ЛЕЧЕНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ГРАНУЛЕМАТОЗНОЙ БОЛЕЗНИ Российский патент 2025 года по МПК C12N5/789 C07K14/80 C12N15/87 A61K35/28 A61K35/15 A61K38/00 A61P31/10 A61P37/02 

Настоящее изобретение относится к средствам и способам лечения хронической гранулематозной болезни.

Уровень техники

Хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ) включает группу врожденных иммунодефицитов с частотой возникновения от 1/19.230 в Саудовской Аравии (Suliaman et al. (2009) Pediatric Asthma, Allergy & Immunology 22, 21-26) до 1/450.000 в Швеции (Ahlin et al. (1995) Acta Paediatr 84, 1386-1394). Эта болезнь проявляется в раннем возрасте, так как организм пациентов с этой болезнью не способен защищаться от бактериальных и грибковых инфекций. Продолжительность жизни значительным образом сокращается несмотря на пожизненное профилактическое лечение антибиотиками и противогрибковыми препаратами (Kuhns et al. (2010) New Engl J Med 363 (27) 2600-10; van den Berg et al. (2009) PloS one 4(4): e5234). Основной причиной этой болезни является значительное снижение или отсутствие способности фагоцитов (гранулоцитов, моноцитов и макрофагов) продуцировать активные формы кислорода (АФК) для инактивации патогенов из-за дефекта в фагоцитарном ферментном комплексе НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный)-оксидазы. Ферментный комплекс НАДФН-оксидазы состоит из шести субъединиц (gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox, p67phox и Rac2). У около 60% всех пациентов с ХГБ эта болезнь бывает вызвана мутациями в гене, кодирующем субъединицу gp91phox (CYBB) в X-хромосоме, в связи с чем ее называют Х-ХГБ (X-CGD). У еще ~30% пациентов имеются аутосомно-рецессивные изменения гена NCF1 (субъединица p47phox) (форма ХГБ с дефектом p47phox), при этом только 5% случаев бывают вызваны аутосомно-рецессивными мутациями в p67phox и p22phox (Roos et al. (2003) Microbes Infect 5: 1307-15).

Генная терапия - новый метод лечения пациентов, страдающих от моногенных заболеваний. Основной принцип современной передовой генной терапии заключается во введении функциональной версии мутированного гена в геном пораженных клеток. Современные клинические подходы, в основном, основываются на доставке терапевтического гена векторами на основе аденоассоциированных вирусов или ретровирусными (гамма-ретровирусными или лентивирусными) векторами. Введенная функциональная версия мутированного гена (трансгена) обуславливает экспрессию нового генного продукта, который компенсирует отсутствие естественного генного продукта. Со времени первого клинического успеха в 2000 году количество заболеваний, для которых клинический успех достигается благодаря данному подходу генной терапии с добавлением гена, непрерывно растет.

Последние разработки сконструированных нуклеаз (цинк-пальцевых нуклеаз (ZFN), нуклеаз на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALEN), методологии CRISPR/Cas (регулярно расположенные группами короткие палиндромные повторы)) делают возможной сиквенс-специфическую генную модификацию (делецию или репарацию), а также сиквенс-специфическую вставку ДНК. Сиквенс-специфическое разрушение гена в терапевтических целях уже нашло клиническое применение (TALEN: W.Quasim et al. (2015) Blood 126: 2016; ZNF: ClinicalTrials.gov Identifier NCT02500849 и CRISPR/Cas9: Cyranoski D. et al. Nature 539, 479; ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03057912). В настоящее время только цинк-пальцевые нуклеазы проходят клиническую оценку на сиквенс-специфическую вставку для лечения гемофилии B, мукополисахаридоза типа I (МПС I) и мукополисахаридоза типа II (МПС II) (https://www.sangamo.com/product-pipeline).

В настоящее время единственным радикальным лечением ХГБ является аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) от HLA-идентичного донора (HLA - человеческий лейкоцитарный антиген). Почти для 75% пациентов можно найти HLA-идентичного донора неродственного европейского происхождения (Grager et al. (2014) N Engl J Med 371: 339-48). Для оставшихся 25% основанная на генной терапии коррекция аутологичных ГСК представляет собой дополнительное потенциальное радикальное лечение.

В связи с этим генная терапия для ХГБ является рациональным вариантом лечения для пациентов, для которых нет HLA-идентичных доноров ГСК. Как известно для женщин-носителей X-сцепленной формы ХГБ, активность НАДФН-оксидазы свыше 20% может ассоциироваться со здоровым фенотипом (Bjorgvinsdottir et al. (1997) Blood 89, 41-48; Kuhns et al. (2010) N Engl J Med 363, 2600-2610). По этой причине коррекционные уровни генной терапии приблизительно в 20% активности НАДФН-оксидазы считаются достаточными для достижения клинического успеха.

Первое клинически успешное исследование генной терапии фазы I/II для пациентов с X-ХГБ было начато в Университетской детской больнице в Цюрихе (University Children’s Hospital Zurich) и Больнице Франкфуртского университета имени Иоганна Вольфганга Гете (Johann Wolfgang Goethe University Hospital Frankfurt) в 2004 году (NCT 00927134; NCT 00564759). В ходе этого исследования было проведено лечение двух детей в Цюрихе и двух взрослых пациентов во Франкфурте. Вектор генной терапии состоял из LTR-регулируемого (несамоинактивирующегося (СИН)) гамма-ретровирусного вектора с gp91phox- кодирующей кДНК в качестве трансгена, что обуславливало убиквитарную экспрессию трансгена. Это исследование было клинически успешным, поскольку все четыре пациента излечились от инфекций, ранее не поддающихся лечению (Ott et al. (2006) Nat Med 12: 401-409; Siler et al. (2015) Curr Gene Ther 15: 416-427; Bianchi et al. (2009) Blood 114: 2619-2622). Тем не менее, в ходе длительного последующего наблюдения были выявлены два серьезных неблагоприятных явления (СНЯ), в результате чего исследование было прекращено в 2010 году:

• Трансактивация: В клонах, в которых вирусный вектор интегрировался рядом с геном MDS1-EVI1, энхансерные последовательности, присутствующие в длинном концевом повторе гамма-ретровирусного вектора, взаимодействовали с промотором прото-онкогена MDS1-EVI1 (трансактивация Evi1), что приводило к селективному преимуществу этих клонов ГСК. Это приводило к доминированию клонов и геномной нестабильности с моносомией 7 и развитию миелодиспластического синдрома (МДС) у трех из четырех пациентов, получивших генную терапию.

• Сайленсинг: Промотор вирусного вектора становился прогрессивно метилированным, что приводило к сниженной экспрессии терапевтического трансгена (сайленсингу трансгена) и к повторному появлению ХГБ.

Эти СНЯ обусловили разработку более безопасных генотерапевтических векторов, основанных на лентивирусных самоинактивирующихся (СИН) векторах с

(I) другим интеграционным профилем, например, использование другого вирусного вектора для предотвращения интеграции вирусного вектора вблизи от гена MDS1-EVI1,

(II) тканеспецифичной экспрессией трансгена, т.е. только в клетках миелоидного происхождения, для которых нужна экспрессия трансгена, но не в ГСК для предотвращения потенциального селективного преимущества клонов ГСК в случае трансактивации, и

(III) предупреждением сайленсинга экспрессии трансгена с течением времени с целью обеспечения долгосрочной эффективности.

Термины и определения

Термин «лентивирусный вектор» при использовании в контексте настоящего описания изобретения относится к геному вириона или вируса, полученного от лентивируса и адаптированного для генной терапии человека. Он содержит трансген, включающий кодирующую последовательность и промотор, функционирующий в клетке пациента-человека. Лентивирусная генная терапия хорошо известна специалисту в данной области; к последним научным публикациям по данной теме относятся Milone and O’Doherty, (2018) Leukemia 32, 1529-1541; Yáñez-Muñoz et al. (2006) Nature Medicine 12, 348-353; Aiuti et al. (2013), Science 341(6148), DOI: 10.1126/science.1233151).

Термин “функциональный вариант” при использовании в контексте настоящего описания изобретения относится к варианту гена, кодирующего полипептид, при этом дисфункциональный или нефункциональный вариант этого гена присутствует у пациента, но этот дисфункциональный или нефункциональный вариант не выполняет конкретную биологическую функцию в организме пациента. В стимулированных фагоцитах здоровых людей белок gp91phox (кодируемый геном CYBB), белок p22phox (кодируемый геном CYBA), белок p47phox (кодируемый геном NCF1), белок p40phox (кодируемый геном NCF4), белок p67phox (кодируемый геном NCF2) вместе образуют один ферментный комплекс, называемый НАДФН-оксидазой. Эта НАДФН-оксидаза имеет каталитическую активность и обязательна для фагоцитарного продуцирования активных форм кислорода (АФК). Белок Rac2 (кодируемый геном RAC2) необходим для индуцирования формирования ферментного комплекса НАДФН-оксидазы при клеточной стимуляции. Мутации в любом из этих генов могут привести к синтезу неправильно уложенных белков или отсутствию одного генного продукта, что в конечном итоге приводит к неспособности клеток пациента образовывать активный комплекс НАДФН-оксидазы и, следовательно, отсутствию у них способности продуцировать АФК, что создает фенотип ХГБ. Функциональный вариант, закодированный вектором генной терапии, способен дополнять или заменять дисфункциональный или нефункциональный вариант и восстанавливать функцию НАДФН-оксидазы.

Краткое описание изобретения

Принимая во внимание предшествующий уровень техники, целью настоящего изобретения является разработка эффективных средств лечения генетического заболевания при хронической гранулематозной болезни.

Эта цель достигается посредством объекта независимых пунктов формулы изобретения, а дополнительные полезные признаки изложены в зависимых пунктах формулы.

Первый аспект изобретения относится к выделенной человеческой гемопоэтической стволовой клетке (ГСК) или клетке-предшественнику, в частности, CD-34 положительной гемопоэтической стволовой клетке, при этом эта стволовая клетка или клетка-предшественник способна дифференцироваться в миелоидную клетку, трансдуцированную лентивирусным вектором. Этот лентивирусный вектор содержит

- нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант дисфункционального полипептида, выбранного из группы, включающей gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox, p67phox и Rac2; которая находится под транскрипционным контролем промоторной последовательности, представляющей собой

- промоторную последовательность, функционирующую в человеческой клетке, при этом этот промотор содержит или, главным образом, состоит из последовательности промотора miR223 (SEQ ID NO 01).

Последовательность промотора miR223 (SEQ ID NO 01)

ACTTGTACAGCTTCACAGGGCTCCATGCTTAGAAGGACCCCACACTTAGTTTAATGTTCTGCTGTCATCATCTTGATATTCTTAATTTTTAAATAAAGGGCCTATCGTTTTCATTTTTTACTGGGCCTTGCAAATTATGTAGCTGGTTCTGTATGCCAGGAGAGAAGTTGGAAGTAAAATGGTATTCCAGGACCAGGAGGCATTCTGGCAGAGTGAAAGAACATGTGATTTGGAGTCCATGGGGATGGGTTTAAATTTCAGCTTTCCACTAATTTGCTTTGTGATACTGAGTATTTCCTTTTATCCCTCAGAGGCTCTGTTTCTCAATTTTGACTACGGGTTTTTTCATTAGATAATGTCTCAGTTCTGGTATTCCAGGTTTCCCTCAATTATTCTGGGAAAACCTCCTTGACCCACAGGCAGAGCCTAGGGCAGCCAGGTGCTTTCTACTCTCTCTCTCTCTGCAGCTTGGAAAGTTAGTGTCTGTTGAAGGTCAGCTGGGAGTTGGTGGAGGCAGGGCAGTGGCCTGCTACTATTGCTGCAGTAGCAGACCCTTTCACAACAGCATTGTTTTGTCATTTTGCATCCAGATTTCCGTTGGCTAACCTCAGTCTTATCTTCCTCATTTCTGTTTCCTGTTGAAGACACCAAGGGCCCTTCAAAACACAGAAGCTTCTTGCTCACGGCAGAAAGCCCAATTCCATCTGGCCCCTGCAGGTTGGCTCAGCACTGGGGAATCAGAGTCCCCTCCATGACCAAGGCACCACTCCACTGACAG.

В определенных вариантах осуществления эта клетка предназначается для лечения хронической гранулематозной болезни, и указанный вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант или функциональные варианты gp91phox (UniProt номер P04839), p22phox (UniProt номер P13498), p40phox (UniProt номер Q15080), p47phox (UniProt номер P14598), p67phox (UniProt номер P19878) и/или Rac2 (UniProt номер P15153).

В определенных вариантах осуществления вектор не содержит лентивирусные промоторный/энхансерный элементы.

Термин «энхансерный элемент» в контексте настоящего описания изобретения относится к короткой нуклеотидной последовательности, которая может быть связана с активирующими белками для повышения вероятности того, что произойдет транскрипция определенной последовательности, особенно промоторной последовательности.

Этот вектор может быть основан на альфа-ретровирусном векторе, гаммаретровирусном векторе, лентивирусном векторе или векторе на основе аденоассоциированного вируса или может происходить от них. В определенных вариантах осуществления вектора генной терапии по настоящему изобретению этот вектор основывается на лентивирусном векторе или происходит от него.

В одном варианте осуществления вектора генной терапии по настоящему изобретению этот вектор содержит или, главным образом, состоит из нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID 02.

SEQ ID No 02:

Lenti_mir223_p47phox_PRE4_KAN(UZH1p47CGD) 8688bp (элементы последовательности в направлении от 5’ к 3’ показаны при помощи шрифта):

Нижний регистр: CMV-промотор; нижний регистр, с подчеркиванием: лентивирусный длинный концевой повтор (ДКП): 5`U5; нижний регистр, курсив: лентивирусная лидерная последовательность; верхний регистр: miR223-промотор; верхний регистр, с подчеркиванием: последовательность Козак; верхний регистр, курсив: открытая рамка считывания p47phox; нижний регистр, курсив, с подчеркиванием: сайты рестрикции; нижний регистр: WPRE-элемент; нижний регистр, курсив, с подчеркиванием: сайты рестрикции; нижний регистр, с подчеркиванием: лентивирусный ДКП: 3'U3; нижний регистр, курсив: лентивирусный ДКП: 3`R; нижний регистр, курсив, жирный шрифт: лентивирусный ДКП: 3`U5; нижний регистр:

ccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagaagcttgatataatagtcgacACTTGTACAGCTTCACAGGGCTCCATGCTTAGAAGGACCCCACACTTAGTTTAATGTTCTGCTGTCATCATCTTGATATTCTTAATTTTTAAATAAAGGGCCTATCGTTTTCATTTTTTACTGGGCCTTGCAAATTATGTAGCTGGTTCTGTATGCCAGGAGAGAAGTTGGAAGTAAAATGGTATTCCAGGACCAGGAGGCATTCTGGCAGAGTGAAAGAACATGTGATTTGGAGTCCATGGGGATGGGTTTAAATTTCAGCTTTCCACTAATTTGCTTTGTGATACTGAGTATTTCCTTTTATCCCTCAGAGGCTCTGTTTCTCAATTTTGACTACGGGTTTTTTCATTAGATAATGTCTCAGTTCTGGTATTCCAGGTTTCCCTCAATTATTCTGGGAAAACCTCCTTGACCCACAGGCAGAGCCTAGGGCAGCCAGGTGCTTTCTACTCTCTCTCTCTCTGCAGCTTGGAAAGTTAGTGTCTGTTGAAGGTCAGCTGGGAGTTGGTGGAGGCAGGGCAGTGGCCTGCTACTATTGCTGCAGTAGCAGACCCTTTCACAACAGCATTGTTTTGTCATTTTGCATCCAGATTTCCGTTGGCTAACCTCAGTCTTATCTTCCTCATTTCTGTTTCCTGTTGAAGACACCAAGGGCCCTTCAAAACACAGAAGCTTCTTGCTCACGGCAGAAAGCCCAATTCCATCTGGCCCCTGCAGGTTGGCTCAGCACTGGGGAATCAGAGTCCCCTCCATGACCAAGGCACCACTCCACTGACAGGGATCCAAGCTTGCCACCATGGGCGACACCTTCATCCGGCACATCGCCCTGCTGGGCTTCGAGAAGCGGTTCGTGCCCAGCCAGCACTACGTGTACATGTTTCTGGTGAAGTGGCAGGACCTGAGCGAGAAGGTGGTGTACCGGCGGTTCACCGAGATCTACGAGTTCCACAAGACCCTGAAAGAGATGTTCCCCATCGAGGCCGGAGCCATCAACCCCGAGAACCGGATCATCCCCCACCTGCCTGCCCCCAAGTGGTTCGACGGCCAGAGAGCCGCCGAGAACAGGCAGGGCACCCTGACCGAGTACTGCAGCACCCTGATGAGCCTGCCCACCAAGATCAGCCGGTGCCCTCACCTGCTGGATTTCTTCAAAGTGCGGCCCGACGACCTGAAGCTGCCCACCGACAACCAGACCAAGAAGCCCGAGACCTACCTGATGCCCAAGGACGGCAAGAGCACCGCCACCGACATCACCGGCCCCATCATCCTGCAGACCTACCGGGCCATCGCCGACTACGAGAAAACCAGCGGCAGCGAGATGGCCCTGAGCACCGGCGACGTGGTGGAGGTGGTGGAAAAGAGCGAGAGCGGGTGGTGGTTCTGCCAGATGAAGGCCAAGCGGGGCTGGATTCCCGCCAGCTTCCTGGAACCCCTGGACAGCCCCGACGAGACCGAGGACCCCGAGCCCAACTACGCCGGCGAGCCCTACGTGGCCATCAAGGCCTACACCGCCGTGGAGGGCGACGAGGTGTCCCTGCTGGAAGGCGAGGCCGTGGAGGTGATCCACAAGCTGCTGGACGGATGGTGGGTGATCCGGAAGGACGACGTGACCGGCTACTTCCCCAGCATGTACCTGCAGAAGAGCGGCCAGGACGTCAGCCAGGCCCAGCGGCAGATCAAGAGAGGCGCCCCTCCCAGGCGGAGCAGCATCCGGAACGCCCACAGCATCCACCAGAGAAGCCGGAAGAGACTGAGCCAGGACGCCTACCGGCGGAACAGCGTGCGGTTCCTGCAGCAGCGGCGGAGGCAGGCCAGACCCGGCCCTCAGAGCCCCGGCAGCCCCCTGGAAGAGGAACGGCAGACCCAGCGGAGCAAGCCCCAGCCCGCCGTGCCCCCTAGACCCAGCGCCGACCTGATCCTGAACCGGTGCAGCGAGAGCACCAAGCGGAAGCTGGCCAGCGCCGTGTGATGActcgagtattatatcaagcttatcgataccgtcgaatcccccgggctgcaggaattcgagcatcttaccgccatttattcccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattcgagctcggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacctactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagggacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatagcacctagatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatttcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaagggaacaaaagctggagctgcaagcttgg

Стволовую клетку или клетку-предшественника получают от пациента с ХГБ и трансдуцируют вектором генной терапии по настоящему изобретению.

В определенных вариантах осуществления такой выделенной человеческой миелоидной стволовой клеткой или клеткой-предшественником по настоящему изобретению является человеческая CD-34+ клетка. При том, что длительно репопулирующие гемопоэтические стволовые клетки содержатся в большом количестве в популяции CD34+ клеток костного мозга человека, клетками с возможностями длительного приживления нормальных взрослых особей мышей являются Lin-, c-kit+, Sca-1+ и CD34- (Sato T., Laver J.H. & Ogawa M. (1999) Blood 94: 2548-2554). Стволовые клетки человека и мыши отличаются не только экспрессией поверхностного маркера, но также условиями роста (среда, цитокины…) для экспансии клеток и для вирусной трансдукции.

Другой аспект изобретения относится к способу получения человеческой клетки-предшественника, способной дифференцироваться в моноцитарную или макрофагальную клетку. Этот способ включает следующие этапы:

- получение ex-vivo CD34+ ГСК, взятых у пациента с ХГБ, и

- трансдукция указанных CD34+ ГСК лентивирусным вектором, содержащим

• кодирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант полипептида, выбранного из gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox, p67phox и Rac2; при этом данная кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промоторной последовательности, представляющей собой

• промоторную последовательность, функционирующую в человеческой клетке, в частности, в миелоидной клетке, при этом указанная промоторная последовательность содержит или, главным образом, состоит из последовательности промотора miR223 (SEQ ID NO 01).

Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента с диагностированной хронической гранулематозной болезнью. Этот способ включает следующие этапы:

- получение CD34+ ГСК, взятых у пациента,

- трансдукция этих CD34+ ГСК лентивирусным вектором, содержащим

• кодирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант полипептида, выбранного из gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox, p67phox и Rac2; при этом данная кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промоторной последовательности, представляющей собой

• промоторную последовательность, функционирующую в человеческой клетке, в частности, в миелоидной клетке, при этом указанная промоторная последовательность содержит или, главным образом, состоит из последовательности промотора miR223 (SEQ ID NO 01);

- введение указанных CD34+ ГСК пациенту.

Нативная нуклеотидная последовательность пациента, кодирующая дисфункциональный полипептид, который вызывает ХГБ, дополняется “здоровой” нуклеотидной последовательностью, кодирующей функциональный полипептид, посредством трансдукции CD34+ клетки вектором по настоящему изобретению. Трансдуцированную (и дополненную) таким образом ГСК или клетку-предшественник затем вводят обратно пациенту.

Вектор по настоящему изобретению может использоваться для трансдукции аутологичных CD34+ ГСК или гемопоэтических клеток-предшественников, способных дифференцироваться в миелоидные клетки, такие как, например, моноциты, макрофаги или нейтрофилы. CD34+ клетки получают от пациента с генетическим заболеванием. Трансдуцированные ГСК переносят обратно пациенту для деления и дифференциации в миелоидные клетки.

Генетическим заболеванием, лечение которого проводится по настоящему изобретению, является хроническая гранулематозная болезнь, и вектор или ГСК или гемопоэтическая клетка-предшественник, способная дифференцироваться в миелоидную клетку, в частности, моноцит/макрофаг или нейтрофил, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант или функциональные варианты гена, выбранного из группы, включающей gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox, p67phox и Rac2. Эта ГСК или гемопоэтическая клетка-предшественник содержит вектор или трансдуцируется им.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения, представлен способ коррекции фенотипа ХГБ в миелоидных клетках. Этот способ включает получение ГСК или гемопоэтической клетки-предшественника по настоящему изобретению и введение этой ГСК или гемопоэтической клетки-предшественника по настоящему изобретению пациенту с таким заболеванием.

В определенных вариантах осуществления эту ГСК или гемопоэтическую клетку-предшественника по настоящему изобретению получают посредством забора ГСК или гемопоэтической клетки-предшественника у пациента с ХГБ и трансдукции этой ГСК и гемопоэтической клетки-предшественника указанным здесь вектором.

Таким генетическим заболеванием в миелоидных клетках является ХГБ, и такая ГСК или гемопоэтическая клетка-предшественник, взятая у пациента, содержит вектор или трансдуцируется вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный варианта или функциональные варианты gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox, p67phox и/или Rac2.

Трансдуцированную ГСК или гемопоэтичесую клетку-предшественника затем переносят обратно пациенту.

Объекты изобретения

1. Выделенная человеческая гемопоэтическая стволовая клетка или миелоидная клетка-предшественник, трансдуцированная лентивирусным вектором, при этом указанный лентивирусный вектор содержит

- кодирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант полипептида, выбранного из gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox, p67phox и Rac2; которая находится под транскрипционным контролем промоторной последовательности, представляющую собой

- промоторную последовательность, функционирующую в человеческой клетке, в частности, в миелоидной клетке, при этом указанная промоторная последовательность содержит или, главным образом, состоит из последовательности промотора miR223 (SEQ ID NO 01).

2. Выделенная человеческая гемопоэтическая стволовая клетка или миелоидная клетка-предшественник по пункту 1, при этом указанный лентивирусный вектор содержит или, главным образом, состоит из нуклеотидной последовательности, характеризующейся SEQ ID NO 02.

3. Человеческая гемопоэтическая стволовая клетка или миелоидная клетка-предшественник по любому из пунктов 1 или 2, при этом данная клетка является CD34+ гемопоэтической стволовой клеткой.

4. Способ приготовления терапевтического клеточного препарата, включающий следующие этапы:

a. приготовление препарата из клеток, содержащего гемопоэтические стволовые клетки, в частности, препарата из CD34+ гемопоэтических стволовых клеток, взятых у пациента с хронической гранулематозной болезнью, ассоциированной с дефектом гена, кодирующего полипептид, выбранный из gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox, p67phox и Rac2;

b. трансдукция указанного препарата клеток лентивирусным вектором, содержащим

- одирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант полипептида, выбранного из gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox, p67phox и Rac2; которая находится под транскрипционным контролем описанной далее промоторной последовательности;

- промоторную последовательность, функционирующую в человеческой клетке, в частности, в миелоидной клетке, при этом указанная промоторная последовательность содержит или, главным образом, состоит из последовательности промотора miR223 (SEQ ID NO 01).

5. Выделенная человеческая гемопоэтическая стволовая клетка или миелоидная клетка-предшественник по любому из пунктов с 1 по 3 или клеточный препарат, полученный при применении способа по пункту 4, для использования в лечении или профилактике хронической гранулематозной болезни.

6. Выделенная человеческая гемопоэтическая стволовая клетка или миелоидная клетка-предшественник для использования в лечении или профилактике хронической гранулематозной болезни по пункту 5, при этом данная клетка является аутологичной клеткой.

Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами и иллюстрациями, из которых можно вывести другие варианты осуществления и преимущества. Эти примеры предназначены для иллюстрирования настоящего изобретения, но не для ограничения его объема.

Описание иллюстраций

Фиг. 1 и 2 демонстрируют определенные варианты осуществления вектора для применения в настоящем изобретении.

Фиг. 3 показывает, что регулируемая miR223 экспрессия p47phox при гаммаретровирусной генной терапии восстанавливает продуцирование АФК и гибель E. coli в человеческих гранулоцитах;

Фиг. 4 показывает восстановление продуцирования АФК в человеческих макрофагах пациента с ХГБ с дефектом p47phox после трансдукции полученных у пациента моноцитов при лентивирусной трансдукции моноцитов;

Фиг. 5 метилирование ДНК чувствительного к сайленсингу SFFV энхансера/промотора (CpG-островка), а также части трансгена p47phox в человеческих CD34+ клетках через четыре недели в клеточной культуре. Клетки CD34+ трансдуцировали гамма-ретровирусным вектором и выращивали на протяжении четырех недель. ДНК выделили, обработали бисульфитом натрия, амплифицировали в ПЦР-реакции и впоследствии секвенировали. Каждая горизонтальная линия представляет результат секвенирования, при котором информационное содержание привели к CpG динуклеотидам: незакрашенные круги = неметилированные CpG; черные круги = метилированные CpG.

Фиг. 6 регулируемая miR223 экспрессия ЗФБ в CD11b+ клетках при трансдукции человеческих ГСК здорового донора лентивирусным вектором, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ) под контролем miR223-промотора или SFFV-промотора, с последующей миелоидной дифференциацией в CD11b+ клетки в жидкой клеточной культуре.

Примеры

Настоящее изобретение, в частности, основано на том удивительном открытии, что использование промотора miR223 в векторах генной терапии позволяет успешно преодолеть известные проблемы трансактивации и/или эпигенетической инактивации. Это, в частности, было продемонстрировано вектором генной терапии LV-SIN для аутосомно-рецессивной ХГБ с дефектом p47phox. Следует отметить, что лентивирусная трансдукция человеческих ГСК лентивирусным вектором, кодирующим p47phox под контролем промотора miR223, для лечения ХГБ, связанной с дефектом p47phox, ранее никогда не демонстрировалась.

Векторы, использованные в доклинических исследованиях для характеристики экспрессии трансгена

Данные, подтверждающие высоко миелоспецифичную экспрессию трансгена, были получены при использовании гамма-ретровирусных векторов и лентивирусных векторов. Примеры использованных гамма-ретровирусных векторов показаны на Фиг. 1. Слитая конструкция ΔLNGFR-2A-p47phox дает два отдельных белка (цитоплазматический p47phox и ΔLNGFR на клеточной поверхности), оба из которых получены от одной мРНК (v). Примеры использованных лентивирусных векторов показаны на Фиг. 2.

Предотвращение трансактивации в ГСК посредством ограничения экспрессии миелодными клетками

Миелоспецифичность активности промотора miR223, показанная в исследованиях на животных

Клетки костного мозга негативной линии дифференцировки выделяли у p47phox -/- мышей и трансдуцировали гамма-ретровирусными векторами, кодирующими p47phox или слитую конструкцию ΔLNGFR-2A-p47, под контролем промотора miR223 (Фиг. 1). p47 -/- мышей-реципиентов облучали в летальной дозе и вводили им внутривенно трансдуцированные клетки костного мозга. Через шесть недель после реинфузии экспрессия p47phox и продуцирование АФК восстанавливались в гранулоцитах, что указывало на успешное приживление трансдуцированных клеток костного мозга. (Brendel et al. (2013) Hum Gene Ther Methods. 24: 151-159).

Параллельно, клетки костного мозга негативной линии дифференцировки выделяли у gp91phox-/- мышей и трансдуцировали вектором LV-SIN, кодирующим gp91phox, под контролем промотора miR223. gp91phox -/- мышей-реципиентов облучали в летальной дозе и вводили им внутривенно трансдуцированные клетки костного мозга. Трансдуцированные клетки приживались, что обуславливало экспрессию трансгена и восстановление продуцирования АФК в периферических гранулоцитах этих мышей (Brendel et al. (2013) ibid.).

Анализ экспрессии трансгена показал необычную линиеспецифичность, обусловленную промотором miR223, в обоих экспериментах на животных, ограничивающую экспрессию трансгена почти исключительно миелоидными клетками (Brendel et al. (2013) ibid.).

Восстановление функции фагоцитов посредством регулируемой miR223 экспрессии трансгена в первичном материале, полученном от пациента

В упомянутых выше экспериментах с участием животных и регулируемая miR223 экспрессия gp91phox (лентивирусный вектор), и регулируемая miR223 экспрессия p47phox (гамма-ретровирусный вектор) восстанавливали продуцирование АФК в фагоцитах при лечении с применением генной терапии в соответствующих моделях животных.

Восстановление продуцирования АФК и восстановление гибели E.coli исследовали на человеческих гранулоцитах после воздействия на ГСК гамма-ретровирусным вектором и дифференциации клеток в клеточной культуре. Для обнаружения цитоплазматической экспрессии трансгена p47phox в живых гранулоцитах авторы настоящего изобретения создали гамма-ретровирусный вектор, кодирующий слитую конструкцию, состоящую из поверхностного маркера ΔLNGFR, связанного с p47phox через 2A последовательность из вируса ящура. Эта слитая конструкция приводит к синтезу двух белков из одного транскрипта мРНК, в одном трансляционном процессе: цитоплазматического белка p47phox и поверхностного маркера ΔLNGFR. Эта коэкспрессия обеспечивает косвенную детекцию p47phox посредством поверхностного окрашивания ΔLNGFR (Wohlgensinger et al. (2010) Gene Ther. 17: 1193-1199). В используемом гамма-ретровирусном векторе авторы настоящего изобретения экспрессировали эту слитую конструкцию под контролем либо конститутивно активного SFFV промотора, либо miR223 промотора.

Авторы настоящего изобретения трансдуцировали человеческую ГСК пациента с ХГБ, связанной с дефектом p47phox, этими гаммаретровирусными векторами с последующей дифференциацией клеток в гранулоциты в клеточной культуре. Дифференциация подтверждалась посредством FACS-измерения гранулоцитарной экспрессии поверхностного маркера CD11b. Детекция поверхностного маркера ΔLNGFR косвенно указывала на экспрессию p47phox.

Продуцирование АФК определяли посредством анализа окисления дигидрородамина 123 (ДГР) при стимуляции клеток PMA или E. coli. Продуцирование АФК в ex vivo дифференцированных гранулоцитах наблюдалось только в ΔLNGFR-позитивных клетках (Фиг. 3).

Дифференцированные (CD11b+) и ΔLNGFR-позитивные гранулоциты, а также дифференцированные и ΔLNGFR-негативные (нетрансдуцированные) клетки выделяли посредством FACS-сортинга и применяли в анализе гибели E. coli в соответствии с описанием (Ott et al. (2006) Nat Med 12: 401-409). В данном анализе успешное уничтожение E. coli приводит к росту в OD420nm. Важный факт, что при использовании гамма-ретровирусного SIN p47phox miR223 вектора, экспрессия трансгена p47phox, продуцирование АФК и уничтожение E. coli восстанавливались до приблизительно тех же значений, как и при применении гамма-ретровирусного SIN p47phox вектора, когда экспрессия трансгена регулируется сильным конститутивно активным SFFV промотором (Фиг. 3).

На Фиг. 3 показано, что регулируемая miR223 экспрессия p47phox восстанавливает продуцирование АФК и уничтожение E. coli в человеческих гранулоцитах. ГСК негативной линии дифференцировки пациента с ХГБ, связанной с дефектом p47phox, трансдуцировали гамма-ретровирусным вектором, конструкцией коэкспресии ΔLNGFR/p47phox под контролем SFFV или miR223 промотора и дифференцировали в CD11b+ гранулоциты. ΔLNGFR/p47phox-экспрессирующие гранулоциты подвергли FACS-сортингу и применили в анализе гибели E. coli. Рост в OD420nm указывает на восстановление уничтожения E. coli.

Также наблюдалось восстановление функции фагоцитов в первичном материале, полученном от пациента с ХГБ, связанной с дефектом p47phox. Вектор lenti_miR223_p47_WPREmut6 (Фиг. 2 и 4) применили для трансдукции моноцитов от пациента с ХГБ, связанной с дефектом p47phox. Трансдуцированные моноциты дифференцировали в макрофаги на протяжении семи дней, в результате чего получили CD14+/CD206+ макрофаги. Экспрессия трансгена p47phox подтверждалась посредством внутриклеточного FACS-окрашивания, в продуцирование АФК при стимуляции PMA подтверждалось посредством анализа восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) (Фиг. 4).

Фиг. 4 иллюстрирует восстановление продуцирования АФК в человеческих макрофагах пациента с ХГБ, связанной с дефектом p47phox. Моноциты пациента с ХГБ, связанной с дефектом p47phox, выделяли из крови, трансдуцировали вектором LV-SIN lenti_miR223_p47_WPREmut6 и дифференцировали в макрофаги. Дифференциацию в CD14+/CD206+ макрофаги и восстановление экспрессии p47phox подтверждали посредством FACS (слева). Восстановление продуцирования АФК при стимуляции PMA подтверждали посредством анализа с применением НСТ. Желтая стрелка: НСТ-позитивный, т.е. продуцирующий АФК, макрофаг, незакрашенная стрелка: NBT-негативный макрофаг.

Предотвращение эпигенетической инактивации экспрессии трансгена

Кинетика эпигенетической инактивации in vivo и в клеточной культуре

В первом временно успешном клиническом исследовании генной терапии X-сцепленной ХГБ, экспрессия трансгена регулировалась гаммаретровирусным промотором/энхансером в вирусном ДКП. Эпигенетическая инактивация экспрессии трансгена начиналась приблизительно через один год после генной терапии, демонстрируя растущее несоответствие между маркировкой гена и функцией гена в течение 1,5 лет впоследствии (Siler et al. (2015) Current Gene Therapy 15: 416-427). Последовательность промотора/энхансера в ДКП используемого гамма-ретровирусного вектора соответствует SFFV промотору/энхансеру, используемому в различных векторах в качестве универсально активный промотор. Этот SFFV промотор проанализировали на его подверженность эпигенетической модификации в животных с ХГБ через три и шесть месяцев после лечения с применением генной терапии. Эпигенетическая инактивация SFFV промотора посредством метилирования ДНК у мышей обнаруживалась уже через три месяца и увеличивалась впоследствии с течением времени (Zhang et al. (2010) Mol Ther 18: 1640-49).

Клетки в состоянии очень примитивной дифференциации, такие как клеточные линии эмбриональной карциномы (He et al. (2005) J Virol 79: 13497-508), эмбриональные стволовые клетки (Liew et al. (2007) Stem Cells 25: 1521-28) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) (Hotta & Ellis (2008) J Cell Biochem 105: 940-8), известны своей высокой активностью метилирования ДНК. Эпигенетическая инактивация SFFV промотора в лентивирусном векторе клетками эмбриональной карциномы P19 определяется уже через шесть-двенадцать дней после трансдукции клеток (Zhang et al. (2010) ibid.).

Новая анти-сайленсинговая активность miR223 промотора

Авторы настоящего изобретения проанализировали подверженность miR223 промотора метилированию ДНК в клетках P19 и в клеточной линии ИПСК p47phox.

В лентивирусном векторе (Фиг. 2), в среднем, 57,1% CpG в miR223 промоторе и более, чем 70% CpG в SFFV промоторе были метилированными в клетках P19 через 20 дней (неопубликованные данные). Поскольку клетки P19 не могут быть дифференцированы в миелоидную линию (в фагоциты) и поскольку miR223 промотор является миелоспецифичным промотором, авторы настоящего изобретения проанализировали лентивирусный вектор, кодирующий p47phox, под контролем miR223 промотора в клетках ИПСК, полученных от пациента с ХГБ, связанной с дефектом p47phox (iPSC CGD1.1; Jiang et al. (2012) Stem Cells 30: 599-611), поскольку эти клетки имеют высокую активность метилирования ДНК и могут быть выращены до фагоцитов.

Клетки iPSC CGD1.1 трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим p47phox, под контролем miR223 промотора (см. Табл. 1 далее) с множественностью заражения 2 (MOI 2, т.е. в два раза больше вирусных частиц, чем клеток).

Начиная со дня +13 после трансдукции, ИПСК сначала были выращены до “эмбриоидных телец” и затем до выпускающих моноциты “фабрик моноцитов”. Сбор первых моноцитов можно было осуществлять, начиная со дня +43 после трансдукции. Собранные моноциты затем дифференцировали в макрофаги посредством инкубирования на протяжении семи дней в среде, дополненной M-CSF (макрофагальным колониестимулирующим фактором).

Среднее число копий вектора генной терапии на геном (ЧКВ) определяли посредством количественной ПЦР на день +16 в ИПСК, а также на день +85 в собранных моноцитах. Экспрессию p47phox определяли в количественном отношении посредством анализа методом поточной цитометрии (FACS) на день +6, +10, +16, +20 в ИПСК, на день +23 в CD133+ стволовых клетках в эмбриоидных тельцах, в CD38dim/CD34+ клетках в эмбриоидных тельцах на день +104, в CD14+ клетках на день +52, в CD15+ клетках на день +48, в CD206+ клетках на день +68. Определяли процентную долю p47phox-позитивных клеток на число копий вектора и среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) p47phox-позитивных клеток согласно FACS для сравнения активности miR223 промотора в отдельных клеточных популяциях.

Анализ экспрессии p47phox на различных этапах дифференциации показал, что, в среднем, на уровне стволовых клеток (ИПСК, CD133+ клетки, CD34+ клетки) (n=6), регулируемая miR223 экспрессия p47phox едва определялась, при этом процентная доля p47-позитивных клеток на число копий вектора составляла 0,67+/-0,33(Stdev). При миелоидной дифференциации экспрессия p47phox сильно увеличивалась, при этом процентная доля p47-позитивных клеток на число копий вектора составляла 5,26+/-0,66. Этот рост в процентной доле p47phox-экспрессирующих клеток происходил параллельно сильному росту интенсивности сигнала FACS (СИФ), указывая на активацию miR223 промотора при дифференциации от уровня стволовых клеток до миелоидных клеток.

Опосредованное генной терапией восстановление продуцирования p47phox в гранулоцитах, моноцитах и макрофагах, созданных из трансдуцированных ИПСК ХГБ, связанной с дефектом p47phox, обусловило восстановление продуцирования АФК согласно результатам анализа окисления дигидрородамина 123 (ДГР) и анализа восстановления нитросинего тетразолия (НСТ).

Параллельно анализу активности miR223 промотора на различных уровнях дифференциации между ИПСК и миелоидными клетками (гранулоцитами, моноцитами, макрофагами), проводился анализ метилирования ДНК miR223 промотора в векторе генной терапии и эндогенного гена miR223 промотора в геноме трансдуцированных клеток в ИПСК на день +20 после трансдукции и в моноцитах, полученных от трансдуцированных ИПСК при дифференциации на день +85 после трансдукции ИПСК. Анализ ИПСК и моноцитов, полученных от ИПСК, при трансдукции вектором, содержащим p47phox, под контролем чувствительного к сайленсингу SFFV промотора служил контролем.

Этот анализ (Табл. 1) показал, что, параллельно клеткам P19 на уровне стволовых клеток, подавляющее большинство (>80%) динуклеотидов CpG miR223 промотора были метилированными, в закодированном вектором генной терапии miR223 промоторе, а также в нативном эндогенном промоторе гена miR223 в геноме трансдуцированных клеток. На функциональном уровне метилированный miR223 промотор был неактивным, что демонстрировалось анализом экспрессии p47phox.

Анализ метилирования ДНК промотора в ИПСК (день +20) и моноцитах, полученных от ИПСК (день +85), после трансдукции ИПСК лентивирусным вектором % метилированных CpG +/-СПС Закодированный вирусом miR223 Эндогенный промотор гена miR223 SFFV промотор В ИПСК 86,8% +/-4,8 80,0 +/-7,5 72,4 +/-9,7 В моноцитах 31,3 +/-4,0 20,8 +/-7,4 70,6 +/-6,3 p-значение (ИПСК против моноцитов) <0,001 <0,001 >0,05

Таблица 1: Анализ метилирования ДНК закодированного вектором генной терапии miR223 промотора и нативного промотора гена miR223 на уровне ИПСК (индуцированная стволовая клетка-предшественник) (день +20) и в моноцитах, полученных от ИПСК, на день +85 после трансдукции ИПСК. Вектор, кодирующий чувствительный к сайленсингу SFFV промотор, служил контролем. Изменение в деметилировании ДНК miR223 промотора было статистически значимым.

Авторы изобретения с удивлением обнаружили, что и первоначально метилированный miR223 промотор в анализируемом векторе генной терапии, и нативный геномный промотор гена miR223 становились деметилированными при миелоидной дифференциации (Табл. 1).

Параллельно росту активности промотора процентная доля метилирования динуклеотида CpG в miR223 промоторе упала с 87% до 31%.

В предыдущем клиническом исследовании авторов настоящего изобретения с применением генной терапии для гамма-ретровирусной X-ХГБ (формы ХГБ, связанной с дефектом gp91phox) экспрессия трансгена регулировалась конститутивно активным (SFFV) промотором. Постепенное увеличение в метилировании промотора, закодированного вектором генной терапии, вызвало в клинических условиях постепенное снижение терапевтической эффективности с течением времени (Ott et al. (2006) Nat Med 12: 401-409; Siler et al. (2015) Curr Gene Ther 15: 416-427). В этом исследовании конститутивно активный промотор стал метилированным в ГСК и привел к высвобождению ГСК из костного мозга с метилированным промотором в векторе генной терапии и, следовательно, с пониженной терапевтической экспрессией трансгена.

При использовании миелоспецифичного miR223 промотора в качестве внутреннего промотора в векторе генной терапии наблюдаемая модель метилирования указывает на то, что промотор является неактивным и метилируется на уровне стволовых клеток. Только при дифференциации miR223 промотор активируется и деметилируется. Это указывает на то, что этот промотор способен обеспечивать длительную эффективность. Поскольку имеет место непрерывный приток миелоидных клеток, получаемых от ГСК, которые высвобождаются из костного мозга, в этих вновь созданных клетках miR223 промотор активно становился деметилированным до высвобождения из костного мозга.

Кинетика метилирования ДНК промотора

В ходе эксперимента с клеточной культурой авторы изобретения ввели SFFV промотор в человеческие CD34+ клетки костного мозга посредством гамма-ретровирусной трансдукции, выращивали клетки в течение четырех недель и впоследствии количественно определили метилирование ДНК. Авторы настоящего изобретения не смогли обнаружить значительные количества метилирования ДНК в человеческих CD34+ клетках через четыре недели в клеточной культуре (Фиг. 5).

Сообщалось, что сайленсинг SFFV промотора in vivo в костном мозге мыши становился обнаруживаемым через три месяца после генной терапии и далее прогрессировал в следующие три месяца (Zhang et al. (2010) ibid.).

Сообщается, что сайленсинг ретровирусных векторов происходит незамедлительно в плюрипотентных стволовых клетках, включая предымплантационные эмбрионы ранней стадии, эмбриональные стволовые (ЭС) клетки и клетки эмбриональной карциномы (ЭК) (Pannell D, Ellis J. (2001) Rev Med Virol 11: 205-217). Клеточную линию эмбриональной карциномы P19 интенсивно используют для анализа подверженности промоторов в векторах генной терапии сайленсингу (Knight et al. (2012) J Virol 86: 9088-95; Brendel et al. (2012) Gene Therapy 19: 1018-29; Zhang, Santilli & Thrasher (2017) Sci Rep. 7: 10213; Zhang et al. (2010) ibid.). Неоднократно сообщалось, что сайленсинг SFFV промотора в этой модели завершается уже через 12-17 дней.

Поскольку клетки P19 не могут быть дифференцированы, эта модель не подходит для анализа тканеспецифичных промоторов. При этом известно, что сайленсинг ретровирусной экспрессии происходит в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК) (Maherali et al. (2007) Cell Stem Cell 1: 55-70; Okita, Ichisaka & Yamanaka (2007) Nature 448: 313-317; Wernig et al. (2007) Nature 448: 318-324), которые способны дифференцироваться в клеточной культуре в клетки любого типа. ИПСК были созданы из материала пациента с ХГБ. Было показано, что эти ИПСК имеют такой же генетический дефект, который был обнаружен в материале пациента. Эти клетки могут дифференцироваться в зрелые моноциты и макрофаги и в отличие от моноцитов и макрофагов от ИПСК людей без ХГБ, моноциты и макрофаги, полученные от ИПСК пациентов с ХГБ, не демонстрируют продуцирование активных форм кислорода (АФК), что имеет место для моноцитов и макрофагов от пациентов с ХГБ (Jiang et al. (2012) Stem Cells 30:599-611).

При ретровирусном введении SFFV промотора в ИПСК пациентов с ХГБ SFFV промотор, который подвергся сайленсингу in vivo в человеческом костном мозге в клиническом исследовании для X-ХГБ через 10 месяцев, в костном мозге мыши через 3-6 месяцев и который подвергся сайленсингу в клетках P19 через 12-17 дней, подвергся сайленсингу в ИПСК пациентов с ХГБ в течение 20 дней (Hänseler et al. (2018) Matters; doi.: 10.19185/matters.201805000005). При дифференциации ИПСК пациентов с ХГБ с SFFV промотором регулируемая SFFV промотором экспрессия трансгена значительно снижалась в терминально-дифференцированных моноцитах и макрофагах. Это показывает, что 1) ИПСК имеют сильную активность в плане сайленсинга промотора, 2) SFFV промотор после сайленсинга остается в таком состоянии при клеточной дифференциации из ИПСК в моноциты (Hänseler et al. (2018) Matters; doi.: 10.19185/matters.201805000005). ИПСК использовали для разработки систем, которые предотвращают сайленсинг универсально активных промоторов, таких как SFFV промотор. Эти антисайленсинговые системы, в основном, основаны на использовании инсуляторов (Sanchez-Hernandez et al. (2018) Mol Ther Nucleic Acids 13: 16-28) или на использовании универсального хроматинраскрывающего элемента (UCOE) (Pfaff et al. (2013) Stem Cells 31: 488-99; Ackermann et al. (2014) Biomaterials 35: 1531-42; Hoffmann et al. (2017) Gene Ther. 24: 298-307).

В заключение можно отметить, что ИПСК являются актуальной моделью для анализа метилирования вектора генной терапии, однако эту модель прежде никогда не применяли для анализа подверженности тканеспецифичных промоторов сайленсингу.

Анализ тканеспецифичного miR223 промотора на его подверженность сайленсингу

Для анализа подверженности сайленсингу miR223 промотора авторы настоящего изобретения использовали ИПСК, которые были получены от пациента с ХГБ, связанной с дефектом p47phox (ИПСК ХГБ p47phox) и которые были способны дифференцироваться в моноциты и макрофаги, демонстрируя фенотип ХГБ (Jiang et al. (2012) Stem Cells 30:599-611).

ИПСК ХГБ p47phox трансдуцировали лентивирусным вектором (день +1) генной терапии авторов настоящего изобретения (UZH1p47CGD) или лентивирусным вектором, кодирующим p47phox, под контролем конститутивно активной и устойчивой к сайленсингу версии SFFV промотора (Lenti UCOE 1662fwd SFFV p47). Трансдуцированные ИПСК сначала дифференцировали в эмбриоидные тельца (ЭТ), далее в моноциты и макрофаги. Среднее число копий вектора на клетку (ЧКВ) определяли посредством количественной ПЦР в ИПСК на день +16 и в моноцитах на день +85 после трансдукции. Экспрессию трансгена контролировали в CD133-позитивных стволовых клетках в эмбриодидных тельцах на день +23, в CD38dim/CD34+ клетках в эмбриоидных тельцах (которые являются клетками, сопоставимыми с ГСК) на день +104, в моноцитах на день +52 и в макрофагах на день +68 после трансдукции. Экспрессию p47phox определяли посредством FACS-анализа при внутриклеточном окрашивании белка p47phox в сочетании с поверхностным окрашиванием CD34, CD38, CD14 и CD206. Для коррекции различий в эффективности трансдукции процентные доли p47phox-позитивных клеток разделяли на ЧКВ.

Экспрессия трансгена p47phox:

В ИПСК и полученном от ИПСК гомологе ГСК, т.е. CD38^dim/CD34^high клетках в эмбриоидных тельцах (далее в настоящем контексте именуемых “ГСК”), miR223 промотор в векторе генной терапии авторов настоящего изобретения UZH1p47CGD обусловил значительно более слабую экспрессию трансгена p47phox, согласно результатам измерений по интенсивности сигнала, и низкую процентную долю p47phox-позитивных клеток на число копий вектора. Напротив, в дифференцированных моноцитах и макрофагах интенсивность сигнала и процентная доля p47phox-позитивных клеток на число копий вектора были высокими в трансдуцированных клетках (см. Табл. 2 далее).

Индукция экспрессии p47phox при дифференциации в полученных от ИПСК в полученных от ИПСК в полученных от ИПСК в полученных от ИПСК CD133+
стволовых клетках ГСК-подобных
CD34+ клетках CD14+
моноцитах CD206+ макрофагах % p47+/ЧКВ SFFV 14,7 3,4 6 4,6 miR223 0,6 0,2 5,5 5,7 СИФ p47+ клеток SFFV 0,96 3,56 1,56 1,8 miR223 0,57 1,93 2,39 3,75 контроль ХГБ 0,48 3,09 1,12 1,22 кратная индукция СИФ отн. контр. SFFV 2 1,15 1,39 1,48 miR223 1,19 0,62 2,13 3,07

Таблица 2: демонстрирует экспрессию трансгена p47phox в ИПСК и полученных от ИПСК популяциях клеток, характеризующуюся процентной долей p47phox-позитивных клеток на число копий вектора (ЧКВ) и средней интенсивностью флуоресцентного сигнала по результатам поточной цитометрии (СИФ). Человеческие p47phox-негативные ИПСК трансдуцировали лентивирусным вектором и выращивали через эмбриоидные тельца в моноциты и макрофаги. Среднее число копий вектора (ЧКВ) определяли в ИПСК и в полученных от ИПСК моноцитах. Экспрессию трансгена контролировали в CD133+ стволовых клетках, в ГСК-подобных CD34+ клетках в эмбриоидных тельцах, в моноцитах и в макрофагах. Экспрессию p47phox определяли посредством FACS-анализа при внутриклеточном окрашивании. Процентные доли p47phox-позитивных клеток нормализовали для эффективности трансдукции посредством вычисления процентной доли p47-позитивных клеток на ЧКВ. Регулируемая miR223 экспрессия p47phox показала маргинальную экспрессию в CD133+ и в CD34+ клетках и рост экспрессии при дифференциации, согласно проценту p47phox-позитивных клеток и СИФ.

Важен тот факт, что регулируемая miR223 промотором экспрессия p47phox обусловила низкий фоновый сигнал (процент позитивных клеток/ЧКВ), а также силу экспрессии (СИФ) в стволовых клетках. Низкий фоновый сигнал в стволовых клетках указывает на отличный профиль безопасности вектора генной терапии UZH1p47CGD.

Человеческие ГСК здорового донора трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим ЗФБ под контролем SFFV или miR223 промотора, с последующей дифференциацией в CD11b-позитивные миелоидные клетки в жидкой клеточной культуре. Экспрессию ЗФБ анализировали в человеческих полученных от ГСК CD11b-позитивных клетках посредством FACS-анализа. Детекция ЗФБ-позитивных человеческих полученных от ГСК миелоидных клеток (Фиг. 6, неопубликованные данных) соответствовала числу копий вектора (ЧКВ) 0,05 и демонстрировала активность экспрессии трансгена miR223 промотора в человеческих полученных от ГСК миелоидных клетках, что требовалось для лечения ХГБ с применением генной терапии.

Восстановление продуцирования АФК:

Продуцирование АФК контролировали в моноцитах и макрофагах посредством анализа окисления ДГР и восстановления НСТ при стимуляции PMA (моноциты) или PMA+fMLP (макрофаги). В анализе ДГР нефлуоресцентный дигидрородамин становится флуоресцентным при окислении АФК. Интенсивности сигнала флуоресценции определяли посредством FACS-анализа. Соответственно, при FACS-анализе сдвиг вправо означает восстановление продуцирования АФК. При анализе НСТ образование темно-синего осадка формазана означает продуцирование АФК. Моноциты/макрофаги от нетрансдуцированных ИПСК пациента с ХГБ служили отрицательными контролями. Положительным контролем служили моноциты/макрофаги, полученные от ИПСК пациента с ХГБ, которые были трансдуцированы вектором, кодирующим p47phox, под контролем универсально активной или устойчивой к сайленсингу версии SFFV промотора (Lenti UCOE1662fwd SFFV p47).

Регулируемая miR223 экспрессия p47phox вектором генной терапии авторов настоящего изобретения UZH1p47CGD обусловила восстановление продуцирования АФК и, следовательно, корректировку фенотипа ХГБ, что было продемонстрировано результатами анализа ДГР и анализа НСТ.

Анализ сайленсинга (метилирования ДНК) в модели ИПСК:

Авторы настоящего изобретения использовали p47-/- ИПСК для анализа метилирования их вектора генной терапии (UZH1p47CGD) и активности экспрессии трансгена при дифференциации ИПСК в фагоциты. p47phox-негативные ИПСК трансдуцировали лентивирусным вектором и выращивали в моноциты. Выделяли ДНК из трансдуцированных ИПСК (день +20) и из полученных от ИПСК моноцитов (день +97). Для анализа метилирования ДНК на выделенную ДНК воздействовали бисульфитом натрия, который преобразует только неметилированный цитозин в урацил. Последующая ПЦР-амплификация преобразует урацил в тимидин. Сравнение первоначальной последовательности с последовательностью после преобразования бисульфитом обнаруживает метилирование ДНК, т.е. во всех метилированных последовательностях цитозин определяется посредством секвенирования, в то время как в неметилированных последовательностях определяется тимидин.

Анализ метилирования ДНК проводили в ИПСК и полученных от ИПСК моноцитах при трансдукции вектором генной терапии (UZH1p47CGD), кодирующим p47phox, под контролем miR223. Анализ метилирования охватывал всю последовательность miR223 промотора, а также часть трансгена p47phox. Кроме того, авторы настоящего изобретения проанализировали метилирование ДНК нативной последовательности промотора гена miR223 генома ИПСК.

Важно, что в ИПСК и закодированный вирусом miR223 промотор, и нативный miR223 промотор были почти полностью метилированы в течение 20 дней. Соответственно, в CD133+ ИПСК и в полученных от ИПСК CD34+CD38- стволовых клетках экспрессия трансгена p47phox была чрезвычайно низкой (см. Табл. 1 выше).

Ни на уровне ИПСК, ни в моноцитах степени метилирования между последовательностью закодированного вектором генной терапии miR223 промотора и нативными промоторами miR223 значительно не отличались. С удивлением, в отличие от результатов, полученных для SFFV промотора (Hänseler et al. (2018) Matters; doi.: 10.19185/matters.201805000005), авторы настоящего изобретения обнаружили, что при дифференциации из ИПСК в терминально дифференцированные клетки метилирование вирусного и нативного miR223 промотора значительным образом снижалось, указывая на активное деметилирование при дифференциации (Табл. 1) и, следовательно, активацию (Табл. 2). При экстраполяции в долгосрочную ситуацию in vivo этот результат указывает на длительную активность miR223 промотора, так как будучи подверженным сайленсингу в покоящейся ГСК, предполагается, что miR223 промотор становится активным при активации и дифференциации ГСК. Как было упомянуто ранее, были разработаны системы на основе UCOE, которые могут предотвращать сайленсинг SFFV или Chim промотора (Zhang, Santilli & Thrasher (2017) Sci Rep 7: 10213). Однако интеграция системы UCOE в ретровирусный вектор генной терапии сопряжена с риском изменения метилирования ДНК вблизи от сайта ретровирусной интеграции, также в ГСК. Эта активность может активировать в ГСК онкогены рядом с сайтом интеграции вектора генной терапии. В отличие от системы UCOE, miR223 промотор в векторе UZH1p47CGD адаптировался к модели метилирования окружения в стволовых клетках и только при дифференциации становился деметилированным, что представляет собой значительное преимущество в плане безопасности.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Цюрихский Университет

<120> Лечение Хронической Гранулематозной Болезни

<130> uz356wo

<160> 2

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 778

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

acttgtacag cttcacaggg ctccatgctt agaaggaccc cacacttagt ttaatgttct

60

gctgtcatca tcttgatatt cttaattttt aaataaaggg cctatcgttt tcatttttta

120

ctgggccttg caaattatgt agctggttct gtatgccagg agagaagttg gaagtaaaat

180

ggtattccag gaccaggagg cattctggca gagtgaaaga acatgtgatt tggagtccat

240

ggggatgggt ttaaatttca gctttccact aatttgcttt gtgatactga gtatttcctt

300

ttatccctca gaggctctgt ttctcaattt tgactacggg ttttttcatt agataatgtc

360

tcagttctgg tattccaggt ttccctcaat tattctggga aaacctcctt gacccacagg

420

cagagcctag ggcagccagg tgctttctac tctctctctc tctgcagctt ggaaagttag

480

tgtctgttga aggtcagctg ggagttggtg gaggcagggc agtggcctgc tactattgct

540

gcagtagcag accctttcac aacagcattg ttttgtcatt ttgcatccag atttccgttg

600

gctaacctca gtcttatctt cctcatttct gtttcctgtt gaagacacca agggcccttc

660

aaaacacaga agcttcttgc tcacggcaga aagcccaatt ccatctggcc cctgcaggtt

720

ggctcagcac tggggaatca gagtcccctc catgaccaag gcaccactcc actgacag

778

<210> 2

<211> 8688

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

ccattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca

60

ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca

120

ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct

180

ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta

240

acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac

300

ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt

360

aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag

420

tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat

480

gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat

540

gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc

600

ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt

660

ttagtgaacc ggggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac

720

tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg

780

cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga

840

aaatctctag cagtggcgcc cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac cagaggagct

900

ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact

960

ggtgagtacg ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag

1020

cgtcagtatt aagcggggga gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt taaggccagg

1080

gggaaagaaa aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt

1140

cgcagttaat cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct

1200

acaaccatcc cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac

1260

cctctattgt gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat

1320

agaggaagag caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac

1380

ctggaggagg agatatgagg gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa

1440

aaattgaacc attaggagta gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa

1500

aaagagcagt gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta

1560

tgggcgcagc gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc

1620

agcagcagaa caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag

1680

tctggggcat caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc

1740

aacagctcct ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt

1800

ggaatgctag ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg

1860

agtgggacag agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc

1920

aaaaccagca agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt

1980

ggaattggtt taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag

2040

gaggcttggt aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc

2100

agggatattc accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc

2160

ccgaaggaat agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga

2220

acggatctcg acggtatcgg ttaactttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg

2280

caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac

2340

aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatc acgagactag cctcgagaag cttgatataa

2400

tagtcgacac ttgtacagct tcacagggct ccatgcttag aaggacccca cacttagttt

2460

aatgttctgc tgtcatcatc ttgatattct taatttttaa ataaagggcc tatcgttttc

2520

attttttact gggccttgca aattatgtag ctggttctgt atgccaggag agaagttgga

2580

agtaaaatgg tattccagga ccaggaggca ttctggcaga gtgaaagaac atgtgatttg

2640

gagtccatgg ggatgggttt aaatttcagc tttccactaa tttgctttgt gatactgagt

2700

atttcctttt atccctcaga ggctctgttt ctcaattttg actacgggtt ttttcattag

2760

ataatgtctc agttctggta ttccaggttt ccctcaatta ttctgggaaa acctccttga

2820

cccacaggca gagcctaggg cagccaggtg ctttctactc tctctctctc tgcagcttgg

2880

aaagttagtg tctgttgaag gtcagctggg agttggtgga ggcagggcag tggcctgcta

2940

ctattgctgc agtagcagac cctttcacaa cagcattgtt ttgtcatttt gcatccagat

3000

ttccgttggc taacctcagt cttatcttcc tcatttctgt ttcctgttga agacaccaag

3060

ggcccttcaa aacacagaag cttcttgctc acggcagaaa gcccaattcc atctggcccc

3120

tgcaggttgg ctcagcactg gggaatcaga gtcccctcca tgaccaaggc accactccac

3180

tgacagggat ccaagcttgc caccatgggc gacaccttca tccggcacat cgccctgctg

3240

ggcttcgaga agcggttcgt gcccagccag cactacgtgt acatgtttct ggtgaagtgg

3300

caggacctga gcgagaaggt ggtgtaccgg cggttcaccg agatctacga gttccacaag

3360

accctgaaag agatgttccc catcgaggcc ggagccatca accccgagaa ccggatcatc

3420

ccccacctgc ctgcccccaa gtggttcgac ggccagagag ccgccgagaa caggcagggc

3480

accctgaccg agtactgcag caccctgatg agcctgccca ccaagatcag ccggtgccct

3540

cacctgctgg atttcttcaa agtgcggccc gacgacctga agctgcccac cgacaaccag

3600

accaagaagc ccgagaccta cctgatgccc aaggacggca agagcaccgc caccgacatc

3660

accggcccca tcatcctgca gacctaccgg gccatcgccg actacgagaa aaccagcggc

3720

agcgagatgg ccctgagcac cggcgacgtg gtggaggtgg tggaaaagag cgagagcggg

3780

tggtggttct gccagatgaa ggccaagcgg ggctggattc ccgccagctt cctggaaccc

3840

ctggacagcc ccgacgagac cgaggacccc gagcccaact acgccggcga gccctacgtg

3900

gccatcaagg cctacaccgc cgtggagggc gacgaggtgt ccctgctgga aggcgaggcc

3960

gtggaggtga tccacaagct gctggacgga tggtgggtga tccggaagga cgacgtgacc

4020

ggctacttcc ccagcatgta cctgcagaag agcggccagg acgtcagcca ggcccagcgg

4080

cagatcaaga gaggcgcccc tcccaggcgg agcagcatcc ggaacgccca cagcatccac

4140

cagagaagcc ggaagagact gagccaggac gcctaccggc ggaacagcgt gcggttcctg

4200

cagcagcggc ggaggcaggc cagacccggc cctcagagcc ccggcagccc cctggaagag

4260

gaacggcaga cccagcggag caagccccag cccgccgtgc cccctagacc cagcgccgac

4320

ctgatcctga accggtgcag cgagagcacc aagcggaagc tggccagcgc cgtgtgatga

4380

ctcgagtatt atatcaagct tatcgatacc gtcgaatccc ccgggctgca ggaattcgag

4440

catcttaccg ccatttattc ccatatttgt tctgtttttc ttgatttggg tatacattta

4500

aatgttaata aaacaaaatg gtggggcaat catttacatt tttagggata tgtaattact

4560

agttcaggtg tattgccaca agacaaacat gttaagaaac tttcccgtta tttacgctct

4620

gttcctgtta atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactga tattcttaac

4680

tatgttgctc cttttacgct gtgtggatat gctgctttaa tgcctctgta tcatgctatt

4740

gcttcccgta cggctttcgt tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat

4800

gaggagttgt ggcccgttgt ccgtcaacgt ggcgtggtgt gctctgtgtt tgctgacgca

4860

acccccactg gctggggcat tgccaccacc tgtcaactcc tttctgggac tttcgctttc

4920

cccctcccga tcgccacggc agaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg

4980

gctaggttgc tgggcactga taattccgtg gtgttgtcgg ggaagggcct gctgccggct

5040

ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc

5100

gcctccccgc ctggaattcg agctcggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg

5160

tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac

5220

gaagacaaga tctgcttttt gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct

5280

gggagctctc tggctaacta gggaacctac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag

5340

tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac

5400

ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtagtagttc atgtcatctt attattcagt

5460

atttataact tgcaaagaaa tgaatatcag agagtgagag gaacttgttt attgcagctt

5520

ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac

5580

tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggctctagc

5640

tatcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc

5700

gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga

5760

gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta gggacgtacc caattcgccc

5820

tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa

5880

aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt

5940

aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa

6000

tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg

6060

accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc

6120

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga

6180

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt

6240

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat

6300

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat

6360

ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa

6420

tttaacgcga attttaacaa aatattaacg cttacaattt aggtggcact tttcggggaa

6480

atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca

6540

tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatagcacct agatcaagag acaggatgag

6600

gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg

6660

agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt

6720

tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc

6780

tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt

6840

gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag

6900

tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg

6960

ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag

7020

cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg

7080

atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcga

7140

gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca

7200

tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc

7260

gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg

7320

ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct

7380

atcgccttct tgacgagttc ttctgaatta ttaacgctta caatttcctg atgcggtatt

7440

ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatcag gtggcacttt tcggggaaat

7500

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg

7560

accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc

7620

aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa

7680

ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag

7740

gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta

7800

ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta

7860

ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag

7920

ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg

7980

gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg

8040

cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag

8100

cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc

8160

cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa

8220

aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg

8280

ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct

8340

gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa

8400

gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg

8460

cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag

8520

ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga

8580

attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagcgc

8640

gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctggagctgc aagcttgg

8688

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: выделенная человеческая гемопоэтическая стволовая клетка и клетка-предшественник, трансдуцированные лентивирусным вектором, который содержит кодирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант полипептида, выбранного из gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox, p67phox и Rac2, под транскрипционным контролем промоторной последовательности, которая состоит из последовательности промотора miR223 - SEQ ID NO 01. Также раскрыты лентивирусный вектор для генной терапии человека и способ приготовления терапевтического клеточного препарата для применения в лечении или профилактике хронической гранулематозной болезни. Изобретение возможно применять для лечения или профилактики хронической гранулематозной болезни у пациента. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Выделенная человеческая гемопоэтическая стволовая клетка для применения в лечении хронической гранулематозной болезни, трансдуцированная лентивирусным вектором, при этом указанный лентивирусный вектор содержит

- кодирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант полипептида, выбранного из gp91phox и p47phox; которая находится под транскрипционным контролем промоторной последовательности, которая представляет собой

- последовательность промотора miR223, как указано в SEQ ID NO 01.

2. Выделенная миелоидная клетка-предшественник для применения в лечении хронической гранулематозной болезни, трансдуцированная лентивирусным вектором, при этом указанный лентивирусный вектор содержит

- кодирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант полипептида, выбранного из gp91phox и p47phox; которая находится под транскрипционным контролем промоторной последовательности, которая представляет собой

- последовательность промотора miR223, как указано в SEQ ID NO 01.

3. Выделенная человеческая гемопоэтическая стволовая клетка или миелоидная клетка-предшественник по п. 1 или 2, при этом указанный лентивирусный вектор содержит или, главным образом, состоит из нуклеотидной последовательности, характеризующейся SEQ ID NO 02.

4. Человеческая гемопоэтическая стволовая клетка или миелоидная клетка-предшественник по любому из пп. 1-3, при этом данная клетка является CD34 позитивной гемопоэтической стволовой клеткой.

5. Лентивирусный вектор для генной терапии человека, включающий:

- кодирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант полипептида, выбранного из gp91phox и p47phox; под транскрипционным контролем описанной далее промоторной последовательности;

- последовательность промотера miR223, как указано в SEQ ID NO 01.

6. Вектор по п. 5, характеризующийся тем, что указанный лентивирусный вектор включает или состоит из нуклеотидной последовательности, определенной в SEQ ID NO 02.

7. Способ приготовления терапевтического клеточного препарата для применения в лечении или профилактике хронической гранулематозной болезни, включающий следующие этапы:

a. приготовление препарата из клеток, содержащего гемопоэтические стволовые клетки, в частности препарата из CD34 позитивных гемопоэтических стволовых клеток, взятых у пациента с хронической гранулематозной болезнью, ассоциированной с дефектом гена, кодирующего полипептид, выбранный из gp91phox и p47phox;

b. трансдукция указанного препарата из клеток лентивирусным вектором, содержащим

i. кодирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант полипептида, выбранного из gp91phox и p47phox; которая находится под транскрипционным контролем описанной далее промоторной последовательности;

ii. последовательность промотора miR223, как указано в SEQ ID NO 01.

8. Выделенная человеческая гемопоэтическая стволовая клетка или миелоидная клетка-предшественник по любому из пп. 1-4 или клеточный препарат, полученный при применении способа по п. 7, для использования в лечении или профилактике хронической гранулематозной болезни.

9. Выделенная человеческая гемопоэтическая стволовая клетка или миелоидная клетка-предшественник для использования в лечении или профилактике хронической гранулематозной болезни по п. 8, при этом данная клетка является аутологичной клеткой.