Новые варианты интерлейкина-2 для лечения рака Российский патент 2025 года по МПК C07K14/55 C07K16/28 C07K19/00 C12P21/00 A61K38/20 A61K47/68 A61P35/00 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТЫ

Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США №62/947,806, поданной 13 декабря 2019 г., и предварительной заявки на патент США №62/861,651, поданной 14 июня 2019 г., каждая из которых полностью включена сюда посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интерлейкин-2 (IL-2) был первым фактором роста, описанным для Т-клеток. С момента его открытия было показано, что он стимулирует пролиферацию и выживание Т-клеток in vitro (Smith, K.А. (1988) Science. 240, 1169-76) и их способность стимулировать иммунный ответ в контексте Т-вирусных инфекций (Blattman, J N, et al. (2003) Nat Med 9, 540-7) или вакцин (Fishman, M., et al. (2008) J Immunother. 31, 72-80; Kudo-Saito, C, et al. (2007) Cancer Immunol Immunother. 56, 1897-910; Lin, С Т., et al. (2007) Immunol Lett. 114, 86-93).

IL-2 применяют в терапии рака. Рекомбинантный человеческий IL-2 является эффективной иммунотерапией метастатической меланомы и рака почки с продолжительными ответами приблизительно у 10% пациентов. Тем не менее, оптимальное дозирование IL-2 ограничено коротким периодом полувыведения и сильной токсичностью. Кроме того, IL-2 также связывается с его гетеротримерным рецептором IL-2Rαβγ с большей аффинностью, что приводит к преимущественному росту числа иммуносупрессивных регуляторных Т-клеток (Treg) с высокими уровнями конститутивной экспрессии IL-2Rα. С точки зрения иммунотерапии рака, рост числа Treg является нежелательным эффектом IL-2. Вследствие этого, для успешной иммунотерапии рака с использованием IL-2 необходимо решить две фундаментально важные проблемы: (1) как ограничить побочные эффекты, сохранив необходимую активность; и (2) как обеспечить преимущественную активацию эффекторных Т-клеток, ограничив при этом стимуляцию Treg.

Недавно было обнаружено, что IL-2 может быть модифицирован для селективной стимуляции цитотоксических эффекторных Т-клеток. Различные методики позволили получить варианты IL-2 с улучшенными и избирательными иммуностимулирующими способностями. Некоторые из этих вариантов IL-2 были разработаны для повышения способности этой молекулы передавать сигнал главным образом через высокоаффинный рецептор (цепи альфа, бета и гамма), а не через рецептор с промежуточной аффинностью (цепи бета и гамма). Основная идея состояла в усилении передачи сигнала в Т-клетках, но не в NK-клетках, которые, предположительно, приводят к наблюдаемым токсическим эффектам. К этому направлению работы относятся следующие изобретения: патент США №7,186,804, патент США №7,105,653, патент США №6,955,807, патент США №5,229,109, заявка на патент США 20050142106. Важно отметить, что ни одно из этих изобретений не относится к вариантам IL-2, которые обладали бы большей терапевтической эффективностью in vivo, чем нативный IL-2.

В заключение, IL-2 является высоко плейотропным цитокином, имеющим большое значение для биологической активности различных клеточных популяций. Это свойство делает IL-2 важным узлом регуляции иммунного ответа и привлекательной мишенью при различных видах терапии и комплексной иммуномодуляции. Кроме того, могут быть получены варианты IL-2, более склонные к связыванию с определенными рецепторными субъединицами, для обеспечения селективной иммуномодуляции, опосредованной IL-2, с преимущественной пролиферацией и активацией Teff-клеток, атакующих раковые клетки, при одновременном снижении пролиферации и активации Treg-клеток.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение относится к получению мутантных вариантов IL-2, характеризующихся тем, что они являются селективными агонистами активности IL-2 со сниженной или устраненной способностью к связыванию с IL-2Rα. Конкретно, эти варианты обеспечат способ преодоления ограничений, наблюдаемых при терапии нативным IL-2 вследствие его подтвержденной способности увеличивать число естественных регуляторных Т-клеток in vivo. Настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим такую же первичную последовательность, как человеческий IL-2, за исключением нескольких аминокислот, которые были изменены посредством мутаций. Введенные мутации существенно снижают способность этих полипептидов стимулировать Treg-клетки и повышают эффективность IL-2. Кроме того, введенные мутации будут, предположительно, уменьшать VLS (синдром повышенной проницаемости сосудов), опосредованный CD25, и эффект клиренса, опосредованный CD25. Настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим такую же первичную последовательность, как человеческий IL-2, за исключением одной или нескольких аминокислот, которые были изменены посредством мутаций. Настоящее изобретение также включает терапевтические применения этих мутантных вариантов, самих по себе, или в комбинации с вакцинами, или ингибиторами иммунных контрольных точек, или биологическими агентами, нацеленными на опухоль-ассоциированные антигены (ТАА), или в составе бифункциональной слитой конструкции для лечения таких заболеваний, как рак или инфекции, где активность регуляторных Т-клеток (Treg) нежелательна.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к получению мутантных вариантов IL-2, характеризующихся тем, что они являются селективными агонистами активности IL-2 с оптимально модулированной общей активностью посредством снижения взаимодействия с IL-2Rβγ, в дополнение к сниженной или устраненной способности к связыванию с IL-2Rα. Введенные мутации предотвращают избыточную активацию пути IL-2, уменьшают нежелательную токсичность, обусловленную связыванием с мишенью вне целевой ткани, уменьшают потенциальный клиренс, уменьшают активационное истощение клеток, связанное с избыточной стимуляцией лимфоцитов, сдерживают рецептор-опосредованную интернализацию IL-2 и, таким образом, увеличивают период полувыведения in vivo и приводят к медленной и продолжительной фармакодинамике, улучшая биораспределение, биодоступность, функционирование и противоопухолевую эффективность. Авторы настоящего изобретения также предполагают, что применение вариантов IL-2 со сниженным/устраненным связыванием с IL-2Rα и ослабленной активностью в отношении IL-2Rβγ должно способствовать установлению стехиометрического баланса между цитокиновой и антителосодержащей частями, демонстрирующими значительно различающиеся активность и молекулярные массы, позволяя определять оптимальные дозы и поддерживать функцию каждой из этих частей. Настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим такую же первичную последовательность, как человеческий IL-2, за исключением одной или нескольких аминокислот, которые были изменены посредством мутаций. Настоящее изобретение также включает терапевтические применения этих мутантных вариантов, самих по себе, или в комбинации с вакцинами, или ингибиторами иммунных контрольных точек, или биологическими агентами, нацеленными на опухоль-ассоциированные антигены (ТАА), или в составе бифункциональной слитой конструкции для лечения таких заболеваний, как рак или инфекции.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к получению мутантных вариантов IL-2, характеризующихся тем, что они являются селективными агонистами активности IL-2 со сниженным взаимодействием с IL-2Rβγ, в дополнение к сниженной или устраненной способности к связыванию с IL-2Rα. Введенные мутации обеспечивают длительную и продолжительную фармакодинамику и, возможно, фармакокинетику. Кроме того, введенные мутации уменьшают истощение клеток и гибель клеток, вызванную их активацией, и усиливают продолжительную реактивность лимфоцитов. В результате введенные мутации позволяют использовать схему с более редким введением и обеспечивают удобство введения при клиническом применении. Кроме того, согласно предположениям, это приведет к снижению себестоимости. Настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим такую же первичную последовательность, как человеческий IL-2, за исключением одной или нескольких аминокислот, которые были изменены посредством мутаций. Настоящее изобретение также включает терапевтические применения этих мутантных вариантов, самих по себе, или в комбинации с вакцинами, или ингибиторами иммунных контрольных точек, или биологическими агентами, нацеленными на опухоль-ассоциированные антигены (ТАА), или в составе бифункциональной слитой конструкции для лечения таких заболеваний, как рак или инфекции.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к получению мутантных вариантов IL-2, характеризующихся тем, что они являются селективными агонистами активности IL-2 с устраненным связыванием с IL-2Rα и усиленными эффекторными Т- и NK-клеточными ответами неожиданно высокой интенсивности, не соответствующей их эквиваленту дикого типа. Предполагается, что мутации, устраняющие связывание с CD25, будут уменьшать клиренс, обусловленный связыванием с CD25 или CD25+ клетками, и, вследствие этого, повышать доступность для IL-2Rβγ. Повышенная степень занятости рецепторов приводит к сильному цитотоксическому клеточному ответу и высокой эффективности уничтожения опухолевых клеток. Настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим такую же первичную последовательность, как человеческий IL-2, за исключением одной или нескольких аминокислот, которые были изменены посредством мутаций. Настоящее изобретение также включает терапевтические применения этих мутантных вариантов, самих по себе, или в комбинации с вакцинами, или ингибиторами иммунных контрольных точек, или биологическими агентами, нацеленными на опухоль-ассоциированные антигены (ТАА), или в составе бифункциональной слитой конструкции для лечения таких заболеваний, как рак или инфекции.

В одном аспекте настоящего изобретения вводимые мутации снижали способность к связыванию с IL-2Rα (CD25), но сохраняли низкие уровни Treg-ответа. Остаточные иммунорегуляторные Treg обеспечивают иммунный противовес, повышая системную переносимость и предотвращая чрезмерное смещение иммунного равновесия в сторону цитотоксических эффекторных клеток. Тонко настроенный Treg-ответ не снижает эффективность уничтожения опухолевых клеток, но достаточно силен для поддержания периферической толерантности. Настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим такую же первичную последовательность, как человеческий IL-2, за исключением одной или нескольких аминокислот, которые были изменены посредством мутаций. Настоящее изобретение также включает терапевтические применения этих мутантных вариантов, самих по себе, или в комбинации с вакцинами, или ингибиторами иммунных контрольных точек, или биологическими агентами, нацеленными на опухоль-ассоциированные антигены (ТАА), или в составе бифункциональной слитой конструкции для лечения таких заболеваний, как рак или инфекции.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к получению мутантных вариантов IL-2, обладающих сниженной агрегацией, повышенной экспрессией, улучшенными возможностями их изготовления и разработки с комбинацией свойств, включая, например, существенно сниженную способность к стимуляции Treg-клеток, меньшую избыточную активацию рецепторов, меньшую нежелательную токсичность, обусловленную связыванием с мишенью вне целевой ткани, и длительную фармакодинамику для улучшения биораспределения, биодоступности, функционирования и противоопухолевой эффективности. Настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим такую же первичную последовательность, как человеческий IL-2, за исключением одной или нескольких аминокислот, которые были изменены посредством мутаций. Настоящее изобретение также включает терапевтические применения этих мутантных вариантов, самих по себе, или в комбинации с вакцинами, или ингибиторами иммунных контрольных точек, или биологическими агентами, нацеленными на опухоль-ассоциированные антигены (ТАА), или в составе бифункциональной слитой конструкции для лечения таких заболеваний, как рак или инфекции.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к получению мутантных вариантов IL-2, характеризующихся уменьшением сильной токсичности, такой как синдром повышенной проницаемости сосудов (VLS), ассоциированный с высокими дозами IL-2, применяемыми в клинических условиях для лечения почечной карциномы и меланомы. Конкретно, введенные мутации существенно снижают способность к связыванию с IL-2Rα (CD25), вследствие чего уменьшают связывание с CD25+ эндотелиальными клетками легких и, предположительно, будут предотвращать повреждение эндотелиальных клеток и существенно уменьшать VLS. Настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим такую же первичную последовательность, как человеческий IL-2, за исключением одной или нескольких аминокислот, которые были изменены посредством мутаций. Настоящее изобретение также включает терапевтические применения этих мутантных вариантов, самих по себе, или в комбинации с вакцинами, или модуляторами иммунных контрольных точек, или биологическими агентами, нацеленными на опухоль-ассоциированные антигены (ТАА), или в составе бифункциональной слитой конструкции для лечения таких заболеваний, как рак или инфекции, для улучшения профиля безопасности.

Настоящее изобретение позволяет существенно улучшить существующие методики иммуномодуляции, основанные на IL-2, при лечении рака. Конкретно, замена нативного IL-2 мутантными вариантами, описанными здесь, приведет к отсутствию преимущественной стимуляции Treg-клеток по сравнению с цитотоксическими эффекторными клетками, уменьшению нежелательной токсичности, обусловленной связыванием с мишенью вне целевой ткани, минимизации клеточного истощения, связанного с избыточной стимуляцией, и улучшению фармакодинамики и, возможно, фармакокинетики. Предположительно, мутации ослабят связывание с CD25+ эндотелиальными клетками легких и, вследствие этого, будут уменьшать VLS. В различных воплощениях вариант (или мутант) IL-2 содержит последовательность варианта (или мутанта) IL-2, имеющую происхождение от последовательности полипептида зрелого человеческого IL-2, представленной в SEQ ID NO: 3. В различных воплощениях вариант IL-2 функционирует как агонист IL-2. В различных воплощениях вариант IL-2 функционирует как антагонист IL-2. В различных воплощениях варианты IL-2 содержат SEQ ID NO: 31-66, или SEQ ID NO: 111-120, или аминокислоты 9-133, 10-133 и 11-113 SEQ ID NO: 47.

В другом аспекте варианты IL-2 по настоящему изобретению соединены с по меньшей мере одним гетерологичным белком. В различных воплощениях варианты IL-2 слиты с по меньшей мере одним полипептидом, придающим слитой молекуле увеличенный период полувыведения. Такие полипептиды включают Fc IgG или другие полипептиды, связывающиеся с неонатальным Fc-рецептором, человеческий сывороточный альбумин или полипептиды, связывающиеся с белком, имеющим увеличенный период полувыведения из сыворотки. В различных воплощениях вариант IL-2 слит с молекулой Fc IgG. В различных воплощениях Fc-домен представляет собой Fc-домен человеческого IgG. В различных воплощениях Fc-домен имеет происхождение от последовательности константного домена тяжелой цепи человеческого IgG1, представленной в SEQ ID NO: 6. В различных воплощениях Fc-домен представляет собой Fc-домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7. В различных воплощениях Fc-домен представляет собой Fc-домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8. В различных воплощениях Fc-домен имеет происхождение от последовательности константного домена тяжелой цепи человеческого IgG2. В различных воплощениях Fc-домен имеет происхождение от последовательности константного домена тяжелой цепи человеческого IgG4.

В различных воплощениях варианты IL-2 могут быть связаны с N-концом или С-концом Fc-области IgG.

Термин «Fc» относится к молекуле или последовательности, содержащим последовательность фрагмента целого антитела, не являющегося антигенсвязывающим фрагментом, в мономерной или мультимерной форме. Иммуноглобулин, являющийся источником нативного Fc, предпочтительно имеет человеческое происхождение и может представлять собой любой из иммуноглобулинов, раскрытых в данной области. Нативные Fc составлены из мономерных полипептидов, которые могут быть связаны с образованием димерных или мультимерных форм ковалентными (то есть дисульфидными) и нековалентными связями. Число межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Fc варьирует от 1 до 4 в зависимости от класса (например, IgG, IgA, IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2). Одним примером нативного Fc является дисульфидно связанный димер, полученный в результате расщепления IgG папаином (см. Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). При использовании здесь термин «нативный Fc» является общим для мономерных, димерных и мультимерных форм. Fc-домены содержат сайты связывания для белка А, белка G, различных Fc-рецепторов и белков комплемента.

В различных воплощениях термин «вариант Fc» относится к молекуле или последовательности, модифицированным относительно нативного Fc, но все еще содержащим сайт связывания для реутилизациоиного рецептора FcRn. Типичные варианты Fc, а также взаимодействие с реутилизационным рецептором описаны в международных заявках WO 97/34631 (опубликована 25 сентября 1997 г.) и WO 96/32458, включенных сюда посредством ссылки. Кроме того, нативный Fc содержит сайты, которые могут быть удалены, поскольку они придают структурные характеристики или биологическую активность, не являющиеся необходимыми для слитых молекул по настоящему изобретению. Таким образом, в различных воплощениях термин «вариант Fc» включает молекулу или последовательность, в которых нет одного или более чем одного сайта или остатка нативного Fc, влияющих на или вовлеченных в (1) образование дисульфидных связей, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) N-концевую неоднородность при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с Fc-рецептором, отличным от реутилизационного рецептора, или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).

Термин «Fc-домен» охватывает молекулы и последовательности нативных Fc и вариантов Fc, определенные выше. Как в случае вариантов Fc и нативных Fc, термин «Fc-домен» включает молекулы в мономерной или мультимерной форме, полученные расщеплением целого антитела, рекомбинантной экспрессией генов или иным образом. В различных воплощениях «Fc-домен» относится к димеру двух Fc-доменных мономеров (SEQ ID NO: 6), который обычно содержит полноразмерную шарнирную область или ее часть. В различных воплощениях возможны мутации Fc-домена для устранения эффекторных функций. В различных воплощениях каждый из Fc-доменных мономеров в Fc-домене содержит аминокислотные замены в константном домене СН2 антитела для снижения взаимодействия или связывания между Fc-доменом и Fcγ-рецептором. В различных воплощениях каждая субъединица Fc-домена содержит три аминокислотные замены, снижающие связывание с активирующим Fc-рецептором и/или эффекторную функцию, где указанные аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и G237A (SEQ ID NO: 7). В различных воплощениях каждая субъединица Fc-домена содержит три аминокислотные замены, снижающие связывание с активирующим Fc-рецептором и/или эффекторную функцию, где указанные аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и P329G.

В различных воплощениях возможны мутации Fc-домена для дополнительного увеличения периода полувыведения in vivo. В различных воплощениях каждая субъединица Fc-домена содержит три аминокислотные замены M252Y, S254T и Т256Е, раскрытые в публикации патента США №7,658,921, усиливающие связывание с человеческим FcRn. В различных воплощениях каждая субъединица Fc-домена содержит аминокислотную замену N434A (SEQ ID NO: 8), раскрытую в публикации патента США №7,371,826. В различных воплощениях каждая субъединица Fc-домена содержит аминокислотную замену M428L или N434S, раскрытую в публикации патента США №8,546,543, усиливающую связывание с человеческим FcRn. В различных воплощениях возможны комбинации мутаций, увеличивающих период полувыведения, с аминокислотными заменами, снижающими связывание с активирующим Fc-рецептором и/или эффекторную функцию.

В различных воплощениях Fc-слитый белок варианта IL-2 будет мономерным, то есть будет содержать только одну молекулу мутеина IL-2. В таких воплощениях слитый белок экспрессируют совместно с гетеродимерным Fc (например, Knob-Fc, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9), связанным с вариантом IL-2, и соответствующим гетеродимерным Fc (например, Hole-Fc, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10). Белок, полученный при образовании гетеродимера двух Fc-содержащих полипептидов, содержит только моновалентный вариант IL-2. В различных воплощениях гетер од имерный Fc-домен, используемый для получения моновалентных Fc-слитых белков IL-2 представляет собой Knob-Fc-домен со сниженной/устраненной эффекторной функцией и увеличенным периодом полувыведения (SEQ ID NO: 134) и Hole-Fc-домен со сниженной/устраненной эффекторной функцией и увеличенным периодом полувыведения (SEQ ID NO: 135).

В различных воплощениях варианты IL-2 по настоящему изобретению могут быть соединены с антителом, придающим слитой молекуле увеличенный период полувыведения, таким как антитело против гемоцианина фиссуреллы (KLH). Такое антитело распознает чужеродный антиген, придает более продолжительный период полувыведения, но не обладает биологической функцией или вредностью для человека. Класс IgG может представлять собой IgG, IgA, IgE или подкласс (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgA2).

В различных воплощениях конструкции варианта IL-2 по настоящему изобретению содержат нацеливающую группировку в форме антитела, фрагмента антитела, белка или пептида, связывающуюся с молекулой, содержание которой повышено в раковой ткани, такой как опухоль-ассоциированный антиген (ТАА).

ТАА может представлять собой любую молекулу, макромолекулу, комбинацию молекул и так далее, против которых желателен иммунный ответ. ТАА может представлять собой белок, содержащий более чем одну полипептидную субъединицу. Например, белок может представлять собой димер, тример или мультимер более высокого порядка. В различных воплощениях две или более субъединиц белка могут быть соединены ковалентной связью, такой как, например, дисульфидная связь. В различных воплощениях субъединицы белка могут удерживаться вместе за счет нековалентных взаимодействий. Таким образом, ТАА может представлять собой любые пептид, полипептид, белок, нуклеиновую кислоту, липид, углевод или малую органическую молекулу или любую их комбинацию, против которых специалист в данной области желает индуцировать иммунный ответ. В различных воплощениях ТАА представляет собой пептид, содержащий приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900 или приблизительно 1000 аминокислот. В различных воплощениях пептид, полипептид или белок представляет собой молекулу, обычно вводимую субъектам посредством инъекции.

В различных воплощениях опухоль-специфичное антитело или связывающий белок действуют как нацеливающая группировка, направляющая вариант IL-2 в очаг заболевания, такой как опухолевый очаг, где они могут стимулировать более оптимальные противоопухолевые иммунные ответы, избегая в то же время системной токсичности, развивающейся при терапии свободным цитокином. В случае полного агониста IL-2, локализацию иммуноцитокина могут определять взаимодействия IL-2 с IL-2R, а не связывание антитела с антигеном, направляя его, при обычных дозах антитела, к клеткам, экспрессирующим рецептор IL-2, а не к опухолевым клеткам. В различных воплощениях применение вариантов IL-2 со сниженным/устраненным связыванием с IL-2Rα и ослабленной активностью в составе слитого белка с антителом способствует установлению стехиометрического баланса между IL-2 и нацеливающим антителом для определения оптимальных доз, при которых антитело позволяет достичь достаточной занятости мишени, в то время как группировка IL-2 не вызывает избыточной активации его пути. Применение вариантов IL-2 со сниженным/устраненным связыванием с IL-2Rα и ослабленной активностью в составе слитых белков IL-2 с антителом дополнительно усиливает нацеливание на опухоль через антитело, минимизирует периферическую активацию и AICD, уменьшает клиренс, обусловленный связыванием с антигеном, и стимулирует нацеливание на опухоль через антителосодержащую часть.

В различных воплощениях варианты IL-2 по настоящему изобретению могут быть соединены с нацеливающей/бифункциональной группировкой, то есть с антителом, фрагментом антитела, белком или пептидом, нацеленными на модуляторы иммунных контрольных точек.

Согласно сообщениям, на различных иммунных клетках экспрессируется ряд белковых антигенов иммунных контрольных точек, включая, например, SIRP (экспрессированный на макрофагах, моноцитах, дендритных клетках), CD47 (с высоким уровнем экспрессии на опухолевых клетках и клетках других типов), VISTA (экспрессированный на моноцитах, дендритных клетках, В-клетках, Т-клетках), CD 152 (экспрессируемый активированными CD8+ Т-клетками, CD4+ Т-клетками и регуляторными Т-клетками), CD279 (экспрессированный на опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах, экспрессируемый активированными Т-клетками (как CD4, так и CD8), регуляторными Т-клетками, активированными В-клетками, активированными NK-клетками, анергичными Т-клетками, моноцитами, дендритными клетками), CD274 (экспрессированный на Т-клетках, В клетках, дендритных клетках, клетках эндотелия сосудов, островковых клетках поджелудочной железы) и CD223 (экспрессируемый активированными Т-клетками, регуляторными Т-клетками, анергичными Т-клетками, NK-клетками, NKT-клетками и плазмоцитоидными дендритными клетками) (см., например, Pardoll, D., Nature Reviews Cancer, 12: 252-264, 2012). Антитела, связывающиеся с антигеном, определенным как белок иммунных контрольных точек, известны специалистам в данной области. Например, в данной области описаны различные антитела против CD276 (см., например, публикацию заявки на патент США №20120294796 (Johnson et al.) и указанные в ней источники); в данной области описаны различные антитела против CD272 (см., например, публикацию заявки на патент США №20140017255 (Mataraza et al.) и указанные в ней источники); в данной области описаны различные антитела против CD152/CTLA-4 (см., например, публикацию заявки на патент США №20130136749 (Korman et al.) и указанные в ней источники); в данной области описаны различные антитела против LAG-3/CD223 (см., например, публикацию заявки на патент США №20110150892 (Thudium et al.) и указанные в ней источники); в данной области описаны различные антитела против CD279 (PD-1 (белок программируемой гибели клеток 1)) (см., например, патент США №7,488,802 (Collins et al.) и указанные в нем источники); в данной области описаны различные антитела против CD274 (PD-L1 (лиганд PD-1)) (см., например, публикацию заявки на патент США №20130122014 (Korman et al.) и указанные в ней источники); в данной области описаны различные антитела против TIM-3 (см., например, публикацию заявки на патент США №20140044728 (Takayanagi et al.) и указанные в ней источники); и в данной области описаны различные антитела против В7-Н4 (см., например, публикацию заявки на патент США №20110085970 (Terrett et al.) и указанные в ней источники); и в данной области описаны различные антитела против TIGIT (Т-клеточный иммунорецептор с Ig и ITIM (тирозиновый ингибиторный мотив иммунорецептора) доменами) (см., например, публикацию заявки на патент США №20180169239 А1 (Grogan) и указанные в ней источники). Каждый из этих источников полностью включен сюда посредством ссылки применительно к конкретным антителам и последовательностям, изложенным в них.

В различных воплощениях вариант IL-2 может быть слит с антителом, фрагментом антитела, или белком, или пептидом, демонстрирующими связывание с белковым антигеном иммунных контрольных точек, присутствующим на поверхности иммунной клетки. В различных воплощениях белковый антиген иммунных контрольных точек выбран из группы, состоящей из, без ограничения, CD279 (PD-1), CD274 (PDL-1), CD276, CD272, CD 152, CD223 (LAG-3), CD40, SIRPα, CD47, OX-40, GITR, ICOS, CD27, 4-1BB, TIM-3, B7-H3, B7-H4, TIGIT и VISTA.

В различных воплощениях антитело представляет собой антагонистическое антитело или фрагмент антагонистического антитела к FAP (белок активации фибробластов). В различных воплощениях антитело представляет собой гуманизированное антагонистическое антитело к FAP, содержащее последовательности вариабельных доменов, представленные в SEQ ID NO: 136 и 137. В различных воплощениях гетерологичный белок представляет собой антитело или фрагмент антитела к модулятору иммунных контрольных точек. В различных воплощениях антитело представляет собой антагонистическое антитело или фрагмент антагонистического антитела к PD-1. В различных воплощениях антитело представляет собой антагонистическое антитело к PD-1, содержащее последовательности вариабельных доменов, представленные в SEQ ID NO: 138 и 139, SEQ ID NO: 140 и 141, SEQ ID NO: 142 и 143, SEQ ID NO: 144 и 145 или SEQ ID NO: 146 и 147. В различных воплощениях антитело представляет собой антагонистическое антитело к человеческому PD-L1, содержащее последовательности вариабельных доменов, представленные в SEQ ID NO: 148 и 149. В различных воплощениях антитело представляет собой антагонистическое антитело к CTLA-4 (антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами), содержащее последовательности вариабельных доменов, представленные в SEQ ID NO: 150 и 151. В различных воплощениях гетерологичный белок соединен с вариантом IL-2 посредством линкерного и/или шарнирного линкерного пептида. Линкер или шарнирный линкер может представлять собой искусственную последовательность из 5, 10, 15, 20, 30, 40 или более аминокислот, относительно свободных от вторичной структуры.

В различных воплощениях гетерологичный белок соединен с вариантом IL-2 посредством ригидного линкерного пептида из 10, 15, 20, 30, 40 или более аминокислот, которые демонстрируют α-спиральную конформацию и могут действовать как ригидные спейсеры между белковыми доменами.

В другом аспекте вариант IL-2 может быть связан с различными небелковыми полимерами, включая, без ограничения, различные полиолы, такие как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, как описано в патентах США №4,640,835, №4,496,689, №4,301,144, №4,670,417, №4,791,192 или №4,179,337. В различных воплощениях возможны аминокислотные замены в различных положениях вариантов IL-2 для облегчения присоединения полимеров, таких как PEG. В различных воплощениях такие пегилированные белки могут иметь увеличенный период полувыведения и/или сниженную иммуногенность по сравнению с непегилированными белками.

В различных воплощениях варианты IL-2 могут быть нековалентно или ковалентно связаны с Fc IgG или другими полипептидами, связывающимися с неонатальным Fcγ-рецептором, человеческим сывороточным альбумином или полипептидами, связывающимися с белком, имеющим увеличенный период полувыведения из сыворотки, или с различными небелковыми полимерами на N-конце или С-конце.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая выделенные варианты IL-2 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака или метастазирования рака у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтических композиций по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. В одном воплощении субъект представляет собой субъекта-человека. В различных воплощениях рак выбран, без ограничения, из рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, колоректального рака, меланомы, лейкоза, миелодиспластического синдрома, рака легкого, рака предстательной железы, рака мозга, рака мочевого пузыря, рака головы и шеи или рабдомиосаркомы.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака или метастазирования рака у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтических композиций по изобретению в комбинации со второй терапией, выбранной из группы, состоящей из цитотоксической химиотерапии, иммунотерапии, направленной терапии низкомолекулярными ингибиторами киназ, хирургического вмешательства, лучевой терапии и трансплантации стволовых клеток. В различных воплощениях комбинированная терапия может включать введение субъекту терапевтически эффективного количества иммунотерапии, включая, без ограничения: лечение с использованием истощающих антител к определенным опухолевым антигенам; лечение с использованием конъюгатов «антитело - лекарственное средство»; лечение с использованием агонистических, антагонистических или блокирующих антител к костимулирующим или коингибирующим молекулам (иммунным контрольным точкам), таким как CTLA-4, PD-1, PD-L1, ОХ-40, CD137, TIGIT, GITR, LAG3, TIM-3, CD47, SIRPa, ICOS и VISTA; лечение с использованием биспецифических антител, привлекающих Т-клетки (BiTE®), таких как блинатумомаб; лечение, включающее введение модификаторов биологического ответа, таких как семейство TNF (фактор некроза опухолей), IL-1, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, IL-22, GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), IFN-α (интерферон-α), IFN-β и IFN-γ; лечение с использованием терапевтических вакцин, таких как сипулейцел-Т; лечение с использованием дендритноклеточных вакцин или вакцин на основе опухолевых антигенных пептидов; лечение с использованием Т-клеток с химерными антигенными рецепторами (CAR-T-клеток); лечение с использованием CAR-NK-клеток; лечение с использованием опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL); лечение с использованием адоптивно перенесенных противоопухолевых Т-клеток (культивированных ex vivo и/или трансгенных по TCR (Т-клеточный рецептор)); лечение с использованием клеток TALL-104; и лечение с использованием иммуностимулирующих агентов, таких как агонисты Toll-подобных рецепторов (TLR: TLR7, TLR8 и TLR9) CpG и имихимод; где комбинированная терапия обеспечивает усиленное уничтожение опухолевых клеток эффекторными клетками, то есть при совместном введении вариантов IL-2 и иммунотерапии возникает синергия.

В другом аспекте согласно изобретению предложено применение вариантов IL-2 для изготовления лекарственного средства для лечения рака.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие полинуклеотид, кодирующий вариант IL-2 по настоящему изобретению. В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложены векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, описанные здесь. В различных воплощениях вектор представляет собой вектор экспрессии. В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложены выделенные клетки, содержащие нуклеиновые кислоты по изобретению. В различных воплощениях клетка представляет собой клетку-хозяина, содержащую вектор экспрессии по изобретению. В другом аспекте предложены способы получения вариантов IL-2, включающие культивирование клеток-хозяев в условиях, способствующих экспрессии белков или полипептидов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 показаны чистота, определенная посредством SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) (в невосстанавливающих (дорожка 1) и восстанавливающих условиях (дорожка 2)), и процент мономеров, оцененный посредством SEC-HPLC (эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии) типичных Fc-слитых белков вариантов IL-2 Р-0635 (1А) и Р-0704 (1B). Р-0635 и Р-0704 имеют одну и ту же аминокислотную замену P65R в IL-2 дикого типа. Р-0635 содержит бивалентный вариант IL-2, слитый с гомодимером Fc, в то время как Р-0704 содержит моновалентный вариант IL-2, слитый с гетеродимерным Fc с модификацией типа «выступ во впадину».

На ФИГ. 2 показана эксклюзионная хроматограмма типичных Fc-слитых белков IL-2Р-0250 (2А), Р-0318 (2В), Р-0317 (2С) и Р-0531 (2D) после очистки с использованием белка А.

На ФИГ. 3 показано влияние валентности IL-2 на силу связывания Fc-слитых белков IL-2 с IL-2Rα в ELISA (твердофазном иммуноферментном анализе). Р-0531 и Р-0689 имеют одну и ту же аминокислотную замену S1251, расширяющую возможности разработки, в IL-2 дикого типа. Р-0531 содержит бивалентный вариант IL-2, слитый с гомодимером Fc, в то время как Р-0689 содержит моновалентный IL-2, слитый с гетеродимерным Fc с модификацией типа «выступ во впадину».

На ФИГ. 4 показано влияние различных мутаций на силу связывания Fc-слитых белков варианта IL-2 с IL-2Rα в ELISA. (4А) Fc-слитые белки варианта IL-2 содержат аминокислотные замены Т41; (4В) Fc-слитые белки варианта IL-2 содержат аминокислотные замены Y107; (4С и 4D) Fc-слитые белки варианта IL-2 содержат аминокислотные замены R38.

На ФИГ. 5 показано влияние замен Е68 IL-2 на силу связывания Fc-слитых белков варианта IL-2 с IL-2Rα в ELISA.

На ФИГ. 6 показано влияние замен Е62 IL-2 на силу связывания Fc-слитых белков варианта IL-2 с IL-2Rα в ELISA.

На ФИГ. 7 показано влияние различных замен Р65 IL-2 на силу связывания Fc-слитых белков варианта IL-2 с IL-2Rα в ELISA. (7А-7В) Замены Р65 приводили к усиленному связыванию с IL-2Rα; (7С) замены Р65 IL-2 приводили к сниженному связыванию с IL-2Rα; (7D) замены Р65 IL-2 приводили к полной утрате связывания с IL-2Rα.

На ФИГ. 8 показан эффект комбинаций аминокислотных замен IL-2 на силу связывания с IL-2Rα в ELISA. (8А) Влияние замены F42A IL-2 на силу связывания с IL-2Rα; (8В) комбинация F42A и замены E62F, нарушающей взаимодействие с CD25, приводила к полной утрате связывания с IL-2Rα; (8С) комбинация F42A и замены Р65Н, нарушающей взаимодействие с CD25, приводила к полной утрате связывания с IL-2Rα.

На ФИГ. 9 показаны дифференциальные эффекты Fc-слитых белков вариантов IL-2 на дозозависимое индуцирование фосфорилирования STAT5 в CD4+ Treg-клетках по сравнению со слитым белком дикого типа (Р-0531) и эталонным белком (Р-0551) в анализе с человеческими РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови). Панель вариантов IL-2 включает мутации, влияющие на взаимодействие с CD25, которые приводят к усилению, снижению или устранению связывания с IL-2Rα.

На ФИГ. 10 показано полное сохранение связывания панели Fc-слитых белков вариантов IL-2 с IL-2Rβγ в ELISA по сравнению со слитым белком IL-2 дикого типа Р-0531 и эталонным белком Р-0551. Панель вариантов IL-2 включает мутации, влияющие на взаимодействие с CD25, которые приводят к усилению, снижению или устранению связывания с IL-2Rα.

На ФИГ. 11 показано, что панель Fc-слитых белков вариантов IL-2 продемонстрировала сопоставимую активность при индуцировании экспрессии Ki67 в CD8+ Т-клетках (11А) и NK-клетках (11В) человеческих РВМС. Панель вариантов IL-2 включает мутации, влияющие на взаимодействие с CD25, которые приводят к усилению, снижению или устранению связывания с IL-2Rα. Слитый белок IL-2 дикого типа Р-0531 и эталонный белок Р-0511 включены для сравнения.

На ФИГ. 12 показано влияние валентности IL-2 на активность при индуцировании экспрессии Ki67 в CD8+ Т-клетках человеческих РВМС. Р-0531 и Р-0689 представляют собой аналогичные бивалентный и моновалентный Fc-слитые белки IL-2 дикого типа. Р-0635 и Р-0704 представляют собой эквивалентные бивалентный и моновалентный Fc-слитые белки IL-2 P65R.

На ФИГ. 13 показано влияние различных аминокислотных замен, модулирующих взаимодействие с IL-2Rβ/γc, или N-концевых делеций на активность индуцирования экспрессии pSTAT5 в CD4+ Т-клетках по сравнению с их аналогом дикого типа. (13А) Мутанты IL-2 с аминокислотными заменами в положении D20; (13В-13С) мутанты IL-2 с аминокислотными заменами в положении L19; (13D) мутация Q126E IL-2; и (13E) мутанты IL-2 с N-концевыми делециями аминокислот.

На ФИГ. 14 показано влияние аминокислотных замен, нарушающих взаимодействие с IL-2Rβ или γс, на силу связывания с IL-2Rβγ в ELISA (14А) и на активность при индуцировании экспрессии Ki67 в CD8+ Т-клетках человеческих РВМС (14В). Р-0689 представляет собой моновалентный Fc-слитый белок IL-2 дикого типа, а Р-0704 представляет собой моновалентный Fc-слитый белок IL-2 P65R, более не способный связываться с IL-2Rα, но полностью сохраняющий аффинность и функциональную активность в отношении димерного рецептора IL-2Rβγ.

На ФИГ. 15 показано влияние различных аминокислотных изменений, нарушающих взаимодействие с IL-2Rβ, на активность Fc-слитых белков вариантов IL-2 при индуцировании экспрессии Ki67 в CD8+ Т-клетках (15А), NK-клетках (15В) и CD4+ Т-клетках (15С) человеческих РВМС. Р-0704 и эталонная молекула (мономерная форма Р-0551) были включены для сравнения.

На ФИГ. 16 показаны зависимые от времени эффекты Р-0704 на рост числа Treg-(16А), CD8+ Т- (16В) и NK-клеток (16С) в периферической крови после однократной инъекции у мышей Ba1b/С. Р-0704 представляет собой моновалентный Fc-слитый белок IL-2 P65R; Р-0689, моновалентный Fc-слитый белок IL-2 дикого типа, был включен для сравнения. Сбор крови проводили в 3 и 5 сутки для фенотипирования лимфоцитов посредством анализа FACS (сортировка клеток с активированной флуоресценцией).

На ФИГ. 17 показано влияние слитого формата на дозозависимое индуцирование фосфорилирования STAT5 в CD4+ Treg- (17A), CD8+ Т- (17 В) и NK-клетках (17С) в анализе с человеческими РВМС. Р-0704 представляет собой моновалентный Fc-слитый белок IL-2 P65R, а Р-0803 представляет собой слитый белок с антителом, содержащий такую же группировку IL-2.

На ФИГ. 18 показаны дифференциальные эффекты слитых белков вариантов IL-2 с антителом на дозозависимое индуцирование фосфорилирования STAT5 в CD4+ Treg- (18А), CD8+ Т- (18В) и NK-клетках (18С) по сравнению со слитым белком дикого типа (Р-0837) в анализе с человеческими РВМС.Р-0838 содержит мутацию P65Q IL-2, которая существенно снижала способность к связыванию с IL-2Rα, а Р-0782 имеет группировку IL-2 P65R с устраненным связыванием с IL-2Rα.

На ФИГ. 19 показано влияние аминокислотных изменений, модулирующих взаимодействие с IL-2Rβ, на активность слитых белков вариантов IL-2 с антителом при стимуляции фосфорилирования STAT5 в CD8+ Т- (19А) и NK-клетках (19В) и при индуцировании экспрессии Ki67 в CD8+ Т- (19С) и NK-клетках (19D) человеческих РВМС. Все три соединения содержат мутацию P65R в группировке IL-2, а Р-0786 и Р-0783 содержат дополнительные нарушающие взаимодействие с IL-2Rβ мутации L19Q и L19H, соответственно.

На ФИГ. 20 показано влияние аминокислотных изменений, модулирующих взаимодействие с IL-2Rβ, на активность слитых белков вариантов IL-2 с антителом при стимуляции фосфорилирования STAT5 в CD4+ Treg- (20А), CD8+ Т- (20В) и NK-клетках (20С) и при индуцировании экспрессии Ki67 в CD8+ Т- (20D) и NK-клетках (20Е) в анализе с человеческими РВМС. Все три соединения, Р-0838, Р-0790 и Р-0787, содержат мутацию P65Q в группировке IL-2, а Р-0790 и Р-0787 содержат дополнительные модулирующие взаимодействие с IL-2Rβ мутации L19Q и L19H, соответственно. Р-0837 представляет собой аналогичный слитый белок IL-2 дикого типа.

На ФИГ. 21 показано влияние аминокислотных изменений, модулирующих взаимодействие с IL-2Rβ, на активность слитых белков вариантов IL-2 с антителом при пролиферации клеток CTLL-2. Р-0782, Р-0783 и Р-0786 содержат мутацию P65R в группировке IL-2; Р-0786 и Р-0783 содержат дополнительные модулирующие взаимодействие с IL-2Rβ мутации L19Q и L19H, соответственно. Р-0837 представляет собой аналогичный слитый белок IL-2 дикого типа.

На ФИГ. 22 показано минимальное влияние слияния вариантов IL-2 на прямое связывание (22А) и конкурентное ингибирование связывания с лигандом (22В) для антителосодержащей части в ELISA, и, сходным образом, в FACS-анализе вариант IL-2 с антителом к человеческому PD-1 продемонстрировал связывание с PD-1, экспрессированным на поверхности клеток, сходное с исходным антителом (ФИГ. 22С). Р-0795 представляет собой антитело-антагонист человеческого PD-1, Р-0803, Р-0880 и Р-0885 имеют мономерный P65R-вариант IL-2, ковалентно связанный с С-концом тяжелой цепи Р-0795. Р-0803 и Р-0885 имеют одни и те же замены P65R/S125I в IL-2, но разные линкеры ((Gr3S)2 и (G4S)3, соответственно). Р-0885 содержит одну дополнительную мутацию L19Q по сравнению с Р-0880. Р-0704 и Р-0859 представляют собой Fc-слитые аналоги Р-0880 и Р-0885, соответственно.

На ФИГ. 23 показаны дифференциальные эффекты слитых белков вариантов IL-2 с антителами на дозозависимое индуцирование фосфорилирования STAT5 в CD4+ Treg- (23А и 23В),) CD8+ Т- (23С и 23D) и NK-клетках (23Е и 23F) человеческих PBMC. P-0803 и P-0804 представляют собой слитые белки вариантов IL-2 с антителом к человеческому PD-1, содержащие мутации P65R и L19H/P65R, соответственно. Р-0782 представляет собой слитый белок IL-2 P65R с суррогатным антителом к мышиному PD-1, а Р-0783 содержит дополнительную мутацию L19H по сравнению с Р-0782.

На ФИГ. 24 показаны эксклюзионные хроматограммы слитых белков вариантов IL-2 с антителом к человеческому PD-1 Р-0840 (24А), Р-0841 (24В), P-0803 (24С) и Р-0880 (24D) после очистки с использованием белка А.

На ФИГ. 25 показано влияние длины линкера в слитых белках вариантов IL-2 с антителом на дозозависимое индуцирование фосфорилирования STAT5 в CD8+ Т- (25А и 25В) и NK-клетках (25С и 25D) в анализе с человеческими РВМС. Р-0840 и Р-0841 представляют собой слитые белки L19Q/P65Q-варианта IL-2 с антителом к человеческому PD-1; Р-0840 содержит линкер (G3S)2, в то время как Р-0841 имеет линкер (G4S)3. Сходным образом, Р-0803 и Р-0880 представляют собой слитые белки P65R-варианта IL-2 с антителом к человеческому PD-1; Р-0803 содержит линкер (G3S)2, в то время как Р-0880 имеет линкер (G4S)3.

На ФИГ. 26 показано влияние аминокислотных изменений, модулирующих взаимодействие с IL-2Rβ, на активность слитых белков вариантов IL-2 с антителом к человеческому PD-1 при стимуляции фосфорилирования STAT5 в CD8+ Т- (26А) и NK-клетках (26В) и при индуцировании экспрессии Ki67 в CD8+ Т- (26С) и NK-клетках (26D) человеческих РВМС. Все три соединения, Р-0880, Р-0885 и Р-0882, содержат мутацию P65R в группировке IL-2, в то время как Р-0885 и Р-0882 содержат дополнительные мутации L19Q и L19H, модулирующие взаимодействие с IL-2Rβ, соответственно. Р-0849 представляет собой эквивалентный слитый белок IL-2 дикого типа. Все соединения имеют линкер (G4S)3, соединяющий тяжелую цепь антитела к PD-1 и IL-2.

На ФИГ. 27 показаны зависимые от времени эффекты слитых белков вариантов IL-2 с суррогатным антителом к мышиному PD-1 Р-0782, Р-0838, Р-0781 (эталонный) и Р-0837 на экспрессию Ki67 в CD8+ Т- (27А) и NK-клетках (27В) и эффекты на рост числа CD8 (27С) и NK-клеток (27D) после однократной инъекции у мышей C57BL6. Рост числа клеток выражали как кратность изменения числа клеток по сравнению с исходным. Р-0782 содержит мутацию P65R в группировке IL-2, Р-0838 содержит мутацию P65Q, Р-0781 содержит эталонный вариант IL-2 с устраненным связыванием с IL-2Rα, а Р-0837 представляет собой аналогичный слитый белок IL-2 дикого типа.

На ФИГ. 28 показаны время- и дозозависимые эффекты слитого белка варианта IL-2 с суррогатным антителом к мышиному PD-1 Р-0786 на экспрессию Ki67 в CD8+ Т-(28А) и NK-клетках (28В) и эффекты на рост числа CD8+ Т- (28С) и NK-клеток (28D) после однократной инъекции у мышей C57BL6. Рост числа клеток выражали как кратность изменения числа клеток по сравнению с исходным. Р-0786 содержит мутацию L19Q/P65R, устраняющую связывание с IL-2Rα и снижающую общую активность. Р-0837, аналогичный слитый белок IL-2 дикого типа, был включен для сравнения.

На ФИГ. 29 показаны время- и дозозависимые эффекты слитого белка варианта IL-2 с суррогатным антителом к мышиному PD-1 Р-0783 на экспрессию Ki67 в CD8+ Т-(29А) и NK-клетках (29В) и эффекты на рост числа CD8 (29С) и NK-клеток (29D) после однократной инъекции у мышей C57BL6. Рост числа клеток выражали как кратность изменения числа клеток по сравнению с исходным. Р-0783 содержит мутацию L19H/P65R, устраняющую связывание с IL-2Rα и снижающую общую активность. Р-0837, аналогичный слитый белок IL-2 дикого типа, был включен для сравнения.

На ФИГ. 30 показано изменение массы тела у мышей C57BL/6, которым вводили слитые белки вариантов IL-2 с суррогатным антителом к мышиному PD-1 Р-0782, Р-0786 и Р-0783. Все соединения содержат мутацию P65R в группировке IL-2, Р-0781 содержит эталонный вариант IL-2 с устраненным связыванием с IL-2Rα, а Р-0786 и Р-0783 содержат дополнительные нарушающие взаимодействие с IL-2Rβ мутации L19Q и L19H, соответственно. Данные представлены как среднее плюс/минус SEM (стандартная ошибка среднего).

На ФИГ. 31 показаны противоопухолевая эффективность (31А) и изменение массы тела (31В) после многократного введения слитых белков вариантов IL-2 с суррогатным антителом к мышиному PD-1 Q7D (один раз в 7 суток) в модели подкожной мышиной меланомы B16F10. Все три слитых белка с антителом содержат мутацию L65Q в IL-2 для уменьшения связывания с IL-2Rα; Р-0790 и Р-0787 содержат дополнительные мутации L19Q и L19H, соответственно, для дополнительного модулирования общей активности. Данные представлены как среднее плюс/минус SEM.

На ФИГ. 32 показаны противоопухолевая эффективность (32А) и изменение массы тела (32В) после многократного введения Р-0787 Q7D в двух разных дозах в модели опухоли подкожной мышиной меланомы B16F10. Р-0787 представляет собой слитый белок варианта IL-2 с суррогатным антителом к мышиному PD-1, содержащий мутации L19H/P65Q. Данные представлены как среднее плюс/минус SEM.

На ФИГ. 33 показана противоопухолевая эффективность слитых белков вариантов IL-2 с суррогатным антителом к мышиному PD-1 Р-0782 и Р-0786 в модели опухоли подкожной мышиной меланомы B16F10 после их многократного введения Q7D. Р-0722, суррогатное антитело к мышиному PD-1, было включено для сравнения. Как Р-0782, так и Р-0786 содержат мутацию P65R, устраняющую связывание с IL-2Rα, в то время как Р-0786 содержит дополнительную мутацию L19Q для модулирования общей активности. Данные представлены как среднее плюс/минус SEM.

На ФИГ. 34 показано дозозависимое ингибирование метастатических узлов в легких под действием Р-0790 в модели легочного метастазирования B16F10 у мышей. (34А) Среднее количество узлов в легких; (34В) изображения легких типичного животного из каждой группы. Р-0790 представляет собой слитый белок IL-2 L19Q/P65Q с суррогатным антителом к мышиному PD-1 с существенно уменьшенным связыванием с IL-2Rα и модулированной общей активностью. Данные представлены как среднее плюс/минус SEM. Статистический анализ проводили посредством однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки. *p менее 0,05.

ВАРИАНТ(Ы) ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим такую же первичную последовательность, как человеческий IL-2, за исключением одной или нескольких аминокислот, которые были изменены посредством мутаций. Варианты IL-2 содержат мутации, существенно снижающие способность этих полипептидов стимулировать Treg-клетки и повышающие их эффективность в лечении опухолей. Оно также включает терапевтические применения этих мутантных вариантов, используемых самих по себе, или в комбинации с вакцинами, или биологическими агентами, нацеленными на ТАА, или блокатором иммунных контрольных точек, или в составе конструкции бифункциональной молекулы для лечения таких заболеваний, как рак или инфекции, где активность регуляторных Т-клеток (Treg) нежелательна. В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим раскрытые полипептиды. В завершение, настоящее изобретение относится к терапевтическому применению раскрытых полипептидов и фармацевтических композиций благодаря их селективному модулирующему эффекту на иммунную систему при раке и различных инфекционных заболеваниях.

Определения

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» использованы здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. В различных воплощениях «пептиды», «полипептиды» и «белки» представляют собой цепи из аминокислот, альфа-углероды которых связаны пептидными связями. Таким образом, концевая аминокислота на одном конце цепи (N-концевая) имеет свободную аминогруппу, в то время как концевая аминокислота на другом конце цепи (С-концевая) имеет свободную карбоксильную группу. При использовании здесь термин «N-конец» относится к свободной α-аминогруппе аминокислоты на N-конце пептида или к α-аминогруппе (аминогруппе при ее участии в пептидной связи) аминокислоты в любом другом месте в пределах рассматриваемого пептида. Сходным образом, термин «С-конец» относится к свободной карбоксильной группе на С-конце пептида или карбоксильной группе аминокислоты в любом другом месте в пределах рассматриваемого пептида. Пептиды также включают практически любую полиаминокислоту, включая, без ограничения, миметики пептидов, такие как аминокислоты, соединенные эфирными, а не амидными связями.

Полипептиды по изобретению включают полипептиды, которые были модифицированы любым образом и по любой причине, например для: (1) снижения чувствительности к протеолизу; (2) снижения чувствительности к окислению; (3) изменения аффинности связывания для образования белковых комплексов; (4) изменения аффинности связывания; и (5) придания или модификации других физико-химических или функциональных свойств.

При использовании здесь «аминокислотная замена» относится к замене одной аминокислоты полипептида в определенном положении исходной полипептидной последовательности на другую аминокислоту. Аминокислотные замены могут быть проведены с применением генетических или химических методов, хорошо известных в данной области. Например, в последовательности, встречающейся в природе (например, в части полипептида вне домена(ов), образующего(их) межмолекулярные контакты), могут быть проведены одна аминокислотная замена или множество аминокислотных замен (например, консервативных аминокислотных замен). «Консервативная аминокислотная замена» относится к замене аминокислоты полипептида на функционально сходную аминокислоту. Каждая из следующих шести групп включает аминокислоты, являющиеся консервативными заменами друг друга:

1) аланин (А), серии (S) и треонин (Т);

2) аспарагиновая кислота (D) и глутаминовая кислота (Е);

3) аспарагин (N) и глутамин (Q);

4) аргинин (R) и лизин (К);

5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М) и валин (V);

6) фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W).

«Неконсервативная аминокислотная замена» относится к замене представителя одного из этих классов на представителя другого класса. При проведении таких изменений, согласно различным воплощениям, можно учитывать индекс гидрофобности аминокислот. Каждой аминокислоте индекс гидрофобности был присвоен, исходя из ее гидрофобности и зарядных характеристик. Он составляет: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серии (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9); и аргинин (-4,5).

Важность индекса гидрофобности аминокислот для придания белку функции биологического взаимодействия известна в данной области (см., например, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Известно, что определенные аминокислоты могут быть заменены на другие аминокислоты, имеющие сходный индекс или показатель гидрофобности, с сохранением сходной биологической активности. В различных воплощениях изменения, основанные на индексе гидрофобности, включают замены аминокислот, индексы гидрофобности которых различаются не более чем на 2. В различных воплощениях включены замены аминокислот, индексы гидрофобности которых различаются не более чем на 1, и, в различных воплощениях, замены аминокислот, индексы гидрофобности которых различаются не более чем на 0,5.

В данной области также известно, что замена аналогичных аминокислот может быть эффективно проведена, исходя из гидрофильности, особенно там, где полученный таким образом биологически функциональный белок или пептид предназначен для использования в иммунологических воплощениях, как раскрыто здесь. В различных воплощениях наибольшая местная средняя гидрофильность белка, определяемая гидрофильностью его смежных аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, то есть с биологическими свойствами белка.

Указанным аминокислотным остаткам были присвоены следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0 плюс/минус 0,1); глутамат (+3,0 плюс/минус 0,1); серии (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5 плюс/минус 0,1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); и триптофан (-3,4). В различных воплощениях изменения, основанные на сходных значениях гидрофильности, включают замены аминокислот, значения гидрофильности которых различаются не более чем на 2, в различных воплощениях включены замены аминокислот, значения гидрофильности которых различаются не более чем на 1, и, в различных воплощениях, замены аминокислот, значения гидрофильности которых различаются не более чем на 0,5.

Примеры аминокислотных замен приведены в Таблице 1.

Специалист сможет определить подходящие варианты полипептидов, как изложено здесь, с применением хорошо известных методик. В различных воплощениях специалист в данной области сможет определить подходящие области молекулы, которые могут быть изменены без нарушения активности посредством направленного изменения областей, которые, предположительно, не важны для активности. В других воплощениях специалист сможет определить остатки и части молекул, консервативные у сходных полипептидов. В других воплощениях даже те области, которые могут быть важны для биологической активности или для структуры, могут быть подвержены консервативным аминокислотным заменам без нарушения биологической активности или без нежелательного влияния на структуру полипептида.

Кроме того, специалист в данной области сможет ознакомиться со структурно-функциональными исследованиями, в которых определены остатки сходных полипептидов, важные для их активности или структуры. Исходя из такого сравнения, специалист сможет спрогнозировать важность аминокислотных остатков полипептида, соответствующих аминокислотным остаткам, важным для активности или структуры сходных полипептидов. Специалист в данной области может предпочесть замены таких спрогнозированных важных аминокислотных остатков на химически сходные аминокислотные остатки.

Специалист в данной области сможет также проанализировать трехмерную структуру и аминокислотную последовательность в сравнении с такой структурой сходных полипептидов. Исходя из такой информации, специалист в данной области сможет спрогнозировать выравнивание аминокислотных остатков полипептида в связи с его трехмерной структурой. В различных воплощениях специалист в данной области может отказаться от радикальных изменений аминокислотных остатков, предположительно расположенных на поверхности полипептида, поскольку такие остатки могут быть вовлечены в важные взаимодействия с другими молекулами. Более того, специалист в данной области может получить тестовые варианты, содержащие одиночную аминокислотную замену каждого желаемого аминокислотного остатка. Затем может быть проведен скрининг этих вариантов с применением анализов активности, известных специалистам в данной области. Такие варианты могут быть использованы для получения информации о подходящих вариантах. Например, при обнаружении того, что изменение определенного аминокислотного остатка привело к нарушению, нежелательному снижению активности или к неподходящей активности, можно избегать вариантов с таким изменением. Иными словами, исходя из информации, полученной в таких рутинных экспериментах, специалист в данной области сможет легко определить аминокислоты, где дальнейших замен, самих по себе или в комбинации с другими мутациями, следует избегать.

При использовании здесь термины «фрагмент полипептида» и «усеченный полипептид» относятся к полипептиду, имеющему N-концевую и/или С-концевую делецию по сравнению с соответствующим полноразмерным белком. В различных воплощениях длина фрагментов может составлять, например, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 25, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 300, по меньшей мере 350, по меньшей мере 400, по меньшей мере 450, по меньшей мере 500, по меньшей мере 600, по меньшей мере 700, по меньшей мере 800, по меньшей мере 900 или по меньшей мере 1000 аминокислот. В различных воплощениях длина фрагментов может также составлять, например, не более 1000, не более 900, не более 800, не более 700, не более 600, не более 500, не более 450, не более 400, не более 350, не более 300, не более 250, не более 200, не более 150, не более 100, не более 50, не более 25, не более 10 или не более 5 аминокислот. Фрагмент может дополнительно содержать, на одном или обоих его концах, одну или более чем одну дополнительную аминокислоту, например последовательность аминокислот из другого встречающегося в природе белка (например, Fc-домен или домен с лейциновой молнией) или искусственную аминокислотную последовательность (например, последовательность искусственного линкера).

При использовании здесь термины «вариант полипептида», «гибридный полипептид» и «мутант полипептида» относятся к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность с вставкой, делецией и/или заменой одного или более чем одного аминокислотного остатка аминокислотной последовательности относительно последовательности другого полипептида. В различных воплощениях число аминокислотных остатков, подлежащих вставке, делеции или замене, может составлять, например, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 25, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 100, по меньшей мере 125, по меньшей мере 150, по меньшей мере 175, по меньшей мере 200, по меньшей мере 225, по меньшей мере 250, по меньшей мере 275, по меньшей мере 300, по меньшей мере 350, по меньшей мере 400, по меньшей мере 450 или по меньшей мере 500 аминокислот в длину. Гибриды по настоящему изобретению включают слитые белки.

«Производное» полипептида представляет собой полипептид, который был химически модифицирован, например посредством конъюгирования с другой химической группировкой, такой как, например, полиэтиленгликоль, альбумин (например, человеческий сывороточный альбумин), фосфорилирования и гликозилирования.

Термин «% идентичности последовательностей» использован здесь взаимозаменяемо с термином «% идентичности» и относится к уровню идентичности аминокислотных последовательностей между двумя или более пептидными последовательностями или уровню идентичности нуклеотидных последовательностей между двумя или более нуклеотидными последовательностями при выравнивании с использованием программы для выравнивания последовательностей. Например, при использовании здесь 80% идентичности обозначает то же, что 80% идентичности последовательностей, определенная заданным алгоритмом, и означает, что заданная последовательность по меньшей мере на 80% идентична другому участку другой последовательности. В различных воплощениях % идентичности выбран из, например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99%, или большей идентичности последовательности заданной последовательности. В различных воплощениях % идентичности входит в диапазон, например, от приблизительно 60% до приблизительно 70%, от приблизительно 70% до приблизительно 80%, от приблизительно 80% до приблизительно 85%, от приблизительно 85% до приблизительно 90%, от приблизительно 90% до приблизительно 95% или от приблизительно 95% до приблизительно 99%.

Термин «% гомологии последовательностей» использован здесь взаимозаменяемо с термином «% гомологии» и относится к уровню гомологии аминокислотных последовательностей между двумя или более пептидными последовательностями или уровню гомологии нуклеотидных последовательностей между двумя или более нуклеотидными последовательностями при выравнивании с использованием программы для выравнивания последовательностей. Например, при использовании здесь 80% гомологии обозначает то же, что 80% гомологии последовательностей, определенная заданным алгоритмом, и, соответственно, гомолог заданной последовательности имеет более чем 80%-ю гомологию последовательности на участке заданной последовательности. В различных воплощениях % гомологии выбран из, например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99%, или большей гомологии последовательности заданной последовательности. В различных воплощениях % гомологии входит в диапазон, например, от приблизительно 60% до приблизительно 70%, от приблизительно 70% до приблизительно 80%, от приблизительно 80% до приблизительно 85%, от приблизительно 85% до приблизительно 90%, от приблизительно 90% до приблизительно 95% или от приблизительно 95% до приблизительно 99%.

Типичные компьютерные программы, которые могут быть использованы для определения идентичности двух последовательностей, включают, без ограничения, набор программ BLAST, например BLASTN, BLASTX, TBLASTX, BLASTP и TBLASTN, общедоступный в интернете на сайте NCBI. См. также Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990 (с особой ссылкой на опубликованные настройки по умолчанию, то есть параметры w, равный 4, и t, равный 17) и Altschul et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997. При оценке заданной аминокислотной последовательности в сравнении с аминокислотными последовательностями из GenBank Protein Sequences и других общедоступных баз данных поиск последовательностей обычно проводят с использованием программы BLASTP. Программа BLASTX предпочтительна для поиска последовательностей нуклеиновых кислот, транслированных во всех рамках считывания, против аминокислотных последовательностей из GenBank Protein Sequences и других общедоступных баз данных. Как BLASTP, так и BLASTX запускают с использованием штрафа за открытие разрыва 11,0 и штрафа за продолжение разрыва 1,0, являющихся параметрами по умолчанию, и матрицы BLOSUM-62.

Помимо расчета процента идентичности алгоритм BLAST также позволяет проводить статистический анализ сходства двух последовательностей (см., например, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787, 1993). Одной мерой сходства при применении алгоритма BLAST является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая предоставляет показатель вероятности случайного совпадения между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновую кислоту считают сходной с эталонной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении анализируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет, например, менее чем приблизительно 0,1, менее чем приблизительно 0,01 или менее чем приблизительно 0,001.

При использовании здесь термин «модификация» относится к любой манипуляции с остовом пептида (например, аминокислотной последовательностью) или к посттрансляционным модификациям (например, гликозилированию) полипептида.

При использовании здесь термин «модификация типа «выступ во впадину» («knob-into-hole»)» относится к модификации обращенных друг к другу поверхностей двух тяжелых цепей иммуноглобулина в домене СН3. В одном воплощении «модификация типа «выступ во впадину»» включает аминокислотную замену T366W и возможно аминокислотную замену S354C в одной тяжелой цепи антитела и аминокислотные замены T366S, L368A, Y407V и возможно Y349C в другой тяжелой цепи антитела. Технология «выступ во впадину» описана, например, в патенте США №5,731,168; патенте США №7,695,936; Ridgway et al, Prot Eng 9, 617-621 (1996); и Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001).

При использовании здесь термин «слитый белок» относится к слитой полипептидной молекуле, содержащей два или более генов, исходно кодирующих раздельные белки, где компоненты слитого белка соединены друг с другом пептидными связями, непосредственно или через пептидные линкеры. При использовании здесь термин «слитый» относится к компонентам, соединенным пептидными связями, непосредственно или через один или более чем один пептидный линкер.

«Линкер» относится к молекуле, соединяющей две другие молекулы, ковалентно или через ионные, ван-дер-Ваальсовы или водородные связи, например к молекуле нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с одной комплементарной последовательностью на 5'-конце и с другой комплементарной последовательностью на 3'-конце, соединяя таким образом две некомплементарные последовательности. «Расщепляемый линкер» относится к линкеру, который может быть разрушен или иным образом разъединен для разделения двух компонентов, соединенных этим расщепляемым линкером. Расщепляемые линкеры в большинстве случаев расщепляются ферментами, обычно пептидазами, протеазами, нуклеазами, липазами и тому подобными. Также возможно расщепление расщепляемых линкеров под действием факторов окружающей среды, таких как, например, изменения температуры, рН, концентрации солей и так далее.

При использовании здесь термин «пептидный линкер» относится к пептиду, содержащему одну или более чем одну аминокислоту, обычно приблизительно 2-20 аминокислот.Пептидные линкеры известны в данной области или описаны здесь. Подходящие неиммуногенные линкерные пептиды включают, например, пептидные линкеры (G₄S)_n, (SG₄)_n или G4(SG₄)_n. В большинстве случаев «n» представляет собой число от 1 до 10, обычно от 2 до 4.

«Фармацевтическая композиция» относится к композиции, подходящей для фармацевтического применения у животного. Фармацевтическая композиция содержит фармакологически эффективное количество активного агента и фармацевтически приемлемый носитель. «Фармакологически эффективное количество» относится к такому количеству агента, которое эффективно для получения предполагаемого фармакологического результата. «Фармацевтически приемлемый носитель» относится к любому из стандартных фармацевтических носителей, наполнителей, буферов и эксципиентов, таких как забуференный фосфатом физиологический раствор, 5% водный раствор декстрозы, эмульсии, такие как масляная/водная или водная/масляная эмульсия, и различные типы смачивающих агентов и/или адъювантов. Подходящие фармацевтические носители и композиции описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Ed. 2005, Mack Publishing Co, Easton. «Фармацевтически приемлемая соль» представляет собой соль, которая может быть включена в соединение для фармацевтического применения, включая, например, соли металлов (натрия, калия, магния, кальция и так далее) и соли аммиака или органических аминов.

При использовании здесь «лечение» (и его грамматические варианты, такие как «лечить») относится к клиническому вмешательству в попытке изменить естественный ход заболевания у индивида, проходящего лечение, и может быть проведено для профилактики или в процессе развития клинической патологии. Желаемые эффекты лечения включают, без ограничения, предотвращение развития или рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение степени выраженности или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию или улучшение прогноза. При использовании здесь «облегчение» заболевания, расстройства или состояния обозначает снижение степени тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, указание «лечения» включает здесь указание на радикальное, паллиативное и профилактическое лечение.

При использовании здесь термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству соединения или композиции, достаточному для лечения указанного расстройства, состояния или заболевания, такому как уменьшение степени выраженности, временное облегчение, уменьшение и/или задержка одного или более чем одного из его симптомов. Применительно к раку или другой нежелательной пролиферации клеток эффективное количество включает количество, достаточное для: (1) уменьшения числа раковых клеток; (2) уменьшения размера опухоли; (3) ингибирования, торможения, некоторого замедления и, предпочтительно, остановки инфильтрации периферических органов раковыми клетками; (4) ингибирования (то есть некоторого замедления и, предпочтительно, остановки) метастазирования опухоли; (5) ингибирования роста опухоли; (6) предотвращения или отсрочки развития и/или рецидива опухоли; и/или (7) некоторого облегчения одного или более чем одного из симптомов, ассоциированных с раком. Эффективное количество можно вводить за одно или более чем одно введение.

Фраза «введение» или «действия, приводящие к введению» относится к действиям, предпринимаемым медицинским работником (например, врачом) или лицом, контролирующим оказание медицинской помощи пациенту, которое контролирует и/или разрешает вводить агент(ы)/соединение(я) пациенту. Действия, приводящие к введению, могут включать диагностику, и/или определение подходящей терапевтической схемы, и/или назначение определенного(ых) агента(ов)/соединений пациенту. Такое назначение может включать, например, заполнение рецептурного бланка, запись в истории болезни и тому подобное. При описании введения здесь также подразумевают «действия, приводящие к введению».

Термины «пациент», «индивид» и «субъект» могут быть использованы взаимозаменяемо и относятся к млекопитающему, предпочтительно человеку или примату, не являющемуся человеком, но также к одомашненным млекопитающим (например, кошкам или собакам), лабораторным млекопитающим (например, мышам, крысам, кроликам, хомякам, морским свинкам) и сельскохозяйственным млекопитающим (например, лошадям, быкам, свиньям, овцам). В различных воплощениях пациент может представлять собой человека (например, взрослого мужчину, взрослую женщину, подростка мужского пола, подростка женского пола, ребенка мужского пола, ребенка женского пола), которому врач или другой медицинский работник оказывает помощь в стационаре, в учреждении для оказания психиатрической помощи, амбулаторно или в ином клиническом контексте. В различных воплощениях пациент может представлять собой пациента со сниженным иммунитетом или пациента с ослабленной иммунной системой, включая, без ограничения, пациентов с первичным иммунодефицитом, СПИД, онкологических пациентов и пациентов после трансплантации, принимающих определенные иммуносупрессивные лекарственные средства, и пациентов с наследственными заболеваниями, влияющими на иммунную систему (например, врожденной агаммаглобулинемией, врожденным дефицитом IgA). В различных воплощениях пациент представляет собой пациента с иммуногенным раком, включая, без ограничения, рак мочевого пузыря, рак легкого, меланому и другие виды рака, при которых, согласно сообщениям, повышена частота мутаций (Lawrence et al., Nature, 499(7457): 214-218, 2013).

Термин «иммунотерапия» относится к лечению рака, включая, без ограничения: лечение с использованием истощающих антител к определенным опухолевым антигенам; лечение с использованием конъюгатов «антитело - лекарственное средство»; лечение с использованием агонистических, антагонистических или блокирующих антител к костимулирующим или коингибирующим молекулам (иммунным контрольным точкам), таким как CTLA-4, PD-1, ОХ-40, CD 137, GITR, LAG3, TIM-3, SIRP, CD47 и VISTA; лечения с использованием биспецифических антител, привлекающих Т-клетки (BiTE®), таких как блинатумомаб; лечения, включающего введение модификаторов биологического ответа, таких как IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, GM-CSF, IFN-α, IFN-β и IFN-γ; лечения с использованием терапевтических вакцин, таких как сипулейцел-Т; лечения с использованием дендритноклеточных вакцин или вакцин на основе опухолевых антигенных пептидов; лечения с использованием Т-клеток с химерными антигенными рецепторами (CAR-Т-клеток); лечения с использованием CAR-NK-клеток; лечения с использованием опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL); лечения с использованием адоптивно перенесенных противоопухолевых Т-клеток (культивированных ex vivo и/или трансгенных по TCR); лечения с использованием клеток TALL-104; и лечения с использованием иммуностимулирующих агентов, таких как агонисты Toll-подобных рецепторов (TLR) CpG и имихимод.

«Резистентный или рефрактерный рак» относится к опухолевым клеткам или раку, не отвечающим на предшествующую противораковую терапию, включая, например, химиотерапию, хирургические вмешательства, лучевую терапию, трансплантацию стволовых клеток и иммунотерапию. Опухолевые клетки могут быть резистентными или рефрактерными в начале лечения, или они могут становиться резистентными или рефрактерными во время лечения. Рефрактерные опухолевые клетки включают опухоли, не отвечающие на момент начала лечения или изначально отвечающие в течение короткого периода, но в конечном счете не отвечающие на лечение. Рефрактерные опухолевые клетки также включают опухоли, отвечающие на проведение противораковой терапии, но не отвечающие на последующие раунды терапии. Для задач настоящего изобретения рефрактерные опухолевые клетки также охватывают опухоли, подавляемые проведением противораковой терапии, но рецидивирующие в течение пяти лет, иногда в течение десяти лет или более после прекращения терапии. При противораковой терапии возможно применение химиотерапевтических агентов самих по себе, облучения самого по себе, направленной терапии самой по себе, хирургического вмешательства самого по себе или их комбинаций. Для простоты описания и не для ограничения следует понимать, что «рефрактерные опухолевые клетки» взаимозаменяемы с «резистентной опухолью».

При использовании здесь термин «Fc-домен» или «Fc-область» использован для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей по меньшей мере часть константной области. Данный термин включает Fc-области с нативной последовательностью и варианты Fc-областей. Fc-область IgG содержит домен СН2 IgG и домен СН3 IgG. Указанная СН3-область может представлять собой домен СН3 с нативной последовательностью или вариант домена СН3 (например, домен СН3, в одну цепь которого введена «выпуклость» («выступ»), а в другую цепь - соответствующая «полость» («впадина»); см. патент США №5,821,333, прямо включенный сюда посредством ссылки). Такие варианты доменов СН3 могут быть использованы для стимулирования гетеродимеризации двух неидентичных тяжелых цепей иммуноглобулина, как описано здесь. Если здесь не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU.

При использовании здесь термин «эффекторные функции» относится к биологической активности, свойственной Fc-области иммуноглобулина, которая варьирует у иммуноглобулинов разных изотипов. Примеры эффекторных функций иммуноглобулинов включают: связывание с C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), связывание с Fc-рецепторами, антителозависимую клеточно-опосред о ванную цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), секрецию цитокинов, захват антигенов антигенпредставляющими клетками, опосредованный иммунными комплексами, понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточных рецепторов) и активацию В-клеток. Эффекторные функции могут также относиться к сходным иммунным ответам, вызванным эффекторными иммунными клетками, такими как CD8- и NK-клетки.

При использовании здесь термин «регуляторная Т-клетка» или «Treg-клетка» обозначает специализированный тип CD4+ Т-клеток, которые могут подавлять ответы других Т-клеток (эффекторных Т-клеток). Treg-клетки характеризуются экспрессией CD4, α-субъединицы рецептора IL-2 (CD25) и транскрипционного фактора forkhead box Р3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)) и играют критическую роль в выработке и поддержании периферической самотолерантности к антигенам, включая антигены, экспрессируемые опухолями.

При использовании здесь термин «обычные CD4+ Т-клетки» обозначает CD4+ Т-клетки, отличные от регуляторных Т-клеток. Обычные CD4+ Т-клетки экспрессируют CD3 и CD4. В отсутствие антигенной стимуляции они не экспрессируют α-субъединицу рецептора IL-2 (CD25), но экспрессируют βγ-субъединицу рецептора IL-2.

Термин «CD8 Т-клетки» представляет собой тип цитотоксических Т-лимфоцитов, характеризующийся экспрессией CD3 и CD8. CD8 Т-клетки экспрессируют главным образом βγ-субъединицу рецептора IL-2 и играют критическую роль в уничтожении раковых клеток, клеток, инфицированных вирусами, или клеток, поврежденных иным образом.

Термин «NK-клетки» представляет собой тип цитотоксических лимфоцитов, критически важный для врожденной иммунной системы. NK-клетки экспрессируют главным образом βγ-субъединицу рецептора IL-2 и обеспечивают быстрые ответы на клетки, инфицированные вирусами, и образование опухолей.

При использовании здесь «специфичное связывание» означает, что связывание селективно в отношении антигена и его можно отличить от нежелательных или неспецифических взаимодействий. Способность иммуноглобулина к связыванию с определенным антигеном может быть измерена посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или других методик, знакомых специалисту в данной области, например методики поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

При использовании здесь термины «аффинность» или «аффинность связывания» относятся к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним связывающим сайтом молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Аффинность молекулы X в отношении ее партнера Y может обычно быть представлена как константа диссоциации (K_D), представляющая собой отношение констант скорости диссоциации и ассоциации (k_off и k_on, соответственно). Особым методом измерения аффинности является поверхностный плазмонный резонанс (SPR).

При использовании здесь термин «сниженное связывание» относится к снижению аффинности соответствующего взаимодействия, измеренному, например, посредством SPR. Наоборот, «повышенное связывание» относится к повышению аффинности связывания при соответствующем взаимодействии.

При использовании здесь термин «полимер» обычно включает, без ограничения: гомополимеры; сополимеры, такие как, например, блок-сополимеры, привитые, случайные и чередующиеся сополимеры; и тройные полимеры; и их смеси и модификации. Кроме того, в отсутствие прямых ограничений, термин «полимер» включает все возможные геометрические конфигурации вещества. Эти конфигурации включают, без ограничения, изотактическую, синдиотактическую и случайную симметрию.

«Полиэтиленгликоль» или «PEG» обозначает полиалкиленгликолевое соединение или его производное с или без сопрягающих агентов или дериватизации с использованием сопрягающих или активирующих группировок (например, с использованием альдегидной, гидроксисукцинимидильной, гидразидной, тиоловой, трифлатной, трезилатной, азирдиновой (azirdine), оксирановой, ортопиридильной, дисульфидной, винилсульфоновой, йодацетамидной или малеимидной группировки). В различных воплощениях PEG включает по существу линейный неразветвленный PEG, разветвленный PEG или дендритный PEG. PEG представляет собой хорошо известный водорастворимый полимер, который может быть приобретен из коммерческих источников или получен посредством полимеризации этиленгликоля с раскрытием кольца методами, хорошо известными в данной области (Sandler and Kara, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161).

«Полинуклеотид» относится к полимеру, состоящему из нуклеотидных единиц. Полинуклеотиды включают встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты, такие как дезоксирибонуклеиновая кислота («ДНК») и рибонуклеиновая кислота («РНК»), а также аналоги нуклеиновых кислот. Аналоги нуклеиновых кислот включают аналоги, содержащие основания, не встречающиеся в природе, нуклеотиды, образующие связи с другими нуклеотидами, отличные от встречающейся в природе фосфодиэфирной связи, или содержащие основания, присоединенные через связи, отличные от фосфодиэфирных связей. Таким образом, аналоги нуклеотидов включают, например и без ограничения, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфоротриэфиры, фосфорамидаты, органофосфаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды, пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) и тому подобное. Такие полинуклеотиды могут быть синтезированы, например, с использованием автоматического синтезатора ДНК. Термин «нуклеиновая кислота» обычно относится к большим полинуклеотидам. Термин «олигонуклеотид» обычно относится к коротким полинуклеотидам, обычно из не более чем приблизительно 50 нуклеотидов. Следует понимать, что представление нуклеотидной последовательности как последовательности ДНК (то есть А, Т, G, С) также включает последовательность РНК (то есть A, U, G, С), в которой «Т» заменен на «U».

Для описания полинуклеотидных последовательностей здесь применена традиционная система записи: левый конец одноцепочечной полинуклеотидной последовательности представляет собой 5'-конец; левое направление двуцепочечной полинуклеотидной последовательности обозначают как 5'-направление. Направление 5'-3'-присоединения нуклеотидов к синтезируемым РНК-транскриптам обозначают как направление транскрипции. Цепь ДНК, имеющую ту же последовательность, что мРНК, называют «кодирующей цепью»; последовательности цепи ДНК, имеющие ту же последовательность, что мРНК, транскрибированная с этой ДНК, и расположенные ближе к 5'-концу от 5'-конца РНК-транс крипта, называют «последовательностями, расположенными выше»; последовательности цепи ДНК, имеющие ту же последовательность, что РНК, и расположенные ближе к 3'-концу от 3'-конца кодирующего РНК-транскрипта, называют «последовательностями, расположенными ниже».

«Комплементарность» относится к топологической совместимости или взаимной сопоставимости взаимодействующих поверхностей двух полинуклеотидов. Таким образом, две молекулы могут быть описаны как комплементарные и, кроме того, характеристики их контактных поверхностей комплементарны друг другу. Первый полинуклеотид комплементарен второму полинуклеотиду, если нуклеотидная последовательность первого полинуклеотид а практически идентична нуклеотидной последовательности полинуклеотидного партнера второго полинуклеотида по связыванию или если первый полинуклеотид может гибридизоваться со вторым полинуклеотидом в жестких условиях гибридизации.

«Специфично гибридизуется с», «специфичная гибридизация» или «селективная гибридизация» относятся к преимущественному связыванию, образованию дуплексов или гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты с определенной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях, когда эта последовательность присутствует в сложной смеси (например, общей клеточной) ДНК или РНК. Термин «жесткие условия» относится к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться преимущественно с его подпоследовательностью-мишенью и в меньшей степени с другими последовательностями или вообще не будет гибридизоваться с другими последовательностями. «Жесткие условия гибридизации» и «жесткие условия промывки при гибридизации» в контексте экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как Саузерн и нозерн-гибридизация, зависят от последовательности и различаются при разных параметрах внешней среды. Всеобъемлющие руководства по гибридизации нуклеиновых кислот представлены в Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y.; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3.sup.rd ed., NY; и Ausubel etal., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.

Обычно условия гибридизации и промывки высокой жесткости выбирают так, чтобы они были примерно на 5°С ниже температуры плавления (Tm) конкретной последовательности при заданных ионной силе и рН. Tm представляет собой температуру (при заданных ионной силе и рН), при которой целевая последовательность гибридизуется с идеально соответствующим ей зондом на 50%. Очень жесткие условия выбирают так, чтобы они были равны Tm для соответствующего зонда. Примером жестких условий гибридизации для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, имеющих более чем приблизительно 100 комплементарных остатков, на фильтре при Саузерн- или нозерн-блоттинге является 50% формалин с 1 мг гепарина при 42°С, при этом гибридизацию проводят в течение ночи. Примером условий промывки высокой жесткости является 0,15 М NaCl при 72°С в течение приблизительно 15 минут.Примером жестких условий промывки является промывка с использованием 0,2×SSC (буфер физиологический раствор-цитрат натрия) при 65°С в течение 15 минут. SSC-буфер описан в Sambrook et al. Перед промывкой в условиях высокой жесткости может быть проведена промывка в условиях низкой жесткости для удаления фонового сигнала зонда. Типичная промывка средней жесткости для дуплекса из, например, более чем приблизительно 100 нуклеотидов представляет собой 1×SSC при 45°С в течение 15 минут. Типичная промывка низкой жесткости для дуплекса из, например, более чем приблизительно 100 нуклеотидов представляет собой 4-6×SSC при 40°С в течение 15 минут. Обычно отношение сигнала к шуму, в 2 (или более) раза превышающее наблюдаемое для неродственного зонда в данном гибридизационном анализе, указывает на выявление специфичной гибридизации.

«Праймер» относится к полинуклеотиду, способному специфично гибридизоваться с обозначенной полинуклеотидной матрицей и обеспечивать точку начала синтеза комплементарного полинуклеотида. Такой синтез происходит при помещении полинуклеотидного праймера в условия, в которых происходит запуск синтеза, то есть в присутствии нуклеотидов, комплементарной полинуклеотидной матрицы и агента для полимеризации, такого как ДНК-полимераза. Праймер обычно является одноцепочечным, но может быть двуцепочечным. Праймеры обычно представляют собой дезоксирибонуклеиновые кислоты, но во многих случаях применим широкий спектр синтетических и встречающихся в природе праймеров. Праймер комплементарен матрице, для гибридизации с которой он разработан, обеспечивая место начала синтеза, но он не обязательно отражает точную последовательность матрицы. В таком случае специфичная гибридизация праймера с матрицей зависит от строгости условий гибридизации. Праймеры могут быть мечены, например, хромогенными, радиоактивными или флуоресцентными группировками и использованы в качестве выявляемых группировок.

При использовании в связи с полинуклеотидом «зонд» относится к полинуклеотиду, способному специфично гибридизоваться с обозначенной последовательностью другого полинуклеотида. Зонд специфично гибридизуется с целевым комплементарным полинуклеотидом, но не обязательно отражает точную комплементарную последовательность матрицы. В таком случае специфичная гибридизация зонда с целевым полинуклеотидом зависит от строгости условий гибридизации. Зонды могут быть мечены, например, хромогенными, радиоактивными или флуоресцентными группировками и использованы в качестве выявляемых группировок. В случаях, когда зонд обеспечивает точку начала синтеза комплементарного полинуклеотида, зонд может также быть праймером.

«Вектор» представляет собой полинуклеотид, который может быть использован для введения другой нуклеиновой кислоты, связанной с ним, в клетку. Одним типом вектора является «плазмида», что относится к линейной или кольцевой молекуле двуцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты нуклеиновой кислоты. Другим типом вектора является вирусный вектор (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), где в геном вируса могут быть введены дополнительные сегменты ДНК. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, содержащие бактериальный репликатор, и эписомные векторы для клеток млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы для клеток млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, благодаря этому, реплицируются вместе с геномом хозяина. «Вектор экспрессии» представляет собой тип вектора, способный управлять экспрессией выбранного полинуклеотида.

«Регуляторная последовательность» представляет собой нуклеиновую кислоту, влияющую на экспрессию (например, уровень, время или место экспрессии) нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Регуляторная последовательность может, например, оказывать свои эффекты на регулируемую нуклеиновую кислоту непосредственно или через действие одной или более чем одной другой молекулы (например, полипептидов, связанных с регуляторной последовательностью и/или нуклеиновой кислотой). Примеры регуляторных последовательностей включают промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Другие примеры регуляторных последовательностей описаны, например, в Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, and Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06. Нуклеотидная последовательность «функционально связана» с регуляторной последовательностью, если регуляторная последовательность влияет на экспрессию (например, уровень, время или место экспрессии) нуклеотидной последовательности.

«Клетка-хозяин» представляет собой клетку, которая может быть использована для экспрессии полинуклеотида по изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой прокариота, например Е. coli, или она может представлять собой эукариота, например одноклеточного эукариота (например, дрожжи или другой гриб), растительную клетку (например, растительную клетку табака или томата), животную клетку (например, человеческую клетку, клетку обезьяны, клетку хомяка, крысиную клетку, мышиную клетку или клетку насекомого) или гибридому. Обычно клетка-хозяин представляет собой культивируемую клетку, которая может быть трансформирована или трансфицирована нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, которая может затем быть экспрессирована в клетке-хозяине. Фраза «рекомбинантная клетка-хозяин» может быть использована для обозначения клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной нуклеиновой кислотой, которую следует экспрессировать. Клетка-хозяин может также представлять собой клетку, содержащую нуклеиновую кислоту, но не экспрессирующую ее на желаемом уровне, если в клетку-хозяина не введена регуляторная последовательность таким образом, что она становится функционально связанной с этой нуклеиновой кислотой. Следует понимать, что термин «клетка-хозяин» относится не только к конкретной рассматриваемой клетке, но также к потомству или возможному потомству такой клетки. Поскольку в последующих поколениях возможны определенные модификации, обусловленные, например, мутациями или влиянием внешней среды, такое потомство может фактически не быть идентичным исходной клетке, но объем данного термина, при его использовании здесь, все равно включает такое потомство.

Термин «выделенная молекула» (где молекула представляет собой, например, полипептид или полинуклеотид) представляет собой молекулу, которая, в силу источника ее происхождения: (1) не связана с компонентами, с которыми она связана естественным образом в ее нативном состоянии; (2) по существу свободна от других молекул того же вида; (3) экспрессирована клеткой другого вида; или (4) не встречается в природе. Таким образом, химически синтезированная молекула или молекула, экспрессированная в клеточной системе, отличной от клетки, являющейся ее естественным источником, будет «выделенной» из компонентов, с которыми она связана естественным образом. Молекула может также стать по существу свободной от компонентов, с которыми она связана естественным образом, в результате ее выделения с применением методик очистки, хорошо известных в данной области. Чистоту или однородность молекулы можно анализировать с применением ряда методов, хорошо известных в данной области. Например, чистоту образца полипептида можно анализировать с применением электрофореза в полиакриламидном геле и окрашивания геля для визуализации полипептида с применением методик, хорошо известных в данной области. Для определенных задач более высокое разрешение можно обеспечить с применением HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) или других методов, хорошо известных в данной области.

Белок или полипептид является «практически чистым», «практически однородным» или «практически очищенным», когда по меньшей мере приблизительно от 60% до 75% образца представлены одной разновидностью полипептида. Полипептид или белок может быть мономерным или мультимерным. По существу чистый полипептид или белок будет обычно составлять приблизительно 50%, 60%, 70%, 80% или 90%, масс./масс., образца белка, чаще приблизительно 95%, и предпочтительно будет чистым более чем на 99%. Чистота или однородность белка может быть продемонстрирована рядом методов, хорошо известных в данной области, таких как электрофорез образца белка в полиакриламидном геле с последующей визуализацией единственной полосы полипептида после окрашивания геля красителем, хорошо известным в данной области. Для определенных задач более высокое разрешение можно обеспечить с применением HPLC или других методов, хорошо известных в данной области.

При использовании здесь термины «метка» или «меченый»/«меченный» относятся к включению другой молекулы в антитело. В одном воплощении метка представляет собой выявляемый маркер, например, при включении радиоактивно меченной аминокислоты или присоединении к полипептиду биотинильных группировок, которые могут быть выявлены авидином, содержащим маркер (например, стрептавидином, содержащим флуоресцентный маркер или имеющим ферментативную активность, которая может быть выявлена оптическими или калориметрическими методами). В другом воплощении метка или маркер могут быть терапевтическими, например, конъюгатом лекарственного средства или токсином. Могут быть применены различные методы мечения полипептидов и гликопротеинов, известные в данной области. Примеры меток для полипептидов включают, без ограничения, следующее: радиоизотопы или радионуклиды (например, ³Н, ¹⁴С, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Тс, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, лантаноидные люминофоры), ферментные метки (например, пероксидазу хрена, β-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу), хемилюминесцентные маркеры, биотинильные группы, предопределенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательности пар лейциновых молний, сайты связывания для вторичных антител, металлосвязывающие домены, эпитопные метки), магнитные агенты, такие как хелаты гадолиния, токсины, такие как коклюшный токсин, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, и их аналоги и гомологи. В различных воплощениях метки присоединены через спейсеры различной длины для уменьшения возможного стерического несоответствия.

При использовании здесь термин «гетерологичный» относится к композиции или структуре, не являющимся нативными или не представленными в природе, например к композиции или структуре, которые могут быть получены посредством замены существующей естественной композиции или структуры композицией или структурой, имеющей происхождение от другого источника. Сходным образом, экспрессия белка в организме, отличном от организма, экспрессирующего этот белок естественным образом, составляет гетерологичную систему экспрессии и гетерологичный белок.

Следует понимать, что аспекты и воплощения изобретения, описанные здесь, включают аспекты и воплощения, «состоящие» и/или «состоящие по существу из» описанных аспектов и воплощений.

Ссылка на «приблизительно» в приведенном здесь описании значения или параметра включает (и описывает) варианты, направленные непосредственно на это значение или параметр. Например, описание с указанием «приблизительно X» включает описание «X».

Если контекстом ясно не продиктовано иное, при использовании здесь и в приложенной формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число. Следует понимать, что аспекты и варианты изобретения, описанные здесь, включают аспекты и варианты, «состоящие» и/или «состоящие по существу из» описанных аспектов и вариантов.

IL-2

Интерлейкин-2 (IL-2), классический Th1-цитокин, продуцируют Т-клетки после активации через Т-клеточный антигенный рецептор и костимулирующую молекулу CD28. Регуляция IL-2 осуществляется посредством активации сигнальных путей и транскрипционных факторов, действующих на промотор IL-2, приводя к новой транскрипции гена, но также включает модулирование стабильности мРНК IL-2. IL-2 связывается с рецептором, содержащим несколько цепей, включая высоко регулируемую α-цепь и β- и γ-цепи, опосредующие передачу сигналов по пути Jak-STAT. IL-2 передает сигналы активации, роста и дифференцировки Т-клеткам, В-клеткам и NK-клеткам. IL-2 также важен для опосредования гибели Т-клеток, индуцированной их активацией, и эта функция является важнейшим механизмом прекращения иммунных ответов. Имеющийся в продаже препарат негликозилированного человеческого рекомбинантного IL-2, алдеслейкин (доступный под торговым названием Пролейкин® как дезаланил-1-серии-125 человеческий интерлейкин-2 от Prometheus Laboratories Inc., Сан-Диего, Калифорния), одобрен для введения пациентам с метастатическим почечно-клеточным раком и метастатической меланомой. Также было предложено вводить IL-2 пациентам, инфицированным вирусом гепатита С (HCV), вирусом иммунодефицита человека (HIV), пациентам с острым миелолейкозом, неходжкинской лимфомой, Т-клеточной лимфомой кожи, ювенильным ревматоидным артритом, атопическим дерматитом, раком молочной железы и раком мочевого пузыря. К сожалению, оптимальное дозирование IL-2 ограничено коротким периодом полувыведения и выраженной токсичностью.

При использовании здесь в контексте белков или полипептидов термины «нативный IL-2» и «нативный интерлейкин-2» относятся к любым встречающимся в природе аминокислотным последовательностям интерлейкина-2 млекопитающих, включая как незрелые формы или формы-предшественники, так и зрелые формы. Неограничивающие примеры регистрационных номеров аминокислотных последовательностей различных разновидностей нативного интерлейкина-2 млекопитающих в GenBank включают NP_032392.1 (Mus musculus, незрелая форма), NP_001040595.1 (Macaca mulatta, незрелая форма), NP_000577.2 (человеческий, форма-предшественник), САА01199,1 (человеческий, незрелая форма), AAD48509.1 (человеческий, незрелая форма) и ААВ20900.1 (человеческий). В различных воплощениях настоящего изобретения нативный IL-2 представляет собой незрелую форму или форму-предшественника встречающегося в природе IL-2 млекопитающего. В других воплощениях нативный IL-2 представляет собой зрелую форму встречающегося в природе IL-2 млекопитающего. В различных воплощениях нативный IL-2 представляет собой форму-предшественника встречающегося в природе человеческого IL-2. В различных воплощениях нативный IL-2 представляет собой зрелую форму встречающегося в природе человеческого IL-2. В различных воплощениях домен D2 на основе IL-2 имеет происхождение от аминокислотной последовательности предшественника человеческого IL-2, представленной в SEQ ID NO: 1:

В различных воплощениях домен D2 на основе IL-2 содержит аминокислотную последовательность зрелой формы человеческого IL-2 дикого типа, представленную в SEQ ID NO: 3, содержащую замену цистеина в положении 125 на серии, но не изменяющую связывание с рецептором IL-2 по сравнению с IL-2, встречающимся в природе:

Варианты IL-2

Настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим такую же первичную последовательность, как человеческий IL-2, за исключением одной или нескольких аминокислот, которые были изменены посредством мутаций. Одна панель вариантов IL-2 включает мутации, существенно снижающие способность этих полипептидов стимулировать Treg-клетки и повышающие их эффективность в лечении опухолей. Оно также включает терапевтическое применение этих мутантных вариантов, самих по себе, или в комбинации с вакцинами, или биологическими агентами, нацеленными на ТАА, или блокатором иммунных контрольных точек, или в составе конструкции бифункциональной молекулы для лечения таких заболеваний, как рак или инфекции, где активность регуляторных Т-клеток (Treg) нежелательна. В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим раскрытые полипептиды. В завершение, настоящее изобретение относится к терапевтическому применению раскрытых полипептидов и фармацевтических композиций благодаря их селективному модулирующему эффекту на иммунную систему при таких заболеваниях, как аутоиммунные и воспалительные расстройства или рак, и при различных инфекционных заболеваниях.

Настоящее изобретение относится к полипептидам длиной от 100 до 500 аминокислот, предпочтительно размером 140 остатков, со средней молекулярной массой по меньшей мере 15 кДа. Эти полипептиды сохраняют высокую, более 90%, идентичность последовательности нативного IL-2. В одной области их последовательности эти полипептиды содержат мутации с введением аминокислотных остатков, отличающихся от аминокислотных остатков в тех же положениях нативного IL-2.

Полипептиды по настоящему изобретению могут быть названы, среди прочего, иммуномодулирующими полипептидами, аналогами IL-2 или вариантами IL-2. Эти полипептиды разработаны, исходя из трехмерной структуры комплекса рецептора IL-2 (представленной в общедоступной базе данных PDB), с введением мутаций главным образом в те положения IL-2, которые соответствуют аминокислотам, взаимодействующим с α-субъединицей рецептора IL-2.

В различных воплощениях вариант (или мутант) IL-2 содержит последовательность, имеющую происхождение от последовательности полипептида зрелого человеческого IL-2, представленной в SEQ ID NO: 3. В различных воплощениях вариант IL-2 содержит аминокислотную последовательность, отличную от нативного белка IL-2 (или белка IL-2 дикого типа). В различных воплощениях вариант IL-2 взаимодействует с полипептидом рецептора IL-2 и функционирует как агонист или антагонист IL-2. В различных воплощениях варианты IL-2 с активностью агонистов имеют активность суперагонистов. В различных воплощениях вариант IL-2 может функционировать как агонист или антагонист IL-2 независимо от его связывания с IL-2Rα. Для агонистов IL-2 характерна сопоставимая или повышенная биологическая активность по сравнению с IL-2 дикого типа. Для антагонистов IL-2 характерны сниженная биологическая активность по сравнению с IL-2 дикого типа или способность ингибировать ответы, опосредованные IL-2. В различных воплощениях последовательность варианта IL-2 имеет по меньшей мере одно аминокислотное изменение, например замену или делецию, по сравнению с последовательностью нативного IL-2, где такие изменения приводят к активности агониста или антагониста IL-2. В различных воплощениях варианты IL-2 имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 31-66, со сниженным/устраненным связыванием с IL-2Rα для селективной активации и пролиферации эффекторных Т-клеток (Teff). В различных воплощениях варианты IL-2 имеют аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 111-120, содержащие мутации, модулирующие взаимодействие с IL-2Rβ или γс, в дополнение к мутациям, приводящим к снижению/устранению связывания с IL-2Rα, для селективной активации и пролиферации эффекторных Т-клеток, с ослабленной активностью для снижения токсичности, связанной с IL-2Rβ или γс, уменьшения клеточного истощения и улучшенной продолжительной фармакодинамики. В различных воплощениях варианты IL-2 имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 189 (аминокислоты 462-586), 190 (аминокислоты 462-585) и 191 (аминокислоты 462-584), содержащие N-концевые делеции, в дополнение к мутациям, приводящим к снижению/устранению связывания с IL-2Rα, для селективной активации и пролиферации эффекторных Т-клеток с ослабленной активностью. В различных воплощениях варианты IL-2 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 31-66, 111-120, и аминокислоты 9-133, 10-133 и 11-133 SEQ ID NO: 47, содержат также аминокислотную замену S125I для расширения возможностей разработки IL-2 и соответствующих слитых белков.

Типичные варианты IL-2 с аминокислотными заменами, введенными в области, взаимодействующие с IL-2Rα, представлены в Таблице 2.

Основной аспект настоящего изобретения состоит в улучшении селективности IL-2 по сравнению с IL-2 дикого типа в отношении клеток, экспрессирующих IL-2Rβγ (но не IL-2Rα), по сравнению с клетками, экспрессирующими IL-2Rαβγ, для лечения рака. Один метод, применяемый авторами настоящего изобретения, состоит в получении высоко селективных Fc-слитых белков IL-2 посредством введения мутаций, нарушающих взаимодействие с CD25, в цитокиновый компонент. Выбор мутаций, нарушающих взаимодействие с CD25, был основан на анализе сокристаллической структуры IL-2/IL-2R (PDB-код 2В51). Вводили множество мутаций одного или двух задействованных аминокислотных остатков в областях, взаимодействующих с α-субъединицей рецептора IL-2, включая R38, Т41, F42, F44, Е62, Р65, Е68 и Y107, направленные на снижение или устранение связывания с IL-2Rα. Эти конструкции также содержали мутацию S125I для существенного расширения возможностей разработки. Кроме того, уменьшение связывания вариантов IL-2 с IL-2Rα+эндотелиальными клетками легких, предположительно, предотвратит повреждение эндотелиальных клеток и существенно уменьшит VLS. Более того, предполагают, что уменьшение связывания с CD25 также снизит клиренс, обусловленный связыванием с антигеном CD25, повысит занятость цитокиновых рецепторов на клетках, экспрессирующих IL-2Rβγ, и, следовательно, усилит in v/vo-ответ и эффективность уничтожения опухолевых клеток.

Поскольку все остатки-мишени IL-2, R38, Т41, F42, F44, Е62, Р65, Е68 и Y107, расположены в областях, взаимодействующих с IL-2Rα, и образуют водородную связь/солевую связь или вступают в гидрофобные взаимодействия с множеством остатков IL-2Rα (Mathias Rickert, et al. (2005) Science 308, 1477-80), было сформулировано предположение, что варианты IL-2, приведенные в Таблице 2, и сходные с ними варианты будут нарушать взаимодействие с IL-2Rα и приводить к получению вариантов IL-2 со сниженным или устраненным связыванием с IL-2Rα. Тем не менее, было обнаружено, что мутации в определенных сайтах и различные замены в одном и том же сайте могут приводить к значительным различиям их влияния на связывание с IL-2Rα, которые невозможно спрогнозировать методом структурно обоснованного мутагенеза, и некоторые из этих различий особенно неожиданны (см. Примеры 4 и 5).

Кроме того, было сформулировано предположение о возможности дополнительного введения замен, модулирующих взаимодействие с IL-2Rβγ, для ослабления общей активности и достижения оптимальной активности. Агонисты с модулированной активностью в отношении IL-2Rβγ могут предотвращать избыточную активацию цитотоксических лимфоцитов и минимизировать токсичность, обусловленную связыванием с мишенью вне целевой ткани. В дополнение, они могут минимизировать клеточное истощение и апоптоз, обусловленные избыточной стимуляцией. Кроме того, снижение аффинности связывания с цитокиновой сигнальной молекулой может уменьшать рецептор-опосредованную интернализацию, снижать нежелательный клиренс, обусловленный связыванием с мишенью, и приводить к стойкой активации рецепторов и продолжительной фармакодинамике и фармакокинетике. Следовательно, замены, модулирующие взаимодействие с IL-2Rβγ, потенциально могут снизить токсичность и улучшить фармакокинетику и фармакодинамику, а также терапевтический индекс.

Типичные варианты IL-2 с аминокислотными заменами, включающими мутации, нарушающие взаимодействие с IL-2Rβ или γс, у вариантов IL-2 со сниженным/устраненным связыванием с IL-2Rα, представлены в Таблице 3.

Настоящее изобретение также включает дополнительные модификации класса вариантов IL-2, указанных выше и, в особенности, описанных в Таблице 2 и Таблице 3, включая делеции 8, или 9, или 10 N-концевых остатков вариантов IL-2, указанных выше, для селективной активации и пролиферации эффекторных Т-клеток с различными уровнями ослабленной активности. Сущность и объем настоящего изобретения включают мутанты с любой дополнительной комбинацией мутаций для изменения их аффинности в отношении определенных компонентов рецептора IL-2 или для улучшения их фармакодинамики in vivo: увеличения периода полувыведения или уменьшения их интернализации Т-клетками. Эти дополнительные мутации могут быть получены посредством рациональной разработки с применением биоинформационных инструментов или с использованием комбинаторных молекулярных библиотек различной природы (фаговых библиотек, библиотек экспрессии генов у дрожжей или бактерий). В другом аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему любой из иммуномодулирующих полипептидов, описанных выше, в сочетании с белком-носителем. Белок-носитель может представлять собой альбумин или Fc-область человеческих иммуноглобулинов.

В различных воплощениях между доменами IL-2 и Fc был связан IL-2RαSushi, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 170, с использованием линкеров различной длины и состава. Fc-домен может быть на N-конце или С-конце. Предполагают, что слитый белок IL-2-IL-2RαSushi-Fc, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 171-172, будет иметь сниженное связывание с IL-2Rα, обеспечивая селективную активацию и пролиферацию эффекторных Т-клеток.

В различных воплощениях IL-2 и IL-2RαSushi образуют нековалентный комплекс. IL-2 был слит с N- или С-концом цепи Hole-Fc (SEQ ID NO: 10), и IL-2RαSushi был слит с N- или С-концом цепи Knob-Fc (SEQ ID NO: 9). Нековалентный С-концевой слитый белок IL-2-IL-2RαSushi-Fc имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 173-174.

Fc-домены

Иммуноглобулины класса IgG являются одними из наиболее распространенных белков в человеческой крови. Период их полувыведения из циркуляции может достигать 21 суток. Были сообщения о слитых белках, содержавших комбинации Fc-областей IgG с доменами других белков, таких как различные цитокины и рецепторы (см., например, Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol, 14:52-60, 1996; патенты США №5,116,964 и №5,541,087). Прототипом слитого белка является гомодимерный белок, связанный через цистеиновые остатки в шарнирной области Fc IgG с получением молекулы, сходной с молекулой IgG, без вариабельного домена и домена СН1 тяжелой цепи и легких цепей. Димерная природа слитых белков, содержащих Fc-домен, может быть предпочтительной с точки зрения обеспечения взаимодействий более высокого порядка (то есть бивалентного или биспецифического связывания) с другими молекулами. В силу структурной гомологии профиль фармакокинетики Fc-слитых белков in vivo сопоставим с соответствующим профилем человеческого IgG сходного изотипа.

Термин «Fc» относится к молекуле или последовательности, содержащим последовательность фрагмента целого антитела, не являющегося антигенсвязывающим фрагментом, в мономерной или мультимерной форме. Иммуноглобулин, являющийся исходным источником нативного Fc, предпочтительно имеет человеческое происхождение и может представлять собой любой из иммуноглобулинов, однако предпочтительны IgG1 и IgG2. Нативные Fc составлены из мономерных полипептидов, которые могут быть связаны с образованием димерных или мультимерных форм ковалентными (то есть дисульфидными) и нековалентными связями. Число межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Fc варьирует от 1 до 4 в зависимости от класса (например, IgG, IgA, IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2). Одним примером нативного Fc является дисульфидно связанный димер, полученный в результате расщепления IgG папаином (см. Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). При использовании здесь термин «нативный Fc» является общим для мономерных, димерных и мультимерных форм. Fc-домены содержат сайты связывания для белка А, белка G, различных Fc-рецепторов и белков комплемента.

В различных воплощениях термин «вариант Fc» относится к молекуле или последовательности, модифицированным относительно нативного Fc, но все еще содержащим сайт связывания для реутилизационного рецептора FcRn. Типичные варианты Fc, а также взаимодействие с реутилизационным рецептором описаны в международных заявках WO 97/34631 (опубл. 25 сентября 1997 г.) и WO 96/32478, включенных сюда посредством ссылки. Кроме того, нативный Fc содержит сайты, которые могут быть удалены, поскольку они придают структурные характеристики или биологическую активность, не являющиеся необходимыми для слитых молекул по настоящему изобретению. Таким образом, в различных воплощениях термин «вариант Fc» включает молекулу или последовательность, в которых нет одного или более чем одного сайта или остатка нативного Fc, влияющих на или вовлеченных в (1) образование дисульфидных связей, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) N-концевую неоднородность при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с Fc-рецептором, отличным от реутилизационного рецептора, или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).

Термин «Fc-домен» охватывает молекулы и последовательности нативных Fc и вариантов Fc, определенные выше. Как в случае вариантов Fc и нативных Fc, термин «Fc-домен» включает молекулы в мономерной или мультимерной форме, полученные посредством расщепления целого антитела, рекомбинантной экспрессии генов или иным образом. В различных воплощениях «Fc-домен» относится к димеру двух Fc-доменных мономеров (SEQ ID NO: 6), который обычно содержит полноразмерную шарнирную область или ее часть. В различных воплощениях возможны мутации Fc-домена для устранения эффекторных функций. В различных воплощениях каждый из Fc-доменных мономеров в Fc-домене содержит аминокислотные замены в константном домене СН2 антитела для снижения взаимодействия или связывания между Fc-доменом и Fcγ-рецептором. В различных воплощениях каждая субъединица Fc-домена содержит три аминокислотные замены, снижающие связывание с активирующим Fc-рецептором и/или эффекторную функцию, где указанные аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и G237A (SEQ ID NO: 7).

В различных воплощениях каждый из двух Fc-доменных мономеров в Fc-домене содержит аминокислотные замены, способствующие гетеродимеризации двух мономеров. В различных других воплощениях гетеродимеризации Fc-доменных мономеров может способствовать введение разных, но совместимых замен в два Fc-доменных мономера, таких как пары остатков типа «выступ во впадину» («knob-into-hole»). Методика «выступ во впадину» также раскрыта в публикации патента США №8,216,805. В еще одном воплощении один Fc-доменный мономер содержит мутацию типа «выступ» T366W, а другой Fc-доменный мономер содержит мутации типа «впадина» T366S, L358A и Y407V. В различных воплощениях вводили два остатка Cys (S354C на стороне «выступа» и Y349C на стороне «впадины»), образующие стабилизирующую дисульфидную связь (SEQ ID NO: 9 и 10). Использование гетеродимерного Fc может приводить к получению моновалентного варианта IL-2.

В различных воплощениях последовательность Fc-домена, используемая для получения димерных Fc-слитых белков вариантов IL-2, представляет собой последовательность Fc-домена человеческого IgG1, представленную в SEQ ID NO: 7:

где SEQ ID NO: 7 содержит аминокислотные замены (подчеркнуты), устраняющие связывание с FcγR и C1q.

В различных воплощениях последовательность Fc-домена, используемая для получения димерных Fc-слитых белков IL-2, представляет собой последовательность Fc-домена IgG1, представленную в SEQ ID NO: 8:

где SEQ ID NO: 8 содержит аминокислотные замены (подчеркнуты), устраняющие связывание с FcγR и C1q, и аминокислотную замену (выделена полужирным шрифтом) для увеличения периода полувыведения.

В различных воплощениях последовательность гетеродимерного Fc-домена, используемая для получения мономерных слитых белков вариантов IL-2, представляет собой последовательность Knob-Fc-домена, представленную в SEQ ID NO: 9:

где SEQ ID NO: 9 содержит аминокислотные замены (подчеркнуты), устраняющие связывание с FcγR и C1q.

В различных воплощениях последовательность гетеродимерного Fc-домена, используемая для получения вариантов IL-2, представляет собой последовательность Hole-Fc-домена, представленную в SEQ ID NO: 10:

где SEQ ID NO: 10 содержит аминокислотные замены (подчеркнуты), устраняющие связывание с FcγR и C1q.

В различных воплощениях гетеродимерный Fc-домен, используемый для получения мономерных Fc-слитых белков IL-2, представляет собой Knob-Fc-домен со сниженной/устраненной эффекторной функцией и увеличенным периодом полувыведения, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 134:

где SEQ ID NO: 134 содержит аминокислотные замены (подчеркнуты), устраняющие связывание с FcγR и C1q, и аминокислотную замену (выделена полужирным шрифтом) для увеличения периода полувыведения.

В различных воплощениях гетеродимерный Fc-домен, используемый для получения мономерных Fc-слитых белков IL-2, представляет собой Hole-Fc-домен со сниженной/устраненной эффекторной функцией и увеличенным периодом полувыведения, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 135:

где SEQ ID NO: 135 содержит аминокислотные замены (подчеркнуты), устраняющие связывание с FcγR и C1q, и аминокислотную замену (выделена полужирным шрифтом) для увеличения периода полувыведения.

Антитела как нацеливающие группировки

В различных воплощениях конструкции варианта IL-2 по настоящему изобретению содержат нацеливающую группировку в форме антитела, фрагмента антитела, белка или пептида, связывающуюся с молекулой, содержание которой повышено в раковой ткани, такой как опухоль-ассоциированный антиген (ТАА).

ТАА может представлять собой любую молекулу, макромолекулу, комбинацию молекул и так далее, против которых желателен иммунный ответ. ТАА может представлять собой белок, содержащий более чем одну полипептидную субъединицу. Например, белок может представлять собой димер, тример или мультимер более высокого порядка. В различных воплощениях две или более субъединицы белка могут быть соединены ковалентной связью, такой как, например, дисульфидная связь. В различных воплощениях субъединицы белка могут удерживаться вместе за счет нековалентных взаимодействий. Таким образом, ТАА может представлять собой любые пептид, полипептид, белок, нуклеиновую кислоту, липид, углевод или малую органическую молекулу или любую их комбинацию, против которых специалист в данной области желает индуцировать иммунный ответ. В различных воплощениях ТАА представляет собой пептид, содержащий приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900 или приблизительно 1000 аминокислот. В различных воплощениях пептид, полипептид или белок представляет собой молекулу, обычно вводимую субъектам посредством инъекции. В различных воплощениях после введения опухоль-специфичное антитело или связывающий белок действуют как нацеливающая группировка, направляющая вариант IL-2 в очаг заболевания, такой как раковый очаг, где возможно высвобождение активного домена и его взаимодействие с его когнатными рецепторами на пораженных заболеванием клетках.

Любой из указанных выше маркеров может быть использован в качестве ТАА-мишени для вариантов IL-2 по данному изобретению. В различных воплощениях один или более чем один ТАА, вариант ТАА или мутант ТАА, которые предполагается использовать в конструкциях вариантов IL-2 и способах по настоящему изобретению, выбраны из списка, представленного в Таблице 5, или имеют происхождение от антигенов, представленных в этом списке.

В различных воплощениях варианты IL-2 по настоящему изобретению могут быть соединены с нацеливающей/бифункциональной группировкой, то есть с антителом, фрагментом антитела, белком или пептидом, нацеленными на модуляторы иммунных контрольных точек.

Согласно сообщениям, различные иммунные клетки экспрессируют ряд белковых антигенов иммунных контрольных точек, включая, например, SIRP (экспрессированный на макрофагах, моноцитах, дендритных клетках), CD47 (с высоким уровнем экспрессии на опухолевых клетках и клетках других типов), VISTA (экспрессированный на моноцитах, дендритных клетках, В-клетках, Т-клетках), CD152 (экспрессируемый активированными CD8+ Т-клетками, CD4+ Т-клетками и регуляторными Т-клетками), CD279 (экспрессированный на опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах, экспрессируемый активированными Т-клетками (как CD4, так и CD8), регуляторными Т-клетками, активированными В-клетками, активированными NK-клетками, анергичными Т-клетками, моноцитами, дендритными клетками), CD274 (экспрессированный на Т-клетках, В-клетках, дендритных клетках, клетках эндотелия сосудов, островковых клетках поджелудочной железы) и CD223 (экспрессируемый активированными Т-клетками, регуляторными Т-клетками, анергичными Т-клетками, NK-клетками, NKT-клетками и плазмоцитоидными дендритными клетками) (см., например, Pardoll, D., Nature Reviews Cancer, 12:252-264, 2012). Антитела, связывающиеся с антигеном, определенным как белок иммунных контрольных точек, известны специалистам в данной области. Например, в данной области описаны различные антитела против CD276 (см., например, публикацию заявки на патент США №20120294796 (Johnson et al.) и указанные в ней источники); в данной области описаны различные антитела против CD272 (см., например, публикацию заявки на патент США №20140017255 (Mataraza et al.) и указанные в ней источники); в данной области описаны различные антитела против CD152/CTLA-4 (см., например, публикацию заявки на патент США №20130136749 (Korman et al.) и указанные в ней источники); в данной области описаны различные антитела против LAG-3/CD223 (см., например, публикацию заявки на патент США №20110150892 (Thudium et al.) и указанные в ней источники); в данной области описаны различные антитела против CD279 (PD-1) (см., например, патент США №7,488,802 (Collins et al.) и указанные в нем источники); в данной области описаны различные антитела против CD274 (PD-L1) (см., например, публикацию заявки на патент США №20130122014 (Korman et al.) и указанные в ней источники); в данной области описаны различные антитела против TIM-3 (см., например, публикацию заявки на патент США №20140044728 (Takayanagi et al.) и указанные в ней источники); и в данной области описаны различные антитела против В7-Н4 (см., например, публикацию заявки на патент США №20110085970 (Terrett et al.) и указанные в ней источники). Каждый из этих источников полностью включен сюда посредством ссылки применительно к изложенным в них конкретным антителам и последовательностям.

В различных воплощениях партнер IL-2 по слиянию может представлять собой антитело, фрагмент антитела, или белок, или пептид, демонстрирующие связывание с белковым антигеном иммунных контрольных точек, присутствующим на поверхности иммунной клетки. В различных воплощениях белковый антиген иммунных контрольных точек выбран из группы, состоящей из, без ограничения, PD1 (CD279), PDL-1 (CD274), CD276, CD272, CD152 (CTLA-4), CD223, CD279, CD274, CD40, SIRPα, CD47, ОХ-40, GITR, ICOS, CD27, 4-1ВВ, TIM-3, В7-Н3, В7-Н4, TIGIT и VISTA.

В различных воплощениях антитело представляет собой антагонистическое антитело или фрагмент антагонистического антитела к FAP. В различных воплощениях антитело представляет собой гуманизированное антагонистическое антитело к FAP, содержащее последовательности вариабельных доменов, представленные в SEQ ID NO: 136 и 137. В различных воплощениях гетерологичный белок представляет собой антитело или фрагмент антитела к модулятору иммунных контрольных точек. В различных воплощениях антитело представляет собой антагонистическое антитело к человеческому TIGIT. В различных воплощениях антитело представляет собой антагонистическое антитело или фрагмент антагонистического антитела к PD-1. В различных воплощениях антитело представляет собой антагонистическое антитело к PD-1, содержащее последовательности вариабельных доменов, представленные в SEQ ID NO: 138 и 139, SEQ ID NO: 140 и 141, SEQ ID NO: 142 и 143, SEQ ID NO: 144 и 145 или SEQ ID NO: 146 и 147. В различных воплощениях антитело представляет собой антагонистическое антитело к человеческому PD-L1, содержащее последовательности вариабельных доменов, представленные в SEQ ID NO: 148 и 149. В различных воплощениях антитело представляет собой антагонистическое антитело к человеческому CTLA-4, содержащее последовательности вариабельных доменов, представленные в SEQ ID NO: 150 и 151. В различных воплощениях типичные бифункциональные слитые белки IL-2 с антителом к PD-1 представлены в Таблице 12.

Бифункциональные слитые белки вариантов IL-2 с антителами к PD-1

В различных воплощениях для конструирования слитых белков IL-2 с антителами используют антитела, блокирующие иммунные контрольные точки, которые позволяют обходить иммуносупрессивные эффекты в опухолевом микроокружении, или иммуностимулирующие антитела для усиления существующих ответов. Уровни экспрессии негативных иммунных контрольных точек особенно высоки в истощенных Т-клетках, контактировавших с опухолевыми антигенами и инфильтрирующих микроокружение опухоли. В различных воплощениях связывание вариантов IL-2 с антителами, направленными на иммунные контрольные точки, будет, как ожидается, направлять IL-2 к истощенным Т-клеткам и иммунологически активизировать опухолевое микроокружение. В различных воплощениях бифункциональные слитые белки вариантов IL-2 с антителами к ингибиторам контрольных точек позволяют доставлять IL-2 преимущественно к тем клеткам, экспрессирующим ингибиторы контрольных точек, таким как истощенные Т-клетки, контактировавшие с опухолевыми антигенами и инфильтрирующие микроокружение опухоли, для содействия селективной передаче сигналов и усиления активности в желаемом опухолевом очаге. В различных воплощениях бифункциональные слитые белки вариантов IL-2 с антителами к ингибиторам контрольных точек обеспечивают синергию посредством устранения негативной регуляции, реактивации функций Т-клеток и увеличения количества Teff-клеток для дополнительного усиления противоопухолевой активности иммунной системы.

В различных воплощениях бифункциональные слитые белки вариантов IL-2 с антителами к ингибиторам контрольных точек снижают системную экспозицию IL-2 и токсичность, не связанную с взаимодействием с мишенью. В различных воплощениях использование вариантов IL-2 со сниженным/устраненным связыванием с IL-2Rα и ослабленной/модулированной активностью в отношении IL-2Rβγ способствует установлению стехиометрического баланса между цитокиновой активностью IL-2 и активностью антитела. Варианты с ослабленной активностью IL-2 с адекватно нацеленным антителом или цис-активацией истощенных Teff-клеток позволят использовать оптимальные дозы и сохранять функцию каждой части. Кроме того, ожидается, что варианты с ослабленной активностью IL-2, слитые с антителами, будут минимизировать периферическую активацию, уменьшать AICD Т-клеток, снижать клиренс, обусловленный связыванием с антигеном, и стимулировать уничтожение опухолевых клеток посредством группировки антитела, нацеленной на опухолевый очаг и/или иммунные клетки.

В различных воплощениях варианты IL-2 по настоящему изобретению могут быть соединены с ингибитором контрольных точек, представляющим собой антитело, фрагмент антитела, белок или пептид, направленные на модуляторы иммунных контрольных точек. В различных воплощениях ингибитор контрольных точек представляет собой антагонистическое антитело к PD-1. В различных воплощениях антитело к PD-1 содержит последовательности вариабельных доменов, представленные в SEQ ID NO: 138 и 139, SEQ ID NO: 140 и 141, SEQ ID NO: 142 и 143, SEQ ID NO: 144 и 145 или SEQ ID NO: 146 и 147. В различных воплощениях типичные бифункциональные слитые белки IL-2 с антителом к PD-1 представлены в Таблице 12.

Линкеры

В различных воплощениях гетерологичный белок соединен с вариантом IL-2 посредством линкерного и/или шарнирного линкерного пептида. Линкер или шарнирный линкер может представлять собой искусственную последовательность из 5, 10, 15, 20, 30, 40 или более аминокислот, относительно свободных от вторичной структуры или демонстрирующих α-спиральную конформацию.

Пептидный линкер обеспечивает ковалентное связывание и дополнительную структурную и/или пространственную гибкость между белковыми доменами. Как известно в данной области, пептидные линкеры содержат гибкие аминокислотные остатки, такие как глицин и серии. В различных воплощениях пептидный линкер может содержать 1-100 аминокислот. В различных воплощениях спейсер может содержать мотив GGGSGGGS (SEQ ID NO: 18). В других воплощениях линкер может содержать мотив GGGGS (SEQ ID NO: 21)n, где n представляет собой целое число от 1 до 10. В других воплощениях линкер может также содержать аминокислоты, отличные от глицина и серина. В другом воплощении линкер может содержать другие белковые мотивы, включая, без ограничения, последовательности с α-спиральной конформацией, такие как AEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 16). В различных воплощениях длину и состав линкера можно подбирать для оптимизации активности или возможностей разработки, включая, без ограничения, уровень экспрессии и склонность к агрегации. В другом воплощении пептидный линкер может представлять собой простую химическую связь, например амидную связь (например, при химической конъюгации PEG).

Типичные пептидные линкеры представлены в Таблице 6.

Полинуклеотиды

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие полинуклеотид, кодирующий IL-2, вариант IL-2, слитый белок IL-2 или слитый белок варианта IL-2 по настоящему изобретению. Рассматриваемые нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двуцепочечными. Такие нуклеиновые кислоты могут представлять собой молекулы ДНК или РНК. ДНК включает, например, кДНК (комплементарная ДНК), геномную ДНК, синтетическую ДНК, ДНК, амплифицированную посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция), и их комбинации. Геномную ДНК, кодирующую полипептиды IL-2, получают из геномных библиотек, доступных для ряда видов. Синтетическая ДНК может быть получена химическим синтезом перекрывающихся олигонуклеотидных фрагментов с последующей сборкой фрагментов для восстановления части или всех кодирующих областей и фланкирующих последовательностей. РНК может быть получена с использованием прокариотических векторов экспрессии, приводящих к высоким уровням синтеза мРНК, таких как векторы с промоторами и РНК-полимеразой Т7. кДНК получают из библиотек, полученных из мРНК, выделенной из различных тканей, экспрессирующих IL-2. Молекулы ДНК по изобретению включают полноразмерные гены, а также полинуклеотиды и их фрагменты. Полноразмерный ген может также содержать последовательности, кодирующие N-концевую сигнальную последовательность. Такие нуклеиновые кислоты могут быть использованы, например, в способах получения новых вариантов IL-2.

В различных воплощениях выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат полинуклеотиды, описанные здесь, и дополнительно содержат полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один гетерологичный белок, описанный здесь. В различных воплощениях молекулы нуклеиновых кислот дополнительно содержат полинуклеотиды, кодирующие линкеры или шарнирные линкеры, описанные здесь.

В различных воплощениях рекомбинантные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть функционально связаны с одной или более чем одной регуляторной нуклеотидной последовательностью в экспрессионной конструкции. Регуляторные последовательности известны в данной области, и их выбирают для управления экспрессией варианта IL-2. Соответственно, термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии. Типичные регуляторные последовательности описаны в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Обычно указанная одна или более чем одна регуляторная нуклеотидная последовательность может включать, без ограничения, промоторные последовательности, лидерные или сигнальные последовательности, сайты связывания рибосом, последовательности начала и терминации транскрипции, последовательности начала и терминации трансляции и энхансерные или активаторные последовательности. Настоящее изобретение предполагает конститутивные или индуцируемые промоторы, известные в данной области. Промоторы могут представлять собой промоторы, встречающиеся в природе, или гибридные промоторы, в которых совмещены элементы более чем одного промотора. Экспрессионная конструкция может присутствовать в клетке на эписоме, такой как плазмида, или экспрессионная конструкция может быть введена в хромосому. В различных воплощениях вектор экспрессии содержит селектируемый маркерный ген, позволяющий проводить селекцию трансформированных клеток-хозяев. Селектируемые маркерные гены хорошо известны в данной области и будут варьировать в зависимости от используемой клетки-хозяина.

В другом аспекте настоящего изобретения рассматриваемая нуклеиновая кислота представлена в векторе экспрессии, содержащем нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант IL-2 и функционально связанную по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью. Термин «вектор экспрессии» относится к плазмиде, фагу, вирусу или вектору для экспрессии полипептида с полинуклеотидной последовательности. Векторы, подходящие для экспрессии в клетках-хозяевах, легко доступны, и молекулы нуклеиновых кислот вводят в векторы с применением стандартных методик рекомбинантных ДНК. Такие векторы могут содержать широкий спектр последовательностей контроля экспрессии, которые, будучи функционально связанными с последовательностью ДНК, контролируют ее экспрессию и могут быть использованы в этих векторах для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих вариант IL-2. Такие полезные последовательности контроля экспрессии включают, например, ранний и поздний промоторы SV40, промотор tet, предранний промотор аденовируса или цитомегаловируса, промоторы RSV, систему lac, систему trp, систему ТАС или TRC, промотор Т7, экспрессию которого обеспечивает РНК-полимераза Т7, основные операторные и промоторные области фага лямбда, контрольные области белка оболочки fd, промотор 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например, PhoS, промоторы а-факторов спаривания дрожжей, полиэдриновый промотор бакуловирусной системы и другие известные последовательности, контролирующие экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и различные их комбинации. Следует понимать, что структура вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которую следует трансформировать, и/или тип белка, который желательно экспрессировать. Более того, следует учитывать число копий вектора, возможность контроля этого числа копий и экспрессию любых других белков, кодируемых вектором, таких как антибиотические маркеры. Типичными векторами экспрессии, подходящими для экспрессии IL-2, являются pDSRa (описанный в WO 90/14363, включенной сюда посредством ссылки) и его производные, содержащие полинуклеотиды IL-2, а также любые дополнительные подходящие векторы, известные в данной области или описанные ниже.

Рекомбинантная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть получена посредством лигирования клонированного гена или его части в вектор, подходящий для экспрессии в прокариотических клетках и/или эукариотических клетках (клетках дрожжей, птиц, насекомых или млекопитающих). Экспрессионные носители для получения рекомбинантного полипептида IL-2 включают плазмиды и другие векторы. Например, подходящие векторы включают плазмиды следующих типов: плазмиды, имеющие происхождение от pBR322, плазмиды, имеющие происхождение от pEMBL, плазмиды, имеющие происхождение от рЕХ, плазмиды, имеющие происхождение от рВТас, и плазмиды, имеющие происхождение от pUC, для экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е. coli.

Некоторые векторы экспрессии для клеток млекопитающих содержат как прокариотические последовательности, способствующие воспроизведению вектора у бактерий, так и одну или более чем одну эукариотическую транскрипционную единицу, экспрессируемую в эукариотических клетках. Примерами векторов экспрессии для клеток млекопитающих, подходящих для трансфекции эукариотических клеток, являются векторы, имеющие происхождение от pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo и pHyg. Некоторые из этих векторов модифицируют, используя последовательности из бактериальных плазмид, таких как pBR322, для облегчения репликации и отбора по лекарственной устойчивости как в прокариотических, так и в эукариотических клетках. Альтернативно, для транзиторной экспрессии белков в эукариотических клетках могут быть использованы производные вирусов, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота (BPV-1) или вирус Эпштейна-Барр (рНЕВо, имеющий происхождение от pREP и р205). Примеры вирусных (включая ретровирусные) систем экспрессии приведены ниже при описании систем доставки для генной терапии. Различные методы, применяемые при получении плазмид и трансформации организмов-хозяев, хорошо известны в данной области. Другие подходящие системы экспрессии как для прокариотических, так и для эукариотических клеток, а также общие рекомбинантные методики приведены в Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapters 16 and 17. В некоторых случаях может быть желательным экспрессировать рекомбинантные полипептиды с использованием бакуловирусной системы экспрессии. Примеры таких бакуловирусных систем экспрессии включают векторы, имеющие происхождение от pVL (такие как pVL1392, pVL1393 и pVL941), векторы, имеющие происхождение от pAcUW (такие как pAcUW1), и векторы, имеющие происхождение от pBlueBac (такие как pBlueBac III, содержащий B-gal).

В различных воплощениях будет разработан вектор для получения рассматриваемых вариантов IL-2 в клетках СНО, такой как вектор Pcmv-Script (Stratagene, Ла-Холья, штат Калифорния), векторы pcDNA4 (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) и векторы pCI-neo (Promega, Мэдисон, штат Висконсин). Как будет ясно, рассматриваемые генные конструкции могут быть использованы для экспрессии рассматриваемых вариантов IL-2 в культивированных клетках, например, для получения белков, включая слитые белки или варианты белков, для очистки.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансфицированной рекомбинантным геном, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность одного или более чем одного из рассматриваемых вариантов IL-2. Клетка-хозяин может представлять собой любую прокариотическую или эукариотическую клетку. Например, вариант IL-2 по настоящему изобретению может быть экспрессирован в бактериальных клетках, таких как Е. coli, клетках насекомых (например, с использованием бакуловирусной системы экспрессии), клетках дрожжей или клетках млекопитающих. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к способам получения рассматриваемых вариантов IL-2. Например, клетку-хозяина, трансфицированную вектором экспрессии, кодирующим вариант IL-2, можно культивировать в подходящих условиях, позволяющих ей экспрессировать вариант IL-2. Вариант IL-2 может быть секретирован и выделен из смеси клеток и среды, содержащей вариант IL-2. Альтернативно, вариант IL-2 может оставаться в цитоплазматической или мембранной фракции, и может быть проведен сбор и лизис клеток с последующим выделением белка. Клеточная культура содержит клетки-хозяева, среды и другие побочные продукты. Подходящие среды для культивирования клеток хорошо известны в данной области.

Полипептиды и белки по настоящему изобретению можно очищать в соответствии с методиками очистки белка, хорошо известными специалистам в данной области. Эти методики включают, на одном уровне, разделение неочищенных белковых и небелковых фракций. После отделения пептидов и полипептидов от других белков может быть проведена дальнейшая очистка интересующего пептида или полипептида с применением хроматографических и электрофоретических методик для достижения частичной или полной очистки (или очистки до однородности). При использовании здесь термин «выделенный полипептид» или «очищенный полипептид» предназначен для обозначения композиции, которая может быть отделена от других компонентов, где полипептид очищен в любой степени по сравнению его состоянием, в котором его получают в естественных условиях. Таким образом, очищенный полипептид также относится к полипептиду, свободному от среды, в которой он может встречаться в природе. Обычно «очищенный» будет относиться к полипептидной композиции, которая была разделена на фракции для удаления различных других компонентов и практически сохраняет свою выраженную биологическую активность. Там, где использован термин «по существу очищенный», это обозначение будет относиться к пептидной или полипептидной композиции, где полипептид или пептид является основным компонентом композиции, например составляя приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, или приблизительно 90%, или более от белков композиции.

Различные методики, подходяще для применения при очистке, будут хорошо известны специалистам в данной области. Они включают, например, преципитацию с сульфатом аммония, PEG, антителами (иммунопреципитация) и тому подобным или посредством термической денатурации с последующим центрифугированием; хроматографию, такую как аффинная хроматография (колонки с белком А), ионообменная хроматография, гель-фильтрация, хроматография с обращенной фазой, хроматография на гидроксиапатите, хроматография гидрофобного взаимодействия; изоэлектрическое фокусирование; гель-электрофорез; и комбинации этих методик. Как общеизвестно в данной области, полагают, что порядок проведения различных стадий очистки можно менять, или что определенные стадии можно опустить, и при этом метод все еще будет подходящим для получения по существу очищенного полипептида.

Фармацевтические композиции

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая варианты IL-2 или слитые белки вариантов IL-2 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Такие фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и понятны специалистам в данной области и описаны во многих источниках (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990). Фармацевтически приемлемые носители могут быть включены для модификации, поддержания или сохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, всасывания или проникновения композиции. Такие фармацевтические композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса полипептида in vivo. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, без ограничения: аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); антимикробные агенты; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия); буферы (такие как борат, бикарбонат, трис-HCl, цитраты, фосфаты, другие органические кислоты); объемообразующие агенты (такие как маннит или глицин); хелатирующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA)); комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин); наполнители; моносахариды, дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины); белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красители; корригенты и разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); полипептиды с малой молекулярной массой; солеобразующие противоионы (такие как натрий); консерванты (такие как хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенилэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, циклодекстрин, сорбиновая кислота или перекись водорода); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (такие как маннит или сорбит); суспендирующие агенты; поверхностно-активные вещества или смачивающие агенты (такие как плюроники, PEG, сорбитановые сложные эфиры, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерин, тилоксапал); агенты, повышающие стабильность (сахароза или сорбит); агенты, усиливающие тоничность (такие как галогениды щелочных металлов (предпочтительно хлорид натрия или калия), маннит, сорбит); наполнители для доставки; разбавители; эксципиенты; и/или фармацевтические адъюванты.

Основной наполнитель или носитель в фармацевтической композиции может иметь водную или неводную природу. Например, подходящий наполнитель или носитель может представлять собой воду для инъекций, физиологический раствор или искусственную спинномозговую жидкость, возможно дополненные другими веществами, часто используемыми в композициях для парентерального введения. Другими типичными наполнителями являются нейтральный забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином. Другие типичные фармацевтические композиции содержат трис-буфер с рН приблизительно 7,0-8,5 или ацетатный буфер с рН приблизительно 4,0-5,5, которые могут дополнительно содержать сорбит или его подходящий заменитель. В одном воплощении настоящего изобретения композиции могут быть подготовлены к хранению путем смешивания выбранной композиции, имеющей желаемую степень чистоты, с дополнительными агентами композиции (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) в форме лиофилизированной массы или водного раствора. Кроме того, терапевтическая композиция может быть изготовлена в форме лиофилизата с использованием подходящих эксципиентов, таких как сахароза. Оптимальная фармацевтическая композиция будет определена специалистом в данной области в зависимости от, например, предполагаемого пути введения, формата доставки и желаемой дозы.

Когда предполагается парентеральное введение, терапевтические фармацевтические композиции могут иметь форму апирогенного водного раствора, приемлемого для парентерального введения, содержащего желаемый полипептид IL-2 или слитый белок полипептида IL-2 в фармацевтически приемлемом наполнителе. Особенно подходящим наполнителем для парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная вода, где полипептид включен в композицию в форме стерильного изотонического раствора с нужным(и) консервантом(ами). В различных воплощениях фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного введения, могут быть изготовлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или забуференный физиологический раствор. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть получены в форме подходящих масляных суспензий для инъекций. Возможно, суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты для повышения растворимости соединений, позволяя получать высококонцентрированные растворы.

В различных воплощениях терапевтические фармацевтические композиции могут быть изготовлены для направленной доставки с использованием коллоидной дисперсионной системы. Коллоидные дисперсионные системы включают макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии типа «масло в воде», мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Примеры липидов, полезных при получении липосом, включают фосфатидильные соединения, такие как фосфатидилглицерин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфинголипиды, цереброзиды и ганглиозиды. Типичные фосфолипиды включают фосфатидилхолин яйца, дипальмитоилфосфатидилхолин и дистеароилфосфатидилхолин. Также возможно нацеленное действие липосом на основе, например, их специфичности в отношении органов, клеток и органелл, известное в данной области.

В различных воплощениях предполагается пероральное введение фармацевтических композиций. Фармацевтические композиции, вводимые таким образом, могут быть изготовлены с теми носителями, которые обычно используют при изготовлении твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы, или без таких носителей. В твердых лекарственных формах для перорального введения (капсулах, таблетках, пилюлях, драже, порошках, гранулах и тому подобных) одно или более чем одно терапевтическое соединение по настоящему изобретению может быть смешано с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем, таким как цитрат натрия или гидрофосфат кальция, и/или любым из следующего: (1) наполнителей или заполнителей, таких как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; (2) связывающих агентов, таких как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или аравийская камедь; (3) увлажнителей, таких как глицерин; (4) разрыхлителей, таких как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, определенные силикаты и карбонат натрия; (5) агентов, замедляющих растворение, таких как парафин; (6) агентов, ускоряющих всасывание, таких как четвертичные аммониевые соединения; (7) смачивающих агентов, таких как, например, ацетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) абсорбентов, таких как каолин и бентонитовая глина; (9) смазывающих агентов, таких как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; и (10) красителей. В случае капсул, таблеток и пилюль фармацевтические композиции могут также содержать буферные агенты. Твердые композиции сходного типа могут также быть использованы в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах с использованием таких эксципиентов, как лактоза или молочные сахара, а также полиэтиленгликоли с высокой молекулярной массой и тому подобное. Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активному ингредиенту жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, часто используемые в данной области, такие как водные или иные растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышевое, оливковое, касторовое и кунжутное масло), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли, сложные эфиры сорбитана и жирных кислот и их смеси. Помимо инертных разбавителей композиции для перорального введения могут также содержать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты, подсластители, корригенты, красители, отдушки и консерванты.

В различных воплощениях предполагается местное введение фармацевтических композиций на кожу или на слизистые оболочки. Композиции для местного введения могут дополнительно содержать один или более чем один из широкого спектра известных агентов, эффективно усиливающих проникновение через кожу или роговой слой. Их примерами являются 2-пирролидон, N-метил-2-пирролидон, диметилацетамид, диметилформамид, пропиленгликоль, метиловый или изопропиловый спирт, диметилсульфоксид и азон. Кроме того, могут быть включены дополнительные агенты для обеспечения косметической приемлемости композиции. Их примерами являются жиры, воски, масла, краски, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы и поверхностно-активные агенты. Также возможно включение кератолитических агентов, таких как кератолитические агенты, известные в данной области. Примерами являются салициловая кислота и сера. Лекарственные формы для местного или трансдермального введения включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и лекарственные формы для ингаляционного введения. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут быть необходимы. Мази, пасты, кремы и гели могут содержать, в дополнение к рассматриваемому соединению по изобретению (например, варианту IL-2), эксципиенты, такие как животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакантовая камедь, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремниевая кислота, тальк и оксид цинка, или их смеси.

Дополнительные фармацевтические композиции, которые предполагается применять здесь, включают композиции, содержащие полипептиды в композициях для длительной или контролируемой доставки. В различных воплощениях фармацевтические композиции могут быть изготовлены в форме наночастиц как гидрогель с медленным высвобождением или включены в онколитические вирусы. Такие методы с применением наночастиц включают, например, инкапсулирование в наночастицы, составленные из полимеров с гидрофобным каркасом и гидрофильными боковыми цепями в качестве носителей лекарственного средства, инкапсулирование в микрочастицы, введение в липосомы в эмульсиях и конъюгирование с другими молекулами. Примеры наночастиц включают мукоадгезивные наночастицы, покрытые хитозаном и карбополом (Takeuchi et al., Adv. Drag Deliv. Rev. 47(1):39-54, 2001), и наночастицы, содержащие заряженные комбинированные полиэфиры, поли(2-сульфобутилвиниловый спирт) и поли(D,L-молочную и гликолевую кислоту) (Jung et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1):147-160, 2000). Композиции наночастиц на основе альбумина были разработаны в качестве системы доставки лекарственных средств для доставки гидрофобных лекарственных средств, таких как таксан. См., например, патенты США №5,916,596, №6,506,405, №6,749,868, №6,537,579, №7,820,788 и №7,923,536. Abraxane®, композиция паклитаксела в форме наночастиц, стабилизированных альбумином, был одобрен в Соединенных Штатах Америки в 2005 г. и затем в различных других странах для лечения метастатического рака молочной железы.

Методики изготовления множества других средств для длительной или контролируемой доставки, таких как липосомальные носители, биоразлагаемые микрочастицы или пористые гранулы, и депо-инъекций также известны специалистам в данной области.

Эффективное количество фармацевтической композиции для терапевтического применения будет зависеть, например, от терапевтического контекста и поставленных задач. Специалисту в данной области будет ясно, что подходящие уровни дозы для лечения будут, таким образом, варьировать в зависимости, отчасти, от доставляемой молекулы, показания к применению полипептида, пути введения и биометрических данных (массы тела, площади поверхности тела или размеров органов) и состояния (возраста и общего состояния здоровья) пациента. Соответственно, клинический специалист может корректировать дозу и модифицировать путь введения для получения оптимального терапевтического эффекта. Типичная доза может входить в диапазон от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, указанных выше. Предпочтительно, полипептидные композиции инъецируют или вводят внутривенно. Длительнодействующие фармацевтические композиции можно вводить один раз в трое или четверо суток, один раз в неделю или один раз в две недели, в зависимости от периода полувыведения и скорости клиренса конкретной композиции. Частота дозирования будет зависеть от фармакокинетических параметров полипептида в применяемой композиции. Обычно композицию вводят до достижения дозы, обеспечивающей желаемый эффект. Таким образом, композицию можно вводить в виде однократной дозы или многкатных доз (в одинаковых или разных концентрациях/дозах) с течением времени или в форме непрерывной инфузии. Кроме того, обычно проводят подбор подходящей дозировки. Подходящие дозировки могут быть определены с использованием доступных данных о зависимости ответа от дозы.

Путь введения фармацевтической композиции соответствует известным способам, например пероральное введение, введение посредством внутривенной, внутрибрюшинной, интрацеребральной (интрапаренхимальной), интрацеребровентрикулярной, внутримышечной, внутриглазной, внутриартериальной, интрапортальной, внутриочаговой инъекции, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, трансдермальное, подкожное, или внутрибрюшинное, или внутриопухолевое введение, а также введение интраназальным, энтеральным, местным, сублингвальным, уретральным, вагинальным или ректальным способом, с использованием систем для длительной доставки или имплантируемых устройств. Там, где это желательно, композиции можно вводить посредством болюсной инъекции или непрерывно посредством инфузии или с использованием имплантируемого устройства. Альтернативно или дополнительно, композицию можно вводить местно посредством имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, на котором абсорбирована или инкапсулирована желаемая молекула. При использовании имплантируемого устройства оно может быть имплантировано в любые подходящие ткань или орган и доставка желаемой молекулы может происходить посредством диффузии, болюсного введения с зависимым от времени высвобождением или непрерывного введения.

Терапевтическое применение

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения раковых клеток у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества (в виде монотерапии или в схеме комбинированной терапии) варианта IL-2 или слитых белков вариантов IL-2 по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе, где такое введение ингибирует рост и/или пролиферацию раковой клетки. Конкретно, вариант IL-2 или слитый белок варианта IL-2 по настоящему изобретению полезны при лечении расстройств, характеризуемых как рак. Такие расстройства включают, без ограничения, солидные опухоли, такие как рак молочной железы, дыхательной системы, головного мозга, репродуктивных органов, пищеварительной системы, мочевыделительной системы, глаза, печени, кожи, головы и шеи, щитовидной железы, паращитовидных желез и их отдаленные метастазы, лимфомы, саркомы, множественную миелому и лейкоз. Примеры рака молочной железы включают, без ограничения, инвазивную протоковую карциному, инвазивную дольковую карциному, протоковую карциному in situ и дольковую карциному in situ. Примеры рака дыхательной системы включают, без ограничения, мелкоклеточную и немелкоклеточную карциному легкого, а также бронхиальную аденому и плевропульмональную бластому. Примеры рака головного мозга включают, без ограничения, глиому ствола головного мозга и гипоталамуса, астроцитому мозжечка и головного мозга, медуллобластому, эпендимому, а также нейроэктодермальные опухоли и опухоли шишковидной железы. Опухоли мужских репродуктивных органов включают, без ограничения, рак предстательной железы и яичка. Опухоли женских репродуктивных органов включают, без ограничения, рак эндометрия, шейки матки, яичника, влагалища и вульвы, а также саркому матки. Опухоли пищеварительной системы включают, без ограничения, анальный рак, рак ободочной кишки, колоректальный рак, рак пищевода, желчного пузыря, желудка, поджелудочной железы, прямой кишки, тонкой кишки и слюнной железы. Опухоли мочевыделительной системы включают, без ограничения, рак мочевого пузыря, полового члена, почки, почечной лоханки, мочеточника и мочеиспускательного канала. Рак глаза включает, без ограничения, внутриглазную меланому и ретинобластому. Примеры рака печени включают, без ограничения, печеночно-клеточный рак (печеночно-клеточный рак с или без фиброламеллярного варианта), холангиокарциному (рак внутрипеченочных желчных протоков) и смешанную печеночно-клеточную холангиокарциному. Рак кожи включает, без ограничения, плоскоклеточный рак, саркому Капоши, злокачественную меланому, рак кожи из клеток Меркеля и немеланомный рак кожи. Рак головы и шеи включает, без ограничения, назофарингеальный рак и рак губы и полости рта. Лимфомы включают, без ограничения, ассоциированную с AIDS (синдром приобретенного иммунодефицита) лимфому, неходжкинскую лимфому, Т-клеточную лимфому кожи, болезнь Ходжкина и лимфому центральной нервной системы. Саркомы включают, без ограничения, саркому мягких тканей, остеосаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, лимфосаркому и рабдомиосаркому. Лейкозы включают, без ограничения, острый миелолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, различные лимфоцитарные лейкозы, различные миелогенные лейкозы и волосатоклеточный лейкоз. В различных воплощениях рак будет представлять собой рак с высокой экспрессией представителя семейства TGF-β, такого как активин А, миостатин, TGF-β и GDF15, например рак поджелудочной железы, рак желудка, рак яичника, колоректальный рак, меланому, лейкоз, рак легкого, рак предстательной железы, рак головного мозга, рак мочевого пузыря и рак головы и шеи.

«Терапевтически эффективное количество» или «терапевтически эффективная доза» относятся к такому количеству вводимого терапевтического агента, которое будет в некоторой степени облегчать один или более чем один из симптомов расстройства, по поводу которого проводят лечение.

Исходная оценка терапевтически эффективной дозы может быть проведена в анализах с клеточными культурами посредством определения ЕС₅₀. Затем в моделях на животных может быть подобрана доза, позволяющая достичь диапазона концентрации в циркулирующей плазме, включающего ЕС₅₀, определенную в клеточной культуре. Такая информация может быть использована для более точного определения полезных доз для человека. Уровни в плазме можно измерять, например, посредством HPLC. Точные композиция, путь введения и доза могут быть выбраны конкретным врачом с учетом состояния субъекта.

Схемы введения можно корректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, может быть проведено однократное болюсное введение, могут быть введены несколько раздельных доз (многократных, повторных или поддерживающих) в течение периода времени, и дозу можно пропорционально снижать или повышать в зависимости от особенностей терапевтической ситуации. Особенно предпочтительно изготавливать композиции для парентерального введения в стандартной лекарственной форме для простоты введения и единообразия доз. При использовании здесь стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для субъектов-млекопитающих, для которых предназначено лечение, где каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, вместе с необходимым фармацевтическим носителем. Характеристики стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению будут продиктованы в первую очередь уникальными свойствами антитела и конкретным терапевтическим или профилактическим эффектом, подлежащим достижению.

Таким образом, исходя из представленного здесь описания, специалисту в данной области будет ясно, что дозу и схему введения корректируют в соответствии с методами, хорошо известными в терапевтической области. То есть можно легко определить максимальную переносимую дозу, и также можно определить эффективное количество, обеспечивающее выявляемый терапевтический полезный эффект у субъекта, как и временные требования для введения каждого агента для обеспечения выявляемого терапевтического полезного эффекта у субъекта. Соответственно, несмотря на то, что здесь приведены примеры определенных доз и схем введения, эти примеры никоим образом не ограничивают дозу и схему введения, которые могут быть использованы у субъекта при практическом применении настоящего изобретения.

Следует отметить, что значения доз могут варьировать в зависимости от типа и тяжести состояния, подлежащего облегчению, и могут включать однократные или многократные дозы. Следует также понимать, что для любого конкретного субъекта указанные схемы введения следует корректировать с течением времени в соответствии с индивидуальными потребностями и профессиональным суждением лица, осуществляющего или контролирующего введение композиций, и что диапазоны доз, приведенные здесь, являются лишь примерами, и подразумевают, что они не ограничивают объем или практическое применение заявленной композиции. Кроме того, схема введения композиций по данному изобретению может быть основана на множестве факторов, включая тип заболевания, возраст, массу тела, пол и состояние здоровья субъекта, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое антитело. Таким образом, схема введения может варьировать в широких пределах, но может быть определена рутинным образом с применением стандартных методов. Например, дозы можно корректировать по фармакокинетическим или фармакодинамическим параметрам, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты, и/или лабораторные показатели. Таким образом, настоящее изобретение охватывает повышение дозы, применяемой у субъекта, по усмотрению специалиста. Определение подходящих доз и схем введения хорошо известно в соответствующей области и будет ясно специалисту, располагающему информацией, раскрытой здесь.

Неограничивающими примерами диапазона суточных доз для терапевтически или профилактически эффективного количества варианта IL-2 или слитого белка варианта IL-2 по изобретению могут быть диапазоны, составляющие от 0,001 до 100 мг/кг, от 0,001 до 90 мг/кг, от 0,001 до 80 мг/кг, от 0,001 до 70 мг/кг, от 0,001 до 60 мг/кг, от 0,001 до 50 мг/кг, от 0,001 до 40 мг/кг, от 0,001 до 30 мг/кг, от 0,001 до 20 мг/кг, от 0,001 до 10 мг/кг, от 0,001 до 5 мг/кг, от 0,001 до 4 мг/кг, от 0,001 до 3 мг/кг, от 0,001 до 2 мг/кг, от 0,001 до 1 мг/кг, от 0,010 до 50 мг/кг, от 0,010 до 40 мг/кг, от 0,010 до 30 мг/кг, от 0,010 до 20 мг/кг, от 0,010 до 10 мг/кг, от 0,010 до 5 мг/кг, от 0,010 до 4 мг/кг, от 0,010 до 3 мг/кг, от 0,010 до 2 мг/кг, от 0,010 до 1 мг/кг, от 0,1 до 50 мг/кг, от 0,1 до 40 мг/кг, от 0,1 до 30 мг/кг, от 0,1 до 20 мг/кг, от 0,1 до 10 мг/кг, от 0,1 до 5 мг/кг, от 0,1 до 4 мг/кг, от 0,1 до 3 мг/кг, от 0,1 до 2 мг/кг, от 0,1 до 1 мг/кг, от 1 до 50 мг/кг, от 1 до 40 мг/кг, от 1 до 30 мг/кг, от 1 до 20 мг/кг, от 1 до 10 мг/кг, от 1 до 5 мг/кг, от 1 до 4 мг/кг, от 1 до 3 мг/кг, от 1 до 2 мг/кг или от 1 до 1 мг/кг массы тела. Следует отметить, что значения доз могут варьировать в зависимости от типа и тяжести состояний, подлежащих облегчению. Следует также понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные схемы введения следует корректировать с течением времени в соответствии с индивидуальными потребностями и профессиональным суждением лица, осуществляющего или контролирующего введение композиций, и что диапазоны доз, приведенные здесь, являются лишь примерами, и подразумевают, что они не ограничивают объем или практическое применение заявленной композиции.

Токсичность и терапевтический индекс фармацевтических композиций по изобретению могут быть определены стандартными фармацевтическими методиками в клеточных культурах или у экспериментальных животных, например методиками определения LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Отношение токсичной и терапевтически эффективной дозы представляет собой терапевтический индекс, и он может быть выражен как отношение LD₅₀/ED₅₀. Обычно предпочтительны композиции, демонстрирующие большие терапевтические индексы.

Частота введения фармацевтической композиции варианта IL-2 или слитого белка варианта IL-2 зависит от природы терапии и конкретного заболевания, по поводу которого проводят лечение. Композицию можно вводить субъекту через равные интервалы, например два раза в неделю, один раз в неделю или один раз в месяц, до достижения желаемого терапевтического результата. Примеры частоты дозирования включают, без ограничения: один раз в неделю без перерывов; один раз в 2 недели; один раз в 3 недели; один раз в неделю без перерыва в течение 2 недель, затем один раз в месяц; один раз в неделю без перерыва в течение 3 недель, затем один раз в месяц; один раз в месяц; один раз в два месяца; один раз в три месяца; один раз в четыре месяца; один раз в пять месяцев; или один раз в шесть месяцев; или один раз в год.

Комбинированная терапия

При использовании здесь термины «совместное введение», «совместно вводимые» и «в комбинации с», относящиеся к варианту IL-2 или слитому белку варианта IL-2 по изобретению и одному или более чем одному другому терапевтическому агенту, предназначены для обозначения и включения следующего: одновременного введения такой комбинации варианта IL-2 или слитого белка варианта IL-2 по изобретению и терапевтического(их) агента(ов) субъекту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты включены вместе в одну лекарственную форму, высвобождающую указанные компоненты у указанного субъекта по существу в одно и то же время; по существу одновременного введения такой комбинации варианта IL-2 или слитого белка варианта IL-2 по изобретению и терапевтического(их) агента(ов) субъекту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты включены отдельно друг от друга в раздельные лекарственные формы, принимаемые указанным субъектом по существу одновременно, вследствие чего высвобождение указанных компонентов у указанного субъекта происходит по существу в одно и то же время; последовательного введения такой комбинации варианта IL-2 или слитого белка варианта IL-2 по изобретению и терапевтического(их) агента(ов) субъекту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты включены отдельно друг от друга в раздельные лекарственные формы, принимаемые указанным субъектом последовательно с существенным временным интервалом между каждым приемом, вследствие чего высвобождение указанных компонентов у указанного субъекта происходит по существу в разное время; и последовательного введения такой комбинации варианта IL-2 или слитого белка варианта IL-2 по изобретению и терапевтического(их) агента(ов) субъекту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты включены вместе в одну лекарственную форму, высвобождающую указанные компоненты контролируемым образом, вследствие чего у указанного субъекта происходит их одновременное, последовательное и/или перекрывающееся высвобождение, в одно и то же и/или в разное время, где все части могут быть введены одним и тем же способом введения или разными способами введения.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака или метастазирования рака у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтических композиций по изобретению в комбинации со второй терапией, включая, без ограничения, иммунотерапию, цитотоксическую химиотерапию, направленную терапию низкомолекулярными ингибиторами киназ, хирургическое вмешательство, лучевую терапию и трансплантацию стволовых клеток. Например, такие способы могут быть применены в профилактическом предотвращении рака, предотвращении рецидивов и метастазов рака после хирургического вмешательства и в качестве дополнения к другой стандартной терапии рака. Согласно настоящему изобретению, применение комбинированных способов, описанных здесь, может повысить эффективность стандартной терапии рака (например, химиотерапии, лучевой терапии, фототерапии, иммунотерапии и хирургических вмешательств).

Показано, что широкий спектр стандартных соединений обладает противоопухолевой активностью. Эти соединения применяют в качестве фармацевтических агентов при химиотерапии для уменьшения размеров солидных опухолей, предотвращения метастазов и дальнейшего роста или уменьшения числа злокачественных Т-клеток при лейкозах или злокачественных новообразованиях костномозгового происхождения. Несмотря на эффективность химиотерапии при лечении различных типов злокачественных новообразований, многие противоопухолевые соединения индуцируют нежелательные побочные эффекты. Было показано, что при сочетании двух или более разных видов лечения они могут действовать синергично, позволяя снижать дозу каждого из них, что приводит к уменьшению вредных побочных эффектов, оказываемых каждым соединением в более высоких дозах. В других случаях злокачественные новообразования, рефрактерные к лечению, могут отвечать на комбинированную терапию из двух или более разных видов лечения.

В различных воплощениях пациенту будут вводить второй противораковый агент, такой как химиотерапевтический агент. Перечень типичных химиотерапевтических агентов включает, без ограничения, даунорубицин, дактиномицин, доксорубицин, блеомицин, митомицин, азотистый иприт, хлорамбуцил, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, бендамустин, цитарабин (СА), 5-фторурацил (5-FU), флоксуридин (5-FUdR), метотрексат (МТХ), колхицин, винкристин, винбластин, этопозид, тенипозид, цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, пентостатин, кладрибин, цитарабин, гемцитабин, пралатрексат, митоксантрон, диэтилстилбестрол (DES), флударабин, ифосфамид, гидроксиуреатаксаны (такие как паклитаксел и доцетаксел) и/или антрациклиновые антибиотики, а также комбинации агентов, такие как, без ограничения, DA-EPOCH, CHOP, CVP или FOLFOX. В различных воплощениях дозы таких химиотерапевтических агентов включают, без ограничения, любое из приблизительно 10 мг/м², 20 мг/м², 30 мг/м², 40 мг/м², 50 мг/м², 60 мг/м², 75 мг/м², 80 мг/м², 90 мг/м², 100 мг/м², 120 мг/м², 150 мг/м², 175 мг/м², 200 мг/м², 210 мг/м², 220 мг/м², 230 мг/м², 240 мг/м², 250 мг/м², 260 мг/м² и 300 мг/м².

В различных воплощениях способы комбинированной терапии по настоящему изобретению могут дополнительно включать проведение у субъекта терапевтически эффективного количества иммунотерапии, включая, без ограничения: лечение с использованием истощающих антител к определенным опухолевым антигенам; лечение с использованием конъюгатов «антитело - лекарственное средство»; лечение с использованием агонистических, антагонистических или блокирующих антител к костимулирующим или коингибирующим молекулам (иммунным контрольным точкам), таким как CTLA-4, PD-1, ОХ-40, CD137, GITR, LAG3, TIM-3, SIRP, CD47, CD40, TIGIT и VISTA; лечение с использованием биспецифических антител, привлекающих Т-клетки (BiTE®), таких как блинатумомаб; лечение, включающее введение модификаторов биологического ответа, таких как IL-12, IL-15, IL-21, GM-CSF, IFN-α, IFN-β и IFN-γ; лечение с использованием терапевтических вакцин, таких как сипулейцел-Т; лечение с использованием дендритноклеточных вакцин или вакцин на основе опухолевых антигенных пептидов; лечение с использованием Т-клеток с химерными антигенными рецепторами (CAR-T-клеток); лечение с использованием CAR-NK-клеток; лечение с использованием опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL); лечение с использованием адоптивно перенесенных противоопухолевых Т-клеток (культивированных ex vivo и/или трансгенных по TCR); лечение с использованием клеток TALL-104; и лечение с использованием иммуностимулирующих агентов, таких как агонисты Toll-подобных рецепторов (TLR) CpG и имихимод; где комбинированная терапия обеспечивает усиленное уничтожение опухолевых клеток эффекторными клетками, то есть при совместном применении вариантов IL-2 и иммунотерапии возникает синергия.

В различных воплощениях комбинированная терапия включает введение варианта IL-2 и композиции второго агента одновременно, в одной и той же фармацевтической композиции или в раздельных фармацевтических композициях. В различных воплощениях композицию варианта IL-2 и композицию второго агента вводят последовательно, то есть композицию варианта IL-2 вводят до или после введения композиции второго агента. В различных воплощениях композицию варианта IL-2 и композицию второго агента вводят одновременно, то есть периоды введения композиции варианта IL-2 и композиции второго агента перекрываются друг с другом. В различных воплощениях композицию варианта IL-2 и композицию второго агента вводят неодновременно. Например, в различных воплощениях введение композиции варианта IL-2 прекращают до введения композиции второго агента. В различных воплощениях введение композиции второго агента прекращают до введения композиции варианта IL-2.

Следующие примеры предложены для более полного пояснения и описания изобретения, но их не следует толковать как ограничение объема изобретения.

Пример 1

Конструирование и получение Fc-слитых конструкций IL-2

Все гены, синтезированные и субклонированные в реципиентный вектор экспрессии для клеток млекопитающих (GenScript), прошли оптимизацию кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих. Экспрессией белка управляет промотор CMV, а на 3'-конце CDS присутствует синтетическая поли-А сигнальная последовательность SV40. На N-конце конструкций была сконструирована лидерная последовательность для обеспечения необходимого сигналинга и процессинга для секреции.

Конструкции получали путем котрансфекции клеток HEK293-F, растущих в суспензии, векторами экспрессии для клеток млекопитающих с использованием полиэтиленимина (PEI, линейный, молекулярная масса 25000, Polysciences). При наличии двух или более векторов экспрессии их использовали для трансфекции в соотношении 1:1. Для трансфекции клетки HEK293 культивировали в бессывороточной экспрессионной среде FreeStyle™293 (ThermoFisher). Для продуцирования в шейкерных колбах объемом 1000 мл (рабочий объем 330 мл) клетки HEK293 высевали с плотностью 0,8×10⁶ клеток/мл за 24 часа до трансфекции. Векторы экспрессии, до общего количества ДНК 330 мкг, смешивали с 16,7 мл среды Opti-MEM (ThermoFisher). После добавления 0,33 мг PEI, разведенного в 16,7 мл среды Opti-MEM, смесь перемешивали на вихревой мешалке в течение 15 сек и затем инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого раствор ДНК/PEI добавляли к клеткам и осуществляли инкубирование при 37°С в инкубаторе с 8% СО₂. В 4 сутки для содействия устойчивой экспрессии белка к клеткам добавляли бутират натрия (Millipore Sigma) в конечной концентрации 2 мМ. После 6 суток культивирования собирали супернатант для очистки путем центрифугирования в течение 20 мин при 2200 об/мин. Полученный раствор стерилизовали путем фильтрования (0,22 мкм фильтр, Corning). Секретированный белок очищали из супернатантов клеточных культур с использованием аффинной хроматографии на белке А.

Альтернативно, конструкции получали в клетках ExpiCHO (ThermoFisher), следуя инструкциям изготовителя.

Для аффинной хроматографии супернатант загружали на колонку HiTrap MabSelect SuRe (CV равен 5 мл, GE Healthcare), уравновешенную с использованием 25 мл забуференного фосфатом физиологического раствора, рН 7,2 (ThermoFisher). Несвязанный белок удаляли путем промывки 5 объемами колонки PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), рН 7,2, и целевой белок элюировали с использованием 25 мМ цитрата натрия, 25 мМ хлорида натрия, рН 3,2. Раствор белка нейтрализовали, добавляя 3% 1 M трис, рН 10,2. По необходимости для дополнительной очистки веществ, очищенных с использованием белка А, применяли также ионообменную хроматографию или смешанную хроматографию, включая, без ограничения, CaptoMMC (GE Healthcare), керамический гидроксиапатит или керамический фтороапатит (Bio-Rad). Целевой белок концентрировали с использованием концентратора Amicon® Ultra-15 с отсечкой по молекулярной массе (NMWC) 10 кДа (Merck Millipore Ltd.).

Чистоту и молекулярную массу очищенных конструкций анализировали посредством SDS-PAGE в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента и окрашивания кумасси (Imperial^R Stain). Использовали гель-систему NuPAGE® Pre-Cast (4-12% или 8-16% бис-трис, ThermoFisher), следуя инструкциям изготовителя. Концентрацию белка в очищенном белковом образце определяли, измеряя поглощение UV (ультрафиолет) при 280 нм (спектрофотометр Nanodrop, ThermoFisher), разделенное на молярный коэффициент экстинкции, рассчитанный, исходя из аминокислотной последовательности. Содержание агрегатов конструкций анализировали на высокоэффективной жидкостно-хроматографической (HPLC) системе Agilent 1200. Образцы наносили на эксклюзионную колонку AdvanceBio (300, 4,6×150 мм, 2,7 мкм, колонка для LC, Agilent) с использованием 150 мкМ фосфата натрия, рН 7,0, в качестве подвижной фазы при 25°С.

SDS-PAGE и анализ эксклюзионных хроматограмм типичных Fc-слитых конструкций IL-2 Р-0635 и Р-0704, очищенных на белке А, показаны на ФИГ. 1. Р-0635 (SEQ ID NO:85; ФИГ. 1А) и Р-0704 (SEQ ID NO:96 и 10; ФИГ. 1В) имеют одинаковую аминокислотную замену P65R в IL-2. Р-0635 содержит бивалентный вариант IL-2, слитый с гомодимером Fc, в то время как Р-0704 содержит моновалентный вариант IL-2, слитый с гетеродимерным Fc с модификацией типа «выступ во впадину». SDS-PAGE-анализ показал, что обе молекулы продемонстрировали высокую степень чистоты белка, а образцы, проанализированные в восстанавливающих условиях (дорожка 2), показали ожидаемую MW (молекулярную массу) как для гомодимерной цепи Fc в Р-0635, так и для гетеродимерных цепей Fc Р-0704. Анализ эксклюзионных хроматограмм показал, что обе молекулы продемонстрировали низкую склонность к агрегации, при этом после исходной стадии захвата на белке А степень агрегации составляла менее 5%.

Пример 2

Замена одной аминокислоты в IL-2 приводит к универсальному расширению возможностей разработки слитых соединений

Применение методик конструирования для поиска комбинации мутаций, которая привела бы к получению варианта белка с желаемыми биологическими свойствами, в случае IL-2 оказалось сопряжено со значительными трудностями. В данной области известно, что встречающийся в природе белок IL-2 имеет тенденцию к очень низкой стабильности и склонен к агрегации. В экспериментах, проведенных авторами изобретения, было продемонстрировано, что Fc-слитый белок IL-2 дикого типа (Р-0250), экспрессированный на низком уровне (примерно 3 мг/л, транзиторно, в клетках HEK-293F), имеет высокую склонность к агрегации, как показано на SEC-хроматограмме, представленной на ФИГ. 2А. Конструирование было сильно затруднено, поскольку аминокислотные замены в IL-2, направленные на достижение желаемой биологической активности, обычно приводили к еще менее стабильным мутантным белкам. Значительная часть вариантов IL-2, полученных на ранней фазе этих исследований, продемонстрировала крайне низкий уровень экспрессии, а некоторые варианты были намного более склонны к агрегации, примером чего является SEC-хроматограмма Р-0318 (Fc-слитого белка IL-2 D20I/N88I), показанная на ФИГ. 2В. Это представляет собой проблему с точки зрения изготовления и хранения терапевтического агента.

Было также отмечено, что профили экспрессии и склонности к агрегации слитых белков вариантов IL-2 существенно варьируют у конструкций с разными сайтами мутаций или у мутантов, имеющих один и тот же сайт мутации, но разные замененные остатки. Примерами этого наблюдения являются Р-0317 (Fc-слитый белок IL-2 D20I/N88R) и Р-0318 (Fc-слитый белок IL-2 D20I/N88I). Слитые белки обоих этих вариантов имеют одинаковые сайты мутаций при остатках 20 и 88, различаются только одной аминокислотой и имеют сходный низкий уровень экспрессии. Как видно на ФИГ. 2В, Р-0318 очень склонен к агрегации и содержит 65% частиц с высокой молекулярной массой, формирующих ожидаемый пик второстепенных частиц на хроматограмме, отмеченный стрелкой. В отличие от этого, Р-0317 относительно чист и содержит 7,5% агрегатов (ФИГ. 2С). Можно было бы сделать вывод, что мутация N88R может уменьшать склонность полученных слитых белков к агрегации. Тем не менее, IL-2 с одиночной мутацией N88R или с двойной мутацией D20T/N88R и полученные слитые белки, Р-0254 и Р-0324, соответственно, были склонны к агрегации и содержали 30-40% агрегатов. Таким образом, влияние отдельных аминокислотных замен на стабильность белка, по-видимому, зависит от контекста.

Тот факт, что аминокислотные замены IL-2 обычно приводят к менее стабильному белку, был дополнен непредсказуемым влиянием замен различных остатков на стабильность белка. Таким образом, крайне желательно найти замену(ы) остатка, которая(ые) могла(и) бы универсальным образом расширять возможности разработки белка, включая повышенную стабильность, более высокий уровень экспрессии и меньшую склонность к агрегации.

Аминокислотные замены в положении 125 были изначально направлены на повышение селективности IL-2, поскольку этот остаток расположен в непосредственной близости к Q126, который необходим для взаимодействия с γс. Встречающийся в природе IL-2 содержит неспаренный цистеин в положении 125, который заменен на серии в Proleukin®. Также широко применяется IL-2, содержащий аланиновую замену в положении 125. Замена цистеина в положении 125 на серии или аланин полностью сохраняла биологическую активность; объемные заряженные или гидрофобные остатки, включая Glu, Lys, Try, His и Iso, вводили в положение 125, чтобы препятствовать взаимодействию Q126 с γс и получить измененную биологическую активность. Все полученные слитые молекулы, кроме слитой молекулы, содержащей Iso125 (Р-0531), экспрессировались на слишком низком уровне, чтобы их охарактеризовать. По сравнению с его S125-эквивалентом (Р-0250), Р-0531 экспрессировался на существенно более высоком уровне (титр 29,5 мг/л против 3,1 мг/л) при значительно меньшей склонности к агрегации (агрегация 0,7% против 25,7%). Такое впечатляющее расширение возможностей разработки, особенно применительно к чистоте продукта, побудило авторов изобретения изучить возможность воспроизведения такого эффекта замены на изолейцин в положении 125 в другом мутационном контексте.

Таким образом, замену S125I вводили в несколько Fc-слитых молекул вариантов IL-2. Конструкции, содержавшие замену на Ile в аминокислотном положении 125 (125I) IL-2, экспрессировали с использованием того же вектора и в тех же условиях культивирования, что их Ser-125-аналоги, и очищали с использованием MabSelect SuRe. Сводные данные по уровню экспрессии в мг/л и чистоте вещества, оцененной посредством SEC-хроматографии, в виде % агрегации для типичных молекул представлены в Таблице 7. Две молекулы в одной строке Таблицы 7 имеют одинаковую(ые) другую(ие) аминокислотную(ые) замену(ы) и различаются только остатком 125, представляющим собой серии или изолейцин. Кроме того, на ФИГ. 2D показан SEC-профиль Р-0531 (SEQ ID NO:68), Fc-слитого белка S125I-эквивалента IL-2 дикого типа. Из Таблицы 7 ясно, что замена на изолейцин в положении 125 приводила к повышению уровня экспрессии в 4-11 раз и одинаково низкой склонности к агрегации.

Из настоящего изобретения очевидно, что изолейцин в положении 125 приводил к универсальному расширению возможностей разработки слитых конструкций IL-2. Эти данные особенно ценны, поскольку конструирование IL-2 для получения желаемых биологических свойств сдерживал тот факт, что изменение IL-2 дикого типа, обладающего пограничной стабильностью, обычно приводит к еще менее стабильным мутантным белкам. Эти проблемы, свойственные конструированию IL-2, могут быть частично решены одиночной аминокислотной заменой на изолейцин в положении 125.

Пример 3

Разработка конструкций IL-2 для улучшения селективности в отношении эффекторных T-клеток и NK-клеток

Основной аспект настоящего изобретения состоит в улучшении селективности IL-2 по сравнению с IL-2 дикого типа в отношении клеток, экспрессирующих IL-2Rβγ (но не IL-2Rα), по сравнению с клетками, экспрессирующими IL-2Rαβγ, для лечения рака. Один подход, применяемый авторами настоящего изобретения, состоит в получении высоко селективных Fc-слитых белков IL-2 посредством введения мутаций, нарушающих взаимодействие с CD25, в цитокиновый компонент. Выбор мутаций, нарушающих взаимодействие с CD25, был основан на анализе сокристаллической структуры IL-2/IL-2R (PDB-код 2В51). Вводили множество замен одного или двух релевантных аминокислотных остатков в областях, взаимодействующих с α-субъединицей рецептора IL-2, включая R38, Т41, F42, F44, Е62, Р65, Е68 и Y107, направленные на снижение или устранение связывания с IL-2Rα. Эти конструкции также содержали мутацию S125I для существенного расширения возможностей разработки. Кроме того, уменьшение связывания вариантов IL-2 с IL-2Rα + эндотелиальными клетками легких, предположительно, предотвратит повреждение эндотелиальных клеток и существенно уменьшит VLS. Более того, предполагают, что уменьшение связывания с CD25 также снизит клиренс, обусловленный связыванием с антигеном CD25, повысит занятость цитокиновых рецепторов на клетках, экспрессирующих IL-2Rβγ, и, следовательно, усилит in vivo-ответ и эффективность уничтожения опухолевых клеток.

Сводные данные о панели мутеинов IL-2, экспрессированных в форме С-концевых слитых белков с гомодимером Fc или гетеродимером Fc, представлены в Таблице 3. Осуществляли слияние панели вариантов IL-2 (SEQ ID NO:31-66), содержащих одну или две аминокислотные замены остатков в областях, взаимодействующих с α-субъединицей рецептора IL-2, через линкер «GGGSGGGS» (SEQ ID NO:18) с С-концом гомодимера Fc в форме бивалентных слитых белков IL-2 (SEQ ID NO:69-95) или гетеродимера Fc в форме моновалентных слитых белков IL-2 (SEQ ID NO:96-106).

Пример 4

Влияние мутаций IL-2, введенных в области, взаимодействующие с IL-2Rα, на связывание с α-субъединицей рецептора

Осуществляли экспрессию панели мутеинов IL-2 в форме С-концевых слитых белков с гомодимером Fc или гетеродимером Fc и их скрининг на предмет связывания с IL-2Rα в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA). Кратко ECD (внеклеточный домен) IL-2Rα (SEQ ID NO:5) сорбировали на лунки 96-луночных микропланшетов Nunc Maxisorp, по 0,1 мкг на лунку. После инкубирования в течение ночи при 4°С и блокирования суперблокирующим агентом (superblock) (ThermoFisher), в каждую лунку вносили по 100 мкл 3-кратных серийных разведений Fc-слитых белков IL-2, начиная со 100 нМ. После инкубирования в течение одного часа при комнатной температуре в каждую лунку вносили по 100 мкл козьего антитела против Fc человеческого IgG, конъюгированного с HRP (пероксидаза хрена) (разведение 1:5000 в разбавителе), и осуществляли инкубирование при комнатной температуре в течение 1 часа. После каждой стадии содержимое лунок тщательно отбирали и проводили их трехкратную промывку с использованием PBS/0,05% Tween-20. В завершение, в каждую лунку вносили по 100 мкл ТМВ-субстрата, планшет проявляли при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут и вносили останавливающий раствор (2 H серная кислота, Ricca Chemical), по 100 мкл на лунку. Оптическую плотность определяли при 450 нм и кривые строили с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad).

Сначала анализировали связывание Fc-слитых белков S125I-эквивалента IL-2 дикого типа, Р-0531 и Р-0689, с CD25. Р-0531 содержит бивалентную группировку IL-2, слитую с гомодимером Fc (SEQ ID NO:68), а Р-0689 (SEQ ID NO:107+10) является моновалентным аналогом Р-0531. Как показано на ФИГ. 3, 2-кратное различие ЕС₅₀ при связывании Р-0531 и Р-0689 (0,21 нМ и 0,51 нМ, соответственно) соответствовало различию валентности IL-2.

Поскольку все остатки-мишени IL-2, R38, Т41, F42, F44, Е62, Р65, Е68 и Y107, расположены в областях, взаимодействующих с IL-2Rα, и образуют водородную связь/солевую связь или вступают в гидрофобные взаимодействия с множеством остатков IL-2Rα (Mathias Rickert, et al. (2005) Science 308, 1477-80), было сформулировано предположение, что аминокислотные замены в этих сайтах будут нарушать взаимодействие с IL-2Rα и приводить к получению вариантов IL-2 со сниженным или устраненным связыванием с IL-2Rα. Тем не менее, полученные данные о связывании выявили, что влияние различных мутаций IL-2 на связывание с IL-2Rα значительно варьирует.

Как показано на ФИГ. 4, слитые белки IL-2 с гомодимером Fc, содержащие различные замены в положении Т41 (примерами которых являются Р-0603, Р-0604 и Р-0605 на ФИГ. 4А) или Y107 (примерами которых являются Р-0610, Р-0611 и Р-0612 на ФИГ. 4В), полностью сохраняли силу связывания с IL-2Rα. Полученные данные указывают на то, что остатки Т41 и Y107, вероятно, не имеют критического функционального значения, несмотря на их расположение в областях, взаимодействующих с различными остатками IL-2Rα.

Остаток R38 был обнаружен в энергетически активной точке взаимодействия IL-2/IL-2Rα, где он участвует в образовании критически важных водородных связей; множество попыток конструирования, например, Keith M. Heaton, et al., (1993) Cancer Res. 53. 2597-2602, and Peisheng Hu, et. al, (2003) Blood 101: 4853-4861, показали, что многие замены R38 приводили к нарушению взаимодействия с IL-2Rα. Поэтому было довольно неожиданным наблюдать, что различные мутации, примерами которых являются Р-0602 (R38A), Р-0614 (R38F) и Р-0615 (R38G), не приводили к уменьшению силы связывания с IL-2Rα или приводили лишь к минимальному (до 3 раз) уменьшению силы связывания с IL-2Rα. Данные по связыванию показаны на ФИГ. 4C-4D.

Сходным образом, остаток Е68 участвует в образовании множества водородных связей с взаимодействующими остатками IL-2Rα, но ни одна из замен Е68 на аминокислоты с различными свойствами, примерами которых являются Е68А (Р-0628), E68F (Р-0629), Е68Н (Р-0630) и E68L (Р-0631), не приводила к снижению связывания с IL-2Rα. Интересно, что Р-0629 и Р-0630 фактически продемонстрировали усиление связывания с IL-2Rα в 3 раза и 14 раз, соответственно (ФИГ. 5).

В заключение, замена остатков IL-2 Т41, R38, Е68 и Y107 обычно не нарушала взаимодействие с IL-2Rα, и полученные слитые белки IL-2 с гомодимером Fc полностью или почти полностью сохраняли связывание с IL-2Rα. Сводные данные по ЕС₅₀ при связывании различных мутеинов IL-2 в ELISA, нормализованные по Р-0531, представлены в Таблице 8.

В отличие от этого, все аминокислотные замены остатка Е62, примерами которых являются Р-0624 (Е62А), Р-0625 (E62F), Р-0626 (Е62Н) и Р-0627 (E62L), приводили к снижению связывания с IL-2Rα, указывая на то, что Е62 действительно расположен в энергетически активной точке при взаимодействии IL-2/IL-2Rα. Как показано на ФИГ. 6, в то время как замены Е62Н и E62L приводили лишь к небольшому снижению связывания с IL-2Rα в 2-3 раза, мутации Е62А и E62F, по-видимому, значительно нарушали взаимодействие с этой субъединицей IL-2R, приводя к снижению связывания с IL-2Rα в 60 и 150 раз, соответственно. Кроме того, в литературе хорошо задокументировано, что мутация F42A в IL-2 (Р-0613) нарушает взаимодействие с α-рецептором, как показано на ФИГ. 8А, снижая связывание с IL-2Rα в 15 раз.

В заключение, F42 и Е62 являются остатками IL-2, замена которых обычно нарушала взаимодействие с IL-2Rα, и полученные варианты IL-2 демонстрировали снижение связывания с IL-2Rα. ЕС₅₀ при связывании различных мутеинов IL-2 в ELISA нормализовали по Р-0531, и они показаны в Таблице 9.

Пример 5

Аминокислотные замены остатка Р65 оказывали неожиданно многообразное влияние на связывание α-субъединицей рецептора

Остаток IL-2 Р65 вступает в ван-дер-Ваальсовы взаимодействия с рядом критически важных взаимодействующих остатков IL-2Rα, включая R36 и L42, но не образует солевых или водородных связей с IL-2Rα. Поэтому предполагалось, что замены Р65 смогут привести лишь к незначительному нарушению взаимодействия с этой субъединицей IL-2R и, вероятно, будут оказывать слабое влияние на связывание с IL-2Rα. Тем не менее, влияние замен Р65 на взаимодействие с IL-2Rα резко противоречило этому предположению и было неожиданно многообразным, включая полное сохранение/усиление, снижение или полное устранение связывания с IL-2Rα.

Были введены многочисленные замены Р65, примерами которых являются P65G, Р65Е, Р65А, Р65Н, P65N, P65Q, P65R, P65K, и полученные мутеины IL-2 экспрессировали в форме С-концевых слитых белков с гомодимером Fc или гетеродимером Fc. Затем проводили скрининг этой панели мутеинов IL-2 в ELISA на предмет их связывания с CD25. Полученные данные по связыванию показаны на ФИГ. 7, и сводные данные по ЕС₅₀ при связывании мутеинов IL-2 в ELISA, нормализованные по Р-0531 или Р-0689 с учетом валентности каждой конструкции, представлены в Таблице 10.

Как показано на ФИГ. 7А и 7В, мутации P65G (Р-0608), Р65Е (Р-0633), Р65А (Р-0706), по-видимому, не приводили к какому-либо нарушению взаимодействия с субъединицей IL-2Rα; наоборот, сила связывания с IL-2Rα возрастала в 18, 10 и 10 раз, соответственно, по сравнению с их аналогами дикого типа.

Другая панель Fc-слитых белков мутеинов IL-2, Р-0634, Р-0708 и Р-0709, содержит мутации Р65, которые существенно нарушали взаимодействие IL-2 с субъединицей IL-2Rα. Как показано на ФИГ. 7С и в Таблице 9, P65N (Р-0708) приводила к умеренному снижению связывания с IL-2Rα в 8,6 раза, в то время как замены Р65Н (Р-0634) и Р65Н (Р-0709) приводили к более выраженному влиянию, на которое указывало снижение связывания с IL-2Rα в 23 раза и 43 раза, соответственно.

Еще одна категория замен Р65 IL-2, P65R и P65K, по-видимому, приводила к значительному нарушению взаимодействия IL-2 и IL-R2Rα и устранению связывания Р-0635, Р-0704 и Р-0707 с IL-2Rα (ФИГ. 7D). Р-0635 и Р-0704 представляют собой эквивалентные бивалентный и моновалентный Fc-слитые белки IL-2, содержащие замену P65R, а Р-0707 содержит аминокислотную замену P65K. На ФИГ. 7D показано, что все три Fc-слитых белка мутеинов IL-2 показали минимальный сигнал при концентрации IL-2Rα 100 нМ, что сопоставимо с эталонной молекулой, содержащей три мутации F42A/Y45A/L72G, нарушающие взаимодействие с CD25, продемонстрировавшей устранение связывания (Christian Klein, et. al, Oncomimunology (2017), 6: 3, е1277306).

Как показано на ФИГ. 7А-7С и в Таблицах 9 и 10, замены остатка Р65 приводили к неожиданно многообразному влиянию на связывание с IL-2Rα. Важно, что его замена может приводить к полному сохранению / усилению, снижению или полному устранению связывания полученных вариантов IL-2 с IL-2Rα. Как будет ясно специалистам в данной области, этот уровень изменения активности в результате изменений одной аминокислоты невозможно спрогнозировать методом структурно обоснованного мутагенеза. Полное устранение связывания с IL-2Rα также не было ожидаемым или описанным в предшествующем уровне техники, поскольку мутации Р65 изменяли лишь ограниченную часть поверхности, задействованной в ван-дер-Ваальсовых взаимодействиях.

Пример 6

Комбинации аминокислотных замен для модулирования связывания IL-2 с α-субъединицей рецептора

Как будет ясно специалистам в данной области, мутации, раскрытые в настоящем изобретении можно альтернативным и независимым образом комбинировать любым способом для оптимального модулирования связывания IL-2 с α-субъединицей рецептора. Здесь авторы изобретения демонстрируют разработку соединений IL-2, неспособных к связыванию с IL-2Rα, посредством комбинаций двух аминокислотных замен, нарушающих взаимодействие с IL-2Rα.

Р-0613 содержит мутацию F42A, приводившую к снижению связывания с IL-2Rα в 15 раз (ФИГ. 8А); Р-0625 и Р-0634 содержат замены E62F и Р65Н, снижавшие связывание с IL-2Rα в 150 раз и 23 раза, соответственно. Комбинации двух мутаций F42A и E62F в Р-0702 и двух мутаций F42A и Р65Н в Р-0703 приводили к устранению связывания с IL-2Rα (ФИГ. 8В и 8С). Как и следовало ожидать, Р-0766, содержавший два аминокислотных изменения F42/E62A, и Р-0767 с двумя заменами F42A/E62H были неспособны к связыванию с IL-2Rα (данные не показаны).

Помимо их применения для эффективной разработки мутеинов IL-2 с устраненным связыванием с IL-2Rα, комбинации аминокислот могут также быть использованы для модулирования уровня связывающей активности. Одним примером, показанным здесь, является Р-0765, содержащий одну мутацию, нарушающую взаимодействие с CD25, F42A, и одну мутацию, усиливающую взаимодействие с CD25, Р65А, и было отмечено умеренное снижение силы связывания с IL-2Rα в 6,8 раза по сравнению с его аналогом дикого типа Р-0689 (данные не показаны), что соответствовало комбинации отдельных мутаций. Сводные данные по ЕС₅₀ при связывании мутеинов IL-2 в ELISA, нормализованные по Р-0689, представлены в Таблице 11.

В заключение, комбинации аминокислотных замен являются универсальным способом модулирования связывания IL-2 с α-субъединицей рецептора. Он позволяет достичь полного устранения связывания с IL-2Rα посредством комбинации двух остатков, нарушающих взаимодействие с CD25, или он может быть применен для модулирования связывания с IL-2Rα с разной степенью его ослабления.

Пример 7

Модулирование силы связывания с IL-2Rα коррелирует с активностью IL-2 по стимуляции Treg-клеток в функциональном анализе ex vivo

Затем панель Fc-слитых белков вариантов IL-2 анализировали на предмет их способности к дифференциальной стимуляции фосфорилирования STAT5 в CD4+ Treg-клетках по сравнению со слитым белком дикого типа Р-0531 и эталонной молекулой Р-0551 (SEQ ID NO:95). Известно, что STAT5 вовлечен в каскад передачи сигнала, следующий после связывания IL-2 с трансмембранными рецепторами IL-2. Фосфорилирование STAT5 в субпопуляциях лимфоцитов измеряли с использованием свежих человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), а для определения популяции Treg в FACS-анализе использовали транскрипционный фактор Forkhead FOXP3.

Очищенные PBMC выдерживали в бессывороточном буфере MACS при 4°С в течение 1 часа. Затем 2×10⁵ PBMC обрабатывали серийными разведениями исследуемых соединений в течение 30 минут при 37°С. Клетки фиксировали и пермеабилизировали с использованием набора буферов Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (EBIO), осуществляя инкубирование с 1x фиксирующим/пермеабилизирующим рабочим раствором Foxp3 в течение 30 минут и промывку 1х пермеабилизирующим буфером. Клетки дополнительно фиксировали буфером Cytofix, пермеабилизировали буфером Perm Buffer III (BD Biosciences) и затем промывали. После блокирования Fc-рецепторов добавлением Human TruStain FcX (разведение 1:50) клетки окрашивали антителами против CD25 с РЕ, против FOXP3 с АРС, против pSTAT5 с FITC и против CD4 с PerCP-Су5.5 в концентрациях, рекомендованных изготовителем, в течение 45 минут при комнатной температуре. Клетки собирали посредством центрифугирования, промывали, ресуспендировали в FACS-буфере и анализировали посредтвом проточной цитометрии. Данные проточной цитометрии субпопуляций Treg-клеток анализировали по группе CD4+ /Foxp3+/CD25_high. Данные выражены как процент pStat5-положительных клеток в анализируемой популяции.

Эта панель Fc-слитых белков вариантов IL-2 включает аминокислотные замены, усиливающие связывание (Р-0608), снижающие связывание (Р-0626, Р-0634 и Р-0624) или устраняющие связывание (Р-0635) с IL-2Rα. Кроме того, Р-0626, Р-0634 и Р-0624 демонстрировали различные уровни ослабления силы связывания с IL-2Rα; у Р-0626, Р-0634 и Р-0624 связывание было снижено в 2,6, 23 и 60 раз, соответственно. Отражением тенденции и уровня модулирования связывания с IL-2Rα является дифференциальная активность различных Fc-слитых белков вариантов IL-2 при стимуляции фосфорилирования STAT5 в CD4+ Treg-клетках (ФИГ. 9). Соответственно, Р-0608 с усиленным связыванием с IL-2Rα продемонстрировал тенденцию к более высокой, чем у Р-0531, активности при стимуляции фосфорилирования STAT5 в Treg. Р-0626, Р-0624 и Р-0634 показали сниженную pSTAT5-активность, что соответствует их сниженному связыванию с IL-2Rα. Их сохраненное, хотя и сниженное, связывание с IL-2Rα приводило ко все еще большей активности Treg, чем в случае Р-0635 и эталонного Р-0551 с устраненным связыванием с IL-2Rα. Р-0635 и Р-0551 имеют сопоставимое 5-кратное логарифмическое правое смещение активности индуцирования pSTAT5 в Treg-клетках, и этот низкий уровень передачи сигнала в Treg, вероятно, обусловлен активацией IL-Rβγ, экспрессированного на Treg-клетках. Вследствие этого ожидается, что эти мутанты позволят достичь желаемой активации Treg в концентрации, при которой также происходила активация CD8+ Т- и NK-клеток. Весьма неожиданно наблюдать, что полное устранение связывания с IL-2Rα приводило к более чем 5-кратному логарифмическому снижению активности в отношении Treg (ФИГ. 9).

Пример 8

Эффект мутаций IL-2, введенных в области, взаимодействующие с IL-2Rα, на взаимодействие с IL-2Rβγ

Для исследования того, влияют ли мутации IL-2, введенные в области, взаимодействующие с IL-2Rα, на взаимодействие IL-2 с IL-2Rβγ, ту же панель Fc-слитых белков вариантов IL-2, что и в Примере 7, анализировали в ELISA на предмет связывания с IL-2Rβγ.

Кратко, рекомбинантный гетеродимер IL-2Rβγ, содержащий ECD IL-2Rβ (SEQ ID NO:109), слитый с N-концом Hole-цепи Fc (SEQ ID NO:10), и ECD γс (SEQ ID NO:110), слитый с N-концом Knob-цепи Fc (SEQ ID NO:9), сорбировали на лунки 96-луночных микропланшетов Nunc Maxisorp, по 2 мкг на лунку. После инкубирования в течение ночи при 4°С и блокирования 1% BSA, в каждую лунку вносили по 100 мкл 3-кратных серийных разведений Fc-слитых белков IL-2, начиная с 10 нМ. После инкубирования в течение одного часа при комнатной температуре в каждую лунку вносили по 100 мкл клона мышиного антитела против человеческого IL-2 В33-2 (BD Biosiences), 0,5 мкг/мл, и осуществляли инкубирование при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл стрептавидина-HRP (разведение 1:5000 в разбавителе) и осуществляли инкубирование при комнатной температуре в течение 40 мин. После каждой стадии содержимое лунок тщательно отбирали и проводили их трехкратную промывку с использованием PBS/0,05% Tween-20. В завершение, в каждую лунку вносили по 100 мкл ТМВ-субстрата, планшет проявляли при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут и вносили останавливающий раствор (2 H серная кислота, Ricca Chemical), по 100 мкл на лунку. Оптическую плотность определяли при 450 нм и кривые строили с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad).

Как показано на ФИГ. 10, по сравнению со слитым белком IL-2 дикого типа Р-0531 все типичные Fc-слитые белки вариантов IL-2, содержащие мутации, усиливающие, снижающие или устраняющие связывание с IL-2Rα, продемонстрировали неизмененное связывание с IL-2Rβγ. Полученные данные подтвердили, что проанализированные мутации IL-2, введенные в области, взаимодействующие с IL-2Rα, действительно препятствуют только связыванию с CD25 и не влияют на взаимодействие с IL-2Rβγ.

Панель типичных Fc-слитых белков вариантов IL-2 также характеризовали на предмет индуцирования экспрессии Ki67 в человеческих CD8+ Т-клетках и NK-клетках посредством проточной цитометрии. Свежевыделенные NK-клетки и CD8+ Т-клетки не экспрессируют CD25 или экспрессируют его на очень низком уровне, и сигналы IL-2R опосредованы главным образом βγ-субъединицами рецептора с промежуточной аффинностью. Ki67 представляет собой ядерный белок, используемый в качестве маркера пролиферации клеток.

Кратко, человеческие РВМС выделяли посредством центрифугирования с использованием Ficoll-Hypaque из лейкоцитарной пленки здорового донора. Очищенные человеческие РВМС обрабатывали серийными разведениями Fc-слитых белков вариантов IL-2 и инкубировали при 37°С в течение 5 суток. В 5 сутки клетки промывали один раз FACS-буфером (1% FBS/PBS) и сначала окрашивали Fc-блокирующим раствором и антителами к поверхностным маркерам, антителом против человеческого CD56 с FITC, антителом против человеческого CD8 с АРС. После 30 минут инкубирования и промывки клеточные осадки полностью ресуспендировали, внося 1х фиксирующий и пермеабилизирующий рабочий раствор Foxp3, 200 мкл на лунку, и осуществляли инкубирование в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После центрифугирования в каждую лунку вносили по 200 мкл 1х пермеабилизирующего буфера для еще одной промывки. Клеточные осадки ресуспендировали в пермеабилизирующем буфере с антителом против человеческого Ki67 с РЕ (разведение 1:25). После 30 минут инкубирования при комнатной температуре клетки собирали и промывали, ресуспендировали в FACS-буфере и анализировали посредтвом проточной цитометрии. Данные выражены как % Ki67-положительных клеток в анализируемой популяции.

Дозозависимое повышение экспрессии Ki67 в CD8+ Т-клетках и NK-клетках в ответ на Fc-слитые белки вариантов IL-2, по сравнению с Р-0531 и Р-0551, показаны на ФИГ. 11А и 11В. Введение мутаций, препятствующих взаимодействию с CD25, приводило к Fc-слитым конструкциям с активностью, сопоставимой с Р-0531, бивалентным слитым белком IL-2 дикого типа.

Кроме того, Р-0689 и Р-0704, моновалентные аналоги Р-0531 и Р-0635, соответственно, характеризовали на предмет индуцирования экспрессии Ki67 в человеческих CD8+ Т-клетках. Как показано на ФИГ. 11С, Р-0689 (IL-2 дикого типа) и Р-0704, содержащий мутацию P65R, устраняющую связывание с IL-2Rα, продемонстрировали одинаковое дозозависимое повышение экспрессии Ki67 в CD8+ Т-клетках. Вместе взятые, функциональные данные, полученные ex vivo, дополнительно подтвердили, что мутации IL-2, введенные в области, взаимодействующие с IL-2Rα, оказывают минимальное влияние на взаимодействие с IL-2Rβγ или не влияют на взаимодействие с IL-2Rβγ. Более того, различия активности между Р-0531 и Р-0689 и между Р-0635 и Р-0704 соответствовали их различиям по валентности IL-2.

Пример 9

Введение замен, нарушающих взаимодействие с IL-2Rβ или γс, в варианты IL-2 со сниженным связыванием с IL-2Rα для ослабления общей активности

Полный агонист IL-2 может приводить к избыточной активации пути IL-2 и нежелательной токсичности, обусловленной связыванием с мишенью вне целевой ткани. Это может быть особенно выражено в случае полного селективного агониста IL-2Rβγ; вследствие повышенной селективности и сниженного клиренса, обусловленного связыванием с CD25, полный селективный агонист IL-2Rβγ может стимулировать выраженные ответы CD4+ , CD8+ эффекторных Т- и NK-клеток in vivo. В результате возможно развитие острой токсичности с сильным уменьшением массы тела. Кроме того, клеточное истощение или гибель клеток, обусловленные избыточной стимуляцией, могут приводить к утрате ответа in vivo после многократного введения. Было сформулировано предположение, что снижение общей активности может предотвратить избыточную активацию пути IL-2 и снизить нежелательный клиренс, обусловленный связыванием с мишенью; следовательно, это может потенциально снизить токсичность и улучшить фармакокинетику и фармакодинамику. Поэтому для оптимальной активности замены, модулирующие взаимодействие с IL-2Rβγ для ослабления общей активности, были введены в варианты IL-2 со сниженным/устраненным связыванием с IL-2Rα. Снижение аффинности связывания с IL-2Rβγ будет также уменьшать рецептор-опосредованную интернализацию IL-2, приводя к медленной, но стойкой активации рецепторов и продолжительной фармакодинамике по сравнению с IL-2 дикого типа.

Выбор мутаций, нарушающих взаимодействие с IL-2Rβ или γс, был основан на анализе сокристаллической структуры IL-2/IL-2R (PDB-код 2В51). Замена остатков, расположенных во взаимодействующих областях, вступающих в непосредственный контакт с субъединицами IL-2Rβ или γс, или вблизи таких областей, может приводить к снижению связывания с IL-2Rβγ и, таким образом, модулировать общую активность при активации пути. Например, D20 вовлечен в обширную сеть водородных связей с боковыми цепями субъединицы рецептора в областях, взаимодействующих с IL-2Rβ. Сходным образом, N88 является энергетически активной точкой взаимодействия IL-2/IL-2Rβ, участвуя в критически важных водородных связях с цепью рецептора. Q126 необходим для взаимодействия с γс. Тем не менее, аминокислотные замены в энергетически активной точке могут приводить к существенному снижению активности до субоптимального уровня, примерами чего являются различные мутации в положении D20 (D20E, D20T, D20N, D20Q, D20S) на ФИГ. 13А. Все мутации вводили в IL-2 Р-0250 (SEQ ID:67) и осуществляли экспрессию в виде Fc-слитых белков вариантов IL-2. Как показано на ФИГ. 13А, большинство мутаций D20 приводили к значительному снижению или устранению активности при стимуляции экспрессии pSTAT5 в CD4+ Tconv-клетках, экспрессирующих только субъединицы IL-2Rβγ. Сходным образом, большинство мутаций в положении N88 также приводили к устранению активности при активации CD4+ Tconv-клеток (данные не показаны).

Поэтому осуществляли аминокислотные замены остатка в положении L19, вступающего только в ван-дер-Ваальсовы взаимодействия с IL-2Rβ, и полученные мутанты только модулируют, но не устраняют функциональную активность IL-2. На ФИГ. 13В и 13С показано, что варианты IL-2 с различными мутациями в положении 19 продемонстрировали спектр уровней активности при индуцировании фосфорилирования STAT5 в CD4+ Tconv-клетках. По сравнению с диким типом, мутации L19Y, L19R, L19Q приводили к небольшому снижению активности, в то время как L19N и L19H умеренно снижали активность. В случае L19D снижение активности было значительным. Различные уровни снижения активности в результате мутаций в положении L19 облегчают тонкую настройку активности для получения оптимальной активности для снижения токсичности и улучшения фармакокинетики и фармакокинетики in vivo.

Кроме того, сходным образом получали варианты IL-2 с аминокислотными изменениями остатка Q126, необходимого для взаимодействия с γс. Функциональная активность Fc-слитого белка IL-2 Q126E при индуцировании фосфорилирования STAT5 в CD4+ Tconv-клетках показана на ФИГ. 13D. По сравнению с аналогом дикого типа, Q126E приводила к незначительному снижению активности.

Кроме того, поскольку во взаимодействие с IL-2Rβγ вовлечены главным образом аминокислоты N-конца IL-2, делецию N-концевых аминокислот рассматривали как еще один способ модулирования общей активности. Поэтому конструировали мутантов с N-концевыми делециями (делециями 5, 7, 9 или 11 N-концевых аминокислот) на основе варианта IL-2, содержащего L19H/S125I/Q126E, и анализировали их в анализе с человеческими РВМС. Поскольку исходная молекула, L19H/S125I/Q126E-вариант IL-2, полностью сохраняет связывание с IL-2Rα, но имеет сниженное связывание с IL-2Rβγ, ее можно надежно анализировать только с использованием Treg-клеток, что все еще позволяет выделить влияние мутаций на общую активность. В случае Fc-варианта IL-2 с делецией 11 аминокислот полученного материала было недостаточно для того, чтобы его охарактеризовать. Как показано на ФИГ. 13Е, в то время как делеции 5 и 7 аминокислот полностью сохраняли активность, делеция 9 аминокислот приводила к снижению активности в 25 раз (18 пМ против 0,74 пМ). Поэтому ожидается, что различные варианты IL-2 с разной активностью можно дополнительно модифицировать для получения желаемого профиля активности посредством делеции 7, 8, 9 или 10 N-концевых аминокислот.

В Р-0704 вводили мутации L19H, L19Q, L19Y, нарушающие взаимодействие с IL-2Rβ, и мутацию Q126E, нарушающую взаимодействие с γс, с получением Р-0731, Р-0759, Р-0761 и Р-0732, соответственно. Р-0704 содержит аминокислотную замену P65R, приводящую к полной утрате связывания с IL-2Rα. Р-0731, Р-0759, Р-0761 и Р-0732 анализировали на предмет связывания с IL-2Rβγ в ELISA и на предмет индуцирования экспрессии Ki67 в человеческих CD8+ Т-клетках, CD4+ Т-клетках и NK-клетках посредством проточной цитометрии в сравнении с Р-0704.

Как показано на ФИГ. 14А, по сравнению с Р-0689 и Р-0704 все типичные Fc-слитые белки вариантов IL-2 продемонстрировали различные уровни снижения связывания с IL-2Rβγ. Поскольку связывание IL-2 с β- или γ-субъединицей рецептора было слабым и характеризовалось высокой скоростью диссоциации, связывающую активность в отношении каждой отдельной субъединицы нельзя было надежно оценить посредством ELISA (данные не показаны). Тем не менее, предполагалось, что снижение связывания с гетеродимером IL-2Rβγ было связано с аминокислотными изменениями, нарушающими взаимодействие с соответствующей β- или γ-субъединицей рецептора.

Снижение активности, обусловленное заменой L19H, нарушающей взаимодействие с IL-2Rβ, в Р-0731 и мутацией Q126E, нарушающей взаимодействие с γс, в Р-0732 оценивали, определяя активность при индуцировании экспрессии Ki67 в человеческих CD8+ Т-клетках человеческих РВМС. Р-0689, S125I-эквивалент мономерного Fc-слитого белка IL-2 дикого типа, и Р-0704, утративший связывание с IL-2Rα, но полностью сохранивший аффинность и функциональную активность в отношении димерного рецептора IL-2Rβγ, были включены для сравнения. Как показано на ФИГ. 14В, все мономерные Fc-слитые белки IL-2 приводили к повышенному проценту Ki67-положительных CD8+ Т-клеток дозозависимым образом; Р-0731 продемонстрировал снижение активности приблизительно в 30 раз по сравнению с Р-0704. Р-0732 продемонстрировал наименьшую активность с ростом ЕС₅₀ более чем в 100 раз по сравнению с Р-0704.

Дозозависимое усиление пролиферации человеческих CD8+ Т-клеток, NK-клеток и CD4+ Т-клеток под действием Р-0731, Р-759 и Р-0761 показано на ФИГ. 15А, 15В и 15С, соответственно. Fc-слитые белки вариантов IL-2 Р-0731, Р-0759 и Р-0761 содержат мутации в положении L19, нарушающие взаимодействие с IL-2Rβ, в дополнение к замене P65R, устраняющей связывание с IL-2Rα, в Р-0704. По сравнению с Р-0704, все варианты продемонстрировали ожидаемое снижение активности при пролиферации человеческих CD8+ Т-клеток, NK-клеток и CD4+ Т-клеток. Р-0759 (L19Q) и Р-0761 (L19Y) продемонстрировали незначительное снижение активности в 3-5 раз, в то время как мутация L19H в Р-0731 приводила к более существенному 30-кратному снижению активности. Уровень ослабления активности заменами L19Q и L19H продемонстрировал одну и ту же тенденцию во всех проанализированных клеточных субпопуляциях и соответствовал уровню снижения активности при индуцировании экспрессии pSTAT5 в CD4+ Tconv-клетках (ФИГ. 13В и 13С) и уровню ослабления связывания с рекомбинантным белком IL-2Rβγ (ФИГ. 14А). Эталонная молекула продемонстрировала сопоставимую, но несколько сниженную активность при индуцировании пролиферации клеток по сравнению с Р-0704.

В заключение, помимо введения замены, нарушающей взаимодействие с CD25, в IL-2 для сдерживания нежелательного роста числа иммуносупрессивных Treg, возможно дополнительное введение замен или N-концевых делеций, нарушающих взаимодействие с IL-2Rβγ, для ослабления общей активности для обеспечения оптимальной активности. Снижение активности может предотвратить избыточную активацию пути IL-2 и снизить нежелательный клиренс, обусловленный связыванием с мишенью; следовательно, это может потенциально снизить токсичность и улучшить фармакокинетику и фармакодинамику.

Пример 10

Фармакодинамические эффекты Fc-слитых белков вариантов IL-2 у мышей после однократной инъекции

Динамику роста числа клеток в различных субпопуляциях лимфоцитов после введения Р-0704 (SEQ ID NO:96 и 10), С-концевого моновалентного Fc-слитого белка варианта IL-2 с устраненным связыванием с IL-2Rα, оценивали у мышей Balb/С после однократной инъекции. Осуществляли мониторинг эффекта на рост числа лимфоцитов в периферической крови с течением времени. Кроме того, сравнивали иммунофармакодинамические профили Р-0704 и Р-0689 (SEQ ID NO:107 и 10), аналога с IL-2 дикого типа.

Самок мышей Balb/с в возрасте семи недель получали от Charles River Laboratory и акклиматизировали в собственном исследовательском центре в течение по меньшей мере 7 суток перед исследованием. Наполнитель, Р-0704 и Р-0689 в дозе 0,6 мг/кг вводили мышам внутрибрюшинно однократно в сутки 0. Забор образцов крови осуществляли в 3 и 5 сутки после инъекции. Каждая группа включала по 4 мыши.

Для иммунного фенотипирования использовали цельную кровь, обработанную гепарином. После лизиса эритроцитов с использованием лизирующего буфера BD Pharm рассчитывали общее число жизнеспособных мононуклеарных клеток крови посредством исключения нежизнеспособных клеток с использованием трипанового синего и затем проводили окрашивание внутриклеточного Ki67. Клеточные осадки полностью ресуспендировали, внося 1х фиксирующий/пермеабилизирующий рабочий раствор Foxp3, 200 мкл на лунку, и осуществляли инкубирование в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После центрифугирования в каждую лунку вносили по 200 мкл 1х пермеабилизирующего буфера для еще одной промывки. После блокирования Fc-рецепторов очищенным антителом против мышиного CD16/CD32 (разведение 1:50) клетки окрашивали с использованием АРС-су7 CD3, BV510 CD4, FITC Foxp3, PE Ki67, APC CD335 и Percpcy5.5 CD8 (разведение 1:50). После 30 минут инкубирования клетки собирали и промывали, ресуспендировали в FACS-буфере и анализировали посредтвом проточной цитометрии.

Как показано на ФИГ. 16А, IL-2 дикого типа в Р-0689 приводил к выраженному росту числа Treg-клеток (6-кратное увеличение количества клеток) с пиковыми значениями в 3 сутки, что нежелательно для лечения рака, в то время как Р-0704 не приводил к росту числа Treg в 3 сутки и приводил лишь к минимальному увеличению количества Treg-клеток в 5 сутки. В отличие от этого, Р-0704 увеличивал процент CD8+ Т-клеток в общей популяции CD3+ лимфоцитов в 3 сутки и продолжал увеличивать CD8 популяцию в 5 сутки с 19% (исходно) до 67% (ФИГ. 16В). Р-0689, наоборот, приводил к минимальному росту числа CD8+ Т-клеток (ФИГ. 16В). Что касается NK-клеток, в 3 сутки после введения Р-0704 был отмечен рост числа клеток в 5,4 раза, который продолжался и приводил к 64-кратному увеличению количества клеток в 5 сутки. Р-0689 увеличивал число NK-клеток в 7,8 раза в 3 сутки, но этот эффект быстро исчезал с возвращением к исходным значениям в 5 сутки (ФИГ. 16С).

В заключение, Р-0704 продемонстрировал почти полное устранение роста числа Treg и значительно усиленный рост числа CD8 и NK-клеток, и этот профиль роста числа клеток значительно отличается от Р-0689. Это наблюдение соответствует значительному различию их способности к связыванию с субъединицей IL-2Rα и, вследствие этого, чувствительности к ним Treg-клеток. Кроме того, как полный IL-2Rβγ-селективный агонист Р-0704 может стимулировать сильные ответы CD8+ эффекторных Т- и NK-клеток in vivo благодаря повышенной селективности и снижению клиренса, обусловленного связыванием с CD25.

Пример 11

Конструирование, экспрессия и очистка слитых белков IL-2 с антителом

В данном примере получали и анализировали различные слитые белки IL-2 с антителом. Связывание вариантов IL-2 с антителами, нацеленными на иммунные контрольные точки, будет, предположительно, направлять IL-2 к истощенным Т-клеткам и иммунологически активизировать опухолевое микроокружение. Эта стратегия также снижает системную экспозицию IL-2 и токсичность, не связанную с взаимодействием с мишенью. Также следует ожидать, что бифункциональный слитый белок ингибиторов иммунных контрольных точек с вариантами IL-2 обеспечит синергию посредством устранения негативной регуляции, реактивации функций Т-клеток и увеличения их количества. Предположительно, слитые белки цитокина с антителом, блокирующим иммунные контрольные точки, дополнительного усилят противоопухолевую активность иммунной системы. Авторы настоящего изобретения предполагают, что применение вариантов IL-2 со сниженным/устраненным связыванием с IL-2Rα и ослабленной активностью в отношении IL-2Rβγ должно способствовать установлению стехиометрического баланса между цитокиновой и антителосодержащей частями, демонстрирующими значительно различающиеся активность и молекулярные массы, позволяя определять оптимальные дозы и поддерживать функцию каждой из этих частей. Кроме того, ожидается, что ослабление активности цитокина минимизирует периферическую активацию, снизит клиренс, обусловленный связыванием с антигеном, и будет стимулировать направленное действие на опухоль через антителосодержащую часть.

Поскольку мишени ингибиторов контрольных точек, такие как PD-1, экспрессированы на цитотоксических Т-клетках или других субпопуляциях лимфоцитов, экспрессирующих также IL-2Rβγ, следует ожидать, что слитые белки IL-2 с антителом к PD-1 позволят доставлять вариант IL-2 преимущественно к PD-1 + клеткам, таким как активированные и истощенные CD8+ Т-клетки опухолевого микроокружения, способствуя селективной передаче сигналов.

Следуя этой концепции, были сконструированы различные слитые белки IL-2 с антителом.

Для получения слитых белков IL-2 с антителом домен СН1-СН2-СН3 (остатки 118-447 антитела по нумерации EU) тяжелых цепей указанных выше антител заменяли последовательностью IgG1, представленной в SEQ ID NO:162, содержащей мутации L234A, L235A, G237A для устранения связывания с FcγR и C1q, но сохранения связывания с FcRn или PK (фармакикинетика). Осуществляют слияние пептида варианта IL-2 через пептидный линкер, последовательность которого приведена в Таблице 6, с С-концом Fc-домена. Альтернативно, для экспрессии моновалентного варианта IL-2 домен СН1-СН2-СН3 тяжелых цепей указанных выше антител заменяли гетеродимерными цепями, представленными в SEQ ID NO:163-164. Осуществляют слияние пептида варианта IL-2 через пептидный линкер, последовательность которого приведена в Таблице 6, с С-концом гетеродимерной тяжелой цепи, содержащей модификацию типа выступ (Knob), конструированной с применением технологии «выступ во впадину» (knob-into-holes). В гомодимерные или гетеродимерные Fc-цепи могут также быть включены мутации, увеличивающие период полувыведения, например N434α. Типичные слитые белки IL-2 с антителом-антагонистом PD-1 представлены в Таблице 12. Кроме того, Р-0844 представляет собой эталонный слитый белок варианта IL-2 с антителом-антагонистом PD-1, содержащий SEQ ID NO:182-184.

Синтез генов, конструирование векторов экспрессии и получение, очистку и определение характеристик белков осуществляли, следуя тем же методикам, что подробно описаны в Примере 1.

Слитые белки вариантов IL-2 с суррогатным антителом к мышиному PD-1 получали аналогичным образом для применения опухолевых моделей у иммунокомпетентных мышей in vivo. Суррогатное антитело против мышиного PD-1 содержит SEQ ID NO:185-187 с мутациями Fc для устранения эффекторной функции и для гетеродимеризации; вариант IL-2 был слит с С-концом НС-цепи 2 антитела против мышиного PD-1 (SEQ ID NO:186) через линкер (G₄S)₃ (SEQ ID NO:15). В Таблице 13 приведены варианты IL-2 в каждом типичном слитом белке вариантов IL-2 с суррогатным антителом к мышиному PD-1.

Пример 12

Слитые белки вариантов IL-2 с антителом полностью сохраняют активность IL-2 и профили активности в функциональных анализах ex vivo

Суррогатное антитело-антагонист мышиного PD-1 (SEQ ID NO:185-187), использованное в данном исследовании, не вступает в перекрестное взаимодействие с человеческим антигеном; поэтому его использовали в качестве нефункционального антитела в человеческих клетках для оценки влияния формата слитого белка с антителом на активность и профиль активности вариантов IL-2 при стимуляции и пролиферации субпопуляций лимфоцитов.

Влияние формата слитого белка с антителом изучали на примере Р-0782 в сравнении с его Fc-слитым аналогом Р-0704. Как Р-0782, так и Р-0704 содержат мономерный P65R-вариант IL-2, соединенный с С-концом гетеродимерного Fc-домена через гибкий линкер (G₃S)₂ (SEQ ID NO:18). Замена P65R в IL-2 устраняла связывание с IL-2Rα (ФИГ. 7D). Как показано на ФИГ. 17А-17С, Р-0782 и Р-0704 равносильны при индуцировании дозозависимого фосфорилирования STAT5 в CD4+ Treg-клетках (ФИГ. 17А), CD8+ Т-клетках (ФИГ. 17В) и NK-клетках (ФИГ. 17С). Полученные данные подтвердили, что группировка IL-2, слитая с антителом, полностью сохраняет свою активность, как в его соответствующем Fc-слитом белке.

Кроме того, три слитых белка вариантов IL-2 с антителом к мышиному PD-1, Р-0837, Р-0838 и Р-0782, сравнивали на предмет их активности при стимуляции pSTAT5 в человеческих РВМС. Мутации IL-2 в Р-0838 и Р-0782 представляют собой P65Q и P65R, соответственно. Р-0837 содержит группировку IL-2 дикого типа (SEQ ID NO:4). По сравнению с диким типом, P65Q уменьшала силу связывания с IL-2Rα в 43 раза (Таблица 10), а P65R устраняла связывание с IL-2Rα. Подтверждая данные, полученные с использованием Fc-слитых молекул IL-2 в предшествующих примерах, на ФИГ. 18А-18С показано, что мутации IL-2, введенные в области, взаимодействующие с IL-2Rα, действительно препятствуют только связыванию с CD25 и не влияют на взаимодействие с IL-2Rβγ. Поскольку CD8+ Т- и NK-клетки человеческих РВМС, не контактировавшие с антигеном, экспрессируют CD25 на очень низких уровнях, все три молекулы демонстрируют идентичную активность при дозозависимой стимуляции экспрессии pSTAT5 в этих двух субпопуляциях лимфоцитов (ФИГ. 18В и 18С). Treg-клетки, наоборот, конститутивно экспрессируют CD25 на высоких уровнях, и поэтому Р-0838 и Р-0782 продемонстрировали значительное снижение ответа при стимуляции экспрессии pSTAT5 в Treg-клетках по сравнению с их аналогом дикого типа Р-0837 (ФИГ. 18А); у Р-0837, Р-0838 и Р-0782 значения ЕС₅₀ составляют 0,45 пМ, 0,36 нМ (в 800 раз слабее Р-0837) и 4,5 нМ (в 10000 раз слабее Р-0837), соответственно. Как мутант со сниженным связыванием с CD25 Р-0838, так и мутант с устраненным связыванием с CD25 Р-0782 сохраняли активность при стимуляции CD8 и NK-клеток, сходную с их аналогом дикого типа. Кроме того, устранение связывания с IL-2Rα в случае Р-0782 приводило к отношению ЕС₅₀ Treg/CD8, равному приблизительно 1, указывая на отсутствие преимущественной стимуляции Treg-клеток в сравнении с цитотоксическими эффекторными клетками (ЕС₅₀ 4,5 нМ для Treg против 4,6 нМ для CD8+ Т-клеток). Наличие связывания с IL-2Rα, пусть и значительно ослабленного, у Р-0838 приводит к 13-кратному усилению pSTAT5-чувствительности Treg по сравнению с CD8+ Т-клетками (0,36 нМ для Treg против 4,6 нМ для CD8+ Т-клеток).

В функциональных анализах формата слитого белка IL-2 с антителом ex vivo были также изучены варианты IL-2 с ослабленной активностью и мутациями L19Q и L19H, нарушающими взаимодействие с IL-2Rβ, в дополнение к сниженному связыванию с IL-2Rα. По сравнению с Р-0782, Р-0786 содержит одну дополнительную замену L19Q, а Р-0783 содержит L19H. Fc-аналогами Р-0782, Р-0786 и Р-0783 являются Р-0704, Р-0759 и Р-0731, соответственно.

Дозозависимое индуцирование фосфорилирования STAT5 под действием Р-0782, Р-0786 и Р-0783 в человеческих CD8+ Т-клетках и NK-клетках показано на ФИГ. 19А и 19В, соответственно; дозозависимое усиление пролиферации тех же субпопуляций лимфоцитов показано на ФИГ. 19С и 19D, соответственно. По сравнению с Р-0782, Р-0786 продемонстрировал небольшое 2-3-кратное снижение активности при индуцировании фосфорилирования STAT5 в CD8+ Т-клетках (ФИГ. 19А) и NK-клетках (ФИГ. 19В), в то время как мутация L19H в Р-0783 приводила к более выраженному снижению активности в 20-30 раз (ФИГ. 19А и 19В). Сходный уровень ослабления активности был отмечен по дозозависимому повышению Ki67 в CD8+ Т-клетках (ФИГ. 19С) и NK-клетках (ФИГ. 19D). Уровень ослабления активности в случае слитых белков с антителом Р-0782, Р-0786 и Р-0783 продемонстрировал ту же тенденцию, что и соответствующие им Fc-слитые белки Р-0704, Р-0759 и Р-0731, соответственно (ФИГ. 15А и 15В).

Ослабление активности посредством мутаций, нарушающих взаимодействие с IL-2Rβ, также оценивали в контексте мутации P65Q в формате слитого белка IL-2 с антителом. L19Q и L19H вводили в Р-0838 с получением Р-0790 и Р-0787, соответственно. На ФИГ. 20А, 20В и 20С показана их активность при стимуляции фосфорилирования STAT5 в Treg, CD8+ T- и NK-клетках. На ФИГ. 20D и 20Е показано дозозависимое повышение маркера пролиферации Ki67 в CD8+ Т-клетках и NK-клетках. Уровни ослабления активности демонстрируют ту же тенденцию, что слитые белки с антителом на основе мутации P65R, устраняющей взаимодействие с IL-2Rα.

Р-0782, Р-0786 и Р-0783 дополнительно анализировали на предмет активности пролиферации CTLL-2 наряду с Р-0837, содержащим S125I-эквивалент IL-2 дикого типа. Клетки CTLL-2 представляют собой цитотоксические Т-клетки, имеющие происхождение от мышей C57BL/6 и экспрессирующие α-, β- и γ-субъединицы рецептора. Кратко, клетки CTLL-2 собирали, промывали, ресуспендировали в среде (RPMI1640, 10% FCS, 2 мМ глутамина) без IL-2 и инкубировали в течение двух часов (без IL-2). После этого 50 мкл клеток CTLL-2, ресуспендированных в количестве 50000/мл в свежей среде без IL-2, переносили в 96-луночный планшет с U-образным дном. В лунки добавляли по пятьдесят мкл серийного разведения слитого белка IL-2 с антителом, получая конечный объем 100 мкл на лунку. Образцы инкубировали в течение 2 суток и пролиферацию оценивали с использованием CellTiter-Glo, следуя инструкциям изготовителя и измеряя люминесцентные сигналы. Как показано на ФИГ. 21, уровни ослабления активности, обусловленного L19Q и L19H, сохранялись и при использовании мышиных клеток. Р-0837, содержащий IL-2 дикого типа, продемонстрировал существенно больший рост, чем Р-0782, вследствие того, что клетки CTLL-2 экспрессируют субъединицу IL-2Rα, аналогично Treg-клеткам.

В заключение, в функциональных анализах ex vivo варианты IL-2 в формате слитых белков с суррогатным антителом к мышиному PD-1 полностью сохраняли активность и профили активности, наблюдаемые у их Fc-слитых эквивалентов.

Пример 13

Определение характеристик слитых белков вариантов IL-2 с антителом к человеческому PD-1 in vitro

Р-0795 представляет собой антитело-антагонист человеческого PD-1, содержащее SEQ ID NO:140 в качестве тяжелой цепи и SEQ ID NO:141 в качестве легкой цепи. Р-0803 (SEQ ID NO:166, 169 и 141) представляет собой иммуноконъюгат Р-0795 с вариантом IL-2, слитым с С-концом гетеродимерной тяжелой цепи, содержащей модификацию типа выступ (Knob). Вариант IL-2 в Р-0803 содержит мутацию P65R, устраняющую связывание с IL-2Rα, и замену S125I, расширяющую возможности разработки. Функцию антителосодержащей части слитого белка с антителом на примере Р-0803 анализировали как в формате ELISA прямого связывания, так и в формате ELISA конкурентного ингибирования связывания с лигандом.

Для анализа прямого связывания следовали тому же протоколу ELISA, что в Примере 4, используя huPD-1-His в качестве сорбируемого антигена. Для ELISA конкурентного ингибирования связывания с лигандом (PD-L1) применяли сходный протокол ELISA с некоторыми изменениями. Кратко, на планшет сорбировали белок человеческого PD-1 с Fc, 0,2 мкг на лунку, при 4°С в течение ночи. После промывки и блокирования с использованием 2% BSA биотинилированный человеческий PD-L1 с Fc, 0,5 мкг/мл, смешивали с серийно разведенным Р-0795 или Р-0803, 1:1 (об./об.); по 100 мкл смеси вносили в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. В качестве вторичного антитела добавляли стрептавидин-HRP.

Как показано на ФИГ. 22А, Р-0803 и Р-0795 имели одинаковую силу связывания с PD-1 (ЕС₅₀ равна 0,6 нМ). Р-0803 и Р-0795 имели также равную активность при блокировании связывания человеческого PD-1 с PD-L1, иммобилизованным на поверхности (IC₅₀ равна 2,1 нМ; ФИГ. 22В). Вместе взятые, эти данные подтвердили полную функциональность антителосодержащей части слитого белка IL-2 с антителом.

Сходным образом, в FACS-анализе вариант IL-2 с антителом к человеческому PD-1 продемонстрировал связывание с PD-1, экспрессированным на поверхности клеток, сходное с исходным антителом (ФИГ. 22С). Р-0795 представляет собой антитело-антагонист человеческого PD-1, и как Р-0880, так и Р-0885 содержат моновалентный IL-2, присоединенный к С-концу Р-0795 через линкер (G₄S)₃. Р-0880 содержит замены P65R/S125I, в то время как Р-0885 содержит мутации L19Q/P65R/S125I. Р-0704 и Р-0759 представляют собой Fc-слитые аналоги Р-0880 и Р-0885, соответственно. Как и следовало ожидать, ввиду отсутствия части, нацеленной на PD-1, Р-0704 и Р-0759 не связывались с клетками, экспрессирующими PD-1.

Поскольку PD-1 связывается с ингибитором контрольных точек PD-1, ожидается, что иммуноконъюгат позволит доставлять вариант IL-2 преимущественно к PD-1 + клеткам, таким как активированные и истощенные CD8+ Т-клетки опухолевого микроокружения, способствуя селективной передаче сигналов. В РВМС здорового человека CD8+ Т-клетки и NK-клетки обычно PD-1-отрицательны, в то время как Treg конститутивно экспрессируют PD-1 на невысоких уровнях. Вследствие этого, было обнаружено, что слитые белки IL-2 с антителом к huPD-1 Р-0803 и Р-0804 стимулировали pSTAT5 в PD-1-положительных Т-клетках более чем в 15 раз активнее, чем их эквиваленты, не нацеленные на PD-1, Р-0782 и Р-0783, соответственно (ФИГ. 23А и 23В); в то же время, в случае PD-1-отрицательных клеток различия активности были минимальны или незначительны (ФИГ. 23C-23F). Слитые белки с антителом к huPD-1 также продемонстрировали тенденцию к повышению активности по сравнению с их аналогами, не нацеленными на PD-1, в неактивированных CD8 и NK-клетках, не контактировавших с антигеном (ФИГ. 23C-23F).

Ожидается, что более высокие уровни экспрессии PD-1 на Т-клетках приведут к повышению вероятности нацеленного действия слитых белков с антителом для достижения селективной передачи сигналов. Поэтому в опухолевом микроокружении слитые белки IL-2 с антителом к PD-1 будут связываться преимущественно с Teff, а не с Treg.

Кроме того, изучали влияние длины линкера, соединяющего тяжелую цепь антитела с модификацией типа выступ (Knob) и вариант IL-2, на профиль экспрессии и активность белка. Р-0840 (SEQ ID NO:168, 169 и 141) и Р-0841 (SEQ ID NO:178, 175 и 141) представляют собой два слитых белка IL-2 Р-0795, которые различаются только длиной линкера. Р-0840 содержит линкер (G₃S)₂ (SEQ ID NO:18), в то время как Р-0841 имеет линкер (G₄S)₃ (SEQ ID NO:15). Как показано на ФИГ. 24А и 24В, Р-0841, очищенный на белке А, полученный транзиторной экспрессией в ExpiCHO, продемонстрировал значительно меньшее содержание низкомолекулярных примесей, чем Р-0840, полученный и очищенный теми же методами (16% против 3%). Сходные различия содержания примесей были отмечены у Р-0803 и Р-0880 (SEQ ID NO:177, 175 и 141) (11% против 2,7%; ФИГ. 24С и 24D) с линкерами (G₃S)₂ и (G₄S)₃, соответственно, и в остальном идентичными последовательностями.

В то время как несколько более длинный линкер у Р-0841 и Р-0880 приводил к повышению чистоты по сравнению с их соответствующими аналогами, содержащими более короткий линкер, влияние на биологическую активность группировки IL-2, на примере активности стимуляции pSTAT5 в цитотоксических лимфоцитах, либо было минимальным, либо представляло собой ее пограничное усиление (ФИГ. 25). С учетом положительного влияния на профиль возможностей разработки слитых белков, более длинный линкер, не оказывающий другого отрицательного влияния, является более предпочтительным, чем короткий линкер.

Были сконструированы несколько слитых белков Р-0795 с вариантами IL-2, слитыми с С-концом гетеродимерной тяжелой цепи, содержащей модификацию типа выступ (Knob), через линкер (G₄S)₃, Р-0880, Р-0882 (SEQ ID NO:176, 175 и 141) и Р-0885 (SEQ ID NO:179, 175 и 141). Как показано на ФИГ. 22С, связывание слитых белков вариантов IL-2 с антителом к huPD-1 и более длинным линкером с PD-1, экспрессированным на поверхности клеток, не было изменено по сравнению с антителом к hPD-1 самим по себе. Их дополнительно анализировали в функциональных анализах ex vivo для изучения активности IL-2 при стимуляции pSTAT5 и индуцировании экспрессии Ki67 в CD8+ Т-клетках и NK-клетках (ФИГ. 26). Все три конструкции содержат мутацию P65R, устраняющую взаимодействие с IL-2Rα, в то время как Р-0882 и Р-0885 содержат дополнительные мутации L19H и L19Q, соответственно, для модулирования общей активности. Р-0849, аналог с IL-2 дикого типа, был включен для сравнения. Сводные данные по функциональной активности ex vivo представлены в Таблице 14. Уровень ослабления активности у Р-0885 и Р-0882, по сравнению с Р-0880, продемонстрировал одну и ту же тенденцию во всех проанализированных клеточных субпопуляциях и соответствовал уровню снижения активности, отмеченному у Р-0759 и Р-0731 в сравнении с Р-0704 (соответствующие Fc-слитые белки; ФИГ. 15А и 15В) и у Р-0786 и Р-0783 в сравнении с Р-0782 (соответствующие слитые белки с антителом к мышиному PD-1; ФИГ. 19). Как и следовало ожидать, у CD8+ Т- и NK-клеток слитый белок IL-2 дикого типа продемонстрировал активность, сопоставимую с Р-0880.

Пример 14

Фармакодинамический эффект слитых белков вариантов IL-2 с суррогатным антителом к мышиному PD-1 у мышей C57BL6

Фармакодинамический эффект слитых белков вариантов IL-2 с антителом к мышиному PD-1 оценивали у мышей C57BL6 после однократной инъекции. Самок мышей C57BL6 в возрасте семи недель получали от Charles River Laboratory и акклиматизировали в собственном исследовательском центре в течение по меньшей мере 7 суток перед исследованием. Наполнитель и каждый слитый белок IL-2 с антителом к мышиному PD-1 вводили мышам внутрибрюшинно однократно в момент времени «0». Забор образцов крови осуществляли в 3, 5, 7 и 10 сутки после инъекции. Каждая группа включала по 5 мыши. Для иммунного фенотипирования использовали цельную кровь, обработанную гепарином, как описано в Примере 10.

Р-0782 содержит группировку IL-2 P65R, устранявшую связывание с IL-2Rα, Р-0838 содержит группировку IL-2 P65Q, снижавшую связывание с IL-2Rα, в то время как Р-0837 содержит IL-2 дикого типа. Р-0781, аналогичный слитый белок с антителом к мышиному PD-1, содержащий эталонный вариант IL-2 (SEQ ID NO:188), полностью утративший связывание с IL-2Rα, был включен для сравнения.

После однократной инъекции, 2 мг/кг, стимуляция Ki67 в CD8 и NK-клетках достигала максимальных уровней у всех проанализированных соединений (ФИГ. 27А-27В). У CD8+ Т-клеток пиковые сигналы экспрессии Ki67 для каждого соединения достигали максимального уровня в 3 сутки. В случае Р-0782, Р-0838 и эталонного Р-0781 сигнал сохранялся до 7 суток и уменьшался в 10 сутки. В сравнении с этим, в случае Р-0837 дикого типа сигнал Ki67 ослабевал быстрее (ФИГ. 27А). При введении всех исследуемых соединений было отмечено сходное индуцирование Ki67 в NK-клетках (ФИГ. 27В).

Рост числа CD8 и NK-клеток неожиданно продемонстрировал значительные различия между исследуемыми соединениями. Р-0782 с мутацией, устраняющей связывание с IL-2Rα, продемонстрировал интенсивный рост числа CD8+ Т- (ФИГ. 27С) и NK-клеток (ФИГ. 27D). Рост численности обеих субпопуляций лимфоцитов начинался в 3 сутки, продолжался, достигая пиковых значений в 7 сутки при увеличении количества CD8+ Т-клеток в 68 раз и NK-клеток в 182 раза. Р-0838, содержащий мутацию со сниженной способностью к связыванию с IL-2Rα, продемонстрировал рост числа CD8 и NK-клеток, сходный со слитым белком дикого типа с антителом или несколько превосходящий его. В случае эталонного Р-0781 рост численности обеих субпопуляций лимфоцитов был промежуточным по сравнению с Р-0780 и Р-0838. В отличие от этого, рост численности обеих субпопуляций лимфоцитов под действием Р-0837 дикого типа достигал пиковых значений в 5 сутки при значительно меньшем максимальном сигнале (рост в 3,9 раза в случае CD8+ Т-клеток и в 6,8 раза в случае NK-клеток; ФИГ. 27С и 27D).

Возможно, мутация, устраняющая связывание с CD25, может уменьшать эффект клиренса, обусловленного связыванием с CD25, и, вследствие этого, повышать доступность для IL-2Rβγ. Повышенная занятость рецепторов приводит к интенсивному росту числа цитотоксических клеток. Мутанты с остаточной CD25-связывающей активностью могут все еще быть подвержены эффекту клиренса, обусловленного связыванием с CD25, что приводит к активности в отношении CD8 и NK-клеток, сходной с диким типом. В заключение, у Р-0782 профиль роста числа клеток резко отличался от Р-0838 и Р-0837. Р-0782 продемонстрировал значительную пролиферацию и рост числа CD8+ Т- и NK-клеток по сравнению с любыми исследованными соединениями, превосходя эталонное соединение Р-0781. Как полные IL-2Rβγ-селетивные агонисты Р-0782 и Р-0781 могут стимулировать сильные ответы CD8+ эффекторных Т- и NK-клеток in vivo благодаря повышенной селективности и снижению клиренса, обусловленного связыванием с CD25. Несмотря на то, что Р-0838 не продемонстрировал сильного роста числа CD8 и NK-клеток по сравнению с диким типом, ожидается, что мутация, введенная для снижения способности к связыванию с IL-2Rα (CD25), обеспечит преимущества меньшего VLS. Кроме того, остаточный иммунорегуляторный ответ Treg может стать иммунным противовесом, повышая системную переносимость и предотвращая чрезмерное смещение иммунного равновесия в сторону цитотоксических эффекторных клеток. Возможна тонкая настройка Treg-ответа без снижения эффективности уничтожения опухолевых клеток, но с сохранением его достаточной силы для поддержания периферической толерантности.

Также анализировали фармакодинамику бифункциональных слитых белков с антителом к PD-1 и вариантами IL-2, содержащими мутации для снижения взаимодействия с IL-2Rβγ, в дополнение к устранению способности к связыванию с IL-2Rα. Как Р-0786, так и Р-0783 являются аналогами Р-0782, где активность IL-2 ослаблена введением разных мутаций L19Q и L19H, модулирующих взаимодействие с IL-2Rβ, соответственно. На ФИГ. 19С и 19D показаны различия активности этих трех соединений при стимуляции экспрессии Ki67 in vitro. Эффект Р-0786 и Р-0783 на пролиферацию и размножение CD8+ и NK-клеток при двух разных уровнях дозы показан на ФИГ. 28 и 29. Как показано на ФИГ. 28А, соединение с меньшей активностью, Р-0786, приводило к пиковому сигналу Ki67 в CD8+ Т-клетках в 5 сутки, а не в 3 сутки, как Р-0837 дикого типа. Максимальное повышение Ki67 в NK-клетках было отмечено при введении Р-0783 и Р-0837 (ФИГ. 28В), что соответствует данным о большей чувствительности NK-клеток к IL-2 по сравнению с CD8+ Т-клетками.

У слитых белков ослабленных вариантов IL-2 с антителом к PD-1 фармакодинамический эффект был намного лучше, чем у слитого белка дикого типа. На ФИГ. 28С и 28D показан значительно более продолжительный и усиленный дозозависимый эффект Р-0786 на рост числа клеток в сравнении с диким типом. Усиление роста числа CD8+ Т- и NK-клеток было отсроченным, но стойким и продолжительным. Ответ в группе введения в дозе 2 мг/кг достигал пиковых значений в 7 сутки без возвращения к исходному уровню в 10 сутки, в то время как ответ в группе введения в дозе 5 мг/кг нарастал быстро и непрерывно, не достигая пиковых значений в 10 сутки после введения. В противоположность этому, рост числа CD8 и NK-клеток в группе слитого белка дикого типа был пограничным, достигая пиковых значений в 5 сутки с возвращением к исходному уровню в 7 сутки (ФИГ. 28С и 28D).

Р-0783, содержащий еще более слабый агонист IL-2, продемонстрировал сходный отсроченный, но стойкий и продолжительный эффект, как Р-0786, применительно к индуцированию экспрессии Ki67 (ФИГ. 29А и 29В) и дозозависимому росту числа CD8+ и NK-клеток (ФИГ. 29С и 29D). Сводные данные по суткам достижения пиковых значений числа клеток и кратности роста числа клеток для каждого соединения представлены в Таблице 15.

Кроме того, как показано на ФИГ. 30, уровень активности и соответствующий рост числа цитотоксических лимфоцитов коррелировали с токсичностью, отражением которой было уменьшение массы тела мышей. Будучи полным IL-2Rβγ-селективным агонистом, Р-0782 приводил к значительному увеличению количества CD8+ Т- и NK-клеток и наибольшему уменьшению массы тела; ослабленные агонисты Р-0786 и Р-0783 продемонстрировали лучшую переносимость in vivo. У Р-0783 переносимость была немного лучше, чем у Р-0786, что соответствует тому факту, что Р-0783 является более слабым агонистом, чем Р-0786.

В заключение, Р-0782 продемонстрировал сильный фармакодинамический эффект пролиферации и роста числа CD8+ Т- и NK-клеток. Р-0786 и Р-0783 продемонстрировали ослабленные, но более стойкие сигналы. Показатели активности этих трех соединений ex vivo и in vivo в целом соответствовали друг другу. Кроме того, соединения с ослабленной активностью Р-0786 и Р-0783 продемонстрировали улучшенную фармакодинамику и переносимость in vivo по сравнению с полным агонистом Р-0782.

Пример 15

Эффективность слитых белков вариантов IL-2 с антителом к PD-1 in vivo в сингенных опухолевых моделях у мышей

Противоопухолевую эффективность слитых белков вариантов IL-2 с антителом к мышиному PD-1 анализировали в модели подкожной мышиной меланомы B16F10. Самок мышей C57BL/6 (7 недель) рандомизировали в группы введения (n равно 10 на группу) по массе тела после 4-7 суток акклиматизации. Клетки B16F10 после 3 пассажа (5×10⁵ клеток на мышь) вводили мышам подкожно (п/к) в правый бок в -1 сутки. Исследуемые соединения вводили мышам внутрибрюшинно (в/б) три раза в 0, 7 и 14 сутки (один раз в 7 суток, Q7D). Всех мышей тщательно наблюдали, измеряя массу тела три раза в неделю. Опухоли измеряли три раза в неделю с использованием стандартных циркулей, размер опухоли рассчитывали по стандартной формуле: длина × ширина (м²) × 0,5 в мм³. Мышей умерщвляли, когда размер опухоли превышал 1500 мм³.

Три слитых белка с антителом, Р-0838, Р-0790 и Р-0787, вводили двукратно в дозе 3 мг/кг один раз в 7 суток. Все три слитых белка содержат мутацию L65Q в IL-2 для уменьшения связывания с IL-2Rα; Р-0790 и Р-0787 содержат дополнительные мутации L19Q и L19H, соответственно, для дополнительного снижения активности в отношении IL-2Rβγ и модулирования общей активности. Как показано на ФИГ. 31А, все соединения продемонстрировали высокую противоопухолевую эффективность в виде монотерапии с ингибированием роста опухоли на 78%, 64% и 57% в случае Р-0787, Р-0790 и Р-0838, соответственно. Уровень эффективности ингибирования опухоли коррелировал с ослаблением активности in vitro от Р-0838 до Р-0790 и до Р-0787.

Сходным с ФИГ. 30 образом, на ФИГ. 31В показано, что полный агонист IL-2, Р-0838, приводил к наиболее ранней и выраженной токсичности, отражением чего является наибольшее уменьшение массы тела, а ослабленные агонисты, Р-0790 и Р-0787, продемонстрировали лучшую переносимость in vivo. У Р-0787 переносимость была несколько лучше, чем у Р-0790, что соответствует тому факту, что Р-0783 является более слабым агонистом, чем Р-0786. В целом, полученные данные указывают на то, что IL-2Rβγ-селективные и ослабленные мутанты демонстрируют хорошую эффективность уничтожения опухолевых клеток и лучшую переносимость.

В случае Р-0787 проводили дополнительное исследование влияния дозы на ингибирование опухоли и переносимость in vivo. Как видно на ФИГ. 32А, Р-0787 продемонстрировал сходный противоопухолевый эффект при повышении дозы с 3 мг/кг до 5 мг/кг. Повышение дозы не приводило к существенному уменьшению массы тела (ФИГ. 32В), указывая на то, что слабый агонист облегчал применение высоких доз и повышал переносимость.

Сильное ингибирование роста опухоли наблюдали также при двукратном введении Р-0782 и Р-0786 в дозе 1,5 мг/кг один раз в 7 суток (ФИГ. 33). Р-0722, суррогатное антитело к мышиному PD-1, не продемонстрировало противоопухолевого эффекта в сингенной модели B16F10, в то время как Р-0782 и Р-0786 продемонстрировали сопоставимое сильное ингибирование роста опухоли, несмотря на то, что Р-0786 является ослабленным аналогом Р-0782.

В завершение, слитый белок варианта IL-2 с антителом, Р-0790, исследовали в модели легочного метастазирования B16F10 у мышей. Кратко, 3×10⁵ клеток мышиной меланомы вводили посредством внутривенной инъекции самкам мышей B57BL6 (в возрасте 10-12 недель). В следующие сутки (1 сутки) начинали введение исследуемого белка, внутрибрюшинно инъекционно, трехкратно, один раз в 7 суток. Группы введения (n равно 5 на группу) включают Р-0790 в дозах 0,3, 1 и 3 мг/кг и соответствующее антитело Р-0722 в дозе 3 мг/кг. В качестве отрицательного контроля был включен носитель (PBS). На 24 сутки всех мышей умерщвляли для забора ткани. Осуществляли подсчет опухолевых узлов в легких и антиметастатический эффект представляли как разное число опухолевых узлов в разных группах введения и в группе контроля, предствляющего собой носитель.

Р-0790 представляет собой слитый белок IL-2 L19Q/P65Q с антителом к PD-1 с существенно уменьшенным связыванием с IL-2Rα и модулированной общей активностью. Сходным образом, Р-0722, суррогатное антитело к мышиному PD-1, не обеспечивало эффективного ингибирования метастазов опухолевых клеток B16F10, в то время как Р-0790 приводил к дозозависимому ингибированию метастатических узлов в легких. На ФИГ. 34А показано среднее количество узлов в легких, а на ФИГ. 34В показаны изображения легких типичных животных из каждой группы. Данные представлены как среднее плюс/минус SEM.

В заключение, различные слитые белки вариантов IL-2 с антителом к мышиному PD-1 продемонстрировали сильные противоопухолевые эффекты в виде монотерапии. Ослабленные агонисты IL-2 продемонстрировали эффективное ингибирование роста опухоли и лучшую переносимость, что позволило применять более высокие дозы для повышения эффективности.

Пример 16

Оценка фармакодинамики/фармакокинетики и безопасности выбранных слитых белков вариантов IL-2 с антителом к PD-1 у яванских макаков

Будет проведена оценка PK/РВ(фармакокинетических/фармакодинамических)-свойств и безопасности выбранных слитых белков вариантов IL-2 с антителом к PD-1 у яванских макаков. Яванских макаков, не получавших ранее лекарственные средства, будут акклиматизировать и тренировать в течение 2-3 недель и рандомизировать по одной обезьяне в каждую группу с последующей исходной неделей до введения. В+1 сутки в одной группе будет проведено внутривенное введение наполнителя (PBS), а в других группах будет проведено внутривенное введение различных исследуемых соединений.

Забор крови осуществляют в -3, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15 сутки. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяют из цельной крови обезьян и используют для иммунофенотипирования Treg, нерегуляторных CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, CD8+центральных Т-клеток памяти, CD8+ эффекторных клеток памяти, CD8+ Т-клеток, не контактировавших с антигенами, и NK-клеток периферической крови посредством FACS для определения фармакодинамики. Также будут осуществлять мониторинг активации и пролиферации клеток посредством измерения CD25 и Ki67. Цельную кровь также используют для клинического анализа крови (СВС), определяя 5 показателей: нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы.

РК-свойства выбранных слитых белков вариантов IL-2 с антителом к PD-1 будут оценивать в образцах плазмы яванских макаков, определяя полноразмерные интактные молекулы с использованием мышиного антитела против человеческого IL-2 (BD Pharmingen) для сорбции на 96-луночные планшеты с целью захвата слитых белков. Для выявления будут использовать мышиное антитело против человеческого IL-2 с биотином (собственное) и затем будут проводить количественное определение концентраций исследуемых соединений в плазме. В дополнение к образцам плазмы, полученным в -3, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 сутки, в 1 сутки получали еще по четыре образца плазмы через 10 минут, 1 час, 4 часа и 8 часов после введения выбранных слитых белков вариантов IL-2 с антителом к PD-1.

Образцы плазмы, полученные в -7, 8 и 15 сутки, будут также использовать для оценки следующих биохимических параметров: аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, гамма-глутамилтрансфераза, альбумин, общий билирубин, креатинин, азот мочевины крови и С-реактивный белок.

Кроме того, в течение всего периода исследования будут проводить еженедельный мониторинг массы тела каждого животного. Мониторинг температуры тела и артериального давления будут проводить в -1 сутки (до введения) и через 6 часов, 24 часа, 96 часов и 168 часов после введения лекарственных средств.

В свете настоящего изобретения, все изделия и способы, раскрытые и заявленные здесь, могут быть изготовлены и осуществлены без ненужных экспериментов. Несмотря на то, что изделия и способы по данному изобретению были описаны посредством предпочтительных воплощений, специалистам в данной области будет ясно, что указанные изделия и способы могут быть изменены без выхода за рамки сущности и объема изобретения. Подразумевается, что все такие измененные варианты и эквиваленты, очевидные специалистам в данной области, существовавшие на момент подачи данной заявки или разработанные позднее, включены в сущность и объем изобретения, определенные приложенной формулой изобретения. Все патенты, заявки на патенты и публикации, упомянутые в настоящем описании, указывают на уровень специалистов в области, к которой относится изобретение. Все патенты, заявки на патенты и публикации полностью включены сюда посредством ссылки для любых задач и в такой же степени, как если бы было конкретно и по отдельности указано, что каждая отдельная публикация полностью включена посредством ссылки для любых задач. Изобретение, наглядно описанное здесь, может быть подходящим образом применено в отсутствие любого(ых) элемента(ов), не раскрытого(ых) здесь конкретно. Таким образом, следует понимать, что, несмотря на то, что настоящее изобретение было конкретно раскрыто посредством предпочтительных воплощений и возможных признаков, специалисты в данной области могут прибегнуть к модификациям и вариантам концепций, раскрытых здесь, и что такие модификации и варианты рассматриваются как входящие в объем данного изобретения, определенный приложенной формулой изобретения.

Перечень последовательностей

Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, приведенные в приложенном перечне последовательностей, показаны с применением стандартных буквенных сокращений нуклеотидных оснований и однобуквенных кодов аминокислот, как определено в части 1.822 раздела 37 Свода федеральных нормативных актов США (37 C.F.R. 1.822).

SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность предшественника человеческого IL-2.

SEQ ID NO: 2 представляет собой встречающуюся в природе аминокислотную последовательность зрелой формы человеческого IL-2.

SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность зрелой формы человеческого IL-2 дикого типа.

SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность зрелой формы человеческого IL-2, содержащую замену S125I для расширения возможностей разработки слитых белков.

SEQIDNO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность внеклеточного домена человеческого IL-2Rα.

SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность Fc человеческого IgG1.

SEQ ID NO: 7 представляет собой последовательность Fc человеческого IgG1 со сниженной/устраненной эффекторной функцией.

SEQ ID NO: 8 представляет собой последовательность Fc человеческого IgG1 со сниженной/устраненной эффекторной функцией и увеличенным периодом полувыведения.

SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность Knob-Fc со сниженной/устраненной эффекторной функцией.

SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность Hole-Fc со сниженной/устраненной эффекторной функцией.

SEQ ID NO: 11-30 представляют собой аминокислотные последовательности различных пептидных линкеров.

SEQ ID NO: 31-66 представляют собой аминокислотные последовательности различных вариантов IL-2 с аминокислотными заменами, введенными в области, взаимодействующей с a-субъединицей рецептора IL-2.

SEQ ID NO: 67-107 представляют собой аминокислотные последовательности Fc-слитых белков различных вариантов IL-2.

SEQ ID NO: 108 представляет собой аминокислотную последовательность Fc-слитого белка эталонного варианта IL-2.

SEQ ID NO: 109 представляет собой аминокислотную последовательность внеклеточного домена человеческого IL-2Rβ.

SEQ ID NO: 110 представляет собой аминокислотную последовательность внеклеточного домена человеческого ус.

SEQ ID NO: 111-120 представляют собой аминокислотные последовательности различных вариантов IL-2.

SEQ ID NO: 121-133 представляют собой аминокислотные последовательности Fc-слитых белков различных вариантов IL-2.

SEQ ID NO: 134 представляет собой аминокислотную последовательность Knob-Fc со сниженной/устраненной эффекторной функцией и увеличенным периодом полувыведения.

SEQ ID NO: 135 представляет собой аминокислотную последовательность Hole-Fc со сниженной/устраненной эффекторной функцией и увеличенным периодом полувыведения.

SEQ ID NO: 136-137 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи гуманизированного антитела против FAP.

SEQ ID NO: 138-139 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-антагониста человеческого PD-1.

SEQ ID NO: 140-141 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-антагониста PD-1.

SEQ ID NO: 142-143 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-антагониста PD-1.

SEQ ID NO: 144-145 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-антагониста PD-1.

SEQ ID NO: 146-147 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-антагониста PD-1.

SEQ ID NO: 148-149 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-антагониста PD-L1.

SEQ ID NO: 150-151 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-антагониста CTLA-4.

SEQ ID NO: 152-153 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-агониста CD40.

SEQ ID NO: 154-155 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-антагониста фибронектина.

SEQ ID NO: 156-157 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-антагониста CD20.

SEQ ID NO: 158-159 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-антагониста Her-2/neu.

SEQ ID NO: 160-161 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела-антагониста EGFR.

SEQ ID NO: 162 представляет собой аминокислотную последовательность доменов СН1-СН2-СН3 человеческого IgG1 со сниженной/устраненной эффекторной функцией Fc.

SEQ ID NO: 163 представляет собой аминокислотную последовательность Knob-цепи доменов СН1-СН2-СН3 человеческого IgG1 со сниженной/устраненной эффекторной функцией Fc.

SEQ ID NO: 164 представляет собой аминокислотную последовательность Hole-цепи доменов СН1-СН2-СН3 человеческого IgG1 со сниженной/устраненной эффекторной функцией Fc.

SEQ ID NO: 165-169 представляют собой аминокислотные последовательности слитых белков различных вариантов IL-2 с антителом.

SEQ ID NO: 170 представляет собой аминокислотную последовательность Sushi-домена человеческого альфа-рецептора IL-2.

SEQ ID NO: 171-174 представляют собой аминокислотные последовательности Fc-слитых белков IL-2 и IL-2RSushi.

SEQ ID NO: 175-181 представляют собой аминокислотные последовательности Knob-цепей слитых белков различных вариантов IL-2 с антителом-антагонистом человеческого PD-1.

SEQ ID NO: 182-184 представляют собой аминокислотные последовательности слитого белка эталонного варианта IL-2 с антителом.

SEQ ID NO: 185-187 представляют собой аминокислотные последовательности суррогатного антитела против мышиного PD-1 с гетеродимерными тяжелыми цепями.

SEQ ID NO: 188 представляет собой аминокислотную последовательность эталонного варианта IL-2.

SEQ ID NO: 189-191 представляют собой аминокислотные последовательности Knob-цепей слитых белков различных вариантов IL-2 с антителом-антагонистом человеческого PD-1.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательность предшественника человеческого IL-2

Встречающаяся в природе последовательность зрелой формы человеческого IL-2

Последовательность зрелой формы человеческого IL-2 дикого типа

Последовательность 8125I-варианта человеческого IL-2

Последовательность внеклеточного домена человеческого IL-2Rα (CD25)

Fc человеческого IgG1

Fc человеческого IgG1 со сниженной/устраненной эффекторной функцией

Fc человеческого IgG1 со сниженной/устраненной эффекторной функцией и увеличенным периодом полувыведения

Knob-Fc человеческого IgG со сниженной/устраненной эффекторной функцией

Hole-Fc человеческого IgG со сниженной/устраненной эффекторной функцией

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность пептидного линкера

Последовательность F42A/S125I-Варианта IL-2

Последовательность R38F/S125I-варианта IL-2

Последовательность R38G/S125I-варианта IL-2

Последовательность R38A/S125I-варианта IL-2

Последовательность T41A/S125I-варианта IL-2

Последовательность Т 41G/S125I-варианта IL-2

Последовательность T41V/S125I-варианта IL-2

Последовательность F44G/S125I-варианта IL-2

Последовательность F44V/S125I-варианта IL-2

Последовательность E62A/S125I-варианта IL-2

Последовательность E62F/S125I-варианта IL-2

Последовательность E62H/S125I-варианта IL-2

Последовательность E62L/S125I-варианта IL-2

Последовательность P65G/S125I-варианта IL-2

Последовательность P65E/S125I-варианта IL-2

Последовательность Р65Н/8125I-варианта IL-2

Последовательность Р65К/8125I-варианта IL-2

Последовательность Р65А/8125I-варианта IL-2

Последовательность P65K/S125I-варианта IL-2

Последовательность Р651Ч/8125I-варианта IL-2

Последовательность P65Q/S125I-варианта IL-2

Последовательность E68A/S125I-варианта IL-2

Последовательность E68F/S125I-варианта IL-2

Последовательность E68H/S125I-варианта IL-2

Последовательность E68L/S125I-варианта IL-2

Последовательность Е68Р/8125I-варианта IL-2

Последовательность Y107G/S125I-варианта IL-2

Последовательность Y107H/S125I-варианта IL-2

Последовательность Y107L/S125I-варианта IL-2

Последовательность Y107V/S125I-варианта IL-2

Последовательность F42A/E62F/S125I-варианта IL-2

Последовательность F42A/E62A/S125I-варианта IL-2

Последовательность F42A/E62H/S125I-варианта IL-2

Последовательность F42A/P65H/S125I-варианта IL-2

Последовательность F42A/P65R/S125I-варианта IL-2

Последовательность F42A/P65A/S125I-варианта IL-2

Р-0250

Р-0531

Р-0613

Р-0614

Р-0615

Р-0602

Р-0603

Р-0604

Р-0605

Р-0606

Р-0607

Р-0624

Р-0625

Р-0626

Р-0627

Р-0608

Р-0633

Р-0634

Р-0635

Р-0628

Р-0629

Р-0630

Р-0631

Р-0632

Р-0609

Р-0610

Р-0611

Р-0612

Р-0551

Knob-цепь Р-0704

Knob-цепь Р-0706

Knob-цепь Р-0707

Knob-цепь Р-0708

Knob-цепь Р-0709

Knob-цепь Р-0702

Knob-цепь Р-0766

Knob-цепь Р-0767

Knob-цепь Р-0703

Knob-цепь Р-0705

Knob-цепь Р-0765

Knob-цепь Р-0689

Эталонная Knob-цепь

Последовательность внеклеточного домена человеческого IL-2Rβ (CD122)

Последовательность внеклеточного домена человеческой общей субъединицы гамма γ_c (CD 132)

Последовательность L19H/Р65К/8125I-варианта IL-2

Последовательность L19Q/P65R/S125I-варианта IL-2

Последовательность L19Y/P65R/S125I-варианта IL-2

Последовательность L19H/P65Q/S125I-варианта IL-2

Последовательность L19H/P65H/S125I-варианта IL-2

Последовательность L19H/P65N/S125I-варианта IL-2

Последовательность L19Q/P65Q/S125I-варианта IL-2

Последовательность L19Q/P65H/S125I-варианта IL-2

Последовательность L19Q/P65N/S125I-варианта IL-2

Последовательность P65R/S125I/Q126E-варианта IL-2

Knob-цепь Р-0731

Knob-цепь Р-0759

Knob-цепь Р-0761

Knob-цепь Р-0811

Knob-цепь Р-0812

Knob-цепь Р-0813

Knob-цепь Р-0814

Knob-цепь Р-0815

Knob-цепь Р-0816

Knob-цепь Р-0732

Р-0758

Р-0760

Р-0762

Knob-Fc с увеличенным периодом полувыведения in vivo

Hole-Fc с увеличенным периодом полувыведения in vivo

Тяжелая цепь гуманизированного антитела против FAP

Легкая цепь каппа гуманизированного антитела против FAP

Тяжелая цепь антитела-антагонист а человеческого PD-1

Lλ антитела-антагонист а человеческого PD-1

НС гуманизированного антитела-антагониста PD-1

Lκ гуманизированного антитела-антагониста PD-1

НС гуманизированного антитела-антагониста PD-1

Lκ гуманизированного антитела-антагониста PD-1

НС гуманизированного антитела-антагониста FD-1

Lκ гуманизированного антитела-антагониста FD-1

НС антитела-антагониста человеческого PD-1

Lκ антитела-антагониста человеческого PD-1

НС гуманизированного антитела-антагониста PD-L1

Lκ гуманизированного антитела-антагониста PD-L1

НС антитела-антагониста человеческого CTLA-4

Lκ антитела-антагониста человеческого CTLA-4

НС антитела-агониста человеческого CD40

Lκ антитела-агониста человеческого CD40

НС гуманизированного антитела против фибронектина

Lκ гуманизированного антитела против фибронектина

НС химерного антитела против CD20

Lκ химерного антитела против CD20

НС гуманизированного антитела против Her2

Lκ гуманизированного антитела против Her2

НС химерного антитела против EGFR

Lκ химерного антитела против EGFR

Домены СН1-СН2-СН3 человеческого IgG1 со сниженной/устраненной эффекторной функцией

Knob-цепь доменов СН1-СН2-СН3 человеческого IgG1 со сниженной/устраненной эффекторной функцией

Hole-цепь доменов СН1-СН2-СН3 человеческого IgG1 со сниженной/устраненной эффекторной функцией

Вариант IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагониста FD-1

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a FD-1

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a FD-1

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a FD-1

Hole-цепь НС гуманизированного IgG1-антит ела-антагонист a PD-1

Последовательность Sushi-домена человеческого IL-2Rα

Р-0327

Р-0422

Hole-цепь Р-0482

Knob-цепь Р-0482

Hole-цепь НС гуманизированного IgG1-антит ела- антагонист a PD-1

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a PD-1

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a FD-1

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a FD-1

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a FD-1

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a FD-1

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a FD-1

Hole-цепь эталонного варианта с НС антитела-антагониста FD-1

Knob-цепь эталонного варианта IL-2 с НС антитела-антагониста FD-1

Эталонный вариант с Lλ антитела-антагониста FD-1

Цепь 1 НС суррогатного антитела-антагониста мышиного FD-1

Цепь 2 НС суррогатного антитела-антагониста мышиного FD-1

LC суррогатного антитела-антагонист а мышиного PD-1

Эталонный вариант IL-2

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a FD-1

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a FD-1

Knob-цепь варианта IL-2 с НС гуманизированного антитела-антагонист a FD-1

--->

SEQUENCE LISTING

<110> Cugene Inc

<120> NOVEL INTERLEUKIN-2 VARIANTS FOR THE TREATMENT OF CANCER

<130> CACCG1.0004WO

<160> 191

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 153

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 4

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность варианта IL-2 S125I человека

<400> 4

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 5

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys

1 5 10 15

Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg

20 25 30

Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly

35 40 45

Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser

50 55 60

Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln

65 70 75 80

Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp

85 90 95

Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn

100 105 110

Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr

115 120 125

Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu

130 135 140

Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln

145 150 155 160

Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu

165 170 175

Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys

180 185 190

Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr

195 200 205

Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln

210 215

<210> 6

<211> 226

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 7

<211> 226

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность Fc человеческого IgG1 со сниженной/устраненной

эффекторной функцией

<400> 7

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 8

<211> 226

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность Fc человеческого IgG1 со сниженной/устраненной

эффекторной функцией

и увеличенным периодом полувыведения

<400> 8

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 9

<211> 226

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-Fc человеческого IgG со сниженной/устраненной эффекторной функцией

<400> 9

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 10

<211> 226

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Hole-Fc человеческого IgG со сниженной/устраненной эффекторной функцией

<400> 10

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 11

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 12

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 13

Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 14

Gly Ser Ser Gly Thr

1 5

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 16

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Ala

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 17

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 18

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 19

Gly Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 20

Gly Gly Ser Ser

1

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 21

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 22

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 22

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 23

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 23

Ser Gly Gly Gly

1

<210> 24

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 24

Gly Ser Gly Ser

1

<210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 25

Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 26

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 27

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 28

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 29

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 30

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 31

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность F42A/S125I-варианта IL-2

<400> 31

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 32

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность R38F/S125I-варианта IL-2

<400> 32

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 33

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность R38G/S125I-варианта IL-2

<400> 33

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Gly Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 34

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность R38A/S125I-варианта IL-2

<400> 34

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 35

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность T41A/S125I-варианта IL-2

<400> 35

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Ala Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 36

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLGFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKP

LEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFIQSIIS

TLT

<400> 36

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Gly Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 37

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность T41V/S125I-варианта IL-2

<400> 37

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Val Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 38

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность F44G/S125I-варианта IL-2

<400> 38

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Gly Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 39

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность F44V/S125I-варианта IL-2

<400> 39

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Val Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 40

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность E62A/S125I-варианта IL-2

<400> 40

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Ala Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 41

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность E62F/S125I-варианта IL-2

<400> 41

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Phe Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 42

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность E62H/S125I-варианта IL-2

<400> 42

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu His Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 43

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность E62L/S125I-варианта IL-2

<400> 43

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Leu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 44

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность P65G/S125I-варианта IL-2

<400> 44

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 45

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность P65E/S125I-варианта IL-2

<400> 45

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Glu Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 46

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность P65H/S125I-варианта IL-2

<400> 46

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

His Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 47

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность P65R/S125I-варианта IL-2

<400> 47

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Arg Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 48

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность P65A/S125I-варианта IL-2

<400> 48

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Ala Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 49

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность P65K/S125I-варианта IL-2

<400> 49

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Lys Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 50

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность P65N/S125I-варианта IL-2

<400> 50

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Asn Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 51

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность P65Q/S125I-варианта IL-2

<400> 51

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Gln Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 52

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность E68A/S125I-варианта IL-2

<400> 52

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Ala Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 53

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность E68F/S125I-варианта IL-2

<400> 53

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Phe Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 54

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность E68H/S125I-варианта IL-2

<400> 54

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu His Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 55

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность E68L/S125I-варианта IL-2

<400> 55

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Leu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 56

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность E68P/S125I-варианта IL-2

<400> 56

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Pro Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 57

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность Y107G/S125I-варианта IL-2

<400> 57

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Val Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Gly Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 58

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность Y107H/S125I-варианта IL-2

<400> 58

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Val Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu His Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 59

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность Y107L/S125I-варианта IL-2

<400> 59

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Val Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Leu Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 60

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность Y107V/S125I-варианта IL-2

<400> 60

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Val Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Val Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 61

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность F42A/E62F/S125I-варианта IL-2

<400> 61

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Phe Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 62

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность F42A/E62A/S125I-варианта IL-2

<400> 62

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Ala Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 63

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность F42A/E62H/S125I-варианта IL-2

<400> 63

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu His Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 64

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность F42A/P65H/S125I-варианта IL-2

<400> 64

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

His Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 65

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность F42A/P65R/S125I-варианта IL-2

<400> 65

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Arg Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 66

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность F42A/P65A/S125I-варианта IL-2

<400> 66

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Ala Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 67

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0250

<400> 67

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 68

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0531

<400> 68

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 69

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0613

<400> 69

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 70

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0614

<400> 70

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Phe

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 71

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0615

<400> 71

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Gly

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 72

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0602

<400> 72

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 73

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0603

<400> 73

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Ala Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 74

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0604

<400> 74

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Gly Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 75

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0605

<400> 75

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Val Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 76

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0606

<400> 76

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Gly Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 77

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0607

<400> 77

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Val Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 78

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0624

<400> 78

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Ala Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 79

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0625

<400> 79

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Phe Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 80

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0626

<400> 80

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu His Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 81

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0627

<400> 81

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Leu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 82

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0608

<400> 82

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Gly Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 83

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0633

<400> 83

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Glu Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 84

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0634

<400> 84

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys His Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 85

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0635

<400> 85

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 86

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0628

<400> 86

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Ala Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 87

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0629

<400> 87

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Phe Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 88

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0630

<400> 88

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu His Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 89

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0631

<400> 89

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Leu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 90

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0632

<400> 90

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Pro Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 91

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0609

<400> 91

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Val Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Gly Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 92

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0610

<400> 92

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Val Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu His Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 93

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0611

<400> 93

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Val Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Leu Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 94

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0612

<400> 94

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Val Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Val Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 95

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0551

<400> 95

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 96

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0704

<400> 96

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 97

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0706

<400> 97

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Ala Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 98

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0707

<400> 98

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 99

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0708

<400> 99

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Asn Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 100

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0709

<400> 100

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Gln Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 101

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0702

<400> 101

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Phe Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 102

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0766

<400> 102

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Ala Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 103

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0767

<400> 103

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu His Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 104

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0703

<400> 104

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys His Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 105

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0705

<400> 105

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 106

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0765

<400> 106

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Ala Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 107

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0689

<400> 107

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 108

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Эталонная Knob-цепь

<400> 108

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 109

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 109

Ala Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala

1 5 10 15

Asn Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser

20 25 30

Cys Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys

35 40 45

Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu

50 55 60

Gly Ala Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu

65 70 75 80

Arg Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln

85 90 95

Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu

100 105 110

Gln Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile

115 120 125

Ser Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg

130 135 140

Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu

145 150 155 160

Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr

165 170 175

Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr

180 185 190

Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala

195 200 205

Ala Leu Gly Lys Asp Thr

210

<210> 110

<211> 240

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 110

Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala

1 5 10 15

Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr

20 25 30

Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val Glu Tyr Met

35 40 45

Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr Asn Leu Thr

50 55 60

Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val Gln Lys Cys

65 70 75 80

Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln

85 90 95

Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn

115 120 125

Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser

130 135 140

Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys

145 150 155 160

Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr

165 170 175

Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp

180 185 190

Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu

195 200 205

Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile His Trp

210 215 220

Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala

225 230 235 240

<210> 111

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность L19H/P65R/S125I варианта IL-2

<400> 111

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu His Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Arg Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 112

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность L19Q/P65R/S125I варианта IL-2

<400> 112

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Gln Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Arg Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 113

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность L19Y/P65R/S125I варианта IL-2

<400> 113

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Tyr Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Arg Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 114

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность L19H/P65Q/S125I варианта IL-2

<400> 114

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu His Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Gln Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 115

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность L19H/P65H/S125I варианта IL-2

<400> 115

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu His Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

His Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 116

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность L19H/P65N/S125I варианта IL-2

<400> 116

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu His Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Asn Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 117

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность L19Q/P65Q/S125I варианта IL-2

<400> 117

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Gln Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Gln Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 118

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность L19Q/P65H/S125I варианта IL-2

<400> 118

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Gln Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

His Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 119

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность L19Q/P65N/S125I варианта IL-2

<400> 119

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Gln Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Asn Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 120

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность P65R/S125I/Q126E варианта IL-2

<400> 120

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Arg Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Glu Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 121

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0731

<400> 121

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu His Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 122

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0759

<400> 122

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Gln Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 123

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0761

<400> 123

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Tyr Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 124

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0811

<400> 124

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu His Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Gln Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 125

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0812

<400> 125

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu His Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys His Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 126

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0813

<400> 126

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu His Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Asn Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 127

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0814

<400> 127

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Gln Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Gln Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 128

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0815

<400> 128

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Gln Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys His Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 129

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0816

<400> 129

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Gln Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Asn Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 130

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь P-0732

<400> 130

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Glu Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 131

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0758

<400> 131

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu His Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 132

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0760

<400> 132

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Gln Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 133

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0762

<400> 133

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Tyr Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 134

<211> 226

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-Fc с увеличенным периодом полувыведения in vivo

<400> 134

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 135

<211> 226

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Hole-Fc с увеличенным периодом полувыведения in vivo

<400> 135

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 136

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Тяжелая цепь гуманизированного антитела против FAP

<400> 136

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Asn

20 25 30

Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Phe His Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Gly Gly Thr Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 137

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Легкая цепь каппа гуманизированного антитела против FAP

<400> 137

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Ser Ile Ser Thr Ser

20 25 30

Ala Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 138

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Тяжелая цепь антитела-антагониста человеческого PD-1

<400> 138

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Asp Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 139

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L? антитела-антагониста человеческого PD-1

<400> 139

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Met Val Ile Tyr

35 40 45

Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Lys Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Asn Ser Ile Thr Tyr

85 90 95

Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 140

<211> 446

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC гуманизированного антитела-антагониста PD-1

<400> 140

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Asp Ser Ser Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 141

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L гуманизированного антитела-антагониста PD-1

<400> 141

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Glu Thr Val

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 142

<211> 452

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC гуманизированного антитела-антагониста PD-1

<400> 142

Gln Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Glu Ser Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Lys Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Gly Ile Thr Thr Val Ala Thr Thr Tyr Tyr Trp Tyr Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 143

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L гуманизированного антитела-антагониста PD-1

<400> 143

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 144

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC гуманизированного антитела-антагониста PD-1

<400> 144

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 145

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L гуманизированного антитела-антагониста PD-1

<400> 145

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 146

<211> 440

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC антитела-антагониста человеческого PD-1

<400> 146

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 147

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L антитела-антагониста человеческого PD-1

<400> 147

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 148

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC гуманизированного антитела-антагониста PD-L1

<400> 148

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 149

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L гуманизированного антитела-антагониста PD-L1

<400> 149

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 150

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC антитела-антагониста человеческого CTLA-4

<400> 150

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 151

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L антитела-антагониста человеческого CTLA-4

<400> 151

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 152

<211> 452

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC антитела-агониста человеческого CD40

<400> 152

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr

130 135 140

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

195 200 205

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val

210 215 220

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

225 230 235 240

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 153

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L антитела-агониста человеческого CD40

<400> 153

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 154

<211> 445

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC гуманизированного антитела против фибронектина

<400> 154

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 155

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L гуманизированного антитела против фибронектина

<400> 155

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 156

<211> 451

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC химерного антитела против CD20

<400> 156

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 157

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L химерного антитела против CD20

<400> 157

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 158

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC гуманизированного антитела против Her2

<400> 158

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 159

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L гуманизированного антитела против Her2

<400> 159

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 160

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC химерного антитела против EGFR

<400> 160

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 161

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L химерного антитела против EGFR

<400> 161

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 162

<211> 329

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Домены CH1-CH2-CH3 человеческого IgG1 со сниженной/устраненной

эффекторной функцией

<400> 162

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 163

<211> 329

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь доменов CH1-CH2-CH3 человеческого IgG1 со

сниженной/устраненной эффекторной функцией

<400> 163

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 164

<211> 329

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Hole-цепь доменов CH1-CH2-CH3 человеческого IgG1 со

сниженной/устраненной эффекторной функцией

<400> 164

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 165

<211> 587

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Вариант IL-2 с HC гуманизированного антитела-антагониста PD-1

<400> 165

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Asp Ser Ser Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr

450 455 460

Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu His Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn

465 470 475 480

Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe

485 490 495

Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys

500 505 510

Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln

515 520 525

Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn

530 535 540

Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu

545 550 555 560

Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile

565 570 575

Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585

<210> 166

<211> 587

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь варианта IL-2 с HC гуманизированного антитела-антагониста PD-1

<400> 166

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Asp Ser Ser Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr

450 455 460

Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn

465 470 475 480

Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe

485 490 495

Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys

500 505 510

Leu Glu Glu Glu Leu Lys Arg Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln

515 520 525

Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn

530 535 540

Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu

545 550 555 560

Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile

565 570 575

Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585

<210> 167

<211> 587

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь варианта IL-2 с HC гуманизированного антитела-антагониста PD 1

<400> 167

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Asp Ser Ser Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr

450 455 460

Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn

465 470 475 480

Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe

485 490 495

Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys

500 505 510

Leu Glu Glu Glu Leu Lys Gln Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln

515 520 525

Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn

530 535 540

Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu

545 550 555 560

Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile

565 570 575

Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585

<210> 168

<211> 587

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Knob-цепь варианта IL-2 с HC гуманизированного антитела-антагониста PD-1

<400> 168

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Asp Ser Ser Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr

450 455 460

Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Gln Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn

465 470 475 480

Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe

485 490 495

Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys

500 505 510

Leu Glu Glu Glu Leu Lys Gln Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln

515 520 525

Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn

530 535 540

Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu

545 550 555 560

Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile

565 570 575

Thr Phe Ile Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585

<210> 169

<211> 446

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Hole-цепь HC гуманизированного IgG1-антитела-антагониста PD-1

<400> 169

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Asp Ser Ser Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 170

<211> 165

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Последовательность Sushi домена человеческого IL-2R?

<400> 170

Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys

1 5 10 15

Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg

20 25 30

Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly

35 40 45

Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser

50 55 60

Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln

65 70 75 80

Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp

85 90 95

Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn

100 105 110

Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr

115 120 125

Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu

130 135 140

Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln

145 150 155 160

Leu Ile Cys Thr Gly

165

<210> 171

<211> 554

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0327

<400> 171

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe

245 250 255

Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys

260 265 270

Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr

275 280 285

Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser

290 295 300

Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu

305 310 315 320

Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val

325 330 335

Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu

340 345 350

Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val

355 360 365

Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala

370 375 380

Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro

385 390 395 400

Gln Leu Ile Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

405 410 415

Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln

420 425 430

Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly

435 440 445

Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys

450 455 460

Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu

465 470 475 480

Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser

485 490 495

Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val

500 505 510

Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr

515 520 525

Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr

530 535 540

Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

545 550

<210> 172

<211> 548

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P-0422

<400> 172

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His

145 150 155 160

Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys

165 170 175

Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met

180 185 190

Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln

195 200 205

Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln

210 215 220

Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met

225 230 235 240

Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro

245 250 255

Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly

260 265 270

Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg

275 280 285

Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp

290 295 300

Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

305 310 315 320

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

325 330 335

Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

340 345 350

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

355 360 365

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

370 375 380

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

385 390 395 400

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

405 410 415

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

420 425 430

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

435 440 445

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

450 455 460

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

465 470 475 480

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

485 490 495

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

500 505 510

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

515 520 525

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

530 535 540

Leu Ser Pro Gly

545

<210> 173

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Hole-цепь P-0482

<400> 173

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220