АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С БЕЛКАМИ LRP5, И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 C12N15/13 C12N15/63 A61K39/395 A61K47/68 G01N33/53 A61P35/00 

Заявление о федерально-спонсируемом исследовании

[0001] Отсутствует.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0002] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки США 62/886913, поданной 14 августа 2019 г., содержание которой в полном объеме включено здесь посредством ссылки.

Названия сторон соглашения о совместных исследованиях

[0003] Отсутствуют.

Уровень техники

[0004] Сигнальный путь Wnt играет ключевую роль в регуляции различных клеточных процессов, таких как определение судьбы, пролиферация, выживаемость, полярность и миграция клетки¹. Нарушения либо в результате измененной экспрессии, либо в результате мутаций в сигнальном пути Wnt связаны с дефектами эмбрионального развития, а также с различными патологиями, такими как рак и остеопороз^2-4. Сигнальный путь Wnt приводит к активации канонических и неканонических сигнальных путей^1,5. Неканонический путь активирует сигнальные молекулы, которые не затрагивают ядро или транскрипцию, а в большей степени активируют цитоплазматические сигналы, регулирующие цитоскелет и запасы кальция. Данный путь в первую очередь играет роль в регуляции клеточной полярности или миграции. Канонический путь преимущественно контролирует транскрипционную активность, регулируя цитоплазматические уровни β-катенина. В условиях отсутствия стимуляции, бета-катенин связан с деструктивным комплексом, состоящим из аксина, APC, CK1 и GSK3b, что приводит к фосфорилированию, убиквитилированию и протеасомной деградации бета-катенина. Сигнальный путь Wnt дестабилизирует этот комплекс, что приводит к накоплению «свободного» бета-катенина в цитозоле, который перемещается в ядро и функционирует в качестве коактиватора транскрипции, опосредованной TCF/LEF. Wnt связываются с семейством frizzled из семи доменов трансмембранных рецепторов, а также либо с LRP5, либо с LRP6, что приводит к инициации канонического сигнального пути^6-8.

[0005] LRP5 и LRP6 представляют собой функционально дублирующие однопроходные трансмембранные рецепторы, которые имеют примерно 70% гомологию. Связывание лигандов Wnt с Fz и LRP5/6 приводит к рекрутменту деструктивного комплекса и растрепанных белков (Dsh/Dvl) и фосфорилированию LRP5/6 по мотивам PPPSPxS, расположенным во внутриклеточном домене⁹. Это фосфорилирование опосредовано GSK3b и CK1, что, в свою очередь, приводит к снижению активности GSK3b, ингибированию фосфорилирования бета-катенина и последующей протеосомной деградации и усилению транскрипционной активности, опосредованной TCF/LEF. LRP5 экспрессируется на высоком уровне во время эмбрионального развития и во взрослых тканях. Мутации в LRP5 ассоциировались с заболеваниями, характеризующимися снижением костной массы, и на нескольких мышиных моделях с нокаутом или мутациями LRP5 были обнаружены изменения в развитии костей¹⁰.

[0006] Также было показано, что экспрессия LRP5 повышается в злокачественных тканях человека и клеточных опухолевых линиях человека, таких как остеосаркома, и было показано, что сигнальный путь Wnt в таких клеточных линиях снижается со сверхэкспрессией доминантно-негативного LRP5^11-13. Более того, LRP5, по-видимому, также играет важную роль в регуляции активности клеточной инвазии и подвижности клеток^14-16. В то время как результаты исследований показали, что LRP6 более эффективен, чем LRP5, в сигнальном пути Wnt, данные недавних генетических экспериментов показали, что для некоторых лигандов Wnt необходимо присутствие обоих рецепторов для генерации канонического сигнала (17). За счет значения LRPS в регуляции сигнального пути Wnt и его установленной роли при некоторых заболеваниях человека, LRPS становится все более важной мишенью для разработки терапевтических препаратов. Существуют существенные биологические аспекты, связанные с LRP5 и его ролью в сигнальном пути Wnt и в патогенезе различных заболеваний, которые еще предстоит открыть, и обширная панель инструментов в виде синтетических антител поможет системно выявить эти функции, а также обеспечить дополнительные нацеленные терапевтические средства.

[0007] Сигнальный путь Wnt приводит к активации канонических и неканонических сигнальных путей. Неканонический путь активирует сигнальные молекулы, которые не затрагивают ядро или транскрипцию, а в большей степени активируют цитоплазматические сигналы, регулирующие цитоскелет и уровни кальция. Данный путь в первую очередь играет роль в регуляции клеточной полярности или миграции.

[0008] Канонический путь преимущественно контролирует транскрипционную активность, регулируя цитоплазматические уровни β-катенина. В условиях отсутствия стимуляции β-катенин связан с деструктивным комплексом, состоящим из аксина, APC, CD1 и GSK β, что приводит к фосфорилированию, убиквитилированию и протеасомной деградации β-катенина. Сигнальный путь Wnt активен, когда Wnt связывается с frizzled (FDZ), 7 проходными трансмембранными рецепторами, и с корецепторным белком, подобным рецептору липопротеинов низкой плотности (либо LRP5, либо LRP6). Данный сигнальный путь дестабилизирует комплекс, частично за счет привлечения растрепанных белков (Dsh/Dvl) к плазматической мембране, что приводит к накоплению β-катенина, который затем перемещается в ядро и активирует TCF/LEF-опосредованную транскрипцию.

[0009] Изобретение, описанное ниже, идентифицирует новый набор синтетических антител, нацеленных на внеклеточные эпитопы LRP5, с использованием библиотек антител и технологии фагового дисплея современного уровня техники.

Сущность изобретения

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с LRP5, содержащему вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность участки CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, вариабельная область легкой цепи содержит определяющие комплементарность участки CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, и с аминокислотными последовательностями указанных CDR, включающими или состоящими из последовательностей, выбранных из: наборов последовательностей CDR анти-LRP5 антител: LRP5-A7, LRP5 - A9, LRP5 - C5, LRP5 - C12, LRP5 - D9, LRP5 - E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6. В одном варианте осуществления аминокислотные последовательности указанных CDR содержат или состоят из последовательностей, выбранных из последовательностей, приведенных ниже: CDR-H1 выбран из группы, состоящей из LSYYYM, ISYSYI, LSYSSM, ISSYSI, ISYSYI, IYSYSI, LSYYYM, FSSSSI, LYYYYI, LSYSSI, IYSYYI, LLYYSSM и FSSSSI; CDR-H2 выбран из группы, состоящей из SIYPYYGYTY, SSSYYGYTY, SISSSYGYTY, SIYSSYGSTS, SIYSSYGYTY, SIYPYSSYTS, SIYSSYGYTY, SIYPSYGYTY, SISPYYGYTS, SISSSYGSTS, SIYSYYGYTY, SISSSYGYTY, SISSTSSYGYTY SISSYYSYTS и; CDR-H3 выбран из группы, состоящей из HGAM, TVRGSKKPYFSGWAM, SSYYSSVSSSVYAL, TVRGSKKPYFSGWAM, HYSYFFYAM, YAVYFPGYYWGM, WSHVSGHYSGM, WGAYHSSGYGM, GGSGVSHYGSVYYSWWAL, AAPYYGYYYSYAM, SGYGWYAM, GYWAI, SYPAM, SWAM; YWAL, GWGSPASAGYYGL, SSYYSSVSSSVYAL, TVRGSKKPYFSGWAM и TVRGSKKPYFSGWAM; CDR-L1 представляет собой SVSSA; CDR-L2 представляет собой SASSLYS; и CDR-L3 выбран из группы, состоящей из AWGWGLF, VHYSPYSLI, YQYSGLI, FSHVSLI, ASYSPI, YHYYYLF, ASYAPI, SSSSPI, SSYSLI, GVSLI, YWFLI, PVGHYGYPI, SSYSPI, YWAYYSPI, VSYYPLI, SSYSLI и VHYSPYSLI. В еще одном варианте осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: i) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, приведенную в таблице 2; ii) аминокислотную последовательность, по меньшей мере, с 50%, по меньшей мере, с 60%, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 80%, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере, с 95%, по меньшей мере, с 98% или, по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи, приведенной в таблице 2, где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, приведенных в таблице 1, или iii) консервативно замещенную аминокислотную последовательность по п. i), где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, приведенных в таблице 1. В еще одном варианте осуществления антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую: i) аминокислотную последовательность легкой цепи, приведенную в таблице 2, ii) аминокислотную последовательность, по меньшей мере, с 50%, по меньшей мере, с 60%, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 80%, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере, с 95%, по меньшей мере, с 98% или, по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью легкой цепи, приведенной в таблице 2, где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, приведенных в таблице 1, или iii) консервативно замещенную аминокислотную последовательность по п. i), где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, приведенных в таблице 1. В еще одном варианте осуществления последовательности CDR представляют собой полный набор последовательностей CDR, выбранных из антител, приведенных в таблице 1. В еще одном варианте осуществления антитело перекрестно реагирует с LRP6. В еще одном варианте осуществления последовательности CDR содержат набор последовательностей CDR легкой цепи или тяжелой цепи, выбранный из антител, приведенных в таблице 1. В еще одном варианте осуществления антитело специфически связывается с LRP5. В еще одном варианте осуществления последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR антитела, выбранного из антител LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5-E5, LRP5-G2, LRP5-G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6. В еще одном варианте осуществления антитело блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5. В еще одном варианте осуществления антитело связывается с лигандом Wnt с сайтом связывания в LRP5, отличным от Wnt3a. В еще одном варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В еще одном варианте осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело. В еще одном варианте осуществления антитело представляет собой одноцепочечное антитело. В еще одном варианте осуществления антитело представляет собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, выбранный из Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, dsFv, ds-scFv, димеров, нанотел, минител, в еще одном варианте осуществления антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое также связывается с рецептором FZD. В еще одном варианте осуществления антитело имеет неприродный паттерн гликозилирования. В еще одном варианте осуществления антитело содержит замену или добавление цистеина, например, в константной области или каркасной области.

[0010] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему антитело, обеспеченное здесь, и детектируемую метку или цитотоксический агент. В еще одном варианте осуществления иммуноконъюгат содержит цитотоксический агент, выбранный из майтанзиноида, ауристатина, доластатина, тубулизина, криптофицина, димера пирролобензодиазепина (PBD), димера индолинобензодиазепина, альфа-аманитина, трихотена, SN-38, дуокармицина, CC1065, калихеамицина, энедиинового антибиотика, таксана, производных доксорубицина, антрациклина и их стереоизомеров, азанофида, изостеров, аналогов или производных.

[0011] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, обеспеченное здесь. В одном варианте осуществления одна или более последовательностей CDR кодируются нуклеиновой кислотой, приведенной в таблице 2. В еще одном варианте осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодированную нуклеиновой кислотой, содержащей: i) последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, представленной в таблице 2; ii) нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, с 50%, по меньшей мере, с 60%, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 80%, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере, с 95%, по меньшей мере, с 98% или, по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, представленной в таблице 2, где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1; или iii) последовательность нуклеиновой кислоты с вырожденными кодонами по п. i), где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1. В еще одном варианте осуществления антитело содержит вариабельную область легкой цепи, кодированную нуклеиновой кислотой, содержащей: i) последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, представленную в таблице 2; ii) последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, с 50%, по меньшей мере, с 60%, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 80%, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере, с 95%, по меньшей мере, с 98% или, по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты легкой цепи, представленной в таблице 2, где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1; или iii) последовательность нуклеиновой кислоты с вырожденными кодонами по п.i), где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1.

[0012] В еще одном аспекте в настоящее изобретение относится к вектору, содержащему последовательность контроля экспрессии, оперативно связанную с нуклеиновой кислотой, обеспеченной здесь.

[0013] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность контроля экспрессии, оперативно связанную с нуклеиновой кислотой, обеспеченной здесь. В еще одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО).

[0014] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вектор.

[0015] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения анти-LRP5 антитела, включающему культивирование клетки-хозяина, обеспеченной здесь.

[0016] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитело, иммуноконъюгат, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или клетку-хозяин, обеспеченные здесь, необязательно с подходящим разбавителем. В одном варианте осуществления композиция содержит одно или более антител или иммуноконъюгатов, где необязательно композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

[0017] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему антитело, иммуноконъюгат, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или клетку-хозяин, обеспеченные здесь.

[0018] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу детектирования экспрессии LRP5, где способ включает приведение в контакт образца, содержащего одну или более клеток, с одним или более антителами или иммуноконъюгатами, обеспеченными здесь, в условиях, допускающих образование комплекса антитело:клетка, и детектирование наличие любого комплекса антитела. В одном варианте осуществления детектирование осуществляется с помощью иммунофлуоресценции. В еще одном варианте осуществления детектирование осуществляется с помощью проточной цитометрии. В еще одном варианте осуществления способ предназначен для детектирования экспрессии LRP4, и антитело или иммуноконъюгат содержат набор последовательностей CDR, соответствующий антителу, выбранному из LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5-E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[0019] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования связывания лиганда Wnt с рецептором LRP5, нарушения сигнального пути Wnt, ингибирования Wnt-индуцированной транскрипционной активности, ингибирования активации растрепанных белков, стимуляции сохранения деструктивного комплекса бета-катенина, стимуляции накопления бета-катенина или ингибирование роста клетки, где способ включает приведение в контактакт клетки, экспрессирующей рецептор LRP5, с антителом или иммуноконъюгатом, обеспеченными здесь. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу или иммуноконъюгату, обеспеченным здесь, для применения в ингибировании связывания лиганда Wnt с рецептором LRP5, нарушении сигнального пути Wnt, ингибировании Wnt-индуцированной транскрипционной активности, ингибировании активации растрепанных белков, стимуляции сохранения деструктивного комплекса бета-катенина, стимуляции накопления бета-катенина или ингибировании роста клетки. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению антитела или иммуноконъюгата, обеспеченным здесь, для ингибирования связывания лиганда Wnt с рецептором LRP5, нарушения сигнального пути Wnt, ингибирования Wnt-индуцированной транскрипционной активности, ингибирования активации растрепанных белков, стимуляции сохранения деструктивного комплекса бета-катенина, стимуляции накопления бета-катенина или ингибирование роста клетки. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению антитела или иммуноконъюгата, обеспеченным здесь, в производстве лекарственного средства для ингибирования связывания лиганда Wnt с рецептором LRP5, нарушения сигнального пути Wnt, ингибирования Wnt-индуцированной транскрипционной активности, ингибирования активации растрепанных белков, стимуляции сохранения деструктивного комплекса бета-катенина, стимуляции накопления бета-катенина или ингибирование роста клетки. В одном варианте осуществления антитело или иммуноконъюгат блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5. В еще одном варианте осуществления антитело или иммуноконъюгат блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5, отличным от Wnt3a. В еще одном варианте осуществления антитело или иммуноконъюгат содержит набор последовательностей CDR, соответствующий антителу, выбранному из LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5-E5, LRP5-G2, LRP5-G9, LRP5. - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[0020] В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело или иммуноконъюгат, обеспеченные здесь. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или иммуноконъюгат, обеспеченные здесь, для применения в лечении рака у субъекта, нуждающегося в этом. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей антитело или иммуноконъюгат, обеспеченные здесь, для лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей антитело или иммуноконъюгат, обеспеченные здесь, в производстве лекарственного средства для лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом. В еще одном варианте осуществления рак выбран из раковых клеток толстого кишечника, легкого, молочной железы, яичников, эндометрия, поджелудочной железы, желудка, печени, карциномы коры надпочечников и остеобластомы. В еще одном варианте осуществления рак выбран из острого миелоидного лейкоза, рака предстательной железы, глиобластомы, рака мочевого пузыря и рака шейки матки. В еще одном варианте осуществления способ включает введение субъекту первого и второго антител или конъюгатов антител, обеспеченных здесь, где первое блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5, и второе блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5, отличным от Wnt3a. В еще одном варианте осуществления первое антитело или иммуноконъюгат содержит набор последовательностей CDR, выбранных из антител группы эпитопов 2. В еще одном варианте осуществления антитело или иммуноконъюгат, которые специфически связываются с LRP5, по меньшей мере, в одном анализе, и ингибируют Wnt3a-индуцированный сигнальный путь, по меньшей мере, в одном анализе, где необязательно антитело или иммуноконъюгат представляет собой антитело или иммуноконъюгат, обеспеченные здесь. В еще одном варианте осуществления антитело или иммуноконъюгат содержит набор последовательностей CDR, соответствующий антителу, выбранному из LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5-E5, LRP5-G2, LRP5-G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[0021] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу усиления сигнальной активности связывания лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5, включающему приведение в контакт клетки, экспрессирующей LRP5, с антителом, которое блокирует связывание лигандов Wnt с сайтом связывания в LRP5, отличным от Wnt3a. В еще одном варианте осуществления способ проводят in vitro. В еще одном варианте осуществления способ проводят in vivo.

[0022] В еще одном настоящее изобретение относится к способу усиления сигнальной активности связывания лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5, отличным от Wnt3a, посредством приведения в контакт клетки, экспрессирующей LRP5, с антителом, которое блокирует связывание лигандов Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5. В одном варианте осуществления способ проводят in vitro. В другом варианте осуществления способ проводят in vivo.

Краткое описание фигур

[0023] Прилагаемые фигуры, которые включены в настоящее описание и составляют часть описания, иллюстрируют примерные варианты осуществления и вместе с описанием дополнительно служат для того, чтобы специалисты в данной области техники могли создавать и использовать эти и другие варианты осуществления, которые будут быть очевидным для специалистов в данной области. Изобретение будет более подробно описано со ссылками на следующие фигуры, где:

[0024] На фиг. 1А и 1В показаны шестнадцать (16) анти-LRP антител. (A) Представлены аминокислотные последовательности определяющих комплементарность участков (CDR) тяжелой (H) и легкой (L) цепей. Антитела сгруппированы в уникальные эпитопы, как определено с использованием конкурентного ELISA. (B) ELISA с одноточечной калибровкой проводили в 96-луночных иммунных планшетах Maxisorb, покрытых ECD мышиного LRP5, мышиного LRP6 и химерного человеческого LRP6. Планшеты инкубировали с очищенным Fab или IgG1 в указанных концентрациях с последующей инкубацией с антителом против каппа цепи, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP). Лунки промывали восемь раз с последующей инкубацией с субстратом 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин/H₂O₂ пероксидаза (ТМВ) в течение 5-10 мин. Реакцию останавливали добавлением 1М H₃PO₄ и спектрометрически измеряли оптическую плотность при 450 нм на ридере для микротитрационных планшетов.

[0025] На фиг. 2 приведены результаты анализа связывания IgG1 с LRP5 клеточной поверхности с использованием проточной цитометрии. LRP5 IgG (5 мкг/мл) тестировали на связывание с линией опухолевых клеток NSCLS, H23. Связывание анти-LRP5 IgG1 белков определяли с использованием вторичного антитела, конъюгированного с Alexa488, против F(ab’)₂. Окрашенная анти-LRP5 популяция показана зеленым цветом, и популяция, окрашенная только вторичным антителом, показана синим цветом.

[0026] На фиг. 3A-3D показано влияние LRP5 IgG на транскрипционную активность в опухолевых клетках. Репортерные анализы TCF/LEF проводили с использованием репортерной конструкции TOPflash (ген люциферазы светлячка) в клетках (A) MDAMB231, (B) T407D, (C) U2OS и (D) H23. Клетки высевали в 96-луночные планшеты с белыми стенками и белым дном, обработанные IgG в указанной концентрации в течение 1 ч перед стимуляцией кондиционированной средой. Клетки лизировали через 16-20 ч после стимуляции кондиционированной средой и репортерную активность оценивали измерением люминесцентного сигнала, генерированного добавлением люминесцентного реагента светлячка. Значения нормализовали к сигналу, наблюдаемому в клетках, обработанных антителом, представляющим собой отрицательный контроль, анти-MBP и стимулированных ConCM. Представленные данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов, где каждое условие представляет собой среднее значение трех повторов.

[0027] На фиг. 4А и 4В показано влияние LRP5-G2 и LRP5-G10 и Fab на транскрипционную активность в опухолевых клетках. Репортерные анализы TCF/LEF проводили с использованием репортерной конструкции TOPflash (ген люциферазы светлячка) в клетках H23, предварительно обработанных возрастающими концентрациями (A) анти-LRP IgG1 или (B) анти-LRP5 Fab. Исходную репортерную активность оценивали, как описано выше для фиг. 3.

[0028] На фиг. 5А и 5В показано влияние LRP5 IgG1 на сигнальный путь β-катенина. Линию клеток H23 предварительно обрабатывали LRP5 IgG (100 мМ) на указанные временные точки до стимуляции кондиционированной средой. (A) Получали полные лизаты цельных клеток или (B) мембранных и цитозольных фракций, и разделяли с использованием SDS/PAGE. Мембрану PVDF вырезали и подвергали иммуноблотингу на фосфорилированные LRP6, LRP5, LRP6, аксин 1, Dvl3 и β-катенин. Актин использовали в качестве контроля нагрузки для лизатов цельных клеток, тогда как Na/K-АТФазу и GAPDH использовали в качестве контроля нагрузки для мембранной и цитозольной фракций соответственно.

[0029] На фиг. 6 показан конкурентный ELISA с многоточечной калибровкой. Кривые доза-ответ и графики нелинейной регрессии относятся к анти-LRP-5 антителам.

[0030] На фиг. 7 приведены результаты анализа связывания IgG1 с LRP5 клеточной поверхности с использованием проточной цитометрии. LRP5 IgG (5 мкг/мл) тестировали на связывание с линией опухолевых клеток молочной железы, MDAMB231. Связывание анти-LRP5 IgG1 белков определяли с использованием вторичного антитела, конъюгированного с Alexa488, против F(ab’)₂. Окрашенная анти-LRP5 популяция показана зеленым цветом, и популяция, окрашенная только вторичным антителом, показана синим цветом.

[0031] На фиг. 8 приведены результаты анализа связывания IgG1 с LRP5 клеточной поверхности с использованием проточной цитометрии. LRP5 IgG (5 мкг/мл) тестировали на связывание с линией опухолевых клеток молочной железы, T47D. Связывание анти-LRP5 IgG1 белков определяли с использованием вторичного антитела, конъюгированного с Alexa488, против F(ab’)₂. Окрашенная анти-LRP5 популяция показана зеленым цветом, и популяция, окрашенная только вторичным антителом, показана синим цветом.

[0032] На фиг. 9 показана схема канонического сигнального пути Wnt.

Подробное описание изобретения

I. Определения

[0033] Если не указано иное, то научные и технические термины, используемые в настоящем раскрытии, имеют значения, обычно понимаемые специалистами в данной области техники. Кроме того, если иное не требуется по контексту, то термины в единственном числе включают множественное число, и термины во множественном числе включают единственное число. Например, термин «клетка» включает одну клетку, а также множество или популяцию клеток. В общем, номенклатуры, использованные в связи с культивированием клеток и тканей, молекулярной биологией, а также химией и гибридизацией белков и олигонуклеотидов или полинуклеотидов, и методы, описанные здесь, хорошо известны и обычно используются в данной области (см., например, Green and Sambrook, 2012).

[0034] В рамках настоящего изобретения, термин «полипептид» относится к молекуле, имеющей последовательность природных и/или неприродных аминокислот, соединенных пептидными связями. Термин «пептид» относится к короткому полипептиду, обычно не более 30 аминокислот в длину. Аминокислотная последовательность полипептида называется его «первичной структурой». Термин «белок» относится к полипептиду, имеющему вторичную, третичную и/или четвертичную структуру, например, структуры, стабилизированные водородными связями, ассоциации между вторичными структурами и структурами, образованными более чем одним белком. Белки могут быть дополнительно модифицированы другими присоединенными молекулами, такими как углеводы (гликопротеины), липиды (липопротеины), фосфатные группы (фосфопротеины) и т.п.

[0035] В рамках настоящего изобретения, аминокислотная последовательность «состоит из» только аминокислот в этой последовательности.

[0036] В рамках настоящего изобретения, первая аминокислотная последовательность «состоит по существу» из второй аминокислотной последовательности, если первая аминокислотная последовательность (1) содержит вторую аминокислотную последовательность и (2) является не более чем на 1, не более чем на 2 или не более чем на 3 аминокислоты длиннее второй аминокислотной последовательности.

[0037] В рамках настоящего изобретения, термин «первая аминокислотная последовательность» представляет собой «фрагмент» второй аминокислотной последовательности, если вторая аминокислотная последовательность содержит первую аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первая аминокислотная последовательность, которая является фрагментом второй аминокислотной последовательности, может содержать не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот меньше, чем вторая аминокислотная последовательность.

[0038] В рамках настоящего изобретения, термин «функциональный эквивалент» референсной аминокислотной последовательности представляет собой последовательность, которая не идентична референсной последовательности, но которая содержит незначительные изменения, например, такие как инсерция, делеция или замена одной или нескольких аминокислот. Функционально эквивалентная последовательность сохраняет функцию (например, иммуногенность) референсной последовательности, которой она эквивалентна. Если функционально эквивалентная аминокислотная последовательность содержит замену одной или нескольких аминокислот по сравнению с референсной последовательностью, то обычно это будут консервативные аминокислотные замены.

[0039] В рамках настоящего изобретения, термин «консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком без потери желаемых свойств белка. Подходящие консервативные аминокислотные замены могут быть сделаны посредством замены аминокислот с аналогичной гидрофобностью, полярностью и длиной R-цепи на другую аминокислоту. См., например, Watson et al., «Molecular Biology of the Gene», 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Menlo Park, CA, 224. Примеры консервативных аминокислотных замен включают следующие (следует обратить внимание, что некоторые категории не являются взаимоисключающими):

Консервативные замены Тип аминокислоты Замещаемые аминокислоты Гидрофильный Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr Сульфгидрильный Cys Алифатический (неполярный, гидрофобный) Ala, Val, Ile, Leu, Met, Gly, Pro Основный Lys, Arg, His Ароматический Phe, Tyr, Trp

[0040] В рамках настоящего изобретения, термин «по существу идентичные» относится к идентичности первой аминокислотной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное число аминокислотных остатков, которые представляют собой i) идентичные или ii) консервативные замены выровненных аминокислотных остатков во второй аминокислотной последовательности, так что первая и вторая аминокислотные последовательности имеют общий структурный домен, и/или общую функциональную активность, и/или общую иммуногенность. Например, аминокислотные последовательности, которые содержат общий структурный или антигенный домен, имеющие, по меньшей мере, примерно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, называются достаточно или по существу идентичными. В контексте нуклеотидной последовательности термин «по существу идентичные» используется здесь для обозначения первой последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит достаточное или минимальное число нуклеотидов, идентичных выровненным нуклеотидам во второй последовательности нуклеиновой кислоты, так что первая и вторая нуклеотидные последовательности кодируют полипептид, обладающий общей функциональной активностью, или кодируют общий структурный домен полипептида, или общую функциональную активность полипептида, или кодируют полипептиды, обладающие одинаковыми иммуногенными свойствами.

[0041] В рамках настоящего изобретения, термины «антиген», «иммуноген» и «антитело-мишень» относятся к молекуле, соединению или комплексу, которые распознаются антителом, т. е. могут связываться с антителом. Термин может относиться к любой молекуле, которая может распознаваться антителом, например, полипептиду, полинуклеотиду, углеводу, липиду, химическому соединению или их комбинациям (например, фосфорилированные или гликозилированные полипептиды и т. д.). Специалисту в данной области техники будет понятно, что данный термин не указывает на то, что молекула является иммуногенной в любом контексте, а просто указывает на то, что на нее может быть нацелено антитело.

[0042] В рамках настоящего изобретения, термин «эпитоп» относится к ограниченному участку на антигене, который распознается и связывается антителом. Эпитопы могут включать несколько аминокислот или участки из нескольких аминокислот, например, 5 или 6, или более, например, 20 или более аминокислот, или участки из этих аминокислот. В некоторых случаях эпитоп включает небелковые компоненты, например, из углевода, нуклеиновой кислоты или липида. В некоторых случаях эпитоп представляет собой трехмерную молекулу. Так, например, когда мишенью является белок, то эпитоп может состоять из последовательных аминокислот или аминокислот из разных частей белка, которые сближаются в результате фолдинга белка (например, прерывистый эпитоп).

[0043] В рамках настоящего изобретения, термин «антитело» относится к иммуноглобулину, который распознает и специфически связывается с одним или несколькими антигенами-мишенями, такими как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или их комбинации. Такое связывание происходит, по меньшей мере, через один сайт распознавания антигена в вариабельной области иммуноглобулина на одном или более эпитопах антигена. Вариабельная область имеет наиболее важное значение для специфичности связывания и аффинности. В рамках настоящего изобретения, термин «антитело» включает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, фрагменты антител, одноцепочечные мутанты Fv (scFv), мультиспецифические антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, гибридные антитела, слитые белки и любые другие иммуноглобулиновые молекулы, содержащие сайт распознавания антигена, при условии, что антитело проявляет желаемую биологическую активность. Антитела могут относиться к (i) любому из пяти основных классов иммуноглобулинов на основе идентичности их константных доменов тяжелой цепи - альфа (IgA), дельта (IgD), эпсилон (IgE), гамма (IgG) и мю (IgM) или (ii) их подклассам (изотипам) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2). Легкие цепи могут быть либо лямбда, либо каппа типа. Антитела могут быть «голыми» или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, лекарства, радиоизотопы, химиотерапевтические агенты и т. д.

[0044] В одном варианте осуществления «интактное антитело» содержит тетрамер, состоящий из двух идентичных пар полипептидных цепей, где каждая пара имеет одну «легкую» (примерно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (примерно 50-70 кДа). Тяжелая цепь и легкая цепь соединяются ковалентными и нековалентными связями (например, дисульфидной связью), число и количество которых варьируется между различными классами иммуноглобулинов. В одном аспекте каждая цепь содержит вариабельную область и константную область. Сайт распознавания антигена вариабельной области состоит из гипервариабельных областей или определяющих комплементарность участков (CDR), и каркасных областей. Каркасные области обычно не вступают в контакт с антигеном, но обеспечивают структурную поддержку для CDR. Константная область взаимодействует с другими иммунными клетками организма. Между константной и вариабельной областью (только IgG, IgD, IgA, но не IgM или IgE) находится шарнирная область в центре между двумя тяжелыми цепями, которая обеспечивает гибкость для координации связывания антигена.

[0045] Ниже приводится неисчерпывающий список различных форм антител, все из которых сохраняют антигенсвязывающую активность:

(1) целые иммуноглобулины (также называемые «интактными» антителами) (две легкие цепи и две тяжелые цепи, например, тетрамер);

(2) полипептид иммуноглобулина (легкая цепь или тяжелая цепь);

(3) фрагмент антитела, такой как Fv (моновалентный или двухвалентный фрагмент вариабельной области, и который может включать только вариабельные области (например, V_L и/или V_H), Fab (V_LC_L V_HC_H), F(ab')₂, Fv (V_LV_H), scFv (одноцепочечный Fv) (полипептид, содержащий V_L и V_H, соединенные линкером, например, пептидным линкером), (scFv)₂, sc(Fv)₂, биспецифический sc(Fv)₂, биспецифический (scFv)₂, минитело (sc(FV)₂, слитое с доменом CH3), триантитело представляет собой трехвалентный sc(Fv)₃ или триспецифический sc(Fv)₃;

(4) мультивалентное антитело (антитело, содержащее связывающие области, которые связывают с двумя разными эпитопами или белками, например, антитело типа «скорпион»);

(5) слитый белок, содержащий связывающий участок иммуноглобулина, слитый с другой аминокислотной последовательностью (такой как флуоресцентный белок).

[0046] В рамках настоящего изобретения, термин «фрагмент антитела» относится к части или участку антитела или цепи антитела, содержащей меньше аминокислотных остатков, чем интактное или полное антитело или цепь антитела, и который связывает антиген или конкурирует с интактным антителом. Фрагменты могут быть получены химической или ферментативной обработкой интактного или полного антитела или цепи антитела. Фрагменты также могут быть получены рекомбинантными способами. Например, фрагменты F(ab')₂ можно получить обработкой антитела пепсином. Фрагмент F(ab')₂ можно обработать для восстановления дисульфидных мостиков с образованием фрагментов Fab'. Расщепление папаином может привести к образованию фрагментов Fab. Fab, Fab' и F(ab')₂, scFv, dsFv, ds-scFv, димеры, минитела, диатела, фрагменты биспецифических антител и другие фрагменты также могут быть сконструированы методами рекомбинантной экспрессии.

[0047] Несмотря на то, что различные фрагменты антител определяются в с точки зрения продуктов расщепления интактного антитела, специалисту в данной области техники будет понятно, что такие фрагменты также можно синтезировать химически de novo или сконструировать и экспрессировать с использованием методов рекомбинантной ДНК.

[0048] Одноцепочечный Fv (scFv) относится к полипептиду, содержащему V_L и V_H, соединенные линкером, например, пептидным линкером. ScFv также можно использовать для образования тандемных (или двухвалентных) scFv или диател. Получение и свойства тандемных scFv и диател описаны, например, в публикациях Asano et al. (2011) J. Biol. Chem., 286:1812; Kenanova et al. (2010) Prot. Eng. Design Sel., 23:789; Asano et al. (2008) Prot. Eng. Design Sel., 21:597.

[0049] Фрагменты антител также включают Fd (участок тяжелой цепи, включенный в Fab-фрагмент) и однодоменные антитела. Однодоменное антитело (sdAb) представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, полученный рекомбинантными методами.

[0050] В рамках настоящего изобретения, выражение «набор последовательностей CDR» относится к 3 CDR тяжелой цепи и/или 3 CDR легкой цепи конкретного антитела, описанного здесь. Набор последовательностей CDR «легкой цепи» относится к последовательностям CDR легкой цепи. Набор последовательностей CDR «тяжелой цепи» относится к последовательностям CDR тяжелой цепи. «Полный» набор последовательностей CDR относится к последовательностям CDR как тяжелой, так и легкой цепи. Например, для антитела LRP5-A7, приведенного в таблице 1, полный набор последовательностей CDR содержит или состоит из SVSSA (CDR L1), SASSLYS (CDR L2), AWGWGLF (CDR L3), LYSSSM (CDR H1), SIYPYYGYTY (CDR H2) и HGAM (CDR H3). Последовательность CDR для каждого CDR может, например, содержать, состоять по существу или состоять из CDR, приведенного в таблице 1. CDR прогнозируются на основе выравнивания последовательностей IMGT.

[0051] В рамках настоящего изобретения, термин «моноклональное антитело» относится к клональному препарату или композиции антител с одной специфичностью связывания и аффинностью к определенному эпитопу на антигене («композиция моноклонального антитела»). «Поликлональное антитело» относится к препарату или композиции антител, которые продуцируются против одного антигена, но с различной специфичностью связывания и аффинностью («композиция поликлональных антител»).

[0052] В рамках настоящего изобретения, термин «химерное антитело» относится к антителу, имеющему аминокислотные последовательности, происходящие от двух или более видов. В одном варианте осуществления вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепи, соответствует вариабельной области антитела, происходящего от одного вида млекопитающего (например, мыши, крысы, кролика и т.д.) с требуемой специфичностью, аффинностью и активностью, в то время как константные области являются гомологичными последовательности, полученной от другого вида (как правило, у субъекта, получающего терапию, например, человека), чтобы избежать индукции иммунного ответа.

[0053] В рамках настоящего изобретения, термин «гуманизированное антитело» относится к химерному антителу, в котором CDR, полученные из областей VH и VL «нечеловеческого» антитела, обладающего желаемой специфичностью, аффинностью и активностью, привиты на последовательность человеческого каркаса. В одном варианте осуществления каркасные остатки гуманизированного антитела модифицируют для повышения и оптимизации специфичности, аффинности и активности антитела. Гуманизация, т.е. замена последовательностей «нечеловеческих» CDR на соответствующие последовательности человеческого антитела, может быть осуществлена в соответствии со способами, описанными, например, в патентах США № 5545806; 5569825; 5633425; 5661016; Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-51 (1996).

[0054] В рамках настоящего изобретения, термин «человеческое антитело» относится к антителу, продуцированному человеком, или к антителу, имеющему соответствующую ему аминокислотную последовательность, полученному любым способом, известным в данной области.

[0055] В рамках настоящего изобретения, термин «гибридное антитело» относится к антителу, в котором пары тяжелых и легких цепей образуют антитела с разными областями антигенных детерминант, собранные вместе, так что два разных эпитопа или два разных антигена могут распознаваться и связываться полученным тетрамером. Гибридные антитела могут быть биспецифическими (связывающие 2 разных антигена или эпитопа) или мультиспецифическими (> 1 разного антигена или эпитопа).

[0056] В рамках настоящего изобретения, антитело является «моноспецифическим», если все его антигенсвязывающие сайты связываются с одним и тем же эпитопом.

[0057] В рамках настоящего изобретения, антитело является «биспецифическим», если оно имеет, по меньшей мере, два разных антигенсвязывающих сайта, каждый из которых связывается с разным эпитопом или антигеном.

[0058] В рамках настоящего изобретения, антитело является «поливалентным», если оно имеет более одного антигенсвязывающего сайта. Например, четырехвалентное антитело имеет четыре антигенсвязывающих сайта.

[0059] Специфичность связывания может быть определена по значениям сравнительных констант диссоциации (Kd) антитела (или другой нацеливающей молекулы) для мишени по сравнению с константой диссоциации в отношении антитела и других соединений в окружающей среде или неродственным молекулам в целом. Большая (более высокая) K_d представляет собой K_d, которая описывает взаимодействие с более низкой аффинностью. Напротив, меньшая (более низкая) K_d представляет собой K_d, которая описывает взаимодействие с более высокой аффинностью или более прочным связыванием. Только в качестве примера, значение K_d для антитела, специфически связывающегося с мишенью, может быть на фемтомолярном, пикомолярном, наномолярном или микромолярном уровне, и K_d для антитела, связывающегося с неродственным соединением, может быть на миллимолярном уровне или выше. Аффинность связывания может находиться в микромолярном диапазоне (kD=от 10^-4 до 10^-6), наномольном диапазоне (kD=от 10^-7 M до 10^-9 M), пикомольном диапазоне (kD=от 10^-10 M до 10^-12 M), или в фемтомолярном диапазоне (kD=от 10^-13 М до 10^-15 М).

[0060] В рамках настоящего изобретения, антитело «связывает» или «узнает» антиген или эпитоп, если оно связывает антиген или эпитоп с Kd ниже 10^-4 М (т.е. в микромолярном диапазоне). Термин «связывается» по отношению к типу клеток (например, антитело, которое связывается с опухолевыми клетками), как правило, указывает на то, что агент связывается с большинством клеток в чистой популяции этих клеток. Например, антитело, которое связывается с данным типом клеток, обычно связывается, по меньшей мере, с 2/3 клеток в популяции указанных клеток (например, 67%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%). В некоторых случаях связывание с полипептидом можно оценить сравнением связывания антитела с клеткой, которая презентирует полипептид, со связыванием (или его отсутствием) антитела с клеткой, которая не экспрессирует полипептид. Специалисту будет понятно, что в зависимости от способа и/или порога определения связывания возникает некоторая вариабельность. Аффинность антитела к мишени можно определить в соответствии со способами, известными в данной области, например, как описано в обзоре Ernst et al. Determination of Equilibrium Dissociation Constants, Therapeutic Monoclonal Antibodies (Wiley & Sons, 2009 г.).

[0061] В рамках настоящего изобретения, термин «более высокая аффинность» относится к относительной степени связывания антитела, при которой антитело X связывается с мишенью Y более сильно (K_on) и/или с меньшей константой диссоциации (K_off), чем с мишенью Z, и в этом контексте антитело X имеет более высокую аффинность к мишени Y, чем к Z. Аналогично, термин «более низкая аффинность» в данном документе относится к степени связывания антитела, при которой антитело X связывается с мишенью Y менее сильно и/или с большей константой диссоциации, чем с мишенью Z, и в этом контексте антитело X имеет более низкую аффинность к мишени Y, чем к Z. Аффинность связывания между антителом и его антигеном-мишенью может быть выражена в виде K_A, равной 1/K_D, где K_D равно k_on/k_off. Значения k_on и k_off можно измерить с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием системы молекулярного скрининга аффинности (MASS-1) (Sierra Sensors GmbH, Hamburg, Германия). Антагонистическое или блокирующее антитело представляет собой антитело, которое частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность, связанную с антигеном-мишенью, по сравнению с активностью в аналогичных физиологических условиях, когда антитело отсутствует. Антагонисты могут быть конкурентными, неконкурентными или необратимыми. Конкурентный антагонист представляет собой соединение, которое связывается с природным лигандом или рецептором в том же сайте, что и взаимодействие природный лиганд-рецептор, или связывается аллостерически таким образом, что вызывает изменение, предотвращающее нормальное связывание. Неконкурентный антагонист связывается в другом сайте, чем взаимодействие природный лиганд-рецептор, но снижает KD или сигнал, возникающий в результате взаимодействия. Необратимый ингибитор вызывает ковалентные модификации рецептора, предотвращая любое последующее связывание.

[0062] В рамках настоящего изобретения, термин «авидность» относится к общей стабильности связывающего комплекса между антителом и антигеном-мишенью. Она определяется тремя факторами: (i) присущей аффинностью антитела к антигену, (2) валентностью антитела и (3) геометрическим расположением взаимодействующих компонентов. Аффинность представляет собой силу взаимодействия между антителом и одной мишенью, тогда как авидность представляет собой совокупную силу многочисленных аффинностей. В одном варианте осуществления антитела, раскрытые здесь, являются двухвалентными.

[0063] В рамках настоящего изобретения, термин антитело «предпочтительно связывает» означает, что оно связывает первый антиген по сравнению со вторым антигеном, если оно связывает первый антиген с более высокой аффинностью, чем второй антиген. Предпочтительное связывание может представлять собой, по меньшей мере, любое значение из 2-кратного, 5-кратного, 9-кратного, 10-кратного, 20-кратного, 30-кратного, 40-кратного, 50-кратного, 100-кратного, 500-кратного или 1000-кратного связывания. Так, например, антитело предпочтительно связывает LRP5 по сравнению с LRP6, если оно связывает LRP5 с более высокой аффинностью, чем связывает LRP6.

[0064] В рамках настоящего изобретения, антитело «специфически связывает» или является «специфическим в отношении» антигена-мишени или целевой группы антигенов, если оно связывается с антигеном-мишенью или каждым членом целевой группы антигенов с аффинностью, равной, по меньшей мере, любому значению из 1×10^-6 М, 1×10^-7 М, 1×10^-8 М, 1×10^-9 М, 1×10^-10 М, 1×10^-11 М, 1×10^-12 М и, например, связывается с антигеном-мишенью или каждым членом целевой группы антигенов с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза выше, чем его аффинность к нецелевым антигенам, с которыми его сравнивают. Как правило, специфическое связывание характеризуется связыванием антигена с достаточной аффинностью, чтобы антитело можно было использовать в качестве диагностического средства для детектирования антигена или эпитопа и/или в качестве терапевтического средства для нацеливания на антиген или эпитоп.

[0065] В рамках настоящего изобретения, термин «антитело» «блокирует» или «противодействует» связыванию лиганда с рецептором, когда оно конкурентно снижает или предотвращает взаимодействие всего лиганда с рецептором. В варианте осуществления измеренный уровень снижения может составлять, по меньшей мере, любое значение из 5%, 10%, 25%, 50%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, 99,5%, 99,9% от контрольного значения для (например, необработанной) клетки. Например, антитело, которое противодействует или блокирует связывание лиганда Wnt с рецептором LRP5, конкурентно уменьшает или предотвращает взаимодействие белка Wnt с рецептором LRP5. Это приводит к ослаблению или блокированию сигнального события в нисходящем направлении, связанного с сигнальным путем Wnt. Это включает, например, активацию растрепанных белков, растворение деструктивного комплекса β-катенина, более низкие цитозольные уровни β-катенина и/или более низкую активность транскрипции, опосредованной TCF/LEF.

[0066] Термин «захватывает» по отношению к мишени антитела (например, антигену, аналиту, иммунному комплексу) обычно указывает, что антитело связывает большинство мишеней антитела в чистой популяции (при условии соответствующих молярных соотношений). Например, антитело, которое связывается с данной мишенью антитела, обычно связывается, по меньшей мере, с 2/3 мишеней антитела в растворе (например, по меньшей мере, с любым из 67%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%). Специалисту будет понятно, что в зависимости от способа и/или порога определения связывания возникает некоторая вариабельность.

[0067] Термин «конъюгат» относится к первой молекуле, например, антителу («иммуноконъюгату»), химически связанной с молекулой, такой как детектируемая метка или биологически активная молекула, такая как лекарственное средство, токсин или химиотерапевтическое средство или цитотоксический агент. Следовательно, настоящее изобретение включает антитела, конъюгированные с одной или более молекулами. Кроме того, антитело может представлять собой «конъюгированное антитело» или «неконъюгированное антитело» (т. е. не конъюгированное с молекулой).

[0068] В рамках настоящего изобретения, термин «конъюгат антитело-лекарственное средство» или («ADC») относится к антителу, конъюгированному с лекарственным средством. Обычно конъюгация включает ковалентное связывание через линкер.

[0069] В рамках настоящего изобретения, термин «меченая» молекула (например, нуклеиновая кислота, белок или антитело) относится к молекуле, которая связана с детектируемой меткой либо ковалентно, через линкер или химическую связь, либо нековалентно, посредством ионных, ван-дер-ваальсовых, электростатических или водородных связей, так что присутствие молекулы может быть обнаружено посредством детектирования присутствия детектируемой метки, связанной с молекулой.

[0070] В рамках настоящего изобретения, термин «детектируемая метка» относится к композиции, детектируемой спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, химическими или другими физическими средствами. Примеры детектируемых меток описаны здесь и включают, без ограничения, колориметрические, флуоресцентные, хемилюминесцентные, ферментативные и радиоактивные метки. Для целей настоящего изобретения детектируемая метка также может представлять собой молекулу, которая сама по себе не генерирует сигнала (например, биотин), но которая связывается со второй молекулой, способной генерировать сигнал (например, меченый авидин).

[0071] Термин «перекрестно сшитое» по отношению к антителу относится к присоединению антитела к твердой или полутвердой матрице (например, сефарозе, гранулам, планшету для микротитрования) или к другому белку или антителу. Например, антитело может быть мультимеризовано с получением комплекса антител с несколькими (более чем 2) антигенсвязывающими сайтами. Антитело может быть мультимеризовано посредством экспрессии антитела в виде высоковалентного изотипа (например, IgA или IgM, которые обычно образуют комплексы из 2 или 5 антител соответственно). Мультимеризацию антител также можно проводить с использованием сшивающего агента, содержащего реакционноспособную группу, способную связывать белки (например, карбодиимид, сложные эфиры NHS и т.д.). Способы и композиции для перекрестного сшивания антитела с матрицей описаны, например, в каталогах и веб-сайтах Abcam и New England Biolab (доступны на abcam.com и neb.com). Перекрестно сшивающие соединения с различными реакционноспособными группами описаны, например, в каталоге и на веб-сайте Thermo Fisher Scientific (доступно на piercenet.com).

[0072] В рамках настоящего изобретения, термин «иммуноанализ» относится к способу детектирования аналита посредством детектирования связывания между антителом, которое распознает аналит, и аналитом.

[0073] В рамках настоящего изобретения, термин «экспрессионная конструкция» относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность контроля экспрессии, оперативно связанную с гетерологичной нуклеотидной последовательностью (т.е. последовательностью, с которой последовательность контроля экспрессии обычно не связана в природе), которая является объектом экспрессии. В рамках настоящего изобретения, термин «экспрессионный вектор» относится к полинуклеотиду, содержащему экспрессионную конструкцию и последовательности, достаточные для репликации в клетке-хозяине или встраивания в хромосому хозяина. Плазмиды и вирусы являются примерами экспрессионных векторов. В рамках настоящего изобретения, термин «последовательность контроля экспрессии» относится к нуклеотидной последовательности, которая регулирует транскрипцию и/или трансляцию нуклеотидной последовательности, операбельно связанной с ней. Последовательности контроля экспрессии включают промоторы, энхансеры, репрессоры (регуляторные последовательности транскрипции) и сайты связывания рибосом (регуляторные последовательности трансляции).

[0074] В рамках настоящего изобретения, термин «вектор» включает любой вспомогательный носитель для молекулы нуклеиновой кислоты, который позволяет, например, вводить указанную молекулу нуклеиновой кислоты в прокариотические и/или эукариотические клетки и/или интегрировать в геном, и включает плазмиды, фагемиды, бактериофаги или вирусные векторы, такие как векторы на основе ретровирусов, аденоассоциированные вирусные векторы и т.п. В рамках настоящего изобретения, термин «плазмида» обычно относится к конструкции внехромосомного генетического материала, обычно кольцевому ДНК-дуплексу, который может реплицироваться независимо от хромосомной ДНК.

[0075] В рамках настоящего изобретения, нуклеотидная последовательность «оперативно связана» с последовательностью контроля экспрессии, когда последовательность контроля экспрессии функционирует в клетке, регулируя транскрипцию нуклеотидной последовательности. Это включает в себя стимуляцию транскрипции нуклеотидной последовательности посредством взаимодействия между полимеразой и промотором.

[0076] В рамках настоящего изобретения, термин «клетка-хозяин» относится к рекомбинантной клетке, содержащей экспрессионную конструкцию.

[0077] В рамках настоящего изобретения, термин «биологический образец» относится к образцу, содержащему клетки (например, опухолевые клетки) или биологические молекулы, полученные из клеток. Биологический образец может быть получен от субъекта, например, пациента, от животного, такого как животная модель, или из культивируемых клеток, например, клеточной линии или клеток, отобранных у пациента и выращенных в культуре для исследования. Биологический образец может содержать ткань и/или жидкость. Его можно получить из любого биологического источника, включая без ограничения, кровь, фракцию крови (например, сыворотку или плазму), спинномозговую жидкость (ЦСЖ), лимфу, слезы, слюну, мокроту, буккальный мазок, молоко, мочу или фекалии. Биологическим образцом может быть биопсийный материал, такой как биопсийный материал ткани, полученный пункционной биопсией, тонкоигольной биопсией, хирургической биопсией и т. д. Образец может включать образец ткани, содержащий патологический очаг или подозреваемый патологический очаг, хотя биологический образец также может быть получен из другого места, например, места предполагаемого метастазирования, лимфатического узла или из крови. Биологический образец может представлять собой часть образца, отобранного у субъекта. Пример образца ткани включает образец ткани головного мозга или образец нервной ткани. Способы получения таких биологических образцов известны в данной области техники, включая стандартные процедуры забора крови, не ограничиваясь этим.

[0078] В рамках настоящего изобретения, термин «диагноз» относится к относительной вероятности того, что у субъекта имеет место такое заболевание, как рак. Аналогично, термин «прогноз» относится к относительной вероятности того, что у субъекта может произойти определенный исход в будущем. Например, в контексте настоящего описания прогноз может относиться к вероятности того, что у субъекта разовьется рак, будет иметь место рецидив, метастазирование рака, излечение рака или вероятное усиление тяжести заболевания (например, тяжести симптомов, уровня функционального снижения, выживаемости и т. д.). Термины не претендуют на то, чтобы быть абсолютными, что будет понятно любому специалисту в области медицинской диагностики.

[0079] В рамках настоящего изобретения, термины «терапия», «лечение», «терапевтическое вмешательство» и «ослабление» относятся к любому действию, приводящему к снижению тяжести симптомов. В случае рака лечение может относиться, например, к уменьшению размера опухоли, количества опухолевых клеток, скорости роста, метастатической активности, снижению гибели неопухолевых клеток, уменьшению тошноты и других побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии и т. д. Термины «лечить» и «профилактировать» не претендуют на то, чтобы быть абсолютными терминами. Лечение и профилактика могут относиться к любой задержке начала развития, облегчению симптомов, повышению выживаемости пациентов, увеличению времени или уровня выживаемости и т. д. Лечение и профилактика могут быть полными (неопределяемый уровень неопластических клеток) или частичными, например, у пациента будет обнаруживаться меньше опухолевых клеток, чем это имело бы место без вмешательства по настоящему изобретению. Эффект лечения можно сравнить с таковым у субъекта или группы субъектов, не получающих лечение, или с тем же пациентом до лечения или в другое время в период хода лечения. В некоторых аспектах тяжесть заболевания снижается, по меньшей мере, на 10% по сравнению, например, с субъектом до введения или с субъектом из контрольной группы, не подвергшимся лечению. В некоторых аспектах тяжесть заболевания снижается, по меньшей мере, на 25%, 50%, 75%, 80% или 90% или, в некоторых случаях, больше не обнаруживается с помощью стандартных диагностических методов.

[0080] В рамках настоящего изобретения, термины «эффективное количество», «эффективная доза» и «терапевтически эффективное количество» относятся к количеству агента, такого как антитело или иммуноконъюгат, которое достаточно для обеспечения желаемого ответа, такого как уменьшение или устранение признака или симптома патологического состояния или облегчение расстройства. В некоторых примерах «эффективное количество» представляет собой количество, с использованием которого можно лечить (включая профилактику) один или более симптомов и/или лежащих в основе причин любого расстройства или заболевания и/или профилактировать прогрессирование заболевания. Например, для данного параметра терапевтически эффективное количество будет показывать увеличение или уменьшение терапевтического эффекта, по меньшей мере, на любое значение из 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% или, по меньшей мере, 100%. Терапевтическую эффективность также можно выразить в качестве «кратного» увеличения или уменьшения. Например, терапевтически эффективное количество может иметь, по меньшей мере, 1,2-кратный, 1,5-кратный, 2-кратный, 5-кратный или более эффект по сравнению с контролем.

[0081] В рамках настоящего изобретения, термин «фармацевтическая композиция» относится к композиции, содержащей фармацевтическое соединение (например, лекарственное средство) и фармацевтически приемлемый носитель.

[0082] В рамках настоящего изобретения, термин «фармацевтически приемлемый» относится к носителю, который совместим с другими ингредиентами фармацевтической композиции, и его можно безопасно вводить субъекту. Данный термин используется в качестве синонима терминов «физиологически приемлемый» и «фармакологически приемлемый». Фармацевтические композиции и способы их приготовления и применения известны специалистам в данной области техники в свете настоящего раскрытия. Подробный перечень подходящих фармакологических композиций и способов их введения можно найти в таких монографиях, как Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985; Brunton et al., «Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics», McGraw-Hill, 2005; University of the Sciences in Philadelphia (eds.), «Remington: The Science and Practice of Pharmacy», Lippincott Williams & Wilkins, 2005; и University of the Sciences in Philadelphia (eds.), «Remington: The Principles of Pharmacy Practice», Lippincott Williams & Wilkins, 2008.

[0083] Фармацевтически приемлемые носители обычно являются стерильными, по меньшей мере, для применения у человека. Фармацевтическая композиция обычно содержит агенты для буферизации и консервации при хранении и может включать буферы и носители для соответствующей доставки в зависимости от пути введения. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают, помимо прочего, нормальный (0,9%) физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический буфер (PBS), сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) и растворы со многими электролитами, такие как PlasmaLyte ATM (Baxter).

[0084] Приемлемые носители, эксципиенты и/или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту, глутатион, цистеин, метионин и лимонную кислоту; консерванты (такие как этанол, бензиловый спирт, фенол, м-крезол, п-хлор-м-крезол, метил- или пропилпарабены, хлорид бензалкония или их комбинации); аминокислоты, такие как аргинин, глицин, орнитин, лизин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, изолейцин, лейцин, аланин, фенилаланин, тирозин, триптофан, метионин, серин, пролин и их комбинации; моносахариды, дисахариды и другие углеводы; низкомолекулярные (менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как желатин или сывороточный альбумин; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как трегалоза, сахароза, лактоза, глюкоза, манноза, мальтоза, галактоза, фруктоза, сорбоза, раффиноза, глюкозамин, N-метилглюкозамин, галактозамин и нейраминовая кислота; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как Твин, Плюроники, Тритон-X или полиэтиленгликоль (PEG).

[0085] Термины «доза» и «дозировка» используются здесь взаимозаменяемо. Доза относится к количеству активного ингредиента, вводимому субъекту при каждом введении. Для настоящего изобретения доза может относиться к концентрации антитела или связанных компонентов, например, к количеству терапевтического агента или дозировке радиоактивной метки. Доза будет варьироваться в зависимости от ряда факторов, включающих частоту введения; размеры и переносимость у субъекта; тяжесть патологического состояния; риск проявления побочных эффектов; путь введения; и модальность визуализации детектируемой метки (если она имеет место). Специалисту в данной области будет понятно, что доза может быть изменена в зависимости от вышеуказанных факторов или на основе терапевтического прогресса. Термин «лекарственная форма» относится к конкретному формату фармацевтического препарата и зависит от пути введения. Например, лекарственная форма может быть в жидкости, например, в солевом растворе для инъекций.

[0086] В рамках настоящего изобретения, термин «субъект» относится к индивидуальному животному. Термин «пациент», используемый в данном документе, относится к субъекту, за которым осуществляется уход или находящемуся под наблюдением поставщика медицинских услуг, такого как врач или медсестра. Субъекты включают млекопитающих, таких как люди, и приматы, отличные от человека, такие как обезьяны, а также собак, кошек, лошадей, крупный рогатый скот, кроликов, крыс, мышей, коз, свиней и других видов млекопитающих. Субъекты также могут включать птиц. Пациент может быть субъектом, который нуждается в лечении, наблюдении, корректировке или модификации существующей терапевтической схемы и т. д. Термин «субъект, страдающий раком» относится к субъекту, у которого диагностирован рак. Больные раком могут включать субъектов, которые не получали лечения, которые получают лечение в настоящее время, перенесли операцию и прекратили лечение.

[0087] В контексте лечения рака субъект, нуждающийся в лечении, может относиться к субъекту, который имеет рак или предраковое состояние, переболел раком и подвергается риску рецидива, имеет подозрение на наличие рака, подвергается стандартному лечению рака, такому как лучевая терапия или химиотерапия и т. д.

[0088] «Рак», «опухоль», «трансформированные» и подобные термины включают предраковые, неопластические, трансформированные и раковые клетки и могут относиться к солидной опухоли или несолидному раку (см., Edge et al., AJCC Cancer Staging Manual (7th ed. 2009); Cibas and Ducatman Cytology: Diagnostic principles and clinical correlates (3rd ed. 2009)). Термин «опухоль» включает как доброкачественные, так и злокачественные новообразования (в общем, аномальный рост). «Трансформация» относится к спонтанным или индуцированным фенотипическим изменениям, например иммортализации клеток, морфологическим изменениям, аберрантному росту клеток, уменьшению контактного торможения и «заякореванию» и/или малигнизации (см. Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)). Хотя трансформация может возникнуть в результате инфицирования трансформирующим вирусом и включения новой геномной ДНК или захвата экзогенной ДНК, она также может возникнуть спонтанно или после воздействия канцерогена.

[0089] Термин «рак» может относиться к любому типу рака, включая, без ограничения, лейкозы, карциному, саркому, аденокарциному, лимфому, солидный и лимфоидный рак и т. д. Примеры различных типов рака включают, не ограничиваясь эти, рак легких (например, немелкоклеточный рак легкого или NSCLC), рак молочной железы, рак предстательной железы, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак яичника, лейкоз, рак печени (например, гепатокарцинома), рак почки (например, почечноклеточная карцинома), рак щитовидной железы рак, рак поджелудочной железы, рак матки, рак шейки матки, рак яичка, рак пищевода, рак желудка (злокачественное образование из слизистой оболочки желудка), рак почки, рак центральной нервной системы, рак кожи, глиобластому и меланому.

[0090] В контексте настоящего документа химическое соединение, такое как полипептид, является «по существу чистым», если оно является преобладающим химическим соединением своего типа (например, полипептидов) в композиции. Это включает химическое соединение, представляющее более 50%, более 80%, более 90%, более 95%, более 98%, более 99%, более 99,5%, более 99,9% или более 99,99% от химических соединений в своего типа в композиции.

[0091] Выражение «выделенное антитело» относится к антителу, продуцированному in vivo или in vitro, которое было извлечено из источника, продуцировавшего антитело, например, животного, гибридомы или другой клеточной линии (такой как рекомбинантные клетки насекомых, дрожжей или бактерий, продуцирующие антитела).

[0092] «По существу чистое» или «выделенное» означает, что целевое соединение является преобладающим присутствующим соединением (т.е. в молярном отношении более распространенным, чем любые другие отдельные макромолекулярные соединения в композиции), и по существу очищенная фракция представляет собой композицию, в которой целевые соединения составляют, по меньшей мере, примерно 50% (в молярном отношении) от всех присутствующих макромолекулярных соединений. Как правило, по существу чистая композиция означает, что примерно от 80% до 90% макромолекулярных соединений, присутствующих в композиции, представляют собой представляющие интерес очищенные соединения. Целевые соединения очищают до значительной гомогенности (загрязняющие вещества не могут быть обнаружены в композиции с помощью обычных аналитических методов), если композиция состоит в основном из одного вида макромолекул. Растворители, небольшие молекулы (<500 дальтон), стабилизаторы (например, BSA) и элементарные ионы не считаются макромолекулярными соединениями для целей данного определения.

[0093] В рамках настоящего изобретения, термин «идентичность последовательностей» относится к процентной идентичности последовательностей между двумя полипептидными последовательностями или двумя последовательностями нуклеиновых кислот. Для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, в первую аминокислотную последовательность или нуклеиновокислотную последовательность можно ввести гэпы для оптимального выравнивания со второй аминокислотной последовательностью или нуклеиновокислотной последовательностью). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы идентичны по этому положению. Процентная идентичность между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % идентичность=числу идентичных перекрывающихся положений/общее число положений × 100%). В одном варианте осуществления две последовательности имеют одинаковую длину. Определение процентной идентичности между двумя последовательностями также можно выполнить с использованием математического алгоритма. Предпочтительным неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2264-2268, в модификации Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:5873-5877. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403. Поиск нуклеотидных последовательностей в BLAST может быть выполнен с набором параметров программы нуклеотидов NBLAST, например, для числа баллов=100, длины слова=12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты по настоящей заявке. Поиск белковых последовательностей в BLAST можно выполнить с установленными параметрами программы XBLAST, например, для баллов 50, длины слова=3, чтобы получить аминокислотные последовательности, гомологичные белковой молекуле, описанной здесь. Для получения выравниваний с гэпами в целях сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано в публикации Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. В качестве альтернативы можно использовать PSI-BLAST для повторного поиска, который выявляет отдаленные отношения между молекулами (там же). При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST) (см., например, веб-сайт NCBI). Другим предпочтительным неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers и Miller, 1988, CABIOS 4:11-17. Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программного обеспечения для выравнивания последовательностей GCG. При использовании для сравнения аминокислотных последовательностей в программе ALIGN можно применять таблицу весов замен остатков PAM120, штраф за продолжение гэпа 12 и штраф за открытие гэпа 4. Процентную идентичность между двумя последовательностями можно определить с использованием методов, аналогичных описанным выше, с гэпами или без них. При вычислении процентной идентичности обычно учитываются только точные совпадения.

[0094] Для антител процентную идентичность последовательностей можно определить, когда последовательности антител максимально выровнены с использованием IMGT. После выравнивания, если область исследуемого антитела (например, всю зрелую вариабельную область тяжелой или легкой цепи) сравнивают с той же областью референсного антитела, то процентная идентичность последовательностей между участками исследуемого и референсного антител представляет собой число положений, занимаемых одной и той же аминокислотой как в исследуемом, так и в референсном участке антитела, деленное на общее число выровненных положений двух участков, умноженное на 100 для преобразования в проценты.

[0095] Процентную идентичность аминокислотной последовательности также можно определить с использованием программы сравнения последовательностей NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). Программа сравнения последовательностей NCBI-BLAST2 может быть получена из Национального института здравоохранения, Bethesda, Md. В NCBI-BLAST2 используется несколько параметров поиска, где всем этим параметрам поиска присваиваются значения по умолчанию, включая, например, unmask=yes, strand=all, expected occurrences=10, minimum low complexity length=15/5, multi-pass e-value=0,01, constant for multi-pass=25, dropoff for final gapped alignment=25 и scoring matrix=BLOSUM62.

[0096] В ситуациях, где для сравнения аминокислотных последовательностей применяют NCBI-BLAST2, то % идентичность аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности A к, с, или против данной аминокислотной последовательности B (что альтернативно можно выразить как данную аминокислотную последовательность A, которая имеет или содержит конкретную % идентичность аминокислотной последовательности к, с или против данной аминокислотной последовательности B) вычисляют следующим образом:

100 умножить на дробь X/Y,

[0097] где X представляет собой число аминокислотных остатков, идентифицированных как идентичные совпадения программой сравнения последовательностей NCBI-BLAST2 при сравнении этой программой A и B, где Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в B. Следует учитывать, что где длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, то % идентичность аминокислотной последовательности A с B не будет равна % идентичности аминокислотной последовательности B с A. Термин «нуклеиновокислотная последовательность», как здесь используется, относится к последовательности нуклеозидных или нуклеотидных мономеров, состоящей из встречающихся в природе оснований, сахаров и межсахарных (каркасных) связей, и включает кДНК. Термин также включает модифицированные или замещенные последовательности, содержащие неприродные мономеры или их части. Последовательности нуклеиновых кислот по настоящей заявке могут представлять собой последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или последовательности рибонуклеиновой кислоты (РНК) и могут включать встречающиеся в природе основания, например, аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил. Последовательности могут также содержать модифицированные основания. Примеры таких модифицированных оснований включают аза- и деаза-аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил; и ксантин и гипоксантин. Понятно, что полинуклеотиды, содержащие нетранскрибируемые азотистые основания, могут быть использованы в качестве зондов, например, в гибридизационных анализах. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной или одноцепочечной и представляет собой смысловую или антисмысловую цепь. Кроме того, термин «нуклеиновая кислота» включает комплементарные последовательности нуклеиновых кислот, а также кодон-оптимизированные или синонимичные кодоновые эквиваленты.

[0098] В рамках настоящего изобретения, термин «выделенная нуклеиновая кислота» относится к нуклеиновой кислоте, по существу свободной от клеточного материала или культуральной среды, когда она получена методами рекомбинантной ДНК, или химических предшественников, или других химических соединений, когда она получена химическим синтезом. Выделенная нуклеиновая кислота также практически не содержит последовательностей, которые фланкируют нуклеиновую кислоту в естественных условиях (т.е. последовательностей, расположенных на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты), из которых получена нуклеиновая кислота.

[0099] Под выражением «по меньшей мере, умеренно жесткие условия гибридизации» подразумевается, что выбраны условия, которые способствуют избирательной гибридизации двух комплементарных молекул нуклеиновых кислот в растворе. Гибридизация может происходить с полноразмерной или с частичной последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты. Как правило, длина гибридизующегося участка составляет, по меньшей мере, 15 (например, 20, 25, 30, 40 или 50) нуклеотидов. Специалисты в данной области понимают, что стабильность дуплекса нуклеиновых кислот, или гибридов, определяется величиной Tm, которая в натрий-содержащих буферах является функцией концентрации ионов натрия и температуры (Tm=81,5°C-16,6 (Log10[Na+])+0,41(%(G+C)-600/л), или аналогичное уравнение). Следовательно, параметры для условий отмывки, определяющие стабильность гибрида, представляют собой концентрацию ионов натрия и температуру. Для идентификации сходных, но не одинаковых молекул в случае известной молекулы нуклеиновой кислоты можно допустить, что несоответствие величиной 1% приводит примерно к снижению Tm на 1°C, например, если проводится поиск молекулы нуклеиновых кислот, совпадающих на >95%, то температуру конечной отмывки снижают примерно на 5°C. На основе этих расчетов специалисты в данной области могут легко выбрать подходящие условия гибридизации. В предпочтительных вариантах осуществления выбирают жесткие условия гибридизации. Например, для достижения жесткой гибридизации можно использовать следующие условия: гибридизация в 5× хлорид натрия/цитрат натрия (SSC)/5× раствор Денхардта/1,0% SDS при Tm - 5°C на основе вышеуказанного уравнения, с последующей отмывкой в 0,2× SSC 0,1% SDS при 60°C. Умеренно жесткие условия гибридизации включают в себя стадию промывания в 3× SSC при 42°C. Однако понятно, что эквивалентную жесткость условий можно достигнуть с применением альтернативных буферов, солей и температур. Дополнительное руководство относительно условий гибридизации можно найти в монографиях Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 2002 и Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

[00100] В рамках настоящего изобретения, термин «лечить» или «лечение», хорошо понятный в данной области техники, означает подход для получения благоприятных или желаемых результатов, включая клинические результаты. Благоприятные или желаемые клинические результаты могут включать, помимо прочего, облегчение или ослабление одного или более симптомов или патологических состояний, снижение тяжести заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) заболевания, предупреждение распространения заболевания, отсрочку или замедление прогрессирование заболевания, ослабление или временное облегчение болезненного состояния, снижение рецидивирования заболевания и ремиссию (частичную или полную), поддающиеся обнаружению или не поддающиеся обнаружению. «Лечить» и «лечение» также могут означать повышение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью в отсутствии лечения. В рамках настоящего изобретения, термины «лечить» и «лечение» также включают профилактическое лечение. Например, субъекта, страдающего раком, можно лечить для предупреждения прогрессирования, его можно лечить антителом, иммуноконъюгатом, нуклеиновой кислотой или композицией, описанными здесь, для предупреждения прогрессирования.

[00101] В рамках настоящего изобретения, термин «введение» означает предоставление или введение субъекту агента, такого как композиция, содержащая эффективное количество антитела, эффективным путем, таким как интратуморальный или внутривенный путь введения.

[00102] В рамках настоящего изобретения, термин «разбавитель» относится к фармацевтически приемлемому носителю, который не ингибирует физиологическую активность или свойство вводимого активного соединения, такого как антитело или иммуноконъюгат, и не вызывает раздражения у субъекта и не отменяет биологическую активность и свойства вводимого соединения. Разбавители включают любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, соли с консервирующим действием, консерванты, связующие вещества, эксципиенты, разрыхлители, смазывающие вещества, подобные вещества и их комбинации, которые известны специалистам в данной области (см., например, монографию Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, 1289-1329, включенную здесь посредством ссылки). За исключением случаев, когда обычный носитель несовместим с активным ингредиентом, подразумевается его использование в фармацевтических композициях.

[00103] Композиции или способы, «содержащие» или «включающие» один или более перечисленных элементов, могут включать другие элементы, не указанные конкретно. Например, композиция, которая «содержит» или «включает» антитело, может содержать антитело отдельно или в комбинации с другими ингредиентами.

[00104] При понимании объема настоящего раскрытия термин «состоящий» и его производные, используемые здесь, предназначены для закрытых терминов, которые определяют наличие заявленных признаков, элементов, компонентов, групп, целых чисел и/или стадий, а также исключают наличие других неуказанных признаков, элементов, компонентов, групп, целых чисел и/или стадий.

[00105] Перечисление числовых диапазонов по конечным точкам в данном документе включает все целые числа и дробные числа, входящие в данный диапазон (например, от 1 до 5 включает 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,90, 4 и 5). Также следует понимать, что все целые числа и дробные чтсла предполагаются для модификации термином «примерно». Кроме того, следует понимать, что формы единственного числа артиклей «a», «an» и «the» включают ссылки во множественном числе, если контекст явно не требует иного. Например, термин «антитело» или «по меньшей мере, одно антитело» может включать множество антител, включая их смеси.

[00106] Термины «Frizzled» и «FZD» относятся, в зависимости от контекста, к любому гену или белку, входящему в семейство Frizzled. Белки Frizzled участвуют в активации растрепанного белка в цитозоле. «Frizzled» относятся к любому члену из «Frizzled-1», «Frizzled-2», «Frizzled-3», «Frizzled-4», «Frizzled»-5, «Frizzled-6», «Frizzled-7», «Frizzled-8», «Frizzled-9» и «Frizzled-10».

[00107] «Белки, подобные рецептору липопротеинов», «белки, подобные рецептору липопротеинов низкой плотности» (HGNC) или «белок, подобный рецептору липопротеинов низкой плотности» (UniProt), сокращенно «LRP», представляют собой группу генов и белков. К ним относятся: LRP1, LRP1B, LRP2 (мегалин), LRP3, LRP4, LRP5, LRP6, LRP8 (рецептор аполипопротеина е), LRP10, LRP11 и LRP12. LRP5 и LRP6 являются частью группы корецепторов LRP5/LRP6/Frizzled, которые участвуют в каноническом пути Wnt. LRP5 также известен как LRP5, BMND1, EVR1, EVR4, HBM, LR3, LRP-5, LRP7, OPPG, OPS, OPTA1, VBCH2 и белок 5, родственный рецептору LDL. Ген LRP5 имеет идентификатор гена ENTREZ: 4041, и белок имеет референсную последовательность NCBI: NP_002326. Ген LRP6 имеет идентификатор гена ENTREZ: 4040, а белок имеет эталонную последовательность NCBI: NP_002327. LRP6 также известен как ADCAD2, STHAG7.

II. Расстройства, ассоциированные с нарушением регуляции сигнального пути LRP

[00108] Связывание Wnt с LRP5 или LRP6 дестабилизирует связывающий β-катенин комплекс, вызывая деградацию β-катенина. В результате повышается уровень внутриклеточного β-катенина. Следовательно, настоящее изобретение относится к способам блокирования связывания Wnt с белками семейства LRP, такими как LRP5 или LRP6.

[00109] «Расстройство, ассоциированное с LRP» (например, «расстройство, ассоциированное с LRP5» или «расстройство, ассоциированное с LRP6») относится к патологическому состоянию или заболеванию, коррелирующему с нарушением регуляции конкретного указанного рецептора LRP. Нарушение регуляции относится к аномальному снижению или увеличению передачи сигналов, которые влияют на нормальные опосредованные β-катенином транскрипционные изменения или любые другие внутриклеточные сигнальные пути, регулируемые этими рецепторами. Так, например, аномальное увеличение передачи сигналов, связанное с LRP, например, через канонический сигнальный путь Wnt (Wnt3/Wnt3A), ассоциировано с некоторыми видами рака и с увеличением плотности костей, в то время как аномальное снижение передачи сигналов, ассоциированное с LRP, связано со снижением плотности костей.

[00110] Антитела, которые блокируют связывание Wnt с LRP5 или LRP6, являются пригодными в лечении рака. В частности, способ блокирования связывания Wnt с LRP5 пригоден в лечении рака головного мозга, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака эндометрия, рака пищевода, рака почки, рака печени, рака легких, рака яичника, рака кожи, рака желудка и рака яичка.

III. Анти-LRP5 антитела

А. Антитела

[00111] LRP5 и LRP6 каждый имеет два сайта связывания Wnt. Большинство Wnt-активаторов сигнального пути β-катенина, включая Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b, 10b и т. д., связываются с β-пропеллерными областями 1 и 2 в LRP5 и LRP6. Данный сайт относится здесь к «сайту связывания, отличному от Wnt3a». Wnt-белки Wnt3 и Wnt3a, как известно, связываются с другим сайтом в β-пропеллерных областях 3 и 4 в LRP5 и LRP6. Этот сайт относится здесь к «сайту связывания Wnt3a». Связывание антитела с LRP5 или LRP6, которое блокирует связывание лигандов Wnt с конкретным сайтом связывания, снижает активность сигнального пути, связанного со связыванием лиганда Wnt с этим сайтом. Такая блокирующая активность также может при определенных обстоятельствах усиливать активность сигнального пути, связанного со связыванием лиганда Wnt с другим сайтом связывания. Так, например, антитело, которое блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a, ингибирует активность сигнального пути Wnt3a и может усиливать активность сигнального пути, отличного от Wnt3a. Аналогично, антитело, которое блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания, отличным от Wnt3a, ингибирует активность сигнального пути, отличного от Wnt3a, и может усиливать активность сигнального пути Wnt3a.

[00112] Антитела против рецепторов LRP5 описаны в настоящем документе. Некоторые из этих антител блокируют связывание лигандов Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5. Другие из этих антител блокируют связывание лигандов Wnt с сайтом связывания, отличным от Wnt3a. Эти антитела блокируют связывание лиганда Wnt и модулируют активность сигнального пути Wnt. Эти антитела также обладают антипролиферативными эффектами, имеют терапевтический потенциал для лечения рака и других заболеваний, при которых нарушена регуляция рецепторов LRP.

[00113] Следовательно, аспект изобретения относится к выделенному антителу, которое специфически связывается с рецептором LRP5. Антитела содержат вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность участки CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, вариабельная область легкой цепи содержит определяющие комплементарность участки CDR-L1, CDR -L2 и CDR-L3, и с аминокислотными последовательностями указанных CDR, содержащими, состоящими по существу из или состоящими из последовательностей, выбранных из последовательностей, представленных в таблице 1 или 2.

[00114] В одном варианте осуществления антитело содержит набор последовательностей CDR, выбранный из наборов последовательностей CDR, представленных в таблице 1, т. е. для клонов LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5. - E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[00115] Также в настоящем документе описаны вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи. В таблице 2 представлены примерные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей Fab из клонов LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5-E5, LRP5-G2, LRP5-G9, LRP5. - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6. Также описаны антитела, содержащие последовательности, представленные в таблице 2, или последовательности, по существу идентичные им, где CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленный в таблице 1. В еще одном варианте осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: i) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную в таблице 2; ii) аминокислотную последовательность, по меньшей мере, с 50%, по меньшей мере, с 60%, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 80%, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере, с 95%, по меньшей мере, с 98% или, по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи, представленной в таблице 2, где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1; или iii) консервативно замещенную аминокислотную последовательность по п.i), где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1.

[00116] В еще одном варианте осуществления антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую i) аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную в таблице 2; ii) аминокислотную последовательность, по меньшей мере, с 50%, по меньшей мере, с 60%, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 80%, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере, с 95%, по меньшей мере, с 98% или, по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью легкой цепи, представленной в таблице 2, где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1; или iii) консервативно замещенную аминокислотную последовательность по п.i), где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1.

[00117] В таблице 1 ниже антитела отнесены к группам эпитопов на основе их характеристик связывания. Антитела в группе эпитопов 1 усиливают активность лигандов Wnt, связывающихся с сайтом связывания, отличным от Wnt3A. Однако они не ингибируют активность лиганда Wnt3A. Антитела в группе эпитопов 2 ингибируют активность связывания лиганда Wnt с сайтами связывания, отличными от Wnt3a. Кроме того, антитело LRP5-G 10 потенцирует активность лигандов Wnt, связывающихся с сайтами связывания Wnt3a. Антитела, относящиеся к группам эпитопов 3 и 4, связывают LRP5, но не ингибируют и не усиливают активность лигандов Wnt. Эпитопные группы других антител не определяли.

[00118] Аминокислотные последовательности для CDR этих антител представлены в таблице 1.

[00119]

Таблица 1
Последовательности CDR анти-LRP5 антител Номер клона CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 Группа эпитопов LRP5 - A7 SVSSA SASSLYS AWGWGLF LSYSSM SIYPYYGYTY HGAM 1 LRP5 - A9 SVSSA SASSLYS VHYSPYSLI ISSYSI SSSYYGYTY TVRGSK KPYFSGWAM не определяли LRP5 - C5 SVSSA SASSLYS YQYSGLI FSSSSI SISSSYGYTY SSYYSSVSSSVYAL 1 LRP5 - C12 SVSSA SASSLYS FSHVSLI FSSSSI SIYSSYGSTS TVRGSK KPYFSGWAM 2 LRP5 - D9 SVSSA SASSLYS ASYSPI ISYSYI SIYSSYGYTY HYSYFFYAM 1 LRP5 - E5 SVSSA SASSLYS YHYYYLF IYSYSI SIYPYSSYTS YAVYFPGYYWGM 4 LRP5 - G2 SVSSA SASSLYS ASYAPI LSYYYM SIYSSYGYTY WSHVSGHYSGM 1 LRP5 - G9 SVSSA SASSLYS SSSSPI ISYSYI SIYSSYGYTY WGAYHSSGYGM 1 LRP5 - G10 SVSSA SASSLYS SSYSLI FSSSSI SISSSYGYTY GGSGVSHYGSVY YSWWAL 2 LRP5 - G11 SVSSA SASSLYS GVSLI ISYSYI SIYPSYGYTY AAPYYGYYYSYAM 1 LRP5 - H3 SVSSA SASSLYS YWFLI LYYYYI SISPYYGYTS SGYGWYAM 3 LRP5 - H5 SVSSA SASSLYS PVGHYGYPI LSYSSI SISSSYGSTS GYWAI 2 LRP5 - H9 SVSSA SASSLYS SSYSPI IYSYYI SIYSYYGYTY SYPAM 1 LRP5 - R3O_D3 SVSSA SASSLYS YWAYYSPI FSSSSI SISSSYGYTY SWAM не определяли LRP5 - R3_E8 SVSSA SASSLYS VSYYPLI LYYSSM SISSYYGYTS YWAL не определяли LRP5 - R3O_G6 SVSSA SASSLYS SSYSLI ISSYSM YISPYYGYTS GWGSPA SAGYYGL не определяли

[00120] Аминокислотные и нуклеотидные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи представлены в таблице 2:

[00121] Таблица 2 - ДНК тяжелой и легкой цепи и аминокислотные последовательности LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5-E5, LRP5-G2, LRP5-G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[00122]

[00123]

[00124]

[00125]

[00126]

[00127]

[00128]

[00129]

[00130]

[00131]

[00132]

[00133]

[00134]

[00135] LRP5-A9

[00136] LRP5-C5

[00137] LRP5-C12

[00138] В некоторых вариантах осуществления последовательности вариабельных областей, по меньшей мере, на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны за пределами участков CDR, и набор последовательностей CDR на 100% идентичен аминокислотным последовательностям, представленным в таблице 1.

[00139] Также в еще одном варианте осуществления обеспечивается конкурирующее антитело, которое конкурирует за связывание с антителом, содержащим набор последовательностей CDR, описанный здесь. Например, конкурирующее антитело в одном варианте осуществления снижает связывание антитела, содержащего набор последовательностей CDR с LRP5 CDR, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99%.

[00140] Как здесь показано, антитела, описанные здесь, обладают высокой аффинностью к LRP5. Например, антитела в одном варианте осуществления имеют аффинность связывания, измеренную с помощью поверхностного плазмонного резонанса, в диапазоне примерно от 1 нМ до примерно 50 нМ.

[00141] Антитело может представлять собой гуманизированное антитело, как здесь описано, или химерное антитело.

[00142] В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой одноцепочечное антитело, которое можно получить, например, слиянием вместе тяжелой цепи и легкой цепи или их участков.

[00143] В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, выбранный из Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, dsFv, ds-scFv, димеров, нанотел, минител, диател и их мультимеров.

[00144] В некоторых других вариантах осуществления антитело представляет собой антигенсвязывающий фрагмент Fab. Для некоторых вариантов осуществления антигенсвязывающий фрагмент является предпочтительным, например, для применения in vitro.

[00145] В еще одних вариантах осуществления может быть предпочтительным иметь мультивалентное антитело или антитело, содержащее часть Ig.

[00146] Как показано в примерах, Fab-фрагмент можно комбинировать с Ig, таким как IgG. В одном варианте осуществления IgG представляет собой IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

B. Антитела с детектируемой меткой

[00147] Детектируемые метки могут включать пептидные последовательности (такие как метка myc, HA-метка, V5-метка или NE-метка), флуоресцентные или люминесцентные белки (например, зеленый флуоресцентный белок или люцифераза), которые могут быть присоединены или введены в антитело, описанное здесь, и способные прямо или опосредованно генетировать детектируемый сигнал. Например, метка может представлять собой рентгеноконтрастный, позитронно-излучающий радионуклид (например, для использования в ПЭТ-визуализации) или радиоизотопом, таким как ³H, ¹³N, ¹⁴C, ¹⁸F, ³²P, ³⁵S, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I; флуоресцентное (флуорофор) или хемилюминесцентное (хромофор) соединение, такое как изотиоцианат флуоресцеина, родамин или люциферин; фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или пероксидаза хрена; визуализирующий агент; или ион металла.

C. Конъюгаты антитело-лекарственное средство

[00148] Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к иммуноконъюгату, содержащему антитело, описанное здесь, и детектируемую метку или цитотоксический агент.

[00149] Химиотерапевтический (противоопухолевый) агент может представлять собой любой агент, способный уменьшать рост раковой опухоли, нарушать репликацию опухолевых клеток, прямо или опосредованно уничтожать опухолевые клетки, уменьшать метастазирование, снижать кровоснабжение опухоли и т. д. Таким образом, химиотерапевтические агенты включают цитотоксические агенты. Цитотоксические агенты включают, не ограничиваясь этим, сапорин, таксаны, алкалоиды барвинка, антрациклин и агенты на основе платины. Классы химиотерапевтических агентов включают, не ограничиваясь этим, алкилирующие агенты, антиметаболиты, например, метотрексат, растительные алкалоиды, например, винкристин, и противоопухолевые антибиотики, такие как антрациклины, например, доксорубицин, а также различные лекарственные средства, которые не относятся к определенному классу, такие как гидроксимочевина. Препараты на основе платины, примером которых являются цисплатин и оксалиплатин, представляют собой большой класс химиотерапевтических средств. Эти препараты связываются с ДНК и нарушают репликацию. Таксаны, примером которых является таксол, представляют собой еще один большой класс химиотерапевтических средств. Эти соединения функционируют, нарушая образование цитоскелета и митотического веретена, подавляя клеточное деление и тем самым предотвращая рост быстро делящихся опухолевых клеток. Другие химиотерапевтические препараты включают гормональную терапию. Химиотерапевтические средства также включают агенты, которые ингибируют сборку или полимеризацию тубулина, такие как майтанзин, мертанзин и ауристатин. Химиотерапевтические агенты также включают агенты, повреждающие ДНК, такие как калихеамицин.

[00150] Химиотерапевтические агенты могут включать майтанзиноид, ауристатин, доластатин, тубулизин, криптофицин, димер пирролобензодиазепина (PBD), димер индолинобензодиазепина, альфа-аманитин, трихотен, SN-38, дуокармицин, CC1065, калихеамицин, энедииновый антибиотик, таксан, производные доксорубицина, антрациклин и их стереоизомеры, азанофид, изостеры, аналоги или производные.

IV. Нуклеиновые кислоты

[00151] Дополнительные аспекты включают молекулы нуклеиновых кислот или полинуклеотиды, рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, экспрессионные конструкции и векторы, как здесь описано.

А. Молекулы нуклеиновой кислоты

[00152] Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, представленной в таблице 2, а также полинуклеотиду, который гибридизуется с одной из указанных последовательностей, например, в жестких условиях гибридизации. Нуклеиновые последовательности CDR и вариабельной области можно использовать, например, для получения экспрессионных конструкций.

B. Экспрессионные конструкции и векторы

[00153] Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть включены известным образом в подходящую экспрессионную конструкцию или экспрессионный вектор, которые обеспечивают экспрессию белка. Экспрессионные конструкции могут содержать последовательность контроля экспрессии, например, промотор, оперативно связанную с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по настоящему изобретению. Возможные экспрессионные векторы включают, не ограничиваясь этим, космиды, плазмиды или модифицированные вирусы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы). Вектор должен быть совместим с используемой клеткой-хозяином. Экспрессионные векторы являются «подходящими для трансформации клетки-хозяина», означая, что экспрессионные векторы содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептиды, соответствующие эпитопам, или антителам, описанным здесь.

[00154] В варианте осуществления вектор подходит для экспрессии, например, одноцепочечных антител в генной терапии. В одном варианте осуществления вектор содержит IRES и обеспечивает экспрессию вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи. Такие векторы можно использовать для доставки антитела in vivo.

[00155] Подходящие регуляторные последовательности могут быть получены из различных источников, включая бактериальные, грибковые, вирусные гены, гены млекопитающих или насекомых.

[00156] Примеры таких регуляторных последовательностей включают: промотор и энхансер транскрипции или последовательность связывания РНК-полимеразы, последовательность связывания рибосомы, включая сигнал инициации трансляции. Кроме того, в зависимости от выбранной клетки-хозяина и используемого вектора в экспрессионный вектор могут быть включены другие последовательности, такие как ориджин репликации, дополнительные сайты рестрикции ДНК, энхансеры и последовательности, придающие индуцибельность транскрипции.

[00157] В варианте осуществления регуляторные последовательности направляют или повышают экспрессию в нервной ткани и/или клетках.

[00158] Вектор может представлять собой любой вектор, включая векторы, подходящие для получения антитела, описанного здесь.

[00159] В одном варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор.

[00160] Рекомбинантные экспрессионные векторы могут также содержать маркерный ген, который облегчает селекцию клеток-хозяев, трансформированных, инфицированных или трансфицированных вектором для экспрессии антитела или эпитопного пептида, описанного здесь.

[00161] Рекомбинантные экспрессионные векторы могут также содержать экспрессионные кассеты, которые кодируют слитую молекулу (т.е. «слитый белок»), которая обеспечивает повышенную экспрессию или стабильность рекомбинантного пептида; повышенную растворимость рекомбинантного пептида; и помогают в очистке целевого рекомбинантного пептида, функционируя в качестве лиганда в аффинной очистке, включая, например, теги и метки, описанные здесь. Кроме того, к целевому рекомбинантному белку может быть добавлен сайт протеолитического расщепления, что позволит отделить рекомбинантный белок от слитой молекулы после очистки слитого белка. Типичные слитые экспрессионные векторы включают pGEX (Amrad Corp., melbourne, Австралия), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) и pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), которые сливают глутатион-S-трансферазу (GST), мальтоза-связывающий белок Е или белок А, соответственно, с рекомбинантным белком.

[00162] Системы для переноса генов как in vitro, так и in vivo включают векторы на основе вирусов, прежде всего вируса простого герпеса, аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV) и ретровирусов, включая лентивирусы. Альтернативные подходы к доставке генов включают использование «голой» плазмидной ДНК, а также комплексов липосома-ДНК.

[00163] В одном аспекте изобретение относится к способу получения антитела, описанного здесь, где способ включает синтез молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит каркас антитела и набор последовательностей CDR, описанный здесь.

V. Рекомбинантные клетки

[00164] Еще одним аспектом является рекомбинантная клетка-хозяин, экспрессирующая антитело, описанное здесь.

[00165] Антитела, описанные здесь, можно получить рекомбинантной экспрессией нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности антител.

[00166] Антитела, раскрытые здесь, можно получить культивированием клеток, сконструированных для экспрессии нуклеиновокислотных конструкций, кодирующих иммуноглобулиновые полипептиды.

[00167] Рекомбинантная клетка-хозяин может быть получена с использованием любой клетки, пригодной для продукции полипептида, например, пригодной для продукции антитела. Например, для введения нуклеиновой кислоты (например, вектора) в клетку, клетка может быть трансфектирована, трансформирована или инфицирована в зависимости от используемого вектора.

[00168] Подходящие клетки-хозяева включают широкий ряд прокариотических и эукариотических клеток-хозяев. Например, белки, описанные здесь, могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как E. coli, клетках насекомых (с использованием бакуловируса), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих.

[00169] В одном варианте осуществления клетка представляет собой эукариотическую клетку, выбранную из клеток дрожжей, растений, гельминтов, насекомых, птиц, рыб, рептилий и млекопитающих.

[00170] В еще одном варианте осуществления клетка млекопитающего представляет собой клетку СНО, миеломную клетку, клетку селезенки или гибридомную клетку.

[00171] Дрожжевые или грибковые клетки-хозяева, подходящие для экспрессии антитела, включают, не ограничиваются этим, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, роды Pichia или Kluyveromyces и различные виды рода Aspergillus. Примеры векторов для экспрессии в дрожжах S. cerevisiae включают pYepSec1, pMFa, pJRY88 и pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Протоколы трансформации дрожжей и грибов хорошо известны специалистам в данной области.

[00172] Клетки млекопитающих, которые могут быть подходящими, включают, среди прочего: COS (например, ATCC № CRL 1650 или 1651), BHK (например, ATCC № CRL 6281), CHO (ATCC № CCL 61), HeLa (например, АТСС № CCL 2), 293 (АТСС № 1573) и клетки NS-1. Подходящие экспрессионные векторы для регуляции экспрессией в клетках млекопитающих обычно включают промотор (например, полученный из вирусного материала, такого как полиома, аденовирус 2, цитомегаловирус и обезьяний вирус 40), а также другие последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию. Примеры экспрессионных векторов млекопитающих включают pCDM8 и pMT2PC.

VI. Фармацевтические композиции

[00173] Еще один аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей антитело, иммуноконъюгат, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или рекомбинантную клетку, описанные здесь, необязательно с подходящим разбавителем, например, фармацевтически приемлемым носителем.

[00174] Композиция может, например, содержать одно или более антител или иммуноконъюгатов.

[00175] Подходящие разбавители для полипептидов, включая антитела и/или клетки, включают, не ограничиваясь этим, солевые растворы, pH-забуференные растворы и растворы глицерина или другие растворы, подходящие для замораживания полипептидов и/или клеток.

[00176] Подходящие разбавители для нуклеиновых кислот включают, не ограничиваясь этим, воду, солевые растворы и этанол.

[00177] В одном варианте осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую любое из антител, нуклеиновых кислот или векторов, раскрытых здесь, и необязательно содержащую фармацевтически приемлемый носитель, такой как разбавитель или носитель.

[00178] Композиции, описанные здесь, можно приготовить известными сами по себе способами приготовления фармацевтически приемлемых композиций, которые можно вводить субъектам таким образом, что эффективное количество активного вещества объединено в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

[00179] Фармацевтические композиции включают, без ограничения, лиофилизированные порошки или водные или неводные стерильные растворы или суспензии для инъекций, которые могут дополнительно содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые делают композиции практически совместимыми с тканями или кровью предполагаемого реципиента. Другие компоненты, которые могут присутствовать в таких композициях, включают, например, воду, поверхностно-активные вещества (такие как Твин), спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Растворы для инъекций и суспензии для приготовления экстемпоре можно приготовить из стерильных порошков, гранул, таблеток или концентрированных растворов или суспензий. Композиция может поставляться, например, но не в порядке ограничения, в виде лиофилизированного порошка, который восстанавливается стерильной водой или физиологическим раствором перед введением пациенту.

[00180] Фармацевтические композиции могут содержать фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают по существу химически инертные и нетоксичные композиции, которые не влияют на эффективность проявления биологической активности фармацевтической композиции. Примеры подходящих фармацевтических носителей включают, не ограничиваясь этим, воду, солевые растворы, растворы глицерина, этанол, N-(1(2,3-диолеилокси)пропил)N,N,N-триметиламмония хлорид (DOTMA), диолезилфосфотидил-этаноламин (DOPE) и липосомы. Такие композиции должны содержать терапевтически эффективное количество соединения вместе с подходящим количеством носителя для обеспечения формы для непосредственного введения пациенту.

[00181] Композиция может находиться в форме фармацевтически приемлемой соли, которая включает, без ограничения, соли, образованные со свободными аминогруппами, такие как производные соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т. д., и соли, образованные со свободными карбоксильными группами, такие как производные натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола.

[00182] В одном варианте осуществления композиция содержит антитело, описанное здесь. В еще одном варианте осуществления композиция содержит антитело, описанное здесь, и разбавитель. В одном варианте осуществления композиция представляет собой стерильную композицию.

[00183] Дополнительный аспект включает комплекс антител, содержащий антитело, описанное здесь, связанное с белком LRP, например, LRP5 или LRP6. Комплекс может находиться в растворе или содержаться в ткани, необязательно in vitro.

[00184] Также настоящее изобретение относится к способам получения и применения реагентов, описанных здесь.

VII. Наборы

[00185] Еще один аспект настоящего изобретения относится к набору или упаковке, содержащих любое из антител, иммуноконъюгатов, молекул нуклеиновых кислот, векторов, рекомбинантных клеток и/или композиций, входящих в настоящий документ. Антитела, иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновых кислот, векторы, рекомбинантные клетки и/или композиции могут быть помещены во флакон, такой как стерильный флакон или другой корпус. В рамках настоящего изобретения, термин «набор» относится к коллекции предметов, предназначенных для совместного использования. Набор может необязательно включать референсный агент и/или инструкции по его применению. Набор может дополнительно включать транспортировочный контейнер, приспособленный для хранения контейнера, такого как флакон, который содержит композицию, описанную здесь.

VIII. Способы применения антител

[00186] Антитела, описанные здесь, можно использовать в ряде способов in vitro и in vivo.

А. Способы детектирования экспрессии LRP5

[00187] Как здесь показано, антитела можно использовать для детектирования экспрессии LRP5.

[00188] Следовательно, один аспект настоящего изобретения относится к способу детектирования экспрессии LRP5, включающему приведение в контакт образца, содержащего одну или более клеток, с одним или более антителами или иммуноконъюгатами, описанными здесь, в условиях, допускающих образование комплекса антитело:LRP5, и детектирование присутствия любого комплекса антитела. Как правило, антитело является частью иммуноконъюгата, содержащего антитело, связанного с детектируемой меткой.

[00189] Образец может содержать жизнеспособные клетки или клеточный экстракт. Комплекс антитело:LRP5 можно детектировать с использованием иммуноанализов, таких как иммунофлуоресценция, проточная цитометрия, вестерн-блоттинг, ELISA, SPR и иммунопреципитация с последующим иммуноцитохимическим окрашиванием с SDS-PAGE. В некоторых вариантах осуществления детектирование осуществляется с использованием иммунофлуоресценции. В некоторых вариантах осуществления детектирование осуществляется с помощью проточной цитометрии.

[00190] Как здесь показано, ряд идентифицированных антител предпочтительно распознают LRP5. Следовательно, в вариантах осуществления, в которых способ предназначен для детектирования экспрессии LRP5, антитело или иммуноконъюгат содержат набор последовательностей CDR, соответствующий антителу, выбранному из LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5- E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

B. Способы ингибирования связывания WNT с LRP5

[00191] Антитела, раскрытые здесь, ингибируют связывание Wnt с белками LRP, в частности, с LRP5. Не желая ограничиваться теорией, ингибирование связывания Wnt с LRP5 влияет на трансдукцию сигнала, индуцированную связыванием конкретного лиганда Wnt. Например, связывание антител с рецепторами LRP5 ингибирует стимуляцию под действием LRP5 фосфорилирования бета-катенина. Поскольку судьба фосфорилированного бета-катенина заключается в разрушении в клетке, то нефосфорилированная форма накапливается. Накопление бета-катенина связано со злокачественными новообразованиями.

[00192] Может быть желательным уменьшить или ингибировать сигнальный путь лиганда Wnt через LRP5. Следовательно, еще один аспект представляет собой способ ингибирования связывания лиганда Wnt с LRP5 или Wnt-индуцированной транскрипционной активности, включающий приведение в контакт одной или более клеток, экспрессирующих один или более полипептидов LRP5, с эффективным количеством антитела или иммуноконъюгата, описанных здесь.

[00193] В одном варианте осуществления антитело или иммуноконъюгат содержат набор последовательностей CDR (полная, легкая цепь или тяжелая цепь), соответствующий антителу, описанному здесь. Как показано в настоящем документе, ряд идентифицированных антител преимущественно распознает LRP5. Следовательно, в вариантах осуществления, где способ предназначен для детектирования экспрессии LRP5, антитело или иммуноконъюгат содержат набор последовательностей CDR, соответствующий антителу, выбранному из LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5- E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[00194] Приведение в контакт может осуществляться, например, in vivo введением субъекту антитела или иммуноконъюгата. Такое ингибирование может быть особенно желательным, когда нарушена регуляция сигнального пути Wnt, как это имеет место в опухолевых клетках.

C. Способы потенцирования сигнальных путей WNT

[00195] Некоторые антитела, которые блокируют связывание лигандов Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5 или LRP6, усиливают сигнальную активность лигандов Wnt, связывающихся с сайтом связывания, отличным от Wnt3a. Аналогично, некоторые антитела, которые блокируют связывание лигандов Wnt с сайтом связывания LRP5 или LRP6, отличным от сайта связывания Wnt3a, усиливают сигнальную активность лигандов Wnt, связывающихся с сайтом связывания Wnt3a. Блокирующая активность может быть конкурентной или аллостерической. Следовательно, настоящее изобретение относится к способам усиления сигнальной активности связывания Wnt-лиганда с сайтом связывания Wnt3a в LRP5 или LRP6 приведением в контакт LRP5 или LRP6 с антителом, которое блокирует связывание лигандов Wnt с сайтом связывания в LRP5 или LRP6, отличным от Wnt3a. Настоящее изобретение также относится к способам усиления сигнальной активности связывания лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5 или LRP6, отличным от Wnt3a, приведением в контакт LRP5 или LRP6 с антителом, которое блокирует связывание лигандов Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5 или LRP6. Приведение в контакт можно проводить in vitro или in vivo. Приведение в контакт in vivo может включать введение субъекту соответствующего анти-LRP5 или анти-LRP6 антитела.

[00196] Например, антитела, содержащие наборы последовательностей CDR из антител группы эпитопов 1, усиливают активность связывания лигандов Wnt с сайтом связывания, отличным от Wnt3A.

D. Способы и применение для лечения рака

[00197] Способы лечения рака включают применение или введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению, которое связывается с LRP5. Субъектом в нем может быть субъект, например, человек, страдающий раком или подверженный риску развития рака, такого как рецидив рака.

[00198] В одном варианте осуществления рак выбран из острого миелоидного лейкоза, рака предстательной железы, глиобластомы, рака мочевого пузыря и рака шейки матки.

[00199] В еще одном варианте осуществления раковые клетки выбраны из рака головного мозга, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака эндометрия, рака пищевода, рака почки, рака печени, рака легких, рака яичника, рака кожи, рака желудка и рака яичка.

[00200] Не желая ограничиваться теорией, такая терапия может функционировать посредством ингибирования активации канонического пути Wnt, например, ингибированием связывания Wnt с LRP5, ингибированием Wnt-индуцированной транскрипционной активности, ингибированием активации растрепанных белков, ингибированием деструктивного комплекса бета-катенина и усилением накопления бета-катенина.

[00201] Поскольку LRP5 и/или LRP6 часто подвергаются положительной регуляции при раке, то в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение эффективного количества антитела или иммуноконъюгата, которые специфически связываются с LRP5 или LRP6, по меньшей мере, в одном анализе, и ингибируют Wnt3a-индуцированный сигнальный путь, по меньшей мере, в одном анализе, субъекту, нуждающемуся в этом. Настоящее изобретение также относится к применению эффективного количества антитела или иммуноконъюгата, которые специфически связываются с LRP5 или LRP6, по меньшей мере, в одном анализе, и ингибируют Wnt3a-индуцированный сигнальный путь, по меньшей мере, в одном анализе, для лечения рака или в производстве лекарственного средства для лечения рака. Раскрытие дополнительно включает эффективное количество антитела или иммуноконъюгата, которые специфически связываются с LRP5 или LRP6, по меньшей мере, в одном анализе, и ингибируют Wnt3a-индуцированный сигнальный путь, по меньшей мере, в одном анализе, для применения в лечении рака.

[00202] В одном варианте осуществления антитело или иммуноконъюгат, например, конъюгат антитело-лекарственное средство, содержится в фармацевтической композиции.

[00203] В одном варианте осуществления рак выбран из рака головного мозга, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака эндометрия, рака пищевода, рака почки, рака печени, рака легких, рака яичника, рака кожи, рака желудка и рака яичка. В одном варианте осуществления антитело или иммуноконъюгат содержат набор последовательностей CDR, соответствующий антителу, описанному здесь. Ряд идентифицированных антител преимущественно распознает LRP5. Следовательно, в вариантах осуществления, в которых способ предназначен для детектирования экспрессии LRP5, антитело или иммуноконъюгат содержат набор последовательностей CDR, соответствующий антителу, выбранному из LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5- E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[00204] Как здесь показано, антитела также способны ингибировать пролиферацию раковых клеток. Следовательно, также обеспечивается способ ингибирования пролиферации раковых клеток, включающий приведение в контакт одной или более раковых клеток, экспрессирующих LRP5, с эффективным количеством антитела или иммуноконъюгата, которые специфически связываются с LRP5, по меньшей мере, в одном анализе, и ингибируют Wnt3a-индуцированный сигнальный путь, по меньшей мере, в одном анализе.

[00205] В одном варианте осуществления способ лечения рака включает введение антител или иммуноконъюгата, содержащего антитело, где первое антитело блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5 или LRP6, и второе антитело блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5 или LRP6, отличным от Wnt3a, у субъекта, нуждающегося в этом. Настоящее изобретение также относится к антителам или иммуноконъюгату, содержащему антитело, где первое антитело блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5 или LRP6, и второе антитело блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5 или LRP6, отличным от Wnt3a, для применения в лечении рака. Настоящее изобретение также относится к применению антител или иммуноконъюгатов, содержащих антитело, где первое антитело блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5 или LRP6, и второе антитело блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5 или LRP6, отличным от Wnt3a, для лечения рака. Настоящее изобретение также относится к применению антител или иммуноконъюгатов, содержащих антитело, где первое антитело блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5 или LRP6, и второе антитело блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5 или LRP6, отличным от Wnt3a, в производстве лекарственного средства для лечения рака.

[00206] В одном варианте осуществления антитело или иммуноконъюгат представляет собой антитело или иммуноконъюгат, описанные здесь, например, антитело или иммуноконъюгат, которые содержат набор последовательностей CDR (полная, легкая цепь или тяжелая цепь), соответствующий антителу, выбранному из LRP5 - A7, LRP5 - A9, LRP5 - C5, LRP5 - C12, LRP5 - D9, LRP5 - E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

IX. Способы введения

[00207] Анти-LRP антитела по изобретению могут эффективно доставлять терапевтическую композицию в клетки с сигнальным путем Wnt in vivo. В некоторых вариантах осуществления способ лечения включает введение субъекту эффективного количества терапевтического анти-LRP конъюгата, например, анти-LRP антитела, присоединенного к терапевтическому агенту. В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагностирован рак. В некоторых вариантах осуществления субъект получает или получал лечение рака, например, хирургическое вмешательство, лучевую терапию или химиотерапию. В некоторых вариантах осуществления у субъекта был диагностирован рак, но рак находится в стадии ремиссии.

[00208] В некоторых вариантах осуществления анти-LRP конъюгат включает липосому. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает наблюдение за субъектом в отношении прогрессирования рака. В некоторых вариантах осуществления доза анти-LRP конъюгата для каждого введения определяется на основе терапевтического прогресса у субъекта, например, когда вводят более высокую дозу химиотерапевтического средства, если субъект недостаточно отвечает на терапию.

[00209] В некоторых вариантах осуществления изобретение может включать антитело или антитело-нацеленную композицию и физиологически (т.е. фармацевтически) приемлемый носитель. Термин «носитель» относится к обычному инертному веществу, используемому в качестве разбавителя или носителя для диагностического или терапевтического средства. Данный термин также включает обычное инертное вещество, которое придает композиции когезивные свойства. Физиологически приемлемые носители могут представлять собой жидкость, например физиологический раствор, фосфатный буфер, нормальный забуференный физиологический раствор (135-150 мМ NaCl), воду, забуференную воду, 0,4% солевой раствор, 0,3% глицин, гликопротеины для обеспечения повышенной стабильности (например, альбумин, липопротеин, глобулин и др.) и тому подобное. Поскольку физиологически приемлемые носители частично определяются конкретной вводимой композицией, а также конкретным способом, используемым для введения композиции, то существует большое разнообразие подходящих составов для фармацевтических композиций по настоящему изобретению (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17 th ed., 1989).

[00210] Композиции по настоящему изобретению можно стерилизовать обычными, хорошо известными методами стерилизации, или они могут быть получены в стерильных условиях. Водные растворы могут быть упакованы для применения или профильтрованы в асептических условиях и лиофилизированы, где перед введением лиофилизированный препарат смешивают со стерильным водным раствором. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как агенты, регулирующие рН и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, смачивающие агенты и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитан монолаурат и олеат триэтаноламина. Также могут быть включены сахара для стабилизации композиций, такие как стабилизатор для лиофилизированных композиций антител.

[00211] Лекарственные формы можно приготовить для мукозального (например, назального, сублингвального, вагинального, буккального или ректального), парентерального (например, подкожной, внутривенной, внутримышечной или внутриартериальной инъекции, в виде болюса или инфузии), перорального или чрескожного введения пациенту. Примеры лекарственных форм включают, не ограничиваясь этим: дисперсии; суппозитории; мази; катаплазмы (припарки); пасты; порошки; повязки; кремы; пластыри; растворы; патчи; аэрозоли (например, назальные спреи или ингаляторы); гели; жидкие лекарственные формы, подходящие для перорального или мукозального введения пациенту, включая суспензии (например, водные или неводные жидкие суспензии, эмульсии масло-в-воде или жидкие эмульсии вода-в-масле), растворы и эликсиры; жидкие лекарственные формы, подходящие для парентерального введения пациенту; и стерильные твердые вещества (например, кристаллические или аморфные твердые вещества), которые могут быть восстановлены для получения жидких лекарственных форм, подходящих для парентерального введения пациенту.

[00212] Композиции для инъекций (например, для внутривенного введения) могут содержать раствор антитела или антитело-нацеленной композиции, суспендированной в приемлемом носителе, таком как водный носитель. Можно использовать любой из множества водных носителей, например воду, забуференную воду, 0,4% солевой раствор, 0,9% изотонический физиологический раствор, 0,3% глицин, 5% декстрозу и т.п., и они могут включать гликопротеины для повышения стабильности, такие как альбумин, липопротеин, глобулин и т. д. Часто используется нормальный забуференный физиологический раствор (135-150 мМ NaCl). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества для приближения к физиологическим условиям, такие как регуляторы рН и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, смачивающие агенты, например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитана монолаурат, олеат триэтаноламина и т.д. В некоторых вариантах осуществления антитело-нацеленная композиция может быть включена в состав набора для внутривенного введения.

[00213] Составы, подходящие для парентерального введения, например, такого как интраартикулярное (в суставы), внутривенное, внутримышечное, интратуморальное, внутрикожное, внутрибрюшинное и подкожное введение, включают водные и неводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые делают состав изотоническим с кровью предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Растворы и суспензии для инъекций можно приготовить также из стерильных порошков, гранул и таблеток. В практике настоящего изобретения композиции можно вводить, например, внутривенной инфузией, местно, внутрибрюшинно, внутрипузырно или интратекально. Парентеральное введение и внутривенное введение являются предпочтительными способами введения. Составы нацеленных композиций могут быть представлены в однодозовых или многодозовых герметичных контейнерах, таких как ампулы и флаконы.

[00214] Выбранная композиция для адресной доставки, отдельно или в комбинации с другими подходящими компонентами, может быть формулирована в виде аэрозольных составов (для «распыления») для введения посредством ингаляции. Аэрозольные составы можно поместить в приемлемые пропелленты под давлением, такие как дихлордифторметан, пропан и азот.

[00215] Фармацевтический препарат может быть упакован или приготовлен в разовой лекарственной форме. В такой форме препарат разделяют на разовые дозы, содержащие соответствующие количества активного компонента, например, в соответствии с дозой терапевтического средства или концентрацией антитела. Разовая лекарственная форма может представлять собой упакованный препарат, где упаковка содержит дискретные количества препарата. Композиция может, при желании, также содержать другие совместимые терапевтические агенты.

[00216] Антитело (или антитело-нацеленную композицию) можно вводить инъекцией или инфузией любым подходящим путем, включая, не ограничиваясь этим, внутривенный, подкожный, внутримышечный или внутрибрюшинный пути. Пример введения фармацевтической композиции включает нахождение антитела в концентрации 10 мг/мл в стерильном изотоническом водном физиологическом растворе для инъекций при 4°C и разведение его либо в 100 мл, либо в 200 мл 0,9% хлорида натрия для инъекций перед введением пациенту. Антитело вводят внутривенной инфузией в течение 1 ч в дозе от 0,2 до 10 мг/кг. В еще одних вариантах осуществления антитело вводят внутривенной инфузией в течение периода времени от 15 мин до 2 ч. В еще одних вариантах осуществления процедура введения представляет собой подкожную болюсную инъекцию.

[00217] Доза антитела выбирается для обеспечения эффективной терапии пациента и находится в диапазоне от менее, чем 0,1 мг/кг массы тела до примерно 25 мг/кг массы тела или в диапазоне 1 мг-2 г на пациента. В некоторых случаях доза находится в диапазоне 1-100 мг/кг или примерно 50-8000 мг/пациента. Дозу можно вводить повторно с соответствующей частотой, которая может находиться в диапазоне от одного раза в день до одного раза в три месяца, в зависимости от фармакокинетики антитела (например, периода полувыведения антитела из кровотока) и фармакодинамического ответа (например, продолжительности терапевтического действия антитела). В некоторых вариантах осуществления период полувыведения in vivo составляет примерно от 7 до примерно 25 суток, и дозирование антител повторяют от одного раза в неделю до одного раза в 3 месяца.

[00218] Введение может быть периодическим. В зависимости от пути введения дозу можно вводить, например, один раз в 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 или 28 суток или дольше (например, один раз в 2, 3, 4 или 6 месяцев). В некоторых случаях введение проводят чаще, например, 2 или 3 раза в сутки. За пациентом можно наблюдать, чтобы корректировать дозировку и частоту введения в зависимости от терапевтического прогресса и любых неблагоприятных побочных эффектов, как понятно специалистам в данной области.

[00219] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления дополнительное введение зависит от прогресса у пациента, например, пациент находится под наблюдением между введениями. Например, после первого введения или цикла введения у пациента можно контролировать скорость роста опухоли, рецидивы (например, в случае послеоперационного пациента) или общие симптомы, связанные с заболеванием, такие как слабость, боль, тошнота и т.д.

[00220] При терапевтическом применении для лечения рака антитело-нацеленную композицию (например, включающую терапевтический и/или диагностический агент), можно вводить в начальной дозе примерно от 0,001 мг/кг до примерно 1000 мг/кг раз в сутки и корректировать во времени. Можно использовать диапазон суточной дозы примерно от 0,01 мг/кг до примерно 500 мг/кг, или примерно от 0,1 мг/кг до примерно 200 мг/кг, или примерно от 1 мг/кг до примерно 100 мг/кг, или примерно от 10 мг/кг до 50 мг/кг. Дозировка варьируется в зависимости от потребностей пациента, тяжести патологического состояния, подлежащего лечению, и используемой нацеленной композиции. Например, дозировки могут быть определены эмпирически с учетом типа и стадии рака, диагностированного у конкретного пациента. Доза, вводимая пациенту в контексте настоящего изобретения, должна быть достаточной для того, чтобы с течением времени оказывать благотворное терапевтическое воздействие на пациента. Также величина дозы будет определяться наличием, характером и степенью проявления любых неблагоприятных побочных эффектов, которые сопровождают введение конкретной нацеленной композиции у конкретного пациента, что будет определяться квалифицированным практикующим врачом.

[00221] Вышеприведенное раскрытие описывает настоящее изобретение, в общем. Более полное понимание можно получить, обратившись к следующим конкретным примерам. Эти примеры описаны исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема заявки. Изменения в форме и замена эквивалентов рассматриваются в зависимости от обстоятельств, которые могут быть предложены или оказаться целесообразными. Несмотря на то, что в данном документе используются конкретные термины, они предназначены в описательном смысле, и не для целей ограничения.

Примерные варианты осуществления

[00222] 1. Антитело, которое специфически связывается с LRP5, содержащее вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность участки CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, вариабельная область легкой цепи содержит определяющие комплементарность участки CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где аминокислотные последовательности указанных CDR содержат или состоят из последовательностей CDR, выбранных из: наборов последовательностей CDR анти-LRP5 антител: LRP5-A7, LRP5 - A9, LRP5 - C5, LRP5 - C12, LRP5 - D9, LRP5 - E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3 , LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[00223] 2. Антитело по варианту осуществления 1, где аминокислотные последовательности указанных CDR содержат или состоят из последовательностей, выбранных из последовательностей, приведенных ниже:

CDR-H1 выбран из группы, состоящей из LSYYYM, ISYSYI, LSYSSM, ISSYSI, ISYSYI, IYSYSI, LSYYYM, FSSSSI, LYYYYI, LSYSSI, IYSYYI, LLYYSSM и FSSSSI;

CDR-H2 выбран из группы, состоящей из SIYPYYGYTY, SSSYYGYTY, SISSSYGYTY, SIYSSYGSTS, SIYSSYGYTY, SIYPYSSYTS, SIYSSYGYTY, SIYPSYGYTY, SISPYYGYTS, SISSSYGSTS, SIYSYYGYTY, SISSSYGYTY, SISSTSSYGYTY SISSYYSYTS и;

CDR-H3 выбран из группы, состоящей из HGAM, TVRGSKKPYFSGWAM, SSYYSSVSSSVYAL, TVRGSKKPYFSGWAM, HYSYFFYAM, YAVYFPGYYWGM, WSHVSGHYSGM, WGAYHSSGYGM, GGSGVSHYGSVYYSWWAL, AAPYYGYYYSYAM, SGYGWYAM, GYWAI, SYPAM, SWAM; YWAL, GWGSPASAGYYGL, SSYYSSVSSSVYAL, TVRGSKKPYFSGWAM и TVRGSKKPYFSGWAM;

CDR-L1 представляет собой SVSSA;

CDR-L2 представляет собой SASSLYS; и

[00224] CDR-L3 выбран из группы, состоящей из AWGWGLF, VHYSPYSLI, YQYSGLI, FSHVSLI, ASYSPI, YHYYYLF, ASYAPI, SSSSPI, SSYSLI, GVSLI, YWFLI, PVGHYGYPI, SSYSPI, YWAYYSPI, VSYYPLI, SSYSLI и VHYSPYSLI.

[00225] 3. Антитело по варианту осуществления 2, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:

i) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, приведенную в таблице 2;

ii) аминокислотную последовательность, по меньшей мере, с 50%, по меньшей мере, с 60%, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 80%, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере, с 95%, по меньшей мере, с 98% или, по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи, приведенной в таблице 2, где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, приведенных в таблице 1, или;

iii) консервативно замещенную аминокислотную последовательность по п.i), где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, приведенных в таблице 1.

[00226] 4. Антитело по любому из вариантов осуществления 2 или 3, где указанное антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую:

i) аминокислотную последовательность легкой цепи, приведенную в таблице 2,

ii) аминокислотную последовательность, по меньшей мере, с 50%, по меньшей мере, с 60%, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 80%, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере, с 95%, по меньшей мере, с 98% или, по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью легкой цепи, приведенную в таблице 2, где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, приведенных в таблице 1, или;

iii) консервативно замещенную аминокислотную последовательность по п.i), где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, приведенных в таблице 1.

[00227] 5. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-4, где последовательности CDR представляют собой полный набор последовательностей CDR, выбранный из антитела, идентифицированного в таблице 1.

[00228] 6. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-5, где антитело перекрестно реагирует с LRP6.

[00229] 7. Антитело по варианту осуществления 1, где последовательности CDR содержат набор последовательностей CDR легкой цепи или набор последовательностей CDR тяжелой цепи, выбранный из антитела, идентифицированного в таблице 1.

[00230] 8. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-7, где указанное антитело специфически связывается с LRP5.

[00231] 9. Антитело по варианту осуществления 8, где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR антитела, выбранного из антител LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5-E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[00232] 10. Антитело по вариантам осуществления 1-9, которое блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5.

[00233] 11. Антитело по вариантам осуществления 1-9, которое блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания LRP5, отличным от Wnt3a.

[00234] 12. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-11, где антитело представляет собой моноклональное антитело.

[00235] 13. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-12, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.

[00236] 14. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-13, где антитело представляет собой одноцепочечное антитело.

[00237] 15. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-14, где антитело представляет собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, выбранный из Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, dsFv, ds-scFv, димеров, нанотел, минител, диател и их мультимеров.

[00238] 16. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-14, где антитело представляет собой биспецифическое антитело.

[00239] 17. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-14, где антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое дополнительно связывается с рецептором FZD.

[00240] 18. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-17, имеющее неприродный паттерн гликозилирования.

[00241] 19. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-17, содержащее замену или добавление цистеина, например, в константной области или каркасной области.

[00242] 20. Иммуноконъюгат, содержащий антитело по любому из вариантов осуществления 1-17 и детектируемую метку или цитотоксический агент.

[00243] 21. Иммуноконъюгат по варианту осуществления 20, содержащий цитотоксический агент, выбранный из майтанзиноида, ауристатина, доластатина, тубулизина, криптофицина, димера пирролобензодиазепина (PBD), димера индолинобензодиазепина, альфа-аманитина, трихотена, SN-38, дуокармицина, CC1065, калихеамицина, ендиинового антибиотика, таксана, производных доксорубицина, антрациклина и их стереоизомеров, азанофида, изостеров, аналогов или производных.

[00244] 22. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по любому из вариантов осуществления 1-17.

[00245] 23. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 22, где одна или более последовательностей CDR кодируются нуклеиновой кислотой, приведенной в таблице 2.

[00246] 24. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 22, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодированную нуклеиновой кислотой, содержащей:

i) последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, приведенной в таблице 2;

ii) нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, с 50%, по меньшей мере, с 60%, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 80%, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере, с 95%, по меньшей мере, с 98% или, по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, представленной в таблице 2, где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1, или;

iii) последовательность нуклеиновой кислоты с вырожденными кодонами по п.i), где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1.

[00247] 25. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 22, где антитело содержит вариабельную область легкой цепи, кодированную нуклеиновой кислотой, содержащей:

i) последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, представленную в таблице 2,

ii) последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, с 50%, по меньшей мере, с 60%, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 80% или, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере, с 98% или по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты легкой цепи, представленной в таблице 2, где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1, или

iii) последовательность нуклеиновой кислоты с вырожденными кодонами по п.i), где последовательности CDR представляют собой набор последовательностей CDR, представленных в таблице 1.

[00248] 26. Вектор, содержащий последовательность контроля экспрессии, оперативно связанную с нуклеиновой кислотой по любому из вариантов осуществления 22-25.

[00249] 27. Клетка-хозяин, содержащая молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность контроля экспрессии, оперативно связанную с нуклеиновой кислотой по любому из вариантов осуществления 22-26.

[00250] 28. Клетка-хозяин по варианту осуществления 27, которая представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО).

[00251] 29. Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту осуществления 26.

[00252] 30. Способ получения анти-LRP5 антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по любому из вариантов осуществления 27-29.

[00253] 31. Композиция, содержащая антитело по любому одному или более вариантам осуществления 1-17, иммуноконъюгат по вариантам осуществления 20-21, молекулу нуклеиновой кислоты по вариантам осуществления 22-25, вектор по варианту осуществления 26 или клетку-хозяин по варианту осуществления 29, необязательно с подходящим разбавителем.

[00254] 32. Композиция по варианту осуществления 31, где композиция содержит одно или более антител или иммуноконъюгатов, где необязательно композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

[00255] 33. Набор, содержащий антитело по любому одному или более вариантам осуществления 1-17, иммуноконъюгат по вариантам осуществления 20-21, молекулу нуклеиновой кислоты по вариантам осуществления 22-25, вектор по варианту осуществления 26 или клетку-хозяин по варианту осуществления 29.

[00256] 34. Способ детектирования экспрессии LRP5, где способ включает приведение в контакт образца, содержащего одну или более клеток, с одним или более антителами или иммуноконъюгатами по любому из вариантов осуществления 1-21 в условиях, допускающих образование комплекса антитело:клетка, и детектирование наличия любого комплекса антитела.

[00257] 35. Способ по варианту осуществления 34, где детектирование осуществляется с помощью иммунофлуоресценции.

[00258] 36. Способ по варианту осуществления 34, где детектирование осуществляют с помощью проточной цитометрии.

[00259] 37. Способ по любому из вариантов осуществления 34-36, где способ предназначен для детектирования экспрессии LRP4, и антитело или иммуноконъюгат содержат набор последовательностей CDR, соответствующий антителу, выбранному из LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5- C5, LRP5 - C12, LRP5 - D9, LRP5 - E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[00260] 38. Способ ингибирования связывания лиганда Wnt с рецептором LRP5, нарушения сигнального пути Wnt, ингибирования Wnt-индуцированной транскрипционной активности, ингибирования активации растрепанных белков, стимуляции сохранения деструктивного комплекса бета-катенина, стимуляции накопления бета-катенина или ингибирования роста клетки, где способ включает приведение в контакт клетки, экспрессирующей рецептор LRP5, с антителом или иммуноконъюгатом по любому из вариантов осуществления 1-21.

[00261] 39. Способ по варианту осуществления 38, где антитело или иммуноконъюгат блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5.

[00262] 40. Способ по варианту осуществления 38, где антитело или иммуноконъюгат блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5, отличным от Wnt3a.

[00263] 41. Способ по варианту осуществления 38, где антитело или иммуноконъюгат содержит набор последовательностей CDR, соответствующий антителу, выбранному из группы, состоящей из LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5 - E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[00264] 42. Способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело или иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-21.

[00265] 43. Способ по варианту осуществления 42, где рак выбран из раковых клеток толстого кишечника, легкого, молочной железы, яичника, эндометрия, поджелудочной железы, желудка, печени, адренокортикальной карциномы и остеобластомы.

[00266] 44. Способ по варианту осуществления 42, где рак выбран из острого миелоидного лейкоза, рака предстательной железы, глиобластомы, рака мочевого пузыря и рака шейки матки.

[00267] 45. Способ по варианту осуществления 42, включающий введение субъекту первого и второго антител или конъюгатов антител по любому из вариантов осуществления 1-21, где первое блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5, и второе блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5, отличным от Wnt3a.

[00268] 46. Способ по варианту осуществления 45, где первое антитело или иммуноконъюгат содержит набор последовательностей CDR, выбранных из антител группы эпитопов 2.

[00269] 47. Способ по варианту осуществления 42, где антитело или иммуноконъюгат специфически связывается с LRP5, по меньшей мере, в одном анализе, и ингибирует Wnt3a-индуцированный сигнальный путь, по меньшей мере, в одном анализе, где необязательно антитело или иммуноконъюгат представляет собой антитело или иммуноконъюгат по любому из вариантов осуществления 1-21.

[00270] 48. Способ по варианту осуществления 42, где антитело или иммуноконъюгат содержит набор последовательностей CDR, соответствующий антителу, выбранному из группы, состоящей из LRP5-A7, LRP5-A9, LRP5-C5, LRP5-C12, LRP5-D9, LRP5 - E5, LRP5 - G2, LRP5 - G9, LRP5 - G10, LRP5 - G11, LRP5 - H3, LRP5 - H5, LRP5 - H9, LRP5 - R3O_D3, LRP5 - R3_E8, LRP5 - R3O_G6.

[00271] 49. Способ усиления сигнальной активности связывания лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5, включающий приведение в контакт клетки, экспрессирующей LRP5, с антителом, которое блокирует связывание лигандов Wnt с сайтом связывания в LRP5, отличным от Wnt3a.

[00272] 50. Способ усиления сигнальной активности связывания лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5, отличным от Wnt3a, приведением в контакт клетки, экспрессирующей LRP5, с антителом, которое блокирует связывание лигандов Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5.

[00273] 51. Способ по любому из вариантов осуществления 49 или 50, проводимый in vitro.

[00274] 52. Способ по любому из вариантов осуществления 49 или 50, проводимый in vivo.

Примеры

[00275] Следующие неограничивающие примеры иллюстрируют настоящее изобретение:

[00276] Пример 1

[00277] Библиотека антител в фаговом дисплее

[00278] Библиотеки антител в фаговом дисплее представляют собой эффективную технологию для получения терапевтических антител^17,18. Очень сложные библиотеки из > 10¹⁰ независимых фрагментов антител отображаются на фаговых частицах в виде слитых белковых молекул оболочки и подвергаются скринингу для выделения антител, распознающих представляющие интерес антигены. Авторы изобретения создали библиотеки синтетических антител с антигенсвязывающими сайтами, полностью сконструированными из сконструированных последовательностей. В полученных антителах используется оптимизированная человеческая каркасная область и, таким образом, они являются минимально иммуногенными при последующем применении в качестве потенциальных терапевтических средств. Синтетические антитела обладают высокой стабильностью, и их человеческий каркас и сайты связывания антигена могут быть адаптированы для оптимизации аффинности, специфичности и эффективности.

[00279] Характеристика и оптимизация анти-LRP5 антител

[00280] Пример 2

[00281] Новые синтетические антитела, нацеленные на LRP5, высоко оптимизированную библиотеку Fab-фагов, сконструированную в лаборатории, использовали для создания специфических анти-LRP5 антител посредством прямой селекции на иммобилизованном рекомбинантном ECD LRP5. Клоны Fab-фагов из раундов 3 и 4 подвергали скринингу на связывание с использованием ELISA, и аминокислотные последовательности CDR положительных связующих продуктов представлены на фиг. 1А. Полные последовательности ДНК и аминокислотные последовательности вариабельной области (тяжелые и легкие цепи) IgG представлены в описании выше. Картирование эпитопов с помощью конкурентного ELISA показывает, что антитела связываются с четырьмя уникальными эпитопами на ECO LRP5.

[00282] Полноразмерные IgG1 и фрагменты антител (Fab) очищали и проводили ELISA с одноточечной калибровкой для определения специфичности антител. Как показано на фиг. 1В, все анти-LRP5 антитела связываются с рекомбинантной мышиной химерой LRP5-His. Интересно, что антитела LRP5-H5 и LRP5-R30D3 демонстрируют частичное связывание с рекомбинантной мышиной химерой LRP6-His. Антитело LRP5-R30D3 также демонстрирует частичное связывание с рекомбинантной человеческой химерой LRP6-Fc. Антитело LRP5-R3OD3 также демонстрирует частичное связывание с рекомбинантной человеческой химерой LRP6-Fc, что позволяет предположить, что это антитело может перекрестно реагировать как с LRP5, так и с LRP6. Для определения относительной аффинности антител к рекомбинантному антигену использовали конкурентный ELISA с многоточечной калибровкой. IC50 определяли с использованием нелинейного регрессионного анализа, и значения представлены в таблице 3. Полные кривые доза-ответ и графики нелинейной регрессии представлены на фиг.6.

[00283] В таблице 3 представлены значения IC50 анти-LRP5 антител, определенные с использованием конкурентного ELISA. Логарифм концентрации рекомбинантной человеческой химеры LRP6-Fc (ось x) наносили на график относительно значения OD450 антитела (ось y). IC50 определяли с помощью нелинейного регрессионного анализа.

Таблица 3 IgG1 антитело IC₅₀ (нМ) LRP5-A7 4,68 LRP5-D9 25,11 LRP5-G2 24,21 LRP5-G9 26,44 LRP5-G10 3,02 LRP5-G11 25,11 LRP5-H5 4,44 LRP5-H9 37,46

[00284] Вестерн-блот анализ лизатов цельных клеток показал, что LRP5 экспрессируется на высоком уровне в клеточной линии NSCLC, H23, в клеточной линии тройного негативного рака молочной железы, MOAMB231, и в клеточной линии рака молочной железы, T470 (данные не показаны). LRP5 IgG1 метят поверхности клеток H23 (фиг. 2), MOAMB231 (приложение 3) и T470 (приложение 4) по результатам анализа FACS, и было показано, что анти-LRP5 антитела могут связываться с полноразмерным рецептором, экспрессированным на поверхности этих клеток. Как упоминалось выше, сигнальный путь Wnt инициирует канонический путь, который в первую очередь регулирует стабильность и функцию бета-катенина.

[00285] При стимуляции Wnt уровни бета-катенина в цитозоле и ядре повышаются, что приводит к увеличению опосредованной TCF/LEF (факторами транскрипции) транскрипции. Репортерный анализ TOPflash является широко используемым инструментом для оценки активности бета-катенина in vitro. Вектор состоит из нескольких сайтов связывания TCF/LEF, которые регулируют экспрессию репортерного гена люциферазы светлячка. Было создано несколько линий опухолевых клеток, экспрессирующих этот репортер, для оценки функциональной активности анти-LRP5 антител в регуляции канонического пути Wnt.

[00286] Как показано на фиг.3A, кондиционированные среды, экспрессирующие Wnt3a (Wnt3aCM), индуцируют 120-кратное увеличение репортерной активности люциферазы по сравнению с обработкой контрольными кондиционированными средами (ConCM) в клетках MOAMB231, предварительно обработанных отрицательным контролем IgG1, анти-MBP. Антитела LRP5-G10 и LRP5-H5 достоверно усиливали Wnt3aCM-индуцированную репортерную активность. Аналогичный результат наблюдали в клеточной линии рака молочной железы T47D (фиг. 38) и клеточной линии остеосаркомы U20S (фиг. 3C). В клеточной линии U20S как ConCM-, так и Wnt3aCM-индуцированная репортерная активность усиливалась под действием антител LRP5-G10 и LRP5-H5 (по сравнению с M8P).

[00287] Структурные исследования и исследования с мутагенезом показали, что Wnt3a связывается с доменом, который является уникальным по сравнению с сайтом связывания остальных лигандов Wnt. Более того, результаты недавних исследований показали, что для некоторых лигандов Wnt необходимы как LRP5, так и LRP6, для инициирования канонического пути. Для проверки гипотезы о том, что специфичные к эпитопу анти-LRP5 антитела будут регулировать опосредованную бета-катенином транскрипционную активность Wnt-зависимым образом, авторы оценили репортерную активность в клеточной линии NSCLC, H23. Результаты предыдущих исследований (20) показали, что Wnt2 преимущественно регулирует исходную транскрипционную активность, опосредованную TCF/LEF, и эти клетки не экспрессируют Wnt3a. Как и предполагалось, антитела LRP5-G10 и LRP5-H5 усиливали Wnt3aCM-индуцированную репортерную активность (по сравнению с M8P; фиг. 3D). Интересно, что эти антитела (а также LRP5-A7, другой член этой группы эпитопов) ингибировали исходную (ConCM-индуцированную) репортерную активность (по сравнению с M8P). Более того, антитела к LRP5-D9 и LRP5-G2 достоверно повышают ConCM-индуцированную репортерную активность (по сравнению с MBP). Полученные результаты показывают, что антитела LRP5-G2 и LRP5-G10 индуцируют наиболее сильный эффект на репортерную активность. В соответствии с этим наблюдением, антитело LRP5-G2 потенцирует ConCM-индуцированную репортерную активность дозозависимым образом (фиг. 4А). Интересно, что антитело LRP5-G10 ингибирует ConCM-индуцированную репортерную активность при всех указанных концентрациях. LRP5-G10 Fab также ингибирует ConCM-индуцированную репортерную активность в указанных концентрациях, в то время как LRP5-G2 Fab не воспроизводит эффект IgG1 на репортерную активность (фиг. 4B).

[00288] Эффекты антител LRP5-G2 и LRP5-G10 на проксимальные события сигнального пути Wnt оценивали с использованием вестерн-блоттинга (фиг.5A). Антитело LRP5-G10, но не антитело LRP5-G2, достоверно ингибировало как ConCM-, так и Wnt3aCM-индуцированное фосфорилирование LRP6 в клетках H23. Антитело LRP5-G10 также достоверно снижало общее фосфорилирование LRP6 в клетках H23. Аналогичный эффект на фосфорилирование LRP6 наблюдали во мембранных фракциях, выделенных из клеток H23, обработанных антителами LRP5-G2 и LRP5-G10 перед стимуляцией кондиционированной средой (фиг. 5B). Антитело LRP5-G10 также достоверно снижало уровни белка аксина 1 в клетках, стимулированных Wnt3aCM. Поскольку аксин 1 является компонентом деструктивного комплекса, который регулирует уровень «свободного» пула бета-катенина, то его сниженная экспрессия при обработке антителом LRP5-G10 перед стимуляцией Wnt3aCM может объяснить, почему это антитело эффективно потенцирует Wnt3aCM-индуцированную репортерную активность (фиг. 3).

[00289] Для того, чтобы лучше понять влияние антител на уровни бета-катенина, выделяли цитозольные фракции из клеток H23, обработанных антителами LRP5-G2 и LRP5-G10, перед стимуляцией кондиционированной средой. Как показано на фиг.5B, антитело LRP5-G2 достоверно повышает уровень бета-катенина в клетках, обработанных ConCM, что согласуется с его влиянием на репортерную активность. Аналогично антитело LRP5-G10 немного снижает и увеличивает уровни бета-катенина в клетках, обработанных ConCM.

[00290] Линия клеток NSCLC, H23, служит отличной системой для исследования эффектов совместной обработки анти-LRP5 антителами на репортерную активность TOPflash. Результаты предыдущих исследований авторов изобретения показывают, что антитело LRP5-G2 усиливает ConCM-индуцированную репортерную активность. Напротив, антитело LRP5-G10 ингибирует и усиливает ConCM-индуцированную репортерную активность и Wnt3aCM-индуцированную репортерную активность соответственно. Как показано на фиг.6, потенцирование ConCM-индуцированная репортерная активность под действием LRP5-G2 достоверно ингибируется в присутствии антитела LRP5-G10. Полученные данные показывают, что совместная обработка антителами LRP5-G2 и LRP5-G10 может оказывать сильное ингибирующее действие на Wnt-стимулированную TCF/LEF-опосредованную транскрипцию. Таким образом, воспользовавшись преимуществами в стратегиях дизайна библиотек, авторы изобретения смогли открыть новые анти-LRP5 антитела, которые могут проявлять как антагонистическую, так и потенцирующую активность в отношении проксимальных и дистальных событий, связанных с сигнальным путем бета-катенина. Эти активности также зависят от различных взаимодействий между лигандами Wnt и LRP5. Авторы изобретения активно исследуют эти антитела на предмет их терапевтического потенциала in vitro и in vivo.

[00291] Сокращенные обозначения:

Сокращенное
обозначение Полный термин APC Аденоматозный полипоз толстой кишки CDR Определяющий комплементарность участок CK1 Казеинкиназа 1 Dsh/Dvl Dishevelled ECD Внеклеточный домен ELISA Твердофазный иммуноферментный анализ Fab Антигенсвязывающий фрагмент FACS Флуоресцентно-активированная сортировка клеток Fc Кристаллизующийся фрагмент GSK3b Киназа гликогенсинтазы 3 бета IC₅₀ Половина максимальной ингибирующей концентрации IgG1 Иммуноглобулин G 1 LRP Белок, подобный рецептору липопротеинов низкой плотности OD Оптическая плотность NSCLC Немелкоклеточная карцинома легких

[00292] 1. Saito-Diaz K. et al. The way Wnt works: components and mechanism. Growth Factors Chur Switz., 31, 1-31 (2013).

[00293] 2. Clevers H. & Nusse, R. Wnt/β-catenin signaling and disease. Cell, 149, 1192-1205 (2012).

[00294] 3. Anastas J.N. & Moon R.T. WNT signalling pathways as therapeutic targets in cancer. Nat. Rev. Cancer, 13, 11-26 (2012).

[00295] 4. Baron R. & Kneissel M. WNT signaling in bone homeostasis and disease: from human mutations to treatments. Nat. Med., 19, 179-192 (2013).

[00296] 5. Kim W., Kim M. & Jho E. Wnt/β-catenin signalling: from plasma membrane to nucleus., Biochem. J., 450, 9-21 (2013).

[00297] 6. MacDonald B.T. & He X. Frizzled and LRP5/6 Receptors for Wnt/β-catenin Signaling. Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 4, a007880-a007880 (2012).

[00298] 7. Chen S. et al. Structural and Functional Studies of LRP6 Ectodomain Reveal a Platform for Wnt Signaling. Dev. Cell, 21, 848-861 (2011).

[00299] 8. Johnson M.L. & Summerfield D. T. Parameters of LRP5 from a structural and molecular perspective. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr., 15, 229-242 (2005).

[00300] 9. Niehrs C. & Shen J. Regulation of Lrp6 phosphorylation. Cell. Mol. Life Sci. CMLS, 67, 2551-2562 (2010).

[00301] 10. Williams B.O. & Insogna K. L. Where Wnts Went: The Exploding Field of Lrp5 and Lrp6 Signaling in Bone. J. Bone Miner. Res., 24, 171-178 (2009).

[00302] 11. Hoang B.H. et al. Expression of LDL receptor-related protein 5 (LRP5) as a novel marker for disease progression in high-grade osteosarcoma. Int. J. Cancer J. Int. Cancer, 109, 106-111 (2004).

[00303] 12. Li Y. & Bu G. LRP5/6 in Wnt signaling and tumorigenesis. Future Oncol. Lond. Engl., 1, 6781 (2005).

[00304] 13. Bjorklund P., Svedlund J., Olsson A.-K., Akerstrom G. & Westin G. The Internally Truncated LRP5 Receptor Presents a Therapeutic Target in Breast Cancer. PLoS ONE, 4, e4243 (2009).

[00305] 14. Guo Y. et al. Blocking Wnt/LRP5 signaling by a soluble receptor modulates the epithelial to mesenchymal transition and suppresses met and metalloproteinases in osteosarcoma Saos-2 cells. J. Orthop. Res. Soc., 25, 964-971 (2007).

[00306] 15. Guo Y., Rubin E. M., Xie J., Zi X. & Hoang B. H. Dominant Negative LRP5 Decreases Tumorigenicity and Metastasis of Osteosarcoma in an Animal Model. Clin. Orthop., 466, 2039-2045 (2008).

[00307] 16. Rabbani S.A., Arakelian A. & Farookhi R. LRP5 knockdown: effect on prostate cancer invasion growth and skeletal metastasis in vitro and in vivo. Cancer Med., 2 (5), 625-635 (2013).

[00308] 17. Goel S. et al. Both LRP5 and LRP6 Receptors Are Required to Respond to Physiological Wnt Ligands in Mammary Epithelial Cells and Fibroblasts. J. Biol. Chem., 287, 16454-16466 (2012).

[00309] 18. Lee C.V. et al. High-affinity human antibodies from phage-displayed synthetic Fab libraries with a single framework scaffold. J. Mol. Biol., 340, 1073-1093 (2004).

[00310] 19. Fellouse F. A. & Sidhu S. S. in Phage Disp. Drug Discov. Biotechnol., 709-740 (CRC Press/Taylor & Francis, 2006).

[00311] 20. Akiri G. et al. Wnt pathway aberrations including autocrine Wnt activation occur at high frequency in human non-small-cell lung carcinoma. Oncogene, 28, 2163-2172 (2009).

[00312] В рамках настоящего изобретения, следующие значения применяются, если не указано иное. Слово «может» используется в разрешительном смысле (т. е. в значении «иметь возможность»), а не в обязательном (т. е. в значении «должен»). Слова «включать», «включая» и «включает» и т.п. означают включение, не ограничиваясь этим. Формы единственного числа «a», «an» и «the» включают множественное число. Таким образом, например, ссылка на «элемент» включает комбинацию двух или более элементов, несмотря на использование других терминов и выражений для одного или более элементов, таких как «один или более». Выражение «по меньшей мере, один» включает «один или более», «один или множество» и «множество». Термин «или» является, если не указано иное, неисключающим, т. е. охватывает как «и», так и «или». Термин «любой из» между определителем и последовательностью означает, что определитель модифицирует каждый элемент последовательности. Так, например, выражение «по меньшей мере, любой из 1, 2 или 3» означает «по меньшей мере, 1, по меньшей мере, 2 или, по меньшей мере, 3». Выражение «состоящий по существу из» относится к включению перечисленных элементов и других элементов, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики заявленной комбинации.

[00313] Следует понимать, что описание и чертежи не предназначены для ограничения изобретения конкретной раскрытой формой, а, наоборот, цель состоит в том, чтобы охватить все модификации, эквиваленты и альтернативы, подпадающие под сущность и объем настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения. Дальнейшие модификации и альтернативные варианты осуществления различных аспектов изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники с учетом данного описания. Следовательно, данное описание и чертежи должны рассматриваться только в качестве иллюстративных, и предназначены для представления специалистам в данной области техники общему способу осуществления изобретения. Следует понимать, что формы изобретения, показанные и описанные здесь, следует рассматривать в качестве примеров вариантов осуществления. Элементы и материалы могут быть заменены иллюстрированными и описанными здесь, части и процессы могут быть заменены на противоположные или опущены, и некоторые признаки изобретения могут быть использованы независимо, все это будет очевидно специалисту в данной области техники после того, как он получит пользу из данного описания изобретения. В элементы, описанные здесь, могут быть внесены изменения без отклонения от сущности и объема изобретения, которые определяются следующей формулой изобретения. Заголовки, используемые здесь, предназначены только для организационных целей и не предназначены для ограничения объема описания.

[00314] Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были конкретно и отдельно указаны для включения посредством ссылки.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитела, которые специфически связываются с LRP5, содержащие их иммуноконъюгаты и композиции, а также способы их применения. Кроме того, раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные антитела, векторы экспрессии и клетки-хозяева, содержащие указанные нуклеиновые кислоты, способ получения антител. Изобретение обеспечивает новый набор синтетических антител, нацеленных на внеклеточные эпитопы LRP5. 11 н. и 17 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 2 пр.

1. Антитело, которое специфически связывается с LRP5, содержащее вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, содержащие:

CDR-H1, содержащую FSSSSI (SEQ ID NO: 4),

CDR-H2, содержащую SISSSYGYTY (SEQ ID NO: 13),

CDR-H3, содержащую SWAM (SEQ ID NO: 33),

CDR-L1, содержащую SVSSA (SEQ ID NO: 34),

CDR-L2, содержащую SASSLYS (SEQ ID NO: 35), и

CDR-L3, содержащую YWAYYSPI (SEQ ID NO: 49).

2. Антитело по п. 1, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:

i) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 99;

ii) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности тяжелой цепи любой из SEQ ID NO: 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115 и 119, где последовательности CDR являются последовательностями по п. 1,

iii) консервативно замещенную аминокислотную последовательность из i).

3. Антитело по п. 1 или 2, где указанное антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую:

i) аминокислотную последовательность легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 101,

ii) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи любой из SEQ ID NO: 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117 и 121, где последовательности CDR представляют собой последовательности по п. 1, или

iii) консервативно замещенную аминокислотную последовательность из i).

4. Антитело по любому из пп. 1-3, которое блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания Wnt3a в LRP5.

5. Антитело по любому из пп. 1-4, которое блокирует связывание лиганда Wnt с сайтом связывания в LRP5, отличным от Wnt3a.

6. Антитело по любому из пп. 1-5, где антитело представляет собой моноклональное антитело.

7. Антитело по любому из пп. 1-6, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.

8. Антитело по любому из пп. 1-7, где антитело представляет собой одноцепочечное антитело.

9. Антитело по любому из пп. 1-8, где антитело представляет собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, выбранный из Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, dsFv, ds-scFv, димеров, нанотел, минител, диател и их мультимеров.

10. Антитело по любому из пп. 1-9, имеющее неприродный паттерн гликозилирования.

11. Антитело по любому из пп. 1-9, содержащее замену или добавление цистеина, например, в константной области или каркасной области.

12. Иммуноконъюгат, который специфически связывается с LRP5, содержащий антитело по любому из пп. 1-9 и детектируемую метку.

13. Иммуноконъюгат, который специфически связывается с LRP5, содержащий антитело по любому из пп. 1-9 и цитотоксический агент.

14. Иммуноконъюгат по п. 13, содержащий цитотоксический агент, выбранный из майтанзиноида, ауристатина, доластатина, тубулизина, криптофицина, димера пирролобензодиазепина (PBD), димера индолинобензодиазепина, альфа-аманитина, трихотена, SN-38, дуокармицина, CC1065, калихеамицина, ендиинового антибиотика, таксана, производных доксорубицина, антрациклина и их стереоизомеров, азанофида, изостеров, аналогов или производных.

15. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по любому из пп. 1-9.

16. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 15, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодированную нуклеиновой кислотой, содержащей:

i) последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 98;

ii) нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности нуклеиновой кислоты тяжелой цепи SEQ ID NO: 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114 и 118, где последовательности CDR являются последовательностями по п. 1; или

iii) последовательность нуклеиновой кислоты с вырожденными кодонами из i).

17. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 15, где антитело содержит вариабельную область легкой цепи, кодированную нуклеиновой кислотой, содержащей:

i) последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 100,

ii) последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, которая на 95% идентична последовательности нуклеиновой кислоты легкой цепи с SEQ ID NO: 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116 и 120, где последовательности CDR представляют собой последовательности по п. 1, или

iii) последовательность нуклеиновой кислоты с вырожденными кодонами из i).

18. Экспрессионный вектор, содержащий последовательность контроля экспрессии, оперативно связанную с нуклеиновой кислотой по любому из пп. 15-17.

19. Клетка-хозяин, экспрессирующая антитело по любому из пп. 1-9, содержащая молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность контроля экспрессии, оперативно связанную с нуклеиновой кислотой по любому из пп. 15-17.

20. Клетка-хозяин по п. 18, которая представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО).

21. Клетка-хозяин, экспрессирующая антитело по любому из пп. 1-9, содержащая вектор по п. 18.

22. Способ получения анти-LRP5 антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по любому из пп. 19-21.

23. Композиция для лечения расстройства, ассоциированного с LRP5, у субъекта, нуждающегося в этом, содержащая антитело по любому одному или более пп. 1-9, или иммуноконъюгат по п. 12 или 13 и подходящий разбавитель.

24. Композиция по п. 23, где композиция содержит одно или более антител или иммуноконъюгатов, где необязательно композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

25. Набор для внутривенного введения, содержащий антитело по любому одному или более пп. 1-9, иммуноконъюгат по п. 12 или 13 и инструкцию по применению.

26. Способ детектирования экспрессии LRP5, где способ включает приведение в контакт образца, содержащего одну или более клеток, с одним или более антителами по любому из пп. 1-9 или иммуноконъюгатами по п. 12 или 13 в условиях, допускающих образование комплекса антитело:клетка, и детектирование наличия любого комплекса антитела.

27. Способ по п. 26, где детектирование осуществляется с помощью иммунофлуоресценции.

28. Способ по п. 26, где детектирование осуществляют с помощью проточной цитометрии.