Настоящее изобретение относится к лечению рака, в частности gp100-положительного рака. В частности, изобретение относится к режиму дозирования для перенаправляющего Т-клетки биспецифичного терапевтического средства, содержащего нацеливающий фрагмент, который связывается с комплексом YLEPGPVTA-HLA-A2, гибридизированным (слитым) с CD3-связывающим фрагментом, перенаправляющим Т-клетки.

Гликопротеин 100 (gp100) человека является одним из ряда ассоциированных с меланомой антигенов, на которые организм может дать естественный иммунный ответ. Этот белок представляет собой ассоциированный с меланосомной мембраной гликопротеин из 661 аминокислоты, который экспрессируется в нормальных меланоцитах и широко сверхэкспрессируется в большинстве раковых клеток меланомы. Например, в одном исследовании (Trefzer et al., (2006) Melanoma Res. 16 (2): 137-45) обнаружили экспрессию gp100 в 82% из 192 метастазов меланомы у 28 пациентов с меланомой. В нескольких исследованиях были получены данные о повышенных уровнях экспрессии gp100 в тканях меланомы (Hofbauer et al., (2004) J Immunother. 27 (1): 73-78, Barrow et al., (2006) Clin Cancer Res. 12: 764-71). В то время как большинство gp100-положительных раков представляют собой меланомы, есть также многочисленные литературные данные о других формах рака, таких как светлоклеточная саркома и различные подтипы рака мозга, которые экспрессируют gp100, что определяется, например, с помощью иммуногистохимии с антителом под названием НМВ-45, широко используемым диагностическим антителом, специфичным к gp100 (Huang et al., (2015) Int J Clin Exp Pathol. 8 (2): 2171-5, Ozuguz et al., (2014) Indian Dermatol Online J 5 (4): 488-90, Taddei et al., Appl Immunohistochem Mol Morphol (2001) 9 (1): 35-41). Точная функция белка неизвестна, но, по-видимому, он участвует в созревании меланосом (Hoashi et al., 2005; Kawakami и Rosenberg, 1997). Антиген gp100 был и остается мишенью ряда клинических исследований меланомы, основанных на иммунотерапии.

Первоначально нацеленная на gp100 иммунотерапия включала стратегии вакцинации пептидами или вирусами, экспрессирующими целый белок gp100 или его фрагменты (см. (Lens (2008) Expert Opin Biol Ther. 8 (3): 315-323.)). Эти исследования имели ограниченный успех, что, как полагают, было скорее результатом того, что эти средства вызывали недостаточный иммунный ответ, а не отражало валидность мишени. Таким образом, принцип применения gp100 в качестве мишени при лечении меланомы остается валидным подходом для специфичной иммунотерапии меланомы.

Разработка нового биспецифичного терапевтического средства, содержащего специфичный к gp100 нацеливающий фрагмент на основе рецептора Т-клеток, который гибридизирован с CD3-связывающим фрагментом, перенаправляющим Т-клетки, обеспечивает новый вариант лечения (Liddy et al., (2012). Nat Med. 8: 980-987). Механизм действия такого терапевтического средства значительно отличается от других иммунотерапевтических предшественников и приводит к быстрому и мощному перенаправлению не специфичных к gp100 Т-клеток на уничтожение gp100-положительных клеток in vitro; таким образом, есть разумное обоснование для ожидания как улучшенных результатов клинической эффективности у пациентов, так и токсических воздействий на мишень вне опухоли в результате активности в отношении gp100-положительных нормальных тканей, таких как меланоциты кожи.

Пептид YLEPGPVTA (SEQ ID No: 1) соответствует номерам аминокислотных остатков 280-288 в gp100. Пептид YLEPGPVTA (SEQ ID No: 1) представлен молекулами HLA класса I на gp100⁺/HLA-A * 02⁺ раковых клеток (Salgaller et al., (1996) Cancer Res 56: 4749- 4757). В WO 2011/001152 описан TCR, которые связывают пептид YLEPGPVTA, представленный в виде комплекса пептид-HLA-А*02. Эти TCR были мутированы по сравнению с нативным альфа и/или бета вариабельными доменами TCR к gp100 для обеспечения улучшенной аффинности связывания с и/или времени полужизни связи с комплексом, и могут быть связаны (ковалентно или иным образом) с терапевтическим агентом. Один из таких терапевтических агентов представляет собой антитело к CD3, или функциональный фрагмент или вариант указанного антитела к CD3, такой как одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). Антитело к CD3 или его фрагмент могут быть ковалентно связаны с С- или N-концом альфа- или бета-цепи TCR. Такие TCR использовали для лечения меланомы у пациентов (идентификатор клинического исследования NCT01211262).

IMCgp100 представляет собой перенаправляющий Т-клетки биспецифичный терапевтический агент, содержащий растворимый TCR с повышенной аффинностью, который связывается с комплексом пептид YLEPGPVTA -HLA-A * 02, гибридизированный с scFv к CD3. Показано, что IMCgp100 функционирует in vitro, связываясь с gp100-положительными клетками-мишенями и вызывая их уничтожение посредством рекрутинга как опухолеспепецифичных, так и неопухолеспецифичных Т-клеток. После связывания с комплексом пептид-HLA-A * 02 на поверхности gp100-положительной клетки-мишени, IMCgp100 соединяет клетку-мишень с Т-клеткой посредством взаимодействия части молекулы, соответствующей. Соединение двух клеток посредством биспецифичного терапевтического средства приводит к формированию иммунного синапса, активации Т-клеток и перенаправлению Т-клеточного ответа на gp100-положительную клетку-мишень. IMCgp100 может активировать как CD4⁺, так и CD8⁺ Т-клетки; однако его основная функция заключается в индукции ответов CD8⁺ Т-клеток. CD8⁺ Т-клетки, также известные как цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), играют важную роль в репертуаре естественной иммунной системы для борьбы с раком. CTL являются цитолитическими, и их функция заключается в лизисе опухолевой клетки по апоптозному пути.

Как упомянуто выше, gp100 экспрессируется в нормальных здоровых клетках, в том числе меланоцитах, что повышает возможность реактивности в отношении мишени вне опухоли в клинических условиях. Известно, что уровни экспрессии gp100 в меланоцитах ниже, чем в опухолях. В ходе доклинического исследования IMCgp100 было подтверждено, что IMCgp100 обладает способностью перенаправлять активность Т-клеток на нормальные меланоциты, но с более низкой, по сравнению с опухолевыми клетками, эффективностью, причем эффективность в данном случае прямо пропорциональна количеству эпитопов, представленных на поверхности клеток-мишеней (Liddy et al., (2012). Nat Med. 8: 980-987). Хотя эти данные указывают на потенциальное терапевтическое окно между реакцией опухоли и реакцией вне опухоли, при лечении IMCgp100 нельзя исключить реакцию в отношении мишени вне опухоли. Ожидается, что любая реакция меланоцитов в коже во время клинических исследований проявляется в виде кожной токсичности, такой как сыпь, витилиго и эффекты локализованного высвобождения цитокинов и хемокинов, которые можно контролировать с помощью лечения гидрокортизоном. Во время доклинических исследований IMCgp100 in vitro не выявили никаких иных проблем безопасности, включая отсутствие доказательств наличия перекрестной реакции вне мишени. На основе этих данных получило одобрение клиническое исследование IMCgp100. Как будет понятно специалистам в данной области техники, подходящие уровни терапевтической дозы невозможно предсказать a priori, и они зависят как от механизма действия терапевтического средства, так и от профиля экспрессии целевого антигена. Отсюда следует, что, хотя известны токсические эффекты в отношении мишени вне опухоли многочисленных получивших оценку в клинических условиях многочисленных специфичных для gp100 вакцин и средств терапии с применением аутологичных Т-клеток, в терапии с перенаправлением Т-клеток все же невозможно a priori предсказать подходящую терапевтическую дозу. Это связано с тем, что, в то время как в результате вакцинации и терапии аутологичными Т-клетками лишь небольшая часть Т-клеток у пациента получает способность распознавать gp100-положительные клетки, то терапия с перенаправлением Т-клеток теоретически может наделить каждую CD3-положительную Т-клетку пациента способностью распознавать и реагировать на gp100-положительные клетки.

Безопасность и переносимость IMCgp100 у пациентов с прогрессирующей меланомой исследовали в фазе I исследования (идентификатор клинического исследования NCT01211262). Промежуточные результаты этого исследования уже известны (Middleton и др.., (2015) Cancer Res 2015; 75 (15 Suppl): Abstract nr CT106). Максимальную переносимую дозу для еженедельного введения определили как 600 нг/кг, на основе этого рассчитали рекомендованную дозу фазы II (РДФ2) - 50 мкг на дозу, независимо от веса пациента. Во время части исследования с повышением дозы в качестве основной дозолимитирующей токсичности наблюдали тяжелую (степень 3/4) гипотензию. Когорта пациентов впоследствии еженедельно получала дозу РДФ2, и поступали сообщения о дальнейших эпизодах тяжелой гипотонии. Другие распространенные нежелательные явления включали сыпь, зуд, гипертермию и отек. Нежелательные явления обычно проявлялись вскоре после первой или второй дозы терапевтического средства. Дополнительные еженедельные дозы IMCgp100 сверх дозы 2 приводили к снижению нежелательных реакций и общему облегчению тяжести этих явлений. Для повышения переносимости во время ранних доз первую из еженедельных IMCgp100 уменьшили на 20% до 40 мкг, как это принято в обычной практике, после чего в последующие недели вводили дозу как РДФ2. Однако случаи тяжелой гипотонии продолжали появляться. Экспрессия gp100 в меланоцитах в коже обеспечивает значительную фракцию антиген-положительных клеток в самом большом органе организма. Мощное нацеливание на gp100-положительные клетки с помощью IMCgp100 приводит к перенаправлению активности Т-клеток на gp100-положительные меланоциты кожи. Это проявляется у пациентов как кожная токсичность. Анализы образцов сыворотки крови и биопсии пациентов демонстрируют локальное высвобождение цитокинов и хемокинов как в коже, так и в опухолях, в результате чего большой объем Т-клеток попадает из периферического кровообращения в ткани в течение чрезвычайно короткого промежутка времени; значительное перемещение жидкости, связанное с этой быстрой миграцией Т-клеток, приводит к гипотонии.

В первом аспекте настоящего изобретения предложено перенаправляющее Т-клетки биспецифичное терапевтическое средство, которое содержит (i) нацеливающий фрагмент, который связывает комплекс YLEPGPVTA-HLA-A2, гибридизированный с (ii) перенаправляющим Т-клетки фрагментом, связывающим CD3, для применения в способе лечения gp100-положительного рака у пациента, включающем введение указанному пациенту указанного биспецифичного терапевтического средства, при этом каждую дозу вводят каждые 5-10 дней, по меньшей мере первая и вторая дозы ниже 40 мкг, а вторая доза выше первой дозы.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили режим повышения дозы у одного и того же пациента, который обеспечивает улучшенную переносимость для лечения gp100-положительных опухолей биспецифичным терапевтическим средством, использующим механизм действия, опосредованный перенаправлением Т-клеток. В настоящем изобретении предложен режим увеличения дозировки, при котором побочные эффекты, такие как тяжелая гипотония, значительно снижены. Этот режим дозирования полезен для снижения тяжести токсичности, связанной с мишенью вне опухоли, у пациентов, и, соответственно, снижения необходимости для пациентов оставаться в больнице и/или поступать в реанимацию в течение первых нескольких недель лечения. Дополнительное и неожиданное преимущество заключается в том, что благодаря облегчению эффектов активности Т-клеток в отношении мишени вне опухоли путем применения этого режима дозирования пациенты впоследствии могут безопасно переносить более высокие общие уровни терапевтической дозы, чем существующая РДФ2, составляющая 50 мкг, что, как ожидается, приведет к улучшению клинической эффективности. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы изобретения предполагают, что ограничивающая дозу токсичность, вызывающая гипотонию, обусловлена уровнями экспозиции C_max биспецифичного терапевтического средства, наличием большого количества gp100-положительных меланоцитов в коже и степенью экспрессии опухолевого gp100 у пациента в отношении как тяжести болезни пациента, так и уровня экспрессии gp100 в опухолях пациента. Авторы изобретения полагают, что этот режим дозирования может сделать возможным достаточное разрушение меланоцитов нормальной кожи, экспрессирующих высокие уровни gp100, чтобы впоследствии обеспечить более безопасное введение более высоких терапевтических доз, что приводит к улучшенному нацеливанию на оставшиеся gp100-положительные опухолевые клетки и тем самым улучшает клиническую эффективность.

Авторы изобретения наблюдали, что пациенты с опухолями большего диаметра или более высокой общей тяжестью заболевания испытывали объективные опухолевые реакции при более высоких значениях общей экспозиции IMCgp100, чем пациенты с меньшим размером опухолей или меньшей тяжестью заболевания. На основании этих данных авторы предполагают, что повышенная экспозиция терапевтического средства в течение недель, следующих за снижением ранее ограничивавшей дозу токсичности благодаря использованию режима дозирования согласно изобретению, может привести к усилению ответа опухоли.

В настоящем изобретении биспецифичное терапевтическое средство можно вводить следующим образом:

(a) по меньшей мере одну первую дозу в диапазоне от 10 до 30 мкг;

(b) по меньшей мере одну вторую дозу в диапазоне от 20 до 40 мкг, где вторая или каждая повторная доза выше, чем первая доза; а затем

(c) по меньшей мере одну дозу по меньшей мере 50 мкг.

В настоящем изобретении соответствующие дозы можно выразить в виде определенной массы терапевтического средства, не зависящей от массы пациента или от того, будет ли введено такое же количество терапевтического средства, если рассчитывать одним из других методов, обычно используемых для расчета подходящей дозы для пациента. Например, массы терапевтического средства на кг массы тела, площади поверхности тела или мышечной массы и т.д. Предпочтительно, если указанную массу терапевтического средства вводят с недельными интервалами, например, в дни 1,8, 15, 22 и т.д. по терапевтической схеме, то интервал между введениями терапевтического средства может быть больше или меньше. Интервал между введениями терапевтического средства может зависеть от антигенсвязывающих характеристик Т-клеток, перенаправляющих биспецифичное терапевтическое средство, и от периода его полувыведения. Так, каждую дозу можно вводить каждые 6-9 или 6-8 дней. В предпочтительном варианте каждую дозу вводят каждые 7 дней. Соответствующие дозы могут быть разделены различными интервалами. В альтернативном варианте, дозы могут быть разделены одинаковыми интервалами.

Первая доза может находиться в диапазоне от 10 до 30 мкг. Она может находиться в диапазоне от 13 до 27 мкг, от 15 до 25 мкг или от 18 до 22 мкг. Доза может составлять 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мкг. Одна предпочтительная первая доза составляет 20 мкг, которые можно вводить еженедельно. Можно ввести одну первую дозу. В альтернативном варианте можно вводить более одной первой дозы, предпочтительно 2-5 первых доз и, более предпочтительно, две первые дозы. В предпочтительном варианте при введении двух или более первых доз они были одинаковыми. Но они могут быть и разными.

Вторая доза может находиться в диапазоне от 20 до 40 мкг и может быть выше, чем первая доза. Вторая доза может быть на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мкг выше, чем первая доза. Она может быть в диапазоне от 23 до 37 мкг, от 25 до 35 мкг или от 28 до 32 мкг. Последующая доза может составлять 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 мкг. Одна предпочтительная вторая доза составляет 30 мкг, которые можно вводить еженедельно. Можно ввести одну вторую дозу. В альтернативном варианте можно вводить более одной второй дозы, предпочтительно 2-5 вторых доз и более предпочтительно две вторые дозы. В предпочтительном варианте при введении двух или более вторых доз они одинаковы. Но они могут быть и разными.

Доза после второй дозы может составлять по меньшей мере 50 мкг. Оно может находиться в диапазоне от 50 до 300 мкг, от 50 до 250 мкг, от 50 до 200 мкг, от 50 до 150 мкг, от 50 до 100 мкг, от 50 до 90 мкг, от 50 до 80 мкг, от 50 до 70 мкг, или от 50 до 60 мкг. Доза может составлять по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 или 250 мкг. Одна предпочтительная доза после второй дозы составляет 50 мкг. Другая составляет 60 мкг, и еще одна составляет 70 мкг. Такую же дозу можно применить впоследствии. В альтернативном варианте дозу можно увеличить. Например, доза может быть выше на 5, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 мкг.

Первая доза может составлять 20 мкг, вторая доза может составлять 30 мкг и/или доза после второй дозы может составлять 50 мкг или более.

Перенаправляющее Т-клетки биспецифичное терапевтическое средство, применяемое в настоящем изобретении, содержит (i) нацеливающий фрагмент, который связывает комплекс YLEPGPVTA-HLA-A2, гибридизированный с (ii) перенаправляющим Т-клетки фрагментом, связывающим CD3.

Нацеливающий фрагмент может представлять собой рецептор Т-клеток (TCR). TCR описываются с использованием Международной иммуногенетической номенклатуры TCR (IMGT) и ссылки на общедоступную базу данных IMGT последовательностей TCR. Уникальные последовательности, определенные по номенклатуре IMGT, общеизвестны и доступны для тех, кто работает в области TCR. Например, их можно найти в "Т cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc & LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Приложение Lefranc, (2003), Leukemia 17 (1): 260-266 и на веб-сайте IMGT (www.IMGT.org)

TCR, которые можно применять в изобретении, могут иметь любой формат, известный специалистам в данной области техники. Например, TCR могут быть αβ гетеродимерами, или они могут быть в одноцепочечном формате (таком, как описано в WO 9918129). Одноцепочечные TCR включают полипептиды αβ TCR типа: Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ или Vα-Cα-L-Vβ-Cβ, необязательно в обратной ориентации, где Vα и Vβ представляют собой вариабельные области TCR α и β соответственно, Сα и Cβ представляют собой константные области TCR α и β соответственно, a L представляет собой линкерную последовательность. TCR предпочтительно находится в растворимой форме (т.е. не имеет трансмембранных или цитоплазматических доменов). Для стабильности такие растворимые TCR предпочтительно имеют интродуцированную дисульфидную связь между остатками соответствующих константных доменов, как описано, например, в WO 03/020763. Предпочтительные TCR этого типа включают те, которые имеют последовательность константного домена TRAC1 и последовательность константного домена TRBC1 или TRBC2, за исключением того, что Thr 48 в TRAC1 и Ser 57 в TRBC1 или TRBC2 заменены остатками цистеина, причем указанные цистеины образуют дисульфидную связь между последовательностью константного домена TRAC1 и последовательностью константного домена TRBC1 или TRBC2 в TCR. Тем не менее они могут содержать альфа- и бета-цепи полной длины.

Альфа- и/или бета-цепи константного домена могут быть укорочены по сравнению нативными/ природными последовательностями TRAC/TRBC. Кроме того, TRAC/TRBC могут содержать модификации. Например, внеклеточная последовательность альфа-цепи может иметь по сравнению с нативной/встречающейся в природе TRAC модификацию, при которой аминокислота Т48 TRAC по нумерации IMGT заменена на С48. Подобным образом внеклеточная последовательность бета-цепи может иметь по сравнению с нативной/встречающейся в природе TRBC1 или TRBC2 модификацию, при которой S57 в TRBC1 или TRBC2 по нумерации IMGT заменена на С57. Эти замены цистеина по сравнению с нативными внеклеточными последовательностями альфа- и бета-цепей обеспечивают образование ненативной дисульфидной связи между цепями, которая стабилизирует рефолдированный растворимый TCR, то есть TCR, образованный путем рефолдинга внеклеточных альфа- и бета- цепей (WO 03/020763). Эта ненативная дисульфидная связь облегчает создание фагового дисплея правильно свернутых TCR (Li et al., Nat Biotechnol 2005 Mar; 23 (3): 349-54). Кроме того, применение растворимого TCR со стабильной дисульфидной связью дает возможность более удобной оценки аффинности связывания и периода полужизни связи. Альтернативные положения для образования ненативной дисульфидной связи описаны в WO 03/020763.

TCR, которые можно применять в изобретении, могут быть сконструированы так, чтобы включать мутации. Способы получения мутантных высокоаффинных вариантов TCR, такие как фаговый дисплей и сайт-направленный мутагенез, известны специалистам в данной области (например, см. WO 04/044004 и Li et al., Nat Biotechnol 2005 Mar; 23 (3): 349- 54).

TCR, которые можно применять в настоящем изобретении, могут иметь аффинность связывания и/или период полужизни в связанном состоянии с комплексом YLEPGPVTA-HLA-A2 по меньшей мере в два раза больше, чем у TCR, имеющего последовательность внеклеточной альфа-цепи SEQ ID No: 2 и последовательность внеклеточной бета-цепи SEQ ID No: 3. TCR, которые можно применять в изобретении, могут иметь K_D гомплекса ≤8 мкМ, ≤5 мкМ, ≤1 мкМ, ≤0,1 мкМ, ≤0,01 мкМ, ≤0,001 мкМ или ≤0,0001 мкМ и/или иметь период полужизни связи для комплекса ≥1,5 с, ≥3 с, ≥10 с, ≥20 с, ≥40 с, ≥60 с, ≥600 с, или ≥6000 с.

Предпочтительный K_D и/или период полужизни связи составляют приблизительно 10-100 рМ и приблизительно 6-48 часов, соответственно. В частности, предпочтительный K_D и/или период полужизни связи составляют приблизительно 24 рМ и приблизительно 24 часа, соответственно.

Аффинность связывания (обратно пропорциональная константе равновесия K_D) и период полужизни связи (выраженный как ) можно определять любым подходящим методом. Понятно, что удвоение аффинности TCR приводит к уменьшению K_D в два раза. рассчитывают как In2, разделенное на константу диссоциации (k_off). Таким образом, удвоение приводит к уменьшению k_off в два раза. Значения K_D и k_off для TCR обычно измеряют для растворимых форм TCR, то есть для тех форм, которые укорочены с удалением остатков гидрофобного трансмембранного домена. Таким образом, следует понимать, что TCR удовлетворяет требованиям к аффинности связывания и/или периоду полураспада связи для комплекса YLEPGPVTA-HLA-A2, если этим требованиям отвечает растворимая форма данного TCR. В предпочтительном случае аффинность связывания или период полужизни связи данного TCR измеряют несколько раз, например 3 или более раз, с применением одного и того же протокола анализа, и используют среднее значение результатов. В предпочтительном варианте реализации эти измерения проводят с использованием метода поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore) из Примера 3 WO 2011/001152. Эталонный TCR к gp100, имеющий последовательность внеклеточной альфа-цепи SEQ ID No: 2 и последовательность внеклеточной бета-цепи SEQ ID No: 3 - обладает K_D, равной приблизительно 19 мкМ, по результатам измерения этим методом, и k_off, составляющей приблизительно 1 с^-1 (т.е. приблизительно 0,7 с).

TCR, которые можно применять в изобретении, могут быть связаны с антителом к CD3 или функциональным фрагментом или вариантом указанного антитела к CD3, и могут быть такими, как описано в WO 2011/001152. Фрагменты и варианты/аналоги антител, которые пригодны для применения в композициях и способах, описанных в настоящем документе, включают, без ограничений, миниантитела, фрагменты Fab, фрагменты F(ab')₂, фрагменты dsFv и scFv, Нанотела™ (эти конструкты, продаваемые Ablynx (Бельгия), содержат синтетический одиночный вариабельный тяжелый домен иммуноглобулина, выделенный из антител верблюдовых (например, верблюда или ламы), и «доменные антитела» (Domantis (Бельгия), содержащие аффинный зрелый одиночный вариабельный тяжелый домен иммуноглобулина или вариабельный легкий домен иммуноглобулина).

Гибриды TCR-анти-CD3, которые можно применять в изобретении, содержат аминокислотную последовательность альфа-цепи TCR, выбранную из группы, состоящей из:

(i) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой S;

(ii) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой А;

(iii) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой G;

(iv) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой S, а С-конец альфа-цепи укорочен на 8 аминокислот от F196 до S203 включительно, на основе нумерации SEQ ID No: 2:

(v) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой А, а С-конец альфа-цепи укорочен на 8 аминокислот от F196 до S203 включительно, на основе нумерации SEQ ID No: 2;

(vi) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой G, а С-конец альфа-цепи укорочен на 8 аминокислот от F196 до S203 включительно, на основе нумерации SEQ ID No 2; и

аминокислотной последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 , которая выбрана

из группы, состоящей из:

(vii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой D и I, соответственно;

(viii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и I, соответственно;

(ix) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и Q, соответственно;

(x) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой D и I, соответственно, аминокислоты в положениях 108-131 заменены на RTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG (SEQ ID No: 6) и аминокислоты в положениях 254-258 заменены на GGEGGGSEGGGS (SEQ ID No: 7);

(xi) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой D и I, аминокислота в положении257 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой D и I, соответственно, аминокислота в положении 256 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xiii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой D и I, соответственно, аминокислота в положении 255 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xiv) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и Q, и где аминокислота в положении 257 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xv) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и Q, и где аминокислота в положении 256 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xvi) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и Q, и где аминокислота в положении 255 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xvii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и I, соответственно, и где аминокислота в положении 257 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xviii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и I, соответственно, и где аминокислота в положении 256 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xix) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и I, соответственно, и где аминокислота в положении 255 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

Примерами таких гибридов TCR-анти-CD3 являются TCR, в которых:

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (i), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (vii);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (i), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (x);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (vi), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (ix);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (v), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (viii);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (vi), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (vii);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (i), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xi);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (i), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xii);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (i), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xiii);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (vi), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xiv);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (vi), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xv);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (vi), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xvi);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (v), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xvii);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (v), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xviii);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (v), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xix);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (vi), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xi);

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (vi), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xii); и

аминокислотная последовательность альфа-цепи представляет собой (vi), а аминокислотная последовательность бета-цепь - анти-CD3 представляет собой (xiii).

Предпочтительный гибрид TCR-анти-CD3 имеет альфа- и бета-цепи SEQ ID NO: 4 и 5, соответственно. Предпочтительный гибрид TCR-анти-CD3 имеет аминокислотную последовательность альфа-цепи (v) и аминокислотную последовательность бета-цепь - анти-CD3 (viii).

В альтернативном варианте нацеливающий фрагмент может представлять собой антитело. Термин «антитело» в настоящем документе относится к молекулам иммуноглобулина и активным в иммунологическом отношении частям молекул иммуноглобулина, то есть молекулам, содержащим антигенсвязывающий сайт, который специфично связывает антиген, либо природный, либо частично или полностью синтезированный. Термин «антитело» включает фрагменты антител, производные, функциональные эквиваленты и гомологи антител, гуманизированные антитела, в том числе любой полипептид, содержащий связывающий домен иммуноглобулина, либо природный, либо полностью или частично синтетический, и любой полипептид или белок, имеющий связывающий домен, который представляет собой связывающий антитело домен или является гомологичным ему. Следовательно, сюда входят химерные молекулы, содержащие связывающий домен иммуноглобулина или его эквивалент, гибридизированный с другим полипептидом. Клонирование и экспрессия химерных антител описаны в ЕР-А-0120694 и ЕР-А-0125023. Гуманизированное антитело может представлять собой модифицированное антитело, имеющее вариабельные области не являющегося человеческим, например, мышиного антитела, и константную область человеческого антитела. Способы получения гуманизированных антител описаны, например, в патенте США №5225539. Примерами антител являются изотипы иммуноглобулинов (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA) и их изотипические подклассы; фрагменты, которые содержат антигенсвязывающий домен, такой как Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; и диатела. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Моноклональное антитело может упоминаться в настоящем документе как «МАТ» (mAb).

Можно взять антитело, например, моноклональное антитело, и применить технологию рекомбинантной ДНК для получения других антител или химерных молекул, которые сохраняют специфичность исходного антитела. Такие методы могут включать введение ДНК, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина или определяющие комплементарность участки (CDR), в константные области, или константные области плюс каркасные участки, другого иммуноглобулина (см., например, ЕР-А-184187, GB 2188638А или ЕР-А-239400). Гибридому (или другую клетку, которая вырабатывает антитела) можно подвергнуть генетической мутации или другим изменениям, которые могут менять или могут не менять специфичность связывания выработанных антител.

Показано, что фрагменты целого антитела могут выполнять функцию связывания антигенов. Примерами связывающих фрагментов являются (i) фрагмент Fab, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1; (ii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1; (iii) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного антитела; (iv) фрагмент dAb (Ward, ES et al., Nature. 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6), который состоит из домена VH; (v) изолированные участки CDR; (vi) фрагменты F(ab')2, бивалентный фрагмент, содержащий два связанных фрагмента Fab (vii) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), где домен VH и домен VL связаны пептидным линкером, который позволяет двум доменам соединяться с образованием антигенсвязывающего сайта (Bird etal., Science. 1988, октябрь 21; 242 (4877): 423-6; Huston et al., Proc Natl Acad Sci US A. 1988 Aвг.; 85 (16): 5879-83); (viii) биспецифичные одноцепочечные димеры Fv (PCT/US92/09965) и (ix) «диатела», мультивалентные или полиспецифичные фрагменты, сконструированные путем гибридизации генов (WO 94/13804; P. Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci US A. 1993 15 июля; 90 (14): 6444-8). Диатела представляют собой мультимеры полипептидов, причем каждый полипептид содержит первый домен, содержащий участок связывания легкой цепи иммуноглобулина, и второй домен, содержащий участок связывания тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом два домена связаны (например, с помощью пептидного линкера), но не способны соединяться друг с другом с образованием антигенсвязывающего сайта: антигенсвязывающие сайты образуются в результате соединения первого домена одного полипептида в мультимере со вторым доменом другого полипептида в мультимере (WO 94/13804). Если необходимо использовать биспецифичные антитела, они могут представлять собой обычные биспецифичные антитела, которые могут быть получены различными способами (Hollinger & Winter, Curr Opin Biotechnol. 1993 Aug; 4 (4): 446-9), например, получены химическим образом или из гибридных гибридом, или могут представлять собой любой из фрагментов биспецифичных антител, упомянутых выше. Может быть предпочтительным применять димеры или диатела scFv, а не целые антитела. Диатела и scFv могут быть сконструированы без участка Fc с применением только вариабельных доменов, что потенциально уменьшает последствия антиидиотипической реакции. Другие формы биспецифичных антител включают одноцепочечные «янусины», описанные в Traunecker et al., EMBO J. 1991 Dec; 10 (12): 3655-9). Можно также применять вместо биспецифичных целых антител биспецифичные диатела, поскольку их можно легко сконструировать и экспрессировать в Е. coli. Диатела (и многие другие полипептиды, такие как фрагменты антител) с подходящей специфичностью связывания можно легко отбирать из библиотек с применением фагового дисплея (WO 94/13804). Если одно плечо диатела нужно сохранять константным, например, со специфичностью к антигену X, можно создать библиотеку, в которой варьируется другое плечо, и выбрать антитело с соответствующей специфичностью. «Антигенсвязывающий домен» является частью антитела, которая содержит область, комплементарную части антигена или к всему антигену и специфично связывающуюся с указанной частью антигена или со всем антигеном. Если антиген большой, антитело может связываться только с определенной частью антигена, которую называют эпитопом. Антигенсвязывающий домен может быть образован одним или несколькими вариабельными доменами антител. Антигенсвязывающий домен может содержать вариабельный участок легкой цепи антитела (VL) и вариабельный участок тяжелой цепи антитела (VH).

Связывающий фрагмент может представлять собой TCR-подобную молекулу, выполненную с возможностью специфичного связывания комплекса пептид-ГКГС. Особенно предпочтительными являются антитела, имитирующие TCR, такие как, например, те, которые описаны в WO 2007143104 и Sergeeva et al., Blood. 2011 Apr 21; 117(16):4262-72 и/или Dahan and Reiter. Expert Rev Mol Med. 2012 фев. 24; 14: е6.

В объем настоящего изобретения также входят связывающие фрагменты на основе сконструированных (модифицированных) белковых каркасов. Белковые каркасы получают из стабильных, растворимых, природных белковых структур, которые модифицируют для получения сайта связывания представляющей интерес молекулы-мишени. Примеры сконструированных белковых каркасов включают аффитела на основе Z-домена стафилококкового белка А, который обеспечивает связывающий интерфейс на двух из своих а-спиралей (Nygren, FEBS J. 2008 Jun; 275 (11): 2668-76); антикалины, полученные из липокалинов, в которые встроены сайты связывания небольших лигандов в открытом конце укладки бета-бета-бочки (Skerra, FEBS J. 2008 Jun; 275 (11): 2677-83), нанотела и сконструированные белки с анкириновым повтором (DARPin), но не ограничиваются перечисленным. Сконструированные белковые каркасы обычно нацелены на связывание тех же самых антигенных белков, что и антитела, и являются потенциальными терапевтическими агентами. Они могут действовать как ингибиторы или антагонисты, или как средства доставки целевых молекул, таких как токсины, в определенную ткань in vivo (Gebauer and Skerra, Curr Opin Chem Biol. 2009 Jun; 13 (3): 245- 55). Для связывания целевого белка можно также использовать короткие пептиды. Филомеры представляют собой природные структурированные пептиды, полученные из бактериальных геномов. Такие пептиды демонстрируют разнообразие структурных укладок белка, и их можно применять с целью ингибирования/нарушения взаимодействий белок-белок in vivo (Watt, Nat Biotechnol. 2006 Feb; 24 (2): 177-83)].

Как описано выше в отношении TCR, перенаправляющий Т-клетки фрагмент, связывающий CD3, может представлять собой антитело к CD3 или функциональный фрагмент или вариант указанного антитела к CD3, и может быть таким, как описано в WO 2011/001152.

В одном варианте реализации настоящего изобретения способ включает введение пациенту дозы не более чем 20 мкг перенаправляющего Т-клетки биспецифичного терапевтического средства в неделю 1, дозы не более чем 30 мкг в неделю 2 и дозы по меньшей мере 50 мкг в неделю 3 и в последующие недели, где TCR-фрагмент биспецифичного терапевтического средства связан с перенаправляющим Т-клетки антителом к CD3 или его фрагментом и имеет аффинность связывания и/или период полужизни связи в комплексе YLEPGPVTA-HLA-A2 по меньшей мере вдвое выше, чем у TCR, имеющего последовательность внеклеточной альфа-цепи SEQ ID No: 2 и последовательность внеклеточной бета-цепи SEQ ID No: 3.

Предпочтительно, если биспецифичное терапевтическое средство, перенаправляющее Т-клетки, вводят посредством внутривенной инфузии. Альтернативные пути введения включают другие парентеральные пути, такие как подкожная или внутримышечная инфузия, энтеральный (включая пероральный или ректальный), ингаляционный или интраназальный пути.

Биспецифичное терапевтическое средство для применения в настоящем изобретении можно вводить в виде монотерапии. В альтернативном варианте его можно вводить в комбинации с одним или несколькими противораковыми средствами, предпочтительно иммуномодулирующими средствами. Потенциал для дополнительной иммунной активации с помощью комбинированной терапии повышает риск токсичности, связанной с мишенью вне опухоли. Такие средства включают:

- химиотерапевтические агенты, такие как дакарбазин и темозоламид,

- иммунотерапевтические агенты, такие как интерлейкин-2 (IL-2) и интерферон (IFN)

- ингибиторы контрольных точек, такие как агенты, мишенью которых является PD-1 или PD-L1, например, пембролизумаб, ниволумаб, атезолизумаб, авелумаб и дурвалумаб, и агенты, мишенью которых является CTLA-4, такие как ипилимумаб и тремелимумаб,

- ингибиторы BRAF, такие как вемурафениб и дабрафениб,

- ингибиторы MEK, такие как траметиниб,

- ингибиторы TGF-β-1668, такие как галунизертиб,

- Ингибиторы МЕТ киназы, такие как мерестиниб.

В предпочтительной комбинированной терапии применяют дурвалумаб, тремелимумаб, галунизертиб и мерестиниб в сочетании с биспецифичным терапевтическим средством, перенаправляющим Т-клетки, описанным выше. Если мерестиниб - см. WO 2010011538 или аналогичный амидофеноксииндазол, как описано в данном документе, используют в сочетании с биспецифичным терапевтическим средством, доза мерестиниба может составлять от 40 до 120 мг один раз в день, предпочтительно в диапазоне от 80 до 120 мг один раз в день.

Биспецифичное терапевтическое средство можно вводить отдельно при первой и последующих дозах, с дополнительными терапевтическими агентами, добавляемыми после этого, или наоборот. В вариантах реализации настоящего изобретения, в которых биспецифичное терапевтическое средство, перенаправляющее Т-клетки, и другую терапию рака применяют в комбинации, биспецифичное терапевтическое средство, перенаправляющее Т-клетки, можно вводить отдельно в недели 1 и 2, а другую терапию добавляют в 3-ю и последующие недели.

Комбинированная терапия может приводить к усилению иммунной активации, включая секрецию цитокинов и хемокинов, а также к миграции лимфоцитов и, следовательно, к увеличению риска побочных эффектов, таких как тяжелая гипотензия. Соответственно, дозу биспецифичного терапевтического средства, перенаправляющего Т-клетки, можно первоначально вводить в виде отдельного агента перед комбинированным введением. В предпочтительном варианте реализации дозу не более 20 мкг вводят в неделю 1, дозу не более 30 мкг вводят в неделю 2, и дозу по меньшей мере 50 мкг вводят в неделю 3 и в последующие недели. Введение одной или нескольких дополнительных иммуномодулирующих терапий можно назначать с недели 3.

Настоящее изобретение относится к лечению gp100-положительного рака. Одним из таких видов рака является меланома. Злокачественная меланома продолжает представлять собой серьезную проблему общественного здравоохранения во всем мире. По оценкам, в 2016 году в Соединенных Штатах Америки будет диагностировано почти 76000 новых случаев меланомы, и ожидается, что почти 10000 человек умрут от меланомы (Статистика Американского онкологического общества, 2016). Кроме того, частота постановки диагноза «меланома» продолжает возрастать значительными темпами; согласно данным исследования 2015 Surveillance средний уровень заболеваемости ежегодно повышался на 1,4% в течение последнего десятилетия, и в настоящее время меланома является пятым по частоте раковым диагнозом в Соединенных Штатах. Хотя прогноз для пациентов с ранней стадией заболевания после хирургической резекции является хорошим, с прогрессированием заболевания средняя выживаемость быстро падает и снижается до менее чем одного года у пациентов с дистальным метастазированием (Garbe et al., Oncologist 2011; 16: 5 24). Рост частоты случаев меланомы в сочетании с плохими исходами при стандартной химиотерапии и ранними сигналами при иммунотерапии стимулировали интенсивные исследования новых подходов и комбинаций для усиления противоопухолевого иммунного ответа.

Меланома, которую можно лечить согласно изобретению, может представлять собой кожную меланому или увеальную меланому (также известную как глазная меланома). В альтернативном варианте она может представлять собой любую из меланомы «злокачественное лентиго», поверхностно распространяющейся меланомы, акральной лентигиозной меланомы, меланомы слизистых оболочек, узловой меланомы, полиповидной меланомы, десмопластической меланомы, беспигментной меланомы, меланомы мягких тканей, мелкоклеточной меланомы с мелкими невусоподобными клетками и меланомы с признаками невуса Шпица.

Меланома, которую лечат, обычно представляет собой заболевание поздней стадии (прогрессирующее заболевание), для которого обычно характерны метастатические поражения. Например, стадия III и/или стадия IV (Balch et al., J Clin Oncol 2009; 27: 6199-206).

Увеальная меланома (УМ) - это редкий тип меланомы, который в биологическом отношении отличается от кожной меланомы. УМ - чрезвычайно злокачественное новообразование, которое поражает сосудистые слои глаза (радужную оболочку, ресничное тело и сосудистую оболочку). Несмотря на малую частоту встречаемости (составляет приблизительно 3% случаев меланомы, приблизительно 4000 случаев во всем мире в год), (Papastefanou et al., (2011) J Skin Cancer; 2011: 573974). Супрессивное окружение и отсутствие активности ингибирования контрольной точки в УМ позволяют предположить, что мобилизация активированных Т-клеток, направленных на опухоль, может обладать противоопухолевой активностью в случае этого заболевания.

Как упомянуто выше, есть литературные данные, что другие, отличные от меланомы виды рака, являются gp100-положительными, примерами этого являются светлоклеточная саркома и раковые заболевания нервной системы, такие как некоторые глиомы. Настоящее изобретение можно применять для лечения таких раковых заболеваний.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения gp100-положительного рака у пациента, включающий введение указанному пациенту биспецифичного терапевтического средства, перенаправляющего Т-клетки, при этом каждую дозу вводят каждые 5-10 дней, по меньшей мере, первая и вторая дозы ниже 40 мкг, а вторая доза выше первой дозы.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено биспецифичное терапевтическое средство, перенаправляющее Т-клетки, которое включает (i) нацеливающий фрагмент, который связывает комплекс YLEPGPVTA-HLA-A2, гибридизированный с (ii) перенаправляющим Т-клетки фрагментом, связывающим CD3. для применения в способе лечения gp100-положительного рака у пациента, включающем следующие последовательные этапы:

(a) введение пациенту еженедельной дозы биспецифичного терапевтического средства в диапазоне от 10 до 30 мкг;

(b) (i) если пациент испытывает связанную с лечением гипотонию степени 1 или ниже, увеличение вводимой пациенту дозы до еженедельной дозы биспецифичного терапевтического средства в диапазоне от 20 до 40 мкг, или

(b) (ii) если пациент испытывает связанную с лечением гипотонию степени 2 или выше, продолжение введения пациенту еженедельной дозы биспецифичного терапевтического средства в диапазоне от 10 до 30 мкг до тех пор, пока пациент не достигнет степени 1 или ниже связанной с лечением гипотонии, а затем увеличение вводимой пациенту дозы до еженедельной дозы биспецифичного терапевтического средства в диапазоне от 20 до 40 мкг; и

(c) (i) если пациент испытывает связанную с лечением гипотонию степени 1 или ниже, увеличение вводимой пациенту дозы до еженедельной дозы по меньшей мере 50 мкг биспецифичного терапевтического средства или

(c) (ii) если пациент испытывает связанную с лечением гипотонию степени 2 или выше, продолжение введения пациенту еженедельной дозы биспецифичного терапевтического средства в диапазоне от 20 до 40 мкг до тех пор, пока пациент не достигнет степени 1 или ниже связанной с лечением гипотонии, а затем увеличение вводимой пациенту дозы до еженедельной дозы по меньшей мере 50 мкг биспецифичного терапевтического средства.

В этом аспекте способ может дополнительно включать, между этапами (b) и (с), этап:

(d) (i) если пациент испытывает связанную с лечением гипотонию степени 1 или ниже, увеличение вводимой пациенту дозы до еженедельной дозы биспецифичного терапевтического средства в диапазоне от 30 до 45 мкг, или

(d) (ii) если пациент испытывает связанную с лечением гипотонию степени 2 или выше, продолжение введения пациенту еженедельной дозы биспецифичного терапевтического средства в диапазоне от 20 до 40 мкг до тех пор, пока пациент не достигнет степени 1 или ниже связанной с лечением гипотонии, а затем увеличение вводимой пациенту дозы до еженедельной дозы биспецифичного терапевтического средства в диапазоне от 30 до 45 мкг.

Степень гипотонии может оценить врач.

Предпочтительные признаки каждого аспекта изобретения являются такими же, как для каждого из других аспектов, с соответствующими изменениями. Следует понимать, что конкретные признаки изобретения, которые для наглядности описаны в контексте отдельных вариантов реализации, также могут быть предложены в комбинации в одном варианте реализации. Наоборот, различные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта реализации, также могут быть предложены отдельно или в любой подходящей подкомбинации. Все комбинации вариантов реализации, относящиеся к перенаправляющему Т-клетки биспецифичному терапевтическому средству для применения и способу лечения gp100-положительного рака, особо включены в объем настоящего изобретения и описаны в настоящем документе, как если бы каждая отдельная комбинация была описана индивидуально и в явной форме. Упомянутые здесь опубликованные документы включены в полном объеме, разрешенном законом. Цитирование или идентификация любого документа в этой заявке не является признанием того, что такой документ доступен в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.

В настоящем документе сделана ссылка на прилагаемые чертежи, на которых:

На Фигуре 1 показана аминокислотная последовательность альфа-цепи внеклеточного домена эталонного TCR gp100 (SEQ ID No; 2);

На Фигуре 2 показана аминокислотная последовательность бета-цепи внеклеточного домена эталонного TCR gp100 (SEQ ID No; 3);

На Фигуре 3 показана аминокислотная последовательность α-цепи gp100-специфичного TCR (SEQ ID No: 4);

Ha Фигуре 4 показана аминокислотная последовательность фрагмента анти-CD3 scFv-антитела (жирный шрифт), гибридизированного посредством линкера, а именно GGGGS (подчеркнуто), на N-конце gp100-специфичной β-цепи TCR (SEQ ID No 5);

На Фигуре 5 показано возникновение токсичности, включая тяжелую и/или серьезную гипотонию, относительно количества доз IMCgp100;

На Фигуре 6 показана миграция лимфоцитов с периферии после первой дозы IMCgp100;

На Фигуре 7 показана пролиферация Т-клеток с IMCgp100 в присутствии или в отсутствие анти-CTLA-4;

На Фигуре 8 показана пролиферация Т-клеток с IMCgp100 в присутствии или в отсутствие анти-PD-L1;

На Фигуре 9 показана секреция цитокинов IFNγ, TNFα и IL-2 с IMCgp100 в присутствии или в отсутствие анти-CTLA-4; и

На Фигуре 10 показана секреция цитокина IFNγ с IMCgp100 в присутствии или в отсутствие анти-CTLA-4.

Примеры

Пример 1 - Определение режима дозирования для IMCgp100, который уменьшает тяжелую гипотензию, связанную с приемом лекарств, и позволяет увеличить верхнюю дозу.

IMCgp100 представляет собой перенаправлющий Т-клетки биспецифичный агент, который содержит растворимый TCR с повышенной аффинностью, связывающийся с комплексом пептид YLEPGPVTA -HLA-A * 02, гибридизированным с анти-CD3 scFv. [альфа- и бета-цепи IMCgp100 представляют собой SEQ ID NO: 4 и 5 соответственно] IMCgp100 исследовали в первом проведенном на людях (FIH) открытом исследовании с выявлением дозы, посвященном оценке безопасности и переносимости IMCgp100 у пациентов с прогрессирующей злокачественной меланомой (идентификатор клинических исследований: NCT01211262). Исследование разработали с целью определения максимальной переносимой дозы (МПД) или рекомендуемой дозы фазы II (РДФ2) IMCgp100 в 2 режимах с повторным дозированием: (группа 1) еженедельное дозирование (РДФ2-QW) и (группа 2) ежедневное дозирование × 4 дня (РДФ2-QD).

В исследование включили пациентов со стадией IV или нерезектабельной стадией III злокачественной меланомы. Все пациенты были HLA-A * 02-положительными, были старше 18 лет и были классифицированы как имеющие измеряемые проявления заболевания в соответствии с критериями RECIST 1.1, ожидаемую продолжительность жизни, превышающую три месяца, и функциональный статус по оценке Восточной объединенной онкологической группы (ECOG). 1 или ниже. Ограничений на количество предшествующих методов лечения не было. У пациентов оценивали адекватность гематологической, почечной, печеночной и сердечной функции. Пациенты с симптоматическими метастазами в мозг были особо исключены из исследования. Лечение получили в общей сложности 84 пациента.

IMCgp100 вводили путем внутривенной инфузии с использованием регулируемой инфузионной помпы. Процедуры скрининга и тесты, определяющие соответствие требованиям, проводили не более чем за 14 дней до начала приема IMCgp100, за исключением HLA-типирования, МРТ-сканирования, офтальмологических, аудиологических и эхокардиологических тестов, которые проводили в течение 28 дней до начала приема. Все пациенты дали информированное согласие. Образцы крови для гематологического, биохимического и фармакокинетического (ФК) анализов были получены при скрининге, в день 1 до инфузии, через 4, 10 и 24 часа после начала инфузии и в дни 2, 8 и 30.

Еженедельное дозирование: Результаты повышения дозы

Для определения максимально переносимой дозы (МПД) следовали стандартному протоколу повышения дозы 3 +3 фазы I. Вкратце, дозу IMCgp100 увеличивали в когортах пациентов 3 (+3) до достижения соответствия критериям МПД или до достижения целевой предельной дозы. Повышение дозы осуществляли с трехкратным увеличением и переходом на модифицированную схему Фибоначчи в соответствии с профилем безопасности и ФК или в случае сообщения о дозолимитирующей токсичности (ДЛТ). МПД определяли как самый высокий уровень дозы, при котором ДЛТ наблюдали у более чем 33% пациентов, вошедших в исследование на этом уровне. ДЛТ наблюдали в течение 8-дневного периода после лечения и оценивали в соответствии со Стандартными терминологическими критериями нежелательных явлений (СТСАЕ) NCI версии 4.0. Временная лимфопения 3 или 4 степени и не представляющая угрозы для жизни кожная сыпь были исключены из дозолимитирующих критериев из-за ожидаемых фармакологических эффектов препарата.

Во время повышения дозы 31 пациент проходил лечение в восьми дозовых когортах и получал от 5 нг/кг до 900 нг/кг препарата. Дозолимитирующую токсичность (ДЛТ) гипотонии 3 или 4 степени наблюдали у четырех пациентов во время повышения дозы при 405 нг/кг (n=1 из 6), 600 нг/кг (n=1 из 6) и 900 нг/кг (n=2 из 6). В 3 из 4 случаев ДЛТ с гипотонией 3 или 4 степени явление произошло после первой дозы IMCgp100 приблизительно через 12-18 часов после введения дозы; 1 явление ДЛТ с гипотонией произошло со второй дозой в 405 нг/кг у пациента, получавшего сопутствующую противогипертоническую терапию. Гипотонию в этих 4 случаях лечили внутривенными жидкостями (инфузии коллоидного раствора и физиологического раствора натрия хлорида); ни у одного из пациентов не было необходимости в фармакологической (инотропной) поддержке артериального давления, и все получали внутривенную терапию кортикостероидами. Все случаи гипотонии 3 или 4 степени были устранены с помощью инфузионной терапии и внутривенной кортикостероидной терапии в течение 2 дней.

На основании этих данных МПД при еженедельном дозировании установили на уровне 600 нг/кг.

Еженедельное дозирование: Результаты когорты РДФ2-QW

Обзор данных по безопасности и ФК по когортам с еженедельным повышением дозы показал, что более тяжелые токсические эффекты и более высокое терапевтическое воздействие IMCgp100 были связаны с введением более высоких абсолютных значений доз. На основании этих данных и диапазона абсолютных значений доз, вводимых при МПД 600 нг/кг (n=5 баллов, диапазон 34-66 мкг QW, медианная доза 54 мкг), рекомендуемую дозу фазы 2 с режимом еженедельного дозирования (обозначенная РДФ2-QW) первоначально определили как фиксированную дозу 50 мкг, вводимую еженедельно.

В течение этого времени еще три пациента испытали нежелательные явления, связанные с гипотонией 2 степени или выше. Эти явления наблюдали в промежуток времени, ограниченный первыми двумя дозами (например, цикл 1 день 1 (Ц1Д1) и цикл 1 день 8 (Ц1Д8)) (Фигура 5). В попытке избежать явлений тяжелой гипотонии первую дозу IMCgp100 впоследствии уменьшили до 40 мкг; однако гипотению (в степени 3/4) наблюдали еще у двух пациентов после введения доз в Ц1Д1 и/или Ц1Д8; у одного пациента гипотению 2 степени наблюдали также после третьей дозы. Случаи тяжелой гипотонии после последующих доз зарегистрированы не были. Следует отметить, что авторы изобретения наблюдали связь между частотой и тяжестью гипотонии и уровнем экспрессии gp100 в опухолях пациента, при этом пациенты с увеальной меланомой имели особенно высокие уровни экспрессии gp100 и, следовательно, более высокий риск токсичности.

Дополнительно 7 пациентов (6 с увеальной и 1 с кожной меланомой), имевшие высокий риск токсичности из-за высокого уровня экспрессии gp100 в опухолях, были включены в фазу с еженедельным расширением дозы, с получением первой дозы 20 мкг (Ц1Д1), затем второй дозы 30 мкг (Ц1Д8) и, наконец, с переходом к фиксированной дозе 50 мкг при третьей и последующих дозах. Неожиданным образом, у этих 7 пациентов не была зарегистрирована тяжелая гипотония (степень 3/4), несмотря на более высокий риск возникновения токсичности, опосредованной экспрессией gp100.

В приведенной ниже Таблице 2 обобщены три использованных в исследовании режима дозирования, количество пациентов, получавших лечение по каждому режиму, и количество зарегистрированных нежелательных явлений гипотонии.

Эти данные демонстрируют неожиданное преимущество двухэтапного режима повышения дозы у одного и того же пациента в отношении облегчения связанной с терапевтическими средствами тяжелой гипотонии при лечении пациентов с gp100-положительным раком.

Гипотония возникает в результате миграции лимфоцитов и высвобождения цитокинов

Анализ крови подгруппы пациентов, которым еженедельно вводили РДФ2, показал заметную миграцию лимфоцитов после введения IMCgp100. Уровни лимфоцитов существенно падали примерно через 12-24 часа после инфузии, возвращаясь на День 8 к исходным уровням. Этот эффект был более глубоким в случаях с тяжелой и/или серьезной гипотонией (Фигура 6). Анализ цитокинов выявил умеренные уровни одного или более воспалительных цитокинов. На периферии наибольшее повышение наблюдали по уровням тканевых хемоаттрактантов хемокинов, параллельное временному падению лимфоциов в периферийно 1 системе кровообращения, которые обычно приходили в норму через 48 часов после введения дозы и достигали уровней до введения дозы на День 8.

Дальнейшее исследование режима дозирования у одного и того же пациента В ретроспективном обзоре данных опухолевого ответа у пациентов, которые получали лечение в вышеуказанном исследовании Фазы 1, в целом отмечалось, что объективные ответы наблюдали у пациентов, которые получали более высокие абсолютные значения доз (приблизительно 65-85 мкг). Поэтому выдвинули гипотезу, что применение 20 мкг в Ц1Д1 и 30 мкг в Ц1Д1 может обеспечить более высокие абсолютные значения доз, т.е. свыше 50 мкг, в в Цикле 1 День 15 (Ц1Д15) и далее, и потенциально улучшить эффективность.

Чтобы проверить это, IMCgp100 дополнительно исследуют в продолжающемся открытом многоцентровом исследовании I фазы у пациентов с прогрессирующей увеальной меланомой (идентификатор клинического исследования: NCT02570308). Первая часть исследования соответствует стандартной схеме повышения дозы 3+3. Первая когорта пациентов получала IMCgp100 с помощью введения путем внутривенной инфузии фикчированной дозы 20 мкг в Ц1Д1 и 30 мкг в Ц1Д8, после чего следовало дозирование по 60 мкг, начиная с Ц1Д15. Первичные данные показывают, что явления, связанные с тяжелой гипотонией, у пациентов в этой когорте отсутствуют (n=3). Дополнительные когорты пациентов получат более высокие дозы в Ц1Д15 (например, 70 мкг, 80 мкг или выше).

Пример 2. Доказательства повышенного риска развития тяжелой гипотонии при введении IMCgp100 в комбинации с другими иммуномодулирующими препаратами.

IMCgp100-опосредованную иммунную активацию исследовали in vitro в присутствии или в отсутствие антител ингибитора контрольной точки к PD-L1/PD-1 и CTLA-4.

Повышенная эффективность ответа Т-клеток ответа при IMCgp100 в комбинации с анти-CTLA-4

В этом эксперименте в качестве показателя эффективности использовали пролиферацию Т-клеток. IMCgp100 использовали в концентрации 80 пМ в присутствии или в отсутствие 40 мкг/мл анти-CTLA-4 (клон L3D10; Biolegend). HLA-A * 02-положительные моноциты, в которые вводили 10 нМ или 100 нМ пептида gp100, использовали в качестве целевых антигенпрезентирующих клеток и высевали в количестве 10000 клеток/лунку. Эффекторные CD3 + Т-клетки метили с помощью Cell Tracker Violet. Пролиферацию Т-клеток измеряли через 5 дней с помощью анализа Intellicyt на основе FACS.

Результаты, представленные на Фигуре 7, показывают, что IMCgp100 в сочетании с анти-CTLA-4 приводит к усилению ответа Т-клеток (при более низких концентрациях пептида) по сравнению с IMCgp100 по отдельности, что указывает на потенциально более высокие уровни как эффективности, так и специфичности gp100 в отношении токсичности, связанной с мишенью вне опухоли, у пациентов, получавших лечение этой комбинацией, по сравнению с монотерапией IMCgp100.

Повышенная эффективность уничтожения посредством Т-клеток при IMCgp100 в комбинации с анти-CTLA-4

В этом эксперименте в качестве показателя эффективности использовали уничтожение посредством Т-клеток. IMCgp100 использовали в концентрации 80 пМ и 100 пМ в присутствии или в отсутствие 10 мкг/мл анти-PD-L1 (клон 29Е.2А3; BioLegend). HLA-A* 02-положительные клетки Mel624 использовали в качестве целевых антиген-презентирующих клеток. CD8 + Т-клетки использовали в качестве эффекторных клеток при соотношении эффектора и мишени 5:1. Уничтожение посредством Т-клеток измеряли с помощью анализа Incucyte ZOOM в течение 3 дней. Активацию каспазы-3/7 в клетках-мишенях отслеживали с помощью измерений апоптоза (визуализация каждые 2 часа).

Результаты, представленные на Фигуре 8, показывают, что IMCgp100 в сочетании с анти-PD-L1 приводит к усилению уничтожения посредством Т-клеток по сравнению с IMCgp100 по отдельности, что указывает на потенциально более высокие уровни как эффективности, так и специфичности gp100 в отношении токсичности, связанной с мишенью вне опухоли, у пациентов, получавших лечение этой комбинацией, по сравнению с монотерапией IMCgp100.

Повышенное образование провоспалительных цитокинов при IMCgp100 в комбинации с анти-CTLA-4 или анти-PD-L1

В этом эксперименте секрецию цитокинов оценивали с помощью провоспалительной человеческой панели 1 V-PLEX аналитического набора от Meso Scale Discovery.

Образцы супернатанта для IMCgp100 в комбинации с анти-CTLA-4 и анти-PD-L1 отбирали через 24 часа после анализа пролиферации и анализа уничтожения, соответственно.

Данные, показанные на Фигуре 9, демонстрируют повышенную секрецию IFNγ, TNFα и IL-2 (при низких концентрациях пептидов) в присутствии IMCgp100 и анти-CTLA-4, по сравнению с IMCgp100 в отдельности.

Данные, показанные на Фигуре 10, демонстрируют повышенную секрецию IFNγ в присутствии IMCgp100 и анти PD-L1, по сравнению с IMCgp100 в отдельности.

Эти данные демонстрируют повышенную иммунную активацию при комбинированной терапии IMCgp100 по сравнению с монотерапией IMCgp100 и, следовательно, потенциальный повышенный риск тяжелой гипотонии у пациентов, получающих комбинированную терапию, из-за целевого внеопухолевого адресного взаимодействия с gp100-положительными меланоцитами.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение перенаправляющего Т-клетки биспецифичного терапевтического средства для лечения gp100-положительного рака у пациента. Терапевтическое средство содержит нацеливающий фрагмент, который представляет собой рецептор Т-клеток и связывает комплекс YLEPGPVTA-HLA-A2, слитый с перенаправляющим Т-клетки фрагментом, представляющим собой антитело к CD3. Режим дозирования перенаправляющего Т-клетки биспецифичного терапевтического средства обеспечивает возможность лечения gp100-положительного рака с улучшенной переносимостью у пациента. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Применение перенаправляющего Т-клетки биспецифичного терапевтического средства, которое содержит (i) нацеливающий фрагмент, который связывает комплекс YLEPGPVTA-HLA-A2, слитый с (ii) перенаправляющим Т-клетки фрагментом, связывающим CD3, для лечения gp100-положительного рака у пациента, включающее введение указанному пациенту биспецифичного терапевтического средства в

(а) по меньшей мере одной первой дозе 20 мкг;

(b) по меньшей мере одной второй дозе 30 мкг; а затем

(с) по меньшей мере одной дозе по меньшей мере 50 мкг,

при этом каждую дозу вводят каждые 5-10 дней,

причем нацеливающий фрагмент представляет собой рецептор Т-клеток (TCR), который имеет аффинность связывания и/или период полужизни связи по отношению к комплексу YLEPGPVTA-HLA-A2 по меньшей мере в два раза больше, чем у TCR, имеющего последовательность внеклеточной альфа-цепи SEQ ID No: 2 и последовательность внеклеточной бета-цепи SEQ ID No: 3, и перенаправляющий Т-клетки фрагмент, связывающий CD3, представляет собой антитело к CD3

и при этом биспецифичное терапевтическое средство содержит аминокислотную последовательность альфа-цепи TCR, выбранную из группы, состоящей из:

(i) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой S;

(ii) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой A;

(iii) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой G;

(iv) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой S, а C-конец альфа-цепи укорочен на 8 аминокислот от F196 до S203 включительно, на основе нумерации SEQ ID No: 2;

(v) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой А, а C-конец альфа-цепи укорочен на 8 аминокислот от F196 до S203 включительно, на основе нумерации SEQ ID No: 2;

(vi) последовательности альфа-цепи TCR SEQ ID No: 2, где аминокислоты с 1 по 109 заменены последовательностью SEQ ID No: 4, при этом аминокислота в положении 1 представляет собой G, а C-конец альфа-цепи укорочен на 8 аминокислот от F196 до S203 включительно, на основе нумерации SEQ ID No 2; и

аминокислотной последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3, которая выбрана из группы, состоящей из:

(vii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой D и I, соответственно;

(viii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и I, соответственно;

(ix) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и Q соответственно;

(x) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой D и I, соответственно, аминокислоты в положениях 108-131 заменены на RTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG (SEQ ID No: 6) и аминокислоты в положениях 254-258 заменены на GGEGGGSEGGGS (SEQ ID No: 7);

(xi) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой D и I, соответственно, аминокислота в положении 257 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой D и I, соответственно, аминокислота в положении 256 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xiii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой D и I, соответственно, аминокислота в положении 255 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xiv) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и Q, и где аминокислота в положении 257 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xv) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и Q, и где аминокислота в положении 256 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xvi) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и Q, и где аминокислота в положении 255 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xvii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и I, соответственно, и где аминокислота в положении 257 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xviii) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и I, соответственно, и где аминокислота в положении 256 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G;

(xix) последовательности бета-цепь TCR - анти-CD3 SEQ ID No: 5, где аминокислоты в положениях 1 и 2 представляют собой A и I, соответственно, и где аминокислота в положении 255 представляет собой S, а аминокислота в положении 258 представляет собой G.

2. Применение по п. 1, характеризующееся тем, что каждую дозу вводят каждые 7 дней.

3. Применение по любому из пп. 1 или 2, характеризующееся тем, что вводят две вторые дозы.

4. Применение по любому из пп. 1-3, характеризующееся тем, что