АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР Российский патент 2024 года по МПК C07K14/705 C07K14/725 A61K35/17 A61P35/00 

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к антигенному рецептору и тому подобное.

Уровень техники

[0002] В дополнение к хирургической операции, лучевой терапии и химиотерапии, иммунотерапия привлекает внимание в качестве четвертого метода лечения рака. Примеры иммунотерапии, доступной в настоящее время, или которая будет одобрена в будущем для применения в Японии, включают ингибиторы иммунных контрольных точек и Т-клеточную терапию, модифицированную геном химерного антигенного рецептора (CAR). CAR-T-клеточная терапия, нацеленная на CD19, которая, как ожидается, будет эффективна против трудноизлечимого B-клеточного острого лимфобластного лейкоза (B-ALL) и диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (DLBCL), была одобрена в Соединенных Штатах, Европе и других странах с 2017 г. и была одобрена в марте 2019 г. в Японии. Несмотря на то, что эта терапия оказывает заметное влияние на трудноизлечимые случаи, резистентные к обычному лечению, включая трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток, имеется немало рецидивов и рефрактерных случаев; таким образом, желательно дальнейшее ее усовершенствование. Ожидается, что в будущем будет разработана CAR-T-клеточная терапия для солидных опухолей.

[0003] С целью усиления эффекта CAR-T-клеточной терапии проводятся исследования, например, по комбинированному применению с ингибиторами иммунных контрольных точек и улучшению метаболизма в микроокружении опухоли. Привлекает к себе внимание сообщение о том, что CD19 CAR-T-клетки с лигандом костимуляторной молекулы 4-1BB, связанным с CD28-CD3ξ в качестве внутриклеточного домена, обладают высокой устойчивостью и более сильными противоопухолевыми эффектами (непатентный документ 1).

Список цитированных ссылок

Непатентный документ

[0004] NPL 1: Zhao Z. et al. Cancer Cell, 28(4): 415-428, 2015.

Сущность изобретения

Техническая задача

[0005] Целью настоящего изобретения является создание нового антигенного рецептора. Предпочтительно целью настоящего изобретения является создание антигенного рецептора с высоким терапевтическим или профилактическим эффектом в отношении рака.

Решение технической задачи

[0006] Авторы настоящего изобретения провели обширные исследования в связи с вышеуказанной задачей и обнаружили, что эту задачу можно решить с помощью антигенного рецептора, который содержит домен GITRL в положении ближе к С-концу через саморасщепляющийся пептидный домен. Авторы настоящего изобретения провели дополнительные исследования на основе этого открытия и завершили настоящее изобретение. В частности, настоящее изобретение включает следующий предмет изобретения.

[0007] Пункт 1. Антигенный рецептор, содержащий домен GITRL в положении ближе к С-концу через саморасщепляющийся пептидный домен.

[0008] Пункт 2. Антигенный рецептор по п.1, содержащий коровый домен, содержащий вариабельную область антитела или Т-клеточного рецептора, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR.

[0009] Пункт 3. Антигенный рецептор по п.2, содержащий домен GITRL в положении ближе к С-концу корового домена через саморасщепляющийся пептидный домен.

[0010] Пункт 4. Антигенный рецептор по пп.2 или 3, где коровый домен дополнительно содержит внутриклеточный домен костимулятора.

[0011] Пункт 5. Антигенный рецептор по п.4, где костимулятор представляет собой CD28.

[0012] Пункт 6. Антигенный рецептор по любому из пп.1-5, который представляет собой химерный антигенный рецептор или Т-клеточный рецептор.

[0013] Пункт 7. Антигенный рецептор по любому из пп.2-6, где вариабельная область способна связываться с CD19.

[0014] Пункт 8. Полинуклеотид, кодирующий антигенный рецептор по любому из пп.1-7.

[0015] Пункт 9. Клетка, содержащая полинуклеотид по п.9.

[0016] Пункт 10. Клетка по п.9, которая представляет собой αβ-Т-клетку, γδ-Т-клетку или NK-клетку.

[0017] Пункт 11. Фармацевтическая композиция, содержащая клетку по п.10.

[0018] Пункт 12. Фармацевтическая композиция по п.11, предназначенная для применения в лечении или профилактике рака.

Преимущественные эффекты изобретения

[0019] Настоящее изобретение относится к новому антигенному рецептору. С использованием антигенного рецептора можно эффективно лечить или профилактировать рак.

Краткое описание фигур

[0020]

На фиг. 1 схематично показано структура 28z CAR.

На фиг. 2 показана нуклеотидная последовательность CD19 28z CAR.

На фиг. 3 приведена нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность CD19 28z GITRL CAR.

На фиг. 4 приведены результаты экспериментального примера 3 (экспрессия CAR в αβ-клетках, когда внутриклеточный домен представляет собой CD28). Относительное количество клеток, экспрессирующих CAR, представлено в процентах. NGMC указывает на клетки с немодифицированным геном (то же самое относится и к другим фигурам).

На фиг. 5 приведены результаты экспериментального примера 3 (экспрессия CAR в γδ-клетках, когда внутриклеточный домен представляет собой CD28). Относительное количество клеток, экспрессирующих CAR, представлено в процентах.

На фиг. 6 приведены результаты экспериментального примера 3 (экспрессия CAR в αβ-клетках, когда внутриклеточный домен представляет собой GITR). Относительное количество клеток, экспрессирующих CAR, представлено в процентах.

На фиг. 7 приведены результаты экспериментального примера 3 (экспрессия CAR в γδ-клетках, когда внутриклеточный домен представляет собой GITR). Относительное количество клеток, экспрессирующих CAR, представлено в процентах.

На фиг. 8 приведены результаты экспериментального примера 4 (экспрессия IFN-γ в αβ-клетках, когда внутриклеточный домен представляет собой CD28). Относительное количество CAR-экспрессирующих клеток и относительное количество IFN-γ-продуцирующих клеток в CAR-экспрессирующих клетках представлено в процентах.

На фиг. 9 приведены результаты экспериментального примера 4 (экспрессия IFN-γ в γδ-клетках, когда внутриклеточный домен представляет собой CD28). Относительное количество CAR-экспрессирующих клеток и относительное количество IFN-γ-продуцирующих клеток в CAR-экспрессирующих клетках представлено в процентах.

На фиг. 10 приведены результаты экспериментального примера 4 (экспрессия IFN-γ в αβ-клетках, когда внутриклеточный домен представляет собой GITR). Относительное количество CAR-экспрессирующих клеток и относительное количество IFN-γ-продуцирующих клеток в CAR-экспрессирующих клетках представлено в процентах.

На фиг. 11 приведены результаты экспериментального примера 4 (экспрессия IFN-γ в γδ-клетках, когда внутриклеточный домен представляет собой GITR). Относительное количество CAR-экспрессирующих клеток и относительное количество IFN-γ-продуцирующих клеток в CAR-экспрессирующих клетках представлено в процентах.

На фиг. 12 приведено обобщение результатов экспериментальных примеров 3 и 4 для αβ-клеток (экспрессия CAR и продукция IFNγ).

На фиг. 13 приведено обобщение результатов экспериментальных примеров 3 и 4 для γδ-клеток (экспрессия CAR и продукция IFNγ).

На фиг. 14 приведены средние значения соотношения GITRL-связанной формы и GITRL-несвязанной формы (GITRL-связанная форма/GITRL-несвязанная форма) в результатах в нижнем ряду каждой из фиг. 12 и 13.

На фиг. 15 приведены результаты экспериментального примера 5 (результаты по αβ-клеткам). В верхнем ряду показаны результаты по цитотоксичности, анализированные во времени при использовании каждого вида эффекторных клеток. В среднем ряду показаны результаты по цитотоксичности через 5, 20, 40, 60, 80, 100 и 120 ч. В нижнем ряду показано время, необходимое для повреждения половины клеток-мишеней. В верхнем и среднем рядах на вертикальной оси представлена цитотоксическая активность (%), измеренная с использованием анализа xCELLigence, и на горизонтальной оси представлено время, прошедшее с момента добавления эффекторных клеток. Столбцы на каждой гистограмме слева показывают вариант опыта, когда эффекторным клеткам не давали возможность функционировать, вариант опыта, когда эффекторным клеткам, в которые был введен CD19 28z, давали возможность функционировать, и вариант опыта, когда эффекторным клеткам, в которые был введен CD19 28z-GITRL, давали возможность функционировать.

На фиг. 16 приведены результаты экспериментального примера 5 (результаты по γδ-клеткам). В верхнем ряду показаны результаты по цитотоксичности, анализированные во времени при использовании каждого вида эффекторных клеток. В среднем ряду показаны результаты по цитотоксичности через 5, 20, 40, 60, 80, 100 и 120 ч. В нижнем ряду показано время, необходимое для повреждения половины клеток-мишеней. В верхнем и среднем рядах на вертикальной оси представлена цитотоксическая активность (%), измеренная с использованием анализа xCELLigence, и на горизонтальной оси представлено время, прошедшее с момента добавления эффекторных клеток. Столбцы на каждой гистограмме слева показывают вариант опыта, когда эффекторным клеткам не давали возможность функционировать, вариант опыта, когда эффекторным клеткам, в которые был введен CD19 28z, давали возможность функционировать, и вариант опыта, когда эффекторным клеткам, в которые был введен CD19 28z-GITRL, давали возможность функционировать.

На фиг. 17 приведены результаты экспериментального примера 6. PBS указывает на случай, когда PBS вводили без введения CAR-T-клеток, NGM-αβT указывает на случай, когда вводили NGM (немодифицированные геном) Т-клетки, CD19 28z-αβT указывает на случай, где вводили Т-клетки, в которые ввели CD19 28z, CD19 28z-GITRL-αβT указывает на случай, где вводили Т-клетки, в которые ввели CD19 28z-GITRL.

На фиг. 18 приведены результаты экспериментального примера 7. Относительное количество IFN-γ-позитивных клеток в CD19CAR-позитивных клетках показано в каждой из фракций CD8 и CD4 (в рамке желтые, красные буквы).

На фиг. 19 приведены результаты экспериментального примера 8. Соотношения эффекторных Т-клеток памяти и Т-клеток центральной памяти показаны в каждой из фракций TMRM низкая и TMRM высокая.

На фиг. 20 приведены результаты экспериментального примера 9. На вертикальной оси представлена цитотоксическая активность (%), измеренная с использованием анализа xCELLigence, и на горизонтальной оси представлено время, прошедшее с момента добавления эффекторных клеток.

На фиг. 21 приведены результаты экспериментального примера 10. На вертикальной оси представлено соотношение обилия инфузированных клеток в периферической крови.

На фиг. 22 приведены результаты экспериментального примера 11. Результаты представляют собой результаты анализа периферической крови мыши через 38 суток после клеточной терапии, т. е. через 10 суток после второй инокуляции клеток NALM6 (NALM6/luc 5×10⁶ клеток в/в/мышь, соотношение эффектор:мишень=1:1).

На фиг. 23 приведены результаты экспериментального примера 12. Они представляют результаты анализа периферической крови мыши № 2, получавшей клетки 28z-GITRL CAR-T, через 55 суток после клеточной терапии, т.е. через 27 суток после второй прививки лейкозных клеток NALM6 для индукции опухолей у мыши.

Подробное описание вариантов осуществления изобретения

[0021] В рамках настоящего изобретения, термины «содержащий», «состоящий» и «включающий» включают понятия «содержащий», «состоящий», «состоящий по существу из» и «состоящий из».

[0022] 1. Определения

В рамках настоящего изобретения, термины «содержащий», «состоящий» и «включающий» включают понятия «содержащий», «состоящий», «состоящий по существу из» и «состоящий из».

[0023] В рамках настоящего изобретения, термин «идентичность» аминокислотных последовательностей относится к степени, в которой две или более разных аминокислотных последовательностей соответствуют друг другу. Таким образом, чем выше степень совпадения между двумя аминокислотными последовательностями, тем выше идентичность или сходство этих последовательностей. Уровень идентичности аминокислотной последовательности определяют, например, с помощью FASTA (инструмента для анализа последовательности) с параметрами по умолчанию. В качестве альтернативы уровень идентичности аминокислотной последовательности можно определить с использованием алгоритма BLAST Karlin and Altschul (Karlin S., Altschul S.F. Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scorings schemes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268(1990), Karlin S., Altschul S.F. Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-7(1993)). На основе этого алгоритма BLAST была разработана программа под названием «BLASTX». Конкретные методы этих способов анализа известны, и их можно найти на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). «Идентичность» нуклеотидных последовательностей также определяется аналогично, как описано выше.

[0024] В рамках настоящего изобретения, термин «консервативная замена» означает замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Например, замена между аминокислотными остатками, имеющими основную боковую цепь, такими как лизин, аргинин или гистидин, считается консервативной заменой. Следующие замены между другими аминокислотными остатками также считаются консервативными заменами: замена между аминокислотными остатками, имеющими кислую боковую цепь, такими как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота; замену между аминокислотными остатками, имеющими незаряженную полярную боковую цепь, такими как глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин или цистеин; замену между аминокислотными остатками, имеющими неполярную боковую цепь, такими как аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин или триптофан; замену между аминокислотными остатками, имеющими бета-разветвленную боковую цепь, такими как треонин, валин или изолейцин; и замену между аминокислотными остатками, имеющими ароматическую боковую цепь, такими как тирозин, фенилаланин, триптофан или гистидин.

[0025] В рамках настоящего изобретения, термин «CDR» является аббревиатурой участка, определяющего комплементарность. CDR представляет собой участок в вариабельных областях иммуноглобулинов или Т-клеточных рецепторах, и активно участвующий в специфическом связывании антитела или Т-клеточного рецептора с его антигеном. Выражение «CDR легкой цепи» относится к CDR, присутствующему в вариабельных областях легкой цепи иммуноглобулинов, и выражение «CDR тяжелой цепи» относится к CDR, присутствующему в вариабельных областях тяжелой цепи иммуноглобулинов. Также в Т-клеточных рецепторах имеется α-цепь, β-цепь, γ-цепь, δ-цепь и подобные цепи, и тоже относится к CDR данных цепей.

[0026] В рамках настоящего изобретения, выражение «вариабельная область» относится к области, содержащей CDR1-CDR3 (ниже просто «CDR 1-3»). Порядок, в котором расположены эти CDR 1-3, не ограничивается; однако вариабельная область предпочтительно относится к области, в которой CDR1, CDR2 и CDR3 расположены в указанном порядке в направлении от N-конца к С-концу или в обратном порядке либо последовательно, либо через другие указанные аминокислотные последовательности в качестве «каркасных областей» (FR), которые будут описаны ниже. Выражение «вариабельная область тяжелой цепи» относится к области, в которой находятся CDR 1-3 тяжелой цепи, и выражение «вариабельная область легкой цепи» относится к области, в которой находятся CDR 1-3 легкой цепи. Также в Т-клеточных рецепторах имеется α-цепь, β-цепь, γ-цепь, δ-цепь и подобные цепи, и тоже относится к CDR данных цепей.

[0027] Области, отличные от CDR 1-3 в каждой вариабельной области, называются «каркасными областями» (FR), как указано выше. В частности, область между N-концом и CDR1 вариабельной области определяется как FR1, область между CDR1 и CDR2 - как FR2, область между CDR2 и CDR3 - как FR3, и область между CDR3 и C-концом вариабельной области определяется как FR2 - как FR4.

[0028] 2. Антигенный рецептор

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антигенному рецептору, содержащему домен GITRL в положении ближе к С-концу через саморасщепляющийся пептидный домен (который может относиться к «антигенному рецептору по настоящему изобретению» в настоящем описании). Антигенный рецептор по настоящему изобретению описан ниже.

[0029] Антигенный рецептор может представлять собой любой антигенный рецептор и представляет собой, например, химерный антигенный рецептор (CAR). Химерный антигенный рецептор (CAR), как правило, представляет собой химерный белок, одноцепочечное антитело (scFv), которое состоит из легкой цепи (VL), связанной в тандеме с тяжелой цепью (VH) вариабельной области моноклонального антитела, расположенной ближе к N-концу в качестве домена, отвечающего за его способность связываться с антигеном, и его ξ-цепь Т-клеточного рецептора (TCR) находится в положении ближе к C-концу. Т-клетки, экспрессирующие CAR, называются «CAR-T-клетками».

[0030] Антигенный рецептор не ограничивается химерным антигенным рецептором и может представлять собой, например, Т-клеточный рецептор.

[0031] Антигенный рецептор по настоящему изобретению может быть любым антигенным рецептором, который содержит домен GITRL в положении ближе к С-концу через саморасщепляющийся пептидный домен. Это может повысить эффективность экспрессии антигенного рецептора или цитотоксическую активность Т-клеток, содержащих антигенный рецептор. Экспрессия антигенного рецептора по настоящему изобретению приводит к расщеплению саморасщепляющегося пептидного домена, что позволяет экспрессировать внутриклеточно GITRL в его свободной форме.

[0032] В рамках настоящего изобретения, выражение «саморасщепляющийся пептид» относится к пептидной последовательности с расщепляющейся активностью, находящейся между двумя аминокислотными остатками в пептидной последовательности. Примеры саморасщепляющихся пептидов включают 2А-пептиды и 2А-подобные пептиды. Например, в 2А-пептидах или 2А-подобных пептидах расщепление происходит между остатком глицина и остатком пролина этих пептидов. Это происходит за счет «механизма проскока рибосомы», при котором во время трансляции не образуется нормальная пептидная связь между остатком глицина и остатком пролина, и это не влияет на трансляцию ниже. Механизм проскока рибосомы известен в данной области и используется для экспрессии многочисленных белков, кодированных одной молекулярной информационной РНК (мРНК). Саморасщепляющийся пептид для применения в настоящем изобретении может быть получен из 2А-пептидов вирусов или 2А-подобных пептидов, обладающих эквивалентной функциональностью. Например, саморасщепляющийся пептид может быть выбран из группы, состоящей из 2А-пептидов, полученных из вируса ящура (FMDV) (F2A), 2А-пептидов, полученных из вируса ринита лошадей А (ERAV) (Е2А), пептидов, полученных из тешовируса свиней (PTV-1) (P2A), и 2A-пептидов, полученных из вируса Thosea asigna (TaV) (T2A). Домен саморасщепляющегося пептида может быть мутирован при условии, что активность саморасщепляющегося пептидного домена существенно не нарушается.

[0033] Домен GITRL может представлять собой любой домен, содержащий аминокислотную последовательность GITRL.

[0034] GITRL для применения могут представлять собой различные типы GITRL, полученные от млекопитающих, таких как люди, обезьяны, мыши, крысы, собаки, кошки и кролики. Из них предпочтительным является GITRL, полученный из целевого организма (например, человека).

[0035] Аминокислотные последовательности GITRL, полученные из различных организмов, известны. В частности, примеры включают белки, имеющие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4. GITRL также может представлять собой белок с делетированным N-концевым сигнальным пептидом.

[0036] GITRL может быть мутирован, например, заменой, делецией, добавлением или инсерцией аминокислот, при условии, что GITRL сохраняет способность связываться со своим рецептором, GITR. Мутация предпочтительно представляет собой замену и более предпочтительно консервативную замену с точки зрения более низкой вероятности того, что GITRL потеряет свою способность связываться с GITR.

[0037] Предпочтительным конкретным примером аминокислотной последовательности GITRL является, по меньшей мере, один член, выбранный из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, описанной в следующем п. (а), и аминокислотной последовательности, описанной в следующем п. (b):

(а) аминокислотная последовательность, показанная в любой части SEQ ID NO: 4, и

(b) аминокислотная последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 85% идентичность с аминокислотной последовательностью, показанной в любой части SEQ ID NO: 4, и которая представляет собой белок, способный связываться с GITR.

[0038] В п.(b) выше идентичность предпочтительно составляет, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 98% и особенно предпочтительно, по меньшей мере, 99%.

[0039] Возможность индукции GITRL для связывания с GITR можно определить в соответствии с известным способом или аналогичным способом. Выражение «способен связываться с GITR» означает, что GITRL способен связываться с GITR, например, в степени, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере,80%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% от связывающей способности GITRL до мутации.

[0040] Примером аминокислотной последовательности, описанной в п. (b) выше, является (b') аминокислотная последовательность, которая имеет замену, делецию, добавление или инсерцию одной или нескольких аминокислот в участке аминокислотной последовательности, показанной в любой части SEQ ID NO: 4, которая представляет собой белок, способный связываться с GITR.

[0041] В п. (b') выше «несколько аминокислот» означает, например, от 2 до 15 аминокислот, предпочтительно от 2 до 10 аминокислот, более предпочтительно от 2 до 5 аминокислот и более предпочтительно от 2 до 3 аминокислот.

[0042] Антигенный рецептор по настоящему изобретению обычно содержит домен, отвечающий за способность связывания с его антигеном (антигенсвязывающий домен). Антиген особым образом не ограничивается, и его примеры включают различные белки или комплексы, которые экспрессируются на поверхности опухолевых клеток или Т-клеток. Конкретные примеры антигенов включают CD19, GD2, GD3, CD20, CEA, HER2, EGFR, мутантный EGFR типа III, CD38, BCMA, MUC-1, PSMA, WT1, антигены рака яичка (например, NY-ESO-1 и MAGE-A4), мутантные пептиды (например, k-ras, h-ras и p53), hTERT, PRAM, TYRP1, мезотелин, PMEL, муцин и комплексы фрагментов этих антигенов с MHC (pMHC). Из них предпочтительно антиген представляет собой CD19 или GD2 и более предпочтительно CD19. Антигенсвязывающий домен обычно содержит один или более, предпочтительно два, три, четыре или пять или более CDR, или более предпочтительно все шесть CDR антитела или Т-клеточного рецептора для антигена (например, в случае CDR антител, CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи). Антигенсвязывающий домен более предпочтительно содержит вариабельную область антитела или Т-клеточного рецептора для антигена (в случае антител, например, вариабельные области тяжелой цепи и/или вариабельные области легкой цепи).

[0043] Антигенсвязывающий домен предпочтительно имеет структуру scFv. Линкер, который связывает вариабельную область тяжелой цепи с вариабельной областью легкой цепи, может представлять собой любой линкер, который сохраняет функциональность антигенного рецептора. Линкер предпочтительно представляет собой линкер GS (как правило, линкер, имеющий повторяющуюся последовательность, содержащую GGGGS (SEQ ID NO: 5) в качестве структурной единицы). Количество аминокислотных остатков линкера составляет, например, от 5 до 30, предпочтительно от 10 до 20 и более предпочтительно 15. Расположение вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи не ограничено. Вариабельная область легкой цепи может находиться в положении ближе к N-концу, или вариабельная область тяжелой цепи может находиться в положении ближе к N-концу. Первое расположение предпочтительно.

[0044] Антигенный рецептор по настоящему изобретению обычно содержит коровый домен, содержащий вариабельную область антитела или Т-клеточного рецептора (например, домен scFv, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи), трансмембранный домен, и внутриклеточный домен TCR. В коровом домене вариабельная область, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR располагаются в указанном порядке от N-конца прямо или через другие домены.

[0045] Антигенный рецептор по настоящему изобретению, содержащий коровый домен, предпочтительно содержит домен GITRL в положении ближе к С-концу корового домена через саморасщепляющийся пептидный домен.

[0046] Трансмембранный домен может быть любого типа, который не оказывает отрицательного влияния на функциональность антигенного рецептора. Например, можно использовать CD28, CD3ξ, CD4 или CD8α, которые экспрессируются в клетках, таких как Т-клетки. Данные трансмембранные домены могут быть мутированы при условии, что при этом не нарушается функциональность химерного антигенного рецептора.

[0047] Внутриклеточный домен TCR может быть, например, внутриклеточным доменом, полученным из CD3, который также называется «ξ-цепью TCR». CD3 может быть мутирован при условии, что при этом не нарушается функциональность химерного антигенного рецептора. Мутация CD3 предпочтительно осуществляется таким образом, что CD3 содержит ITAM (мотив активации иммунорецепторов на основе тирозина).

[0048] Антигенный рецептор по настоящему изобретению предпочтительно имеет спейсерную последовательность между вариабельной областью и трансмембранным доменом. Спейсерная последовательность может быть любой длины и может быть образована из любых аминокислотных остатков при условии, что функциональность антигенного рецептора не нарушается. Например, спейсерную последовательность можно сконструировать таким образом, чтобы она содержала примерно от 10 до 200 аминокислотных остатков. Используемая спейсерная последовательность предпочтительно представляет собой последовательность константной области легкой цепи.

[0049] Коровый домен в антигенном рецепторе по настоящему изобретению предпочтительно дополнительно содержит внутриклеточный домен костимулятора. Внутриклеточный домен костимулятора может представлять собой любой внутриклеточный домен, полученный из костимулятора клеток, таких как Т-клетки. Например, можно подходящим образом выбрать и использовать, по меньшей мере, один член, выбранный из группы, состоящей из OX40, 4-1BB, GITR, CD27, CD278, CD28 и тому подобное. Из них CD28 является предпочтительным с учетом его существенно высокой эффективности за счет его комбинации с доменом GITRL. Внутриклеточный домен этих костимуляторов может быть мутирован при условии, что не нарушается функциональность антигенного рецептора. Положение внутриклеточного домена костимулятора особым образом не ограничивается при условии, что внутриклеточный домен находится в положении ближе к С-концу трансмембранного домена; внутриклеточный домен может находиться ближе к N-концу или С-концу внутриклеточного домена TCR.

[0050] В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вариабельная область, спейсерная последовательность, трансмембранный домен, внутриклеточный домен костимулятора, внутриклеточный домен TCR, домен саморасщепляющегося пептида и домен GITRL расположены в указанном порядке от N-конца прямо или через другие домены.

[0051] Антигенный рецептор по настоящему изобретению может содержать домен лиганда, такой как домен GITRL, домен 4-1BBL или домен ICOSL, в положении ближе к С-концу корового домена через саморасщепляющийся пептидный домен.

[0052] Антигенный рецептор по настоящему изобретению может представлять собой молекулу, образованную одним типом полипептида, или молекулу, образованную комплексом двух или более типов полипептидов. Антигенный рецептор по настоящему изобретению может также представлять собой молекулу, образованную полипептидом или комплексом полипептидов, или молекулу, образованную полипептидом или комплексом полипептидов, к которой присоединено другое соединение (например, флуоресцентное соединение, радиоактивное соединение или неорганическая частица).

[0053] Антигенный рецептор по настоящему изобретению может быть химически модифицирован. Полипептид, который составляет антигенный рецептор по настоящему изобретению, может иметь карбоксильную группу (-COOH), карбоксилатную группу (-COO-), амидную группу (-CONH₂) или сложноэфирную группу (-COOR) на С-конце. «R» в сложном эфире представляет собой, например, C_1-6 алкильную группу, такую как метил, этил, н-пропил, изопропил или н-бутил; C_3-8 циклоалкильную группу, такую как циклопентил или циклогексил; C_6-12 арильную группу, такую как фенил или α-нафтил; фенил-C_1-2 алкильную группу, такую как бензил или фенэтил; C_7-14 аралкильную группу, такую как α-нафтил-C_1-2 алкильную группу, такую как α-нафтилметил; или пивалоилоксиметильную группу. Полипептид, который составляет антигенный рецептор по настоящему изобретению, может иметь амидированную или этерифицированную карбоксильную группу (или карбоксилат), которая не является карбоксильной группой на С-конце. Сложный эфир в данном случае может быть, например, сложным эфиром на С-конце, описанным выше. Полипептид, который составляет антигенный рецептор по настоящему изобретению, дополнительно включает полипептиды, имеющие аминогруппу N-концевого аминокислотного остатка, защищенную защитной группой (например, C_1-6 ацильной группой, включая C_1-6 алканоил, такую как формильная группа и ацетильная группа), полипептиды, имеющие пироглутаминированный N-концевой остаток глутамина, который может образоваться в результате расщепления in vivo; и полипептиды, имеющие заместитель (например, -ОН, -SH, аминогруппу, имидазольную группу, индольную группу и гуанидиногруппу) на стороне замены аминокислоты в молекуле, защищенной соответствующей защитной группой (например, C_1-6 ацильная группа, включая C_1-6 алканоильную группу, такую как формильная группа и ацетильная группа).

[0054] Антигенный рецептор по настоящему изобретению может иметь добавленный белок или пептид (например, известную белковую метку или сигнальную последовательность). Примеры белковых меток включают биотин, His-метку, FLAG-метку, Halo-метку, MBP-метку, HA-метку, Myc-метку, V5-метку, PA-метку и флуоресцентную белковую метку.

[0055] Антигенный рецептор по настоящему изобретению может представлять собой фармацевтически приемлемую соль, образованную кислотой или основанием. Соль может представлять собой любую фармацевтически приемлемую соль и может быть либо кислой, либо основной солью. Примеры кислых солей включают соли неорганических кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, сульфат, нитрат и фосфат; соли органических кислот, такие как ацетат, пропионат, тартарат, фумарат, малеат, малат, цитрат, метансульфонат и пара-толуолсульфонат; и соли аминокислот, такие как аспартат и глутамат. Примеры основных солей включают соли щелочных металлов, такие как соли натрия и соли калия; и соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и соли магния.

[0056] Антигенный рецептор по настоящему изобретению может быть в форме сольвата. Растворителем может быть любой фармацевтически приемлемый растворитель, например вода, этанол, глицерин или уксусная кислота.

[0057] Способы получения антигенного рецептора и CAR-T-клетки, которая экспрессирует антигенный рецептор, известны. Антигенные рецепторы и CAR-T-клетки могут быть получены в соответствии с известным способом или аналогичным способом.

[0058] 3. Полинуклеотид

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему антигенный рецептор по настоящему изобретению (который может относиться к «полинуклеотиду по настоящему изобретению» в настоящем описании). Полинуклеотид по настоящему изобретению описан ниже.

[0059] Полинуклеотид по настоящему изобретению может содержать другие последовательности в дополнение к последовательности, кодирующей антигенный рецептор по настоящему изобретению. Предпочтительно полинуклеотид по настоящему изобретению точно содержит последовательность антигенного рецептора по настоящему изобретению. Другие последовательности включают последовательности промотора, последовательности энхансера, последовательности репрессора, последовательности инсулятора, ориджины репликации, последовательности, кодирующие репортерный белок (например, флуоресцентные белки) и последовательности, кодирующие ген лекарственной устойчивости. Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть линейным полинуклеотидом или циклическим полинуклеотидом (например, вектором). Вектор может представлять собой плазмидный вектор или вирусный вектор (например, аденовирусный или ретровирусный). Вектор также может быть, например, вектором для клонирования или для экспрессии. Вектор для экспрессии включает векторы для прокариотических клеток, таких как Escherichia coli или актиномицеты, и векторы для эукариотических клеток, таких как дрожжевые клетки, клетки насекомых или клетки млекопитающих.

[0060] Полинуклеотид по настоящему изобретению включает не только ДНК и РНК, но также известные химически модифицированные ДНК или РНК, описанные ниже. Для предупреждения деградации под действием гидролазах, таких как нуклеазы, фосфатный остаток (фосфат) каждого нуклеотида может быть заменен, например, химически модифицированным фосфатным остатком, таким как фосфоротиоат (PS), метилфосфонат или фосфородитионат. Гидроксильная группа в положении 2 рибозы каждого рибонуклеотида также может быть заменена на -OR (R представляет собой, например, CH₃(2'-O-Me), CH₂CH₂OCH₃(2'-O-MOE), CH₂CH₂NHC(NH)NH₂, CH₂CONHCH₃ или CH₂CH₂CN). Кроме того, группа основания (пиримидинового, пуринового) может быть химически модифицирована, например, введением метильной группы или катионной функциональной группы в положение 5 пиримидинового основания или замещением карбонильной группы в положении 2 тиокарбонилом. Кроме того, полинуклеотиды по настоящему изобретению также включают, не ограничиваясь этим, полинуклеотиды, образованные модификацией фосфатной группы или гидроксильной группы, например, биотином, аминогруппой, низшей алкиламиногруппой или ацетильной группой. Термин «полинуклеотид» включает не только природные нуклеиновые кислоты, но также BNA (мостиковые нуклеиновые кислоты), LNA (замкнутые нуклеиновые кислоты) и PNA (пептидные нуклеиновые кислоты).

[0061] 4. Клетка

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке, содержащей полинуклеотид по настоящему изобретению (которая может относиться к «клетке по настоящему изобретению» в настоящем описании). Клетка по настоящему изобретению описана ниже.

[0062] Клетки, из которых происходят клетки по настоящему изобретению, особым образом не ограничиваются. С целью использования клетки по настоящему изобретению для получения антигенного рецептора по настоящему изобретению можно, например, использовать клетки, которые можно использовать для экспрессии белка (например, клетки насекомых, эукариотические клетки, клетки млекопитающих) используются в качестве исходных клеток.

[0063] Клетка по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой Т-клетку (например, αβ-Т-клетку или γδ-Т-клетку) или NK-клетку. Данные клетки предпочтительно представляют собой клетки, экспрессирующие антигенный рецептор по настоящему изобретению. В более конкретном варианте осуществления данных клеток по настоящему изобретению, антигенный рецептор по настоящему изобретению экспрессируется на клеточной мембране и предпочтительно экспрессируется в таком состоянии, что антигенсвязывающий домен экспонируется снаружи клеточной мембраны.

[0064] Т-клетка или тому подобное, экспрессирующая антигенный рецептор, распознает антиген в антигенсвязывающем домене, и затем внутриклеточно переносит сигнал распознавания для активации сигнала, индуцирующего цитотоксическую активность. В связи с этим клетка «атакует» другие клетки или ткани, экспрессирующие антиген, или проявляет цитотоксическую активность.

[0065] Когда клеткой, проявляющей такую функцию, является CTL, то такая клетка называется «Т-клеткой с химерным антигенным рецептором» («CAR-T-клетка»). Клетки, которые потенциально могут проявлять цитотоксическую активность, такие как NK-клетки, также могут проявлять цитотоксическую активность, когда антигенсвязывающий домен связывается с антигеном, как с Т-клеточным химерным антигенным рецептором. Таким образом, клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид, кодирующий антигенный рецептор (в частности, клетка-хозяин, обладающая цитотоксической активностью), является пригодной в качестве активного ингредиента фармацевтических композиций.

[0066] Такие T-клетки и т.п. применимы для лечения или профилактики рака и т.п., поскольку они специфически распознают раковую ткань (опухолевую ткань). Тип рака особым образом не ограничивается и включает солидную опухоль и рак крови. Примеры солидного рака включают рак легких, колоректальный рак, рак яичника, рак молочной железы, опухоль головного мозга, рак желудка, рак печени, рак языка, рак щитовидной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак матки, остеосаркому, хондросаркому, рабдомиосаркому и тому подобное.

[0067] Клетку по настоящему изобретению можно получить введением полинуклеотида по настоящему изобретению в клетки. При необходимости клетки, содержащие полинуклеотид по настоящему изобретению, можно сконцентрировать или можно сконцентрировать с использованием специфического маркера (антигена CD, такого как CD8) в качестве индикатора.

[0068] 5. Фармацевтическая композиция

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей Т-клетку или NK-клетку по настоящему изобретению (которая может относиться к «фармацевтической композиции по настоящему изобретению» в настоящем описании). Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению описана ниже.

[0069] Содержание клетки в фармацевтической композиции может быть соответствующим образом установлено с учетом типа целевого заболевания (например, солидного рака), желаемых терапевтических эффектов, способа введения, периода лечения, возраста пациента, массы тела пациента и т.д. Содержание клеток в фармацевтической композиции может составлять, например, примерно от 1 клетки/мл до 10⁴ клеток/мл.

[0070] Форма введения фармацевтической композиции особым образом не ограничивается, при условии, что достигаются желаемые эффекты. Фармацевтическую композицию можно вводить млекопитающим, включая человека, любым из следующих способов введения: пероральное введение и парентеральное введение (например, внутривенная инъекция, внутримышечная инъекция, подкожное введение, ректальное введение, накожное введение и местное введение). Поскольку активным ингредиентом является клетка, то форма введения предпочтительно представляет собой парентеральное введение и более предпочтительно внутривенную инъекцию. Лекарственные формы для перорального введения и парентерального введения, а также способы их получения хорошо известны специалисту в данной области. Фармацевтическую композицию можно получить обычным способом, например, смешиванием антитела или клетки по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем и т.д.

[0071] Примеры лекарственных форм для парентерального введения включают препараты для инъекций (например, внутривенные капельные вливания, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, подкожные инъекции и эндодермальные инъекции), препараты для наружного применения (например, мази, катаплазмы и лосьоны), суппозитории, ингалянты, глазные капли, глазные мази, назальные капли, ушные капли, липосомальные агенты и т.п. Например, препарат для инъекций можно приготовить растворением или суспендированием антитела или клеток в дистиллированной воде для инъекций и необязательного добавлением солюбилизатора, буфера, регулятора pH, изотонического агента, успокаивающего агента, консерванта, стабилизатора, и т.д. Фармацевтическую композицию также можно использовать в виде лиофилизированного препарата, приготовленного перед применением.

[0072] Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другие лекарственные средства, эффективные для лечения или профилактики заболеваний. Фармацевтическая композиция может также содержать такие компоненты, как стерилизаторы, противовоспалительные средства, клеточные активаторы, витамины и аминокислоты, если это необходимо.

[0073] В качестве носителя, используемого для формуляции фармацевтической композиции, можно использовать эксципиенты, связующие вещества, дезинтеграторы, смазывающие вещества, красители и ароматизаторы, которые обычно используются в этой области техники; и также могут быть необязательно использованы стабилизаторы, эмульгаторы, усилители абсорбции, поверхностно-активные вещества, регуляторы pH, антисептики, антиоксиданты, наполнители, увлажнители, активаторы поверхности, диспергаторы, буферы, консерванты, солюбилизаторы, успокаивающие агенты и т.п.

[0074] Тип заболевания, которое лечится или профилактируется с использованием фармацевтической композиции, особым образом не ограничивается, если лечение или профилактика могут быть достигнуты. Примеры конкретных целевых заболеваний включают опухоли. Тип опухоли особым образом не ограничивается и включает солидный рак и рак крови. Примеры солидного рака включают рак легкого, колоректальный рак, рак яичника, рак молочной железы, опухоль головного мозга, рак желудка, рак печени, рак языка, рак щитовидной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак матки, остеосаркому, хондросаркому, рабдомиосаркому и т.п.

[0075] Целевым субъектом для введения (испытуемым субъектом) фармацевтической композиции является, например, животное, страдающее заболеванием, описанным выше, или животное с потенциальным риском развития такого заболевания. «Потенциальный риск развития такого заболевания» можно определить с использованием известного диагностического метода. Животное представляет собой, например, млекопитающее и предпочтительно человека.

[0076] Дозу фармацевтической композиции может определить лечащий врач с учетом различных факторов, таких как путь введения, тип заболевания, степень выраженности симптомов, возраст, пол и масса тела пациента, тяжесть заболевания, фармакологические данные, такие как фармакокинетика и токсикологические характеристики, использование или неиспользование системы доставки лекарственного средства и то, вводится ли композиция в виде части комбинированного лекарственного средства с другими лекарственными средствами. Например, если активным ингредиентом является клетка, то доза может составлять примерно от 10⁴ клеток/кг (массы тела) до 10⁹ клеток/кг (массы тела). Схема введения фармацевтической композиции также может быть определена с учетом тех же факторов, что и при определении дозы. Например, композицию можно вводить от одного раза в сутки до одного раза в месяц в суточной дозе, приведенной выше.

Примеры

[0077] Настоящее изобретение подробно описано ниже со ссылкой на примеры. Однако настоящее изобретение не ограничивается приведенными примерами.

[0078] Экспериментальный пример 1: конструирование CAR конструкции

Конструкцию CAR анти-CD19 (FMC-63)-28z или анти-CD19 (FMC-63)-28z-GITRL рекомбинировали с pMS3 с получением плазмидного вектора, и плазмидный вектор вводили в клетки Plat-A (Cell Biolabs) с FuGENE (Promega) для получения ретровирусов. На фиг. 1 приведены структуры CD19 28z CAR и CD19 28z GITRL CAR. На фиг. 2 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1) CD19 28z CAR, и на фиг. 3 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 2) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 3) CD19 28z GITRL CAR.

[0079] Ретровирусы также получали с использованием CAR конструкции анти-CD19 (FMC-63)-zG или анти-CD19 (FMC-63)-zG-GITRL. В частности, ретровирусы получали аналогичным образом, за исключением того, что область N-концевая сторона- внутриклеточный домен CD28-домен CD3ξ в CD19 28z CAR и CD19 28z GITRL CAR заменяли областью N-концевая сторона-CD3ξ домен-домен GITR.

[0080] Экспериментальный пример 2: получение эффекторной клетки

αβ-клетки (полученные культивированием мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных с использованием Ficoll-Paque, в среде GT-T551 с добавлением 0,6% инактивированной плазмы человека и IL-2 в конечной концентрации 600 МЕ/мл в 12-луночном планшете, содержащем 2 мкг OKT3 и 10 мкг ретронектина, иммобилизованного на нем, и сбором клеток на сутки 4), и γδ-клетки (полученные культивированием мононуклеарных клеток периферической крови в среде YM-AB, содержащей новый бисфосфонатный препарат (PTA), с добавлением 25 нг/мл IL-7 и 25 нг/мл IL-15, и сбором клеток на сутки 4) инфицировали вышеуказанными иммобилизованными ретровирусами.

[0081] Экспериментальный пример 3: подтверждение экспрессии CAR

Экспрессию CAR определяли с использованием проточного цитометра. После взаимодействия с человеческим κ-антителом (кроличий IgG) клетки подвергали взаимодействию с Alexa 488-меченными антикроличьим IgG (козьи поликлональные антитела) (Invitrogen). Кроме того, для αβ-клеток было добавлено окрашивание APC/Cy7-меченным антителом против человеческого CD8 (BD) и APC-меченным антителом против человеческого CD4 (BioLegend), и для γδ-клеток было добавлено окрашивание PE-меченным антителом против человеческого Vδ2 с последующим измерением с использованием анализа FACSCanto. Рассчитывали уровень экспрессии молекул CAR (распознаваемых античеловеческим κ-антителом) во фракциях CD4 и CD8 αβ-клеток и в Vδ2-позитивной фракции γδ-клеток.

[0082] В отношении CD19 28z и CD19 28z-GITRL, использованных для переноса генов, то экспрессия CD19 CAR была выше в клетках, в которые вводили CD19 28z-GITRL, как в αβ-клетках (пять экспериментов по переносу генов), так и в γδ-клетках (четыре эксперимента по переносу генов) (фиг. 4 и 5 и верхний ряд каждой из фиг. 12 и 13).

[0083] Для каждого из CD19 zG и CD19 zG-GITRL, чей внутриклеточный домен представляет собой zG, проводили один эксперимент по переносу гена с использованием αβ-клеток, и один эксперимент по переносу гена был проведен с использованием γδ-клеток. Как и в случае 28z, экспрессия CD19 CAR была выше при использовании GITRL-связанной формы (фиг. 6 и 7, и столбец крайний справа в верхнем ряду каждой из фиг. 12 и 13).

[0084] Экспериментальный пример 4: распознавание клетки-мишени эффекторной клеткой

После добавления APC-меченного антитела против человеческого CD107a (BD) проводили сокультивирование с CD19-позитивной линией клеток B-острого лимфоцитарного лейкоза NALM6 (CD19-негативную линию K562 использовали в качестве контроля) в течение 4 ч. После этого поверхностный антиген CAR-T-клеток окрашивали аналогично, как описано выше, и цитокины в клетках после обработки Cytofix/Cytoperm (BD) окрашивали V450-меченным антителом против человеческого IFN-γ и PE/Cy7-меченным антителом против человеческого TNF-α с последующим анализом с помощью FACSCanto II. Определяли уровни CD107a, IFN-γ и TNF-α-позитивных CAR-позитивных клеток во фракциях CD4 и CD8 αβ-клеток и в Vδ2-позитивной фракции γδ-клеток.

[0085] Относительное количество клеток, продуцирующих IFN-γ, в CD19CAR-позитивных клетках после 4-ч сокультивирования с линией клеток-мишеней (NALM6) имела тенденцию быть выше как в αβ-клетках (28z: фиг. 8, zG: фиг. 10), так и γδ-клетках (28z: фиг. 9 и zG: фиг. 11) при использовании GITRL-связанной формы, но статистически значимая разница отсутствовала (средний ряд на каждой из фиг. 12 и 13). Однако количество IFN-γ-продуцирующих CD19CAR-позитивных клеток было выше в клетках в GITRL-связанной трансдуцированной форме (как в αβ-клетках, так и γδ-клетках) (нижний ряд на каждой из фиг. 12 и 13). В среднем значение в клетках в GITRL-связанной трансдуцированной форме было примерно в два раза выше (фиг. 14).

[0086] Экспериментальный пример 5: подтверждение цитотоксического действия эффекторной клетки

Цитотоксическую активность во времени измеряли с помощью анализа CTL в режиме реального времени (xCELLigence) посредством сокультивирования с NALM6. В частности, антитело против CD9 (набор ACEA Bioscience, номер по каталогу: 8710247), доведенное до конечной концентрации 4 мкг/мл с использованием связывающего буфера (номер по каталогу: 8718617), иммобилизовали в каждой лунке E-планшета 16. Через три часа проводили промывание PBS, и клетки-мишени NALM6 (6,0×10⁴), суспендированные в 100 мкл среды RPMI 1640 с добавлением 10% FCS, добавляли и оставляли при комнатной температуре на чистом стенде в течение 0,5 ч, после чего культивировали в инкубаторе в условиях 0,5% СО₂ и 37°С в течение 24 ч и более. Каждый вид эффекторных клеток (6×10⁴) добавляли и оставляли при комнатной температуре на чистом стенде на 0,5 ч с последующим дополнительным культивированием в инкубаторе в условиях CO₂ и 37°C в течение 5-7 суток. Изменения электрического сопротивления во времени анализировали в отношении цитотоксичности для клеток NALM6 (метод xCELLigence, ACEA Bioscience). В качестве эффектора использовали CD19 28zCAR-трансдуцированные αβ-T-клетки или γδ-T-клетки, или GITRL-коэкспрессирующие CD19 28zCAR-трансдуцированные αβ-T-клетки или γδ-T-клетки.

[0087] В анализе CTL в режиме реального времени в течение 120 ч как αβ-клетки, трансдуцированные CD19 28z-GITRL, так и γδ-клетки, трансдуцированные CD19 28z-GITRL, показали более высокую цитотоксическую активность, чем клетки, трансдуцированные CD19 28z. В частности, CD19 28z-GITRL превосходил по уровню цитотоксической активности, продолжительности/устойчивости максимальной цитотоксической активности и быстроте, на что указывает время, необходимое для достижения половины максимальной цитотоксической активности (фиг. 15 и 16).

[0088] Экспериментальный пример 6: исследование противоопухолевого эффекта

Исследовали противоопухолевый эффект на клетки NALM6, трансплантированные иммунодефицитным (NOG) мышам. После облучения в дозе 2 Гр, мышам NOG трансплантировали и прививали, NALM6 (1×10⁶), в которые был введен ген люциферазы, затем вводили каждый вид CD19 CAR-T-клеток (5×10⁶). Изображения получали с использованием визуализации IVIS во времени для наблюдения за кинетикой клеток NALM6. В частности, эксперимент проводили следующим образом.

[0089] Сразу после того, как 6-недельных иммунодефицитных самок мышей (NOD/Shi-scid/IL-2Rgammanull) подвергали тотальному облучению тела (TBI) в дозе 2 Гр, каждой мыши через хвостовую вену вводили CD19-позитивные лейкозные клетки, в которые был введен ген люциферазы (NALM6/Luc), в количестве 1×10⁶ клеток/мышь (на сутки -7). Через неделю (в сутки 0) мышам вводили через хвостовую вену 200 мкл/мышь PBS (группа без обработки; две мыши), и мышам вводили через хвостовую вену Т-лимфоциты от того же донора без переноса гена CD19 CAR (группа, обработанная NGM-αβ-Т-лимфоцитами; 5×10⁶ клеток/мышь; две мыши) (обе эти группы являются отрицательным контролем); и контрольной группе (трем мышам) внутривенно вводили обычные CD19-28z CAR-трансдуцированные αβ-Т-лимфоциты, и опытной группе (три мыши) внутривенно вводили желаемые CD19 28z-GITRL CAR-трансдуцированные γδТ-лимфоциты. Количество оставшихся лейкозных клеток, люминесцирующих при введении люциферина, анализировали во времени с использованием системы визуализации PerkinElmer in vivo (IVIS).

[0090] Как показано на фиг. 17, животные в группе без обработки (группа, получавшая PBS), пали от опухолей в течение 3 недель, и животные в группе, получавшей немодифицированные Т-лимфоциты (группа, получавшая NGM-T), также пали от опухолей в течение 4 недель. Напротив, как в группе с введением 28z CAR-T, так и в группе с введением 28z-GITRL CAR-T лейкозные клетки элиминировались через 1 неделю после введения, и рецидив лейкоза не наблюдали до 7 недель после введения. Однако выживаемость в группе, получавшей 28z-CAR-T, была ниже, чем в группе, получавшей 28z-GITRL CAR-T.

[0091] Экспериментальный пример 7: анализ продукции IFN-γ

После сокультивирования CD19-позитивной лейкозной клеточной линии NALM6 (2×10⁵) с CD19 28z CAR-T-клетками или GITRL-коэкспрессирующих CD19 28z CAR-T-клетками (2×10⁵) в течение 4 ч, анализировали NALM6-реактивную IFN-γ продукцию каждого вида эффекторных клеток с использованием проточного цитометра (BD FACSCanto II).

[0092] На фиг. 18 приведены результаты. Клетки CD19 CAR-T (αβ), коэкспрессирующие GITRL, показали повышенную продукцию IFN-γ после сокультивирования с лейкозными клетками-мишенями (NALM6).

[0093] Экспериментальный пример 8: анализ клеток центральной памяти

Окрашивание CD8-позитивных αβ-Т-клеток, в которые был введен CD19 28z CAR или GITRL-коэкспрессирующий CD19 28z CAR, проводили с использованием метилового эфира тетраметилродамина (TMRM), который является индикатором митохондриального мембранного потенциала, в дополнение к антителу против CD45RA и CD62L, которые оба являются показателями стадии дифференцировки клеток.

[0094] На фиг. 19 приведены результаты. По сравнению с 28z CAR-трансдуцированными CD8-позитивными Т-клетками наблюдали увеличение группы клеток иммунологической памяти (CD62L-CD45RA-, эффекторные Т-клетки памяти (T_EM) и CD62L+CD45RA-, Т-клетки центральной памяти (T_CM)) в группе CD8-позитивных Т-клеток, трансдуцированных 28z-GITRL CAR. Данная тенденция была более выражена в T_CM. Кроме того, было подтверждено, что указанные клетки иммунологической памяти являются клетками иммунологической памяти по их метаболическим характеристикам, что сопровождалось увеличением митохондриального мембранного потенциала и завивисмотью от окислительного фосфорилирования для получения их энергии. Считается, что эти свойства способствуют длительному приживлению CAR-T-клеток, введенных в организм пациента, что указывает на превосходство гена GITRL-коэкспрессирующего CAR.

[0095] Экспериментальный пример 9: анализ продолжительной цитотоксической активности

СЕА-позитивные клетки BxPC-3 (7000 клеток) и СЕА-негативные клетки MIA Paca-2 (7000 клеток) культивировали в Е-планшете и к ним добавляли эффекторные клетки (21000 клеток), полученные из γδ-клеток. Проводили сокультивирование и анализировали цитотоксичность в течение 24 ч во времени. После завершения сокультивирования эффекторные клетки собирали и сокультивировали с новыми клетками-мишенями в течение 24 ч, после чего анализировали изменения во времени. Третье сокультивирование проводили аналогично, и анализировали изменения во времени.

[0096] На фиг. 20 приведены результаты. Цитотоксическая активность была выше при использовании коэкспрессирующих GITRL клеток CEA 28z CAR-T, чем при использовании клеток CEA 28z CAR-T. Было отмечено, что разница в цитотоксической активности имеет тенденцию к увеличению по мере увеличения числа проведенных культивирований.

[0097] Экспериментальный пример 10: анализ 1 оставшихся клеток

СЕА-позитивные клетки BxPC-3 (5×10⁶) подкожно трансплантировали мышам NOG для индукции развития у мышей опухолей. После этого коэкспрессирующие GITRL клетки CEA 28z CAR-T и клетки CEA 28z CAR-T, обе из которых были получены из γδ-клеток, и контрольные холостые клетки, в которые не вводили ген (каждая в количестве 1×10⁷), вводили животным индивидуально внутривенно. Соотношение обилия инфузированных клеток в периферической крови через 2 недели и 3 недели исследовали с использованием окрашивания анти-Vd2 антителами и окрашивания биотинилированным СЕА. Количество мышей, использованных в эксперименте, составляло 2, 2 и 3.

[0098] На фиг. 21 приведены результаты. В организме мышей NOG через 3 недели после инфузии эффекторных клеток количество оставшихся клеток было выше при инфузии GITRL-коэкспрессирующих клеток γδ CEA 28z CAR-T, чем при инфузии γδ CEA 28z CAR-T клеток.

[0099] Экспериментальный пример 11: анализ 2 оставшихся клеток

На сутки 7 после внутривенной инокуляции меченых люциферазой лейкозных клеток NALM6 мышам NOG для индукции развития у мышей опухолей, вводили CD19 28 CAR-T-клетки (αβ) или CD19 28z-GITRL CAR-T-клетки (αβ). Элиминацию опухолевых клеток подтверждали через 14 суток после инфузии, и такое же количество клеток NALM6 инокулировали для индукции развития опухолей у мышей на сутки 28. На сутки 38 исследовали венозную кровь мышей. Как у мышей, обработанных CD19 28 CAR-T-клетками, так и у мышей, обработанных CD19 28z-GITRL CAR-T-клетками, NALM6 вновь отторгались, указывая на то, что противолейкозный эффект сохранялся. В отношении оставшихся инфузированных CAR-T-клеток, окрашенных анти-каппа-антителом, то количество оставшихся CD8+CAR+ клеток составляло 0,002%, и количество оставшихся CD4+CAR+ клеток составляло 0,017% в периферической крови мышей с инфузией 28z CAR-T-клеток, тогда как у двух мышей, которым вводили 28z-GITRL-CAR-T-клетки, количество оставшихся CD8+CAR+ клеток составляло 0,01% и 0,024%, и количество оставшихся CD4+CAR+ клеток составляло 0,033% и 0,032% в периферической крови. Как CD8+CAR+ клетки, так и CD4+CAR+ клетки оставались более многочисленными у мышей, которым вводили 28z-GITRL CAR-T-клетки (фиг. 22).

[0100] Экспериментальный пример 12: анализ привитых клеток

Периферическую кровь анализировали через 55 суток после клеточной терапии у мыши № 2, получавшей 28z-GITLR CAR-T-клетки (αβ) на модели лечения мышей NOG, несущих клетки NALM6 (описанной выше). В лимфоцитах периферической крови мыши было обнаружено 20,3% человеческих лимфоцитов (1 на фиг. 23). Человеческие CD3-позитивные Т-лимфоциты были обнаружены в 20,3% лимфоцитов, и CD19-позитивные человеческие лейкозные клетки NALM6 не были обнаружены (2 на фиг. 23). CAR-T-клетки были обнаружены в 3,4% человеческих Т-лимфоцитов (3 на фиг. 23). Когда периферическую кровь этой мыши снова сокультивировали с клетками NALM6 в пробирке в течение 18 ч, то все CAR-позитивные человеческие лимфоциты сохранили свою NALM6-реактивную способность к продукции IFN-γ (реактивность к лейкозным клеткам) (4 на фиг. 23).

[0101] Заключение

По сравнению с CD19 28z, CD19 28z-GITRL обеспечивает эффективную экспрессию молекулы CAR как в αβ-, так и в γδ-Т-клетках. Даже когда внутриклеточный домен представляет собой zG вместо 28z, GITRL-связанная форма обеспечивает высокую эффективность экспрессии молекулы CAR. Более того, несмотря на то, что не было обнаружено преимущества GITRL-связанной формы в продукции цитокинов при сокультивировании с клетками-мишенями в течение короткого периода времени (4 ч), и GITRL-связанная форма показала сильную, быструю и длительную мишень-специфическую цитотоксическую активность как в αβ-, так и в γδ-Т-клетках в анализе CTL в режиме реального времени. Исходя из этих результатов, полагается, что GITRL-связанные CAR-T-клетки индуцируют повышенную противоопухолевую активность в большей степени за счет усиленной активации и увеличения продолжительности процесса активации T-клеток после распознавания антигена, а не за счет процесса распознавания антигена. Таким образом, ожидается, что GITRL-связанные CAR-T-клетки будут оказывать клиническое действие на рефрактерные и рецидивирующие случаи, которые представляют собой проблемы в существующей в настоящее время CD19 CAR-T (28z)-клеточной терапии.

[0102] Более того, аналогичную тенденцию, описанную выше, наблюдали при нацеливании на GD2.

--->

Список последовательностей

<110> MIE UNIVERSITY

<120> АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР

<130> P20-149WO

<150> JP 2019-142357

<151> 2019-08-01

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1693

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность CD19 28z CAR

<400> 1

gcggccgccc agatccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct 60

gctccacgcc gccaggccgg acatccagat gacacagact acatcctccc tgtctgcctc 120

tctgggagac agagtcacca tcagttgcag ggcaagtcag gacattagta aatatttaaa 180

ttggtatcag cagaaaccag atggaactgt taaactcctg atctaccata catcaagatt 240

acactcagga gtcccatcaa ggttcagtgg cagtgggtct ggaacagatt attctctcac 300

cattagcaac ctggagcaag aagatattgc cacttacttt tgccaacagg gtaatacgct 360

tccgtacacg ttcggagggg ggaccaagct ggagatcaca ggaggtggag gttctggtgg 420

aggaggttca ggtggaggtg gatcagaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt 480

ggcgccctca cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta 540

tggtgtaagc tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg 600

gggtagtgaa accacatact ataattcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga 660

caactccaag agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat 720

ttactactgt gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggcca 780

aggaacctca gtcaccgtct cctcacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc 840

gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt 900

ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc 960

ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct 1020

gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca 1080

gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgtacta gattttgggt 1140

gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat 1200

tattttctgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac 1260

tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt 1320

cgcagcctat cgctccctga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca 1380

gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt 1440

tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgcaga gaaggaagaa 1500

ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga 1560

gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct 1620

cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta 1680

atcgattctc gag 1693

<210> 2

<211> 2356

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность CD19 28z GITRL CAR

<400> 2

gcggccgccc agatccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct 60

gctccacgcc gccaggccgg acatccagat gacacagact acatcctccc tgtctgcctc 120

tctgggagac agagtcacca tcagttgcag ggcaagtcag gacattagta aatatttaaa 180

ttggtatcag cagaaaccag atggaactgt taaactcctg atctaccata catcaagatt 240

acactcagga gtcccatcaa ggttcagtgg cagtgggtct ggaacagatt attctctcac 300

cattagcaac ctggagcaag aagatattgc cacttacttt tgccaacagg gtaatacgct 360

tccgtacacg ttcggagggg ggaccaagct ggagatcaca ggaggtggag gttctggtgg 420

aggaggttca ggtggaggtg gatcagaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt 480

ggcgccctca cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta 540

tggtgtaagc tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg 600

gggtagtgaa accacatact ataattcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga 660

caactccaag agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat 720

ttactactgt gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggcca 780

aggaacctca gtcaccgtct cctcacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc 840

gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt 900

ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc 960

ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct 1020

gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca 1080

gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgtacta gattttgggt 1140

gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat 1200

tattttctgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac 1260

tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt 1320

cgcagcctat cgctccctga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca 1380

gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt 1440

tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgcaga gaaggaagaa 1500

ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga 1560

gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct 1620

cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcgg 1680

atcccagtgc accaattacg ctcttctgaa gctggccggc gacgtggaga gcaaccccgg 1740

ccccatgacc ctgcacccca gccccatcac ctgcgagttc ctgttcagca ccgccctgat 1800

cagccccaag atgtgcctga gccacctgga gaacatgccc ctgagccaca gcagaaccca 1860

gggcgcccag agaagcagct ggaagctgtg gctgttctgc agcatcgtga tgctgctgtt 1920

cctgtgcagc ttcagctggc tgatcttcat cttcctgcag ctggagaccg ccaaggagcc 1980

ctgcatggcc aagttcggcc ccctgcccag caagtggcag atggccagca gcgagccccc 2040

ctgcgtgaac aaggtgagcg actggaagct ggagatcctg cagaacggcc tgtacctgat 2100

ctacggccag gtggccccca acgccaacta caacgacgtg gcccccttcg aggtgagact 2160

gtacaagaac aaggacatga tccagaccct gaccaacaag agcaagatcc agaacgtggg 2220

cggcacctac gagctgcacg tgggcgacac catcgacctg atcttcaaca gcgagcacca 2280

ggtgctgaag aacaacacct actggggcat catcctgctg gccaaccccc agttcatcag 2340

ctaatcgatt ctcgag 2356

<210> 3

<211> 775

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CD19 28z GITRL CAR

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

260 265 270

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

275 280 285

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

290 295 300

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

305 310 315 320

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

325 330 335

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

340 345 350

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

355 360 365

Glu Cys Thr Arg Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala

370 375 380

Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

385 390 395 400

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

405 410 415

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

420 425 430

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

435 440 445

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

450 455 460

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

465 470 475 480

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro

485 490 495

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

500 505 510

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

515 520 525

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

530 535 540

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gln Cys Thr Asn

545 550 555 560

Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

565 570 575

Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr

580 585 590

Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro

595 600 605

Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu

610 615 620

Trp Leu Phe Cys Ser Ile Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser

625 630 635 640

Trp Leu Ile Phe Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys

645 650 655

Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser

660 665 670

Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu

675 680 685

Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn

690 695 700

Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp

705 710 715 720

Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly

725 730 735

Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser

740 745 750

Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu

755 760 765

Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser

770 775

<210> 4

<211> 199

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr

1 5 10 15

Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro

20 25 30

Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu

35 40 45

Trp Leu Phe Cys Ser Ile Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser

50 55 60

Trp Leu Ile Phe Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys

65 70 75 80

Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser

85 90 95

Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu

100 105 110

Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn

115 120 125

Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp

130 135 140

Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly

145 150 155 160

Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser

165 170 175

Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu

180 185 190

Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser

195

<210> 5

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер GS

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к антигенному рецептору, содержащему домен GITRL на С-концевой стороне через саморасщепляющийся пептидный домен, а также к полинуклеотиду, кодирующему данный антигенный рецептор. Также раскрыта клетка, экспрессирующая данный антигенный рецептор, причем клетка представляет собой Т-клетку с цитотоксичной активностью или NK-клетку, и фармацевтическая композиция. Изобретение обеспечивает создание антигенного рецептора с высоким терапевтическим или профилактическим эффектом в отношении рака. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 23 ил., 12 пр.

1. Антигенный рецептор, содержащий домен GITRL на С-концевой стороне через саморасщепляющийся пептидный домен и домен, связывающийся с антигеном опухоли, причем антигенный рецептор обладает способностью связываться со своим антигеном.

2. Антигенный рецептор по п.1, содержащий коровый домен, содержащий вариабельную область антитела или Т-клеточного рецептора, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR.

3. Антигенный рецептор по п.2, содержащий домен GITRL на С-концевой стороне корового домена через саморасщепляющийся пептидный домен.

4. Антигенный рецептор по п.2 или 3, где коровый домен содержит внутриклеточный домен костимулятора.

5. Антигенный рецептор по п.4, где костимулятор представляет собой CD28.

6. Антигенный рецептор по любому из пп.1-5, который представляет собой химерный антигенный рецептор или Т-клеточный рецептор.

7. Антигенный рецептор по любому из пп.2-6, где вариабельная область способна связываться с CD19.

8. Полинуклеотид, кодирующий антигенный рецептор по любому из пп.1-7, при этом аминокислотная последовательность домена GITRL представляет собой по меньшей мере один член, выбранный из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, описанной ниже (a), и аминокислотной последовательности, описанной ниже (b):

(a) аминокислотная последовательность, показанная в любой части SEQ ID NO: 4, и

(b) аминокислотная последовательность, которая имеет по меньшей мере 85% идентичность с аминокислотной последовательностью, показанной в любой части SEQ ID NO: 4, и которая представляет собой белок, способный связываться с GITR.

9. Клетка, содержащая полинуклеотид по п.8, причем клетка экспрессирует антигенный рецептор по любому из пп.1-7, и причем клетка представляет собой αβ-Т-клетку с цитотоксичной активностью, γδ-Т-клетку с цитотоксичной активностью или NK-клетку.

10. Фармацевтическая композиция, состоящая из клетки по п.9 и фармацевтически приемлемого носителя, которая предназначена для применения в лечении или профилактике рака.

11. Фармацевтическая композиция по п.10, где рак представляет собой рак крови или рак поджелудочной железы.