МЕЖВИДОВАЯ ЛИНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ОВЦЫ (Ovis aries) С ЛИМФОЦИТАМИ КРОЛИКА (ПО-TK×ЛК) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2007 года по МПК C12N5/06 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению клеточных гибридов, используемых при вирусологических и биотехнологических исследованиях.

Методы гибридизации соматических клеток в настоящее время широко применяются для решения многих проблем биологии, медицины и ветеринарии. Гибридные линии клеток используются при исследовании механизмов клеточной дифференцировки, взаимодействия ядра и цитоплазмы для изучения взаимодействия между вирусами и клетками хозяев.

Известен штамм внутривидовых гибридных клеток почки овцы (OVIS ARIES) со спленоцитами овцы (ПО-ТК^-×СО) для культивирования вирусов и агента скрепи.

Морфологические признаки: межвидовой гибридный штамм представлен преимущественно клетками эпителиоподобного типа. Наряду с этим до 10-20% клеточной популяции составляют клетки лимфоидного типа, округлой формы, лежащие группами, с плотным ядром и узким ободком цитоплазмы. Пик митотической активности - 32-35%₀, наблюдается через 72 часа культивирования; индекс пролиферации составил 3,2-4,2. Интервал изменчивости хромосом составил от 13 до 72 хромосом, модальный класс представлен 48 хромосомами.

Культуральные свойства: межвидовой гибридный штамм культивируется в среде Игла MEM, Игла ДМЕМ с добавлением 4-5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов трипсина 0,25% и Версена 0,02% в соотношении 1:9, с коэффициентом пересева 1:4-1:5. Монослой формируется на 3-4 сутки при посевной концентрации 70-80 тыс. кл./мл.

Криоконсервация штамма: криоконсервацию штамма осуществляют по 2-ступенчатому методу. Температуру снижают по 1-2°С в минуту до - 30°С, а далее до - 70°С по 3-5°С в минуту. По достижении температуры - 70°С ампулу с клетками помещают в жидкий азот. Криозащитную среду готовят по следующей прописи, %:

ДМSO - 10

Сыворотка эмбрионов - 40-30

Среда Игла MEM - до 100

Гибридный штамм ПО ТК^-×СО чувствителен к вирусу ринопневмонии лошадей, вирусу инфекционного ринотрахеита, латентному герпес-вирусу крупного рогатого скота (1).

В задачу исследований входило - получить гибридный штамм лимфоцитов кролика, обладающий высокой чувствительностью к патогенным вирусам крупного рогатого скота.

Предложенный штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы с лимфоцитами кролика (ПО-ТК^-×ЛК) получен путем слияния не размножающихся в культуре лимфоцитов кролика с перевиваемым мутантными клетками овцы ПО-ТК^- методом многошаговой селекции.

Штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы (Ovis aries) с лимфоцитами кролика назван ПО-ТК^-×ЛК депонирован 20 мая 2004 г. в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №62.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами:

Морфологические признаки: межвидовой гибридный штамм состоит из 2 популяций клеток: эпителиоподобных, напоминающих клетки исходной мутантной культуры, и лимфоцитоподобных, округлых с плотным ядром и узким ободком цитоплазмы, характерных для лимфоцитов. Полученная культура обладает высокой митотической активностью - 50-54%₀, наблюдающейся на вторые сутки культивирования; индекс пролиферации составил 3,2-4,0. Число хромосом в метафазных пластинках составило от 88 до 120.

Культуральные свойства: клетки активно растут и размножаются на синтетических питательных средах с добавлением сыворотки крупного рогатого скота. Межвидовой гибридный штамм культивируется в среде Игла MEM, Игла ДМЕМ с добавлением 4-5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов трипсина 0,25% и Версена 0,02% в соотношении 1:9, с коэффициентом пересева 1:4-1:5. Монослой формируется на 3-4 сутки при посевной концентрации 70-80 тыс. кл./мл.

Криоконсервация штамма: криоконсервацию штамма осуществляют по 2-ступенчатому методу. Температуру снижают по 1-2°С в минуту до -30°С, а далее до -70°С по 3-5°С в минуту. По достижении температуры -70°С ампулу с клетками помещают в жидкий азот. Криозащитную среду готовят по следующей прописи, %:

ДМSO - 10

Сыворотка эмбрионов - 40-30

Среда Игла MEM - до 100

Чувствительность к патогенным вирусам крупного рогатого скота отражена в таблице 1.

Из приведенных примеров таблицы 1 видно, что новый межвидовой гибридный штамм ПО-ТК^-×ЛК обладает более высокой чувствительностью к вирусам инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота, чем исходная мутантная линия ПО-ТК^- и внутривидовой гибрид почки и спленоцитов овцы ПО-ТК^-×СО. Гибридный штамм ПО-ТК^-×СО чувствителен к вирусам ринопневмонии лошадей, вирусу инфекционного ринотрахеита, латентному герпесу вируса крупного рогатого скота.

Результаты исследований по чувствительности к вирусам клеток ПО-ТК^-×ЛК коррелируют с ранее опубликованными данными по культивированию вируса ринопневмонии в гибридной культуре ПО ТК^-×СО. Таким образом, предлагаемый штамм клеток ПО-ТК^-×ЛК может служить в качестве резервного для выращивания вирусов.

Предложенный штамм апробирован нами с положительным результатом в Лаборатории клеточной биотехнологии ВИЭВ с ноября 2002 года по октябрь 2004 года.

Гибридный штамм ПО-TK^-×ЛК найдет широкое применение в вирусологических исследованиях для культивирования вирусов - диагностических исследований при производстве вирус-вакцин и диагностикумов, например, для накопления вирусов инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, вирусной диареи крупного рогатого скота.

Источники информации

1. Патент RU №2203318, С12N 5/06, 2003 г.

Таблица 1Сравнительная чувствительность штаммов гибридных клеток ПО-ТК^-×ЛК, ПО-ТК^-×СО и перевиваемых мутантных клеток почки овцы ПО-ТК^- к различным патогенным вирусам крупного рогатого скотаВирусКультуры клеток Гибридная ПО-ТК^-×ЛКПО-ТК^-Гибридная ПО-ТК^-×СО Проявление ЦПД вируса (час)Титр вируса ТЦД, 50/млПроявление ЦПД вируса (час)Титр вируса ТЦД, 50/млПроявление ЦПД вируса (час)Титр вируса ТЦД, 50/млЛатентный герпесвирус, "Movar" крупного рогатого скотаНе чувствительнаНе чувствительнаНе чувствительнаНе чувствительна5210⁵Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (BHV-1)2410⁷2410^6,0-6,72410⁶Вирусная диарея - болезнь слизистых (ВД-БС) крупного рогатого скота4810⁵Не чувствительнаНе чувствительнаНе чувствительнаНе чувствительнаПарагрипп-3 (ПГ-3) крупного рогатого скотаНе чувствительнаНе чувствительна7210^5,51610^5,5

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии. Штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы с лимфоцитами кролика (ПО-ТК^-×ЛК) получен путем слияния не размножающихся в культуре лимфоцитов кролика с перевиваемым мутантными клетками овцы ПО-ТК^- методом многошаговой селекции. Штамм обладает высокой чувствительностью к вирусам инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи. Изобретение может быть использовано в вирусологических исследованиях для культивирования вирусов - диагностических исследований и в биотехнологии при производстве вакцин и диагностикумов. 1 табл.

Линия межвидовых гибридных клеток почки овцы (Ovis aries) с лимфоцитами кролика (ПО-TK^-×ЛК) депонирована в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) под №62 для культивирования вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.