СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ (S)-НИКОТИНА Российский патент 2025 года по МПК C07D401/04 C12P17/16 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области техники органического синтеза и, более конкретно, к способу получения (S)-никотина посредством восстановления.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

(S)-Никотин, также известный как никотин, представляет собой алкалоид, встречающийся в природе в растениях, относящихся к семейству Solanaceae, и является жизненно необходимым элементом в табаке. Как правило, листья табака содержат 1,5-3,5% (S)-никотина, который в основном получают посредством экстракции. При том, что были описаны способы химического синтеза для получения никотина, такие способы все еще находятся на ранних стадиях разработки и являются более дорогими по сравнению с процессами экстракции. Описанные на данный момент способы химического синтеза включают химическое расщепление, асимметричную гидрогенизацию, применение способов с использованием хирального вспомогательного реагента и так далее.

В публикации патентного документа № WO 2014174505 раскрыт способ синтеза никотина путем катализирования псевдооксиникотина с помощью иминредуктаз (фермента, представляющего собой кеторедуктазу), конкретно с применением иминредуктаз, источником которых являются Streptomyces sp. GF3546 и Streptomyces sp. GF3587. Следует отметить, что способ, подробно описанный в патенте, обеспечивает исключительно получение (R)-никотина и в нем не представлено инструкций для получения (S)-никотина.

В публикации патентного документа № US10913962B раскрыт способ синтеза (S)-никотина. В способе применяется катализирование миосмина с применением фермента, представляющего собой редуктазу, с получением (S)-норникотина с последующим восстановительным метилированием (S)-норникотина. Способ решает проблему экономической эффективности путем применения биологического катализа в получении (S)-норникотина, что приводит к значительному выходу (S)-норникотина. Кроме того, в процессе метилирования используют формальдегид в качестве источника метила, и муравьиная кислота служит в качестве восстановителя.

Чтобы преодолеть недостатки вышеуказанных способов, в которых либо требуется метилирование для синтеза (S)-никотина, либо невозможно получать (S)-никотин посредством ферментативного катализа без метилирования, важно разработать способ, в котором исключена необходимость метилирования при получении (S)-никотина.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предусмотрен способ получения (S)-никотина посредством восстановления, в частности, способ получения (S)-никотина посредством восстановления.

В настоящем изобретении предусмотрен способ получения (S)-никотина посредством восстановления, и при этом способ включает:

осуществление процесса восстановления алкенового соединения, представленного формулой I, и/или иминиевого катионного соединения, представленного формулой II, с получением таким образом (S)-никотина:

Учитывая ограниченные способы получения, раскрытые в предшествующем уровне техники, в которых либо требуется метилирование для синтеза (S)-никотина, либо невозможно получать (S)-никотин посредством ферментативного катализа без метилирования, в настоящем изобретении творчески разработан абсолютно новый способ эффективного получения (S)-никотина без метилирования, другими словами, восстановление алкенового соединения, представленного формулой I, и/или иминиевого катионного соединения, представленного формулой II. Способ обладает преимуществами, заключающимися в простоте операций, безопасности и надежности, высоком выходе и высокой чистоте.

В настоящем изобретении восстановление конкретно предусматривает два следующих раствора.

Процесс восстановления проводят с применением биокаталитического способа, и биокаталитический способ включает:

в системе с циклическим использованием кофермента каталитическое восстановление алкенового соединения, представленного формулой I, и/или иминиевого катионного соединения, представленного формулой II, с помощью иминредуктазы в качестве катализатора для реакции каталитического восстановления с получением таким образом (S)-никотина.

Предпочтительно система с циклическим использованием кофермента содержит кофермент, глюкозу и глюкозодегидрогеназу.

Предпочтительно кофермент предусматривает соль NADP (никотинамидадениндинуклеотидфосфата) и/или соль NAD (никотинамидадениндинуклеотида) , предпочтительно соль NADP.

Предпочтительно глюкозодегидрогеназа содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID No: 1.

SEQ ID No: 1:

MYKDLEGKVVVITGSSTGLGKSMAIRFATEKAKVVVNYRSKEDEANSVLEEIKKVGGEAIAVKGDVTVESDVINLVQSAIKEFGKLDVMINNAGLENPVSSHEMSLSDWNKVIDTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGTVINMSSVHEKIPWPLFVHYAASKGGMKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPEQRADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASSEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGR.

Предпочтительно иминредуктаза содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID No: 2-6, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 95% идентичностью с аминокислотной последовательностью под SEQ ID No: 12, предпочтительно аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID No: 2-4, SEQ ID No: 12, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 95% идентичностью с аминокислотной последовательностью под SEQ ID No: 12.

SEQ ID No: 2:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGEAIAASDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARSLESWCHTRGARYLDGAILCFPDQIGTTDASIICSGASTAFSEAEPVLRLLAPPLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEVEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ.

SEQ ID No: 3:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ.

SEQ ID No: 4:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLIKGGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQQLLDEARDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPDQIGTSDASIICSGASAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAL.

SEQ ID No: 5:

MRPISVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKATPLIALGAILAPSVSEAIAAGDITLICVDNYAVSQQLLDEASNAVTGKLVVQLSTGSPLGARTLESWCHARGACYLDGAILCFPDQIGTTDASIICSGANAAFREAEPVLRLLAPTLEHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLTDHAADAGIDNSFPRFAADLFEEGVEQGLGQQEVSALIKVLRARNGAAQ.

SEQ ID No: 6:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLIKAGHPVTVWNRSAAKSAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKQLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPDQIGTSDASIICSGANTAFSDAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVTKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ.

SEQ ID No: 7:

MGTALVEAFLAGGHATTVWNRTPGKADGVVARGAVVAETVAEAVAASPLVVVCLWDDAVVRDVLHPVADALAGRVVVNLTNGTPAQAREMAAWAAEHGVEYVDGGIMAIPPGIGTEHAFVLYSGAEAAFEAHREVLERLGAAKYLGADAGLAALFDLALLSGMYGTFAGLWHSLAMVRTENVSAAEFVPMLGPWMQAMIGGNLDRLAHQLDTGDYGHEVVSNLAMQAAAFPNIVQASLDQGIRPDLMAPIQRLMDQAVAAGHGAEDVAVVVDLLKN.

SEQ ID No: 8:

MKPTLTVIGAGRMGSALIKAFLQSGYTTTVWNRTKAKSEPLAKLGAHLADTVRDAVKRSDIIVVNVLDYDTSDQLLRQDEVTRELRGKLLVQLTSGSPALAREQETWARQHGIDYLDGAIMATPDFIGQAECALLYSGSAALFEKHRAVLNVLGGATSHVGEDVGHASALDSALLFQMWGTLFGTLQALAISRAEGIPLEKTTAFIKLTEPVTQGAVADVLTRVQQNRLTADAQTLASLEAHNVAFQHLLALCEERNIHRGVADAMYSVIREAVKAGHGKDDFAILTRFLK.

SEQ ID No: 9:

MVSSPYLNVTAYPKVRNLPWPVPGPIRVASQILELRPMTTIGFLGAGRMGSALVKSLLEAGHSVHVWNRTAEKAQALADFGAVPEPSAERAAGPAEIVIVNLLDYEASDAELRKPDVAEALKGKLLVQLTSGSPKTARETGRWAGDHGIAYLDGAIMATPNFIGGAETVILYSGSKTHFEKHEGLFKALGGKSAFVGEDFGTASALDSALLSQMWGTLFGTLQALAVCRAEGIEHDVYAGFLMSAQPMIDGAQQDLMERIRDGRDLADAQTLATVAVHNVAFHHLRDLIADRDLNPAFGDALGSLLETALRNDHQDDDFAVLARFMGAK.

SEQ ID No: 10:

MTDLGKSAVTVLGLGAMGTALAEALLAAGHPTTVWNRSPARTAGPAQRGAAVAAATAEAIAASRLIVVCLLDHTSVHAVLDGQELTGRIVVNLTSGTPGQARELDARVAERGGDHLDGAVLAVPSMIGTPDASVLYSGSRGAFDTHRPVLEVFGAADYVGADPGAASLQDAALLSAMYGQVAGVLHAFALVRSAGVTATEFLPRLVGWLTAMGGFPADAARRIDARAYADDVDAALTMQVTAVRNLVRAAREQGVSAELIAPLVPVMQRRIDDGDGGDDLAALVEVITAEEVA.

SEQ ID No: 11:

MTDKPPVTVLGLGAMGTALARTLLNAGYPTTVWNRTASKTAPLTELGAHAADSPADAIARGELVLACLLDYDSVHQTLAGTGDALRGKAFVNLTNGTPEQARALAGKLDTAYLDGGIMAVPPMIGSPGAFLFYSGEIAVFEQYRPVLESFGEAIEVGTDPGLAALHDLALLSAMYGMFGGVLQAFALTGSAGVSAASLAPLLHRWLDGMSGFIAQSAAQLDSGDFATGVVSNLAMQDTGFANLFRAAKEQGISTGQLEPLGALIRRRVEDGHGAEDLAGIVEYLKIGANA.

SEQ ID No: 12:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ.

Специалист в данной области техники, применяя общепринятые способы, вводит мутации по одной или более аминокислотам аминокислотных последовательностей, представленных под SEQ ID No: 2-12, с получением таким образом мутантных вариантов иминредуктазы. Мутантные варианты иминредуктазы подвергают скринингу в отношении их способности катализировать субстраты, необходимые для получения (S)-никотина, со степенью превращения и значением энантиомерного избытка (ee), соответствующими рабочим стандартам, установленным для иминредуктазы.

Предпочтительно аминокислотная последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью под SEQ ID No: 12 демонстрирует наличие мутаций при сравнении с аминокислотной последовательностью под SEQ ID No: 12 по аминокислотным остаткам в любом одном из следующих положений или комбинации из по меньшей мере двух из следующих положений: L73, S148, V171 и A172.

Дополнительно предпочтительно аминокислотный остаток в положении 73 подвержен мутации, предусматривающей замену L на Q или V, аминокислотный остаток в положении 148 подвержен мутации, предусматривающей замену S на R, аминокислотный остаток в положении 171 подвержен мутации, предусматривающей замену V на Y, N, A или S, и аминокислотный остаток в положении 172 подвержен мутации, предусматривающей замену A на V или F.

Дополнительно предпочтительно аминокислотная последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью под SEQ ID No: 12 дополнительно демонстрирует наличие мутаций при сравнении с аминокислотной последовательностью под SEQ ID No: 12 по аминокислотным остаткам в любом одном из следующих положений или комбинации из по меньшей мере двух из следующих положений: A57, A176, Y230 и S241.

Дополнительно предпочтительно аминокислотный остаток в положении 57 подвержен мутации, предусматривающей замену A на R, аминокислотный остаток в положении 176 подвержен мутации, предусматривающей замену A на G, аминокислотный остаток в положении 230 подвержен мутации, предусматривающей замену Y на G, A или T, и аминокислотный остаток в положении 241 подвержен мутации, предусматривающей замену S на G или A.

В качестве примера, аминокислотная последовательность, характеризующаяся по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью под SEQ ID No: 12, может представлять собой следующее:

SEQ ID No: 13:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQVLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAAAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ;

SEQ ID No: 14:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ;

SEQ ID No: 15:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPGASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ;

SEQ ID No: 16:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAAVAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPTASLKTWSAAIGRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ;

SEQ ID No: 17:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAAVAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAIGRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ;

SEQ ID No: 18:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAAAAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAIGRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ;

SEQ ID No: 19:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVVAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAIGRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ;

SEQ ID No: 20:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ;

SEQ ID No: 21:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAIARLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ или

SEQ ID No: 22:

MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPTASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ.

Специалист в данной области техники, применяя общепринятые способы, получает мутантные варианты иминредуктазы с любой комбинацией указанных выше точек мутации. Мутантные варианты иминредуктазы подвергают скринингу в отношении их способности катализировать субстраты, необходимые для получения (S)-никотина, со степенью превращения, составляющей 99% или больше, и значением ee, составляющим 99% или больше.

Предпочтительно реакцию каталитического восстановления проводят при температуре в диапазоне от 15 до 45°C, такой как 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C или 45°C; могут быть выбраны также другие конкретные значения температуры в пределах данного диапазона, и они не описаны подробно в данном документе.

Предпочтительно реакцию каталитического восстановления осуществляют в буферном растворе; и буферный раствор предусматривает фосфатный буфер, буфер на основе Tris-HCl или буфер на основе TEA-HCl.

Предпочтительно реакцию каталитического восстановления проводят при pH в диапазоне от 6,0 до 8,0, таком как pH 6,0, pH 6,2, pH 6,5, pH 6,8, pH 7,0, pH 7,2, pH 7,5, pH 7,8 или pH 8,0, и могут быть выбраны также другие конкретные значения pH в пределах данного диапазона, и они не описаны подробно в данном документе.

В настоящем изобретении процесс восстановления проводят с применением хирального металлического катализатора, и конкретный способ включает:

в атмосфере газообразного водорода каталитическое восстановление алкенового соединения, представленного формулой I, и/или иминиевого катионного соединения, представленного формулой II, с помощью хирального металлического катализатора с получением таким образом (S)-никотина.

Предпочтительно хиральный металлический катализатор предусматривает хиральный катализатор на основе иридия, хиральный катализатор на основе рутения или хиральный катализатор на основе родия и более предпочтительно хиральный катализатор на основе иридия.

Предпочтительно в реакцию каталитического восстановления добавляют лиганд.

Лиганд выбран из любого одного из лигандов или комбинации из по меньшей мере двух лигандов в таблице 1, предпочтительно (R,R)-f-SpiroPhos и (S,S)-Ph-BPE.

Таблица 1

Предпочтительно реакцию каталитического восстановления проводят при температуре в диапазоне от 50°C до 100°C, такой как 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, 95°C или 100°C, могут быть выбраны также другие конкретные значения температуры в пределах данного диапазона, но они не описаны подробно в данном документе.

Предпочтительно во время реакции каталитического восстановления давление газообразного водорода поддерживают в диапазоне от 1,0 МПа до 6,0 МПа, как, например, при 1,0 МПа, 2,0 МПа, 3,0 МПа, 4,0 МПа, 5,0 Мпа или 6,0 МПа, и могут быть выбраны также другие конкретные значения давления в пределах данного диапазона, но они не описаны подробно в данном документе.

Предпочтительно реакцию каталитического восстановления проводят при pH в диапазоне от 4,0 до 13,0, таком как pH 4,0, 5,0, 6,0, pH 6,2, pH 6,5, pH 6,8, pH 7,0, pH 7,2, pH 7,5, pH 7,8, pH 8,0, pH 10,0, pH 12,0 или pH 13,0, и могут быть выбраны также другие конкретные значения pH в пределах данного диапазона, но они не описаны подробно в данном документе.

В настоящем изобретении алкеновое соединение, представленное формулой I, или иминиевое катионное соединение, представленное формулой II, получают путем обессоливания и/или циклизации соединения, представленного формулой III, или его соли:

Предпочтительно соль предусматривает гидрохлорид, дигидрохлорид, гидробромид, дигидробромид, сульфат или бисульфат.

Соединение, представленное формулой III или его соль, подвергают обессоливанию и/или циклизации в присутствии неорганического основания и/или органического основания с получением таким образом алкенового соединения, представленного формулой I, или иминиевого катионного соединения, представленного формулой II.

В настоящем изобретении способ синтезирования соли соединения, представленного формулой III, включает:

смешивание соединения A с N-метилпирролидоном и органическим основанием с получением соединения D и смешивание соединения D с кислотой с получением соли соединения, представленного формулой III; уравнения реакции являются следующими:

.

В качестве альтернативы способ синтезирования соли соединения, представленного формулой III, включает:

смешивание соединения A с N-метилпирролидоном и органическим основанием и нейтрализацию с помощью кислоты с достижением pH, составляющего 7-8, с получением таким образом соединения B и смешивание соединения B с кислотой с получением соли соединения, представленного формулой III; уравнения реакции являются следующими:

.

В настоящем изобретении способ синтезирования соединения A включает: смешивание никотиновой кислоты с метанолом и этерифицирование в высококислой среде с получением таким образом соединения A.

В качестве предпочтительного технического решения по настоящему изобретению способ синтезирования (S)-никотина включает:

смешивание никотиновой кислоты с метанолом и этерифицирование в высококислой среде с получением таким образом соединения A; смешивание соединения A с N-метилпирролидоном и органическим основанием с получением соединения D, необязательно с последующей нейтрализацией с помощью кислоты с получением соединения B; смешивание соединения B или соединения D с кислотой с получением таким образом соли соединения, представленного формулой III; обессоливание и циклизацию соли соединения, представленного формулой III, и восстановление полученного продукта с применением биокаталитического способа или хирального металлического катализатора с получением (S)-никотина; и уравнения реакции являются следующими:

.

По сравнению с предшествующим уровнем техники настоящее изобретение имеет следующие преимущества. Принимая во внимание, что большинство ранее раскрытых способов получения (S)-никотина, как правило, включают стадию метилирования с получением (S)-никотина, или при применении ферментативного катализа метилирование все же является необходимым, это указывает на то, что доступные способы получения (S)-никотина имеют ограничения. В настоящем изобретении творчески разработан абсолютно новый способ эффективного получения (S)-никотина без метилирования, другими словами, восстановление алкенового соединения, представленного формулой I, и/или иминиевого катионного соединения, представленного формулой II. Способ обладает преимуществами, заключающимися в простоте операций, безопасности и надежности, высоком выходе и высокой чистоте, таким образом увеличивая количество вариантов синтеза, доступных для получения (S)-никотина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 представляет собой спектр ядерного магнитного резонанса (S)-никотина, полученного в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 2 представляет собой спектр ядерного магнитного резонанса хлористоводородной соли соединения III, полученного в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 3 представляет собой спектр ядерного магнитного резонанса соединения B, полученного в соответствии с настоящим изобретением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Технические решения настоящего изобретения дополнительно описаны ниже с использованием конкретных вариантов осуществления. Специалистам в данной области техники будет понятно, что примеры предназначены лишь для обеспечения лучшего понимания настоящего изобретения и не должны рассматриваться в качестве конкретных ограничений настоящего изобретения.

В следующих примерах получения и примерах чистоту соединения A определяют с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), и способ расчета выхода соединения A является следующим:

.

Чистоту соединения B определяют с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), и способ расчета выхода соединения A является следующим:

.

Чистоту соединения, представленного формулой III, или его соли определяют с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), и способ расчета выхода соединения, представленного формулой III, или его соли является следующим:

.

Чистоту и оптическую чистоту (S)-никотина определяют с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), и способ расчета выхода (S)-никотина является следующим:

.

Пример получения 1-1

В данном примере получения получали соединение A:

.

Добавляли 50 г никотиновой кислоты и 250 г метанола в реакционный сосуд вместимостью 500 мл. При непрерывном перемешивании в реакционный сосуд постепенно добавляли 60 г концентрированной серной кислоты с образованием смеси. Температуру затем повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником в течение 18 часов и охлаждали до 45°C. Затем давление снижали для концентрирования смеси, с удалением таким образом метанола. После отгонки остатка, при наличии такого, концентрированный остаток охлаждали до 20°C. Затем добавляли 250 г этилацетата и 250 г воды и перемешивали до полного растворения. Регулировали pH полученной смеси до 7,5 с применением 20% раствора гидроксида натрия и обеспечивали разделение полученной смеси на органический слой и водный слой. Органический слой собирали. Водный слой экстрагировали один раз с помощью 250 г этилацетата, объединяли с органическим слоем и высушивали с помощью безводного сульфата натрия. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением таким образом 55,2 г бесцветной прозрачной жидкости с чистотой 99% и выходом 99%. Жидкость охлаждали и обеспечивали ее затвердевание с получением соединения A.

Пример получения 1-2

В данном примере получения получали соединение A.

Добавляли 50 г никотиновой кислоты и 250 г метанола в реакционный сосуд вместимостью 500 мл. При непрерывном перемешивании в реакционный сосуд добавляли по каплям 120,5 г тионилхлорида (2,5 эквивалента) с образованием смеси. Температуру затем повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником в течение 9 часов и охлаждали до 40°C. Затем давление снижали для концентрирования смеси, с удалением таким образом метанола. После отгонки остатка, при наличии такого, концентрированный остаток охлаждали до 10°C. Затем добавляли 200 г дихлорметана и 100 г воды и перемешивали до полного растворения. Регулировали pH полученной смеси до 8 с применением 15% раствора гидроксида натрия и обеспечивали разделение полученной смеси на органический слой и водный слой. Органический слой собирали. Водный слой экстрагировали один раз с помощью 200 г дихлорметана, объединяли с органическим слоем, промывали с помощью 5% раствора гидроксида натрия и высушивали с помощью безводного сульфата натрия. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением таким образом 44,8 г светло-желтой прозрачной жидкости с чистотой 99% и выходом 81%. Жидкость охлаждали и обеспечивали ее затвердевание с получением соединения A.

Пример получения 1-3

В данном примере получения получали соединение A.

Добавляли 5 г никотиновой кислоты, 5,2 г триметилортоформиата (1,2 эквивалента), 25 г метанола и 0,48 г тетрахлорида циркония (0,05 эквивалента) в реакционный сосуд вместимостью 100 мл. Затем при непрерывном перемешивании повышали температуру и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником в течение 17 часов и охлаждали до 25°C. Затем добавляли 0,55 г этоксида натрия (0,2 эквивалента) для нейтрализации охлажденной смеси с последующей фильтрацией. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с удалением метанола с получением таким образом 5,5 г бесцветной прозрачной жидкости с чистотой 98,1% и выходом 99%. Жидкость охлаждали и обеспечивали ее затвердевание с получением соединения A.

Пример получения 1-4

В данном примере получения получали соединение A. Добавляли 5 г никотиновой кислоты, 5,2 г триметилортоформиата (1,2 эквивалента), 25 г метанола и 0,1 г тетрахлорида циркония (0,01 эквивалента) в реакционный сосуд вместимостью 100 мл. Затем при непрерывном перемешивании повышали температуру и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником в течение 36 часов и охлаждали до 30°C. Затем добавляли 0,11 г этоксида натрия (0,04 эквивалента) для нейтрализации охлажденной смеси с последующей фильтрацией. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с удалением метанола с получением таким образом 5,3 г бесцветной прозрачной жидкости с чистотой 91,6% и выходом 95%. Жидкость охлаждали и обеспечивали ее затвердевание с получением соединения A.

Пример получения 1-5

В данном примере получения получали соединение A.

Добавляли 5 г никотиновой кислоты, 5,2 г триметилортоформиата (1,2 эквивалента), 25 г метанола и 0,19 г тетрахлорида циркония (0,02 эквивалента) в реакционный сосуд вместимостью 100 мл. Затем при непрерывном перемешивании повышали температуру и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником в течение 30 часов и охлаждали до 20°C. Затем добавляли 0,22 г этоксида натрия (0,08 эквивалента) для нейтрализации охлажденной смеси с последующей фильтрацией. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с удалением метанола с получением таким образом 5,4 г бесцветной прозрачной жидкости с чистотой 93,9% и выходом 97%. Жидкость охлаждали и обеспечивали ее затвердевание с получением соединения A.

Пример получения 1-6

В данном примере получения получали соединение A.

Добавляли 200 г никотиновой кислоты, 207 г триметилортоформиата (1,2 эквивалента), 1000 г метанола и 9,5 г тетрахлорида циркония (0,025 эквивалента) в 2-л реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником в течение 20 часов и охлаждали до 25°C. Затем добавляли 11,06 г этоксида натрия (0,1 эквивалента) для нейтрализации охлажденной смеси с последующей фильтрацией. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с удалением метанола с получением таким образом 220,6 г бесцветной прозрачной жидкости с чистотой 98,5% и выходом 99%. Жидкость охлаждали и обеспечивали ее затвердевание с получением соединения A.

Пример получения 2-1

В данном примере получения получали соединение B:

.

Добавляли 102,0 г соединения A, полученного в примере получения 1-1, 88,5 г N-метилпирролидона (1,2 эквивалента), 1,2 кг толуола и 133,6 г трет-бутоксида калия (1,6 эквивалента) в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 25°C, нейтрализовали до pH 7,5 с помощью 5% хлористоводородной кислоты с последующим разделением на органический слой и водный слой. Водный слой экстрагировали с помощью дихлорметана, объединяли с органическим слоем и концентрировали при пониженном давлении с удалением растворителя с получением таким образом 121,0 г желто-коричневой жидкости, идентифицированной как соединение B, с чистотой 94% и выходом 80%. Дополнительные стадии очистки не требовались, и соединение B непосредственно поступало на следующую стадию реакции.

Неочищенный продукт очищали посредством колоночной хроматографии и анализировали с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). ЯМР-анализ показал одновременное существование как кето-, так и енольных форм с преобладанием кетоформы при соотношении 10:1. Данные по спектру ЯМР на основе водорода для кетоформы соединения представлены следующим образом: δ ppm (400 MГц, CDCl₃) 9,30 (s, 1H), 8,77-8,80 (m, 1H), 8,44 (1H, dt, J = 8,0, 2,0 Гц), 7,43-7,47 (m, 1H), 4,46 (1H, dd, J = 8,8, 3,2 Гц), 3,36-3,46 (m, 2H), 2,87 (s, 3H), 2,67-2,75 (m, 1H), 2,22-2,32 (m, 1H). Спектр ЯМР на основе водорода изображен на фиг. 3.

Пример получения 2-2

В данном примере получения получали соединение B.

Добавляли 102,0 г соединения A, полученного в примере получения 1-2, 77,4 г N-метилпирролидона (1,05 эквивалента), 1,2 кг толуола и 91,8 г трет-бутоксида калия (1,1 эквивалента) в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 20°C, нейтрализовали до pH 7 с помощью 5% хлористоводородной кислоты с последующим разделением на органический слой и водный слой. Водный слой экстрагировали с помощью толуола, объединяли с органическим слоем и концентрировали при пониженном давлении с удалением растворителя с получением таким образом 118,0 г желто-коричневой жидкости, идентифицированной как соединение B, с чистотой 93,5% и выходом 78%. Дополнительные стадии очистки не требовались, и соединение B непосредственно поступало на следующую стадию реакции.

Неочищенный продукт очищали посредством колоночной хроматографии и анализировали с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). ЯМР-анализ показал одновременное существование как кето-, так и енольных форм с преобладанием кетоформы при соотношении 10:1. Данные по спектру ЯМР на основе водорода для кетоформы соединения представлены следующим образом: δ ppm (400 MГц, CDCl₃) 9,30 (s, 1H), 8,77-8,80 (m, 1H), 8,44 (1H, dt, J = 8,0, 2,0 Гц), 7,43-7,47 (m, 1H), 4,46 (1H, dd, J = 8,8, 3,2 Гц), 3,36-3,46 (m, 2H), 2,87 (s, 3H), 2,67-2,75 (m, 1H), 2,22-2,32 (m, 1H).

Пример получения 2-3

В данном примере получения получали соединение B.

Добавляли 102,0 г соединения A, полученного в примере получения 1-3, 88,5 г N-метилпирролидона (1,2 эквивалента), 1,2 кг толуола и 114,4 г трет-бутоксида натрия (1,6 эквивалента) в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 30°C и нейтрализовали до pH 8 с помощью 5% хлористоводородной кислоты с последующим разделением на органический слой и водный слой. Водный слой экстрагировали с помощью этилацетата, объединяли с органическим слоем и концентрировали при пониженном давлении с удалением растворителя с получением таким образом 117,8 г желто-коричневой жидкости, идентифицированной как соединение B, с чистотой 95% и выходом 78%. Дополнительные стадии очистки не требовались, и соединение B непосредственно поступало на следующую стадию реакции.

Неочищенный продукт очищали посредством колоночной хроматографии и анализировали с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). ЯМР-анализ показал одновременное существование как кето-, так и енольных форм с преобладанием кетоформы при соотношении 10:1. Данные по спектру ЯМР на основе водорода для кетоформы соединения представлены следующим образом: δ ppm (400 MГц, CDCl₃) 9,30 (s, 1H), 8,77-8,80 (m, 1H), 8,44 (1H, dt, J = 8,0, 2,0 Гц), 7,43-7,47 (m, 1H), 4,46 (1H, dd, J = 8,8, 3,2 Гц), 3,36-3,46 (m, 2H), 2,87 (s, 3H), 2,67-2,75 (m, 1H), 2,22-2,32 (m, 1H).

Пример получения 2-4

В данном примере получения получали соединение B.

Добавляли 102,0 г соединения A, полученного в примере получения 1-4, 77,4 г N-метилпирролидона (1,05 эквивалента), 1,2 кг толуола и 78,6 г трет-бутоксида натрия (1,1 эквивалента) в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 25°C и нейтрализовали до pH 7,5 с помощью 5% хлористоводородной кислоты с последующим разделением на органический слой и водный слой. Водный слой экстрагировали с помощью толуола, объединяли с органическим слоем и концентрировали при пониженном давлении с удалением растворителя с получением таким образом 108,7 г желто-коричневой жидкости, идентифицированной как соединение B, с чистотой 93% и выходом 72%. Дополнительные стадии очистки не требовались, и соединение B непосредственно поступало на следующую стадию реакции.

Неочищенный продукт очищали посредством колоночной хроматографии и анализировали с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). ЯМР-анализ показал одновременное существование как кето-, так и енольных форм с преобладанием кетоформы при соотношении 10:1. Данные по спектру ЯМР на основе водорода для кетоформы соединения представлены следующим образом: δ ppm (400 MГц, CDCl₃) 9,30 (s, 1H), 8,77-8,80 (m, 1H), 8,44 (1H, dt, J = 8,0, 2,0 Гц), 7,43-7,47 (m, 1H), 4,46 (1H, dd, J = 8,8, 3,2 Гц), 3,36-3,46 (m, 2H), 2,87 (s, 3H), 2,67-2,75 (m, 1H), 2,22-2,32 (m, 1H).

Пример получения 2-5

В данном примере получения получали соединение B.

Добавляли 102,0 г соединения A, полученного в примере получения 1-5, 88,5 г N-метилпирролидона (1,2 эквивалента), 1,2 кг толуола и 81,0 г этоксида натрия (1,6 эквивалента) в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником в течение 16 часов. После завершения реакции смесь охлаждали до 25°C и нейтрализовали до pH 7,5 с помощью 5% хлористоводородной кислоты с последующим разделением на органический слой и водный слой. Водный слой экстрагировали с помощью толуола, объединяли с органическим слоем и концентрировали при пониженном давлении с удалением растворителя с получением таким образом 127,0 г желто-коричневой жидкости, идентифицированной как соединение B, с чистотой 92% и выходом 84%. Дополнительные стадии очистки не требовались, и соединение B непосредственно поступало на следующую стадию реакции.

Неочищенный продукт очищали посредством колоночной хроматографии и анализировали с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). ЯМР-анализ показал одновременное существование как кето-, так и енольных форм с преобладанием кетоформы при соотношении 10:1. Данные по спектру ЯМР на основе водорода для кетоформы соединения представлены следующим образом: δ ppm (400 MГц, CDCl₃) 9,30 (s, 1H), 8,77-8,80 (m, 1H), 8,44 (1H, dt, J = 8,0, 2,0 Гц), 7,43-7,47 (m, 1H), 4,46 (1H, dd, J = 8,8, 3,2 Гц), 3,36-3,46 (m, 2H), 2,87 (s, 3H), 2,67-2,75 (m, 1H), 2,22-2,32 (m, 1H).

Пример получения 2-6

В данном примере получения получали соединение B.

Добавляли 102,0 г соединения A, полученного в примере получения 1-6, 88,5 г N-метилпирролидона (1,2 эквивалента), 1,2 кг толуола и 47,6 г гидрида натрия (1,6 эквивалента, 60% гидрид натрия в масле) в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 25°C и нейтрализовали до pH 7 с помощью 5% хлористоводородной кислоты с последующим разделением на органический слой и водный слой. Водный слой экстрагировали с помощью метил-трет-бутилового эфира, объединяли с органическим слоем и концентрировали при пониженном давлении с удалением растворителя с получением таким образом 111,0 г желто-коричневой жидкости, идентифицированной как соединение B, с чистотой 90% и выходом 70%. Дополнительные стадии очистки не требовались, и соединение B непосредственно поступало на следующую стадию реакции.

Неочищенный продукт очищали посредством колоночной хроматографии и анализировали с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). ЯМР-анализ показал одновременное существование как кето-, так и енольных форм с преобладанием кетоформы при соотношении 10:1. Данные по спектру ЯМР на основе водорода для кетоформы соединения представлены следующим образом: δ ppm (400 MГц, CDCl₃) 9,30 (s, 1H), 8,77-8,80 (m, 1H), 8,44 (1H, dt, J = 8,0, 2,0 Гц), 7,43-7,47 (m, 1H), 4,46 (1H, dd, J = 8,8, 3,2 Гц), 3,36-3,46 (m, 2H), 2,87 (s, 3H), 2,67-2,75 (m, 1H), 2,22-2,32 (m, 1H).

Пример получения 3-1

В данном примере получения получали хлористоводородную соль соединения, представленного формулой III, с применением соединения B в качестве исходного материала,

Добавляли 100,0 г соединения B, полученного в примере получения 2-1, и 500,0 г концентрированной хлористоводородной кислоты в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 55°C и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 300,0 г метанола к полученному осадку, охлаждали до 4°C и подвергали фильтрации с получением таким образом 92,2 г беловатого твердого вещества, идентифицированного как соединение, представленное формулой III, с чистотой 99% и выходом 75%.

При анализе спектр ядерного магнитного резонанса (¹H-ЯМР) полученного соединения соответствовал предусмотренной структуре, и спектральные данные являлись следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, D₂O): δ ppm 9,25 (m, 1H), 9,0 (dt, J = 8,4 Гц, 1,6 Гц, 1H), 8,90-8,91 (m, 1H), 8,13-8,17 (m, 1H), 3,28 (t, J = 6,8 Гц, 2H), 3,06 (t, J = 8,0 Гц, 2H), 2,66 (s, 3H), 2,02-2,09 (m, 2H). Спектр изображен на фиг. 2.

Пример получения 3-2

В данном примере получения получали соединение, представленное формулой III, с применением соединения B в качестве исходного материала.

Добавляли 100,0 г соединения B, полученного в примере получения 2-2, и 100,0 г концентрированной хлористоводородной кислоты в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 50°C и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 100,0 г метанола к полученному осадку, охлаждали до 8°C и подвергали фильтрации с получением таким образом 95,9 г беловатого твердого вещества, идентифицированного как соединение, представленное формулой III, с чистотой 98,5% и выходом 78%.

При анализе спектр ядерного магнитного резонанса (¹H-ЯМР) полученного соединения соответствовал предусмотренной структуре, и спектральные данные являлись следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, D₂O): δ ppm 9,25 (m, 1H), 9,0 (dt, J = 8,4 Гц, 1,6 Гц, 1H), 8,90-8,91 (m, 1H), 8,13-8,17 (m, 1H), 3,28 (t, J = 6,8 Гц, 2H), 3,06 (t, J = 8,0 Гц, 2H), 2,66 (s, 3H), 2,02-2,09 (m, 2H).

Пример получения 3-3

В данном примере получения получали соединение, представленное формулой III, с применением соединения B в качестве исходного материала.

Добавляли 100,0 г соединения B, полученного в примере получения 2-3, и 300,0 г концентрированной хлористоводородной кислоты в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 50°C и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 300,0 г этанола к полученному осадку, охлаждали до 0°C и подвергали фильтрации с получением таким образом 100,8 г беловатого твердого вещества, идентифицированного как соединение, представленное формулой III, с чистотой 99% и выходом 82%.

При анализе спектр ядерного магнитного резонанса (¹H-ЯМР) полученного соединения соответствовал предусмотренной структуре, и спектральные данные являлись следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, D₂O): δ ppm 9,25 (m, 1H), 9,0 (dt, J = 8,4 Гц, 1,6 Гц, 1H), 8,90-8,91 (m, 1H), 8,13-8,17 (m, 1H), 3,28 (t, J = 6,8 Гц, 2H), 3,06 (t, J = 8,0 Гц, 2H), 2,66 (s, 3H), 2,02-2,09 (m, 2H).

Пример получения 3-4

В данном примере получения получали соединение, представленное формулой III, с применением соединения B в качестве исходного материала.

Добавляли 100,0 г соединения B, полученного в примере получения 2-4, и 300,0 г концентрированной хлористоводородной кислоты в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 55°C и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 500,0 г изопропанола к полученному осадку, охлаждали до 4°C и подвергали фильтрации с получением таким образом 93,4 г беловатого твердого вещества, идентифицированного как соединение, представленное формулой III, с чистотой 97,5% и выходом 76%.

При анализе спектр ядерного магнитного резонанса (¹H-ЯМР) полученного соединения соответствовал предусмотренной структуре, и спектральные данные являлись следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, D₂O): δ ppm 9,25 (m, 1H), 9,0 (dt, J = 8,4 Гц, 1,6 Гц, 1H), 8,90-8,91 (m, 1H), 8,13-8,17 (m, 1H), 3,28 (t, J = 6,8 Гц, 2H), 3,06 (t, J = 8,0 Гц, 2H), 2,66 (s, 3H), 2,02-2,09 (m, 2H).

Пример получения 3-5

В данном примере получения получали соединение, представленное формулой III, с применением соединения B в качестве исходного материала.

Добавляли 100,0 г соединения B, полученного в примере получения 2-5, и 500,0 г концентрированной хлористоводородной кислоты в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 55°C и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 100,0 г изопропанола к полученному осадку, охлаждали до 4°C и подвергали фильтрации с получением таким образом 103,3 г беловатого твердого вещества, идентифицированного как соединение, представленное формулой III, с чистотой 96% и выходом 84%.

При анализе спектр ядерного магнитного резонанса (¹H-ЯМР) полученного соединения соответствовал предусмотренной структуре, и спектральные данные являлись следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, D₂O): δ ppm 9,25 (m, 1H), 9,0 (dt, J = 8,4 Гц, 1,6 Гц, 1H), 8,90-8,91 (m, 1H), 8,13-8,17 (m, 1H), 3,28 (t, J = 6,8 Гц, 2H), 3,06 (t, J = 8,0 Гц, 2H), 2,66 (s, 3H), 2,02-2,09 (m, 2H).

Пример получения 4-1

В данном примере получения соединение D сначала получали из соединения A в качестве исходного материала с последующим получением соединения, представленного формулой III.

Добавляли 120,0 г соединения A, полученного в примере получения 1-1, 96,2 г N-метилпирролидона, 1,6 кг толуола и 147 г трет-бутоксида калия в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 25°C и подвергали фильтрации с получением таким образом соединения D (калиевой соли). Соединение D непосредственно поступало на следующую стадию реакции.

Соединение D (калиевую соль), полученное с помощью фильтрации, добавляли к 650 г концентрированной хлористоводородной кислоты и температуру повышали до 100°C. После завершения реакции применяли перегонку с пониженным давлением для удаления большей части воды из полученной смеси. Затем к остатку добавляли 650 мл 95% этанола с последующим тщательным перемешиванием. Температуру снижали до 10°C и смесь подвергали фильтрации и высушиванию с получением таким образом 86 г беловатого твердого вещества, идентифицированного как соединение, представленное формулой III, с выходом 55,2% и чистотой 97,2%.

При анализе спектр ядерного магнитного резонанса (¹H-ЯМР) соединения, представленного формулой III, соответствовал предусмотренной структуре, и спектральные данные являлись следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, D₂O): δ ppm 9,25 (m, 1H), 9,0 (dt, J = 8,4 Гц, 1,6 Гц, 1H), 8,90-8,91 (m, 1H), 8,13-8,17 (m, 1H), 3,28 (t, J = 6,8 Гц, 2H), 3,06 (t, J = 8,0 Гц, 2H), 2,66 (s, 3H), 2,02-2,09 (m, 2H).

Пример получения 4-2

В данном примере получения соединение D сначала получали из соединения A в качестве исходного материала с последующим получением соединения, представленного формулой III.

Добавляли 153,0 г соединения A, полученного в примере получения 1-2, 165,0 г N-метилпирролидона, 2 кг толуола и 214,5 г трет-бутоксида калия в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании температуру повышали и смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником. После завершения реакции смесь охлаждали до 15°C и подвергали фильтрации с получением таким образом соединения D (калиевой соли). Соединение D непосредственно поступало на следующую стадию реакции.

Соединение D (калиевую соль), полученное с помощью фильтрации, добавляли к 960 г концентрированной хлористоводородной кислоты и температуру повышали до 100°C. После завершения реакции применяли перегонку с пониженным давлением для удаления большей части воды из полученной смеси. Затем к остатку добавляли 800 мл изопропанола с последующим тщательным перемешиванием. Температуру снижали до 20°C и смесь подвергали фильтрации и высушиванию с получением таким образом 127 г беловатого твердого вещества, идентифицированного как соединение, представленное формулой III, с выходом 63,5% и чистотой 96,7%.

При анализе спектр ядерного магнитного резонанса (¹H-ЯМР) соединения, представленного формулой III, соответствовал предусмотренной структуре, и спектральные данные являлись следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, D₂O): δ ppm 9,25 (m, 1H), 9,0 (dt, J = 8,4 Гц, 1,6 Гц, 1H), 8,90-8,91 (m, 1H), 8,13-8,17 (m, 1H), 3,28 (t, J = 6,8 Гц, 2H), 3,06 (t, J = 8,0 Гц, 2H), 2,66 (s, 3H), 2,02-2,09 (m, 2H).

Пример получения 5-1

В данном примере получения получали глюкозодегидрогеназу с аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID No: 1.

Аминокислотную последовательность глюкозодегидрогеназы (SEQ ID No: 1), полученную из Priestia megaterium (номер доступа в NCBI AUO12718.1) отправляли в корпорацию Kingsray в Нанкине для кодон-оптимизации и полного синтеза гена. Впоследствии аминокислотную последовательность лигировали в плазмиду pET30a(+) и трансформировали в компетентные клетки Escherichia coli BL21 (DE3), получая тем самым рекомбинантные бактерии, содержащие ген глюкозодегидрогеназы.

Рекомбинантные бактерии инокулировали в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и культивировали в течение ночи при 37°C. Затем 1 мл бактериальной культуры переносили в 125 мл жидкой среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и инкубировали при 37°C в течение 3 часов; впоследствии добавляли 125 мкл 1 M IPTG и индуцировали культуру в течение ночи при 25°C. Клетки собирали с помощью центрифугирования (при 4000 об/мин и 4°C в течение 10 мин), ресуспендировали в фосфатном буфере (pH = 7,0) в четырехкратном от исходного объеме, подвергали соникации для обеспечения разрушения клеток и затем центрифугировали (при 4000 об/мин и 4°C в течение 10 мин) для сбора надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость лиофилизировали с получением порошка фермента глюкозодегидрогеназы.

Пример получения 5-2

В данном примере получения получали следующие одиннадцать разных иминредуктаз, обозначенных как ферменты 1, 3-11 и 13.

Аминокислотные последовательности иминредуктаз, представленные в NCBI (с информацией, представленной в таблице ниже под SEQ ID No: 2-12), отправляли в корпорацию Kingsray в Нанкине для кодон-оптимизации и полного синтеза гена. Впоследствии аминокислотные последовательности лигировали в плазмиду pET30a(+) и трансформировали в компетентные клетки Escherichia coli BL21 (DE3), получая тем самым рекомбинантные бактерии, содержащие ген иминредуктазы.

Рекомбинантные бактерии инокулировали в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и культивировали в течение ночи при 37°C. Впоследствии 1 мл бактериальной культуры переносили в 125 мл жидкой среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и инкубировали при 37°C в течение 3 часов; затем добавляли 125 мкл 1 M IPTG и индуцировали культуру в течение 16 часов при 25°C. Клетки собирали с помощью центрифугирования (при 4000 об/мин, 4°C в течение 10 мин), ресуспендировали в фосфатном буфере (pH = 7,0) в четырехкратном от исходного объеме, подвергали соникации для обеспечения разрушения клеток и затем снова центрифугировали (при 4000 об/мин, 4°C в течение 10 мин) для сбора надосадочной жидкости. Полученную надосадочную жидкость лиофилизировали с получением порошка иминредуктазы.

Десять иминредуктаз, обозначенных как ферменты 14-23, также получали в данном примере получения путем проведения сайтнаправленного мутагенеза в отношении аминокислотной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 12, с получением таким образом иминредуктаз, содержащих аминокислотные последовательности, представленные под SEQ ID No: 13-22. Аминокислотные последовательности отправляли в корпорацию Kingsray в Нанкине для кодон-оптимизации и полного синтеза гена. Впоследствии аминокислотные последовательности лигировали в плазмиду pET30a(+) и переносили в компетентные клетки Escherichia coli BL21 (DE3), получая тем самым рекомбинантные бактерии, содержащие гены иминредуктаз. Те же операции проводили, чтобы в конце получить порошок иминредуктазы.

Пример получения 5-3

В данном примере получения получали следующий фермент, обозначенный как фермент 12.

Аминокислотную последовательность (SEQ ID No: 2) иминредуктазы и аминокислотную последовательность (SEQ ID No: 1) глюкозодегидрогеназы последовательно клонировали в плазмиду pETDuet-1. Рекомбинантную плазмиду затем переносили в компетентные клетки Escherichia coli BL21 (DE3), получая тем самым рекомбинантные бактерии, содержащие как ген иминредуктазы, так и ген глюкозодегидрогеназы.

Рекомбинантные бактерии инокулировали в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивировали в течение ночи при 37°C. Впоследствии 1 мл бактериальной культуры переносили в 125 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 37°C в течение 3 часов; затем добавляли 125 мкл 1 M IPTG и индуцировали культуру в течение ночи при 25°C. Клетки собирали с помощью центрифугирования (при 4000 об/мин, 4°C в течение 10 мин), ресуспендировали в фосфатном буфере (pH = 7,0) в четырехкратном от исходного объеме, подвергали соникации для обеспечения разрушения клеток и затем снова центрифугировали (при 4000 об/мин и 4°C в течение 10 мин) для сбора надосадочной жидкости. Полученную надосадочную жидкость лиофилизировали с получением порошка фермента 12.

Пример 1

В данном примере получали (S)-никотин с помощью процесса восстановления с помощью хирального металлического катализатора.

Добавляли 1,25 г соединения C, полученного в примере получения 3-1, 50 мл метанола, 1,0 г триэтиламина, 16,7 мг димера хлор(1,5-циклооктадиен)иридия (I) в качестве хирального металлического катализатора и 30 мг (S)-(-)-1-((R)-2-дифенилфосфино)ферроценил)этилди-трет-бутилфосфина в качестве лиганда в реактор для гидрогенизации вместимостью 100 мл. Затем в реактор для гидрогенизации вводили газообразный водород для поддержания давления 2,5 МПа и удерживали температуру на уровне 60°C. Когда реакция завершалась, растворитель удаляли посредством концентрирования и остаток суспендировали в н-гептане, фильтровали и концентрировали с получением (S)-никотина с чистотой 96% и оптической чистотой 72%.

Полученный (S)-никотин очищали посредством колоночной хроматографии и определяли его характеристики с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР), как показано на фиг. 1. Данные ЯМР являются следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, CDCl₃): δ ppm 8,54 (1H, d), 8,50 (1H, dd), 7,70 (1H, dt), 7,24-7,27 (1H, m), 3,22-3,27 (1H, m), 3,08 (1H, t), 2,27-2,34 (1H, m), 2,17-2,24 (1H, m), 2,16 (3H, m), 1,91-2,02 (1H, m), 1,79-1,87 (1H, m), 1,68-1,76 (1H, m). Результаты подтверждают успешный синтез (S)-никотина.

Пример 2

В данном примере получали (S)-никотин с помощью процесса восстановления с помощью хирального металлического катализатора.

Добавляли 1,25 г соединения C, полученного в примере получения 3-2, 50 мл метанола, 1,0 г триэтиламина, 16,7 мг димера хлор(1,5-циклооктадиен)иридия (I) в качестве хирального металлического катализатора и 27 мг (+)-1,2-бис((2S,5S)-2,5-дифенилфосфолано)этана в качестве лиганда в реактор для гидрогенизации вместимостью 100 мл. Затем вводили газообразный водород в реактор для гидрогенизации для поддержания давления 3,0 МПа и удерживали температуру на уровне 60°C. Когда реакция завершалась, растворитель удаляли посредством концентрирования и остаток суспендировали в н-гептане, фильтровали и концентрировали с получением (S)-никотина с чистотой 94% и оптической чистотой 80%.

Полученный (S)-никотин очищали посредством колоночной хроматографии и определяли его характеристики с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Данные ЯМР являются следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, CDCl₃): δ ppm 8,54 (1H, d), 8,50 (1H, dd), 7,70 (1H, dt), 7,24-7,27 (1H, m), 3,22-3,27 (1H, m), 3,08 (1H, t), 2,27-2,34 (1H, m), 2,17-2,24 (1H, m), 2,16 (3H, m), 1,91-2,02 (1H, m), 1,79-1,87 (1H, m), 1,68-1,76 (1H, m). Результаты подтверждают успешный синтез (S)-никотина.

Пример 3

В данном примере получали (S)-никотин с помощью процесса восстановления с помощью хирального металлического катализатора.

Добавляли 1,25 г соединения C, полученного в примере получения 3-3, 50 мл метанола, 1,0 г триэтиламина, 16,7 мг димера хлор(1,5-циклооктадиен)иридия (I) в качестве хирального металлического катализатора и 38 мг (R,R)-f-SpiroPhos в качестве лиганда в реактор для гидрогенизации вместимостью 100 мл. Затем вводили газообразный водород в реактор для гидрогенизации для поддержания давления 5,5 МПа и удерживали температуру на уровне 80°C. Когда реакция завершалась, растворитель удаляли посредством концентрирования и остаток суспендировали в н-гептане, фильтровали и концентрировали с получением (S)-никотина с чистотой 90% и оптической чистотой 88%.

Полученный (S)-никотин очищали посредством колоночной хроматографии и определяли его характеристики с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Данные ЯМР являются следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, CDCl₃): δ ppm 8,54 (1H, d), 8,50 (1H, dd), 7,70 (1H, dt), 7,24-7,27 (1H, m), 3,22-3,27 (1H, m), 3,08 (1H, t), 2,27-2,34 (1H, m), 2,17-2,24 (1H, m), 2,16 (3H, m), 1,91-2,02 (1H, m), 1,79-1,87 (1H, m), 1,68-1,76 (1H, m). Результаты подтверждают успешный синтез (S)-никотина.

Пример 4

В данном примере получали (S)-никотин с помощью процесса восстановления с помощью хирального металлического катализатора.

Пример 4 сходен с примером 3, за исключением следующих отличий: 16,7 мг димера хлор(1,5-циклооктадиен)иридия (I) и 38 мг R,R)-f-SpiroPhos заменяли на 45 мг Rh((R,R)-DIPAMP)(COD)BF₄, при этом все остальные условия оставляли без изменений. Полученный (S)-никотин демонстрировал чистоту 45% и оптическую чистоту 27%.

Полученный (S)-никотин очищали посредством колоночной хроматографии и определяли его характеристики с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Данные ЯМР являются следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, CDCl₃): δ ppm 8,54 (1H, d), 8,50 (1H, dd), 7,70 (1H, dt), 7,24-7,27 (1H, m), 3,22-3,27 (1H, m), 3,08 (1H, t), 2,27-2,34 (1H, m), 2,17-2,24 (1H, m), 2,16 (3H, m), 1,91-2,02 (1H, m), 1,79-1,87 (1H, m), 1,68-1,76 (1H, m). Результаты подтверждают успешный синтез (S)-никотина.

Пример 5

В данном примере получали (S)-никотин с помощью процесса восстановления с помощью хирального металлического катализатора.

Добавляли 1,25 г соединения C, полученного в примере получения 3-4, 60 мл этанола, 1,0 г триэтиламина и 45 мг Rh[(R,R)-DIPAMP](COD)BF₄ в качестве хирального металлического катализатора в реактор для гидрогенизации вместимостью 100 мл. Затем вводили газообразный водород в реактор для гидрогенизации для поддержания давления 4,0 МПа и удерживали температуру на уровне 90°C. Когда реакция завершалась, растворитель удаляли посредством концентрирования и остаток суспендировали в н-гептане, фильтровали и концентрировали с получением (S)-никотина с чистотой 85% и оптической чистотой 58%.

Полученный (S)-никотин очищали посредством колоночной хроматографии и определяли его характеристики с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Данные ЯМР являются следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, CDCl₃): δ ppm 8,54 (1H, d), 8,50 (1H, dd), 7,70 (1H, dt), 7,24-7,27 (1H, m), 3,22-3,27 (1H, m), 3,08 (1H, t), 2,27-2,34 (1H, m), 2,17-2,24 (1H, m), 2,16 (3H, m), 1,91-2,02 (1H, m), 1,79-1,87 (1H, m), 1,68-1,76 (1H, m). Результаты подтверждают успешный синтез (S)-никотина.

Пример 6

В данном примере получали (S)-никотин с помощью процесса восстановления с помощью хирального металлического катализатора.

Добавляли 1,25 г соединения C, полученного в примере получения 3-5, 50 мл метанола, 1,0 г N,N-диизопропилэтиламина и 39 мг тетрафторбората (-)-1,2-бис((2S,5S)-2,5-диметилфосфино)этан(циклооктадиен)родия(I) в качестве хирального металлического катализатора в реактор для гидрогенизации вместимостью 100 мл. Затем вводили газообразный водород в реактор для гидрогенизации для поддержания давления 1,5 МПа и удерживали температуру на уровне 100°C. Когда реакция завершалась, растворитель удаляли посредством концентрирования и остаток суспендировали в метил-трет-бутиловом эфире, фильтровали и концентрировали с получением (S)-никотина с чистотой 64% и оптической чистотой 82%.

Полученный (S)-никотин очищали посредством колоночной хроматографии и определяли его характеристики с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Данные ЯМР являются следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, CDCl₃): δ ppm 8,54 (1H, d), 8,50 (1H, dd), 7,70 (1H, dt), 7,24-7,27 (1H, m), 3,22-3,27 (1H, m), 3,08 (1H, t), 2,27-2,34 (1H, m), 2,17-2,24 (1H, m), 2,16 (3H, m), 1,91-2,02 (1H, m), 1,79-1,87 (1H, m), 1,68-1,76 (1H, m). Результаты подтверждают успешный синтез (S)-никотина.

Пример 7

В данном примере получали (S)-никотин с помощью процесса восстановления с помощью хирального металлического катализатора.

Добавляли 1,25 г соединения C, полученного в примере получения 4-1, 50 мл метанола, 1,0 г триэтиламина и 35 мг [(R)-(+)-2,2’-бис(дифенилфосфино)-1,1’-бинафтил]дихлоррутения(II) в качестве хирального металлического катализатора в реактор для гидрогенизации вместимостью 100 мл. Затем вводили газообразный водород в реактор для гидрогенизации для поддержания давления 3,0 МПа и удерживали температуру на уровне 90°C. Когда реакция завершалась, растворитель удаляли посредством концентрирования и остаток суспендировали в н-гептане, фильтровали и концентрировали с получением (S)-никотина с чистотой 59% и оптической чистотой 66%.

Полученный (S)-никотин очищали посредством колоночной хроматографии и определяли его характеристики с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Данные ЯМР являются следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, CDCl₃): δ ppm 8,54 (1H, d), 8,50 (1H, dd), 7,70 (1H, dt), 7,24-7,27 (1H, m), 3,22-3,27 (1H, m), 3,08 (1H, t), 2,27-2,34 (1H, m), 2,17-2,24 (1H, m), 2,16 (3H, m), 1,91-2,02 (1H, m), 1,79-1,87 (1H, m), 1,68-1,76 (1H, m). Результаты подтверждают успешный синтез (S)-никотина.

Пример 8

В данном примере (S)-никотин получали с помощью биокаталитического способа.

Добавляли 30 мг соединения C, полученного в примере получения 4-2, в каждую из 10 пробирок для центрифугирования (каждая по 5 мл) с последующим добавлением 2 мл 0,1 M фосфатного буфера. Уровень pH смеси регулировали до 6,0. Затем добавляли 32 мг глюкозы в каждую пробирку для центрифугирования и перемешивали до полного растворения. Впоследствии 30 мг иминредуктаз, содержащих аминокислотные последовательности, представленные под SEQ ID No: 2-22, полученных в примерах получения 5-2, по отдельности добавляли в каждую пробирку для центрифугирования. Добавляли 3 мл 0,1 M фосфатного буфера, 40 мг фермента 2, полученного в примере получения 5-1, и 40 мг соли NADP во вторую пробирку для центрифугирования вместимостью 5 мл, перемешивали до полного растворения. Затем 0,1 мл раствора из второй пробирки для центрифугирования медленно добавляли в каждую из первых пробирок для центрифугирования. Температуру повышали до 25°C и смесь перемешивали при 300 об/мин в течение 16 часов. Смешивали 0,1 мл полученного раствора с 0,9 мл метанола, встряхивали в течение 1 мин, фильтровали и затем переносили во флакон для жидкой фазы вместимостью 1 мл для анализа с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии. Отношение площади (S)-никотина соответствует степени превращения.

Данные о степени превращения показаны в таблице 2.

Таблица 2

Ссылаясь на данные в таблице 2, очевидно, что ферменты 1, 3, 4, 13-18 и 22 демонстрируют превосходную каталитическую эффективность по сравнению с другими ферментами с достижением степени превращения, составляющей 94,6% или больше.

Пример 9

В данном примере (S)-никотин получали с помощью биокаталитического способа.

Добавляли 4,5 г соединения C, полученного в примере получения 4-1, и 20 мл 0,1 M фосфатного буфера в трехгорлую круглодонную колбу вместимостью 50 мл, pH смеси регулировали до 7,0. Затем 4,8 г глюкозы добавляли в трехгорлую круглодонную колбу и перемешивали до полного растворения. Добавляли 10 мл 0,1 M фосфатного буфера, 0,3 г фермента 1, полученного в примере получения 5-2, 0,04 г фермента 2, полученного в примере получения 5-1, и 0,008 г соли NADP в колбу вместимостью 50 мл и перемешивали до полного растворения. Затем раствор из колбы медленно добавляли в трехгорлую круглодонную колбу. Температуру повышали до 30°C и полученную смесь перемешивали при 300 об/мин в течение 16 часов и фильтровали. Уровень pH фильтрата регулировали до 10 с помощью раствора гидроксида натрия. Затем фильтрат экстрагировали с помощью метил-трет-бутилового эфира, высушивали с помощью безводного сульфата натрия и концентрировали с получением 2,6 г (S)-никотина с чистотой 99%, оптической чистотой 100% и выходом 89,5%.

Полученный (S)-никотин очищали посредством колоночной хроматографии и определяли его характеристики с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Данные ЯМР являются следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, CDCl₃): δ ppm 8,54 (1H, d), 8,50 (1H, dd), 7,70 (1H, dt), 7,24-7,27 (1H, m), 3,22-3,27 (1H, m), 3,08 (1H, t), 2,27-2,34 (1H, m), 2,17-2,24 (1H, m), 2,16 (3H, m), 1,91-2,02 (1H, m), 1,79-1,87 (1H, m), 1,68-1,76 (1H, m). Результаты подтверждают успешный синтез (S)-никотина.

Пример 10

В данном примере (S)-никотин получали с помощью биокаталитического способа.

Добавляли 4,5 г соединения C, полученного в примере получения 3-1, и 20 мл 0,1 M фосфатного буфера в трехгорлую круглодонную колбу вместимостью 50 мл, pH смеси регулировали до 6,0. Затем 4,8 г глюкозы добавляли в трехгорлую круглодонную колбу и перемешивали до полного растворения. Добавляли 10 мл 0,1 M фосфатного буфера, 0,4 г фермента 3, полученного в примере получения 5-2, 0,04 г фермента 2, полученного в примере получения 5-1, и 0,008 г соли NADP в колбу вместимостью 50 мл и перемешивали до полного растворения. Затем раствор из колбы медленно добавляли в трехгорлую круглодонную колбу. Температуру повышали до 35°C и полученную смесь перемешивали при 300 об/мин в течение 16 часов и фильтровали. Уровень pH фильтрата регулировали до 10 с помощью раствора гидроксида натрия. Затем фильтрат экстрагировали с помощью этилацетата, высушивали с помощью безводного сульфата натрия и концентрировали с получением 2,4 г (S)-никотина с чистотой 99%, оптической чистотой 99,4% и выходом 82,6%.

Полученный (S)-никотин очищали посредством колоночной хроматографии и определяли его характеристики с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Данные ЯМР являются следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, CDCl₃): δ ppm 8,54 (1H, d), 8,50 (1H, dd), 7,70 (1H, dt), 7,24-7,27 (1H, m), 3,22-3,27 (1H, m), 3,08 (1H, t), 2,27-2,34 (1H, m), 2,17-2,24 (1H, m), 2,16 (3H, m), 1,91-2,02 (1H, m), 1,79-1,87 (1H, m), 1,68-1,76 (1H, m). Результаты подтверждают успешный синтез (S)-никотина.

Пример 11

В данном примере (S)-никотин получали с помощью биокаталитического способа.

Добавляли 4,5 г соединения C, полученного в примере получения 3-1, и 20 мл 0,1 M фосфатного буфера в трехгорлую круглодонную колбу вместимостью 50 мл, pH смеси регулировали до 6,0. Затем 4,8 г глюкозы добавляли в трехгорлую круглодонную колбу и перемешивали до полного растворения. Добавляли 10 мл 0,1 M фосфатного буфера, 0,4 г фермента 12, полученного в примере получения 5-3, и 0,008 г соли NADP в колбу вместимостью 50 мл и перемешивали до полного растворения. Затем раствор из колбы медленно добавляли в трехгорлую круглодонную колбу. Температуру повышали до 35°C и полученную смесь перемешивали при 300 об/мин в течение 16 часов и фильтровали. Уровень pH фильтрата регулировали до 10 с помощью раствора гидроксида натрия. Затем фильтрат экстрагировали с помощью этилацетата, высушивали с помощью безводного сульфата натрия и концентрировали с получением 2,3 г (S)-никотина с чистотой 99%, оптической чистотой 99,6% и выходом 79,2%.

Полученный (S)-никотин очищали посредством колоночной хроматографии и определяли его характеристики с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Данные ЯМР являются следующими: ¹H-ЯМР (400 MГц, CDCl₃): δ ppm 8,54 (1H, d), 8,50 (1H, dd), 7,70 (1H, dt), 7,24-7,27 (1H, m), 3,22-3,27 (1H, m), 3,08 (1H, t), 2,27-2,34 (1H, m), 2,17-2,24 (1H, m), 2,16 (3H, m), 1,91-2,02 (1H, m), 1,79-1,87 (1H, m), 1,68-1,76 (1H, m). Результаты подтверждают успешный синтез (S)-никотина.

Заявитель заявляет, что в настоящем изобретении проиллюстрирован способ получения (S)-никотина с применением способа восстановления из вышеуказанных вариантов осуществления, но настоящее изобретение не ограничено вышеуказанными вариантами осуществления, что не означает, что для осуществления настоящего изобретения необходимо опираться на вышеуказанные варианты осуществления. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что любые усовершенствования настоящего изобретения, эквивалентная замена исходных материалов и добавление вспомогательных компонентов к продукту по настоящему изобретению, а также выбор конкретных способов входят в пределы объема правовой охраны и раскрытия настоящего изобретения.

Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения подробно описаны выше, но настоящее изобретение не ограничено конкретными подробными данными вышеуказанных вариантов осуществления. В пределах объема технической концепции настоящего изобретения можно осуществлять множество простых изменений в отношении технического решения по настоящему изобретению, все из которых находятся в пределах объема правовой защиты настоящего изобретения.

Кроме того, следует отметить, что конкретные технические признаки, описанные в вышеуказанных конкретных вариантах осуществления, могут быть объединены любым подходящим образом без противоречия, и с целью избегания излишнего повторения в настоящем изобретении не описаны все возможные комбинированные способы.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ПОРТОН ФАРМА СОЛЮШНС ЛТД.

<120> СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ (S)-НИКОТИНА

<130> BY22DX0700FPPC-CN

<160> 22

<170> PatentIn версия 3.3

<210> 1

<211> 260

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Глюкозодегидрогеназа

<400> 1

Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ser

1 5 10 15

Thr Gly Leu Gly Lys Ser Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala

20 25 30

Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Lys Glu Asp Glu Ala Asn Ser Val

35 40 45

Leu Glu Glu Ile Lys Lys Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys Gly

50 55 60

Asp Val Thr Val Glu Ser Asp Val Ile Asn Leu Val Gln Ser Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Lys Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu

85 90 95

Asn Pro Val Ser Ser His Glu Met Ser Leu Ser Asp Trp Asn Lys Val

100 105 110

Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Thr Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg

260

<210> 2

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 2

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Glu Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ser Leu Glu Ser Trp Cys His Thr Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Asp Gln Ile Gly Thr Thr Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Thr Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Pro Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Val Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 3

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 3

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 4

<211> 258

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 4

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Ile Lys Gly Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Arg Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Asp Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Tyr Phe Ala Gly Gly

130 135 140

Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu Gly Leu

145 150 155 160

Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro Ile Leu

165 170 175

Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly Asp Phe

180 185 190

Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile Ser Arg

195 200 205

Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe Pro Arg

210 215 220

Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe Gly Gln

225 230 235 240

Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn Gly Ala

245 250 255

Ala Leu

<210> 5

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 5

Met Arg Pro Ile Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Thr Pro Leu Ile Ala Leu Gly Ala Ile Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Ser Glu Ala Ile Ala Ala Gly Asp Ile Thr Leu Ile Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asn

65 70 75 80

Ala Val Thr Gly Lys Leu Val Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Leu

85 90 95

Gly Ala Arg Thr Leu Glu Ser Trp Cys His Ala Arg Gly Ala Cys Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Asp Gln Ile Gly Thr Thr Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Asn Ala Ala Phe Arg Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Glu His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ser Arg Leu Thr Asp His Ala Ala Asp Ala Gly Ile Asp Asn Ser Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Glu Gln Gly Leu

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 6

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 6

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Ile Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ser Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Gln Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Asp Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Asn Thr Ala Phe Ser Asp Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Thr Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 7

<211> 276

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 7

Met Gly Thr Ala Leu Val Glu Ala Phe Leu Ala Gly Gly His Ala Thr

1 5 10 15

Thr Val Trp Asn Arg Thr Pro Gly Lys Ala Asp Gly Val Val Ala Arg

20 25 30

Gly Ala Val Val Ala Glu Thr Val Ala Glu Ala Val Ala Ala Ser Pro

35 40 45

Leu Val Val Val Cys Leu Trp Asp Asp Ala Val Val Arg Asp Val Leu

50 55 60

His Pro Val Ala Asp Ala Leu Ala Gly Arg Val Val Val Asn Leu Thr

65 70 75 80

Asn Gly Thr Pro Ala Gln Ala Arg Glu Met Ala Ala Trp Ala Ala Glu

85 90 95

His Gly Val Glu Tyr Val Asp Gly Gly Ile Met Ala Ile Pro Pro Gly

100 105 110

Ile Gly Thr Glu His Ala Phe Val Leu Tyr Ser Gly Ala Glu Ala Ala

115 120 125

Phe Glu Ala His Arg Glu Val Leu Glu Arg Leu Gly Ala Ala Lys Tyr

130 135 140

Leu Gly Ala Asp Ala Gly Leu Ala Ala Leu Phe Asp Leu Ala Leu Leu

145 150 155 160

Ser Gly Met Tyr Gly Thr Phe Ala Gly Leu Trp His Ser Leu Ala Met

165 170 175

Val Arg Thr Glu Asn Val Ser Ala Ala Glu Phe Val Pro Met Leu Gly

180 185 190

Pro Trp Met Gln Ala Met Ile Gly Gly Asn Leu Asp Arg Leu Ala His

195 200 205

Gln Leu Asp Thr Gly Asp Tyr Gly His Glu Val Val Ser Asn Leu Ala

210 215 220

Met Gln Ala Ala Ala Phe Pro Asn Ile Val Gln Ala Ser Leu Asp Gln

225 230 235 240

Gly Ile Arg Pro Asp Leu Met Ala Pro Ile Gln Arg Leu Met Asp Gln

245 250 255

Ala Val Ala Ala Gly His Gly Ala Glu Asp Val Ala Val Val Val Asp

260 265 270

Leu Leu Lys Asn

275

<210> 8

<211> 291

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 8

Met Lys Pro Thr Leu Thr Val Ile Gly Ala Gly Arg Met Gly Ser Ala

1 5 10 15

Leu Ile Lys Ala Phe Leu Gln Ser Gly Tyr Thr Thr Thr Val Trp Asn

20 25 30

Arg Thr Lys Ala Lys Ser Glu Pro Leu Ala Lys Leu Gly Ala His Leu

35 40 45

Ala Asp Thr Val Arg Asp Ala Val Lys Arg Ser Asp Ile Ile Val Val

50 55 60

Asn Val Leu Asp Tyr Asp Thr Ser Asp Gln Leu Leu Arg Gln Asp Glu

65 70 75 80

Val Thr Arg Glu Leu Arg Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Thr Ser Gly

85 90 95

Ser Pro Ala Leu Ala Arg Glu Gln Glu Thr Trp Ala Arg Gln His Gly

100 105 110

Ile Asp Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asp Phe Ile Gly

115 120 125

Gln Ala Glu Cys Ala Leu Leu Tyr Ser Gly Ser Ala Ala Leu Phe Glu

130 135 140

Lys His Arg Ala Val Leu Asn Val Leu Gly Gly Ala Thr Ser His Val

145 150 155 160

Gly Glu Asp Val Gly His Ala Ser Ala Leu Asp Ser Ala Leu Leu Phe

165 170 175

Gln Met Trp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Leu Gln Ala Leu Ala Ile Ser

180 185 190

Arg Ala Glu Gly Ile Pro Leu Glu Lys Thr Thr Ala Phe Ile Lys Leu

195 200 205

Thr Glu Pro Val Thr Gln Gly Ala Val Ala Asp Val Leu Thr Arg Val

210 215 220

Gln Gln Asn Arg Leu Thr Ala Asp Ala Gln Thr Leu Ala Ser Leu Glu

225 230 235 240

Ala His Asn Val Ala Phe Gln His Leu Leu Ala Leu Cys Glu Glu Arg

245 250 255

Asn Ile His Arg Gly Val Ala Asp Ala Met Tyr Ser Val Ile Arg Glu

260 265 270

Ala Val Lys Ala Gly His Gly Lys Asp Asp Phe Ala Ile Leu Thr Arg

275 280 285

Phe Leu Lys

290

<210> 9

<211> 329

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 9

Met Val Ser Ser Pro Tyr Leu Asn Val Thr Ala Tyr Pro Lys Val Arg

1 5 10 15

Asn Leu Pro Trp Pro Val Pro Gly Pro Ile Arg Val Ala Ser Gln Ile

20 25 30

Leu Glu Leu Arg Pro Met Thr Thr Ile Gly Phe Leu Gly Ala Gly Arg

35 40 45

Met Gly Ser Ala Leu Val Lys Ser Leu Leu Glu Ala Gly His Ser Val

50 55 60

His Val Trp Asn Arg Thr Ala Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Asp Phe

65 70 75 80

Gly Ala Val Pro Glu Pro Ser Ala Glu Arg Ala Ala Gly Pro Ala Glu

85 90 95

Ile Val Ile Val Asn Leu Leu Asp Tyr Glu Ala Ser Asp Ala Glu Leu

100 105 110

Arg Lys Pro Asp Val Ala Glu Ala Leu Lys Gly Lys Leu Leu Val Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Ser Pro Lys Thr Ala Arg Glu Thr Gly Arg Trp Ala

130 135 140

Gly Asp His Gly Ile Ala Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro

145 150 155 160

Asn Phe Ile Gly Gly Ala Glu Thr Val Ile Leu Tyr Ser Gly Ser Lys

165 170 175

Thr His Phe Glu Lys His Glu Gly Leu Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys

180 185 190

Ser Ala Phe Val Gly Glu Asp Phe Gly Thr Ala Ser Ala Leu Asp Ser

195 200 205

Ala Leu Leu Ser Gln Met Trp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Leu Gln Ala

210 215 220

Leu Ala Val Cys Arg Ala Glu Gly Ile Glu His Asp Val Tyr Ala Gly

225 230 235 240

Phe Leu Met Ser Ala Gln Pro Met Ile Asp Gly Ala Gln Gln Asp Leu

245 250 255

Met Glu Arg Ile Arg Asp Gly Arg Asp Leu Ala Asp Ala Gln Thr Leu

260 265 270

Ala Thr Val Ala Val His Asn Val Ala Phe His His Leu Arg Asp Leu

275 280 285

Ile Ala Asp Arg Asp Leu Asn Pro Ala Phe Gly Asp Ala Leu Gly Ser

290 295 300

Leu Leu Glu Thr Ala Leu Arg Asn Asp His Gln Asp Asp Asp Phe Ala

305 310 315 320

Val Leu Ala Arg Phe Met Gly Ala Lys

325

<210> 10

<211> 293

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 10

Met Thr Asp Leu Gly Lys Ser Ala Val Thr Val Leu Gly Leu Gly Ala

1 5 10 15

Met Gly Thr Ala Leu Ala Glu Ala Leu Leu Ala Ala Gly His Pro Thr

20 25 30

Thr Val Trp Asn Arg Ser Pro Ala Arg Thr Ala Gly Pro Ala Gln Arg

35 40 45

Gly Ala Ala Val Ala Ala Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ala Ala Ser Arg

50 55 60

Leu Ile Val Val Cys Leu Leu Asp His Thr Ser Val His Ala Val Leu

65 70 75 80

Asp Gly Gln Glu Leu Thr Gly Arg Ile Val Val Asn Leu Thr Ser Gly

85 90 95

Thr Pro Gly Gln Ala Arg Glu Leu Asp Ala Arg Val Ala Glu Arg Gly

100 105 110

Gly Asp His Leu Asp Gly Ala Val Leu Ala Val Pro Ser Met Ile Gly

115 120 125

Thr Pro Asp Ala Ser Val Leu Tyr Ser Gly Ser Arg Gly Ala Phe Asp

130 135 140

Thr His Arg Pro Val Leu Glu Val Phe Gly Ala Ala Asp Tyr Val Gly

145 150 155 160

Ala Asp Pro Gly Ala Ala Ser Leu Gln Asp Ala Ala Leu Leu Ser Ala

165 170 175

Met Tyr Gly Gln Val Ala Gly Val Leu His Ala Phe Ala Leu Val Arg

180 185 190

Ser Ala Gly Val Thr Ala Thr Glu Phe Leu Pro Arg Leu Val Gly Trp

195 200 205

Leu Thr Ala Met Gly Gly Phe Pro Ala Asp Ala Ala Arg Arg Ile Asp

210 215 220

Ala Arg Ala Tyr Ala Asp Asp Val Asp Ala Ala Leu Thr Met Gln Val

225 230 235 240

Thr Ala Val Arg Asn Leu Val Arg Ala Ala Arg Glu Gln Gly Val Ser

245 250 255

Ala Glu Leu Ile Ala Pro Leu Val Pro Val Met Gln Arg Arg Ile Asp

260 265 270

Asp Gly Asp Gly Gly Asp Asp Leu Ala Ala Leu Val Glu Val Ile Thr

275 280 285

Ala Glu Glu Val Ala

290

<210> 11

<211> 290

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 11

Met Thr Asp Lys Pro Pro Val Thr Val Leu Gly Leu Gly Ala Met Gly

1 5 10 15

Thr Ala Leu Ala Arg Thr Leu Leu Asn Ala Gly Tyr Pro Thr Thr Val

20 25 30

Trp Asn Arg Thr Ala Ser Lys Thr Ala Pro Leu Thr Glu Leu Gly Ala

35 40 45

His Ala Ala Asp Ser Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Gly Glu Leu Val

50 55 60

Leu Ala Cys Leu Leu Asp Tyr Asp Ser Val His Gln Thr Leu Ala Gly

65 70 75 80

Thr Gly Asp Ala Leu Arg Gly Lys Ala Phe Val Asn Leu Thr Asn Gly

85 90 95

Thr Pro Glu Gln Ala Arg Ala Leu Ala Gly Lys Leu Asp Thr Ala Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Gly Ile Met Ala Val Pro Pro Met Ile Gly Ser Pro Gly

115 120 125

Ala Phe Leu Phe Tyr Ser Gly Glu Ile Ala Val Phe Glu Gln Tyr Arg

130 135 140

Pro Val Leu Glu Ser Phe Gly Glu Ala Ile Glu Val Gly Thr Asp Pro

145 150 155 160

Gly Leu Ala Ala Leu His Asp Leu Ala Leu Leu Ser Ala Met Tyr Gly

165 170 175

Met Phe Gly Gly Val Leu Gln Ala Phe Ala Leu Thr Gly Ser Ala Gly

180 185 190

Val Ser Ala Ala Ser Leu Ala Pro Leu Leu His Arg Trp Leu Asp Gly

195 200 205

Met Ser Gly Phe Ile Ala Gln Ser Ala Ala Gln Leu Asp Ser Gly Asp

210 215 220

Phe Ala Thr Gly Val Val Ser Asn Leu Ala Met Gln Asp Thr Gly Phe

225 230 235 240

Ala Asn Leu Phe Arg Ala Ala Lys Glu Gln Gly Ile Ser Thr Gly Gln

245 250 255

Leu Glu Pro Leu Gly Ala Leu Ile Arg Arg Arg Val Glu Asp Gly His

260 265 270

Gly Ala Glu Asp Leu Ala Gly Ile Val Glu Tyr Leu Lys Ile Gly Ala

275 280 285

Asn Ala

290

<210> 12

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 12

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 13

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 13

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Val Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Ala Ala Ala Tyr Phe Ala

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 14

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 14

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 15

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 15

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Gly Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 16

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 16

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Ala Val Ala Tyr Phe Gly

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Thr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Gly Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 17

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 17

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Ala Val Ala Tyr Phe Gly

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Gly Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 18

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 18

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Ala Ala Ala Tyr Phe Gly

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Gly Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 19

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 19

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Val Ala Tyr Phe Gly

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Gly Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 20

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 20

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Gly

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 21

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 21

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Gly

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<210> 22

<211> 292

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Иминредуктаза

<400> 22

Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys

50 55 60

Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr

100 105 110

Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp

115 120 125

Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu

130 135 140

Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Gly

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu

180 185 190

Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Asp Phe Asp His Pro Thr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe

245 250 255

Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe

260 265 270

Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn

275 280 285

Gly Ala Ala Gln

290

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения (S)-никотина посредством восстановления. Указанный способ включает осуществление процесса восстановления алкенового соединения, представленного формулой I, и/или иминиевого катионного соединения, представленного формулой II, с получением таким образом (S)-никотина, причем восстановление осуществляют с применением биокаталитического метода или хирального металлического катализатора. Настоящее изобретение обеспечивает получение (S)-никотина, не требующее осуществления метилирования и обеспечивающее безопасность, а также высокий выход и высокую чистоту получаемого продукта. 9 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 11 пр.

1. Способ получения (S)-никотина посредством восстановления, включающий:

осуществление процесса восстановления алкенового соединения, представленного формулой I, и/или иминиевого катионного соединения, представленного формулой II, с получением таким образом (S)-никотина:

Формула I; Формула II;

при этом процесс восстановления проводят с применением биокаталитического способа и биокаталитический способ включает:

осуществляемое в системе с циклическим использованием кофермента каталитическое восстановление алкенового соединения, представленного формулой I, и/или иминиевого катионного соединения, представленного формулой II, с помощью иминредуктазы в качестве катализатора для реакции каталитического восстановления с получением таким образом (S)-никотина;

при этом система с циклическим использованием кофермента содержит кофермент, глюкозу и глюкозодегидрогеназу; и при этом иминредуктаза содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID No: 2-6 и SEQ ID No: 12-22;

или

процесс восстановления проводят с применением хирального металлического катализатора и он включает:

осуществляемое в атмосфере газообразного водорода каталитическое восстановление алкенового соединения, представленного формулой I, и/или иминиевого катионного соединения, представленного формулой II, с помощью хирального металлического катализатора с получением таким образом (S)-никотина;

при этом хиральный металлический катализатор выбран из димера хлор(1,5-циклооктадиен)иридия (I), тетрафторбората (-)-1,2-бис((2S,5S)-2,5-диметилфосфино)этан(циклооктадиен)родия (I) и [(R)-(+)-2,2’-бис(дифенилфосфино)1,1’-бинафтил]дихлоррутения (II), и при этом лиганд выбран из (S)-(+)-1-((R)-2-дифенилфосфино)ферроценил)этилди-трет-бутилфосфина, (S)-(-)-1-((R)-2-дифенилфосфино)ферроценил)этилди-трет-бутилфосфина, (S)-NMDPP, (R)-(+)-BINAP, (R,R)-(2-(4’-изопропилоксазолин-2’-ил)ферроценил)дифенилфосфина, (R)-(S)-JOSIPHOS, (R)-(S)-Cy2PF-P(tBu)2, (R)-(S)-PPF-P(tBu)2, (S,S)-Ph-BPE, (S, S)-Me-BPE, (S,S)-DIOP, (S)-MONOPHOS, лиганда троста (S,S)-DACH-фенил, (R)-SEGPHOS, (S)-MeO-BIPHEP, (S,S)-TsDPEN, (R,R)-f-SpiroPhos и (R,R)-Et-Duphos.

2. Способ по п. 1, где кофермент предусматривает соль NADP и/или соль NAD, предпочтительно соль NADP;

предпочтительно глюкозодегидрогеназа содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID No: 1.

3. Способ по п. 1, где иминредуктаза содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID No: 2-4, SEQ ID No: 12.

4. Способ по п. 1, где реакцию каталитического восстановления с применением биокаталитического способа проводят при температуре в диапазоне от 15 до 45°C;

предпочтительно реакцию каталитического восстановления осуществляют в буферном растворе; и буферный раствор предусматривает фосфатный буфер, буфер на основе Tris-HCl или буфер на основе TEA-HCl;

предпочтительно реакцию каталитического восстановления проводят при pH в диапазоне от 6,0 до 8,0.

5. Способ по п. 1, где реакцию каталитического восстановления с применением хирального металлического катализатора проводят при температуре в диапазоне от 50 до 100°C;

предпочтительно во время реакции каталитического восстановления поддерживают давление газообразного водорода в диапазоне от 1,0 до 6,0 МПа;

предпочтительно реакцию каталитического восстановления проводят при pH в диапазоне от 4,0 до 13,0.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где алкеновое соединение, представленное формулой I, или иминиевое катионное соединение, представленное формулой II, получают путем обессоливания и/или циклизации соединения, представленного формулой III, или его соли,

Формула III;

предпочтительно соль предусматривает гидрохлорид, дигидрохлорид, гидробромид, дигидробромид, сульфат или бисульфат.

7. Способ по п. 6, где способ синтезирования соли соединения, представленного формулой III, включает:

смешивание соединения A с N-метилпирролидоном и органическим основанием с получением соединения D и смешивание соединения D с кислотой с получением соли соединения формулы III; и уравнения реакции являются следующими:

8. Способ по п. 6, где способ синтезирования соли соединения, представленного формулой III, включает:

смешивание соединения A с N-метилпирролидоном и органическим основанием и нейтрализацию с помощью кислоты с достижением pH, составляющего 7-8, с получением таким образом соединения B и смешивание соединения B с кислотой с получением соли соединения, представленного формулой III; и уравнения реакции являются следующими:

9. Способ по п. 7 или 8, где способ синтезирования соединения A включает

смешивание никотиновой кислоты с метанолом и этерифицирование в высококислой среде с получением таким образом соединения A.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где способ синтезирования (S)-никотина включает:

смешивание никотиновой кислоты с метанолом и этерифицирование в высококислой среде с получением таким образом соединения A; смешивание соединения A с N-метилпирролидоном и органическим основанием, необязательно добавление первой кислоты для нейтрализации с получением соединения B или соединения D; смешивание соединения B или соединения D с кислотой с получением таким образом соли соединения, представленного формулой III; обессоливание и циклизацию соли соединения, представленного формулой III, и восстановление полученного продукта с применением биокаталитического способа или хирального металлического катализатора с получением (S)-никотина; и уравнения реакции являются следующими: