньюгатов ГК (3-5) в зависимости от времени добавления/удаления препаратов в двух режимах (фиг. 10). Анализ зависимости от времени добавления/удаления препаратов проводили в культуре клеток Vero Е6 в 6-луночных планшетах при одновременном добавлении вируса и испытуемого препарата (entry) или при добавлении препаратов через 1 ч после инфицирования (post-entry) клеток вирусом Денге 2 при 37°С. Анализ на инфекционность проводили иммунофлуоресцентным методом, характеризующим ингибирующий эффект препарата на стадии проникновения вируса в клетку и после проникновения вируса в клетку, соответственно. Установлено, что при репликации вируса Денге 2 коньюгаты ГК с TyrOMe (3), D-ValOMe (4) и PheOEt (5) оказывали более выраженное ингибирующее действие на репликацию вируса на стадии постпроникновения, нежели на стадии проникновения вируса.

Вирусингибирующее действие коньюгатов ГК на репликацию вируса Денге 2 было также впервые исследовано на стабильной клеточной линии ВНК-21, содержащей самореплицирующийся репликон вируса Денге 2, слитый с геном люциферазы светлячка, под контролем промотора цитомегаловируса (CMV). В результате исследований показано, что коньюгаты ГК с TyrOMe (3) и D-ValOMe (4) оказывают значительное ингибирующее действие на активность люциферазы светлячка, управляемого репликоном вируса Денге 2 (фиг. 11), что является подтверждением ингибирующего действия данных соединений на репликацию вируса на стадии пост-проникновения.

Противовирусная активность коньюгатов глицирризиновой кислоты (2-9) в отношении вируса Зика

Цитотоксичность и противовирусную активность коньюгатов ГК (2-9) в отношении вируса Зика исследовали в культуре клеток SF268. Оценка цитотоксичности проводилась с помощью МТТ теста после 96 ч инкубации с исследуемыми соединениями в культуре клеток SF268 в 96-луночных планшетах. Анализ цитотоксичности показал, что все исследованные соединения не оказывают токсического действия на клетки SF268 (СС50≥50 мкМ).

Для качественной характеристики противовирусной активности проведено скрининговое исследование коньюгатов ГК (2-9) по ингибированию цитопатического эффекта (СРЕ), индуцированного вирусом Зика, в культуре клеток SF268. Для этого клетки инфицировали вирусом Зика (множественность заражения MOI 0.05) и одновременно добавляли различные концентрации исследуемых соединений (0.1, 1.0 и 10 мкМ). После 96-ч инкубации инфицированные клетки фотографировали под микроскопом, используя контрастную микроскопию с обращенной фазой. Микроскопические фотографии зараженных клеток показали, что коньюгаты ГК с Ile (2), TyrOMe (3), PheOEt (5), LeuOEt (6) и GluOMe (7) и LysZ (8) в концентрации 10 мкМ значительно снижают СРЕ вируса (+++) (таблица, фиг. 12-16). Коньюгаты (4) и (9) были менее активны.

Для количественной характеристики противовирусного действия и определения значений 50% ингибирующих концентрацию (IC50) был проведен количественный анализ ингибирующего действия ГК и ее коньюгатов (2-9) в тесте инфекционности вируса Зика в культуре клеток SF268 иммунофлуоресцентным методом с использованием анти-Зика антител NS1 (NS1 - неструктурный белок вируса 1). После 96-ч инкубации процент остаточной инфекционности вируса Зика в клетках, обработанных исследованными препаратами, рассчитывали как отношение NS1-позитивных клеток к общему количеству клеток, окрашенных DAPI, в каждой лунке инфицированных клеток. Установлено, что коньюгаты ГК (2,3) и (5-8) оказывали выраженное ингибирующее действие на инфекционность вируса Зика, существенно снижая процент NS1-положительных клеток в зависимости от концентрации (фиг. 12-16). Определены количественные характеристики - значения 50% ингибирующих концентраций IC50 в тесте инфекционности вируса Зика, которые составили 0.56 мкМ для коньюгата ГК с Ile (2), 0.05 мкМ для коньюгата ГК с TyrOMe (3), 1.66 мкМ для коньюгата ГК с PheEt (5), 1.65 мкМ для коньюгата ГК с LeuOEt (6), 1.17 мкМ для коньюгата ГК с GluOMe (7), соответственно (таблица). Наиболее высокую активность в данном тесте обнаружил коньюгат ГК с TyrOMe (3), IC50 которого в 15 раз меньше, чем у препарата сравнения ГК (1) (IC50 0.77 мкМ). Полученные результаты говорят о том, что исследованные коньюгаты ГК проявляют высокую противовирусную активность в отношении вируса Зика (IC50<2 мкМ) и перспективны для дальнейших исследований. Активными противовирусными агентами считаются соединения с IC50<10 мкМ согласно критериям отбора Национального института аллергических и инфекционных заболеваний США (National Institute of Allergy and Infectious Diseases) (http://niaid.nih.gov.).

Таким образом, предложенные средства - коньюгаты ГК (2-9) представляют собой малотоксичные высокоэффективные противовирусные агенты (фармацевтические субстанции), перспективные для доклинических исследований и применения в качестве противовирусных препаратов для лечения вирусных инфекций, вызванных вирусами Денге и Зика. Коньюгаты (2-6) и (8, 9) проявляют высокую ингибирующую активность в отношении вируса Денге 2. Коньюгаты (2, 3) и (5-7) обладают высокой ингибирующей активностью в отношении вируса Зика.

Сущность технического решения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Синтез коньюгатов глицирризиновой кислоты (2-9)

Реагенты и препараты. В качестве реагентов использовались N-гидроксибензотриазол, N-гидроксисукцинимид, N,N'-дициклогексилкарбодиимид, реагент Вудворда K, гидрохлориды метиловых, этиловых эфиров и трет-бутиловых эфиров L- и D-аминокислот (Aldrich-Sigma). ГК высокой степени чистоты (96.0±0.5%), которую использовали в качестве препарата сравнения, получали по методике [Kondratenko R.M., Baltina L.A., Mustafina S.R., Makarova N.V., Nasyrov Kh.M., Tolstikov G.A. Crystalline Glycyrrhizic acid synthesized from commercial glycyrrham. Immunomodulant properties of high-purity Glycyrrhizic acid. // Pharm. Chem. J., 2001, 35, 101-104]. Синтез коньюгата ГК (2) проводили с использованием N-гидроксибензотриазола и N,N'-дициклогексилкарбодиимида согласно [Baltina, L.A., Ryzhova, S.A., Vasil'eva E.V., Tolstikov G.A. Transformations of Glycyrrhizic acid. VIII. Synthesis of immunomodulating glycopeptides using tert-butyl esters of amino acids. // Russ. J. Bioorg. Chem., 1994, 20, 778-785]. Синтез соединений (3, 4) проводили по ранее описанным методам [Baltina L.A., Zarubaev V.V., Baltina L.A., Orshanskaya J.A., Fairushina A.I., Kiselev O.I., Yunusov M.S. Glycyrrhizic acid as influenza A/H1N1 virus inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2015, 25, 1742-1746; Fairushina А.I., Baltina L.A., jr., Baltina L.A., Konovalova N.I., Petrova P.A., Eropkin M.Yu. Synthesis and antiviral activity of novel Glycyrrhizic acid conjugates with D-amino acids esters. //Russian J. Bioorg. Chem., 2017, 43, 456-462]. Коньюгат (7) был получен согласно [Kondratenko R.M., Baltina L.A., jr., Baltina L.A., Baschenko N.Zh., Tolstikov G.A. Synthesis and immunomodulating activity of new glycopeptides of Glycyrrhizic acid containing residues of L-glutamic acid. // Russian J. Bioorg. Chem., 2006, 32, 660-666], коньюгат (8) согласно [Baltina L.A., jr., Kondratenko R.M., Baltina L.A., Plyasunova O.A., Galin F.Z., Tolstikov G.A. Synthesis of Glycyrrhizic acid conjugates containing L-lysine. // Chem, Nat. Compd., 2006, 42, 543-548].

3-O-{2-O-[N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-изолейцин]-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-изолейцин}-(3β,20β)-11-оксо-30-(N-карбонил-L-изолейцин}-(3β,20β)-норолейн-12-ен (2). К раствору ГК (0.82 г, 1.0 ммоль) в диоксане (20 мл) прибавляли N-гидроксибензотриазол (0.48 г, 3.5 ммоль) и N,N'-дициклогексилкарбодиимид (0.7 г, 3.4 ммоль) при 0-5°С и перемешивали в течение 1 ч при этой температуре, 5 ч при 20-22°С. Осадок N,N'-дициклогексилмочевины отфильтровывали и к фильтрату добавляли гидрохлорид трет-бутилового эфира L-изолейцина (1.03 г, 4 ммоль) и триэтиламин (0.8 мл, 6 ммоль). Смесь выдерживали при периодическом перемешивании при 20-22°С в течение 24 ч и выливали в холодную воду, подкисляли лимонной кислотой (рН 3-4), осадок отфильтровывали, промывали водой, сушили и полученный трет-бутиловый эфир коньюгата ГК обрабатывали трифторуксусной кислотой (CF₃COOH) в хлористом метилене (10 мл смеси 1:1) при 20-22°С 1 ч для удаления трет-бутильной сложноэфирной группы. Деблокированный продукт очищали на колонке с силикагелем, элюируя градиентной смесью хлороформа-метанола-воды (CHCl₃-МеОН-H₂O) 400:10:1→50:10:1 (v/v) с контролем по тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках Сорбфил (Сорбополимер).

Выход 56%; [α]_D²⁰+42° (с 0,02, МеОН). ИК, ν, см^-1: 3600-3200 (ОН, NH); 1720 (СООН); 1660 (С11=О); 1530 (CONH). Спектр ЯМР ¹³С (75,5 МГц, CD₃OD, δ, м.д.): 202.7 (С11), 178.6 (С30), 171.5 (С6''), 171.4 (С6'), 171.3 (С13), 126.9 (С12), 105.0 (С1), 104.9 (С1), 90.3 (С3), 81.7 (С2'), 77.7 (С5''), 77.3 (С5'), 76.3 (С3'), 76.0 (С3''), 75.2 (С2''), 73.6 (С4''), 73.4 (С4'), 63.2 (С9)), 56.4 (С5), 48.2 (С18), 46.8 (С8), 44.9 (С20), 44.6 (С14), 42.5 (С19), 40.3 (С1), 38.7 (С22), 38.1 (С10), 28.8 (С28).), 27.6 (С2), 40.7 (С4), 18.5 (С6), 33.8 (С7), 27.4 (С15, С16), 33.0 (С17), 32.0 (С21), 29.2 (С29), 28.4 (С23), 23.9 (С27), 19,4 (С26), 17,3 (С25), 17,0 (С24); 3Ile: 175,0, 174,5, 172,9, 57,9, 57,8, 57,7, 39,0, 38,9, 38.7, 26.5, 26.2, 26.1, 16.1, 16.0, 12.1, 12.0, 11.8. Найдено, С 65,90; Н 7,22; N 3,35%. Вычислено: С 66,18; Н 7,33; N 3,22%. C₇₂H₉₅N₃O₁₉; М=1306,49.

Общая методика синтеза коньюгатов (3-8). К раствору ГК (0.82 г, 1.0 ммоль) в тетрагидрофуране или диоксане (25-30 мл) при 0-5°С добавляли N-гидроксисукцинимид (0.60 г, 5.2 ммоль) и N,N'-дициклогексилкарбодиимид (0.65 г, 3.0 ммоль) и смесь перемешивали при этой температуре 1 ч, при 20-22°С - 5 ч. Осадок N,N'-дициклогексилмочевины отфильтровывали и добавляли гидрохлорид эфира аминокислоты (метилового, этилового, трет-бутилового) (3.0 ммоль) и триэтиламин (6.0 ммоль) или N-метилморфолин (6.0 ммоль). Смесь выдерживали с периодическим перемешиванием при 20-22°С в течение 24 ч, разбавляли холодной водой, подкисляли лимонной кислотой (рН 3-4), осадок отфильтровывали, промывали водой, сушили и очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя градиентной смесью CHCl₃-МеОН-H₂O (400:10:1→50:10:1, v/v) с контролем по ТСХ.

3-О-{2-O-[N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-тирозина метиловый эфир]-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-тирозина метиловый эфир}-(3β,20β)-11-оксо-30-норолеан-12-ен-30-ой кислоты (3). Выход 54%; [α]_D²⁰=+54° (с 0.04; МеОН). ИК-спектр, ν, cm^-1: 3600-3200 (ОН, NH); 1734 (СООСН₃); 1665 (С=O); 1615 (Ph); 1597; 1516 (CONH). Спектр ЯМР ¹³С (125 МГц, CD₃OD, δ, м.д.): 201.2 (С11), 179.0 (С30), 171.4 (С13), 169.9 (С6''), 169.8 (С6'), 127.6 (С12), 103.4 (С1''), 103.2 (С1'), 89.3 (С3), 79.3 (С2'), 78.1 (С5''), 76.4 (С5'), 75.8 (С3''), 74.4 (С2''), 73.9 (С3'), 72.1 (С4''), 71.9 (С4'), 61.7 (С9), 55.0 (С5), 48.4 (С18), 45.4 (С8), 43.5 (С20), 43.2 (С14), 41.0 (С19), 39.3 (С4), 39.0 (С1), 37.7 (С22), 36.2 (С10), 32.7 (С7); 32.38 (С17); 31.58 (С21); 30.64 (С29); 27.93 (С28); 27.50 (С16), 27.15 (С23), 26.22 (С15), 25.8 (С2), 22.7 (С27), 18.0 (С26), 17.1 (С6), 16.0 (С25), 15.8 (С24); 2TyrOMe: 171.6, 171.5, 156.2, 156.1, 130.2, 130.0, 126.6, 115.2, 115.1. 53.6, 53.5, 51.7, 51.6. Найдено, С 63.05, Н 7.28, N 2.25%. Вычислено, С 63.25; Н 7.19; N 2.38%; C₆₂H₈₄N₂O₂₀. М=1177.30.

3-O-{2-O-[N-(β-D-глюкопиранозиуроноил)-D-валина метиловый эфир]-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-D-валина метиловый эфир}-(3β,20β)-11-оксо-30-норолеан-12-ен-30-ой кислоты (4). Выход 52%; [α]_D²⁰+62° (с 0.06, EtOH). ИК-спектр, ν, см^-1: 3500-3200 (ОН, NH), 1739 (СООМе), 1659 (СО), 1532 (CONH). Спектр ЯМР ¹³С (75.5 МГц, CD₃OP, δ, м.д.): 202.6 (С11), 180.4 (С30), 171.5 (С13), 171.0 (С6', С6''), 129.0 (С12), 105.5 (С1''), 105.0 (С1'), 90.8 (С3), 82.4 (C2'), 77.8 (C5''), 77,4 (С5'), 76.2 (С2''), 75.7 (C3'), 75.7 (C3''), 73.1 (С4', C4''), 63.2 (С9), 56.5 (С5), 46.8 (С8). 44.9 (С20), 44.6 (С14), 42.5 (С19), 40.8 (С4), 40.2 (С1), 39.1 (С22), 38.1 (С10), 33.8 (С7), 33.0 (С17), 32.1 (С21), 29.2 (С29), 28.8 (С28), 28.3 (С23), 27.6 (С16), 27.4 (С15), 26.6 (С2), 23.9 (С27), 19.4 (С26), 18.2 (С6), 17.1 (С24, С25); 2D-ValOMe: 173.2, 172.9, 58.9, 58.6, 52.8, 52.6, 18.8, 18.5. Найдено, С 61.65, Н 7.86, N 2.52%. Вычислено, С 61.81, Н 8.07, N 2.67%; C₅₄H₈₄N₂O₁₈. М=1049.22.

3-O-{2-O-[N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-фенилаланина этиловый эфир]-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-фенилаланина этиловый эфир}-(3β,20β)-11-оксо-30-норолеан-12-ен-30-ой кислоты (5). Выход 55%; [α]_D²⁰+55° (с 0.12, EtOH). ИК-спектр, ν, см^-1: 3500-3200 (ОН, NH), 1739 (COOEt), 1653 (С=O), 1527 (CONH), 1490 (Ph). ЯМР ¹³С (75.5 МГц, Py-d₅, δ, м.д.): 199.4 (С11), 178.9 (С30), 171.3 (С13), 170.2 (С6''), 169.8 (С6), 127.1 (С12), 105.3 (С1'), 104.4 (С1'), 88.8 (С3), 81.7 (С2'), 77.4, 77.3 (С5', С5''), 76.4, 76.3 (С3', С3''), 75.8 (С2''), 37.1 (С4', С4''), 61.9 (С9), 55.1 (С5), 48.5 (С18), 45.3 (С8), 43.4 (С20), 43.3 (С14), 41.5 (С19), 39.7 (С4), 39.4 (С1), 38.7 (С22), 38.2 (С10), 32.7 (С7), 31.9 (С17), 31.3 (С21), 28.5 (С29), 28.2 (С28), 27.8 (С23), 27.6 (С2), 26.5 (С16), 26.0 (С15), 23.3 (С27), 18.6 (С26), 17.4 (С6), 16.7 (С25), 16.5 (С24); 2PheOEt: 172.9, 172.3, 137.5, 136.9, 129.7, 129.6, 128.7, 128.5, 61.1, 60.7, 54.1, 53.6. 37.7, 37.3, 13.92. Найдено, С 65.42, Н 7.68, N 2.30%. Вычислено, С 65.61, Н 7.56, N 2.39%; C₆₄H₈₈N₂O₁₈. М=1173.35.

3-O-{2-O-[N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-лейцина этиловый эфир]-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-лейцина этиловый эфир}-(3β,20β)-11-оксо-30-норолеан-12-ен-30-ой кислоты (6). Выход 52%. [α]_D²⁰+59° (с 0.12, EtOH). ИК-спектр, ν, см^-1: 3500-3200 (OH, NH), 1740 (COOEt), 1662 (С10), 1533 (CONH). Спектр ЯМР ¹³C (125 МГц, CD₃OD, δ, м.д.): 200.9 (С11), 178.6 (С30), 171.5 (C13), 170.1, 169.9 (C6'', C6'), 127.5 (C12), 103.7 (C1''), 103.6 (С1'), 89.1 (C3), 80.3 (C2'), 78.2 (C5''), 78.0 (C5'), 75.7, 74.6 (С3', C3''), 74.2 (C2''), 72.1, 72.0 (C4', C4''), 61.7 (C9), 55.2 (C5), 48.4 (C18), 45.3 (C8), 43.6 (C20), 43.2 (C14), 41.1 (C19), 40.4 (C4), 39.4 (C1), 37.7 (C22), 36.7 (C10), 32.4 (C7), 31.6 (C17), 30.7 (C21), 27.9 (C29), 27.5 (C28), 27.2 (C23), 26.2 (C2), 26.0 (C16), 24.6 (C15), 22.3 (C27), 18.0 (C26), 17.1 (C6), 16.1 (C25), 16.0 (C24); 2LeuOEt: 172.2, 172.1, 61.1, 61.0, 50.7, 50.5, 22.9, 22.7, 21.0, 20.9, 20.7, 15.9, 15.1, 13.3. Найдено, С 62.24, H 9.02, N 2.55%. Вычислено, С 62.45, Н 9.22, N 2.51%. C₅₈H₁₀₂N₂O₁₈. М=1115.41.

3-O-{2-O-[N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-глутаминовой кислоты α-метиловый эфир)-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-L-глутаминовой кислоты α-метиловый эфир)-(3β,20β)-11-оксо-30-норолеан-12-ен-30-ой кислота (7). В соответствии с методикой, описанной выше, из ГК (0.82 г, 1 ммоль), N-гидроксисукцинимида (0.6 г, 5.2 ммоль), N,N'-дициклогексилкарбодиимида (0.65 г, 3 ммоль) и гидрохлорида α-метилового, γ-трет-бутилового эфира L-глутаминовой кислоты (0.52 г, 3 ммоль)) в присутствии N-этилморфолина (0.6 мл, 5 ммоль) в тетрагидрофуране (25 мл) получали α-метиловый, γ-трет-бутиловый эфир коньюгата ГК, который без очистки обрабатывали CF₃COOH в CH₂Cl₂ (10 мл, 1:1) при 20-22°С (40 мин) для удаления трет-бутильных сложноэфирных групп. Упаривали растворитель и CF3COOH, остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, как описано выше. Выход 53%; [α]d²⁰+47° (с 0.02, МеОН). ИК-спектр, ν, см^-1: 3600-3200 (ОН, NH); 1740 (СООМе); 1660 (С=O); 1540 (CONH). Спектр ЯМР ¹³С (75.5 MHz, CD₃OD, δ, м.д.): 202.4 (С11), 198.0 (С30), 172.5 (С13), 171.6 (С6''); 171.4 (С6'), 129.1 (С12), 82.2 (С2'), 105.1 (С1') 105.0 (С1') 90.6 (С3), 77.6 (С5'), 77.1 (С5''), 76.2 (С3'), 75.9 (С2", С3''), 73.4 (С4''), 73.2 (С4'), 63.1 (С9), 56.4 (С5), 46.7 (С8), 44.8 (С20), 44.5 (С14). 42.5 (С19), 40.7 (С4), 40.3 (С1), 38.7(С22), 38.0 (С10), 33.8 (С7), 32.9 (С17), 32.0 (С21), 29.3 (С29), 29.2 (С28), 28.6 (С23), 28.4 (С16), 27.9 (С15), 27.6 (С2), 23.9 (С27), 19.4 (С26), 18.4 (С6), 17.1 (С24); 2Glu(OMe): 174.9, 174.5, 173.7, 173.1, 53.1, 52.9, 52.4, 31.2, 31.1, 27.8, 27.6. Найдено, С 58.32, Н 7.14, N 2.60%. Вычислено, С 58.47, Н 7.27, N 2.52%. C₅₄H₈₀O₂₂N₂. М=1109.19.

3-O-{2-O-[N-(β-D-глюкуронопиранозилуроноил)-L-лизин (ε-N-карбобензокси)]-N-(β-D-глюкуронопиранозилуроноил)-L-лизин (ε-N-карбобензокси)}-(3β,20β)-11-оксо-30-норолеан-12-ен-30-ой кислота (8). В соответствии с методикой, описанной выше, из ГК (0.82 г, 1 ммоль), N-гидроксисукцинимида (0.6 г, 5.2 ммоль), N,N'-дициклогексилкарбодиимида (0.65 г, 3 ммоль) и гидрохлорида трет-бутилового эфира ε-N-карбобензокси-L-лизина (1.12 г, 3 ммоль)) в присутствии триэтиламина (0.6 мл, 4 ммоль) получили трет-бутиловый эфир коньюгата ГК, который без очистки обрабатывали CF₃COOH в CH₂Cl₂ (10 мл, 1:1) как описано выше, упаривали и очищали хроматографией на колонке с силикагелем. Выход 52%. [α]_D²⁰+55° (с 0.02; МеОН). ИК-спектр, ν, см^-1: 3500-3200 (ОН, NH), 1670 (С=O), 1530 (CONH). Спектр ЯМР ¹³С (75.5 МГц, DMSO-d₆, δ, м.д.): 199.54 (С11), 178.15 (С30), 170.25 (С13). 168.73 (С6''), 168.62 (С6'), 127.49 (С12), 104.81(С1''), 103.88 (С1') 88.38 (С3), 82.23 (С2'), 76.40 (С5''), 76.05 (С5'), 75.21 (С3''), 75.06 С3'), 72.88 (С2''), 72.13 (С4''), 71.39 (С4'), 61.51 (С9), 54.79 (С5), 48.42 (С18), 45.24 (С8), 43.44 (С20), 43.22 (С14), 40.52 (С19), 39.31 (С4), 39.14 (С1), 37.50 (С22), 36.67 (С10), 31.86 (С7), 31.53 (С17); 28.70 (С29), 28.20 (С28); 27.58 (С23), 26.50 (С2), 26.05 (С16); 25.86 (С15), 23.26 (С27); 18.65 (С26, С6); 16.48 (С25, С24); 2Lys(Z): 173.98 (2СООН), 156.50 (2С Ar), 137.62 (С Ar), 137.55 (С Ar), 130.50 (С Ar), 128.73 (2С Ar), 128.12 (С Ar), 128.05 (С Ar), 127.97 (С Ar), 127.65 (С Ar), 122.38 (С Ar), 65.87 (СН₂), 65.54 (СН₂), 52.45 (α-СН), 51.93 (α-СН), 29.53 (СН₂), 29.40 (СН₂), 23.04 (СН₂), 22.63 (СН₂). Найдено, С 61.70, Н 6.58, N 4.26%. Вычислено, С 61.92, Н 6.67, N 4.31%. C₇₀H₉₈N₄O₂₂. М=1299.38.

3-О-{2-O-[N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-лейцин-тирозина метиловый эфир)]-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-лейцин-тирозина метиловый эфир)}-(3β,20β)-11-оксо-30-норолеан-12-ен-30-ой кислота (9).

Синтез дипептида Leu-TyrOMe. К раствору 4-нитрофенилового эфира трет-бутилоксикарбонил-L-лейцина (BocLeuONp) (1.76 г, 5 ммоль) в диметилформамиде (ДМФА) (20 мл) добавляли N-этилморфолин (0.5 мл) и гидрохлорид метилового эфира L-тирозина (1.15 г, 5 ммоль) при перемешивании. Реакционную смесь выдерживали при 40-45°С в течение 48 ч, упаривали и разбавляли хлороформом, промывали 5% раствором NaHCO₃, водой, 5% раствором соляной кислоты, водой и сушили над MgSO₄. Остаток (1.2 г) использовали без дальнейшей очистки; R_f=0,64 (бензол-этанол, 5:1). ИКспектр, ν, см^-1: 3400-2800 (BocNH, CONH), 1781 (СООМе), 1670 (СО), 1616, 1595, 1517, 1600 (Tyr). Защищенный дипептид BocLeu-TyrOMe обрабатывали CF₃COOH (15 мл) при 20-22°С (40 мин), упаривали и растирали с диэтиловым эфиром с получением трифторацетата дипептида CF₃COOH•Leu-TyrOMe (1.08 г), который вводили в реакцию с ГК без дальнейшей очистки.

Синтез коньюгата ГК (9). К раствору ГК (0.82 г, 1 ммоль) в ДМФА (20 мл) при 0-5°С добавляли N-этилморфолин (0.7 мл, 6 ммоль) и реагент Вудворда K (0.6 г, 2.5 ммоль) и перемешивали при 0-5°С в течение 1.5 ч, при 20-22°С 1.5 ч. Затем добавляли N-метилморфолин (0.5 мл, 4 ммоль) и CF₃COOH•Leu-TyrOMe (1.08 г, 2.5 ммоль). Реакцию выдерживали с периодическим перемешиванием при 20-22°С в течение 48 ч, упаривали и выделяли продукт с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя градиентной смесью CHCl₃-МеОН-H₂O (400:10:1→50:10:1, v/v) с контролем ТСХ. Выход 49%. Аморфное вещество; [α]_D²⁰+46° (с 0.04, МеОН). ИК-спектр, ν, см^-1: 3500-3200, 1730, 1691, 1644, 1600, 1560, 1500. Спектр ЯМР ¹³С: (125 МГц, DMSO-d₆, δ, м.д.): 199.2 (С11), 178.8 (С30), 171.1 (С13), 168.6, 168.2 (С6', С6''), 128.3 (С12), 104.0, 103.8 (С1', С1''), 90.1 (С3), 76.6, 76.5 (С5', С5''), 74.1, 74.0 (С3', С3''), 72.5 (С2''), 72.0, 71.8 (С4', С4''), 64.1 (С9), 56.3 (С5), 49.2 (С18), 47.4 (С8), 44.2 (С20), 43.7 (С14), 43.5 (С19), 38.7 (С4), 38.2 (С1), 36.9 (С22), 34.4 (С7), 33.9 (С17), 32.1 (С21), 28.9 (С29), 28.4 (С28), 27.7 (С23), 26.7 (С2), 26.5, 26.3 (С 15, С16), 24.00 (С27), 18.9 (С26), 16.7 (С25). 16.0 (С24); 2Leu-TyrOMe: 172.2, 172.1, 167.4, 167.1, 156.9, 156.3, 147.4, 136.6, 136.1, 132.0, 131.0, 130.7, 129.9, 129.4, 126.64, 126.3, 125.6, 115.7, 115.6, 66.4, 52.9,52.1,51.5,51.4, 23.5,23.3,22.3,21.7, 15.2, 14.9. Найдено, С 63.10, Н 7.73, N 3.85%. Вычислено, С 63.32, Н 7.61, N 3.99%. C₇₄H₁₀₆N₄O₂₂. М=1403.6.

Пример 2. Исследование цитотоксичности и противовирусной активности коньюгатов ГК (2-9) в отношении вируса Денге 2

Клетки и вирусы. Исследования проводили в культуре клеток Vero Е6 (почки африканской зеленой обезьяны) и А549 (альвеолярные базальные эпителиальные клетки человека) с использованием штамма вируса Денге 2 (DENV2 16681).

Клетки Vero Е6 и А549 культивировали в поддерживающей среде Игла, модифицированной Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), пирувата и пенициллина/стрептомицина. В исследованиях использовалась также стабильная клеточная линия BHK-21 репликона вируса Денге 2 (BHK-D2-Fluc-SGR-Neo), которая экспрессирует самореплицирующиеся субгомы вируса Денге 2 без генов prM и Е, слитые с геном люциферазы светлячка.

Опыты проводили в среде DMEM, содержащей 10% бычьего сывороточного альбумина (FBS) и 1 мг/мл генецетина G418 согласно [Hsu Y.C., Chen N.C., Chen Р.С., Wang C.C., Cheng W.C., Wu H.N. Identification of a small-molecule inhibitor of dengue virus using a replicon system. // Arch Virol., 2012 Apr; 157(4), 681-8].

Определение цитотоксичности: Цитотоксичность коньюгатов ГК (2-10) для клеток Vero Е6 определяли с помощью МТТ-теста с использованием тетратиазолилового красителя -желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) по методике, описанной ранее [Lien J.C., Wang C.Y., Lai Н.С., Lu C.Y., Lin Y.F., Gao G.Y., Chen K.C., Huang A.C., Huang S.H., Lin C.W. Structure analysis and antiviral activity of CW-33 analogues against Japanese encephalitis virus. // Sci. Rep., 2018, Nov 9; 8(1), 16595].

Клетки Vero E6 (5×103/на лунку) культивировали в 96-луночных планшетах в течение ночи и обрабатывали различными концентрациями (0.01, 0.1, 1.0, 10, 20, 50 и 100 мкМ) каждого исследуемого соединения. После 4-дневной инкубации в клетки добавляли раствор тетратиазолилового красителя (МТТ), через 4 ч краситель восстанавливали и интенсивность пурпурной окраски восстановленного красителя (МТТ-формазана), показывающего степень жизнеспособности клеток, оценивали с помощью считывающего устройства микро-ELISA с оптической плотностью (OD) 570-630 нм. Коэффициент выживаемости обработанных клеток определяли количественно следующим образом: коэффициент выживаемости (%) = (обработанные клетки / клетки Acontrol) × 100%. Анализ ингибирования цитопатического эффекта вируса Денге 2. Для оценки ингибирующего эффекта исследуемых коньюгатов ГК на цитопатический эффект вируса Денге 2 клетки Vero Е6 инфицировали вирусом Денге 2 с множественностью заражения (MOI) 0.01 и сразу добавляли исследуемые соединения. После 96 ч инкубации индуцированный вирусом Денге 2 цитопатический эффект (СРЕ) регистрировали под микроскопом в виде микрофотографий.

Анализ ингибирования инфекционности вируса Денге 2: Клетки Vero Е6 и А549 (2×105 / на лунку) культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS в течение ночи, дважды промывали фосфатным солевым раствором (PBS), инфицировали вирусом Денге 2 при MOI 0.01 и одновременно обрабатывали исследуемыми соединениями в различных концентрациях (0, 0.1, 1.0 и 10 мкМ). После 96 ч инкубации при 37°С клетки фиксировали 4% раствором формальдегида, блокировали фиксирующим раствором (бычий сывороточный альбумин:тритон (triton-100) = 1000:1), а затем окрашивали кроличьими анти-Денге 2-NS4B антителами и вторично красителем Alexa Fluor 555 (AF555), конъюгированными с анти-кроличьими антителами IgG, соответственно (GeneTex, Inc; ThermoFisher). Затем клеточные ядра окрашивали 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и подсчитывали количество клеток.

Для определения процента NS4B-положительных клеток в инфицированных клетках использовали программное обеспечение Image J. Ингибирование инфекционности вируса препаратами рассчитывали как отношение процента NS4B-положительных клеток, обработанных препаратами / NS4B-положительных клеток в инфицированных клетках без добавления препаратов.

Анализ снижения выхода вируса. Культивированные среды в обработанных/инфицированных клетках собирали через 96 ч после инкубации. Серийные 10-кратные разведения культивируемых супернатантов наносили на монослой клеток Vero Е6 в лунках 96-луночных планшетов и инкубировали 96 ч. Затем регистрировали индуцированный вирусом Денге 2 цитопатический эффект (СРЕ) в каждой лунке. Конечный (50%) титр выхода вируса рассчитывали по методу Спирмена-Кербера [Ramakrishnan MA. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World J Virol, 2016 May 12; 5(2), 85-6]. Выход вируса выражали как среднюю (50%) инфекционную дозу культуры ткани (TCID50).

Анализ зависимости инфекционности вируса от времени добавления/удаления препарата. Исследуемые соединения в различных концентрациях (0, 0.1, 1, 10 мкМ) добавляли в монослой клеток Vero Е6 в 6-луночных планшетах одновременно с вирусом (одновременная обработка) или через 1 ч после инфицирования (последующая обработка). Смесь вируса Денге 2 и исследуемого соединения удаляли из монослоя клеток через 1 ч после инкубации. Остаточную инфекционность вируса Денге 2 определяли иммунофлуоресцентным методом через 96 ч инкубации, как описано выше в анализе ингибирования инфекционности вируса.

Анализ ингибирующей активности исследуемых соединений с использованием репликона вируса Денге 2. Для изучения ингибирующего действия исследуемых соединений на стадии репликации вируса Денге 2 использовали стабильную клеточную линию ВНК-21 репликона вируса Денге 2 (BHK-D2-Fluc-SGR-Neo). Клетки BHK-D2-Fluc-SGR-Neo (2×105 клеток/на лунку) в 6-луночных планшетах обрабатывали исследуемыми препаратами в различных концентрациях (0, 1 и 10 мкМ) в среде DMEM, содержащей 1 мг/мл G418. Через 24 ч после инкубации отбирали пробы и определяли активность люциферазы светлячка с использованием набора для анализа люциферазы (Promega).

Пример 3. Исследование противовирусной активности коньюгатов ГК (2-9) в отношении вируса Зика

Клетки и вирусы. В исследовании использовали клетки SF268 и ВНК-21 глиобластомы человека и клетки ТЕ-671 медуллобластомы человека, которые культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS с добавлением пенициллина/стрептомицина. Клетки BHK-21 использовали для получения вируса Зика (штамм PRVABC-59) (вирус человека/2015/Пуэрто-Рико) и определения вирусных титров с помощью анализа TCID50. Клетки SF268 использовали для анализа противовирусной активности соединений.

Определение цитотоксичности. Определение цитотоксичности исследуемых соединений проводили в культуре клеток SF268 (3×103 клеток/на лунку), культивируемых в 96-луночных планшетах. Клетки обрабатывали исследуемыми соединениями в различных концентрациях (0, 0.1, 10, 20 и 50 мкМ). После 96 ч инкубации в клетки добавляли раствор МТТ, проводили 4-х часовую реакцию, восстановливали МТТ, растворяли в 10% растворе ДМСО, затем измеряли оптическую плотность (OD) при 570-630 нм с помощью считывающего устройства микро-ELISA. Коэффициент выживаемости обработанных клеток по сравнению с контрольными клетками рассчитывали следующим образом: Коэффициент выживаемости (%) = (Обработанные клетки / Acontrol клетки) × 100%.

Анализы ингибирования цитопатического эффекта и ингибирования инфекционности вируса Зика. Противовирусную активность исследуемых соединений в отношении вируса Зика исследовали по влиянию на индуцированный вирусом Зика цитопатический эффект (СРЕ). Клетки SF268 инфицировали вирусом Зика при MOI 0.05 и сразу обрабатывали исследуемыми соединениями в различных концентрациях (0, 0.1, 1 и 10 мкМ). Изображения СРЕ в каждой лунке 6-луночного планшета получали под микроскопом через 96 ч инкубации. Затем определяли остаточную инфекционность вируса Зика в обработанных/инфицированных клетках в каждой лунке с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Клетки окрашивали кроличьими анти-Зика-NS 1 антителами (GeneTex, Inc) и анти-кроличьими антителами IgG, конъюгированными с AF555 (ThermoFisher). Ядра всех клеток окрашивались DAPI. Ингибирование инфекционности вируса Зика определяли как отношение NS1-положительных клеток к общему количеству ядер с помощью программного обеспечения Image J.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к применению конъюгатов глицирризиновой кислоты формулы 1 с аминокислотами формулы 2-9 в качестве ингибиторов флавивирусов Денге 2 и Зика. В указанных формулах R=L-изолейцин (Ile) (2), метиловый эфир L-тирозина (TyrOMe) (3), метиловый эфир D-валина (D-ValOMe) (4), этиловый эфир L-фенилаланина (PheOEt) (5), этиловый эфир L-лейцина (LeuOEt) (6), α-метиловый эфир L-глутаминовой кислоты (GluOMe) (7), ε-N-карбобензокси-лизин (LysZ) (8), метиловый эфир L-лейцин-тирозина (Leu-TerOMe) (9). Конъюгаты малотоксичны и могут найти применение для лечения вирусных инфекций, вызванных вирусами Денге 2 и Зика. 16 ил., 1 табл., 3 пр.

Применение конъюгатов глицирризиновой кислоты формулы 1 с аминокислотами формулы 2-9

где R=L-изолейцин (Ile) (2), метиловый эфир L-тирозина (TyrOMe) (3), метиловый эфир D-валина (D-ValOMe) (4), этиловый эфир L-фенилаланина (PheOEt) (5), этиловый эфир L-лейцина (LeuOEt) (6), α-метиловый эфир L-глутаминовой кислоты (GluOMe) (7), ε-N-карбобензокси-лизин (LysZ) (8), метиловый эфир L-лейцин-тирозина (Leu-TerOMe) (9), в качестве ингибиторов флавивирусов Денге 2 и Зика.