ОСТЕОКРИН, ЛЕБЕТИН ИЛИ ПРЕДСЕРДНЫЙ НАТРИЙУРЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД (ANP) ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БИОПЛЕНОК Российский патент 2024 года по МПК A61K38/22 A61K38/17 A61K45/06 A61P11/00 A61P31/04 

Данное изобретение относится к разрушению бактериальных биопленок, в частности, в ситуации хронической бактериальной инфекции.

Устойчивость бактерий к воздействию антибиотиков обычно считается обусловленной их способностью переходить от существования во взвешенном в среде состоянии к жизни в составе биопленки - сообщества микроорганизмов в тканях зараженного организма-хозяина. Жизнь в форме биопленки дает бактериальным клеткам защиту от веществ, обладающих противомикробным эффектом, и средств иммунной защиты организма-хозяина, таким образом позволяя патогенным микроорганизмам выживать во враждебном окружении, не поддаваясь воздействию различных противомикробных агентов. Кроме того, небольшое количество бактериальных клеток, называемых персистирующими, остаются в пределах биопленки, контактирующей с антибиотиками, становясь временно устойчивыми к ним, так что могут обеспечить возобновление инфекции.

Оппортунистический патогенный микроорганизм Pseudomonas aeruginosa является основной причиной смерти субъектов с ослабленной иммунной системой, в частности, больных муковисцидозом.

Лечение тяжелых случаев инфекции P. aeruginosa включает терапию рядом антибиотиков, из которых у большинства наиболее эффективных (тобрамицина, колистина, ципрофлоксацина, гентамицина, нетилмицина и амикацина) низкий терапевтический индекс из-за нефро- и ототоксичности. Кроме того, когда такое лечение длительное, возникают штаммы бактерий, устойчивые к антибиотикам.

По этой причине P. aeruginosa относят к крайне приоритетной группе бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, которые представляют наибольшую угрозу для больных и в отношении которых требуются новые лекарственные средства или терапевтические подходы (ESKAPE group; см. Santajit, Indrawattana (2016) Biomed. Res. Int. 2016:2475067). Недавно Всемирная организация здравоохранения (WHO), рассматривая бактерии с критически высокой устойчивостью к антибиотикам (в частности, к карбапенемам) включила P. aeruginosa в тройку первоочередных объектов в этом смысле.

Данное изобретение ставит своей задачей удовлетворить потребность в таких новых средствах лечения.

Данное изобретение является результатом неожиданного открытия, сделанного его авторами, а именно того факта, что предсердный натрийуретический пептид (ANP) в низких дозах (от 0,1 нм) очень быстро (через 30 минут после введения) может разрушать около 80% ранее сформировавшихся биопленок P. aeruginosa зависимым от дозы образом. Авторы данного изобретения также показали, что и другие пептиды из семейства натрийуретических пептидов, в частности, остеокрин, лебетин-2α и лебетин-1β, в низких дозах способны в равной мере разрушать сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa.

Натрийуретические пептиды составляют семейство гормонов, первоначально идентифицированных по их влиянию на тонус сосудов сердца, участию в регуляции водно-солевого гомеостаза, кровяного давления и экскреции натрия в почках (натрийурезу - отсюда и их название). Основные представители этого семейства - предсердный натрийуретический пептид (ANP), мозговой натрийуретический пептид (натрийуретический пептид типа В, BNP) и натрийуретический пептид типа С (CNP). Эти пептиды состоят из 22-38 аминокислотных остатков; структура большинства представителей семейства натрийуретических пептидов характеризуется наличием дисульфидной связи, из-за которой в молекуле пептида имеется петля из 17 аминокислотных остатков, так что молекула имеет форму «омега».

Ранее было показано, что ANP, BNP и CNP предотвращают образование биопленки P. aeruginosa (Desriac et al. The natriuretic peptide hormones prevent Pseudomonas aeruginosa biofilm formation through a specific bacterial target. 16th International conference on Pseudomonas, Sep 2017, Liverpool, United Kingdom; Rosay et al. (2015) MBio 6: 6; Desriac et al. (2018) Pathogens 7: 47).

Однако до сих пор не было продемонстрировано, что эти пептиды действуют на сформировавшиеся биопленки.

Авторы данного изобретения также показали, что способность ANP вызывать дезинтеграцию ранее сформировавшихся биопленок не связана со способностью ANP вызывать гибель бактерий и не обусловлена ею и не влияет на вирулентность, присущую данным бактериям. Такие особенности воздействия ANP на бактериальные клетки позволяют предотвращать возникновение штаммов, устойчивых к этому пептиду.

Авторы данного изобретения также показали, что когда малые дозы ANP применяются в сочетании с такими антибиотиками, как тобрамицин или ципрофлоксацин, взятыми тоже в малых дозах, то разрушается более 97% сформировавшихся биопленок.

Следовательно, в разрушении бактериальных биопленок ANP и антибиотики действуют синергически.

Таким образом, данное изобретение относится к натрийуретическому пептиду, выбираемому из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина и (iii) предсердным натрийуретическим пептидом (ANP), его пропептидом или его производным, для применения в способе терапевтического лечения бактериальной инфекции, в частности, хронической бактериальной инфекции, связанной с наличием у субъекта бактериальной биопленки, в котором указанный натрийуретический пептид, в частности, указанные пептид ANP, его пропетид или его производное, вызывает распад указанной бактериальной биопленки.

В одном из конкретных воплощений данного изобретения указанный натрийуретический пептид, в частности, указанные ANP, пропептид ANP или производное ANP применяются в сочетании с антибиотиком.

Другая цель данного изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей (A) натрийуретический пептид, выбираемый из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина, (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, и (B) антибиотиком.

Другая цель данного изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей (A) натрийуретический пептид, выбираемый из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина, (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, и (B) антибиотиком, для применения в способе терапевтического лечения бактериальной инфекции, в частности, хронической бактериальной инфекции, связанной с наличием у субъекта бактериальной биопленки.

Другая цель данного изобретения относится к фармацевтической антибактериальной комбинации, включающей (A) натрийуретический пептид, выбираемый из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина, (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, и (B) антибиотиком, для одновременного, раздельного или последовательного применения при терапевтическом лечении бактериальной инфекции, в частности, хронической бактериальной инфекции, связанной с наличием у субъекта бактериальной биопленки.

Данное изобретение также относится к применению in vitro или ex vivo натрийуретического пептида, выбираемого из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина, (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, для разрушения бактериальной биопленки

Осуществление изобретения

Натрийуретические пептиды

Под натрийуретическим пептидом в настоящем документе понимается представитель семейства гормонов и нейрогормонов эукариот, один из трех основных соединений этой группы: предсердный натрийуретический пептид (ANP), мозговой натрийуретический пептид (натрийуретический пептид типа В, BNP) и натрийуретический пептид типа С (CNP). Эти пептиды синтезируются и выделяются преимущественно кардиомиоцитами и эндотелиальными клетками. Помимо указанных трех пептидов семейство натрийуретических пептидов включает также остеокрин и пептиды, подобные натрийуретическим, например, лебетин.

Эти разные соединения сходны по аминокислотной последовательности. У всех них, за исключением остеокрина и лебетина 1β, в молекуле имеется петля длиной 17 аминокислотных остатков, сформированная с помощью дисульфидной связи. Из 17 аминокислотных остатков, образующих петлю, 11 одинаковы у ANP и лебетина 2α. В молекуле остеокрина в той области имеется характерная консервативная последовательность из 7 аминокислотных остатков, и такая же как в ANP. Этот консервативный участок последовательности натрийуретических пептидов обеспечивает их связывание с молекулой рецептора натрийуретических пептидов человека (NPR-A, NPR-B и NPR-C). Кроме того, было показано, что ANP, остеокрин и лебетин 2α связываются с высоким сродством с сенсором AmiC P. aeruginosa (Rosay et al. (2015) mBio 25: e01033-15). В то же время в С- и N-концевых областях аминокислотных последовательностей натрийуретических пептидов существуют многочисленные различия, обусловливающие разницу в их физиологической активности. Интересно, что помимо конечных активных продуктов, указанных ниже, синтез, созревание и частичное расщепление натрийуретических пептидов могут приводить к образованию множества вариантов с различной физиологической активностью.

У человека и в царстве животных известно множество представителей этого семейства: описанный ниже уродилатин, урогуанилин, желудочковый натрийуретический пептид (VNP), натрийуретический пептид мамбы (DNP) и натрийуретический пептид крайта (KNP).

Желудочковый натрийуретический пептид (VNP) был первоначально идентифицирован у угрей как пептид, имеющий физиологические функции, сходные с таковыми ANP, и позже обнаружен у многих видов рыб (Kawakoshi et al. (2004) J. Mol. Endocrinol. 32 :547-555).

Натрийуретический пептид мамбы (DNP) был идентифицирован в яде змеи зеленой мамбы (Schweitz et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 :13928-13932), а натрийуретический пептид крайта (KNP) был обнаружен в яде змеи Bungarus flaviceps (Sridharan et al. (2015) Biochem. J. 469 :255-266).

Многочисленные другие соединения, сходные с натрийуретическими пептидами, периодически обнаруживают также в яде гадюк, например, лебетины, выделенные из яда Macrovipera lebetina, крупных рептилий, таких как комодские драконы (натрийуретический пептидный токсин Var2) (Fry et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 8 969-8974), и яда скорпионов (Alves et al. (2013) Toxicon 74 :19-26). Их обычно называют пептидами с активностью, подобной натрийуретической. Из них предпочтительными по данному изобретению являются лебетины, обозначаемые L2α (Gly1-Gly38) и L1β (Asp2-Gly13). Наконец, энтеротоксин, называемый ST («термостабильный энтеротоксин»), обладающий активностью, подобной натрийуретической, и имеющий пептидную структуру, близкую к человеческому гуанилину и урогуанилину, описан у бактерий Escherichia coli.

Натрийуретический пептид, используемый в соответствии с данным изобретением, выбирают из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина, (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP.

С помощью «ANP» в настоящем документе обозначается пептид, соответствующий основной зрелой форме, образующейся в результате отщепления N-концевого фрагмента от соответствующего прогормона proANP.

Как правило, человеческий ANP представляет собой пептид из 28 аминокислотных остатков, образующийся в результате отщепления N-концевого фрагмента от соответствующего прогормона proANP, который состоит из 126 аминокислотных остатков. Человеческий ANP состоит из аминокислотных остатков с 99-го по 126-й последовательности прогормона proANP.

Аминокислотная последовательность пептида ANP высококонсервативна, поскольку она одинакова, например, у людей, обезьян, горилл, свиней, лошадей, свиней и овец (Takei et al. (2011) General and Comparative Endocrinology 171 :258-266). Однако среди множества видов, у которых он экспрессируется, наблюдается некоторые различия в последовательности. Например, у крыс, мышей и кроликов в положении 12 находится иной аминокислотный остаток, нежели у животных, перечисленных выше, и человека (а именно, изолейцин вместо метионина). Аналогично, у слонов имеется ANP, укороченный до 27 аминокислотных остатков и имеющий два отличных аминокислотных остатка по сравнению с человеческим (Takei et al. (2011) General and Comparative Endocrinology 171 :258-266).

Термин «пропептид ANP» (proANP) в настоящем документе подразумевает любой пептид, образующийся в результате экспрессии гена, кодирующего препропептид ANP (preproANP), последующего созревания и при необходимости последовательного расщепления preproANP, и содержащий пептидную аминокислотную последовательность ANP.

Таким образом, термин «пропептид ANP» включает прогормон proANP (у человека состоит, как правило, из 126 аминокислотных остатков), несущий ANP в С-концевой части, препрогормон preproANP (у человека состоит, как правило, из 151 аминокислотного остатка), который соответствует белку, продуцируемому геном NPPA у человека. Препрогормон preproANP содержит сигнальный пептид, который отщепляется, с образованием proANP.

В контексте данного изобретения термин «пропептид ANP» также включает любой пептид, образующийся в результате созревания и расщепления preproANP и proANP.

ANP, как правило, состоит из аминокислотной последовательности SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY (SEQ ID NO: 1), с дисульфидным мостиком между аминокислотными остатками в положениях 7 и 23.

ProANP, как правило, состоит из аминокислотной последовательности NPMYNAVSNADLMDFKNLLDHLEEKMPLEDEVVPPQVLSEPNEEAGAALSPLPEVPPWTGEVSPAQRDGGALGRGPWDSSDRSALLKSKLRALLTAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY (SEQ ID NO: 3).

PreproANP, как правило, состоит из аминокислотной последовательности MSSFSTTTVSFLLLLAFQLLGQTRANPMYNAVSNADLMDFKNLLDHLEEKMPLEDEVVPPQVLSEPNEEAGAALSPLPEVPPWTGEVSPAQRDGGALGRGPWDSSDRSALLKSKLRALLTAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY (SEQ ID NO: 4).

Под производным пептида ANP в настоящем документе понимается природное или синтетическое производное ANP.

«Производное ANP» в настоящем документе подразумевает пептид ANP, например, описанный выше, в котором один или более аминокислотных остатков химически модифицированы, например, путем алкилирования, ацилирования, амидирования, метоксилирования, образования эфирной или амидной группы, вставки липофильного заместителя, присоединения полиэтиленгликоля (PEG), присоединения углеводной цепи.

Под производным пептида ANP в настоящем документе также имеются в виду укороченные формы ANP, соответствующие положениям с 4-го или 5-го по 28-е полноразмерной аминокислотной последовательности ANP, формы со структурой, являющейся антипараллельным димером ANP, в частности гомодимером β-ANP, полимер, мономером которого является ANP.

Под производным пептида ANP в настоящем документе также подразумеваются пептидные варианты ANP, то есть промежуточные формы, получающиеся в процессе синтеза, созревания и частичного расщепления ANP, например, как описано выше, а также пептиды ANP, в которых 1-12, в частности, 1-10, в частности, 1-5, в частности, 1-4, в частности, 1-3, в некоторых случаях 1 или 2 аминокислотных остатка удалены, заменены или добавлены с сохранением активности ANP дикого типа.

В одном конкретном воплощении данного изобретения производное ANP является пептидом ANP, в котором заменена аминокислота фенилаланин (Phe) в положении 8 в петле (и, например, заменена на аминокислотой аланином).

В другом конкретном воплощении данного изобретения производное ANP является пептидом ANP, в котором заменена аминокислота фенилаланин (Phe) в положении 26 или аминокислота серин в положении 25, две аминокислоты, ответственные за расщепление ANP дикого типа (Ichiki and Burnett (2017) Circ. J. 81: 913-919).

В одном конкретном воплощении данного изобретения производное ANP является удлиненной формой ANP уродилатином с аминокислотной последовательностью TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY (SEQ ID NO: 2), в которой имеется дисульфидный мостик между аминокислотными остатками в положениях 11 и 27. Этот пептид соответствует ANP, который удлинен на 4 аминокислотных остатка с N-конца.

В другом конкретном воплощении данного изобретения производное ANP является удлиненной на 12 аминокислот формой ANP, например, fsANP, которой который является формой ANP, удлиненной на 12 аминокислот на С-конце, обнаруженной у людей с мутацией в гене, кодирующем ANP (Dickey et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:19196-19202).

В другом конкретном воплощении данного изобретения производное ANP является лианезированным вариантом ANP с расщепленной дисульфидной связью (исходно имеющейся между аминокислотами в 7-м и 23-м положениях).

Как правило, производные ANP, которые можно использовать в соответствии с данным изобретением, предпочтительно модифицированы по сравнению с ANP таким образом, что их время полужизни больше, чем у ANP, и/или сродство связывания с эндогенными человеческими рецепторами ANP слабее, чем у ANP.

Под остеокрином в настоящем документе понимается гормон, действующий как регулятор роста дендритов в развивающейся коре головного мозга в ответ на чувственный опыт.

Как правило, у человека остеокрин - это пептид из 50 аминокислотных остатков, образующийся в результате отщепления N-концевого фрагмента от прогормона проостеокрина, состоящего из 106 аминокислот. Человеческий остеокрин сформирован с 83-ей по 132-ую аминокислотами прогормона проостеокрина.

Пропептидом остеокрина в настоящем документе называется прогормон проостеокрин, состоящий из 106 аминокислотных остатков и включающий аминокислотную последовательность остеокрина в своей С-концевой части, и/или препрогормон препроостеокрин, состоящий из 132 аминокислотных остатков, который соответствует белку, продуцируемому геном OSTN человека. Препроостеокрин содержит сигнальный пептид, который отщепляется с образованием проостеокрина, состоящего из 106 аминокислотных остатков.

Остеокрин, как правило, имеет аминокислотную последовательность SFSGFGSPLDRLSAGSVDHKGKQRKVVDHPKRRFGIPMDRIGRNRLSNSR (SEQ ID NO: 5).

Проостеокрин, как правило, имеет аминокислотную последовательность VDVTTTEAFDSGVIDVQSTPTVREEKSATDLTAKLLLLDELVSLENDVIETKKKRSFSGFGSPLDRLSAGSVDHKGKQRKVVDHPKRRFGIPMDRIGRNRLSNSRG (SEQ ID NO: 6).

Препроостеокрин, как правило, имеет аминокислотную последовательность MLDWRLASAHFILAVTLTLWSSGKVLSVDVTTTEAFDSGVIDVQSTPTVREEKSATDLTAKLLLLDELVSLENDVIETKKKRSFSGFGSPLDRLSAGSVDHKGKQRKVVDHPKRRFGIPMDRIGRNRLSNSRG (SEQ ID NO: 7).

В контексте данного изобретения термин «пропептид остеокрина» также включает любой пептид, образующийся в результате созревания и расщепления препроостеокрина и проостеокрина.

Под производным остеокрина в настоящем документе понимается природное или синтетическое производное остеокрина.

Под производным остеокрина в настоящем документе понимается остеокрин, например, описанный выше, в котором один или более аминокислотных остатков химически модифицированы, например, путем алкилирования, ацилирования, амидирования, метоксилирования, образования эфирной или амидной группы, вставки липофильного заместителя, присоединения полиэтиленгликоля (PEG), присоединения углеводной цепи.

Под производным остеокрина в настоящем документе также подразумеваются пептидные варианты остеокрина, то есть промежуточные формы, получающиеся в процессе синтеза, созревания и частичного расщепления остеокрина, например, как описано выше.

Под лебетином в настоящем документе имеется в виду пептид, полученный из яда змеи Macrovipera lebetina.

Лебетин, например, описанный выше, предпочтительно представляет собой лебетин 2α или лебетин 1β.

Под лебетином 2α понимается пептид, произведенный гадюкой Macrovipera lebetina, как описано в работе Barbouche et al. (1996) FEBS Lett. 392 :6-10.

Как правило, лебетин 2α представляет собой пептид из 38 аминокислот.

Лебетин 2α, как правило, имеет аминокислотную последовательность GDNKPPKKGPPNGCFGHKIDRIGSHSGLGCNKVDDNKG (SEQ ID NO: 8) дисульфидным мостиком между аминокислот в положениях 14 и 30.

Под лебетином 1β понимается пептид, произведенный гадюкой Macrovipera lebetina, как описано в работе Barbouche et al. (1998) Toxicon 36(12): 1939-47.

Как правило, лебетин L1 бета представляет собой пептид из 12 аминокислот.

Лебетин 1β, как правило, имеет аминокислотную последовательность DNKPPKKGPPNG (SEQ ID NO: 9).

Фрагментом лебетина в настоящем документе называют фрагмент указанного лебетина, предпочтительно описанных выше лебетина 2α или лебетина 1β, состоящий из по меньшей мере 10 аминокислотных остатков.

Указанный фрагмент лебетина содержит предпочтительно по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, предпочтительно по меньшей мере 12 аминокислотных остатков, предпочтительно по меньшей мере 14 аминокислотных остатков, предпочтительно по меньшей мере 16 аминокислотных остатков и/или не больше чем 30 аминокислотных остатков, предпочтительно не больше чем 25 аминокислотных остатков, предпочтительно не больше чем 20 аминокислотных остатков.

Фрагмент лебетина 2α содержит, например, аминокислоты с 4 по 10 последовательности SEQ ID NO: 8, предпочтительно аминокислоты с 2 по 12 последовательности SEQ ID NO: 8.

Фрагмент лебетина 2α состоит, например, из аминокислот с 1 по 13 последовательности SEQ ID NO: 8.

Лебетин 1β, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9, является также фрагментом лебетина 2α, состоящим из аминокислот со 2 по 13 последовательности SEQ ID NO: 8.

Под производным лебетина или фрагмента лебетина в настоящем документе понимается природное или синтетическое производное лебетина или фрагмента лебетина.

Под производным лебетина или фрагмента лебетина в настоящем документе понимается лебетин, например, описанный выше, или фрагмент лебетина, например, описанный выше, в котором один или более аминокислотных остатков химически модифицированы, например, путем алкилирования, ацилирования, амидирования, метоксилирования, образования эфирной или амидной группы, вставки липофильного заместителя, присоединения полиэтиленгликоля (PEG), присоединения углеводной цепи.

Под производным лебетина или фрагмента лебетина в настоящем документе также подразумеваются пептидные варианты лебетина или фрагмента лебетина, то есть промежуточные формы, получающиеся в процессе синтеза, созревания и частичного расщепления лебетина или фрагмента лебетина, например, описанных выше.

Под другом натрийуретическим пептидом в настоящем документе понимается натрийуретический пептид, не являющийся ANP, или пропептидом ANP, или производным пептида ANP (например, уродилатином).

Бактериальная биопленка и бактериальная инфекция

Под бактериальной инфекцией в настоящем документе понимается инфекция, вызванная одним или более видами бактерий, в частности, грамотрицательными и/или грамположительными бактериями.

В одном конкретном воплощении данного изобретения бактериальная инфекция является хронической.

В одном конкретном воплощении данного изобретения возбудителем бактериальной инфекции являются грамотрицательные бактерии.

В одном конкретном воплощении данного изобретения возбудителем бактериальной инфекции являются бактерии из рода Pseudomonas, в частности, вида Pseudomonas aeruginosa.

В другом конкретном воплощении данного изобретения возбудителем бактериальной инфекции являются грамположительные бактерии.

В одном конкретном воплощении данного изобретения возбудителем бактериальной инфекции являются бактерии из рода Staphylococcus, в частности, вида Staphylococcus aureus.

Под бактериальной биопленкой в настоящем документе понимается сообщество связанных друг с другом бактериальных клеток, прикрепленных к какой-либо поверхностии. Формирование биопленки характеризуется секретированием матрикса, который способен прикрепляться к различным типам поверхностей, обеспечивающий когезию и защиту бактерий, образующих эту структуру.

В соответствии с данным изобретением бактериальная биопленка содержит по меньшей мере один или более видов бактерий, вызвавших инфекцию, подлежащую лечению.

В соответствии с данным изобретением указанный натрийуретический пептид, в частности, указанные пептид ANP, пропептид ANP или производное ANP диспергируют бактериальную биопленку.

Под диспергированием или разрушением бактериальной биопленки в настоящем документе понимается то, что бактериальные клетки, образующие устойчивый конгломерат бактериальной биопленки, отделяются друг от друга и от поверхности, так что биопленка сокращается в размерах и даже исчезает, в результате чего, как правило, антибиотики получают снова доступ к этим клеткам.

В одном конкретном воплощении данного изобретения указанная бактериальная биопленка диспергируется по меньшей мере на 50%, в частности, по меньшей мере на 55%, в частности, по меньшей мере на 60%, в частности, по меньшей мере на 65%, в частности, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 100%.

Предпочтительно указанный натрийуретический пептид, в частности, указанные пептид ANP, пропептид ANP или производное пептида ANP, диспергируют бактериальную биопленку, не вызывая гибель составляющих ее бактерий.

Однако следует заметить, что указанный натрийуретический пептид, в частности, указанные пептид ANP, пропептид ANP или производное пептида ANP, применяется в сочетании с антибиотиком, и бактерии, составляющие биопленку, могут быть убиты этим антибиотиком, в частности, когда они высвобождаются из биопленки вследствие диспергирующего эффекта указанного натрийуретического пептида, в частности, пептида ANP, пропептида ANP или производного пептида ANP,

Терапевтическое применение

Данное изобретение относится к натрийуретическому пептиду, выбираемому из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), или фрагментом лебетина, или производным лебетина или фрагмента лебетина и (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, например, описанными выше в разделе «Натрийуретические пептиды», для применения в способе терапевтического лечения бактериальной инфекции, связанной с наличием бактериальной биопленки, например, описанной выше в разделе «Бактериальная биопленка и бактериальная инфекция», у субъекта, причем указанный натрийуретический пептид диспергирует бактериальную биопленку.

Данное изобретение относится также к применению натрийуретического пептида, выбираемого из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), фрагментом лебетина, или производным лебетина или фрагмента лебетина и (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, например, описанными выше в разделе «Натрийуретические пептиды», при изготовлении лекарственного средства для терапевтического лечения бактериальной инфекции, связанной с бактериальной биопленкой, например, описанной выше в разделе «Бактериальная биопленка и бактериальная инфекция», у субъекта, причем указанный натрийуретический пептид диспергирует бактериальную биопленку.

Данное изобретение относится также к способу терапевтического лечения бактериальной инфекции, связанной с бактериальной биопленкой, например, описанной выше в разделе «Бактериальная биопленка и бактериальная инфекция», у субъекта, страдающего бактериальной инфекцией, в частности, с хронической бактериальной инфекцией, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества натрийуретического пептида, выбираемого из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), фрагментом лебетина, или производным лебетина или фрагмента лебетина и (iii)пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, например, описанными выше в разделе «Натрийуретические пептиды», причем указанный натрийуретический пептид диспергирует бактериальную биопленку.

Под субъектом в настоящем документе понимается человек или животное, например, млекопитающее, отличное от человека, птица или рыба.

В одном конкретном воплощении данного изобретения у субъекта имеется хроническое патологическое состояние органов дыхания, например, муковисцидоз, хроническое обструктивное заболевание легких или бронхоэктазия. В соответствии с данным изобретением субъект предпочтительно болен муковисцидозом.

В другом конкретном воплощении данного изобретения указанный субъект страдает от обширных ожогов (жертва тяжелых ожогов) или от поверхностной инфекции.

В другом воплощении данного изобретения у субъекта имеется имплантатат и/или протез.

В одном конкретном воплощении данного изобретения указанный натрийуретический пептид, в частности, пептид ANP, пропептид ANP или производное пептида ANP используется в сочетании с антибиотиком.

Под антибиотиком в настоящем документе понимается природное или синтетическое вещество, нарушающее или блокирующее рост бактерий.

Антибиотики включают:

- антибиотики, подавляющие синтез клеточной стенки бактерий, в том числе

- β-лактамные соединения, в частности

- пенициллины, включая пенициллины группы А, например, амоксициллин; пенициллины групп G и V, например, бензатина бензилпенициллин, бензатина пенициллин, бензатина феноксиметилпенициллин, пенициллины G и пенициллин V; пенициллины группы, например, клоксациллин и оксациллин; карбоксипенициллины, например, тикарциллин; уреидопенициллины, например, пиперациллин; амидинопенициллины, например, пивмециллинам; и темоциллин;;

- карбапенемы, например, эртапенем, имипенем и меропенем;

- монобактамы, например, азтреонам;

- цефалоспорины, включая цефалоспорины 1-го поколения, например, цефаклор, цефадроксил, цефалексин, цефалотин, цефазолин и цефрадин; цефалоспорины 2-го поколения, например, цефамандол, цефокситин, цефуроксим натрия и цефуроксима аксетил; и цефалоспорины 3-го поколения, например, цефиксим, цефподоксима проксетил, цефотиам-гексетил, цефепим, цефотаксим, цефпиром, цефтазидим и цефтриаксон;

- фосфомицины, например, фосфомицин и фосфомицина трометамол;

- гликопептиды, например, тейкопланин и ванкомицин;

- липопептиды, например, даптомицин; и

- полимиксины, например, полимиксин В и полимиксин Е, или колистин;

- Антибиотики, подавляющие синтез белков, в том числе:

- аминогликозиды, например, амикацина сульфат, гентамицин, неомицин, нетилмицин, спектиномицин, стрептомицин и тобрамицин;

- макролиды и им подобные соединения, в частности:

- истинные макролиды, например, амфотерицин В, азитромицин, кларитромицин, эритромицин, йозамицин, мидекамицин, рокситромицин;

- линкозамиды, например, клиндамицин и линкомицин;

- кетолиды, например, телитромицин; и

- синергистины, например, пристинамицин;

- фениколы, например, триамфеникол;

- циклины, например, хлортетрациклин, доксициклин, лимециклин, метациклин, миноциклин и тигециклин;

- производные фузидовой кислоты, например, натриевая соль фузидовой кислоты (фузидин); и

- оксазолидиноны, например, линезолид и тедизолид;

- антибиотики, подавляющие синтез нуклеиновых кислот, в том числе:

- хинолоны, например, пипемидовая кислота, флумехин, эноксацин, ломефлоксацин, норфлоксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, левофлоксацин и моксифлоксацин;

- хинолины, например, гидроксихинолин;

- мупироцин; и

- рифамицин;

- антибиотики, подавляющие синтез фолиевой кислоты, в том числе сульфамиды, например, сульфадиазин, сульфаметизол, сульфафуразол и сульфаметоксазол; и

- антибиотики со сложным или плохо изученным механизмом действия, в том числе:

- нитросоединения, в частности:

- нитрофураны, например, нитрофурантоин и нифуроксазид; и

- нитроимидазолы, например, метронидазол, омидазол и тинидазол; и

- этамбутол, изониазид, пиразинамид, рифабутин и рифампицин.

В одном конкретном воплощении данного изобретения указанный антибиотик является антибиотиком, подавляющим синтез белков, в частности, аминогликозидом, например, тобрамицином; антибиотиком, подавляющим синтез нуклеиновых кислот, в частности, хинолоном, например, ципрофлоксацином; антибиотиком, подавляющим синтез клеточной стенки бактерий, в частности, β-лактамным соединением, говоря конкретнее карбапенемом, например, имипенемом, дорипенемом или меропинемом; или антибиотиком, воздействующим на структуру клеточной стенки бактерий, в частности, полимиксином, например, полимиксином В или колистином.

В одном конкретном воплощении данного изобретения указанный антибиотик является аминогликозидом, хинолоном, карбапенемом или полимиксином. Говоря конкретнее, указанный антибиотик может быть аминогликозидом или хинолоном.

В другом конкретном воплощении данного изобретения указанный антибиотик является тобрамицином, ципрофлоксацином, имипенемом и/или колистином.

Говоря конкретнее, указанный антибиотик может быть тобрамицином и/или ципрофлоксацином.

Авторы данного изобретения показали, что совместное применение пептида ANP с этими антибиотиками имеет синергический эффект в разрушении биопленок. Без теоретических рассуждений предполагается, что благодаря вызванной пептидом ANP диспергирования бактерий, образующих биопленку, эти бактерии становятся доступными для антибиотиков, эффективность которых тем самым повышается.

В другом конкретном воплощении данного изобретения указанный натрийуретический пептид используется в сочетании с по меньшей мере одним другим натрийуретическим пептидом, например, из числа описанных в разделе «Натрийуретические пептиды».

Таким образом, в одном конкретном воплощении данного изобретения, когда указанный натрийуретический является пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, он может использоваться в сочетании с остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина и/или лебетином (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина.

Или же в другом конкретном воплощении данного изобретения, когда указанный натрийуретический является остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, он может использоваться в сочетании с пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP и/или лебетином (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина.

Или же в другом конкретном воплощении данного изобретения, когда указанный натрийуретический является лебетином (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина он может использоваться в сочетании с пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP и/или остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина.

Совместное применение нескольких натрийуретических пептидов имеет то преимущество, что можно использовать меньшие дозы каждого из этих соединений, тем самым существенно сокращая возможность всяческих побочных эффектов.

В этом конкретном воплощении данного изобретения указанный натрийуретический пептид можно также применять в сочетании с антибиотиком из числа описанных выше, используя их при необходимости последовательно (сначала вводят указанный натрийуретический пептид, а затем антибиотик).

В одном конкретном воплощении данного изобретения указанный натрийуретический пептид, в частности, указанные пептид ANP, пропептид ANP или производное пептида ANP применяют в сочетании с любым другим веществом, пригодным для лечения субъекта с бактериальной инфекцией, например, из числа описанных выше, используя их при необходимости последовательно (сначала вводят указанный натрийуретический пептид, а затем другое лечебное средство).

В частности, в случаях хронической патологии дыхательной системы указанный натрийуретический пептид, в частности, указанные пептид ANP, пропептид ANP или производное пептида ANP применяют предпочтительно в сочетании с каким-либо веществом, пригодным для лечения хронической патологии дыхательной системы, например, из числа описанных выше, используя их при необходимости последовательно (сначала вводят указанный натрийуретический пептид, а затем пригодным веществом).

Таким образом, в одном из воплощений данного изобретения, в котором указанный субъект болен муковисцидозом, указанный натрийуретический пептид, в частности, указанные пептид ANP, пропептид ANP или производное пептида ANP применяют предпочтительно в сочетании с каким-либо средством, способствующим мукоцилиарному клиренсу, например, рекомбинантной дезкосирибонуклеазой (например, препаратом Pulmozyme®), и/или бронхорасширяющее средство, используя их при необходимости последовательно (сначала вводят средство, способствующее мукоцилиарному клиренсу, а затем указанный натрийуретический пептид).

В этих конкретных воплощениях данного изобретения указанный натрийуретический пептид можно применять также в сочетании с антибиотиком из числа описанных выше и/или с другим натрийуретическим пептидом, описанным выше, предпочтительно с антибиотиком, описанным выше.

В контексте данного изобретения термин «лечение» или «лечить» означает облегчать, ослаблять или подавлять прогрессирование заболевания, применительно к которому данный термин употребляется, или один либо более из симптомов этого заболевания.

Под терапевтически эффективным количеством в настоящем документе понимается количество представляющего интерес вещества, достаточное для диспергирования бактериальной биопленки при лечении бактериальной инфекции с разумным соотношении эффективной риска и пользы, применяемым для любого лечебного мероприятия. Очевидно, что общая суточная доза соединений в соответствии с данным изобретением находится в компетенции лечащих врачей и определяется на основе их медицинского заключения. Величина терапевтически эффективной дозы, специфичной для конкретного субъекта, зависит от ряда факторов, в том числе от заболевания, подлежащего лечению, и степени его тяжести, от активности соединений, используемых для лечения в данном конкретном случае, от возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и питания субъекта, времени и пути введения этих соединений, скорости их выведения из организма, продолжительности лечения, медицинских средств, применяемых в сочетании с ними или параллельно, и других подобных факторов, хорошо известных в области медицины. Например, известно, что курс лечения следует начинать с доз, меньших, нежели требуются для достижения желаемого терапевтического действия, и постепенно повышать дозировку до тех пор, пока не появится нужный эффект.

Соединения, используемые в соответствии с данным изобретением, можно вводить в организм в составе фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемые эксципиенты и при необходимости матриксы, обеспечивающие замедленное/отсроченное высвобождение, например, биоразлагаемые полимеры для получения терапевтических композиций.

Определения «фармацевтический» или «фармацевтически приемлемый» в настоящем документе означают химические вещества и их композиции, введение которых млекопитающим, в частности, человеку, не приводит к аллергическим или другим нежелательным вторичным реакциям в организме. Фармацевтическим приемлемый носитель или эксципиент - это твердый, полужидкий или жидкий нетоксичный наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательный компонент любого типа.

Форма фармацевтической композиции, содержащей соединения, используемые в соответствии с данным изобретением, и путь ее введения, разумеется, зависят от заболевания, подлежащего лечению, и степени его тяжести, от возраста, массы тела, пола субъекта и от прочего.

Соединения, используемые в контексте данного изобретения, могут быть, например, включены в составы для введения в организм через дыхательные пути или ингаляцией (в частности, с помощью небулайзеров), перорально, парентерально, интраназально, внутривенно, внутримышечно, местно, подкожно или внутриглазным путем.

В одном из конкретных воплощений данного изобретения предлагаемые соединения вводят через дыхательные пути или ингаляцией (в частности, с помощью небулайзеров).

В одном конкретном воплощении данного изобретения натрийуретический пептид, в частности, пептид ANP (или пропептид, или производное) вводят в суточной дозе от 0,3 нг/мл до 3,000 нг/мл.

В другом конкретном воплощении данного изобретения антибиотик, используемый в сочетании с натрийуретическим пептидом, вводят в дозе, максимально составляющей 600 мг/сут (по 300 мг два раза в сутки).

Фармацевтические композиции и фармацевтические комбинации

Данное изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей (A) натрийуретический пептид, выбираемый из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), фрагментом лебетина, или производным лебетина или фрагмента лебетина и (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, например, описанными выше в разделе «Натрийуретические пептиды», и (B) антибиотика, например, из числа описанных выше в разделе «Терапевтическое применение».

В одном конкретном воплощении данного изобретения предлагаемая композиция содержит также фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, например, из числа упомянутых выше.

В другом конкретном воплощении данного изобретения предлагаемая композиция содержит также другой натрийуретический пептид, например, из числа описанных выше в разделе «Натрийуретические пептиды».

Данное изобретение относится также к фармацевтической антибактериальной комбинации, включающей (A) натрийуретический пептид, выбираемый из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), фрагментом лебетина, или производным лебетина или фрагмента лебетина и (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, например, описанными выше в разделе «Натрийуретические пептиды», и (B) антибиотик, например, из числа перечисленных выше в разделе «Терапевтическое применение», для одновременного, раздельного или последовательного использования при терапевтическом лечении субъекта, описанного выше, от бактериальной инфекции, связанной с наличием бактериальной биопленки, например, описанной выше в разделе «Бактериальные биопленки и бактериальная инфекции».

Данное изобретение относится также к применению (A) натрийуретического пептида, выбираемого из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина и (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, например, описанными выше в разделе «Натрийуретические пептиды», и (B) антибиотика, например, из числа перечисленных выше в разделе «Терапевтическое применение», для составлении фармацевтической антибактериальной комбинации, которые вводят описанному выше субъекту одновременно, раздельно или последовательно при терапевтическом лечении от бактериальной инфекции, связанной с наличием бактериальной биопленки, например, описанной выше в разделе «Бактериальные биопленки и бактериальная инфекции».

Другой целью данного изобретения является способ терапевтического лечения бактериальной инфекции, связанной с наличием бактериальной биопленки, например, описанной выше в разделе «Бактериальные биопленки и бактериальная инфекции», включающий одновременное, раздельное или последовательное введение нуждающемуся в том субъекту терапевтически эффективного количества (A) натрийуретического пептида, выбираемого из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина и (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, например, описанными выше в разделе «Натрийуретические пептиды», и (B) антибиотика, например, из числа перечисленных выше в разделе «Терапевтическое применение».

В контексте данного изобретения термин «комбинация» иди «фармацевтическая комбинация» подразумевает определенное сочетание в составе однодозовой формы или набора для совместного введения, в которых натрийуретический пептид и антибиотик вводят независимо в одно и то же время или же раздельно через некоторые промежутки времени, чтобы обеспечить синергический эффект компонентов комбинации.

Соединения, входящие в комбинацию в соответствии с данным изобретением, могут быть в составе одной фармацевтической комбинации или двух отдельных комбинаций, которые вводится одним и тем же путем или же разными путями.

В одном конкретном воплощении данного изобретения указанная фармацевтическая комбинация включает также (C) другой натрийуретический пептид, например, из числа описанных в разделе «Натрийуретические пептиды» и/или (D) другое вещество, пригодное для лечения субъекта, страдающего бактериальной инфекцией, например, из числа указанных в разделе «Терапевтическое применение».

В этом конкретном воплощении данного изобретения предлагаемая комбинация является фиксированной комбинацией в виде однодозовой формы или набором для совместного введения, в котором натрийуретический пептид, антибиотик, другой натрийуретический пептид и/или другое вещество, пригодное для лечения данного субъекта, вводят независимо в одно и то же время или же раздельно через некоторые промежутки времени, чтобы обеспечить синергический эффект компонентов комбинации.

В этом воплощении данного изобретения соединения, образующие комбинацию, могут быть представлены в виде одной, двух, трех или четырех отдельных фармацевтических комбинаций, которые вводят субъекту одним и тем же путем или же разными путями.

Для получения соединений, используемых в соответствии с данным изобретением, для фармацевтического применения эффективные количества этих соединений растворяют или диспергируют в фармацевтически приемлемом носителе или водной среде.

Фармацевтические формы, пригодные для введения путем инъекций, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий, вводимых путем инъекций, непосредственно перед введением, например, микронизированные формы. В любом случае фармацевтическая форма должна быть стерильной и жидкой для того, чтобы ее можно было вводить с помощью шприца. Кроме того, она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения, а также защищенной от контаминации микроорганизмами, например, бактериями, вирусами или грибками.

Носителем в соответствии с данным изобретением может служить растворитель или диспергирующая среда, например, содержащая воду, этиловый спирт, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль или другие вещества) и их подходящие смеси. Необходимая текучесть обеспечивается, например, использованием обволакивающих агентов, например, лецитина, поддержанием нужного размера частиц для дисперсий и использованием поверхностно-активных веществ, стабилизирующих агентов, криопротекторов или антиоксидантов. Для предотвращения воздействия микроорганизмов используются антибактериальные и противогрибковые агенты. Во многих случаях предпочтительно включать в состав фармацевтической формы изотонические агенты, например, сахара или хлорид натрия.

Чтобы приготовить стерильный инъецируемый раствор, активные вещества вносят в нужное количество подходящего растворителя вместе с другими ингредиентами, после чего полученный раствор стерилизуют фильтрацией. Для приготовления дисперсий, как правило, различные стерилизованные активные вещества вносят в стерильную несущую среду, содержащую основную диспергирующую среду и другие необходимые ингредиенты. Что касается стерильных порошков, предназначенных для приготовления стерильных инъецируемых растворов, то предпочтительны методы сушки в вакууме и лиофилизации, которые позволяют получить порошок активного вещества вместе с любыми желаемыми дополнительными ингредиентами из их раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией.

В случае парентерального введения, например, водные растворы предпочтительно подходящим образом забуферивают, если необходимо, а жидкий разбавитель делают изотоническим с помощью раствора соли или глюкозы. Такие конкретные водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного или внутрибрюшинного введения.

Составы фармацевтических композиций для введения через дыхательные пути хорошо известны специалистам в данной области техники. Как правило, в таких препаратах активные вещества доставляют в форме аэрозольного спрея с помощью дозированного аэрозольного ингалятора, содержащего пригодный газ-пропеллент, например, дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан или диоксид углерода, или же в форме порошка, который вводится с помощью порошкового ингалятора, или в форме жидкого водного аэрозоля с помощью небулайзера. Небулайзеры для доставки жидкого аэрозоля можно разделить на струйные небулайзеры, применяющие сжатый поток воздуха, обеспечиваемый с использованием портативного компрессора или центральной подачи воздуха в больнице, ультразвуковые небулайзеры, включающие пьезокристалл, обеспечивающий энергию, необходимую для создания аэрозоля, и электронные небулайзеры, работающие по принципу перфорированной вибрирующей мембраны.

Нетерапевтическое применение

Данное изобретение относится также к применению in vitro или ex vivo (A) натрийуретического пептида, выбираемого из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина и (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, например, описанными выше в разделе «Натрийуретические пептиды», для диспергирования бактериальных биопленок.

Натрийуретический пептид, в частности, пептид ANP, пропептид ANP или производное пептида ANP, обычно можно использовать для защиты от обрастания, например, корпусов кораблей или трубопроводов.

Таким образом, данное изобретение относится также к способу диспергирования бактериальных биопленок на поверхности in vitro или ex vivo, включающий нанесение на указанную поверхность композиции, содержащей натрийуретический пептид, выбираемый из группы, образованной (i) остеокрином, пропептидом остеокрина или производным остеокрина, (ii) лебетином, (предпочтительно лебетином 2α или лебетином 1β), фрагментом лебетина или производным лебетина или фрагмента лебетина и (iii) пептидом ANP, пропептидом ANP или производным пептида ANP, например, описанными выше в разделе «Натрийуретические пептиды».

Указанная поверхность - это, как правило, поверхность трубы, судна, имплантируемого устройства перед имплантацией.

Применение указанной композиции на указанной поверхности может осуществляться любыми подходящими техническими средствами в зависимости от состава композиции.

Ниже данное изобретение описывается более подробно на примерах и иллюстрациях.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO Описание Последовательность 1 Аминокислотная последовательность ANP SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY 2 Аминокислотная последовательность уродилатина TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY 3 Аминокислотная последовательность proANP NPMYNAVSNADLMDFKNLLDHLEEKMPLEDEVVPPQVLSEPNEEAGAALSPLPEVPPWTGEVSPAQRDGGALGRGPWDSSDRSALLKSKLRALLTAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY 4 Аминокислотная последовательность preproANP MSSFSTTTVSFLLLLAFQLLGQTRANPMYNAVSNADLMDFKNLLDHLEEKMPLEDEVVPPQVLSEPNEEAGAALSPLPEVPPWTGEVSPAQRDGGALGRGPWDSSDRSALLKSKLRALLTAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY 5 Аминокислотная последовательность
остеокрина SFSGFGSPLDRLSAGSVDHKGKQRKVVDHPKRRFGIPMDRIGRNRLSNSR 6 Аминокислотная последовательность
проостеокрина VDVTTTEAFDSGVIDVQSTPTVREEKSATDLTAKLLLLDELVSLENDVIETKKKRSFSGFGSPLDRLSAGSVDHKGKQRKVVDHPKRRFGIPMDRIGRNRLSNSRG 7 Аминокислотная последовательность
препроостеокрина MLDWRLASAHFILAVTLTLWSSGKVLSVDVTTTEAFDSGVIDVQSTPTVREEKSATDLTAKLLLLDELVSLENDVIETKKKRSFSGFGSPLDRLSAGSVDHKGKQRKVVDHPKRRFGIPMDRIGRNRLSNSRG 8 Аминокислотная последовательность
лебетина 2α GDNKPPKKGPPNGCFGHKIDRIGSHSGLGCNKVDDNKG 9 Аминокислотная последовательность
лебетина 1β DNKPPKKGPPNG

Краткое описание иллюстраций

На фигуре 1 приведен график, показывающий рост P. aeruginosa в присутствии различных концентраций ANP.

Примеры

Пример 1. Влияние ANP (0,1 мкМ) самого по себе на образование биопленки, на сформировавшуюся биопленку P. aeruginosa и на рост P. aeruginosa

Этот пример демонстрирует воздействие ANP на сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa.

Материалы и методы

Испытываемые вещества, штаммы и культуры бактерий

Штамм дикого типа P. aeruginosa PA14 был предоставлен Гарвардской медицинской школой (Бостон, шт. Массачусетс, США) (Liberati et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 2833-2838).

Штаммы бактерий культивировали при температуре 37°C в среде Луриа-Бертани (LB) при встряхивании.

Образование биопленки P. aeruginosa в динамических условиях

Клетки P. aeruginosa, прекультивированные в среде LB при температуре 37°C в течение 3 часов, инокулировали в среду LB до OD₆₀₀ = 0,08 и субкультивировали в течение 2 часов.

Через 2 часа после начала культивирования, этот момент соответствовал середине экспоненциальной фазы роста бактерий, добавляли ANP (Calbiochem Merck). Конечную плотность бактерий и отсутствие контаминации контролировали путем посева.

Биопленки сформировали в динамических условиях при температуре 37°C в трехканальной проточной камере, как описано в работе Bazire et al. (2010) J. Bacteriol. 192:3001-3010. Вкратце проделывали следующее: из 18-часовой прекультуры готовили суспензию бактерии с OD₆₀₀=0,08 в стерильном физиологическом солевом растворе и вносили в каждый канал проточной камеры. Бактерий оставляли на 2 часа при температуре 37°C в статических условиях (не проточных), так что они прикреплялись к предметному стеклу. Затем изучали образование биопленки при потоке среды LB (2,5 мл/ч) в течение 24 часов при температуре 37°C.

Разрушение биопленки P. aeruginosa в динамических условиях

Чтобы изучить влияние ANP на уже сформировавшиеся за 24 ч биопленки, в разные каналы проточной камеры вносили 300 мкл раствора ANP (0,1 мкМ) либо в качестве контроля 300 мкл стерильной особо чистой воды. Обработка продолжалась 2 ч при температуре 37°C в статических условиях. После этого возобновляли поток среды на 15 мин, чтобы удалить клетки, отделившиеся от биопленки в процессе обработки.

Биопленки после обработки флуорохромом SYTO9 Green (Invitrogen) в концентрации 5 мкМ в течение 15 мин изучали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss LSM710 (Zeiss). Получали трехмерные изображения различных слоев биопленки; в каждом канале проточной камеры делали по меньшей мере три изображения с разных точек. Файлы каждого изображения анализировали с помощью программы COMSTAT (Heydorn et al. (2000) Microbiology 146 :2395-2407); для определения средних и максимальных значений толщины биопленок и объемной концентрации бактерий анализировали по три изображения, полученных в по меньшей мере в трех независимых опытах.

Культура клеток

Линию A549 человеческих эпителиальных клеток легких типа II (ATCC-CCL185TM, Американская коллекция типовых культур, Манассас, шт. Вирджиния, США) культивировали в среде DMEM (Lonza) с добавлением 10% плодной бычьей сыворотки (FCS) и 1% пенициллина и стрептомицина (Penistrep, Lonza) при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO₂. В условиях стандартного клеточного культивирования клетки высевали в колбы объемом 25 мл и использовали при конфлюэнтности 80%.

Для проверки цитотоксичности перед использованием клетки высевали на 24-луночные планшеты до конечной плотности 3×10⁵ клеток на одну лунку и культивировали в течение 48 часов. Как минимум за 24 ч до исследования заражения клетки лишали поступления антибиотиков и фетальной телячьей сыворотки за счет добавления среды без свежей сыворотки.

Определение высвобождения цитозольной лактатдегидрогеназы клетками А549

Лактатдегидрогеназа (LDH) - стабильный цитозольный фермент, высвобождающийся в культуральную среду после лизиса клетки и потому являющийся маркером гибели клеток. Определяли количество LDH, высвобождающейся из эукариотических клеток, в присутствии бактерий при воздействии ANP (в концентрации 1 мкМ-10 нМ) или без него, измеряя ферментативную активность LDH с помощью набора Cytotox 96 (Promega, Шарбоньер, Франция). Клетки A549 инкубировали в течение 6 часов без бактерий (контроль) или с P. aeruginosa PA14 (предварительно обработанными ANP) с множественностью заражения 10. Чтобы определить максимальное количество LDH, которое потенциально может выделиться из клеток А549 в условиях эксперимента (100%-ное высвобождение LDH), использовали лизирующий буфер, состоящий из раствора тритон X-100 (9% водный раствор). Чтобы установить базовый уровень «шума» для исключения вклада культуральной среды, использовали культуральную среду саму по себе и определяли 0%-ное высвобождение LDH. Относительное процентное количество LDH, высвобождаемой клеточной популяцией, определяли по формуле

,

где OD_sample - OD образца.

Такой тест был достаточно чувствителен, чтобы измерить концентрацию LDH, эквивалентную лизису 1% клеточной популяции.

Результаты

Влияние ANP на уже сформировавшуюся биопленку P. aeruginosa

Авторы данного изобретения исследовали потенциальную активность ANP в отношении уже сформировавшейся биопленки P. aeruginosa. Для этого через 24 ч после образования биопленки P. aeruginosa в динамической системе бактерии подвергали воздействию ANP в концентрации 0,1 мкМ в течение 2 ч. В этих условиях наблюдалось диспергирование биопленки, строение которой нарушалось после контактирования с ANP, и отсутствие грибовидных структур, наблюдавшихся в контрольных условиях и характерных для биопленок P. aeruginosa. После двухчасового воздействия ANP в концентрации 0,1 мкМ биомасса бактерий уменьшалась на 81,4 ± 4,1% (P<0,001) по сравнению с биомассой, помещенной в контрольные условия. Параллельно авторы изобретения наблюдали значительное уменьшение толщины биопленки после двухчасового воздействия ANP.

Сходные результаты были получены при воздействии ANP на сформировавшуюся биопленку в течение 30 мин. В этих условиях авторы изобретения наблюдали существенное диспергирование биопленки с помощью ANP, и характерные для биопленок P. aeruginosa грибовидные структуры, обнаруженные в контрольных условиях, после воздействия ANP исчезли. Оставшаяся биомасса бактерий была уменьшена на 80,2 ± 2,0% (P<0,05) после воздействия ANP (30 минут) по сравнению с биомассой, содержавшейся в контрольных условиях.

Влияние ANP на рост P. aeruginosa

Чтобы определить возможное прямое влияние ANP на рост P. aeruginosa, авторы данного изобретения изучили действие ANP в концентрации 1 мкМ и 0,1 мкМ на / рост P. aeruginosa P14 в жидкой среде. Ни в одной из протестированных концентраций ANP не влиял на рост бактерий, как показано на фиг. 1.

Таким образом, действие ANP на биопленки нельзя отнести на счет его влияния на рост бактерий.

Влияние ANP на обусловленную бактериями цитотоксичность для культивируемых легочных клеток человека

Определяли цитотоксическую активность P. aeruginosa, подвергнутых воздействию различных концентраций ANP (1 мкМ-10 нМ), в отношении легочных клеток A549. По наблюдениям авторов данного изобретения, в любой концентрации ANP не влиял на цитотоксическую активность P. aeruginosa в отношении легочных клеток, что продемонстрировано в приведенной ниже таблице.

Условия опыта % LDH
(мертвые клетки) PA14 без воздействия 56,4 ± 5,5 PA14 + ANP (10^-6 M) 58,9 ± 5,8 PA14 + ANP (10^-7 M) 53,5 ± 5,3 PA14 + ANP (10^-8 M) 54,5 ± 5,5

Выводы

Таким образом, в этом примере авторы данного изобретения показали, что ANP, использованный в концентрации 0,1 мкМ, полностью предотвращает образование биопленки P. aeruginosa и сильно разрушает уже сформировавшуюся биопленку P. aeruginosa.

Долгое время исследования по предотвращению образования биопленок были сосредоточены на начальных стадиях образования биопленки, в том числе на ее прикреплении к поверхности и созревании. Концентрации веществ, требующиеся для подавления образования биопленки, как правило, намного ниже, чем те, которые нужны для разрушения или нарушения уже сформировавшейся биопленки.

Основное преимущество ANP, доказанное авторами данного изобретения в настоящем документе, состоит в том, что применение этого вещества в концентрации 0,1 мкМ в течение 2 часов и даже 30 минут достаточно для диспергирования около 80% структуры биопленки. Это особенно интересно с точки зрения использования синергического эффекта натрийуретического пептида с антибиотиками.

Это влияние ANP на биопленки P. aeruginosa больше, чем подавляющее влияние CNP на образование, которое наблюдалось ранее, и дает дополнительные преимущества, поскольку CNP немного увеличивает вирулентность бактерий и цитотоксичность за счет активации бактериальной системы чувства кворума.

Авторы данного изобретения показали, что хотя ANP сильное влияет на биопленки, он не вызывает гибель бактерий и не повышает цитотоксичность P. aeruginosa в отношении культивируемых легочных клеток человека. Тот факт, что бактерии не гибнут, представляет особый интерес, так как за счет этого предотвращается возникновение резистентных штаммов.

Пример 2. Дозозависимый эффект ANP на уже сформированные биопленки P. aeruginosa

Этот пример демонстрирует, что действие отдельно взятого ANP на сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa зависит от его дозы и наблюдается, начиная с концентрации 0,3 нг/мл.

Материалы и методы

В этом примере использовались такие же материалы и методы, какие описаны выше в примере 1 (разрушение биопленки P. aeruginosa в динамических условиях).

Результаты

Авторы данного изобретения исследовали потенциальную активность ANP в отношении сформировавшейся биопленки P. aeruginosa при различных концентрациях ANP: 0,3 нг/мл; 3 нг/мл и 30 нг/мл - по сравнению с активностью, наблюдавшейся в примере 1 ([ANP] = 300 нг/мл или 0,1 мкМ), после продолжительного воздействия в течение 2 часов или 30 минут.

По наблюдениям авторов данного изобретения, значительное диспергирование биопленки под действием ANP происходило при его наименьшей концентрации 0,3 нг/мл и при ее превышении и уже через 30 мин.

Полученные результаты представлены в приведенной ниже таблице

Условия опыта Объемная концентрация бактерий
(2 ч)
(мкм³/мкм²) Подавление (%)
(2 ч) Объемная концентрация бактерий
(30 мин)
(мкм³/мкм²) Подавление (%)
(30 мин) PA14
без обработки 21,1 22,19 ANP (0,3 нг/мл) 10,6 45,1 (**) 9,5 57,5 (*) ANP (3 нг/мл) 6,3 65,9 (***) 8,8 59,1 (*) ANP (30 нг/мл) 4,4 72,5 (***) 6,7 69,0 (*) ANP(300 нг/мл) 4,9 81,4 (***) 4,4 80,2 (*)

: Среднее значение из всех контролей; *: p < 0,05 в сравнении с биопленкой без обработки; **: p < 0,01 в сравнении с биопленкой без обработки; ***: p < 0,001 в сравнении с биопленкой без обработки.

Таким образом, этот пример подтверждает преимущества ANP, который активен против биопленок при весьма низкой концентрации и при ее превышении и начиная с воздействия в течение 30 мин.

Пример 3. Влияние остеокрина на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa

Этот пример демонстрирует действие остеокрина самого по себе в дозе 10^-8 M на сформировавшуюся биопленку P. aeruginosa.

Материалы и методы

В этом примере использовались такие же материалы и методы, какие описаны выше в примере 1 (разрушение биопленки P. aeruginosa в динамических условиях).

Результаты

Авторы данного изобретения исследовали потенциальную активность остеокрина в отношении уже сформировавшейся биопленки P. aeruginosa в концентрации 10^-8 M и после воздействия в течение 2 часов.

По наблюдениям авторов данного изобретения, под действием остеокрина происходило сильное и значительное диспергирование биопленки.

Условия опыта Объемная концентрация (2 ч) (мкм³/мкм²) Подавление (%) (2 ч) PA14 без обработки
(контроль) 29,8 Остеокрин (10^-8 M) 12,1 59,4 (***)

Пример 4. Влияние пептида лебетина 2α на уже сформировавшиеся биопленки

P. aeruginosa

Этот пример демонстрирует действие пептида лебетина L2 альфа самого по себе в дозе 10^-8 M на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa.

Материалы и методы

В этом примере использовались такие же материалы и методы, какие описаны выше в примере 1 (разрушение биопленки P. aeruginosa в динамических условиях).

Результаты

Авторы данного изобретения исследовали потенциальную активность пептида лебетина L2 альфа в отношении образовавшейся биопленки P. aeruginosa в концентрации 10^-8 M и после воздействия в течение 2 часов.

По наблюдениям авторов данного изобретения, под действием пептида лебетина L2 альфа происходило сильное и значительное диспергирование биопленки.

Условия опыта Объемная концентрация
(2 ч)
(мкм³/мкм²) Подавление (%)
(2 ч) PA14 без обработки
(контроль) 29,7 Лебетин L2 альфа (10^-8 M) 8,9 70,2 (***)

Пример 5. Влияние пептида лебетина 1β на уже сформировавшуюся биопленку P. aeruginosa

Этот пример демонстрирует действие пептида лебетина L1 бета самого по себе в концентрации 10^-8 M на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa.

Материалы и методы

В этом примере использовались такие же материалы и методы, какие описаны выше в примере 1 (разрушение биопленки P. aeruginosa в динамических условиях).

Результаты

Авторы данного изобретения исследовали потенциальную активность пептида лебетина L1 бета в отношении уже сформировавшейся биопленки P. aeruginosa в концентрации 10^-8 M и после воздействия в течение 2 часов.

По наблюдениям авторов данного изобретения, под действием пептида лебетина L1 бета происходило значительное диспергирование биопленки.

Условия опыта Объемная концентрация
(2 ч)
(мкм³/мкм²) Подавление (%)
(2 ч) PA14 без обработки
(контроль) 21,0 Лебетин L1 бета (10^-8 M) 6,9 67,0

Пример 6. Влияние комбинации ANP и тобрамицина на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa

Этот пример демонстрирует синергическое действие комбинации ANP + тобрамицин на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa.

Материалы и методы

В этом примере использовались такие же материалы и методы, какие описаны выше в примере 1, со следующими особенностями.

Чтобы изучить действие ANP в комбинации с тобрамицином на сформировавшиеся за 24 ч биопленки P. aeruginosa (как описано в примере 1), 300 мкл смеси ANP (1 нМ) и тобрамицина (50 мкг/мл) или 300 мкл одного только тобрамицина (контрольные условия) вносили в разные каналы проточной ячейки. Обработка сформировавшейся биопленку продолжалось 2 ч при температуре 37°C в статических условиях. По истечении этих двух часов поток среды возобновляли на 15 мин, чтобы удалить клетки, отделившиеся от биопленки в результате воздействия этой обработки.

Затем биопленки изучали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, как описано в примере 1. Для определения целостности клеточной мембраны бактерий использовали смесь флуорохрома SYTO 9 Green в концентрации 5 мкМ и пропидия иодида (PI) в концентрации 0,3 мкМ (Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit, Invitrogen).

Результаты

Авторы данного изобретения исследовали потенциальную активность комбинации ANP (10^-9 M; 3 нг/мл) и тобрамицина (50 кг/мл или 10 мкг/мл) в отношении образовавшейся биопленки P. aeruginosa.

Определяли объемную концентрацию биопленки, и результаты представлены в приведенной ниже таблице.

Условия опыта Объемная концентрация
(мкм³/мкм²) Подавление (%) PA14 без обработки 13,5 Тобрамицин (50 мкг/мл) 3,26 75,9 ANP (10^-9 M) 4,53 66,4 Тобрамицин (50 мкг/мл)+ ANP (10^-9 M) 0,5 96,3 Условия опыта Объемная концентрация
(мкм³/мкм²) Подавление (%) PA14 без обработки 13,5 Тобрамицин (10 мкг/мл) 2,9 78,5 ANP (10^-9 M) 4,53 66,4 Тобрамицин (10 мкг/мл)+ ANP (10^-9 M) 0,7 94,8

По наблюдениям авторов данного изобретения, в этих условиях под действием комбинации ANP (1 нМ) + тобрамицин (50 мкг/мл), происходило значительное диспергирования биопленки, которые действовали синергически с разрушением 96,3% биопленки. Сходным образом комбинация ANP (1 нМ) + тобрамицин (10 мкг/мл) действовала синергически с разрушением 94,8% биопленки.

Пример 7. Влияние комбинации ANP и ципрофлоксацина

на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa

Этот пример демонстрирует синергическое действие ANP в комбинации с ципрофлоксацином на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa.

Материалы и методы

Чтобы определить действие ANP в комбинации с ципрофлоксацином на сформировавшиеся за 24 ч биопленки P. aeruginosa (как описано в примере 1), 300 мкл смеси ANP (10 нМ) и ципрофлоксацина (0,01 мкг/мл или 0,04 мкг/мл) или же 300 мкл одного только ципрофлоксацина (контроль) вносили в разные каналы проточной ячейки. Обработка сформировавшейся биопленки продолжалось 2 ч при температуре 37°C в статических условиях. По истечении этих двух часов поток среды возобновляли на 15 мин, чтобы удалить клетки, которые могли отделиться от биопленки в результате воздействия обработки.

Затем биопленки в течение 15 мин обрабатывали флуорохромом SYTO 9 Green (Invitrogen) в концентрации 5 мкМ, после чего изучали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, как описано в примере 1.

Результаты

Авторы данного изобретения исследовали потенциальную активность комбинации ANP (10^-8 M; 30 нг/мл) и ципрофлоксацина (0,01 мкг/мл или 0,04 мкг/мл) в отношении образовавшейся биопленки P. aeruginosa.

Определяли объемную концентрацию биопленки, и результаты представлены в приведенной ниже таблице.

Условия опыта Объемная концентрация
(мкм³/мкм²) Подавление (%) PA14 без обработки 12,6 Ципрофлоксацин (0,04 мкг/мл) 0,7 99,3 Ципрофлоксацин (0,04 мкг/мл) + ANP (10^-8 M) 0,5 99,5 Условия опыта Объемная концентрация
(мкм³/мкм²) Подавление (%) PA14 без обработки 15,5 Ципрофлоксацин (0,01 мкг/мл) 1,55 90,0 Ципрофлоксацин (0,01 мкг/мл) + ANP (10^-8 M) 0,47 97,0

По наблюдениям авторов данного изобретения, в этих условиях под действием комбинации ANP + ципрофлоксацин происходила даже более значительное диспергирование биопленки, чем под действием одного только ципрофлоксацина.

Таким образом, комбинация с ANP позволяет получить 97% разрушение биопленки в сочетании с концентрацией ципрофлоксацина 0,01 мкг/мл.

Пример 8. Влияние комбинации ANP и колистина на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa

Этот пример демонстрирует синергическое действие комбинации ANP + колистин на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa.

Материалы и методы

Чтобы изучить действие ANP в комбинации с колистином на сформировавшиеся за 24 ч биопленки P. aeruginosa (как описано в примере 1), 300 мкл смеси ANP (10 нМ) и колистина (1 мкг/мл) или же 300 мкл одного только колистина (контрольные условия) вносили в разные каналы проточной ячейки. Обработка сформировавшейся биопленки продолжалось 2 ч при температуре 37°C в статических условиях. По истечении этих двух часов поток среды возобновляли на 15 мин, чтобы удалить клетки, которые могли отделиться от биопленки в результате воздействия обработки.

Затем биопленки в течение 15 мин обрабатывали флуорохромом SYTO 9 Green (Invitrogen) в концентрации 5 мкМ, после чего изучали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, как описано в примере 1.

Результаты

Авторы данного изобретения исследовали потенциальную разрушающую активность комбинации ANP (10^-8 M; 30 нг/мл) и колистина (1 мкг/мл) в отношении образовавшейся биопленки P. aeruginosa.

Определяли объемную концентрацию биопленки, и результаты представлены в приведенной ниже таблице.

Условия опыта Объемная концентрация
(мкм³/мкм²) Подавление (%) PA14 без обработки 18,5 ANP (10^-8 M) 4,9 73,5 Колистин (1 мкг/мл) 2,1 88,6 Колистин (1 мкг/мл)+ ANP (10^-8 M) 0,5 97,3

По наблюдениям авторов данного изобретения, в этих условиях под действием комбинации ANP + колистин (1 мкг/мл) происходило даже более значительное диспергирование биопленки, чем под действием одного только колистина или одного только ANP.

Таким образом, комбинация с ANP позволяет получить разрушение биопленки на 97,3 % в сочетании с концентрацией колистина 1 мкг/мл.

Пример 9. Влияние комбинации ANP и имипенема на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa

Этот пример демонстрирует синергическое действие комбинации ANP + имипенема на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa.

Материалы и методы

Чтобы определить действие ANP в комбинации с имипенемом на сформировавшиеся за 24 ч биопленки P. aeruginosa (как описано в примере 1), 300 мкл смеси ANP (10 нМ) и имипенема (0,5 мкг/мл) или же 300 мкл одного только имипенема (контроль) вносили в разные каналы проточной ячейки. Обработка сформировавшейся биопленки продолжалось 2 ч при температуре 37°C в статических условиях. По истечении этих двух часов поток среды возобновляли на 15 мин, чтобы удалить клетки, которые могли отделиться от биопленки в результате воздействия обработки.

Затем биопленки в течение 15 мин обрабатывали флуорохромом SYTO 9 Green (Invitrogen) в концентрации 5 мкМ, после чего изучали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, как описано в примере 1.

Результаты

Авторы данного изобретения исследовали потенциальную активность комбинации ANP (10^-8 M; 30 нг/мл) и имипенема (0,5 мкг/мл) в отношении уже сформировавшихся биопленок P. aeruginosa.

Определяли объемную концентрацию биопленки, и результаты представлены в приведенной ниже таблице.

Условия опыта Объемная концентрация
(мкм³/мкм²) Подавление (%) PA14 без обработки 28,0 ANP (10^-8 M) 6,9 75,4 Имипенем (0,5 мкг/мл) 7,0 75,0 Имипенем (0,5 мкг/мл)+ ANP (10^-8 M) 0,6 97,9

По наблюдениям авторов данного изобретения, в этих условиях под действием комбинации ANP + имипенем (0,5 мкг/мл) происходило даже более значительное диспергирование биопленки, чем под действием одного только имипенема или одного только ANP.

Таким образом, комбинация с ANP позволяет получить 97,9 % разрушения биопленки в сочетании с концентрацией имипенема 0,5 мкг/мл.

Пример 10. Влияние комбинации ANP и полимиксина В на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa

Этот пример демонстрирует синергическое действие комбинации ANP + полимиксин В на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa.

Материалы и методы

Чтобы изучить действие ANP в комбинации с полимиксином В на сформировавшиеся за 24 ч биопленки P. aeruginosa (как описано в примере 1), 300 мкл смеси ANP (10 нМ) и полимиксина В (4 мкг/мл) или же 300 мкл одного только полимиксина В (контроль) вносили в разные каналы проточной ячейки. Обработка сформировавшейся биопленки продолжалось 2 ч при температуре 37°C в статических условиях. По истечении этих двух часов поток среды возобновляли на 15 мин, чтобы удалить клетки, которые могли отделиться от биопленки в результате воздействия обработки.

Затем биопленки в течение 15 мин обрабатывали флуорохромом SYTO 9 Green (Invitrogen) в концентрации 5 мкМ, после чего изучали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, как описано в примере 1.

Результаты

Авторы данного изобретения исследовали потенциальную активность комбинации ANP (10^-8 M; 30 нг/мл) и полимиксина В (4 мкг/мл) в отношении образовавшейся биопленки P. aeruginosa.

Определяли объемную концентрацию биопленки, и результаты представлены в приведенной ниже таблице.

Условия опыта Объемная концентрация
(мкм³/мкм²) Подавление (%) PA14 без обработки 18,2 ANP (10^-8 M) 4,5 75,3 Полимиксин В (4 мкг/мл) 7,4 59,3 Полимиксин В (4 мкг/мл)+ ANP (10^-8 M) 3,0 83,5

По наблюдениям авторов данного изобретения, в этих условиях под действием комбинации ANP + полимиксин В (4 мкг/мл) происходило даже более значительное диспергирование биопленки, чем под действием одного только полимиксина В или одного только ANP.

Следовательно, комбинация с ANP позволяет получить 83,5 % разрушения биопленки в сочетании с концентрацией полимиксина В 4 мкг/мл.

Пример 11. Эффект последовательного воздействия ANP и тобрамицина на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa

Этот пример демонстрирует эффект последовательного воздействия - сначала ANP, затем тобрамицина - на уже сформировавшиеся биопленки P. aeruginosa.

Материалы и методы

В этом примере использовались такие же материалы и методы, какие описаны выше в примере 1, со следующими особенностями.

Чтобы определить эффект последовательного воздействия ANP и тобрамицина на сформировавшиеся за 24 ч биопленки P. aeruginosa (как описано в примере 1), 300 мкл ANP (1 нМ) (контроль) вносили в два канала проточной ячейки. Обработка биопленки продолжалось 2 ч при температуре 37°C в статических условиях. По истечении этих двух часов поток среды возобновляли на 15 мин, чтобы удалить клетки, которые могли отделиться от биопленки в результате воздействия обработки. Затем в один из тех двух каналов проточной ячейки, в которые вносили ANP, добавляли 300 мкл тобрамицина (50 мкг/мл), а в другой - 300 мкл стерильной воды, очищенной с помощью системы milliQ (контрольные условия). Эту вторую обработку биопленки также проводили в течение 2 ч при температуре 37°C в статических условиях. По истечении этих двух часов поток среды возобновляли на 15 мин, чтобы удалить клетки, которые могли отделиться от биопленки в результате воздействия обработки.

Затем биопленки 15 мин обрабатывали флуорохромом SYTO 9 Green (Invitrogen) в концентрации 5 мкМ, после чего изучали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, как описано в примере 1.

Результаты

Авторы данного изобретения исследовали потенциальную активность последовательного воздействия ANP и тобрамицина: сначала ANP (10^-9 M; 3 нг/мл), затем тобрамицина (50 кг/мл или 10 мкг/мл) - в отношении образованной биопленки P. aeruginosa.

Определяли объемную концентрацию биопленки, и результаты представлены в приведенной ниже таблице.

Условия опыта Объемная концентрация
(мкм³/мкм²) Подавление (%) PA14 без обработки 13,1 ANP (10^-9 M) 4,1 68,7 ANP (10^-9 M) (2 ч),
затем тобрамицин (50 мкг/мл) (2 ч) 0,7 94,7

По наблюдениям авторов данного изобретения, в этих условиях в результате последовательной обработки двумя агентами: сначала ANP (10^-9 M; 2 ч), затем тобрамицином (50 мкг/мл; 2 ч) - происходило даже более значительное диспергирование биопленки, чем в результате воздействия одного только ANP.

В результате последовательного воздействия ANP (2ч) и затем тобрамицина (2 ч) биопленка разрушалась на 94,7%.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> UNIVERSITE DE ROUEN-NORMANDIE

<120> OSTEOCRIN, LEBETIN OR ANP FOR DESTROYING BACTERIAL BIOFILMS

<130> BET20P1919

<150> FR19 08511

<151> 2019-07-26

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

20 25

<210> 2

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met

1 5 10 15

Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

20 25 30

<210> 3

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys

1 5 10 15

Asn Leu Leu Asp His Leu Glu Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val

20 25 30

Val Pro Pro Gln Val Leu Ser Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala

35 40 45

Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro

50 55 60

Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser

65 70 75 80

Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala

85 90 95

Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg

100 105 110

Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

115 120 125

<210> 4

<211> 151

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Phe Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val

20 25 30

Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu

35 40 45

Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser

50 55 60

Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val

65 70 75 80

Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala

85 90 95

Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys

100 105 110

Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser

115 120 125

Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu

130 135 140

Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

145 150

<210> 5

<211> 50

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Ser Phe Ser Gly Phe Gly Ser Pro Leu Asp Arg Leu Ser Ala Gly Ser

1 5 10 15

Val Asp His Lys Gly Lys Gln Arg Lys Val Val Asp His Pro Lys Arg

20 25 30

Arg Phe Gly Ile Pro Met Asp Arg Ile Gly Arg Asn Arg Leu Ser Asn

35 40 45

Ser Arg

50

<210> 6

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Val Asp Val Thr Thr Thr Glu Ala Phe Asp Ser Gly Val Ile Asp Val

1 5 10 15

Gln Ser Thr Pro Thr Val Arg Glu Glu Lys Ser Ala Thr Asp Leu Thr

20 25 30

Ala Lys Leu Leu Leu Leu Asp Glu Leu Val Ser Leu Glu Asn Asp Val

35 40 45

Ile Glu Thr Lys Lys Lys Arg Ser Phe Ser Gly Phe Gly Ser Pro Leu

50 55 60

Asp Arg Leu Ser Ala Gly Ser Val Asp His Lys Gly Lys Gln Arg Lys

65 70 75 80

Val Val Asp His Pro Lys Arg Arg Phe Gly Ile Pro Met Asp Arg Ile

85 90 95

Gly Arg Asn Arg Leu Ser Asn Ser Arg Gly

100 105

<210> 7

<211> 133

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Met Leu Asp Trp Arg Leu Ala Ser Ala His Phe Ile Leu Ala Val Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Trp Ser Ser Gly Lys Val Leu Ser Val Asp Val Thr Thr

20 25 30

Thr Glu Ala Phe Asp Ser Gly Val Ile Asp Val Gln Ser Thr Pro Thr

35 40 45

Val Arg Glu Glu Lys Ser Ala Thr Asp Leu Thr Ala Lys Leu Leu Leu

50 55 60

Leu Asp Glu Leu Val Ser Leu Glu Asn Asp Val Ile Glu Thr Lys Lys

65 70 75 80

Lys Arg Ser Phe Ser Gly Phe Gly Ser Pro Leu Asp Arg Leu Ser Ala

85 90 95

Gly Ser Val Asp His Lys Gly Lys Gln Arg Lys Val Val Asp His Pro

100 105 110

Lys Arg Arg Phe Gly Ile Pro Met Asp Arg Ile Gly Arg Asn Arg Leu

115 120 125

Ser Asn Ser Arg Gly

130

<210> 8

<211> 38

<212> PRT

<213> Macrovipera lebetina

<400> 8

Gly Asp Asn Lys Pro Pro Lys Lys Gly Pro Pro Asn Gly Cys Phe Gly

1 5 10 15

His Lys Ile Asp Arg Ile Gly Ser His Ser Gly Leu Gly Cys Asn Lys

20 25 30

Val Asp Asp Asn Lys Gly

35

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> Macrovipera lebetina

<400> 9

Asp Asn Lys Pro Pro Lys Lys Gly Pro Pro Asn Gly

1 5 10

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Раскрыто применение натрийуретического пептида, выбранного из группы, состоящей из остеокрина, лебетина и пептида ANР, для терапевтического лечения бактериальной инфекции, связанной с наличием бактериальной биопленки, у субъекта, где указанный натрийуретический пептид разрушает указанную бактериальную биопленку, где указанная бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную бактерией рода Pseudomonas. Также представлены: фармацевтическая композиция для терапевтического лечения бактериальной инфекции, применение фармацевтической антибактериальной комбинации, включающей натрийуретический пептид, выбранный из группы, состоящей из остеокрина, лебетина и пептида ANР, и антибиотик и применение in vitro или ex vivo натрийуретического пептида, выбираемого из группы, состоящей из остеокрина, лебетина и пептида ANР, для диспергирования бактериальной биопленки, при этом указанная бактериальная биопленка содержит по меньшей мере одну бактерию рода Pseudomonas. Изобретение может быть использовано для лечения бактериальной инфекции, связанной с наличием бактериальной биопленки у субъекта, где натрийуретический пептид разрушает бактериальную биопленку, и где указанная бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную бактерией рода Pseudomonas. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 11 пр.

1. Применение натрийуретического пептида, выбранного из группы, состоящей из (i) остеокрина, (ii) лебетина и (iii) пептида ANР, для терапевтического лечения бактериальной инфекции, связанной с наличием бактериальной биопленки, у субъекта, где указанный натрийуретический пептид разрушает указанную бактериальную биопленку, где указанная бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную бактерией рода Pseudomonas.

2. Применение по п. 1, в котором указанная бактериальная инфекция является инфекцией Pseudomonas aeruginosa.

3. Применение по любому из пп. 1, 2, в котором указанный субъект страдает хронической патологией дыхательной системы, в частности муковисцидозом.

4. Применение по любому из пп. 1, 2, в котором у указанного субъекта имеется имплантат или протез, либо обширные ожоги (жертва ожогов), либо наружная инфекция.

5. Применение по любому из пп. 1-4, в котором указанный натрийуретический пептид применяют в комбинации с антибиотиком.

6. Применение по п. 5, в котором указанный антибиотик является аминогликозидным антибиотиком или хинолоном.

7. Применение по любому из пп. 1-6, в котором указанный натрийуретический пептид применяют в комбинации с по меньшей мере одним другим натрийуретическим пептидом.

8. Фармацевтическая композиция для терапевтического лечения бактериальной инфекции, связанной с наличием бактериальной биопленки, которая представляет собой инфекцию, вызванную бактерией рода Pseudomonas, содержащая (A) лебетин и (B) антибиотик.

9. Применение фармацевтической антибактериальной комбинации, включающей (A) натрийуретический пептид, выбранный из группы, состоящей из (i) остеокрина, (ii) лебетина и (iii) пептида ANР, и (B) антибиотик, для одновременного, раздельного или последовательного применения при терапевтическом лечении бактериальной инфекции, связанной с наличием бактериальной биопленки, у субъекта, где указанный натрийуретический пептид разрушает указанную бактериальную биопленку, и где указанная бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную бактерией рода Pseudomonas.

10. Применение in vitro или ex vivo натрийуретического пептида, выбираемого, из группы, состоящей из (i) остеокрина, (ii) лебетина и (iii) пептида ANР, для диспергирования бактериальной биопленки, при этом указанная бактериальная биопленка содержит по меньшей мере одну бактерию рода Pseudomonas.