Область техники

Настоящее изобретение относится к химерным рецепторам антигенов (CAR), включающим спейсеры на основе рецептора фактора роста нервов с низким сродством (LNGFR).

Уровень техники

Иммунотерапия на основе адоптивного переноса иммунных клеток (например, Т-клеток) в организм пациента может играть важную роль в лечении заболеваний, в частности рака. Среди множества различных типов иммунотерапевтических агентов, один из самых перспективных терапевтических методов предполагает использование химерных рецепторов антигенов (CAR). CAR представляют собой сконструированные с помощью генной инженерии рецепторы, которые предназначены для нацеливания на специфический антиген, такой как опухолевый антиген (Sadelain et al., Cancer Discovery 2013. 3(4):388-98). Например, Т-клетки трансдуцируют с использованием CAR, так что Т-клетки, экспрессирующие CAR, уничтожают опухоли через антиген-мишень.

CAR включают экстраклеточный лигандсвязывающий домен, обычно одноцепочечный вариабельный фрагмент моноклонального антитела (scFv), связанный с внутриклеточными, передающими сигналы компонентами, обычно CD3ζ отдельно или в сочетании с одним или более костимулирующих доменов. Между экстраклеточным антигенсвязывающим доменом и трансмембранным фрагментом часто добавляют спейсер для оптимизации взаимодействия с мишенью.

Обычно Fc-домен, в состав которого входят шарнирная область-СН2-СН3 константной области иммуноглобулина IgG, используется в качестве спейсерного домена. Этот спейсер используется для отбора и отслеживания клеток, экспрессирующих CAR. Однако спейсер на основе IgG1 может также связываться с поверхностными Fc-гамма-рецепторами для IgG, представленными на врожденных иммунных клетках, подобных макрофагам и клеткам природным киллерам (Hombach et al. Gene Ther 2000, Jun;7(12):1067-75). Это связывание активирует как сконструированные Т-клетки, так и врожденные иммунные клетки независимо от специфичности связывающего домена CAR, приводя к нежелательной, нецелевой иммунной реакции.

Существует потребность в CAR, которые не вызывают нецелевые иммунные реакции, и не устраняются преждевременно иммунной системой хозяина. Существует также потребность в CAR, включающих спейсерные единицы, которые облегчают отбор клеток, сконструированных с помощью генной инженерии для экспрессии CAR. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих потребностей.

Сущность изобретения

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения обеспечивается химерный рецептор антигена (CAR), включающий экстраклеточный спейсер, который включает по крайней часть экстраклеточного домена рецептора фактора роста нервов с низким сродством (LNGFR) человека или ее производное.

CAR может включать по крайней мере фрагмент экстраклеточного домена рецептора фактора роста нервов с низким сродством (LNGFR) человека или его производное.

Предпочтительно, когда по крайней мере часть LNGFR подходит для облегчения иммуноселекции клеток, трансдуцированных указанным CAR.

Предпочтительно, когда в спейсере отсутствует внутриклеточный домен LNGFR.

Предпочтительно, когда экстраклеточный спейсер включает первые три TNFR-Cys домена LNGFR или их фрагменты или производные.

В одном варианте осуществления спейсер включает все четыре TNFR-Cys домена LNGFR или их фрагменты или производные.

В другом варианте осуществления спейсер включает четвертый домен TNFR-Cys (TNFR-Cys 4), но при этом следующие аминокислоты удалены из указанного домена: NHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRW. Предпочтительно последовательность NHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRW заменена следующей аминокислотной последовательностью ARA.

В другом варианте осуществления спейсер включает богатую серином/треонином ножку LNGFR.

В другом варианте осуществления в спейсере отсутствует богатая серином/треонином ножка LNGFR.

Спейсер может включать последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7, или последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична ей.

В другом варианте осуществления спейсер может состоять из последовательности, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7, или последовательности, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична ей.

SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:5 являются предпочтительными спейсерными элементами.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения обеспечивается химерный рецептор антигена (CAR), включающий

(i) антигенспецифический таргетирующий (нацеливающий) домен;

(ii) экстраклеточный спейсерный домен, определенный здесь;

(iii) трансмембранный домен;

(iv) необязательно по крайней мере один костимулирующий домен; и

(v) внутриклеточный, передающий сигналы домен.

Предпочтительно, когда антигенспецифический таргетирующий домен включает антитело или его фрагмент, более предпочтительно одноцепочечный вариабельный фрагмент.

Предпочтительно, когда мишенью антигенспецифического таргетирующего домена является опухолевый антиген. Примеры таких антигенов включают CD44, CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, CEA, MAGE A3 TCR.

Предпочтительно, когда опухолевым антигеном является изоформа 6 CD44 (CD44v6).

Примеры трансмембранных доменов включают трансмембранный домен дзета-цепи Т-клеточного рецепторного комплекса, CD28 и CD8a.

Примеры костимулирующих доменов включают костимулирующий домен из CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), DaplO, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30 и CD40.

Примеры внутриклеточных, передающих сигналы доменов включают дзета-цепь CD3 человека, FcγRIII, FcsRI, цитоплазматический хвост Fc-рецептора и несущие иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM) цитоплазматические рецепторы.

В предпочтительном варианте осуществления мишенью антигенспецифического таргетирующего домена CAR является CD44v6, трансмембранный домен CAR включает трансмембранный домен CD28, внутриклеточный, передающий сигналы домен CAR включает внутриклеточный, передающий сигналы домен дзета-цепи CD3 человека, а костимулирующий домен CAR включает эндо-костимулирующий домен CD28.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается полинуклеотид, кодирующий CAR настоящего изобретению и определенный здесь.

Предпочтительно, когда полинуклеотид кодирует спейсерный домен, который включает последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:8, или последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична ей.

В одном варианте осуществления полинуклеотид кодирует спейсерный домен, который состоит из последовательности SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:8, или последовательности, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична ей.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается вектор, включающий полинуклеотид настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается клетка, включающая CAR, полинуклеотид или вектор настоящего изобретения. Предпочтительно, когда клетка представляет собой Т-клетку.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция, включающая клетку настоящего изобретения.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается CAR, полинуклеотид, вектор или клетка настоящего изобретения для применения в терапии, предпочтительно терапии рака.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается CAR настоящего изобретения, мишенью антигенспецифического таргетирующего домена которого является CD44v6 для применения при лечении опухолей, которые экспрессируют CD44.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ лечения, включающий введение CAR, полинуклеотида, вектора или клетки настоящего изобретения субъекту, нуждающемуся в таком введении.

Примеры CAR представлены на фиг. 10-17.

Описание чертежей

Фиг. 1. Обоснование создания конструкций CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR. А. Схема, объясняющая ограничения Т-клеток, экспрессирующих CAR, содержащий спейсер CH2CH3 IgG1. B. Структура экстраклеточной части рецептора фактора роста нервов с низким сродством (LNGFR) и 4-х новых конструкций CAR, которые были созданы. Также включены CD44v6-CAR.28z, содержащие спейсер CH2CH3 IgG1 дикого типа или мутированный (mCH2CH3). CHW: CD44v6-CAR.28z, содержащий спейсер CH2CH3 дикого типа. CHM: CD44v6-CAR.28z, содержащий мутированный спейсер CH2CH3. NWL: CD44v6-CAR.28z, содержащий длинный спейсер на основе LNGFR дикого типа (включающий 4 TNFR-Cys домена и ножку). NWS: CD44v6-CAR.28z, содержащий короткий спейсер на основе LNGFR дикого типа (включающий только 4 TNFR-Cys домена). NML: CD44v6-CAR.28z, содержащий мутированный длинный спейсер на основе LNGFR (включающий 4 TNFR-Cys домена с делецией в четвертом домене и ножку). NMS: CD44v6-CAR.28z, содержащий мутированный короткий спейсер на основе LNGFR (включающий 4 TNFR-Cys домена с делецией в четвертом домене и ножку). Фигурные скобки указывают длину спейсера, представленную в аминокислотах. Серый цвет: scFv. Белый цвет: костимулирующий домен CD28; Черный цвет: CD3ζ.

Фиг. 2. Экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки могут быть отсортированы с использованием мАт против LNGFR, эффективно размножаться in vitro и сохранять рано дифференцированный фенотип. Т-клетки активировали с использованием CD3/CD28-сфер, трансдуцировали ретровирусными векторами (RV), кодирующими CD44v6.CAR28z с различными спейсерами на основе LNGFR, и культивировали с IL-7/IL-15. А. Идентификация CAR на поверхности Т-клеток с использованием специфического для LNGFR мАт C40-1457 (верхние графики). Идентификация CAR на поверхности Т-клеток с использованием LNGFR-специфического мАт ME20.4 (нижние графики) B. Слева: Т-клетки, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR, после сортировки с использованием мАт C40-1457 и анти-PE сфер. Справа: кинетика увеличения количества отсортированных экспрессирующих CD44v6-CAR.28z со спейсером CH2CH3 и спейсерами на основе LNGFR Т-клеток, представленная как кратное увеличение. С. Фенотип функциональной дифференцировки Т-клеток, экспрессирующих CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR, через 15 дней после активации. CD45RA+/CD62L+ стволовые Т-клетки памяти, CD45RA-/CD62L+ центральные Т-клетки памяти, CD45RA-/CD62L- эффекторные Т-клетки памяти, CD45RA+/CD62L- эффекторные Т-клетки памяти RA. Графики и кривые соответствуют n=4 независимым экспериментам.

Фиг. 3. Экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки специфически распознают CD44v6+ опухолевые клетки in vitro. А. После сортировки экспрессирующие CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетки (NWL, NWS, NML, NMS), экспрессирующие CD44v6-CAR со спейсером CH2CH3 Т-клетки (CHW, CHM) и Т-клетки, несущие нерелевантный CAR, культивировали с CD44v6+ клетками миеломы MM1.S, CD44v6+ лейкозными клетками ТНР-1 или CD44v6- лимфобластоидными клетками BV-173 при различных соотношениях Е:Т. Спустя 4 дня, остаточные опухолевые клетки подсчитывали и анализировали с помощью FACS. Представлен индекс элиминации (смотрите пример «Методы») с помощью экспрессирующих CD44v6-CAR.28z Т-клеток при различных соотношениях E:T. В. В экспрессирующие CD44v6-CAR.28z Т-клетки вводили краситель CFSE, и их стимулировали с использованием линий облученных опухолевых клеток в соотношении Е:Т=1:5. Спустя 6 дней, пролиферацию Т-клеток анализировали с помощью FACS, выражая в виде разбавляющих CFSE клеток. Графики и кривые соответствуют n=4 независимым экспериментам.

Фиг. 4. У экспрессирующих CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клеток отсутствует FcRg-опосредованное распознание. А. После сортировки экспрессирующие CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетки (NWL, NWS, NML, NMS), экспрессирующие CD44v6-CAR со спейсером CH2CH3 Т-клетки (CHW, CHM) и Т-клетки, несущие нерелевантный CAR, от n=4 здоровым донорам культивировали с CD44v6+/FcRg+ лейкозными клетками ТНР-1 или CD44v6-/FcRg+ лейкозными клетками HL-60 при различных соотношениях Е:Т. Спустя 4 дня, остаточные опухолевые клетки подсчитывали и анализировали с помощью FACS. Представлен индекс элиминации (смотрите пример «Методы») с помощью экспрессирующих CD44v6-CAR.28z Т-клеток при различных соотношениях E:T. В. В экспрессирующие CD44v6-CAR.28z Т-клетки вводили краситель CFSE, и их стимулировали с использованием линий облученных клеток THP1, HL60 или CD44v6-/FcRg- лимфобластоидных клеток BV-173. Через 6 дней пролиферацию Т-клеток анализировали с помощью FACS и представляли в виде разбавляющих CFSE клеток. Графики и кривые соответствуют n=4 независимым экспериментам.

Фиг. 5. CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR не стимулируются с помощью растворимого NGF. А. После подвергания в течение 24 ч воздействию человеческого рекомбинантного NGF в различных концентрациях, LNGFR+ нервные клетки PC-12 анализировали в отношении образования дендритов с помощью оптической микроскопии. B. После сортировки в экспрессирующие CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетки (NWL, NWS, NML, NMS) и экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсером CH2CH3 Т-клетки (CHW, CHM) вводили краситель CFSE, и их подвергали воздействию различных концентраций NGF. Через 4 дня пролиферацию Т-клеток анализировали с помощью FACS и представляли в виде разбавляющих CFSE клеток. Разведение CFSE после сокультивирования с CD44v6+ клетками миеломы MM1.S или CD44v6- лимфобластоидными клетками BV-173 представлено для сравнения. Фотографии и кривые соответствуют n=2 независимым экспериментам. Графики показывают среднее значение ± стандартное отклонение от двух экспериментов.

Фиг. 6. 3. Экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки лучше размножаются, сохраняются и опосредуют превосходные противолейкозные эффекты в модели минимальной остаточной болезни. Мышам NSG вводили путем инфузии CD44v6+ лейкозные клетки ТНР-1, и спустя 3 дня их подвергали лечению экспрессирующими CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетками (NWL, NWS, NML, NMS), экспрессирующими CD44v6-CAR со спейсером CH2CH3 Т-клетками (CHW) или Т-клетками, экспрессирующими нерелевантный CAR (CTR), всех их сортировали до составляющей >95% степени чистоты. A. Репрезентативные графики (слева) и включающий все график (справа), на котором представлены циркулирующие, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z Т-клетки у каждой мыши через три дня после инфузии. CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами отслеживались с помощью FACS после окрашивания поликлональным антителом против IgG (CTR и CHW) или LNGFR-специфическим мАт, C40-1457 мАт. В. Кинетика увеличения количества и персистенции со временем экспрессирующих CD44v6-CAR28z Т-клеток. C. Вес печени с инфильтрующими клетками Thp1 у подвергнутых лечению мышей при умерщвлении (7 недель). Пунктирная зона изображает диапазон нормального веса печени от подобранных по возрасту/полу нормальных мышей NSG. Результаты однофакторного дисперсионного анализа представлены в случае статистической значимости (*Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001).

Фиг. 7. Экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки лучше размножаются, сохраняются и опосредуют превосходные противомиеломные эффекты в модели устойчивого заболевания. Мышам NSG вводили путем инфузии CD44v6+ клетки MM1.S, и спустя 5 недель их подвергали лечению экспрессирующими CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетками (NWL, NWS, NMS), экспрессирующими CD44v6-CAR.28z со спейсером CH2CH3 Т-клетками (CHW) или Т-клетками, экспрессирующими нерелевантный CAR (CTR), всех их сортировали до составляющей >95% степени чистоты. A. Включающий все график (справа), на котором представлены циркулирующие, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z Т-клетки у каждой мыши через три дня после инфузии. CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами отслеживались с помощью FACS после окрашивания поликлональным антителом против IgG (CTR и CHW) или LNGFR-специфическим мАт, C40-1457 мАт. В. Кривые выживаемости Каплана-Мейера подвергнутых лечению мышей. Представлены результаты проверки по критерию Кокса, сравнивающей различные условия (ns: незначимое, *Р<0,05, ***Р<0,001).

Фиг. 7 BIS. 3. Экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки опосредуют превосходные противомиеломные эффекты в модели устойчивого заболевания. Мышам NSG вводили путем инфузии CD44v6+ клетки MM1.S, экспрессирующие люциферазу, и через 26 дней их подвергали лечению экспрессирующими CD44v6-CAR.28z со спейсером на основе LNGFR Т-клетками (NMS), экспрессирующими CD44v6-CAR со спейсером CH2CH3 Т-клетками (CHW) или Т-клетками, экспрессирующими нерелевантный CAR (CTR), всех их сортировали до составляющей >95% степени чистоты. А. Циркулирующее количество опухолевых клеток оценивали в виде относительных световых единиц (RLU) в указанные моменты времени. B. Кривые выживаемости Каплана-Мейера подвергнутых лечению мышей. Представлены результаты проверки по критерию Кокса, сравнивающей различные условия (**P<0,01).

Фиг. 8. Последовательность LNGFR человека.

Фиг. 9. Последовательность CD44v6CAR.28z. Представлены последовательности scFv, CH2CH3, CD28 и дзета-цепи.

Фиг. 10. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6CAR.28z со спейсером LNGFR дикого типа длинным (NWL) (SEQ ID NO:21)

Фиг. 11. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6-CAR.28z со спейсером LNGFR дикого типа коротким (NWS) (SEQ ID NO:22)

Фиг. 12. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6-CAR.28z со спейсером LNGFR мутированным длинным (NML) (SEQ ID NO:23)

Фиг. 13. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6-CAR.28z со спейсером LNGFR мутированным коротким (NMS) (SEQ ID NO:24)

Фиг. 14. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6CAR.28z со спейсером LNGFR дикого типа длинным (NWL) (SEQ ID NO:25)

Фиг. 15. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6-CAR.28z со спейсером LNGFR дикого типа коротким (NWS) (SEQ ID NO:26)

Фиг. 16. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6CAR.28z со спейсером LNGFR мутированным длинным (NML) (SEQ ID NO:27)

Фиг. 17. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6-CAR.28z со спейсером LNGFR мутированным коротким (NMS) (SEQ ID NO:28)

Фиг. 18. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6-4GS2-CAR28z со спейсером LNGFR дикого типа длинным (NWL) (SEQ ID NO:32)

Фиг. 19. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6-4GS2-CAR28z со спейсером LNGFR дикого типа коротким (NWS) (SEQ ID NO:33)

Фиг. 20. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6-4GS2-CAR28z со спейсером LNGFR мутированным длинным (NML) (SEQ ID NO:34)

Фиг. 21. Приводимая в качестве примера последовательность CD44v6-4GS2-CAR28z со спейсером LNGFR мутированным коротким (NMS) (SEQ ID NO:35)

Фиг. 22. Создание CAR с различными спейсерами на основе LNGFR. Структура экстраклеточной части рецептора фактора роста нервов с низким сродством (LNGFR) и различных конструкций CAR, мишенью которых являются CD19 и СЕА, которые были созданы. Также включены CD19/CEA-CAR.28z, содержащие спейсер CH2CH3 IgG1 дикого типа (CH2CH3). NWL: CD19/CEA-CAR.28z, содержащий длинный спейсер на основе LNGFR дикого типа (включающий 4 TNFR-Cys домена и ножку). NMS: CD19/CEA-CAR.28z, содержащий мутированный короткий спейсер на основе LNGFR (включающий 4 TNFR-Cys домена с делецией в четвертом домене). Фигурные скобки указывают длину спейсера, представленную в аминокислотах. Серый цвет: scFv.

Фиг. 23. Экспрессирующие CD19/CEA-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки могут быть окрашены мАт против LNGFR. Т-клетки активировали с использованием CD3/CD28-сфер, трансдуцировали ретровирусными векторами (RV), кодирующими CD19/CEA.CAR28z с различными спейсерами на основе LNGFR, культивировали с IL-7/IL-15 и отбирали с использованием мАт C40-1457 и анти-PE сфер. В качестве положительного контроля, экспрессирующие CD44v6-4GS2.CAR28z Т-клетки были получены в тех же самых условиях. Представлена идентификация CAR на поверхности Т-клеток с использованием LNGFR-специфического мАт C40-1457.

Фиг. 24. Экспрессирующие CD19/CEA-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки специфически распознают антигенэкспрессирующие опухолевые клетки in vitro. А. После сортировки экспрессирующие CD19/CEA/CD44v6-4GS2-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетки (NWL, NWS) и экспрессирующие CD19/CEA-CAR со спейсером CH2CH3 Т-клетки (CHW) Т-клетки культивировали с лейкозными клетками ALL-CM и HL60, лимфобластоидными клетками BV-173 и клетками карциномы BXPC3 при соотношении Е:Т=1:10. Спустя 4 дня, остаточные опухолевые клетки подсчитывали и анализировали с помощью FACS. Представлен индекс элиминации (смотрите пример «Методы») с помощью различных CAR.28z+ Т-клеток. В. В. Супернатанты от сокультур, описанных в A, собирали через 24 часа и анализировали на продукцию цитокинов с помощью анализа СВА (Biolegend). Представлен выброс IFNα, IL-2 и TNFα при распознании клеток-мишеней.

Фиг. 25. Экспрессирующие CD19-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки опосредуют противолейкозные эффекты. Мышей NSG подвергали инфузии CD19+ лейкозных клеток ALL-CM и через три дня подвергали лечению экспрессирующими CD19-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетками (19 NWL и 19 NMS). Т-клетки, экспрессирующие неродственную конструкцию CD44v6-4GS2-CAR.28z (v6 NWL и v6 NMS), использовали для инфузии в качестве контроля. Все CAR+ Т-клетки сортировали до составляющей >95% степени чистоты перед инфузией. График показывает наличие опухолевых клеток ALL-см в костном мозге (ВМ) каждой мыши в момент умерщвления. Опухолевые клетки отслеживали с помощью FACS после окрашивания с использованием мАт против hCD45 и hCD19. Результаты проверки по критерию Стьюдента представлены в случае статистической значимости (*Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001).

Фиг. 26. Полинуклеотидная последовательность CD44v6-4GS2-CAR28z, со спейсером LNGFR дикого типа длинным (NWL) (SEQ ID NO: 37)

Фиг. 27. Полинуклеотидная последовательности CD44v6-4GS2-CAR28z, со спейсером LNGFR дикого типа коротким (NWS) (SEQ ID NO:38)

Фиг. 28. Полинуклеотидная последовательность CD44v6-4GS2-CAR28z со спейсером LNGFR мутированным длинным (NML) (SEQ ID NO:39)

Фиг. 29. Полинуклеотидная последовательность CD44v6-4GS2-CAR28z со спейсером LNGFR мутированным коротким (NMS) (SEQ ID NO:40)

Подробное описание изобретения

Различные предпочтительные признаки и варианты осуществления настоящего изобретения будут теперь описаны в качестве неограничивающих примеров.

При осуществлении на практике настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, обычные методы химии, биохимии, молекулярной биологии, микробиологии и иммунологии, которые находятся в пределах возможностей специалиста со средним уровнем компетентности в данной области техники. Такие методы объяснены в литературе. Смотрите, например, Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 и приложения к периодическому изданию) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J., and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M., and McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; и Lilley, D.M., and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press. Каждый из этих общих текстов включен сюда посредством ссылки.

Химерные рецепторы антигенов

«Химерный рецептор антигена» или «CAR», как здесь используется, относится к сконструированным рецепторам, которые могут обеспечивать специфичность в отношении антигена клеткам (например, Т-клеткам, такими как необученные Т-клетки, центральные Т-клетки памяти, эффекторные Т-клеток памяти или их комбинации). CAR также известные как искусственные Т-клеточные рецепторы, химерные Т-клеточные рецепторы или химерные иммунорецепторы. Предпочтительно, когда CAR настоящего изобретения включают антигенспецифический таргетирующий район, экстраклеточный домен, трансмембранный домен, необязательно один или более костимулирующих доменов и внутриклеточный, передающий сигналы домен.

Антигенспецифический таргетирующий домен

Антигенспецифический таргетирующий домен обеспечивает CAR способностью к связыванию с представляющим интерес антигеном-мишенью. Предпочтительно мишенью антигенспецифическего таргетирующего домена является представляющий клинический интерес антиген, против которого был бы желательным вызов эффекторного иммунного ответа, который приводит к уничтожению опухоли.

Антигенспецифическим таргетирующим доменом может быть любой белок или пептид, который обладает способностью к специфическому распознанию и связыванию с биологической молекулы(ой) (например, рецептора клеточной поверхности или опухолевого белка, или его компонента). Антигенспецифический таргетирующий домен включает любой встречающийся в природе, синтетический, полусинтетический или рекомбинантно полученный партнер по связыванию для биологической молекулы, представляющей интерес.

Иллюстративные антигенспецифические таргетирующие домены включают антитела или фрагменты или производных антител, экстраклеточные домены рецепторов, лиганды для молекул/рецепторов клеточной поверхности или их связывающиеся с рецепторами домены, и связывающиеся с опухолью белки.

В предпочтительном варианте осуществления аАнтигенспецифический таргетирующий домен представляет собой, или является происходящим из, антитело(а). Происходящий из антитела таргетирующий домен может быть фрагментом антитела или полученным методами генной инженерии продуктом одного или более фрагментов антитела, при этом фрагмент участвует в связывании с антигеном. Примеры включают вариабельную область (Fv), определяющий комплементарность участок (CDR), Fab, одноцепочечное антитело (scFv), вариабельную область тяжелой цепи (VH), вариабельную область легкой цепи (VL) и антитело семейства верблюдовые (VHH). В предпочтительном варианте осуществления связывающий домен представляет собой одноцепочечное антитело (scFv). ScFv может быть мышиным, человеческим или гуманизированным scFv.

«Определяющий комплементарность район» или «CDR», в отношении антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, относится к высокой степени вариабельному петлевому участку в вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи антитела. CDR может взаимодействовать с конформацией антитела и в значительной степени определять связывание с антигеном (хотя некоторые каркасные области, как известно, участвуют в связывании). Каждая из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи содержит 3 CDR.

«Вариабельная область тяжелой цепи» или «VH» относится к фрагменту тяжелой цепи антитела, который содержит три CDR, расположенные между фланкирующими участками, известными как каркасные области, которые являются в более высокой степени консервативными, чем CDR, и образуют каркас для поддержки CDR.

«Вариабельная область легкой цепи» или «VL» относится к фрагменту легкой цепи антитела, который содержит три CDR, расположенные между каркасными областями.

«Fv» относится к наименьшему фрагменту антитела, который несет полный антигенсвязывающий сайт. Fv-фрагмент состоит из вариабельной области одной легкой цепи, связанной с вариабельной областью одной тяжелой цепи.

«Одноцепочечное Fv-антитело» или «scFv» относится к сконструированному антителу, состоящему из вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи, которые соединены друг с другом непосредственно или через последовательность пептидного линкера.

Антитела, которые специфически связываются с молекулой на поверхности опухолевых клеток, могут быть получены, используя методы, хорошо известные в данной области техники. Такие методы включают фаговый дисплей, методы получения человеческих или гуманизированных антител, или методы с использованием трансгенного животного или растения, созданного для продуцирования антител человека. Библиотеки фагового дисплея частично или полностью синтетических антител доступны и могут быть подвергнуты скринингу на антитело или его фрагмент, которое(ый) может связываться с молекулой-мишенью. Библиотеки фагового дисплея антител человека также доступны. После идентификации аминокислотная последовательность или полинуклеотидная последовательность, кодирующая антитело, может быть изолирована и/или определена.

Примеры антигенов, на которые могут быть нацелены CAR настоящего изобретения, включают, но без ограничения ими, антигены, представленные на раковых клетках, и антигены, представленные на клетках, связанных с различными гематологическими заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями, воспалительными заболеваниями и инфекционными заболеваниями.

Что касается таргетирующих доменов, мишенью которых являются раковые антигены, выбор таргетирующего домена будет зависеть от типа рака, подлежащего лечению, и он может быть нацелен на опухолевые антигены. Образец опухоли от субъекта может быть охарактеризован в отношении наличия определенных биомаркеров или маркеров клеточной поверхности. Например, клетки рака молочной железы у субъекта могут быть позитивными или негативными по каждому из Her2Neu, эстрогенового рецептора и/или рецептора прогестерона. Выбирают молекулу опухолевого антигена или клеточной поверхности, которая встречается на опухолевых клетках отдельного субъекта. Предпочтительно, когда мишенью антигенспецифического таргетирующего домена является молекула клеточной поверхности, которая встречается на опухолевых клетках и по существу не встречается в нормальных тканях, или ее экспрессия ограничивается не являющимися необходимыми для жизни нормальными тканями.

Дополнительные специфические для рака антигены, на которые может быть нацелен CAR настоящего изобретения, включают, но без ограничения, любой один или более из карциноэмбрионального антигена (СЕА), специфического для простаты антигена, PSMA, Her2/neu, эстрогенового рецептора, рецептора прогестерона, эфрина B2, ROR1, мезотелина, c-Met, GD-2, и MAGE А3 TCR, 4-1ВВ, 5T4, антигена аденокарциномы, альфа-фетопротеина, BAFF, клетки В-лимфомы, антигена С242, СА-125, карбоангидразы 9 (СА-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (рецептора IgE), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CEA, CNT0888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, дополнительного домена-B фибронектина, рецептора 1 фолиевой кислоты, GD2, ганглиозида GD3, гликопротеина 75, GPNMB, HGF, рецепторной киназы фактора роста гепатоцитов человека, рецептора IGF-1, IGF-1, IgG1, L1-САМ, IL-13, IL-6, рецептора инсулиноподобного фактора 1 роста, интегрина α5β1, интегрина ανβ3, MORAb-009, MS4A1, MUC1, муцинового CanAg, N-гликолилнейраминовой кислоты, NPC-1C, PDGF-Rα, PDL192, фосфатидилсерина, клеток карциномы простаты, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, тенасцина C, TGF бета 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, опухолевого антигена CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR1, VEGFR2 или виментина.

Специфические для воспалительных заболеваний антигены, на которые может быть нацелен CAR настоящего изобретения, включают, но без ограничения, любой один или более из AOC3 (VAP-1), CAM-3001, CCL11 (эотаксина-1), CD125, CD147 (басигина), CD154 (CD40L), CD2, CD20, CD23 (рецептора IgE), CD25 (α-цепи рецептора IL-2), CD3, CD4, CD5, IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE, Fc-фрагмента IgE, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, рецептора IL-6, интегрина α4, интегрина α4β7, шерсти ламы, LFA-1 (CD11а), MEDI-528, миостатина, ОХ-40, rhuMAb β7, склеросцина, SOST, TGFβ1, TNF-а или VEGF-A.

Специфические для нейрональных нарушений антигены, на которые может быть нацелен CAR настоящего изобретения, включают, но без ограничения, любой один или более из бета-амилоида или MABT5102A.

Специфические для диабета антигены, на которые может быть нацелен CAR настоящего изобретения, включают, но без ограничения, любой один или более из L-1β или CD3. Другие антигены, специфические для диабета или других нарушений обмена веществ, будут очевидны квалифицированным специалистам в данной области.

Специфические для сердечнососудистых заболеваний антигены, на которые может быть нацелен CAR настоящего изобретения, включают, но без ограничения, любой один или более из C5, сердечного миозина, CD41 (интегрина альфа-IIb), фибрина II, бета-цепи, ITGB2 (CD18) и сфингазин-1-фосфата.

Предпочтительно антигенспецифический связывающий домен специфически связывается с опухолевым антигеном. В конкретном варианте осуществления полинуклеотид кодирует одноцепоченый Fv, который специфически связывается с CD44v6.

Иллюстративным антигенспецифическим таргетирующим доменом является CD44v6-специфический одноцепочечный фрагмент (scFv), например, описанный в Casucci M et al. Blood, 2013, Nov 14; 122(20):3461-72). Такая последовательность представлена ниже:

CD44v6-специфический одноцепочечный фрагмент (scFv)

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYIYWLQQKPGQAPRILIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQWSSNPLTFGGGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYLDSIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGLDYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:17)

В одном варианте осуществления CD44v6-специфический одноцепочечный фрагмент по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичен последовательности SEQ ID NO:17.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи CD44v6-специфического одноцепочечного фрагмента соединены друг с другом через пептидный линкер, имеющий следующую последовательность GGGGSGGGGS (4GS2). Такой CD44v6-специфический одноцепочечный фрагмент (CD44v6-4GS2) имеет следующую последовательность:

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYIYWLQQKPGQAPRILIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQWSSNPLTFGGGTKVEIKRGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYLDSIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGLDYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:31)

Костимулирующий домен

CAR настоящего изобретения может также включать один или более костимулирующих доменов. Этот домен может усиливать пролиферацию клеток, выживаемость клеток и развитие клеток памяти.

Каждый костимулирующий домен включает костимулирующий домен любого одного или более из, например, членов суперсемейства TNFR, CD28, CD137 (4-1ВВ), CD134 (OX40), DaplO, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 или их комбинаций. Костимулирующие домены из других белков могут быть также использованы с CAR настоящего изобретения. Дополнительные костимулирующие домены будут очевидны квалифицированным специалистам в данной области техники.

В одном варианте осуществления как трансмембранный, так и костимулирующий домены получены из CD28. В одном варианте осуществления трансмембранный и внутриклеточный костимулирующий домены включают последовательность, приведенную ниже:

Трансмембранная и внутриклеточная часть CD28 человека (UNIPROT: P10747, CD28_HUMAN, положения 153-220)

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:18)

В одном варианте осуществления трансмембранный и внутриклеточный, передающий сигналы домен по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичен последовательности SEQ ID NO:18.

В одном варианте осуществления трансмембранный домен CD28 включает последовательность FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:29).

В одном варианте осуществления внутриклеточный костимулирующий домен CD28 включает последовательность RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:30).

Внутриклеточный, передающий сигналы домен

CAR настоящего изобретения может также включать внутриклеточный, передающий сигналы домен. Этот домен может быть цитоплазматическим и может передавать эффекторный функциональный сигнал и направлять клетки на выполнение своей специальной функции. Примеры внутриклеточных, передающих сигналы доменов включают, но без ограничения ими, ζ-цепь Т-клеточного рецептора или любой из ее гомологов (например, η-цепь, FcεR1γ и β-цепи, MB1 (lgα) цепь, B29 (lgβ) цепь и т.д.), полипептиды CD3 (Δ, δ и ε), семейство Syk тирозинкиназ (Syk, ZAP 70 и т.д.), семейство scr тирозинкиназ (Lck, Fyn, Lyn, и т.д.) и другие молекулы, участвующие в преобразовании сигналов в Т-клетках, такие как CD2, CD5 и CD28. Внутриклеточный, передающий сигналы домен может быть дзета-цепью CD3 человека, FcγRIII, FcsRI, цитоплазматическими хвостами Fc-рецепторов, несущими иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM) цитоплазматическими рецепторами или их комбинациями.

Предпочтительно, когда внутриклеточный, передающий сигналы домен включает внутриклеточный, передающий сигналы домен дзета-цепи CD3 человека.

В одном варианте осуществления внутриклеточный, передающий сигналы домен дзета-цепи CD3 человека включает следующую последовательность:

UNIPROT: P20963, CD3Z_HUMAN, положения 31-143

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEG LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:20)

В одном варианте осуществления внутриклеточный, передающий сигналы домен по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичен последовательности SEQ ID NO:20.

Дополнительные внутриклеточные, передающие сигналы домены будут очевидны квалифицированным специалистам в данной области техники и могут быть использованы в связи с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения.

Трансмембранный домен

CAR настоящего изобретения может также включать трансмембранный домен. Трансмембранный домен может включать трансмембранную последовательность из любого белка, который имеет трансмембранный домен, в том числе любого из трансмембранных белков типа I, типа II или типа III. Трансмембранный домен CAR настоящего изобретения может также включать искусственную гидрофобную последовательность. Трансмембранные домены CAR настоящего изобретения могут быть выбраны таким образом, чтобы не подвергаться димеризации. Дополнительные трансмембранные домены будут очевидны квалифицированным специалистам в данной области техники. Примеры трансмембранных (ТМ) районов, используемых в конструкциях CAR, являются: 1) ТМ-район CD28 (Pule et al. Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Brentjens et al. CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Casucci et al. Blood, 2013, Nov 14;122(20):3461-72.); 2) ТМ-район OX40 (Pule et al. Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41); 3) ТМ-район 41BB (Brentjens et al. CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35); 4) ТМ-район CD3 дзета (Pule et al. Mol Ther, 2005, Nov; 12(5):933-41; Savoldo B, Blood, 2009, Jun 18;113(25):6392-402); 5) ТМ-район CD8a (Maher et al. Nat Biotechnol, 2002, Jan; 20(1):70-5.; Imai C, Leukemia, 2004, Apr;18(4):676-84; Brentjens et al. CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Milone et al. Mol Ther, 2009, Aug;17(8):1453-64).

В одном варианте осуществления как трансмембранный, так и внутриклеточный, передающий сигналы домены получены из CD28. В одном варианте осуществления трансмембранный и внутриклеточный, передающий сигналы домен включает последовательность, приведенную ниже:

Трансмембранная и внутриклеточная часть CD28 человека (UNIPROT: P10747, CD28_HUMAN, положения 153-220)

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPR DFAAYRS (SEQ ID NO:18)

В одном варианте осуществления трансмембранный и внутриклеточный, передающий сигналы домен по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичен последовательности SEQ ID NO:18.

Спейсерный домен - рецептор фактора роста нервов с низким сродством (LNGFR)

CAR настоящего изобретения включает экстраклеточный спейсерный домен. Экстраклеточный спейсерный домен присоединен к антигенспецифическому таргетирующему району и трансмембранному домену.

CAR настоящего изобретения включает экстраклеточный спейсер, который включает по крайней мере часть экстраклеточного домена рецептора фактора роста нервов человека с низким сродством (LNGFR) или ее производное.

LNGFR не экспрессируется в большинстве гемопоэтических клеток человека, так что делается возможным количественный анализ экспрессии трансдукцированных генов с помощью иммунофлуоресценции, с разрешающей способностью=одной клетке. Таким образом, анализ экспрессии LNGFR с использованием сортера клеток с активацией флуоресценции может быть выполнен на трансдуцированных клетках для изучения экспрессии гена. Более подробную информацию об анализе с использованием LNGFR можно найти в Mavilio 1994, Blood 83, 1988-1997.

Последовательность LNGFR человека представлена на фиг. 8 (SEQ ID NO:14).

В настоящем изобретении в одном варианте осуществления используется усеченный LNGFR (также известный как ΔLNGFR). Предпочтительно, когда LNGFR, используемый в настоящем изобретении, является усеченным в его внутрицитоплазматическом домене. Такое усечение описано в Mavilio 1994.

Таким образом, предпочтительно спейсер LNGFR настоящего изобретения включает по крайней мере часть экстраклеточного домена, или ее производное, но в нем отсутствует внутриклеточный домен LNGFR. Экстраклеточный домен может включать аминокислоты 29-250 из LNGFR или его производного.

Экстраклеточный домен LNGFR человека (UNIPROT #P08138, TNR16_HUMAN, положения 29-250)

KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN (SEQ ID NO:19)

Предпочтительно, когда в LNGFR отсутствует сигнальный пептид.

В одном варианте осуществления спейсер включает по крайней мере часть белка, идентичного по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% экстраклеточному домену LNGFR (например, SEQ ID NO:19). В одном варианте осуществления спейсер включает по крайней мере часть белка, идентичного по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотам 29-250 белка LNGFR.

LNGFR включает 4 TNFR-Cys домена (TNFR-Cys 1, TNFR-Cys 2, TNFR-Cys 3 и TNFR-Cys 4). Последовательности доменов проиллюстрированы ниже:

TNFR-Cys 1, SEQ ID NO:9

ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC

TNFR-Cys 2, SEQ ID NO:10

PCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVC

TNFR-Cys 3, SEQ ID NO:11

RCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVC

TNFR-Cys 4. SEQ ID NO:12

ECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAEC

В одном варианте осуществления спейсер включает TNFR-Cys 1, 2 и 3 домены или их фрагменты или производные. В другом варианте осуществления спейсер включает TNFR-Cys 1, 2, 3 и 4 домены или их фрагменты или производные.

В одном варианте осуществления спейсер включает последовательность, идентичную по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% TNFR-Cys 1 (SEQ ID NO:9), последовательность, идентичную по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% TNFR-Cys 2 (SEQ ID NO:10), или последовательность, идентичную по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% TNFR-Cys 3 (SEQ ID NO:11). Спейсер может, кроме того, включать последовательность, идентичную по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% TNFR-Cys 4 (SEQ ID NO:12).

Вместо того, чтобы включать в себя полный TNFR-Cys 4 домен, спейсер может включать TNFR-Cys 4 домен со следующими удаленными из указанного домена аминокислотами: NHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRW. В одном варианте осуществления аминокислоты NHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRW заменены следующими аминокислотами ARA.

В одном варианте осуществления в спейсере отсутствует богатая серином/треонином ножка LNGFR. В другом варианте осуществления спейсер включает богатую серином/треонином ножку LNGFR.

Спейсер может включать или состоять из последовательность(и) SEQ ID NO:1 или последовательность(и), идентичную по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO:1.

Спейсер может включать или состоять из последовательность(и) SEQ ID NO:3 или последовательность(и), идентичную по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO:3.

Спейсер может включать или состоять из последовательность(и) SEQ ID NO:5 или последовательность(и), идентичную по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO:5.

Спейсер может включать или состоять из последовательность(и) SEQ ID NO:7 или последовательность(и), идентичную по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO:7.

Спейсер может придавать CAR свойства из условия, чтобы делалась возможной иммуноселекция клеток, предпочтительно Т-клеток, экспрессирующих указанный CAR.

CAR настоящего изобретения (включающий спейсер, упоминаемый здесь) предпочтительно дает возможность Т-клеткам, экспрессирующим CAR, пролиферироваться в присутствии клеток, экспрессирующих антиген, для которого разработан CAR.

CAR настоящего изобретения (включающий спейсер, упоминаемый здесь) предпочтительно дает возможность Т-клеткам, экспрессирующим CAR, опосредовать терапевтически значимые противораковые эффекты против рака, который CAR предназначен делать мишенью.

CAR настоящего изобретения (включающий спейсер, упоминаемый здесь) предпочтительно пригоден для облегчения иммуноселекции клеток, трансдуцированных указанным CAR.

CAR настоящего изобретения, включающий спейсер на основе LNGFR, позволяет избежать активации нежелательных и потенциально токсичных нецелевых иммунных реакций и позволяет CAR-экспрессирующим Т-клеткам продолжать существовать in vivo, не будучи преждевременно устраненными иммунной системой хозяина.

Как упомянуто ниже, настоящее изобретение также охватывает применение вариантов, производных, гомологов и фрагментов спейсерных элементов, описанных здесь.

Производные и фрагменты

Помимо специфических белков, пептидов и нуклеотидов, упомянутых здесь, настоящее изобретение также охватывает применение их производных и фрагментов.

Термин «производное», используемый здесь, в отношении белков или полипептидов настоящего изобретения, включает любое замещение, изменение, модификацию, замену, делецию и/или добавление одного (или более) аминокислотных остатков из или в последовательности при условии, что полученный в результате белок или полипептид сохраняет желаемую функцию.

Как правило, аминокислотные замены могут быть составлены, например, из 1, 2 или от 3 до 10 или 20 замен при условии, что модифицированная последовательность сохраняет требуемую активность или способность. Замены аминокислот могут включать использование не встречающихся в природе аналогов.

Белки или пептиды, используемые в настоящем изобретении, могут также иметь делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, которые вызывают молчащие изменения и дают в результате функционально эквивалентный белок. Преднамеренные аминокислотные замены могут быть осуществлены на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков, пока сохраняется эндогенная функция. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, имеющие сходные величины гидрофильности, включают аспарагин, глутамин, серин, треонин и тирозин.

Консервативные замены могут быть осуществлены, например, в соответствии с приведенной ниже таблицей. Аминокислоты в одном и том же блоке во втором столбце и предпочтительно в той же строке в третьем столбце могут быть заменены друг на друга:

АЛИФАТИЧЕСКИЕ Неполярные G A P I L V Полярные - незаряженные C S T M N Q Полярные - заряженные D E K R H АРОМАТИЧЕСКИЕ F W Y

Производное может быть гомологом. Термин «гомолог», используемый здесь, означает структуру, имеющую определенную степень гомологии с аминокислотной последовательностью дикого типа и нуклеотидной последовательностью дикого типа. Термин «гомология» может быть приравнен к «идентичности».

Гомологичная последовательность может включать аминокислотную последовательность, которая может быть по меньшей мере на 50%, 55%, 65%, 75%, 85% или 90% идентична, предпочтительно по меньшей мере на 95% или 97% или 99% идентична рассматриваемой последовательности. Как правило, гомологи будут включать такие же активные центры и т.д., как и рассматриваемая аминокислотная последовательность. Хотя гомологию можно также рассматривать с точки зрения сходства (т.е. аминокислотные остатки, имеющие сходные химические свойства/функции), в контексте настоящего изобретения предпочтительно выражать гомологию в терминах идентичности последовательности.

Гомологичная последовательность может включать нуклеотидную последовательность, которая может быть по меньшей мере на 50%, 55%, 65%, 75%, 85% или 90% идентична, предпочтительно по меньшей мере на 95% или 97% или 99% идентична рассматриваемой последовательности. Хотя гомологию также можно рассматривать с точки зрения сходства, в контексте настоящего изобретения предпочтительно выражать гомологию в терминах идентичности последовательности.

Сравнения гомологии могут проводиться на глаз или, чаще всего, с помощью легкодоступных программ сравнения последовательностей. Эти коммерчески доступные компьютерные программы могут рассчитать процент гомологии или идентичности между двумя или более последовательностей.

Процент гомологии может быть рассчитан на протяжении прилегающих последовательностей, т.е. одну последовательность совмещают с другой последовательностью, и каждую аминокислоту в одной последовательности непосредственно сравнивают с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, один остаток за один раз. Это называется совмещением, «не содержащим разрывы». Как правило, такие не содержащие разрывы совмещения выполняют только на протяжении относительно короткого числа остатков.

Несмотря на то, что это очень простой и согласующийся метод, он не в состоянии принять во внимание, что, например, в идентичной во всем остальном паре последовательностей одна вставка или делеция в нуклеотидной последовательности может привести к тому, что следующие кодоны будут выведены из совмещения, что таким образом может потенциально привести к значительному уменьшению процента гомологии при выполнении общего совмещения. Следовательно, большинство методов сравнения последовательностей разработано для получения оптимальных совмещений, которые принимают во внимание возможные вставки и делеции без неоправданного ухудшения общей оценки гомологии. Это достигается за счет вставки «разрывов» при совмещении последовательностей, чтобы попытаться максимизировать локальную гомологию.

Однако эти более сложные методы назначают «штрафы за разрывы» каждому разрыву, который возникает при совмещении, так что, для одного и того же числа идентичных аминокислот, совмещение последовательностей с наименьшим по возможности количеством разрывов, что отражает более высокую степень родства между двумя сравниваемыми последовательностями, получит более высокую оценку, чем совмещение со множеством разрывов. Как правило, используются «аффинные штрафы за разрывы», которые взимают относительно высокий штраф за существование разрыва и меньший штраф за каждый последующий остаток в разрыве. Это является наиболее часто используемой системой подсчета очков за разрывы. Высокие штрафы за разрывы будут, конечно, давать оптимизированные совмещения с меньшим количеством разрывов. Большинство программ для совмещений позволяет корректировать штрафы за разрывы. Однако предпочтительно использовать значения по умолчанию при использовании такого программного обеспечения для сравнения последовательностей. Например, при использовании пакета программ GCG Wisconsin Bestfit штраф за разрыв по умолчанию для аминокислотных последовательностей составляет -12 за разрыв и -4 за каждое расширение.

По этой причине для расчета максимального процента гомологии прежде всего требуется получения оптимального совмещения, принимая во внимание штрафы за разрывы. Подходящей компьютерной программой для проведения такого совмещения является пакет программ GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, USA; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Примеры другого программного обеспечения, которое может выполнять сравнение последовательностей, включают, но без ограничения ими, пакет программ BLAST (смотрите Ausubel et al. (1999) там же главу 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) и набор инструментов для сравнения GENEWORKS. Как BLAST, так и FASTA доступны для поиска в режиме оффлайн (вне Интернета) и онлайн (смотрите Ausubel et al. (1999) там же, страницы с 7-58 до 7-60). Однако для некоторых применений предпочтительно использовать программу GCG Bestfit. Еще один инструмент, называемый BLAST 2 Sequences, также доступен для сравнения белковых и нуклеотидных последовательностей (смотрите FEMS Microbiol Lett (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol Lett (1999) 177: 187-8).

Хотя конечный процент гомологии можно измерить в терминах идентичности, сам процесс совмещения обычно не основывается на попарном сравнении по принципу «все или ничего». Вместо этого, обычно используется матрица дифференцированных оценок сходства, которая присваивает оценки каждому попарному сравнению на основе химического сходства или эволюционного расстояния. Примером такой обычно используемой матрицы является матрица BLOSUM62 - матрица по умолчанию для пакета программ BLAST. Программы GCG Wisconsin обычно используют либо общие значения по умолчанию или таблицу сравнения пользовательских символов, если предоставляется (смотрите инструкцию для получения более подробной информации). Для некоторых применений предпочтительно использовать общие значения по умолчанию для пакета программ GCG или, в случае другого программного обеспечения, матрицу по умолчанию, такую как BLOSUM62.

После того как программа произвела оптимальное совмещение, можно вычислить процент гомологии, предпочтительно процент идентичности последовательностей. Программное обеспечение, как правило, делает это как часть сравнения последовательностей и выдает численный результат.

Фрагменты обычно относятся к выбранной области полипептида или полинуклеотида, которая представляет интерес функционально. «Фрагмент», таким образом, относится к аминокислотной последовательности, которая представляет собой часть полноразмерного полипептида, или последовательности нуклеиновой кислоты, которая представляет собой часть полноразмерного полинуклеотида. Поскольку фрагменты представляют интерес функционально, например, сохраняют желаемую функциональность, они, следовательно, исключают например, одну аминокислоту или одну нуклеиновую кислоту.

Такие производные и фрагменты могут быть получены, используя стандартные методы рекомбинантной ДНК, такие как сайт-направленный мутагенез. Если вставки должны быть сделаны, синтетическая ДНК, кодирующая вставку вместе с 5' и 3' фланкирующими районами, соответствующими встречающейся в природе последовательности с той или другой стороны от места вставки, могут быть созданы. Фланкирующие районы будут содержать удобные сайты рестрикции, соответствующие сайтам во встречающейся в природе последовательности, так что последовательность может быть разрезана с помощью соответствующего фермента(ов), и синтетическая ДНК лигирована в место разреза. Затем ДНК экспрессируют в соответствии с настоящим изобретением для выработки кодируемого белка. Эти методы являются только иллюстрацией многочисленных стандартных методов, известных в данной области техники для манипулирования последовательностями ДНК, и другие известные методы могут быть также использованы.

Полинуклеотиды

Полинуклеотиды настоящего изобретения могут включать ДНК или РНК. Они могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Квалифицированному специалисту будет понятно, что многочисленные различные полинуклеотиды могут кодировать один и тот же полипептид в результате вырожденности генетического кода. Кроме того, следует понимать, что квалифицированный специалист может, используя обычные методы, произвести замены нуклеотидов, которые не влияют на последовательность полипептида, кодируемую полинуклеотидами настоящего изобретения, чтобы отразить частоту использования кодонов любого конкретного организма хозяина, в котором полипептиды настоящего изобретения должны быть экспрессированы.

Полинуклеотиды могут быть модифицированы любым способом, доступным в данной области техники. Такие модификации могут быть выполнены для того, чтобы увеличить in vivo активность или продолжительность существования полинуклеотидов настоящего изобретения.

Полинуклеотиды, такие как ДНК-полинуклеотиды, могут быть получены рекомбинантным способом, синтетически или любыми способами, доступными квалифицированным специалистам в данной области техники. Они также могут быть клонированы с помощью стандартных методов.

Более длинные полинуклеотиды, как правило, получают, используя рекомбинантные способы, например, используя методы клонирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Они будут включать в себя получение пары праймеров (например, приблизительно от 15 до 30 нуклеотидов), фланкирующих последовательность-мишень, которую желательно клонировать, приведение праймеров в контакт с мРНК или кДНК, полученной из клетки животного или человека, выполнение полимеразной цепной реакции в условиях, которые вызывают амплификацию желаемого района, выделение амплифицированного фрагмента (например, путем очистки реакционной смеси с использованием агарозного геля) и выделение амплифицированной ДНК. Могут быть разработаны праймеры, которые содержат подходящие сайты узнавания ферментами рестрикции, так что амплифицированная ДНК может быть клонирована в подходящий вектор.

Оптимизация частоты использования кодонов

Полинуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть оптимизированы в отношении частоты использования кодонов. Оптимизация частоты использования кодонов ранее была описана в WO 1999/41397 и WO 2001/79518. Различные клетки отличаются использованием в них отдельных кодонов. Это предпочтение кодонов соответствует смещению относительной численности отдельных тРНК в этом типе клеток. Изменяя кодоны в последовательности таким образом, чтобы подогнать их к соответствию с относительным содержанием соответствующих тРНК, можно увеличить экспрессию. К тому же, можно уменьшить экспрессию путем намеренного выбора кодонов, для которых соответствующие тРНК, как известно, являются редкими в конкретном типе клеток. Таким образом, доступна дополнительная степень трансляционного контроля.

Векторы

Вектор представляет собой инструмент, который делает возможным или облегчает перенос структуры из одной среды в другую. В соответствии с настоящим изобретением, и в качестве примера, некоторые векторы, используемые в методах рекомбинантных нуклеиновых кислот, делают возможным перенос таких структур, как сегмент нуклеиновой кислоты (например, сегмент гетерологичной ДНК, такой как сегмент гетерологичной кДНК), в клетки-мишени. Векторы могут быть невирусными или вирусными. Примеры векторов, используемых в методах рекомбинантных нуклеиновых кислот, включают, но без ограничения ими, плазмиды, молекулы мРНК (например, in vitro транскрибированные мРНК), хромосомы, искусственные хромосомы и вирусы. Вектор может также быть, например, «голой» нуклеиновой кислотой (например, ДНК). В своей простейшей форме, сам вектор может быть представляющим интерес нуклеотидом.

Векторы, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой, например, плазмиды, мРНК или вирусные векторы и могут включать промотор для экспрессии полинуклеотида и необязательно регулятор промотора.

Векторы, включающие полинуклеотиды настоящего изобретения, могут быть введены в клетки с использованием различных методов, известных в данной области техники, таких как трансформация и трансдукция. В данной области техники известно несколько методов, например, инфицирование рекомбинантными вирусными векторами, такими как ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, аденоассоциированные вирусные, бакуловирусные векторы и векторы на основе вируса простого герпеса; прямая инъекция нуклеиновых кислот и баллистическая трансформация.

Невирусные системы доставки включают, но без ограничения ими, методы трансфекции ДНК. Здесь, трансфекция включает процесс с использованием невирусного вектора для доставки гена в клетку-мишень.

Типичные способы трансфекции включают электропорацию, баллистическую трансфекцию ДНК, трансфекцию с использованием липидов, трансфекцию с использованием упакованной ДНК, липосомы, иммунолипосомы, липофектин, трансфекцию с использованием катионных агентов, катионные поверхностные амфифилы (CFA) (Nat Biotechnol (1996) 14: 556) и их комбинации.

Ретровирусные векторы

В одном варианте осуществления вектор, используемый в настоящем изобретении, представляет собой вектор на основе ретровируса, которой был сконструирован с использованием методов генной инженерии таким образом, что он не может реплицироваться и давать потомство инфекционных вирусных частиц, как только вирус вошел в клетку-мишень. Существует множество ретровирусов, которые широко используются для доставки генов как в условиях культивирования тканей, так и в живые организмы. Примеры включают, и не ограничиваются ими, вирус лейкоза мышей (MLV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV), вирус опухоли молочной железы мышей (MMTV), вируса саркомы Рауса (RSV), вирус саркомы Фудзинами (FuSV), вирус лейкоза Молони мышей (Mo-MLV), вирус остеосаркомы FBR мышей (FBR МСВ), вирус саркомы Молони мышей (Мо-МСВ), вирус лейкоза Абельсона мышей (А-MLV), вирус-29 миелоцитоматоза птиц (MC29) и вирус эритробластоза птиц (AEV) и все остальные вирусы семейства Retroviridiae, включая лентивирусы. Подробный список ретровирусов можно найти в Coffin et al., 1997, ʺretrovirusesʺ, Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763.

Основной структурой генома ретровирусов является 5' LTR и 3' LTR, между или внутри которых расположены сигнальная последовательность упаковки, которая делает возможной упаковку генома, сайт связывания праймера, сайты интеграция, которые делают возможной интеграцию в геном клетки-хозяина, и гены gag, pol и env, кодирующие компоненты упаковки - они представляют собой полипептиды, необходимые для сборки вирусных частиц. Более сложные ретровирусы имеют дополнительные признаки, такие как последовательности rev и RRE у ВИЧ, которые делают возможным эффективный экспорт РНК-транскриптов с интегрированного провируса из ядра в цитоплазму инфицированной клетки-мишени.

В провирусе, эти гены фланкированы на обоих концах участками, называемыми длинными концевыми повторами (LTR). LTR ответственны за интеграцию провируса и транскрипцию. LTR также служат в качестве энхансерных-промоторных последовательностей и могут контролировать экспрессию вирусных генов. Инкапсулирование ретровирусных РНК происходит благодаря последовательности psi, расположенной на 5'-конце вирусного генома.

Сами LTR представляют собой одинаковые последовательности, которые можно разделить на три элемента, которые называются U3, R и U5. U3 происходит от последовательности, уникальной для 3' конца РНК. R происходит от последовательности, повторяющейся на обоих концах РНК, и U5 происходит от последовательности, уникальной для 5' конца РНК. Размеры трех элементов могут значительно варьировать среди различных ретровирусов.

В геноме дефектного ретровирусного вектора gag, pol и env могут отсутствовать или не быть функциональными. R-районы на обоих концах РНК представляют собой повторяющиеся последовательности. U5 и U3 представляют собой уникальные последовательности на 5' и 3'-концах РНК-генома, соответственно.

Более предпочтительно, когда вирусный вектор является таргетирующим вектором, то есть он имеет тканевой тропизм, который изменен по сравнению со встречающимся в природе вирусом, так что вектор является нацеленным на конкретные клетки. Это может быть достигнуто путем изменения белка Env ретровируса. Предпочтительно белок оболочки представляет собой нетоксичную оболочку или оболочку, которая может продуцироваться в нетоксичных количествах в первичных клетках-мишенях, такую как, например, амфотропная оболочка MMLV или модифицированная амфотропная оболочка.

Предпочтительно, когда оболочкой является оболочка, которая делает возможной трансдукцию клеток человека. Примеры подходящих генов env включают, но без ограничения ими, VSV-G, амфотропный env MLV, такой как env 4070A, env вируса лейкоза кошек RD114 или гемагглютинин (HA) из вируса гриппа. Белок Env может быть таким, который способен связываться с рецептором на ограниченном количестве типов клеток человека, и может быть сконструированным белком оболочки, содержащим таргетирующие составляющие. Кодирующие последовательности env и gag-pol транскрибируются с промотора и необязательно энхансера, являющего активным в выбранной пакующей линии клеток, и единица транскрипции терминируется сигналом полиаденилирования. Например, если пакующая клетка представляет собой клетку человека, подходящей комбинацией промотор-энхансер является таковая из основного немедленно-раннего гена цитомегаловируса человека (hCMV-MIE), и может быть использован сигнал полиаденилирования из вируса SV40. Другие подходящие промоторы и сигналы полиаденилирования известны в данной области техники.

MLV

Предпочтительно, когда ретровирусный вектор, используемый в настоящем изобретении, представляет собой вектор в виде вируса лейкоза мышей (MLV). Ретровирусные векторы, полученные исходя из амфотропного вируса лейкоза Молони мышей (MLV-A), обычно используются в клинических протоколах по всему миру. Эти вирусы используют рецепторы-транспортеры фосфата на клеточной поверхности для вхождения, а затем надолго интегрируются в хромосомы пролиферирующихся клеток. Эти гены затем сохраняются в течение времени существования клетки. Активность генов в конструкциях на основе MLV легко контролируется и может быть эффективной в течение длительного времени. Клинические испытания, проведенные с этими системами на основе MLV, показали, что они хорошо переносятся без каких-либо неблагоприятных побочных эффектов.

Пример вектора MLV для использования в настоящем изобретении представляет собой вектор, происходящий от SFCMM-3, который несет как ген «самоубийства» HSV-tk, так и маркерный ген ΔLNGFR (Verzeletti 98, Human Gene Therapy, 9:2243). Первоначальным вектором, использованным для получения SFCMM-3, является LXSN (Miller et al. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques 7:980-990, 1989) (номер доступа в Genebank 28248). Вектор LXSN был модифицирован путем вставки гена HSV-tk в уникальный сайт HpaI (расщепление с образованием «тупых концов»), удаления гена neo путем расщепления HindIII и NaeI и вставки кДНК, кодирующей ΔLNGFR, в этот сайт.

Лентивирусный вектор

В одном варианте осуществления вектор настоящего изобретения может представлять собой лентивирусный вектор. Лентивирусные векторы являются частью большой группы ретровирусных векторов. Подробный список лентивирусов можно найти в Coffin et al. (ʺRetrovirusesʺ 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763). Вкратце, лентивирусы можно разделить на группы лентивирусов приматов и не приматов. Примеры лентивирусов приматов включают, но без ограничения ими: вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), возбудитель синдрома приобретенного иммунодефицита человека (СПИД) и обезьяний вирус иммунодефицита (SIV). Группа лентивирусов не приматов включает вирус висна-маеди (VMV) прототипа «медленный вирус», а также родственный вирус артрита-энцефалита коз (CAEV), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV) и недавно описанный вирус иммунодефицита кошачьих (FIV), и вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV).

Различие между семейством лентивирусов и другими типами ретровирусов заключается в том, что лентивирусы обладают способностью инфицировать как делящиеся, так и не делящиеся клетки. В противоположность этому, другие ретровирусы - такие как MLV - не способны инфицировать не делящиеся или медленно делящиеся клетки, такие как те, которые составляют, например, мышечную ткань, ткань головного мозга, легких и печени. Поскольку лентивирусы способны к трансдукции окончательно дифференцированных/первичных клеток, использование стратегии скрининга лентивирусов позволяет выбрать библиотеку в первичной, целевой не делящейся или медленно делящейся клетке-хозяине.

Аденовирусные векторы

В другом варианте осуществления вектором настоящего изобретения может быть аденовирусный вектор. Аденовирус представляет собой содержащий двухцепочечную, линейную ДНК вирус, который не проходит через стадию РНК-посредника. Существует более 50 различных серотипов аденовируса человека, которые делятся на 6 подгрупп на основе гомологии генетических последовательностей. Естественной мишенью аденовируса является эпителий дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта, как правило, порождая лишь легкие симптомы. Серотипы 2 и 5 (с 95% гомологией последовательности) чаще всего используются в аденовирусных векторных системах и, как правило, связаны с инфекциями верхних дыхательных путей у молодых.

Аденовирусы представляют собой правильные икосаэдры без оболочки. Типичным аденовирусом является вирус с заключенной в капсид ДНК диаметром 140 нм. Икосаэдральная симметрия вируса состоит из 152 капсомеров: 240 гексонов и 12 пентонов. Ядро частицы содержит линейную дуплексную ДНК размером 36 т.п.о., которая ковалентно связана на 5'-концах с терминальным белком (ТР), который действует в качестве праймера для репликации ДНК. ДНК содержит инвертированные концевые повторы (ITR), и их длина меняется в зависимости от серотипа.

Аденовирус представляет собой содержащий двухцепочечную ДНК вирус без оболочки, который способен к in vivo и in vitro трансдукции широкого ряда типов клеток человека и нечеловеческого происхождения. Эти клетки включают эпителиальные клетки дыхательных путей, гепатоциты, мышечные клетки, кардиомиоциты, синовиоциты, первичные эпителиальные клетки молочных желез и постмитотически окончательно дифференцированные клетки, такие как нейроны.

Аденовирусные векторы также способны к трансдукции не делящихся клеток. Это очень важно для таких заболеваний, как муковисцидоз, в случае которого пораженные клетки в эпителии легкого имеют низкую скорость кругооборота. На самом деле, несколько испытаний ведутся с использованием аденовирус-опосредованного переноса белка транспортера муковисцидоза (CFTR) в легкие взрослых пациентов, больных муковисцидозом.

Аденовирусы были использованы в качестве векторов для генной терапии и для экспрессии гетерологичных генов. Большой (36 т.п.о.) геном может вместить вплоть до 8 т.п.о. вставки чужеродной ДНК и способен эффективно реплицироваться в линии дополняющих клеток с продукцией очень высоких титров вплоть до 10¹². Таким образом, аденовирус является одной из лучших систем для исследования экспрессии генов в первичных не размножающихся клетках.

Для экспрессии вирусных или чужеродных генов с генома аденовируса не требуется размножающаяся клетка. Аденовирусные векторы входят в клетки с помощью опосредованного рецептором эндоцитоза. Оказавшись внутри клетки, аденовирусный вектор редко интегрируется в хромосому хозяина. Вместо этого, он функционирует эписомально (независимо от генома хозяина) в виде линейного генома в ядре хозяина. Следовательно, применение рекомбинантного аденовируса устраняет проблемы, связанные со случайной интеграцией в геном хозяина.

Поксвирусные векторы

Поксвирусные векторы могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, так как крупные фрагменты ДНК легко клонировать в их геном, и были описаны рекомбинантные аттенюированные варианты вируса осповакцины (Meyer et al. 1991; Smith and Moss, 1983).

Примеры поксвирусных векторов включают, но без ограничения ими, лепорипоксвирус: Upton et al. 1986, (вирус фиброма Шоупа); каприпоксвирус: Gershon et al., 1989, (вирус оспы овец-1 из Кении); ортопоксвирус: Weir et al., 1983, (вирус коровьей оспы); Esposito et al., 1984, (вирус оспы обезьян и натуральной оспы); Hruby et al., 1983, (вирус коровьей оспы); Kilpatrick et al., 1985, (вирус опухоли обезьян Яба); авипоксвирус: Binns et al., (1988) (вирус птичьей оспы); Boyle et al., 1987, (вирус оспы кур); Schnitzlein et al., 1988, (вирус оспы кур, вирус оспы перепелов); энтомопоксвирус (Lytvyn et al., 1992).

Поксвирусные векторы широко используются в качестве векторов для экспрессии интересующих генов в эукариотических клетках. Легкость их клонирования и размножения во множестве клеток-хозяев привела, в частности, к широкому использованию поксвирусных векторов для экспрессии чужеродного белка и в качестве средств доставки антигенов вакцины.

Векторы на основе вируса коровьей оспы

Вектор настоящего изобретения может представлять собой вектор на основе вируса коровьей оспы, такой как MVA или NYVAC. Наиболее предпочтительным является штамм модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA) или штамм, происходящий от него. Альтернативные варианты векторов на основе вируса коровьей оспы включают векторы на основе авипоксвирусов, такие как вирус птичьей оспы или оспы канареек, известный как ALVAC, и производные от него штаммы, которые могут инфицировать и экспрессировать рекомбинантные белки в клетках человека, но не способны реплицироваться.

Клетки

Настоящим изобретением также обеспечиваются сконструированные с помощью генной инженерии клетки, которые включают и стабильно экспрессируют CAR настоящего изобретения.

Антигенспецифические таргетирующие домены могут быть способны к специфическому связыванию, MHC-неограниченным образом, с антигеном, который обычно не связывается с Т-клеточным рецептором таким образом. В одном варианте осуществления антигенспецифические таргетирующие районы включают специфические в отношении мишени антитела или их функциональные эквиваленты или их фрагменты или производные. Антигенспецифическое антитело может представлять собой Fab-фрагмент антитела или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) антитела.

Сконструированные с помощью генной инженерии клетки, которые могут включать и экспрессировать CAR настоящего изобретения, включают, но без ограничения ими, Т-клетки, необученные Т-клетки, стволовые Т-клетки памяти, центральные Т-клетки памяти, эффекторные Т-клетки памяти, клетки-природные киллеры, гемопоэтические стволовые клетки и/или клетки, способные давать начало терапевтически соответствующему потомству. В одном варианте осуществления сконструированные с помощью генной инженерии клетки являются аутологичными клетками. В качестве примера, отдельные Т-клетки настоящего изобретения могут быть CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4-/CD8- или CD4+/CD8+. Т-клетки могут представлять собой смешанную популяцию CD4+/CD8- и CD4-/CD8+ клеток или популяцию одного клона.

Генетически модифицированные клетки могут быть получены путем стабильной трансфекции клеток с использованием ДНК, кодирующей CAR настоящего изобретения.

Различные методы дают стабильные трансфектанты, которые экспрессируют CAR настоящего изобретения. В одном варианте осуществления способ стабильной трансфекции и перенацеливания клеток осуществляют путем электропорации с использованием голой ДНК. При использовании голой ДНК, время, необходимое для создания перенацеленных клеток, может быть значительно уменьшено. Дополнительные методы генной инженерии клеток с использованием голой ДНК, кодирующей CAR настоящего изобретения, включают, но без ограничения, химические методы трансформации (например, с использованием фосфата кальция, дендримеров, липосом и/или катионных полимеров), нехимические методы трансформации (например, электропорацию, оптическую трансформацию, электроперенос генов и/или гидродинамическую доставку) и/или методы на основе частиц (например, импалефекция, используя генную пушку, и/или магнетофекцию). Трансфецированные клетки, демонстрирующие присутствие одного интегрированного не перестроенного вектора и экспрессию CAR, могут быть размножены ех vivo. В одном варианте осуществления клетки, выбранные для ех vivo размножения, являются CD8+ и демонстрируют способность специфически распознавать и лизировать антигенспецифические клетки-мишени.

Вирусные методы трансдукции также могут быть использованы для создания перенацеленных клеток, которые экспрессируют CAR настоящего изобретения.

Стимуляция Т-клеток с помощью антигена при соответствующих условиях приводит к пролиферации (размножению) клеток и/или продукции IL-2. Клетки, включающие CAR настоящего изобретения, будут увеличиваться в количестве в ответ на связывание одного или более антигенов с антигенспецифическими таргетирующими районами CAR. Настоящим изобретением также обеспечивается способ получения и увеличения количества клеток, экспрессирующих CAR. Способ может включать трансфекцию или трансдукцию клеток вектором, экспрессирующим CAR, после стимуляции клеток: 1) поликлональными стимулами, такими как бесклеточные каркасы, предпочтительно сферы с оптимальным размером, содержащие по крайней мере активирующий полипептид, предпочтительно антитело, специфическое для CD3, и активирующий полипептид, предпочтительно антитело, специфическое для CD28; 2) опухолевыми клетками, экспрессирующими антиген-мишень; 3) естественными искусственными антигенпрезентирующими клетками, и культивирование их вместе с цитокинами, включающими IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 отдельно или в комбинации.

Терапевтические методы и фармацевтические композиции

Здесь обеспечиваются способы лечения заболевания, связанного с антигеном, являющегося мишенью CAR настоящего изобретения, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение эффективного количества CAR, полинуклеотида или вектора, кодирующего CAR, или клетки, экспрессирующей указанный CAR, для осуществления лечения заболевания, связанного с этим антигеном, у субъекта.

Также обеспечивается фармацевтическая композиция, включающая CAR настоящего изобретения. CAR настоящего изобретения в композиции может быть любым одним или более из полинуклеотида, кодирующего CAR, вектора, кодирующего CAR, белка, включающего CAR, или генетически модифицированных клеток, включающих CAR.

Фармацевтическая композиция представляет собой композицию, которая включает или состоит из терапевтически эффективное(го) количество(а) фармацевтически активного агента. Она предпочтительно включает фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель (в том числе их комбинации). Приемлемые носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтической области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). Выбор фармацевтического носителя, наполнителя или разбавителя может быть осуществлен с учетом предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практики. Фармацевтические композиции могут включать в качестве - или в дополнение к - носителя(ю), наполнителя или разбавителя любое подходящее связующее вещество(а), смазочный материал(ы), суспендирующий агент(ы), обволакивающее средство(а) или солюбилизатор(ы).

Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают, например, воду, солевые растворы, спирт, силикон, воски, вазелин, растительные масла, полиэтиленгликоли, пропиленгликоль, липосомы, сахара, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, поверхностно-активные вещества, кремниевую кислоту, вязкий парафин, парфюмерное масло, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, сложные эфиры жирных кислот, растворенные в петролейном эфире, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и тому подобное.

Примеры

Пример 1 - Методы

Создание конструкций CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR

Последовательности спейсеров на основе LNGFR происходили из экстраклеточной части рецептора фактора роста нервов с низким сродством (LNGFR), за исключением сигнального пептида (P08138, TNR16_HUMAN). Длинная конструкция дикого типа (NWL) содержит как четыре богатых цистеином домена TNFR, так и богатую серином/треонином ножку. Короткая конструкция дикого типа (NWS) содержит только четыре богатых цистеином домена TNFR. Мутированная длинная конструкция (NML) содержит четыре богатых цистеином домена TNFR, богатую серином/треонином ножку и включает специфическую модификацию в четвертом домене во избежание связывания с NGF (Yan et al. J Biol Chem, 1991, Jun 25;266(18):12099-104). Мутированная короткая конструкция (NMS) содержит только четыре богатых цистеином домена TNFR, включая специфическую модификацию в четвертом домене. Спейсеры были синтезированы GENEART, фланкированы специфическими сайтами рестрикции (BamHI и PflMI), чтобы сделать возможным клонирование в принадлежащую авторам настоящего изобретения, оригинальную CD44v6-специфическую конструкцию CAR второго поколения (фиг. 9, SEQ ID NO:15), вместо спейсера CH2CH3 IgG1. Все конструкции были оптимизированы в отношении частоты использования кодонов для экспрессии в организме человека. Все конструкты были экспрессированы в основах SFG-RV (широко используемом ретровирусном векторе на основе MoMLV, который опирается на сплайсинг для экспрессии генов (Riviere et al., PNAS, 1995, Jul 18;92(15):6733-7)).

Спейсер LNGFR дикого типа длинный (NWL):

Последовательность белка (SEQ ID NO:1)

KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN.

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:2):

AAAGAGGCCTGCCCCACCGGCCTGTACACCCACAGCGGAGAGTGCTGCAAGGCCTGCAACCTGGGAGAGGGCGTGGCCCAGCCTTGCGGCGCCAATCAGACCGTGTGCGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACCTTCAGCGACGTGGTGTCCGCCACCGAGCCCTGCAAGCCTTGCACCGAGTGTGTGGGCCTGCAGAGCATGAGCGCCCCCTGCGTGGAAGCCGACGACGCCGTGTGTAGATGCGCCTACGGCTACTACCAGGACGAGACAACCGGCAGATGCGAGGCCTGTAGAGTGTGCGAGGCCGGCAGCGGCCTGGTGTTCAGTTGTCAAGACAAGCAGAATACCGTGTGTGAAGAGTGCCCCGACGGCACCTACAGCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCCTGCCTGCCCTGCACTGTGTGCGAGGACACCGAGCGGCAGCTGCGCGAGTGCACAAGATGGGCCGACGCCGAGTGCGAAGAGATCCCCGGCAGATGGATCACCAGAAGCACCCCCCCTGAGGGCAGCGACAGCACCGCCCCTAGCACCCAGGAACCTGAGGCCCCTCCCGAGCAGGACCTGATCGCCTCTACAGTGGCCGGCGTGGTGACAACCGTGATGGGCAGCTCTCAGCCCGTGGTGACACGGGGCACCACCGACAAT.

Спейсер LNGFR дикого типа короткий (NWS):

Последовательность белка (SEQ ID NO:3):

KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEE.

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:4):

AAAGAGGCCTGCCCCACCGGCCTGTACACCCACAGCGGAGAGTGCTGCAAGGCCTGCAACCTGGGAGAGGGCGTGGCCCAGCCTTGCGGCGCCAATCAGACCGTGTGCGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACCTTCAGCGACGTGGTGTCCGCCACCGAGCCCTGCAAGCCTTGCACCGAGTGTGTGGGCCTGCAGAGCATGAGCGCCCCCTGCGTGGAAGCCGACGACGCCGTGTGTAGATGCGCCTACGGCTACTACCAGGACGAGACAACCGGCAGATGCGAGGCCTGTAGAGTGTGCGAGGCCGGCAGCGGCCTGGTGTTCAGTTGTCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGTGAAGAGTGCCCCGACGGCACCTACAGCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCCTGCCTGCCCTGCACTGTGTGCGAGGACACCGAGCGGCAGCTGCGCGAGTGCACAAGATGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAA.

Спейсер LNGFR мутированный длинный (NML):

Последовательность белка (SEQ ID NO:5):

KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEAARAADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN.

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:6):

AAAGAGGCCTGCCCCACCGGCCTGTACACCCACAGCGGAGAGTGCTGCAAGGCCTGCAACCTGGGAGAGGGCGTGGCCCAGCCTTGCGGCGCCAATCAGACCGTGTGCGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACCTTCAGCGACGTGGTGTCCGCCACCGAGCCCTGCAAGCCTTGCACCGAGTGTGTGGGCCTGCAGAGCATGAGCGCCCCCTGCGTGGAAGCCGACGACGCCGTGTGTAGATGCGCCTACGGCTACTACCAGGACGAGACAACCGGCAGATGCGAGGCCTGTAGAGTGTGCGAGGCCGGCAGCGGCCTGGTGTTCAGTTGTCAAGACAAGCAGAATACCGTGTGTGAAGAGTGCCCCGACGGCACCTACAGCGACGAAGCCGCCAGAGCCGCCGACGCCGAGTGCGAAGAGATCCCCGGCAGATGGATCACCAGAAGCACCCCCCCTGAGGGCAGCGACAGCACCGCCCCTAGCACCCAGGAACCTGAGGCCCCTCCCGAGCAGGACCTGATCGCCTCTACAGTGGCCGGCGTGGTGACAACCGTGATGGGCAGCTCTCAGCCCGTGGTGACACGGGGCACCACCGACAAT.

Спейсер LNGFR мутированный короткий (NMS):

Последовательность белка (SEQ ID NO:7):

KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEAARAADAECEE.

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:8):

AAAGAGGCCTGCCCCACCGGCCTGTACACCCACAGCGGAGAGTGCTGCAAGGCCTGCAACCTGGGAGAGGGCGTGGCCCAGCCTTGCGGCGCCAATCAGACCGTGTGCGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACCTTCAGCGACGTGGTGTCCGCCACCGAGCCCTGCAAGCCTTGCACCGAGTGTGTGGGCCTGCAGAGCATGAGCGCCCCCTGCGTGGAAGCCGACGACGCCGTGTGTAGATGCGCCTACGGCTACTACCAGGACGAGACAACCGGCAGATGCGAGGCCTGTAGAGTGTGCGAGGCCGGCAGCGGCCTGGTGTTCAGTTGTCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGTGAAGAGTGCCCCGACGGCACCTACAGCGACGAGGCCGCCCGGGCCGCCGACGCCGAGTGCGAGGAA.

Условные обозначения:

С подчеркиванием: богатый цистеином домен c номером 1 TNFR.

Жирный шрифт: богатый цистеином домен c номером 2 TNFR.

Жирный шрифт с подчеркиванием: богатый цистеином домен c номером 3 TNFR.

Курсив: богатый цистеином домен c номером 4 TNFR.

Курсив с подчеркиванием: богатая серином/треонином ножка

Трансдукция и условия культивирования

Т-клетки активировали с использованием CD3/CD28-сфер клеточного размера (ClinExVivo, Invitrogen) плюс IL-7/IL-15 (5 нг/мл, Peprotech) и RV-трансдуцировали путем двух циклов центрифужной инокуляции в день 2 и 3 после стимуляции. В день 6, сферы удаляли, и Т-клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco-BRL), 10% FBS (BioWhittaker) в присутствии IL-7 и IL-15. Поверхностная экспрессия CD44v6-специфических конструкций CAR со спейсером CH2CH3 (CHW и CHM) была обнаружена с помощью мАт, специфических для спейсера CH2CH3 IgG1 (Jackson Laboratories), в то время как поверхностную экспрессию CD44v6-специфических конструкций CAR со спейсерами на основе LNGFR (NWL, NWS, NML и НМС) анализировали с использованием LNGFR-специфических мАт от BD Bioscience (клон: C40-14579) или от Miltenyi (клон: ME20.4). Между днем 9 и днем 15 с момента активации, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсером CH2CH3 IgG1 Т-клетки были FACS-отсортированы, используя поликлональные, специфические для CH2CH3 IgG1 мАт, в то время как экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки окрашивали РЕ-конъюгированным, LNGFR-специфическим мАт C40-14579 и сортировали с помощью колонок, используя анти-PE парамагнитные сферы (Miltenyi). После сортировки увеличение количества Т-клеток представляли как кратное увеличение: число Т-клеток в день х/число Т-клеток после сортировки.

In vitro анализы для анализа специфического распознавания

В анализах сокультивирования, CAR-отсортированные Т-клетки культивировали с клетками-мишенями при различных соотношениях Е:Т. Спустя 4 дня выжившие клетки подсчитывали и анализировали с помощью FACS. Т-клетки, трансдуцированные нерелевантным CAR (CD19), всегда использовались в качестве контроля. Индекс элиминации рассчитывали следующим образом: 1-(количество остаточных клеток-мишеней в присутствии CD44v6.CAR28z+ Т-клеток)/(число остаточных клеток-мишеней в присутствии CTR.CAR28z+ Т-клеток). В анализах разведения CFSE, в CAR-отсортированные Т-клетки вводили CFSE, и их стимулировали с использованием облученных (10000 рад) опухолевых клеток в соотношении Е:Т=1:5 или биологически активных концентраций NGF. Спустя 6 дней, пролиферацию Т-клеток измеряли с помощью FACS, анализируя процент клеток, которые разбавили краситель CFSE.

Модели противоопухолевой эффективности с использованием ксенотрансплантата

Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованием (IACUC). Для модели минимальной остаточной болезни, мышам NSG (Jackson) внутривенно вводили путем инфузии 1,5×10⁶ лейкозных клеток Thp1/мышь. Через три дня мышей подвергали лечению путем внутривенного введения 5×10⁶ отсортированных, экспрессирующих CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клеток, экспрессирующих CD44v6-CAR.28z со спейсером CH2CH3 Т-клеток или Т-клеток, несущих нерелевантный CAR (CD19). Приживление Т-клеток контролировали еженедельно с помощью кровопускания и анализа FACS. Через 7 недель мышей умерщвляли, и их печень анализировали с помощью гистопатологии и FACS на наличие клеток ТНР-1. Для модели устойчивого заболевания, мышам NSG вводили внутривенно 2×10⁶ клеток миеломы MM1.S/мышь. Через пять недель после этого мышей подвергали лечению путем внутривенного введения 5×10⁶ отсортированных, экспрессирующих CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клеток, экспрессирующих CD44v6-CAR.28z со спейсером CH2CH3 Т-клеток или Т-клеток, несущих нерелевантный CAR (CD19). Приживление Т-клеток и прогрессирование миеломы контролировали еженедельно с помощью кровопускания и анализа FACS (клетки миеломы будут отличать от Т-клеток по отличному CD45/CD3 человека фенотипу). Когда циркулирующие клетки MM1.S превышали 30 клеток/мкл, и/или мыши проявляли явные признаки связанного с опухолью страдания (паралич или >10% потери веса), мышей подвергали эвтаназии.

Проточная цитометрия

Для анализа FACS были использованы конъюгированные с FITC, PE, PerCP, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 и Pacific Blue антитела, направленные против человеческого CD44v6, CD4 (е-Bioscience), CD123, CD19, CD14, CD3, CD8, CD45RA, CD62L, CXCR4, CD127, CD33, CD38, CD45, LNGFR, мышиного CD45, 7AAD (BD Biosciences) и CH2CH3 IgG1 (Jackson Laboratories). Клетки (2×10⁵) инкубировали с антителами в течение 15 минут при 4^οС и промывали PBS с 1% FBS. Образцы пропускали через проточный цитометр FACS Canto II (BD Biosciences), и данные были проанализированы с помощью программного обеспечения Flow Jo (Tree star Inc). Относительная интенсивность флуоресценции (RFI) была рассчитана следующим образом: средняя интенсивность флуоресценции образца/среднюю интенсивность флуоресценции соответствующего изотипа в качестве контроля.

Пример 2 - Создание конструкций CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR.

Недавно авторы настоящего изобретения сконструировали CD44v6-специфический CAR на основе цепи CD3ζ в сочетании с эндокостимулирующим доменом CD28 (Casucci e al, Blood 2013, Nov 14;122(20):3461-72). В экстраклеточный спейсерный район этого CAR, спейсер CH2CH3 IgG1 был вставлен для лучшего таргетинга антигена CD44v6 и для обеспечения возможности отбора и in vivo отслеживания трансдуцированных Т-клеток. Однако серьезным недостатком CAR со спейсером CH2CH3 является их взаимодействие с Fcγ-рецепторами (FcγR) (Hombach et al. Gene Ther 2000, Jun;7(12):1067-75), что потенциально ведет к неспецифическому таргетингу клеток, экспрессирующих эти рецепторы, (например, моноцитов/макрофагов) и/или in vivo устранению трансдуцированных Т-клеток (фиг. 1). Чтобы обойти эту проблему, авторы настоящего изобретения заменили первоначальный спейсер CH2CH3 различными экстраклеточными доменами из рецептора фактора роста нервов с низким сродством (LNGFR). Усеченный вариант LNGFR, в котором отсутствуют внутриклеточные, передающие сигналы компоненты, уже использовался в клинике для генной маркировки Т-клеток (Bonini et al., Nat Med, 2003, Apr;9(4):367-9; Ciceri et al., Lancet Oncol, 2009, May;10(5):489-500). Экстраклеточная часть LNGFR состоит из 4 богатых цистеином районов TNFR и богатой серином/треонином ножки (фиг. 1В). Прежде всего, авторы настоящего изобретения создали две конструкции CD44v6-CAR.28z: одну со спейсером в виде всей экстраклеточной части LNGFR (LNGFR дикого типа длинным или NWL), а другую только с 4 богатыми цистеином районами TNFR (LNGFR дикого типа короткий или NWS). Для исключения возможности антиген-независимой активации конструкции со спейсером на основе LNGFR с помощью природного лиганда NGF, авторы настоящего изобретения создали две дополнительные конструкции CD44v6-CAR.28z, несущие делецию четвертого богатого цистеином домена TNFR, который, как известно, аннулирует передачу сигнала от NGF (Yan et al., J Biol Chem, 1991, Jun 25; 266(18):12099-104), создавая мутированную по LNGFR длинную изоформу или NML и мутированную по LNGFR короткую изоформу или NMS, соответственно. В качестве контроля, авторы настоящего изобретения создали также конструкцию CD44v6-CAR.28z, включающую мутированный вариант первоначального спейсера CH2CH3 (CHM), который не способен распознавать FcγRI (Hombach et al. Gene Ther 2000, Jun;7(12):1067-75). Примечательно, что как FcγRII, так и FcγRIII могут использовать остатки помимо этого общего набора, что позволяет предположить, что эта мутация не полностью аннулирует связывание (Shields et al. J Biol Chem, 2001, Mar 2;276(9):6591-604. Armour et al. Mol Immunol, 2003, Dec; 40(9):585-93).

Пример 3 - Конструкции CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR могут быть использованы для отбора и отслеживания трансдуцированных Т-клеток

Различные конструкции CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR были клонированы в ретровирусные векторы (RV) для трансдукции первичных Т-клеток. Для трансдукции, Т-клетки активировали с использованием CD3/CD28-сфер плюс IL-7/IL-15, в соответствии с протоколом, который лучше сохраняет их функциональный фенотип (Kaneko et al. Blood, 2009, Jan 29;113(5):1006-15. Bondanza et al. Blood 2011, Jun 16;117(24):6469-78. Cieri et al. Blood, 2013, Jan 24;121(4):573-84). После трансдукции, все конструкции могли быть идентифицированы на поверхности Т-клеток, используя направленное против LNGFR мАт C40-1457 (фиг. 2А), что указывало на то, что они правильно процессировались, закреплялись на клеточной мембране и, самое главное, распознавались направленными против NGFR мАт. Как следствие, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетки могли быть отсортированы с использованием иммуномагнитных сфер (фиг. 2В). При ближайшем рассмотрении, авторы настоящего изобретения обнаружили, что только изоформа со спейсером NWL связывалась с другим направленным против LNGFR мАт, ME20.4, что позволяет предположить, что конформационные изменения, определяемые спейсерами на основе LNGFR различных длин, могут контролировать доступность эпитопа для ME20.4. Важно отметить, что кинетика увеличения количества экспрессирующих конструкции с различными спейсерами на основе LNGFR клеток была схожа с таковой экспресссирующих CD44v6-CAR.28z со срейсером СН2СН3 Т-клеток (фиг. 2В), что исключает потенциальное пролиферативное преимущество, вызванное экстраклеточными последовательностями LNGFR, установленными в CAR. В конце культивирования получаемая в результате популяция была обогащена в отношении рано дифференцированных Т-клеток (фиг. 2С), что указывает на отсутствие нарушения пути функциональной дифференцировки активированных с помощью сфер Т-клеток в присутствии IL-7/IL-15.

Пример 4 - Экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки сохраняют CD44v6-специфическое распознавание, потеряв при этом неспецифическое распознавание, опосредованное взаимодействием с FcγR.

Для проверки сохранения CD44v6-специфического распознавания после замены первоначального спейсера CH2CH3 спейсерами на основе LNGFR, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки были исследованы в экспериментах сокультивирования с CD44v6-экспрессирующими опухолевыми клетками. Подобно экспрессирующим CD44v6-CAR.28z со спейсером CH2CH3 Т-клеткам, экспресссирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки эффективно устраняли CD44v6+ (линии клеток MM1S и ТНР-1), но не CD44v6- (линии клеток BV173) опухолевые клетки (фиг. 3А). Кроме того, CD44v6-специфическое распознавание было связано с сильным увеличением количества Т-клеток (фиг. 3B), что означает полное сохранение терапевтического потенциала экспрессирующих CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клеток. Следовательно, в результате получается, что CAR со спейсерами на основе LNGFR в соответствии с настоящим изобретением являются эффективными против опухолевых моделей, экспрессирующих специфический антиген, на который они нацелены.

Чтобы продемонстрировать отсутствие неспецифического распознавания, опосредованного взаимодействием с FcRγ, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки сокультивировали с CD44v6+/FcγRs+ лейкозными клетками Thp1 или с CD44v6-/FcγRs+ лейкозными клетками HL-60. В этой системе, в то время как экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсером СН2СН3 Т-клетки устраняли как CD44v6+ клетки Thp1, так и CD44v6- клетки HL-60, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z CAR со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки специфически устраняли CD44v6+ клетки ТНР-1, но не CD44v6- клетки HL-60 (фиг.4А). Соответственно, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z CAR со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки пролиферировали в ответ на CD44v6+ клетки ТНР-1, но не на CD44v6- клетки HL-60 (фиг. 4В). В обеих системах, поведение экспрессирующих конструкций со спейсерами на основе LNGFR клеток перекрывалось с таковым экспрессирующих CD44v6-CAR.28z CAR с мутированным спейсером CH2CH3 Т-клеток, демонстрируя отмену FcγR-опосредованных эффектов.

Следовательно, из-за отсутствия Fc-домена, в состав которого входят шарнирная область-СН2-СН3 константной области иммуноглобулина IgG, в качестве спейсера, CAR, содержащие происходящий от LNGFR спейсер в соответствии с настоящим изобретением, не связываются с Fc-гамма-рецепторами для IgG, что, таким образом, позволяет избежать активации нежелательной и потенциально токсичной нецелевой иммунной реакции. Соответственно, CAR со спейсерами на основе LNGFR являются более безопасными, чем те, которые содержат шарнирную область-СН2-СН3 IgG.

И, наконец, чтобы исключить антиген-независимую стимуляцию с помощью растворимого NGF, экспресссирующие CD44v6-CAR28.z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки культивировали in vitro с NGF. Даже при сверхфизиологических концентрациях NGF, которые, как известно, подталкивает дифференциацию линии LNGFR-экспрессирующих нервных клеток РС12 (фиг. 5А), экспрессирующие CD44v6-CAR.28z CAR со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки не были стимулированы к пролиферации (фиг. 5В), что указывает на отсутствие передачи сигнала с помощью растворимого NGF.

Пример 5 - Экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки лучше сохраняются in vivo и опосредуют превосходные противоопухолевые эффекты

После демонстрации эффективного и специфического распознавания in vitro, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки испытывали на противоопухолевую активность in vivo, сначала в модели минимальной остаточной болезни, а затем в модели устойчивого заболевания (WED). В первой модели, мышей NSG подвергали инфузии лейкозных клеток ТНР-1 и через три дня подвергали лечению экспрессирующими CD44v6-CAR.28z со спейсером СН2СН3 или различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетками. Экспрессирующие CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетки лучше размножались (фиг. 6А) и сохранялись (фиг. 6В), чем экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсером СН2СН3 Т-клетки. Соответственно, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки, по-видимому, опосредует более сильные противоопухолевые эффекты, на что указывала лучшая нормализация веса печени с инфильтратом клеток Thp1 по сравнению с мышами, которым осуществлена инфузия экспрессирующих CD44v6-CAR.28z со спейсером CH2CH3 Т-клеток (фиг. 6В). Во второй модели устойчивого заболевания, мышей NSG подвергали инфузии CD44v6-экспрессирующих миеломных клеток ММ1.S, а через 5 недель, когда опухоль уже колонизировала костный мозг, подвергали лечению экспрессирующими CD44v6-CAR.28z со спейсером СН2СН3 или различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетками. Экспрессирующие CD44v6-CAR.28z Т-клетки, несущие изоформу NML, не были включены. В этой более точной модели, в то время как экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсером СН2СН3 Т-клетки едва приживлялись и не опосредовали какой-либо значительный противоопухолевый эффект, экспрессирующие CD44v6-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR Т-клетки размножались (Фиг. 7А), сохранялись и приводили к поразительный противоопухолевой активности (фиг. 7В).

Способность экспрессирующих CD44v6-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клеток опосредовать превосходную противоопухолевую активность была в дальнейшем подтверждена с использованием модели устойчивой миеломы с использованием CD44v6+ клеток ММ1.S, экспрессирующих секретируемую люциферазу. Наличие этой люциферазы позволяет контролировать изо дня в день количество циркулирующих опухолевых клеток ММ1.S у мышей, подвергнутых лечению экспрессирующими CD44v6-CAR.28z со спейсером CH2CH3 (v6 CHW) или со спейсером NMS LNGFR (v6 NMS) Т-клетками. В этой сложной модели, в то время как экспрессирующие CD44v6-CAR.28z со спейсером CH2CH3 Т-клетки продемонстрировали одинаковую противоопухолевую активность с экспрессирующими неродственный CAR Т-клетками (CTR), экспрессирующие CD44v6- CAR.28z со спейсером NMS Т-клетки способны держать под контролем количество циркулирующих опухолевых клеток вплоть до 21 дней (фиг. 7BIS A) и значительно увеличивать общую выживаемость (фиг. 7BIS B).

Пример 6 - Методы

Создание конструкций CD19-CAR.28z и CEA-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR

Стратегию, аналогичную той, которая описана в примере 1, использовали для создания CD19-специфических и СЕА-специфических конструкций CAR (фиг. 22). Были созданы следующие конструкции:

CD19-CAR.28z: содержащая CD19-специфический таргетирующий домен, цепь CD3ζ в сочетании с эндокостимулирующим доменом CD28 и спейсером CH2CH3 IgG1 дикого типа (CH2CH3)

NWL: CD19-CAR.28z, содержащая длинный спейсер на основе LNGFR дикого типа (включающий 4-TNFR-Cys домена и ножку)

NMS: CD19-CAR.28z, содержащая мутированный короткий спейсер на основе LNGFR (в том числе 4-TNFR-Cys домена с делецией в четвертом домене)

CEA-CAR.28z: содержащая СЕА-специфический, таргетирующий домен, цепь CD3ζ в сочетании с эндокостимулирующим доменом CD28 и спейсером CH2CH3 IgG1 дикого типа (CH2CH3)

NWL: CEA-CAR.28z, содержащая длинный спейсер на основе LNGFR дикого типа (включающий 4-TNFR-Cys домена и ножку)

NMS: СЕА-CAR.28z, содержащая мутированный короткий спейсер на основе LNGFR (включающий 4-TNFR-Cys домена с делецией в четвертом домене)

Трансдукция и условия культивирования

Т-клетки активировали с использованием CD3/CD28-сфер клеточного размера (ClinExVivo, Invitrogen) плюс IL-7/IL-15 (5 нг/мл, Peprotech) и RV-трансдуцировали путем двух циклов центрифужной инокуляции в день 2 и 3 после стимуляции. В день 6, сферы удаляли, и Т-клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco-BRL), 10% FBS (BioWhittaker) в присутствии IL-7 и IL-15. Поверхностная экспрессия CD19- и СЕА-специфических конструкций CAR со спейсером CH2CH3 (CHW) была обнаружена с помощью мАт, специфических для спейсера CH2CH3 IgG1 (Jackson Laboratories), в то время как поверхностную экспрессию конструкций CAR со спейсерами на основе LNGFR (NWL и NWS) анализировали с использованием LNGFR-специфических мАт от BD Bioscience (клон: C40-14579). Между днем 9 и днем 15 с момента активации, экспрессирующие CAR.28z со спейсером CH2CH3 Т-клетки были FACS-отсортированы, используя поликлональные, специфические для CH2CH3 IgG1 мАт, в то время как экспрессирующие CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки окрашивали РЕ-конъюгированным, LNGFR-специфическим мАт C40-14579 и сортировали с помощью колонок, используя анти-PE парамагнитные сферы (Miltenyi).

In vitro анализы для анализа специфического распознавания

В анализах сокультивирования, CAR-отсортированные Т-клетки культивировали с клетками-мишенями в соотношении Е:Т=1:10. Спустя 4 дня выжившие клетки подсчитывали и анализировали с помощью FACS. Индекс элиминации рассчитывали следующим образом: 1-(количество остаточных клеток-мишеней в присутствии CD44v6- 4GS2.CAR28z+ Т-клеток, CD19.CAR28z+ Т-клеток и CEA.CAR28z+ Т-клеток)/(число оставшихся клеток-мишеней в присутствии CD19.CAR28z+ Т-клеток). Супернатант от сокультур собирали через 24 часа инкубации и анализировали на продукцию цитокинов (IFNγ, IL-2 и TNFα) с помощью анализа CBA (BD BioLegend).

Модели противоопухолевой эффективности с использованием ксенотрансплантата

Для модели минимальной остаточной болезни, мышам NSG (Jackson) внутривенно вводили путем инфузии 1,5×10⁶ лейкозных клеток ALL-CM/мышь. Через три дня мышей подвергали лечению путем внутривенного введения 5×10⁶ отсортированных, экспрессирующих CD19-CAR.28z или CD44v6-4GS2.CAR.28 со спейсерами на основе LNGFR (NWL, NMS). Приживление Т-клеток контролировали еженедельно с помощью кровопускания и анализа FACS. Через 7 недель, мышей умерщвляли, и их костный мозг (ВМ) анализировали с помощью FACS на наличие клеток ALL-CM с использованием направленных против hCD45 и hCD19 мАт.

Пример 7 - Конструкции CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR могут быть использованы для отбора и отслеживания трансдуцированных Т-клеток

Конструкции CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR были клонированы в ретровирусные векторы (RV) для трансдукции первичных Т-клеток. Для трансдукции, Т-клетки активировали с использованием CD3/CD28-сфер плюс IL-7/IL-15, в соответствии с протоколом, который лучше сохраняет их функциональный фенотип (Kaneko et al. Blood, 2009, Jan 29;113(5):1006-15. Bondanza et al. Blood 2011, Jun 16;117(24):6469-78. Cieri et al. Blood, 2013, Jan 24;121(4):573-84). После трансдукции, Т-клетки можно было отсортировать с помощью иммуномагнитных сфер (фиг. 23), что указывает на то, что, как это показано для CAR, мишенью которых является антиген CD44v6, происходящие от LNGFR спейсеры правильно процессировались и закреплялись на клеточной мембране также в контексте двух других CAR, специфических для антигенов CD19 и CEA.

Пример 8 - Экспрессирующие CD19-CAR.28z, СЕА-CAR.28z и CD44v6-4GS2.CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки сохраняют антигенспецифическое распознавание, потеряв при этом неспецифическое распознавание, опосредованное взаимодействием с FcγR.

Для проверки сохранения CD19- и СЕА-специфического распознавания после замены первоначального спейсера CH2CH3 спейсерами на основе LNGFR, экспрессирующие CD19-CAR.28z и СЕА-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки были исследованы в экспериментах сокультивирования с антигенэкспрессирующими опухолевыми клетками. Подобно экспрессирующим конструкцию со спейсером CH2CH3 Т-клеткам, экспресссирующие CD19-CAR.28z, СЕА-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки эффективно устраняли CD19+, CEA+ и CD44v6+ опухолевые клетки, соответственно, сберегая негативные по антигену опухолевые клетки (фиг. 24А). В частности, экспрессирующие CD19-CAR.28z CAR со спейсером на основе LNGFR Т-клетки специфически устраняли CD19+ клетки ALL-CM и BV-173, но не CD19- клетки HL-60 и BXPC3 (фиг. 24А). Точно так же, экспресссирующие CEA-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки специфически устраняли СЕА+ клетки BXPC3, но не CEA- клетки HL-60, ALL-CM и BV-173 (фиг. 24A), а экспрессирующие CD44v6-4GS2.CAR.28z Т-клетки специфически устраняли CD44v6+ клетки BXPC3 клетки, но не CD44v6- клетки ALL-СМ, BV173 и HL-60 (фиг. 24А). Сравнимые результаты были получены при оценке антигенспецифического высвобождения цитокинов (IFNγ, IL-2 и TNFα) (фиг. 24В).

CAR, содержащие LNGFR в качестве спейсера в соответствии с настоящим изобретением, как получается в результате, сохраняют специфичность и противоопухолевый эффект с различными антигенспецифическими таргетирующими доменами.

Чтобы продемонстрировать отсутствие неспецифического распознавания, опосредованного взаимодействием с FcRγ, экспрессирующие CD19-CAR.28z, CEA-CAR.28z CD44v6-4GS2.CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки сокультивировали с FcγRs+ CD19- CEA- клетками HL-60. В этой системе только экспрессирующие CD19-CAR.28z и СЕА-CAR.28z со спейсером СН2СН3 Т-клетки способны устранять клетки HL-60-мишени, тем самым подтверждая, что использование спейсера на основе LNGFR позволяет избежать активации нежелательного врожденного иммунного ответа.

Пример 12 - Экспрессирующие CD19-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки опосредуют противоопухолевые эффекты in vivo

После демонстрации эффективного и специфического распознавания in vitro, экспрессирующие CD19-CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR Т-клетки испытывали на противоопухолевую активность in vivo, в модели минимальной остаточной болезни. Мышей NSG подвергали инфузии лейкозных клеток ALL-CM и через три дня подвергали лечению экспрессирующими CD19-CAR.28z с различными спейсерами на основе LNGFR (NWL и NMS) Т-клетками. В этом случае, экспрессирующие CD44v6-4GS2.CAR.28z со спейсерами на основе LNGFR (NWL и NMS) Т-клетки были использованы в качестве отрицательного контроля, поскольку лейкозные клетки ALL-CM не экспрессируют антиген CD44v6 (фиг. 25). Экспрессирующие CD19-CAR.28z с обоими спейсерами на основе LNGFR Т-клетки, по-видимому, опосредует противоопухолевые эффекты, на что указывала более низкая концентрация клеток ALL-CM, инфильтрующих костный мозг, по сравнению с мышами, которым осуществлена инфузия экспрессирующих CD44v6-CAR.28z Т-клеток (фиг. 25).

Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены сюда посредством ссылки. Различные модификации и вариации описанных CAR, полинуклеотидов, векторов, клеток и композиций настоящего изобретения будут очевидны квалифицированным специалистам в данной области техники, не выходя за рамки объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно быть чрезмерно ограничено такими конкретными вариантами осуществления. В самом деле, различные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, которые очевидны специалистам в области биохимии и биотехнологии или в смежных областях, как предполагается, находятся в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> MOLMED SpA

<120> Химерные рецепторы антигенов

<130> P105739PCT

<150> EP 14184838.2

<151> 2014-09-15

<160> 40

<170> Патент в версии 3.5

<210> 1

<211> 222

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер LNGFR дикого типа длинный (NWL)

<400> 1

Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys

1 5 10 15

Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn

20 25 30

Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val

35 40 45

Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu

50 55 60

Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg

65 70 75 80

Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala

85 90 95

Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp

100 105 110

Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp

115 120 125

Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp

130 135 140

Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys

145 150 155 160

Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly

165 170 175

Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu

180 185 190

Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met

195 200 205

Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn

210 215 220

keacptglyt hsgecckacn lgegvaqpcg anqtvcepcl dsvtfsdvvs atepckpcte

cvglqsmsap cveaddavcr caygyyqdet tgrceacrvc eagsglvfsc qdkqntvcee

cpdgtysdea nhvdpclpct vcedterqlr ectrwadaec eeipgrwitr stppegsdst

apstqepeap peqdliastv agvvttvmgs sqpvvtrgtt dn

<210> 2

<211> 666

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер LNGFR дикого типа длинный (NWL)

<400> 2

aaagaggcct gccccaccgg cctgtacacc cacagcggag agtgctgcaa ggcctgcaac 60

ctgggagagg gcgtggccca gccttgcggc gccaatcaga ccgtgtgcga gccctgcctg 120

gacagcgtga ccttcagcga cgtggtgtcc gccaccgagc cctgcaagcc ttgcaccgag 180

tgtgtgggcc tgcagagcat gagcgccccc tgcgtggaag ccgacgacgc cgtgtgtaga 240

tgcgcctacg gctactacca ggacgagaca accggcagat gcgaggcctg tagagtgtgc 300

gaggccggca gcggcctggt gttcagttgt caagacaagc agaataccgt gtgtgaagag 360

tgccccgacg gcacctacag cgacgaggcc aaccacgtgg acccctgcct gccctgcact 420

gtgtgcgagg acaccgagcg gcagctgcgc gagtgcacaa gatgggccga cgccgagtgc 480

gaagagatcc ccggcagatg gatcaccaga agcacccccc ctgagggcag cgacagcacc 540

gcccctagca cccaggaacc tgaggcccct cccgagcagg acctgatcgc ctctacagtg 600

gccggcgtgg tgacaaccgt gatgggcagc tctcagcccg tggtgacacg gggcaccacc 660

gacaat 666

<210> 3

<211> 162

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер LNGFR дикого типа короткий (NWS)

<400> 3

Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys

1 5 10 15

Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn

20 25 30

Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val

35 40 45

Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu

50 55 60

Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg

65 70 75 80

Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala

85 90 95

Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp

100 105 110

Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp

115 120 125

Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp

130 135 140

Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys

145 150 155 160

Glu Glu

keacptglyt hsgecckacn lgegvaqpcg anqtvcepcl dsvtfsdvvs atepckpcte

cvglqsmsap cveaddavcr caygyyqdet tgrceacrvc eagsglvfsc qdkqntvcee

cpdgtysdea nhvdpclpct vcedterqlr ectrwadaec ee

<210> 4

<211> 486

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер LNGFR дикого типа корткий (NWS)

<400> 4

aaagaggcct gccccaccgg cctgtacacc cacagcggag agtgctgcaa ggcctgcaac 60

ctgggagagg gcgtggccca gccttgcggc gccaatcaga ccgtgtgcga gccctgcctg 120

gacagcgtga ccttcagcga cgtggtgtcc gccaccgagc cctgcaagcc ttgcaccgag 180

tgtgtgggcc tgcagagcat gagcgccccc tgcgtggaag ccgacgacgc cgtgtgtaga 240

tgcgcctacg gctactacca ggacgagaca accggcagat gcgaggcctg tagagtgtgc 300

gaggccggca gcggcctggt gttcagttgt caggacaagc agaacaccgt gtgtgaagag 360

tgccccgacg gcacctacag cgacgaggcc aaccacgtgg acccctgcct gccctgcact 420

gtgtgcgagg acaccgagcg gcagctgcgc gagtgcacaa gatgggccga cgccgagtgc 480

gaggaa 486

<210> 5

<211> 200

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер LNGFR мутированный длинный (NML)

<400> 5

Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys

1 5 10 15

Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn

20 25 30

Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val

35 40 45

Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu

50 55 60

Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg

65 70 75 80

Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala

85 90 95

Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp

100 105 110

Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp

115 120 125

Glu Ala Ala Arg Ala Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg

130 135 140

Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro

145 150 155 160

Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser

165 170 175

Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln Pro Val

180 185 190

Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn

195 200

keacptglyt hsgecckacn lgegvaqpcg anqtvcepcl dsvtfsdvvs atepckpcte

cvglqsmsap cveaddavcr caygyyqdet tgrceacrvc eagsglvfsc qdkqntvcee

cpdgtysdea araadaecee ipgrwitrst ppegsdstap stqepeappe qdliastvag

vvttvmgssq pvvtrgttdn

<210> 6

<211> 600

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер LNGFR мутированный длинный (NML)

<400> 6

aaagaggcct gccccaccgg cctgtacacc cacagcggag agtgctgcaa ggcctgcaac 60

ctgggagagg gcgtggccca gccttgcggc gccaatcaga ccgtgtgcga gccctgcctg 120

gacagcgtga ccttcagcga cgtggtgtcc gccaccgagc cctgcaagcc ttgcaccgag 180

tgtgtgggcc tgcagagcat gagcgccccc tgcgtggaag ccgacgacgc cgtgtgtaga 240

tgcgcctacg gctactacca ggacgagaca accggcagat gcgaggcctg tagagtgtgc 300

gaggccggca gcggcctggt gttcagttgt caagacaagc agaataccgt gtgtgaagag 360

tgccccgacg gcacctacag cgacgaagcc gccagagccg ccgacgccga gtgcgaagag 420

atccccggca gatggatcac cagaagcacc ccccctgagg gcagcgacag caccgcccct 480

agcacccagg aacctgaggc ccctcccgag caggacctga tcgcctctac agtggccggc 540

gtggtgacaa ccgtgatggg cagctctcag cccgtggtga cacggggcac caccgacaat 600

<210> 7

<211> 140

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер LNGFR мутированный короткий (NMS)

<400> 7

Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys

1 5 10 15

Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn

20 25 30

Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val

35 40 45

Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu

50 55 60

Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg

65 70 75 80

Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala

85 90 95

Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp

100 105 110

Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp

115 120 125

Glu Ala Ala Arg Ala Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu

130 135 140

keacptglyt hsgecckacn lgegvaqpcg anqtvcepcl dsvtfsdvvs atepckpcte

cvglqsmsap cveaddavcr caygyyqdet tgrceacrvc eagsglvfsc qdkqntvcee

cpdgtysdea araadaecee

<210> 8

<211> 420

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер LNGFR мутированный короткий (NMS)

<400> 8

aaagaggcct gccccaccgg cctgtacacc cacagcggag agtgctgcaa ggcctgcaac 60

ctgggagagg gcgtggccca gccttgcggc gccaatcaga ccgtgtgcga gccctgcctg 120

gacagcgtga ccttcagcga cgtggtgtcc gccaccgagc cctgcaagcc ttgcaccgag 180

tgtgtgggcc tgcagagcat gagcgccccc tgcgtggaag ccgacgacgc cgtgtgtaga 240

tgcgcctacg gctactacca ggacgagaca accggcagat gcgaggcctg tagagtgtgc 300

gaggccggca gcggcctggt gttcagttgt caggacaagc agaacaccgt gtgtgaagag 360

tgccccgacg gcacctacag cgacgaggcc gcccgggccg ccgacgccga gtgcgaggaa 420

<210> 9

<211> 34

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 9

Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala

1 5 10 15

Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr

20 25 30

Val Cys

<210> 10

<211> 42

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 10

Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu

1 5 10 15

Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala

20 25 30

Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys

35 40

<210> 11

<211> 39

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 11

Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu

1 5 10 15

Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln

20 25 30

Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys

35

<210> 12

<211> 41

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 12

Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro

1 5 10 15

Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu

20 25 30

Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys

35 40

<210> 13

<211> 25

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 13

Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu

1 5 10 15

Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp

20 25

<210> 14

<211> 427

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 14

Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys

20 25 30

Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn

35 40 45

Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys

50 55 60

Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr

65 70 75 80

Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser

85 90 95

Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly

100 105 110

Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys

115 120 125

Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr

130 135 140

Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His

145 150 155 160

Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln

165 170 175

Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro

180 185 190

Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr

195 200 205

Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile

210 215 220

Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln

225 230 235 240

Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys

245 250 255

Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe

260 265 270

Lys Arg Trp Asn Ser Cys Lys Gln Asn Lys Gln Gly Ala Asn Ser Arg

275 280 285

Pro Val Asn Gln Thr Pro Pro Pro Glu Gly Glu Lys Leu His Ser Asp

290 295 300

Ser Gly Ile Ser Val Asp Ser Gln Ser Leu His Asp Gln Gln Pro His

305 310 315 320

Thr Gln Thr Ala Ser Gly Gln Ala Leu Lys Gly Asp Gly Gly Leu Tyr

325 330 335

Ser Ser Leu Pro Pro Ala Lys Arg Glu Glu Val Glu Lys Leu Leu Asn

340 345 350

Gly Ser Ala Gly Asp Thr Trp Arg His Leu Ala Gly Glu Leu Gly Tyr

355 360 365

Gln Pro Glu His Ile Asp Ser Phe Thr His Glu Ala Cys Pro Val Arg

370 375 380

Ala Leu Leu Ala Ser Trp Ala Thr Gln Asp Ser Ala Thr Leu Asp Ala

385 390 395 400

Leu Leu Ala Ala Leu Arg Arg Ile Gln Arg Ala Asp Leu Val Glu Ser

405 410 415

Leu Cys Ser Glu Ser Thr Ala Thr Ser Pro Val

420 425

<210> 15

<211> 2046

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность конструкции CD44v6-специфического CAR второго поколения, CD44v6-CAR.28z

<400> 15

atggaagccc ctgcccagct gctgttcctg ctgctgctgt ggctgcccga caccaccggc 60

gagatcgtgc tgacacagag ccccgccacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 120

ctgagctgta gcgccagcag cagcatcaac tacatctact ggctgcagca gaagcccggc 180

caggccccca gaatcctgat ctacctgacc agcaacctgg ccagcggcgt gcccgccaga 240

ttttctggca gcggcagcgg caccgacttc accctgacca tcagcagcct ggaacccgag 300

gacttcgccg tgtactactg cctgcagtgg tccagcaacc ccctgacctt cggcggaggc 360

accaaggtgg aaatcaagcg gggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tggcggcggc 420

ggctccggtg gtggtggatc tgaggtgcag ctggtggaaa gcggcggagg cctggtcaag 480

cctggcggca gcctgagact gagctgtgcc gccagcggct tcaccttcag cagctacgac 540

atgagctggg tccgacaggc tccaggcaag ggactggaat gggtgtccac catcagcagc 600

ggcggcagct acacctacta cctggacagc atcaagggcc ggttcaccat cagccgggac 660

aacgccaaga acagcctgta cctgcagatg aacagcctgc gggccgagga caccgccgtc 720

tactactgtg cccggcaggg cctcgactac tggggcagag gcaccctggt caccgtgtcc 780

agcggggatc ccgccgagcc caaatctcct gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 840

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 900

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 960

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1140

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1200

ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcaacc ggagaacaac 1320

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1380

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa aaaagatccc 1500

aaattttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 1560

gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 1620

atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 1680

ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 1740

gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1800

tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 1860

aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1920

agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1980

ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 2040

cgctaa 2046

<210> 16

<211> 681

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Белок CD44v6-CAR.28z

<400> 16

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu

195 200 205

Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys

260 265 270

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

275 280 285

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

290 295 300

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

305 310 315 320

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

325 330 335

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

340 345 350

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

355 360 365

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

370 375 380

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

385 390 395 400

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

405 410 415

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

420 425 430

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

435 440 445

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

450 455 460

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

465 470 475 480

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

485 490 495

Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

500 505 510

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

515 520 525

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

530 535 540

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

545 550 555 560

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

565 570 575

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

580 585 590

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

595 600 605

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

610 615 620

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

625 630 635 640

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

645 650 655

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

660 665 670

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675 680

<210> 17

<211> 261

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-специфический одноцепочечный фрагмент

<400> 17

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu

195 200 205

Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser

260

<210> 18

<211> 68

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 18

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser

65

<210> 19

<211> 222

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 19

Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys

1 5 10 15

Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn

20 25 30

Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val

35 40 45

Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu

50 55 60

Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg

65 70 75 80

Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala

85 90 95

Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp

100 105 110

Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp

115 120 125

Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp

130 135 140

Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys

145 150 155 160

Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly

165 170 175

Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu

180 185 190

Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met

195 200 205

Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn

210 215 220

<210> 20

<211> 113

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 20

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 21

<211> 669

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-CAR28z со спейсером LNGFR дикого типа длинным (NWL)

<400> 21

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu

195 200 205

Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu

260 265 270

Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly

275 280 285

Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu

290 295 300

Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys

305 310 315 320

Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val

325 330 335

Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp

340 345 350

Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser

355 360 365

Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu

370 375 380

Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys

385 390 395 400

Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys

405 410 415

Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile

420 425 430

Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr

435 440 445

Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val

450 455 460

Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr

465 470 475 480

Arg Gly Thr Thr Asp Asn Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

485 490 495

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

500 505 510

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

515 520 525

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

530 535 540

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe

545 550 555 560

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

565 570 575

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

580 585 590

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg

595 600 605

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

610 615 620

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

625 630 635 640

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

645 650 655

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

660 665

<210> 22

<211> 609

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-CAR28z со спейсером LNGFR дикого типа коротким (NWS)

<400> 22

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu

195 200 205

Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu

260 265 270

Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly

275 280 285

Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu

290 295 300

Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys

305 310 315 320

Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val

325 330 335

Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp

340 345 350

Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser

355 360 365

Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu

370 375 380

Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys

385 390 395 400

Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys

405 410 415

Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Pro Lys Phe Trp Val Leu

420 425 430

Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val

435 440 445

Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His

450 455 460

Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys

465 470 475 480

His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

485 490 495

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

500 505 510

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

515 520 525

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

530 535 540

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

545 550 555 560

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

565 570 575

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

580 585 590

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

595 600 605

Arg

<210> 23

<211> 647

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-CAR28z со спейсером LNGFR мутированным длинным (NML)

<400> 23

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu

195 200 205

Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu

260 265 270

Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly

275 280 285

Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu

290 295 300

Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys

305 310 315 320

Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val

325 330 335

Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp

340 345 350

Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser

355 360 365

Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu

370 375 380

Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Ala Arg Ala Ala Asp Ala

385 390 395 400

Glu Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro

405 410 415

Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro

420 425 430

Pro Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr

435 440 445

Val Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn

450 455 460

Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

465 470 475 480

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

485 490 495

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

500 505 510

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

515 520 525

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

530 535 540

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

545 550 555 560

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

565 570 575

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

580 585 590

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

595 600 605

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

610 615 620

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

625 630 635 640

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

645

<210> 24

<211> 587

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-CAR28z со спейсером LNGFR мутированным коротким (NMS)

<400> 24

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu

195 200 205

Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu

260 265 270

Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly

275 280 285

Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu

290 295 300

Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys

305 310 315 320

Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val

325 330 335

Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp

340 345 350

Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser

355 360 365

Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu

370 375 380

Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Ala Arg Ala Ala Asp Ala

385 390 395 400

Glu Cys Glu Glu Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

405 410 415

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

420 425 430

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

435 440 445

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

450 455 460

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg

465 470 475 480

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

485 490 495

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

500 505 510

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn

515 520 525

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

530 535 540

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

545 550 555 560

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

565 570 575

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

580 585

<210> 25

<211> 668

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-CAR28z со спейсером LNGFR дикого типа длинным (NWL)

<400> 25

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu

195 200 205

Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu

260 265 270

Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly

275 280 285

Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu

290 295 300

Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys

305 310 315 320

Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val

325 330 335

Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp

340 345 350

Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser

355 360 365

Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu

370 375 380

Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys

385 390 395 400

Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys

405 410 415

Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile

420 425 430

Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr

435 440 445

Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val

450 455 460

Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr

465 470 475 480

Arg Gly Thr Thr Asp Asn Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

485 490 495

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

500 505 510

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

515 520 525

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

530 535 540

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe

545 550 555 560

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

565 570 575

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

580 585 590

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

595 600 605

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

610 615 620

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

625 630 635 640

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

645 650 655

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

660 665

<210> 26

<211> 608

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-CAR28z со спейсером LNGFR дикого типа коротким (NWS)

<400> 26

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu

195 200 205

Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu

260 265 270

Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly

275 280 285

Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu

290 295 300

Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys

305 310 315 320

Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val

325 330 335

Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp

340 345 350

Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser

355 360 365

Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu

370 375 380

Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys

385 390 395 400

Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys

405 410 415

Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Pro Lys Phe Trp Val Leu

420 425 430

Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val

435 440 445

Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His

450 455 460

Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys

465 470 475 480

His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

485 490 495

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

500 505 510

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

515 520 525

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

530 535 540

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

545 550 555 560

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

565 570 575

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

580 585 590

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

595 600 605

<210> 27

<211> 646

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-CAR28z со спейсером LNGFR мутированным длинным (NWL)

<400> 27

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu

195 200 205

Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu

260 265 270

Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly

275 280 285

Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu

290 295 300

Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys

305 310 315 320

Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val

325 330 335

Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp

340 345 350

Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser

355 360 365

Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu

370 375 380

Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Ala Arg Ala Ala Asp Ala

385 390 395 400

Glu Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro

405 410 415

Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro

420 425 430

Pro Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr

435 440 445

Val Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn

450 455 460

Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

465 470 475 480

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

485 490 495

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

500 505 510

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

515 520 525

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

530 535 540

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

545 550 555 560

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

565 570 575

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

580 585 590

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

595 600 605

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

610 615 620

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

625 630 635 640

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

645

<210> 28

<211> 586

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-CAR28z со спейсером LNGFR мутированным коротким (NWL)

<400> 28

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu

195 200 205

Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu

260 265 270

Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly

275 280 285

Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu

290 295 300

Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys

305 310 315 320

Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val

325 330 335

Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp

340 345 350

Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser

355 360 365

Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu

370 375 380

Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Ala Arg Ala Ala Asp Ala

385 390 395 400

Glu Cys Glu Glu Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

405 410 415

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

420 425 430

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

435 440 445

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

450 455 460

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg

465 470 475 480

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

485 490 495

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

500 505 510

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

515 520 525

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

530 535 540

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

545 550 555 560

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

565 570 575

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

580 585

<210> 29

<211> 27

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 29

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 30

<211> 41

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 30

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 31

<211> 251

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-4GS2, CD44v6-специфический одноцепочечный фрагмент

<400> 31

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly

180 185 190

Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

210 215 220

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr

225 230 235 240

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 32

<211> 658

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-4GS2-CAR28z со спейсером LNGFR дикого типа длинным (NWL)

<400> 32

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly

180 185 190

Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

210 215 220

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr

225 230 235 240

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu

245 250 255

Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala

260 265 270

Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr

275 280 285

Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser

290 295 300

Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser

305 310 315 320

Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala

325 330 335

Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg

340 345 350

Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln

355 360 365

Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala

370 375 380

Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu

385 390 395 400

Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu

405 410 415

Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp

420 425 430

Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp

435 440 445

Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser

450 455 460

Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Pro Lys Phe Trp

465 470 475 480

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val

485 490 495

Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu

500 505 510

Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr

515 520 525

Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr

530 535 540

Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

545 550 555 560

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

565 570 575

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

580 585 590

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

595 600 605

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

610 615 620

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

625 630 635 640

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

645 650 655

Pro Arg

<210> 33

<211> 598

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-4GS2-CAR28z со спейсером LNGFR дикого типа коротким (NWS)

<400> 33

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly

180 185 190

Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

210 215 220

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr

225 230 235 240

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu

245 250 255

Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala

260 265 270

Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr

275 280 285

Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser

290 295 300

Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser

305 310 315 320

Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala

325 330 335

Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg

340 345 350

Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln

355 360 365

Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala

370 375 380

Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu

385 390 395 400

Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu

405 410 415

Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

420 425 430

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

435 440 445

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

450 455 460

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

465 470 475 480

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

485 490 495

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

500 505 510

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

515 520 525

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

530 535 540

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

545 550 555 560

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

565 570 575

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

580 585 590

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

595

<210> 34

<211> 636

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-4GS2-CAR28z со спейсером LNGFR мутированным длинным(NML)

<400> 34

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly

180 185 190

Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

210 215 220

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr

225 230 235 240

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu

245 250 255

Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala

260 265 270

Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr

275 280 285

Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser

290 295 300

Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser

305 310 315 320

Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala

325 330 335

Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg

340 345 350

Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln

355 360 365

Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala

370 375 380

Ala Arg Ala Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile

385 390 395 400

Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr

405 410 415

Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val

420 425 430

Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr

435 440 445

Arg Gly Thr Thr Asp Asn Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

450 455 460

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

465 470 475 480

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

485 490 495

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

500 505 510

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe

515 520 525

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

530 535 540

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

545 550 555 560

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

565 570 575

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

580 585 590

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

595 600 605

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

610 615 620

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

625 630 635

<210> 35

<211> 576

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-4GS2-CAR28z со спейсером LNGFR мутированным коротким (NMS)

<400> 35

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Asn Tyr Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Ile Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly

180 185 190

Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

210 215 220

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr

225 230 235 240

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Pro Lys Glu

245 250 255

Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala

260 265 270

Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr

275 280 285

Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser

290 295 300

Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser

305 310 315 320

Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala

325 330 335

Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg

340 345 350

Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln

355 360 365

Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala

370 375 380

Ala Arg Ala Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Pro Lys Phe Trp Val Leu

385 390 395 400

Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val

405 410 415

Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His

420 425 430

Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys

435 440 445

His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

450 455 460

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

465 470 475 480

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

485 490 495

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

500 505 510

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

515 520 525

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

530 535 540

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

545 550 555 560

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

565 570 575

<210> 36

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 36

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 37

<211> 8331

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44v6-4GS2-CAR.28Z С NGFR ДИКОГО ТИПА ДЛИННЫМ (V6 NWL)

<400> 37

aagctttgct cttaggagtt tcctaataca tcccaaactc aaatatataa agcatttgac 60

ttgttctatg ccctaggggg cggggggaag ctaagccagc tttttttaac atttaaaatg 120

ttaattccat tttaaatgca cagatgtttt tatttcataa gggtttcaat gtgcatgaat 180

gctgcaatat tcctgttacc aaagctagta taaataaaaa tagataaacg tggaaattac 240

ttagagtttc tgtcattaac gtttccttcc tcagttgaca acataaatgc gctgctgagc 300

aagccagttt gcatctgtca ggatcaattt cccattatgc cagtcatatt aattactagt 360

caattagttg atttttattt ttgacatata catgtgaatg aaagacccca cctgtaggtt 420

tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaaatacat aactgagaat 480

agaaaagttc agatcaaggt caggaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat 540

atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggaa cagctgaata 600

tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga 660

tggtccccag atgcggtcca gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg 720

gtgccccaag gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc 780

tcgcttctgt tcgcgcgctt atgctccccg agctcaataa aagagcccac aacccctcac 840

tcggggcgcc agtcctccga ttgactgagt cgcccgggta cccgtgtatc caataaaccc 900

tcttgcagtt gcatccgact tgtggtctcg ctgttccttg ggagggtctc ctctgagtga 960

ttgactaccc gtcagcgggg gtctttcatt tgggggctcg tccgggatcg ggagacccct 1020

gcccagggac caccgaccca ccaccgggag gtaagctggc cagcaactta tctgtgtctg 1080

tccgattgtc tagtgtctat gactgatttt atgcgcctgc gtcggtacta gttagctaac 1140

tagctctgta tctggcggac ccgtggtgga actgacgagt tcggaacacc cggccgcaac 1200

cctgggagac gtcccaggga cttcgggggc cgtttttgtg gcccgacctg agtcctaaaa 1260

tcccgatcgt ttaggactct ttggtgcacc ccccttagag gagggatatg tggttctggt 1320

aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt cggtttggga 1380

ccgaagccgc gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcatcgtt ctgtgttgtc tctgtctgac 1440

tgtgtttctg tatttgtctg aaaatatggg cccgggctag cctgttacca ctcccttaag 1500

tttgacctta ggtcactgga aagatgtcga gcggatcgct cacaaccagt cggtagatgt 1560

caagaagaga cgttgggtta ccttctgctc tgcagaatgg ccaaccttta acgtcggatg 1620

gccgcgagac ggcaccttta accgagacct catcacccag gttaagatca aggtcttttc 1680

acctggcccg catggacacc cagaccaggt ggggtacatc gtgacctggg aagccttggc 1740

ttttgacccc cctccctggg tcaagccctt tgtacaccct aagcctccgc ctcctcttcc 1800

tccatccgcc ccgtctctcc cccttgaacc tcctcgttcg accccgcctc gatcctccct 1860

ttatccagcc ctcactcctt ctctaggcgc ccccatatgg ccatatgaga tcttatatgg 1920

ggcacccccg ccccttgtaa acttccctga ccctgacatg acaagagtta ctaacagccc 1980

ctctctccaa gctcacttac aggctctcta cttagtccag cacgaagtct ggagacctct 2040

ggcggcagcc taccaagaac aactggaccg accggtggta cctcaccctt accgagtcgg 2100

cgacacagtg tgggtccgcc gacaccagac taagaaccta gaacctcgct ggaaaggacc 2160

ttacacagtc ctgctgacca cccccaccgc cctcaaagta gacggcatcg cagcttggat 2220

acacgccgcc cacgtgaagg ctgccgaccc cgggggtgga ccatcctcta gactgccatg 2280

gaagcccctg cccagctgct gttcctgctg ctgctgtggc tgcccgacac caccggcgag 2340

atcgtgctga cacagagccc cgccaccctg tctctgagcc ctggcgagag agccaccctg 2400

agctgtagcg ccagcagcag catcaactac atctactggc tgcagcagaa gcccggccag 2460

gcccccagaa tcctgatcta cctgaccagc aacctggcca gcggcgtgcc cgccagattt 2520

tctggcagcg gcagcggcac cgacttcacc ctgaccatca gcagcctgga acccgaggac 2580

ttcgccgtgt actactgcct gcagtggtcc agcaaccccc tgaccttcgg cggaggcacc 2640

aaggtggaaa tcaagcgggg tggtggtggt tctggtggtg gtggttctga ggtgcagctg 2700

gtggaaagcg gcggaggcct ggtcaagcct ggcggcagcc tgagactgag ctgtgccgcc 2760

agcggcttca ccttcagcag ctacgacatg agctgggtcc gacaggctcc aggcaaggga 2820

ctggaatggg tgtccaccat cagcagcggc ggcagctaca cctactacct ggacagcatc 2880

aagggccggt tcaccatcag ccgggacaac gccaagaaca gcctgtacct gcagatgaac 2940

agcctgcggg ccgaggacac cgccgtctac tactgtgccc ggcagggcct cgactactgg 3000

ggcagaggca ccctggtcac cgtgtccagc ggggatccca aagaggcctg ccccaccggc 3060

ctgtacaccc acagcggaga gtgctgcaag gcctgcaacc tgggagaggg cgtggcccag 3120

ccttgcggcg ccaatcagac cgtgtgcgag ccctgcctgg acagcgtgac cttcagcgac 3180

gtggtgtccg ccaccgagcc ctgcaagcct tgcaccgagt gtgtgggcct gcagagcatg 3240

agcgccccct gcgtggaagc cgacgacgcc gtgtgtagat gcgcctacgg ctactaccag 3300

gacgagacaa ccggcagatg cgaggcctgt agagtgtgcg aggccggcag cggcctggtg 3360

ttcagttgtc aagacaagca gaataccgtg tgtgaagagt gccccgacgg cacctacagc 3420

gacgaggcca accacgtgga cccctgcctg ccctgcactg tgtgcgagga caccgagcgg 3480

cagctgcgcg agtgcacaag atgggccgac gccgagtgcg aagagatccc cggcagatgg 3540

atcaccagaa gcaccccccc tgagggcagc gacagcaccg cccctagcac ccaggaacct 3600

gaggcccctc ccgagcagga cctgatcgcc tctacagtgg ccggcgtggt gacaaccgtg 3660

atgggcagct ctcagcccgt ggtgacacgg ggcaccaccg acaatcccaa attttgggtg 3720

ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt 3780

attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact 3840

ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc 3900

gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 3960

ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 4020

gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 4080

gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 4140

atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 4200

gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgcctcctcg ctaagcatgc 4260

aacctcgatc cggattagtc caatttgtta aagacaggat atcagtggtc caggctctag 4320

ttttgactca acaatatcac cagctgaagc ctatagagta cgagccatag ataaaataaa 4380

agattttatt tagtctccag aaaaaggggg gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca 4440

agctagctta agtaacgcca ttttgcaagg catggaaaaa tacataactg agaatagaga 4500

agttcagatc aaggtcagga acagatggaa cagctgaata tgggccaaac aggatatctg 4560

tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggaacagct gaatatgggc 4620

caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggtc 4680

cccagatgcg gtccagccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc 4740

ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc gcttctcgct 4800

tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc ctcactcggg 4860

gcgccagtcc tccgattgac tgagtcgccc gggtacccgt gtatccaata aaccctcttg 4920

cagttgcatc cgacttgtgg tctcgctgtt ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac 4980

tacccgtcag cgggggtctt tcacacatgc agcatgtatc aaaattaatt tggttttttt 5040

tcttaagtat ttacattaaa tggccatagt acttaaagtt acattggctt ccttgaaata 5100

aacatggagt attcagaatg tgtcataaat atttctaatt ttaagatagt atctccattg 5160

gctttctact ttttctttta tttttttttg tcctctgtct tccatttgtt gttgttgttg 5220

tttgtttgtt tgtttgttgg ttggttggtt aatttttttt taaagatcct acactatagt 5280

tcaagctaga ctattagcta ctctgtaacc cagggtgacc ttgaagtcat gggtagcctg 5340

ctgttttagc cttcccacat ctaagattac aggtatgagc tatcattttt ggtatattga 5400

ttgattgatt gattgatgtg tgtgtgtgtg attgtgtttg tgtgtgtgac tgtgaaaatg 5460

tgtgtatggg tgtgtgtgaa tgtgtgtatg tatgtgtgtg tgtgagtgtg tgtgtgtgtg 5520

tgtgcatgtg tgtgtgtgtg actgtgtcta tgtgtatgac tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 5580

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgttgt gaaaaaatat tctatggtag tgagagccaa 5640

cgctccggct caggtgtcag gttggttttt gagacagagt ctttcactta gcttggaatt 5700

cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 5760

gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 5820

gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc 5880

ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 5940

atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg 6000

cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt 6060

gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgatgac gaaagggcct cgtgatacgc 6120

ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt 6180

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 6240

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 6300

agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 6360

tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 6420

gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 6480

gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 6540

attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 6600

gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 6660

agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 6720

ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 6780

cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 6840

gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 6900

cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 6960

gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 7020

ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 7080

acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 7140

ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 7200

aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 7260

aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 7320

ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 7380

ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 7440

actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc 7500

caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 7560

gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 7620

ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 7680

cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc attgagaaag cgccacgctt 7740

cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 7800

acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 7860

ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 7920

gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 7980

tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 8040

accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag 8100

cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac 8160

gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 8220

actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt 8280

gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc c 8331

<210> 38

<211> 8151

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD44V6-4GS2-CAR.28Z С NGFR ДИКОГО ТИПА КОРОТКИМ (V6 NWS)

<400> 38