ШТАММ МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ОВЦЫ (OVIS ARIES) С БЕТА-КЛЕТКАМИ КРОЛИКА - ПРОДУЦЕНТ ИНСУЛИНА Российский патент 2007 года по МПК C12N5/26 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению клеточных гибридов, используемых при биотехнологических исследованиях.

Методы гибридизации соматических клеток в настоящее время широко применяются для решения многих проблем биологии, медицины, ветеринарии. Гибридные линии клеток используются для решения проблем вирусологии, патологии сельскохозяйственных животных, при исследовании механизмов клеточной дифференцировки, взаимодействия ядра и цитоплазмы.

Существует способ культивирования первичных β-клеток плодов животных, которые являются продуцентами инсулина. Недостатком этого способа является краткосрочная жизнеспособность клеток и необходимость периодического получения материала от животных (новорожденных крольчат) для приготовления первичных культур бета-клеток [1] - аналог.

Известен также штамм культуры клеток щитовидной железы, продуцирующий тиреоидные гормоны: трийодтиронин и тироксин. Штамм обладает следующими свойствами:

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ: Штамм (ЩС) представлен клетками эпителиоподобного типа. Эпителиоподобные клетки полигональной формы с крупным ядром, содержащим 1-3 ядрышка, цитоплазма неоднородна, в большинстве клеток содержатся вакуоли различного типа. Они формируют равномерный монослой с напластованием клеток и формированием структур, напоминающих "фолликулы" ткани щитовидной железы.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА: культура хорошо пассируется, образуя сплошной монослой. Для культивирования клеток используется среда 199 с добавлением 7-10% сыворотки крупного рогатого скота. Посевная концентрация клеток 80-100 тыс./мл, коэффициент пересева 1:4 - 1:5, митотический индекс через 48 часов культивирования составляет 23-25‰. Культура клеток ЩС выделяет в культуральную жидкость два гормона - трийодтиронин и тироксин

КАРИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА: 2n=38, модальный класс хромосом 38, интервал изменчивости на 92 пассаже составил 22-60.

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ШТАММА: концентрация клеток при замораживании составляет 3-5 млн/мл.

Культура клеток ЩС используется для культивирования корона - парвовируса свиней, ринопневмонии лошадей, и может использоваться для наработки тиреоидных гормонов in vitro [2] - прототип.

В задачу наших исследований входило - получить штамм гибридных клеток, обладающий in vitro высокой продукцией инсулина.

Нами получен межвидовой гибридный штамм почки овцы ПО ТК^- с β-клетками поджелудочной железы кролика.

Предложенный гибридный штамм получен путем слияния практически неразмножающихся в культуре β-клеток поджелудочной железы кролика с перевиваемыми мутантньми клетками почки овцы ПО-ТК^-.

Штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы ((Ovis aries) с β-клетками кролика), назван нами ПО-ТК^- × βкр., является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодным для биотехнологии при наработке препаратов.

Предложенный штамм хранится в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) под №64.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ: монослой представлен клетками эпителиоподобного типа с наличием органотипических структур, окруженных уплотненными тяжами, внутри структур наблюдается скопление выпуклых округлых клеток. Полученная культура обладает высокой пролиферативной активностью; индекс пролиферации составил 1:4, 1:6. Число хромосом в метафазных пластинках составило от 46-102.

СВЕДЕНИЯ О КОНТАМИНАНТАХ: микоплазмы, бактерии, грибы не обнаружены.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА: Межвидовой гибридный штамм ПО-TK^- × βкр культивируется в среде Игла MEM с добавлением 7-10% сыворотки крупного рогатого скота. Клетки снимаются с субстрата с использованием раствора коллагеназы или методом соскабливания монослоя и культивируется с коэффициентом пересева 1:4 - 1:6. Монослой формируется через 3-4 суток при посевной концентрации 80-100 тыс. кл/мл.

Межвидовой гибридный штамм продуцирует инсулин в диапазоне от 5 до 50 пикамоль/литр в культуральной среде.

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ШТАММА: криоконсервацию штамма осуществляют по 2-ступенчатому методу. Температуру снижают по 1-2°С до -30°, а далее до -70°С по 3-5° в минуту. По достижении -70°С ампулу с клетками помещают в жидкий азот. Криозащитную среду готовят по следующей прописи:

Среда Игла MEM - 50-60%

Сыворотка крови крупного рогатого скота - 40-30%

DMSO - 10%

ПРИМЕР 1.

Культуру клеток ПО-ТК^- βкр. культивируют на среде Игла MEM с добавлением 7-10% сыворотки крупного рогатого скота. При пересеве клетки снимаются со стекла соскабливанием и тщательным пипетированием. Монослой формируется на 3-4 сутки культивирования. После формирования монослоя на 3-е сутки культивирования отбирают пробы для тестирования на инсулин. Активность продуцируемого инсулина определяется радиоиммунным методом. На 3-е сутки культивирования в ростовой среде регистрируется наличие инсулина в количестве 5 пикамоль/литр.

ПРИМЕР 2.

Культивирование проводят, как в примере 1. Пробы на продукцию инсулина отбирают на 6-е сутки культивирования. Наличие инсулина определяется иммуногистохимическим методом. Активность продуцируемого инсулина определяется радиоиммунным методом. На 6-е сутки культивирования она составляет 30 пикамоль/литр.

ПРИМЕР 3.

После проведенной работы по селекции культуру клеток культивируют на среде Игла MEM с добавлением 7-10% сыворотки крупного рогатого скота. Пробы на продукцию инсулина отбирают на 5-6 сутки культивирования. Активность продуцируемого инсулина определяется радиоиммунным методом и составляет 45-50 пикамоль/литр.

Таким образом, предлагаемая перевиваемая межвидовая гибридная культура клеток ПО-ТК^- × βкр. может служить в качестве продуцента инсулина.

Предложенный штамм апробирован нами с положительным результатом в лаборатории клеточной биотехнологии ВИЭВ, ВИЖе, НИИТ и ИО с ноября 2004 года по апрель 2005 года.

Активность продукции инсулина в межвидовой гибридной культуре проверена радиоиммунным, иммуногистохимическим, флуоресцентными методами.

Гибридный штамм ПО-ТК^- × βкр. найдет широкое применение в ветеринарной биотехнологии и медицине для наработки инсулина.

Источники информации.

1. В кн. "Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы", изд. "Канон", 1995 г., стр.38-45.

2. А.С. РФ №1347446, кл. С 12 N 5/00, 1987 г.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению клеточных гибридов, и может быть использовано в ветеринарной биотехнологии и медицине для получения инсулина. Штамм межвидовых гибридных клеток получают путем слияния практически неразмножающихся в культуре β-клеток поджелудочной железы кролика с перевиваемыми мутантными клетками почки овцы. Полученный штамм (ПО TK^- × βкр) является продуцентом инсулина. Изобретение обеспечивает высокую продукцию инсулина in vitro.

Штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы (ovis aries) с β-клетками кролика - продуцент инсулина, депонированный в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) г.Москвы под №64.