ЛИГАНДСВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА С РЕГУЛИРУЕМОЙ ЛИГАНДСВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2023 года по МПК C07K14/52 C07K16/24 C07K19/00 C12P21/00 A61K38/19 A61K39/395 A61P35/00 A61P37/00 

Область техники, к которой относится изобретение

В настоящем изобретении предложны лигандсвязывающая молекула, имеющая по меньшей мере один сайт расщепления, где связывание лиганда лигандсвязывающей молекулой, расщепленной в сайте расщепления, ослаблено, способ получения лигандсвязывающей молекулы и фармацевтическая композиция, содержащая лигандсвязывающую молекулу.

Предпосылки создания изобретения

Антитела привлекают внимание в качестве лекарственных средств благодаря их высокой стабильности в плазме и небольшому количеству нежелательных реакций. Среди них многие лекарственные средства на основе антител IgG-типа поступают в продажу, и большое количество лекарственных средств на основе антител находится настоящее время в разработке (непатентные документы 1 и 2).

К настоящему времени в качестве терапевтических лекарственных средств против рака, представляющих собой лекарственные средства на основе антител, разрешены ритуксан против CD20, цетуксимаб против EGFR, герцептин против HER2 и т.п. (непатентный документ 3). Указанные молекулы антител связываются с их антигенами, экспрессируемыми на раковых клетках, и в результате проявляют цитотоксическую активность против раковых клеток посредством ADCC, ингибирования сигнала и т.д.

Известен также метод доставки обладающего физиологической активностью лиганда, такого как цитокин, к солидным опухолям с использованием иммуноцитокина, который содержит лиганд, слитый с молекулой антитела, которая связывается с раковым антигеном, характеризующимся высоким уровнем экспрессии на раковых клетках. Цитокин, доставленный к солидному раку с помощью иммуноцитокина, активирует иммунитет и тем самым проявляет противоопухолевое действие. Поскольку цитокины, включающие IL2, IL12 и TNF, обладают сильной токсичностью, ожидается, что местное действие указанных цитокинов на рак при их местной доставке к раку с помощью антитела усилит их воздействия, но снизит при этом нежелательные реакции (непатентные документы 4, 5 и 6). Однако все указанные цитокины пока еще не разрешены в качестве лекарственных средств из-за связанных с ними проблем, таких, например, как: они не обладают достаточной эффективностью в клинических условиях при системном введении; диапазон их терапевтического воздействия (терапевтическое окно) является узким; и их нельзя вводить системно из-за сильной токсичности.

Это в значительной степени объясняется тем, что цитокины, включая иммуноцитокины, при их системном введении воздействуют на весь организм и поэтому могут обладать токсичностью при системном действии, или цитокины требуется применять в очень низких дозах для того, чтобы избежать токсичности. Известно также, что противоопухолевое действие не изменялось при применении иммуноцитокина, который содержал IL2, слитый с антителом, которое связывается с раковым антигеном, и иммуноцитокина, который содержал IL2, слитый с антителом, которое не связывается с раковым антигеном (непатентный документ 7).

В качестве метода решения указанных выше проблем является применение молекулы, содержащей цитокин и цитокиновый рецептор, которые соединены линкером, расщепляемым протеазой, для которой характерен высокий уровень экспрессии. Цитокин ингибируется цитокиновым рецептором, соединенным с ним через линкер, но цитокин высвобождается из слияния с цитокиновым рецептором путем расщепления протеазой и при этом приобретает активную форму. Например, описана молекула, содержащая TNF-альфа и TNF-R, соединенные через линкер, который расщепляется uPA (непатентный документ 8), и молекула, содержащая IL2 и IL2R, соединенные через линкер, который расщепляется ММР2 (непатентный документ 9). Однако цитокины в этих молекулах являются активными даже до расщепления линкера, а расщепление линкера повышает активность лишь примерно в 10 раз. Кроме того, описана молекула, содержащая IL2, соединенный с анти-IL2 scFv вместо IL2R через линкер, который расщепляется ММР-2 (непатентный документ 9).

Перечень процитированных документов

[Непатентные документы]

[Непатентный документ 1] Monoclonal antibody successes in the clinic. Janice M. Reichert, Clark J. Rosensweig, Laura B. Faden и Matthew C. Dewitz, Nat. Biotechnol. 23, 2005, cc. 1073-1078.

[Непатентный документ 2] The therapeutic antibodies market to 2008. Pavlou A.K., Belsey M.J., Eur. J. Pharm. Biopharm. 59 (3), 2005, cc. 389-396.

[Непатентный документ 3] Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Weiner L.M., Surana R., Wang S., Nat. Rev. Immunol. 10 (5), 2010, cc. 317-327.

[Непатентный документ 4] Cyclophosphamide and tucotuzumab (huKS-IL2) following first-line chemotherapy in responding patients with extensive-disease small-cell lung cancer. Gladkov O., Ramlau R., Serwatowski P., Milanowski J., Tomeczko J., Komarnitsky P.В., Kramer D., Krzakowski M.J. Anticancer Drugs. 26 (10), ноябрь 2015 г., с. 1061-1068.

[Непатентный документ 5] Defining the Pharmacodynamic Profile and Therapeutic Index of NHS-IL12 Immunocytokine in Dogs with Malignant Melanoma. Paoloni M., Mazcko C, Selting K., Lana S., Barber L., Phillips J., Skorupski K., Vail D., Wilson H., Biller В., Avery A., Kiupel M., LeBlanc A., Bernhardt A., Brunkhorst В., Tighe R., Khanna C. PLoS One. 10 (6), 19 июня 2015 г., e0129954.

[Непатентный документ 6] Isolated limb perfusion with the tumor-targeting human monoclonal antibody-cytokine fusion protein L19-TNF plus melphalan and mild hyperthermia in patients with locally advanced extremity melanoma. Papadia F., Basso V., Patuzzo R., Maurichi A., Di Florio A., Zardi L., Ventura E., Gonzalez-Iglesias R., Lovato V., Giovannoni L., Tasciotti A., Neri D., Santinami M., Menssen H.D., De Cian F. J Surg Oncol. 107 (2), февраль 2013 г., cc. 173-179.

[Непатентный документ 7] Antigen specificity can be irrelevant to immunocytokine efficacy and biodistribution. Tzeng A., Kwan B.H., Opel C.F., Navaratna Т., Wittrup K.D. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (11), 17 марта 2015 г., cc. 3320-3325.

[Непатентный документ 8] Cancer Immunol Immunother. 55 (12), декабрь 2006 г., cc. 1590-1600. Epub 25 апреля 2006 г. Target-selective activation of a TNF prodrug by urokinase-type plasminogen activator (uPA) mediated proteolytic processing at the cell surface. Gerspach J.L., Nemeth J., Munkel S., Wajant H., Pfizenmaier K.

[Непатентный документ 9] Immunology. 133 (2), июнь 2011 г., cc. 206-220. doi: 10.1111/j.1365-2567.2011.03428.x. Epub 23 марта 2011 г. Development of an attenuated interleukin-2 fusion protein that can be activated by tumour-expressed proteases. Puskas J L., Skrombolas D., Sedlacek A., Lord E., Sullivan M., Frelinger J.

Краткое изложение сущности изобретения

Задача, положенная в основу изобретения

Настоящее изобретение было создано с учетом вышеуказанных обстоятельств. В основу настоящего изобретения была положена задача создать лигандсвязывающую молекулу, которая активирует лиганд, такой как цитокин или хемокин, избирательно в ткани-мишени, фармацевтическую композицию, содержащую лигандсвязывающую молекулу, и способы получения фармацевтической композиции и действующего вещества.

Решение задачи

При создании изобретения проведены тщательные исследования для решения задачи и затем разработана лигандсвязывающая молекула, лигандсвязывающая активность которой ослабляется расщеплением сайта расщепления. При создании изобретения было установлено также, что лигандсвязывающую молекулу или фармацевтическую композицию, содержащую лигандсвязывающую молекулу, можно применять для лечения заболевания с использованием лиганда, а также установлено, что: лигандсвязывающую молекулу или фармацевтическую композицию можно применять для лечения заболевания, осуществляя введение лигандсвязывающей молекулы; лигандсвязывающую молекулу можно применять для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания. При создании разработан также способ получения лигандсвязывающей молекулы, представляющий собой еще один объект настоящего изобретения.

Настоящее изобретение базируется на указанных данных и в нем представлены конкретные примеры вариантов осуществления изобретения, которые описаны ниже.

(1) Лигандсвязывающая молекула, которая представляет собой молекулу, обладающую способностью связываться с лигандом, где молекула представляет собой полипептид, имеющий по меньшей мере один сайт расщепления, и связывание лиганда молекулой, расщепленной по меньшей мере в одном сайте расщепления, ослабляется.

(2) Лигандсвязывающая молекула по п. (1), где лиганд высвобождается из лигандсвязывающей молекулы, расщепленной в сайте расщепления.

(3) Лигандсвязывающая молекула по п. (1) или п. (2), в которой сайт расщепления содержит последовательность, расщепляемую протеазой.

(4) Лигандсвязывающая молекула по п. (3), где протеаза представляет собой специфическую для ткани-мишени протеазу.

(5) Лигандсвязывающая молекула по п. (4), где ткань-мишень представляет собой раковую ткань, а специфическая для ткани-мишени протеаза представляет собой специфическую для раковой ткани протеазу.

(6) Лигандсвязывающая молекула по п. (4), в которой ткань-мишень представляет собой воспалительную ткань, а специфическая для ткани-мишени протеаза представляет собой специфическую для воспалительной ткани протеазу.

(7) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (3)-(6), где протеаза представляет собой по меньшей мере одну протеазу, выбранную из матриптазы, урокиназы (uPA) и металлопротеиназы.

(8) Лигандсвязывающая молекула по п. (3), в которой последовательность, расщепляемая протеазой, представляет собой последовательность, выбранную из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3, 34, 66, 70, 71, 72, 73, 35, 75, 76 и 345.

(9) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (3)-(8), в которой первый гибкий линкер дополнительно присоединен к одному концу последовательности, расщепляемой протеазой.

(10) Лигандсвязывающая молекула по п. (9), в которой второй гибкий линкер дополнительно присоединен к другому концу последовательности, расщепляемой протеазой.

(11) Лигандсвязывающая молекула по п. (9), в которой первый гибкий линкер представляет собой гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера.

(12) Лигандсвязывающая молекула по п. (10), в которой второй гибкий линкер представляет собой гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера.

(13) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (1)-(12), где лигандсвязывающая молекула содержит VH антитела, VL антитела и константную область антитела.

(14) Лигандсвязывающая молекула по п. (13), в которой сайт расщепления или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер, и второй гибкий линкер локализованы в константной области антитела.

(15) Лигандсвязывающая молекула по п. (14), в которой сайт расщепления или последовательность, расщепляемая протеазой, или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер, и второй гибкий линкер встроены в любое положение в последовательности от аминокислотного положения 118 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела до аминокислотного положения 140 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.

(16) Лигандсвязывающая молекула по п. (14), в которой сайт расщепления или последовательность, расщепляемая протеазой, или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер, и второй гибкий линкер встроены в любое положение в последовательности от аминокислотного положения 108 (EU-нумерация) (положение 108 согласно нумерации Кэбота) константной области легкой цепи антитела до аминокислотного положения 131 (EU-нумерация) (положение 131 согласно нумерации Кэбота) константной области легкой цепи антитела.

(17) Лигандсвязывающая молекула по п. (13), в которой сайт расщепления или последовательность, расщепляемая протеазой, или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер, и второй гибкий линкер локализованы в VH антитела или VL антитела.

(18) Лигандсвязывающая молекула по п. (17), в которой сайт расщепления или последовательность, расщепляемая протеазой, или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер, и второй гибкий линкер встроены в любое положение последовательности, выбранное из группы, которая состоит из последовательности, простирающейся от аминокислотного положения 7 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 16 (нумерация по Кэботу), последовательности, простирающейся от аминокислотного положения 40 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 47 (нумерация по Кэботу), последовательности, простирающейся от аминокислотного положения 55 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 69 (нумерация по Кэботу), последовательности, простирающейся от аминокислотного положения 73 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 79 (нумерация по Кэботу), последовательности, простирающейся от аминокислотного положения 83 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 89 (нумерация по Кэботу), последовательности, простирающейся от аминокислотного положения 95 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 99 (нумерация по Кэботу), и последовательности, простирающейся от аминокислотного положения 101 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 113 (нумерация по Кэботу) в VH антитела.

(19) Лигандсвязывающая молекула по п. (17), в которой сайт расщепления или последовательность, расщепляемая протеазой, или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер, и второй гибкий линкер встроены в любое положение последовательности, выбранное из группы, которая состоит из последовательности, простирающейся от аминокислотного положения 7 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 19 (нумерация по Кэботу), последовательности, простирающейся от аминокислотного положения 39 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 46 (нумерация по Кэботу), последовательности, простирающейся от аминокислотного положения 49 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 62 (нумерация по Кэботу), и последовательности, простирающейся от аминокислотного положения 96 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 107 (нумерация по Кэботу), в VL антитела.

(20) Лигандсвязывающая молекула по п. (13), в которой сайт расщепления или последовательность, расщепляемая протеазой, или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер, и второй гибкий линкер локализованы вблизи границы между константной областью антитела и VH антитела и/или между константной областью антитела и VL антитела.

(21) Лигандсвязывающая молекула по п. (20), в которой сайт расщепления или последовательность, расщепляемая протеазой, или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер, и второй гибкий линкер встроены в любое положение в последовательности от аминокислотного положения 109 (нумерация по Кэботу) VH антитела до аминокислотного положения 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.

(22) Лигандсвязывающая молекула по п. (20), в которой сайт расщепления или последовательность, расщепляемая протеазой, или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер или последовательность, расщепляемая протеазой, и первый гибкий линкер, и второй гибкий линкер встроены в любое положение в последовательности от аминокислотного положения 104 (нумерация по Кэботу) VL антитела до аминокислотного положения 113 (EU-нумерация) (положение 113 согласно нумерации Кэбота) константной области легкой цепи антитела.

(23) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (13)-(22), где VL антитела и VH антитела в лигандсвязывающей молекуле находятся в ассоциации друг с другом, где ассоциация разрушается с помощью расщепления сайта расщепления или разрушается расщеплением протеазой последовательности, расщепляемой протеазой.

(24) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (1)-(23), где лиганд представляет собой молекулу, обладающую биологической активностью, и лигандсвязывающая молекула ингибирует биологическую активность лиганда путем связывания с лигандом.

(25) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (1)-(24), где лиганд представляет собой цитокин или хемокин.

(26) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (1)-(24), где лиганд представляет собой лиганд, выбранный из интерлейкина, интерферона, гематопоэтического фактора, члена суперсемейства TNF, хемокина, фактора роста клеток и члена семейства TGF-β.

(27) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (1)-(24), где лиганд представляет собой CXCL10, IL12, PD1 или IL6R.

(28) Лигандсвязывающая молекула по п. (27), где лиганд представляет собой CXCL10, и лигандсвязывающая молекула содержит VH антитела и VL антитела, где лигандсвязывающая молекула имеет:

(а) VH, которая содержит H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 374, Н-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 375, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 376, и VL антитела, которая содержит L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 377, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 378, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 379;

(б) VH антитела, которая содержит H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 380, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 381, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 382, и VL антитела, которая содержит L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 383, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 384, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 385;

(в) VH антитела и VL антитела, которые конкурируют с VH антитела и VL антитела, описанными в подпункте (а) или (б); или

(г) VH антитела и VL антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и VH антитела и VL антитела, описанные в подпункте (а) или (б).

(29) Лигандсвязывающая молекула по п. (28), где лигандсвязывающая молекула представляет собой антитело, которое содержит тяжелую цепь антитела, выбранную из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 4-14, 23-27, 33, 59, 60, 356 и 367, или легкую цепь антитела, выбранную из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 15-22.

(30) Лигандсвязывающая молекула по п. (27), где лиганд представляет собой IL12, и лигандсвязывающая молекула содержит VH антитела и VL антитела, где лигандсвязывающая молекула имеет:

(а) VH антитела, которая содержит H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 386, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 387, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 388, и VL антитела, которая содержит L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 389, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 390, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 391;

(б) VH антитела и VL антитела, которые конкурируют с VH антитела и VL антитела, описанными в подпункте (а); или

(в) VH антитела и VL антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и VH антитела и VL антитела, описанные в подпункте (а).

(31) Лигандсвязывающая молекула по п. (30), где лигандсвязывающая молекула представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь антитела, которая представлена в SEQ ID NO: 146.

(32) Лигандсвязывающая молекула по п. (27), где лиганд представляет собой PD1, и лигандсвязывающая молекула содержит VH антитела и VL антитела, где лигандсвязывающая молекула имеет:

(а) VH антитела, которая содержит H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 392, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 393, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 394, и VL антитела, которая содержит L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 395, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 396, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 397;

(б) VH антитела и VL антитела, которые конкурируют с VH антитела и VL антитела, описанными в подпункте (а); или

(в) VH антитела и VL антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и VH антитела и VL антитела, описанные в подпункте (а).

(33) Лигандсвязывающая молекула по п. (32), где лигандсвязывающая молекула представляет собой антитело, которое содержит тяжелую цепь антитела, выбранную из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 304 и 305, или легкую цепь антитела, выбранную из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 306-315 и 322.

(34) Лигандсвязывающая молекула по п. (27), где лиганд представляет собой IL-6R (рецептор IL-6), и лигандсвязывающая молекула содержит VH антитела и VL антитела, где лигандсвязывающая молекула имеет:

(а) VH антитела, которая содержит H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 398, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 399, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 400, и VL антитела, которая содержит L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 401, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 402, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 403;

(б) VH антитела и VL антитела, которые конкурируют с VH антитела и VL антитела, описанными в подпункте (а); или

(в) VH антитела и VL антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и VH антитела и VL антитела, описанные в подпункте (а).

(35) Лигандсвязывающая молекула по п. (34), где лигандсвязывающая молекула представляет собой антитело, которое содержит тяжелую цепь антитела, выбранную из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 153-156, 157-159 и 404-470, или легкую цепь антитела, выбранную из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 471-535.

(36) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (1)-(35), где лигандсвязывающая молекула представляет собой антитело IgG-типа.

(37) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (1)-(36), где лигандсвязывающая молекула связана с лигандом.

(38) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (1)-(36), где лигандсвязывающая молекула слита с лигандом.

(39) Лигандсвязывающая молекула по п. (38), где лигандсвязывающая молекула, слитая с лигандом, не связывается дополнительно с другим лигандом.

(40) Лигандсвязывающая молекула по п. (38) или п. (39), где лигандсвязывающая молекула слита с лигандом через линкер.

(41) Лигандсвязывающая молекула по п. (40), в которой линкер не содержит последовательность, расщепляемую протеазой.

(42) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (38)-(41), где лиганд представляет собой CXCL10, и лигандсвязывающая молекула содержит легкую цепь антитела и тяжелую цепь антитела, где легкая цепь антитела или тяжелая цепь антитела слита с лигандом.

(43) Лигандсвязывающая молекула по п. (42), в которой сайт расщепления содержится в легкой цепи антитела или тяжелой цепи антитела.

(44) Лигандсвязывающая молекула по п. (42) или п. (43), где лиганд представляет собой CXCL10, и легкая цепь антитела, содержащаяся в лигандсвязывающей молекуле, слита с лигандом, где лигандсвязывающая молекула имеет:

(а) тяжелую цепь антитела, которая содержит H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 374, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 375, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 376, и легкую цепь антитела, которая содержит L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 377, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 378, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 379; или

(б) тяжелую цепь антитела, которая содержит H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 380, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 381, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 382, и легкую цепь антитела, которая содержит L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 383, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 384, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 385.

(45) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (42)-(44), где лиганд представляет собой вариант CXCL10, представленный в SEQ ID NO: 370.

(46) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (38)-(41), где лиганд представляет собой PD1, и лигандсвязывающая молекула содержит легкую цепь антитела и тяжелую цепь антитела, где легкая цепь антитела или тяжелая цепь антитела слита с лигандом.

(47) Лигандсвязывающая молекула по п. (46), в которой сайт расщепления содержится в легкой цепи антитела или тяжелой цепи антитела.

(48) Лигандсвязывающая молекула по п. (46) или (47), где лиганд представляет собой PD1, легкая цепь антитела имеет L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 395, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 396, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 397, и тяжелая цепь антитела имеет H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 392, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 393, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 394.

(49) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (46)-(48), где лиганд представляет собой PD1, представленный в SEQ ID NO: 320.

(50) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (46)-(49), где лиганд представляет собой PD1, и тяжелая цепь антитела, содержащаяся в лигандсвязывающей молекуле, слита с лигандом, где набор полипептидов тяжелой цепи антитела, слитой с PD1, содержит последовательность, выбранную из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 323 и 324.

(51) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (46)-(49), где лиганд представляет собой PD1, и легкая цепь антитела, содержащаяся в лигандсвязывающей молекуле, слита с лигандом, где набор полипептидов легкой цепи антитела, слитой с PD1, содержит последовательность, выбранную из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 325-334.

(52) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (38)-(41), где лиганд представляет собой IL12, и лигандсвязывающая молекула содержит легкую цепь антитела и тяжелую цепь антитела, где легкая цепь антитела или тяжелая цепь антитела слита с лигандом.

(53) Лигандсвязывающая молекула по п. (52), в которой сайт расщепления содержится в легкой цепи антитела или тяжелой цепи антитела.

(54) Лигандсвязывающая молекула по п. (52) или п. (53), где лиганд представляет собой IL12, легкая цепь антитела имеет L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 389, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 390, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 391, и тяжелая цепь антитела имеет H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 386, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 387, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 388.

(55) Лигандсвязывающая молекула по одному из п.п. (38)-(41), где лиганд представляет собой IL-6R, и лигандсвязывающая молекула содержит легкую цепь антитела и тяжелую цепь антитела, где легкая цепь антитела или тяжелая цепь антитела слита с лигандом.

(56) Лигандсвязывающая молекула по п. (55), в которой сайт расщепления содержится в легкой цепи антитела или тяжелой цепи антитела.

(57) Лигандсвязывающая молекула по п. (55) или п. (56), где лиганд представляет собой IL-6R, легкая цепь антитела имеет L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 401, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 402, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 403, и тяжелая цепь антитела имеет H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 398, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 399, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 400.

(58) Комплекс, образованный лигандом и лигандсвязывающей молекулой по одному из п.п. (1)-(36), связанной с лигандом.

(59) Слитый белок, содержащий лигандсвязывающую молекулу по одному из п.п. (1)-(36), слитую с лигандом.

(60) Слитый белок по п. (59), в котором лигандсвязывающая молекула, слитая с лигандом, не связывается дополнительно с другим лигандом.

(61) Слитый белок по п. (59) или п. (60), в котором лигандсвязывающая молекула слита с лигандом через линкер.

(62) Слитый белок по п. (61), в котором линкер не содержит последовательность, расщепляемую протеазой.

(63) Слитый белок по п. (61) или п. (62), в котором линкер представляет собой линкер, состоящий из глицин-серинового полимера.

(64) Слитый белок по одному из п.п. (59)-(63), в котором лиганд представляет собой CXCL10, и лигандсвязывающая молекула содержит легкую цепь антитела и тяжелую цепь антитела, где легкая цепь антитела или тяжелая цепь антитела слита с лигандом.

(65) Слитый белок по п. (64), в котором сайт расщепления содержится в легкой цепи антитела или тяжелой цепи антитела лигандсвязывающей молекулы.

(66) Слитый белок по п. (64) или п. (65), в котором лиганд представляет собой CXCL10, и легкая цепь антитела, содержащаяся в лигандсвязывающей молекуле, слита с лигандом, где лигандсвязывающая молекула имеет:

(а) тяжелую цепь антитела, которая содержит H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 374, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 375, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 376, и легкую цепь антитела, которая содержит L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 377, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 378, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 379; или

(б) тяжелую цепь антитела, которая содержит H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 380, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 381, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 382, и легкую цепь антитела, которая содержит L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 383, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 384, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 385.

(67) Слитый белок по одному из п.п. (64)-(66), в котором лиганд представляет собой вариант CXCL10, представленный в SEQ ID NO: 370.

(68) Слитый белок по одному из п.п. (59)-(63), в котором лиганд представляет собой PD1, и лигандсвязывающая молекула содержит легкую цепь антитела и тяжелую цепь антитела, где легкая цепь антитела или тяжелая цепь антитела слита с лигандом.

(69) Лигандсвязывающая молекула по п. (68), в которой сайт расщепления находится в легкой цепи антитела или тяжелой цепи антитела.

(70) Слитый белок по п. (68) или п. (69), в котором лиганд представляет собой PD1, легкая цепь антитела имеет L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 395, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 396, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 397, и тяжелая цепь антитела имеет H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 392, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 393, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 394.

(71) Слитый белок по одному из п.п. (68)-(70), в котором лиганд представляет собой PD1, имеющий SEQ ID NO: 320.

(72) Слитый белок по одному из п.п. (68)-(71), в котором лиганд представляет собой PD1, и тяжелая цепь антитела, содержащаяся в лигандсвязывающей молекуле, слита с лигандом, где набор полипептидов тяжелой цепи антитела, слитой с PD1, содержит последовательность, выбранную из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 323 и 324.

(73) Слитый белок по одному из п.п. (68)-(71), в котором лиганд представляет собой PD1, и легкая цепь антитела, содержащаяся в лигандсвязывающей молекуле, слита с лигандом, где набор полипептидов легкой цепи антитела, слитой с PD1, содержит последовательность, выбранную из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 325-334.

(74) Слитый белок по одному из п.п. (59)-(63), в котором лиганд представляет собой IL12, и лигандсвязывающая молекула содержит легкую цепь антитела и тяжелую цепь антитела, где легкая цепь антитела или тяжелая цепь антитела слита с лигандом.

(75) Слитый белок по п. (74), в котором сайт расщепления содержится в легкой цепи антитела или тяжелой цепи антитела.

(76) Слитый белок по п. (74) или п. (75), в котором лиганд представляет собой IL12, легкая цепь антитела имеет L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 389, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 390, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 391, и тяжелая цепь антитела имеет H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 386, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 387, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 388.

(77) Слитый белок по одному из п.п. (59)-(63), в котором лиганд представляет собой IL-6R, и лигандсвязывающая молекула содержит легкую цепь антитела и тяжелую цепь антитела, где легкая цепь антитела или тяжелая цепь антитела слита с лигандом.

(78) Слитый белок по п. (77), в котором сайт расщепления содержится в легкой цепи антитела или тяжелой цепи антитела.

(79) Слитый белок по п. (77) или п. (78), в котором лиганд представляет собой IL-6R, легкая цепь антитела имеет L-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 401, L-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 402, и L-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 403, и тяжелая цепь антитела имеет H-CDR1, представленный в SEQ ID NO: 398, H-CDR2, представленный в SEQ ID NO: 399, и H-CDR3, представленный в SEQ ID NO: 400.

(80) Фармацевтическая композиция, содержащая лигандсвязывающую молекулу по одному из п.п. (1)-(57).

(81) Фармацевтическая композиция, содержащая лигандсвязывающую молекулу по одному из п.п. (1)-(37) и лиганд.

(82) Фармацевтическая композиция, содержащая комплекс по п. (58).

(83) Фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по одному из п.п. (59)-(79).

(84) Способ получения лигандсвязывающей молекулы по одному из п.п. (1)-(57).

(85) Способ производства по п. (84), включающий интродукцию последовательности, расщепляемой протеазой, в молекулу, которая обладает способностью связываться с лигандом.

(86) Способ получения слитого белка по одному из п.п. (59)-(79), включающий слияние лигандсвязывающей молекулы, которая имеет расщепляемую протеазой последовательность, с ее лигандом.

(87) Полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающую молекулу по одному из п.п. (1)-(57).

(88) Вектор, содержащий полинуклеотид по п. (87).

(89) Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. (87) или вектор по п. (88).

(90) Способ получения лигандсвязывающей молекулы по одному из п.п. (1)-(57), включающий стадию культивирования клетки-хозяина по п. (89).

(91) Полинуклеотид, кодирующий слитый белок по одному из п.п. (59)-(79).

(92) Вектор, содержащий полинуклеотид по п. (91).

(93) Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. (91) или вектор по п. (92).

(94) Способ получения слитого белка по одному из п.п. (59)-(79), включающий стадию культивирования клетки-хозяина по п. (93).

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - диаграмма, на которой представлен слитый белок антитела IgG-типа и лиганда, который содержит молекулу лиганд-линкер-VH антитела к лиганду, специфически высвобождающуюся в ткани-мишени, и один из путей ее активации. Лиганд и антитело к лиганду слиты через линкер;

на фиг. 2 - диаграмма, на которой представлено антитело IgG-типа, которое высвобождает лиганд специфически в ткани-мишени, и один из механизмов его активации. Антитело к лиганду, несущее расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между VH и СН1, смешивают с лигандом и вводят индивидууму;

на фиг. 3 - диаграмма, на которой представлено антитело IgG-типа, которое высвобождает лиганд специфически в ткани-мишени, и один из механизмов его активации. Антитело к лиганду, несущее расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между VH и СН1, вводят индивидууму. Введенное антитело связывается с лигандом, исходно присутствующим в организме. Последующий процесс является таким же, как и механизм активации, продемонстрированный на фиг. 2;

на фиг. 4 - диаграмма, на которой представлены результаты оценки взаимодействия между MabCXCL10 и человеческим CXCL10, полученные с помощью Biacore;

на фиг. 5А - диаграмма, на которой представлены модели молекул антител, полученные путем встраивания (инсерции) расщепляемой протеазой последовательности вблизи грацины между вариабельной областью и константной областью антитела MabCXCL10;

на фиг. 5Б - диаграмма, на которой представлено обозначение каждого полученного варианта тяжелой цепи, положение, в которое встроена расщепляемая протеазой последовательность, и встроенная аминокислотная последовательность. Сайт инсерции обозначен как [вставка];

на фиг. 5В - диаграмма, на которой представлены обозначение каждого полученного варианта легкой цепи, положение, в которое встроена расщепляемая протеазой последовательность, и встроенная аминокислотная последовательность. Сайт инсерции обозначен как [вставка];

на фиг. 6А - диаграмма, на которой представлены результаты оценки взаимодействия человеческого CXCL10 с каждой молекулой антитела, полученной путем встраивания распознаваемой протеазой последовательности вблизи границы между вариабельной областью и константной областью тяжелой цепи MabCXCL10, полученные с помощью Biacore;

на фиг. 6Б - диаграмма, на которой представлены результаты оценки взаимодействия человеческого CXCL10 с каждой молекулой антитела, полученной путем встраивания распознаваемой протеазой последовательности вблизи границы между вариабельной областью и константной областью легкой цепи MabCXCL10, полученные с помощью Biacore;

на фиг. 7-1 - диаграмма, на которой представлены (А) результаты оценки степени расщепления по миграции при использовании ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и детекции с помощью кумасси бриллиантового голубого (СВВ) после обработки протеазой (MT-SP1) молекул антител, полученных путем встраивания расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между вариабельной областью и константной областью тяжелой цепи MabCXCL10. Из двух новых полос, образовавшихся в результате обработки протеазой, полоса, соответствующая примерно 15 кДа, представляет собой полосу, полученную из VH, а полоса, соответствующая примерно 25-50 кДа, представляет собой полосу, полученную из константной области;

на фиг. 7-2 - диаграмма, на которой представлено продолжение результаты (А) и (Б) оценки степени расщепления по миграции при использовании ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и детекции с помощью кумасси бриллиантового голубого (СВВ) после обработки протеазой (MT-SP1) молекул антител, полученных путем встраивания расщепляемой протеазой последовательности в вариабельную область или константную область легкой цепи MabCXCL10. Обработка протеазой приводила к образованию двух новых полос, полученных из расщепленной легкой цепи;

на фиг. 7-3 - диаграмма, являющаяся продолжением (Б);

на фиг. 8 - диаграмма, на которой представлены обозначения каждого варианта тяжелой цепи, полученного путем встраивания расщепляемой протеазой последовательности и последовательности гибкого линкера вблизи границы между вариабельной и константной областями MabCXCL10, положение, в которое встроена расщепляемая протеазой последовательность и последовательность гибкого линкера, и встроенная аминокислотная последовательность. Сайт инсерции обозначен как [вставка];

на фиг. 9 - диаграмма, на которой представлены результаты оценки взаимодействия человеческого CXCL10 с каждой молекулой антитела, полученной путем встраивания распознаваемой протеазой последовательности и последовательности гибкого линкера вблизи границы между вариабельной областью и константной областью тяжелой цепи MabCXCL10, полученные с помощью Biacore;

на фиг. 10-А - диаграмма, на которой представлены результаты оценки степени расщепления по миграции при использовании ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и детекции с помощью СВВ после обработки протеазой (uPA или MT-SP1) молекул антител, полученных путем встраивания распознаваемой протеазой последовательности и последовательности линкера вблизи границы между вариабельной областью и константной областью тяжелой цепи MabCXCL10. Из двух новых полос, образовавшихся в результате обработки протеазой, полоса, соответствующая примерно 15 кДа, представляет собой полосу, полученную из VH, а полоса, соответствующая примерно 25-50 кДа, представляет собой полосу, полученную из константной области;

на фиг. 10Б - диаграмма, являющаяся продолжением фиг. 10А.

на фиг. 11А - диаграмма, на которой представлены результаты определения того, происходит ли высвобождение CXCL10 из комплекса MabCXCL10a и CXCL10 в результате обработки протеазой (MT-SP1);

на фиг. 11Б - диаграмма, на которой представлены результаты определения того, происходит ли высвобождение CXCL10 из комплекса EEIVHC006a/EEIVL и CXCL10 в результате обработки протеазой (MT-SP1);

на фиг. 12 - диаграмма, на которой представлено обозначение каждой из тяжелых цепей, полученных путем замены части аминокислотной последовательности вблизи границы между вариабельной и константной областями MabCXCL10 на распознаваемую протеазой последовательность и последовательность гибкого линкера, сайты инсерции и изменения аминокислот, встроенная последовательность и аминокислотная последовательность после инсерции и изменения. Сайт инсерции обозначен как [вставка]. Аминокислотные остатки, обозначенные перечеркиванием в колонке «Положение вставки и положение изменения», удаляли, т.е. заменяли на С-концевую первую аминокислоту встроенной последовательности в момент инсерции встраиваемой последовательности;

на фиг. 13 - диаграмма, на которой представлены результаты оценки степени расщепления по миграции при использовании ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и детекции с помощью СВВ после обработки протеазой (uPA или MT-SP1) молекул антител, полученных путем замены части аминокислотной последовательности вблизи границы между вариабельной и константной областями MabCXCL10 на расщепляемую протеазой последовательность и гибкий линкер. Из двух новых полос, образовавшихся в результате обработки протеазой, полоса, соответствующая примерно 15 кДа, представляет собой полосу, полученную из VH, а полоса, соответствующая примерно 25-50 кДа, представляет собой полосу, полученную из константной области;

на фиг. 14 - диаграмма, на которой представлены данные о люциферазной активности (интенсивность люминесценции);

на фиг. 15 - результаты, полученные с помощью ДСН-ПААГ до и после расщепления протеазой слитого белка CXCL10-антитело к CXCL10;

на фиг. 16 - диаграмма, на которой представлены данные о люциферазной активности (интенсивность люминесценции);

на фиг. 17 - результаты, полученные с помощью ДСН-ПААГ до и после расщепления протеазой нейтрализующих антител к IL-12, несущих распознаваемую протеазой последовательность и последовательность гибкого линкера;

на фиг. 18 - диаграмма, на которой представлены данные о производстве интерферона гамма при добавлении IL-12 и антитела. NoAb обозначен образец, в который добавлен только IL-12 без добавки антитела, a NoIL-12 обозначен образец, в который не добавлен ни IL-12, ни антитело;

на фиг. 19А - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления протеазой антитела;

на фиг. 19Б - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления протеазой антитела;

на фиг. 20А - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления различными протеазами;

на фиг. 20Б - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления различными протеазами;

на фиг. 21 - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления различными протеазами;

на фиг. 22А- диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 22Б - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 22В - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 22Г - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 22Д - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 22Е - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 22Ж - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 22З - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 22И - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 23А - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 23Б - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 23В - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 24А - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 24Б - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 24В - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 24Г - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 24Д - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 25А - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 25Б - диаграмма, на которой представлены результаты расщепления вариантов антитела MRA протеазой;

на фиг. 26 - диаграмма, на которой представлено сравнение графиков, полученных в реальном времени, на которых продемонстрировано связывание 5С4-bio с PD1 в предназначенных для оценки связывания образцах, содержащих обработанное протеазой антитело или необработанной протеазой антитело и PD1. Жирными черными линиями обозначены предназначенные для оценки связывания образцы, содержащие обработанное протеазой антитело, а тонкими серыми линиями обозначены предназначенные для оценки связывания образцы, содержащие необработанное протеазой антитело. На оси X отложено время измерения (с), и начало измерения обозначено как 0 с. На оси Y отложен уровень связывания. Название каждого графика соответствует антителу, содержащемуся в предназначенном для оценки образце. График «нет (только антиген)» соответствует варианту, в котором только антиген применяли в качестве предназначенного для оценки образца и не смешивали с антителом;

на фиг. 27 - результаты электрофоретического исследования обработанных протеазой антител и необработанных протеазой антител. Дорожки, обозначенные как протеаза (+), соответствуют обработанным протеазой образцам, а дорожки, обозначенные как протеаза (-), соответствуют необработанным протеазой образцам;

на фиг. 28 - диаграмма, на которой представлено сравнение графиков, полученных в реальном времени, на которых продемонстрировано связывание PD1 обработанными протеазой антителами и необработанными протеазой антителами. Жирными черными линиями обозначены образцы, содержащие обработанное протеазой антитело, а тонкими серыми линиями обозначены образцы, содержащие необработанное протеазой антитело. На оси X отложено время измерения (с), и начало измерения обозначено как 0 с. На оси Y отложен уровень связывания. Название каждого графика соответствует антителу, содержащемуся в образце. График «нет» соответствует образцу, в котором применяли только ЗФР-буфер без применения антитела;

на фиг. 29 - диаграмма, на которой представлено сравнение графиков, полученных в реальном времени, на которых продемонстрировано связывание 5С4-bio с высвободившимся PD1, который присутствует в образцах, обработанных протеазой в присутствии PD1, и в образцах, не обработанных протеазой в присутствии PD1. Жирными черными линиями обозначены обработанные протеазой образцы, а тонкими серыми линиями обозначены необработанные протеазой образцы. На оси X отложено время измерения (с), и начало измерения обозначено как 0 с. На оси Y отложен уровень связывания. Название каждого графика соответствует антителу, содержащемуся в образце. График «антиген и протеаза» соответствует образцу, содержащему только PD1 и не содержащему антитело;

на фиг. 30 - диаграмма, на которой представлено сравнение графиков, полученных в реальном времени, на которых продемонстрировано связывание 5С4-bio с высвободившимся PD1, который присутствует в растворах обработанного протеазой слитого белка и необработанного протеазой белка. Жирными черными линиями обозначены обработанные протеазой образцы, а тонкими серыми линиями обозначены необработанные протеазой образцы. На оси X отложено время измерения (с), и начало измерения обозначено как 0 с. На оси Y отложен уровень связывания. Название каждого графика соответствует антителу в слитом белке. График «нет (только антиген)» соответствует варианту, в котором только антиген PD1 применяли в качестве образца, предназначенного для оценки, не применяя слитый белок. График «5C4H-G1T4/5C4L-KT0» соответствует варианту, в котором применяли только антитело 5С4Н-G1T4/5C4L-KT0, не применяя слитый белок;

на фиг. 31 - результаты электрофоретического исследования слитый белков антитело - PD1, обработанных протеазой. Дорожки, обозначенные как протеаза (+), соответствуют обработанным протеазой слитым белкам, а дорожки, обозначенные как протеаза (-), соответствуют необработанным протеазой слитым белкам.

Описание вариантов осуществления изобретения

Согласно настоящему изобретению полипептид, как правило, представляет собой пептид, имеющий длину порядка 4 аминокислот или более, и белок. Кроме того, согласно настоящему изобретению полипептид, как правило, состоит из искусственно созданной последовательности (но, не ограничиваясь только ею). Например, можно применять полученный из организма полипептид. Альтернативному этому, полипептид согласно настоящему изобретению может представлять собой любой встречающийся в естественных условиях полипептид, синтетический полипептид, рекомбинантный полипептид и т.п. Кроме того, согласно настоящему изобретению фрагменты указанных полипептидов также подпадают под понятие полипептид.

В настоящем описании каждую аминокислоту обозначают однобуквенным или трехбуквенным кодом или ими обоими, например, следующим образом: Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I или Val/V.

Для изменения аминокислоты в аминокислотной последовательности полипептида можно соответствующим образом адаптировать известный в данной области метод, такой как сайтнаправленный мутагенез (Kunkel и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, cc. 488-492) или ПЦР с удлинением перекрытий. Множество методов, известных в данной области, можно также адаптировать в качестве альтернативных методов замены аминокислот на аминокислоты, отличные от встречающихся в естественных условиях аминокислот (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 2006, cc. 225-249; и Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(11), 2003, cc. 6353-6357). Можно применять, например, бесклеточную систему трансляции, содержащую тРНК, в которой не встречающаяся в естественных условиях аминокислота слита с супрессорной тРНК, подавляющей амбер-мутацию, комплементарной UAG-кодону (амбер-кодон), который представляет собой стоп-кодон (фирма Clover Direct (Protein Express)).

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «и/или», применяемое для обозначения сайтов аминокислотных изменений, включает каждую комбинацию, к которой применимо «и» и «или». В частности, например, фраза «аминокислоты в положениях 37, 45 и/или 47 заменены» включает следующие вариации аминокислотных изменений:

(а) положение 37, (б) положение 45, (в) положение 47, (г) положения 37 и 45, (д) положения 37 и 47, (е) положения 45 и 47 и (ж) положения 37, 45 и 47.

В настоящем описании выражение, в котором однобуквенные коды или трехбуквенные коды аминокислот до и после изменения применяют перед или после номера, обозначающего конкретное положение, можно применять соответственно для обозначения аминокислотного изменения. Например, изменение F37V или Phe37Val, применяемое для замены аминокислоты, содержащейся в вариабельной области антитела, обозначает замену Phe в положении 37 согласно нумерации Кэбота на Val. В частности, номер обозначает аминокислотное положение согласно нумерации Кэбота; однобуквенный или трехбуквенный код аминокислоты, предшествующий номеру, означает аминокислоту до замены; а однобуквенный код или трехбуквенный код аминокислоты после номера означает аминокислоту после замены. Аналогично этому, изменение Р238А или Pro238Ala, применяемое для замены аминокислоты в Fc-области в константной области антитела означает замену Pro в положении 238 согласно EU-нумерации на Ala. В частности, номер обозначает аминокислотное положение согласно EU-нумерации; однобуквенный или трехбуквенный код аминокислоты, предшествующий номеру, означает аминокислоту до замены; а однобуквенный код или трехбуквенный код аминокислоты после номера означает аминокислоту после замены.

Настоящее изобретение относится к лигандсвязывающей молекуле, имеющий сайт расщепления, в которой связывание лиганда лигандсвязывающей молекулой, расщепленной в сайте расщепления, ослабляется. Лигандсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой полипептид, и это понятие относится к молекуле, которая обладает способностью связываться с лигандом.

Лигандсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой молекулу, которая обладает способностью связываться с лигандом, в частности, молекулу, которая обладает способностью связываться с лигандом, будучи нерасщепленной. В этом контексте понятие «связывание», как правило, относится к связыванию посредством взаимодействия, основанного главным образом на нековалентной связи, такой как электростатическая сила, Ван-дер-вальсова сила, или водородной связи. Предпочтительные примеры формы связывания с лигандом лигандсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, включают (но, не ограничиваясь только ими) взаимодействие по типу антиген-антитело, посредством которого антигенсвязывающая область, антигенсвязывающая молекула, антитела, фрагмент антитела или т.п. связывается с антигеном.

Фраза «обладает способностью связываться с лигандом» означает, что лигандсвязывающая молекула обладает способностью связываться с лигандом даже, если лигандсвязывающая молекула и лиганд представляют собой различные молекулы, и не означает, что лигандсвязывающая молекула и лиганд соединены через ковалентную связь. Например, фраза «обладает способностью связываться с лигандом» не означает, что лиганд и лигандсвязывающая молекула соединены ковалентной связью через линкер. Кроме того, фраза «связывание лиганда ослабляется» означает, что описанная выше способность связываться (связывающая способность) ослабляется. Например, когда лиганд и лигандсвязывающая молекула соединены посредством ковалентной связи через линкер, то расщепление линкера не означает, что связывание лиганда ослабляется. В настоящем изобретении лигандсвязывающая молекула может быть соединена с лигандом через линкер или т.п., если лигандсвязывающая молекула при этом обладает способностью связываться с лигандом.

Лигандсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, не ограничен только связыванием с лигандом, будучи нерасщепленной, а может представлять собой молекулу, которая имеет любую структуру, если применяемая молекула может связываться с представляющим интерес лигандом, будучи нерасщепленной. Примеры лигандсвязывающей молекулы включают (но, не ограничиваясь только ими) вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH), вариабельную область легкой цепи антитела (VL), однодоменное антитело (sdAb), модуль, состоящий примерно из 35 аминокислот, обозначенный как А-домен, который входит в авимер (Avimer), белок клеточной мембраны, присутствующий in vivo (публикация международных заявок на патент WO 2004/044011 и WO 2005/040229), аднектин (Adnectin), содержащий 10Fn3-домен, служащий в качестве связывающего белок домена, полученного из гликопротеина фибронектина, экспрессируемого на клеточных мембранах (публикация международной заявки на патент WO 2002/032925), аффибоди (Affibody), имеющий каркас IgG-связывающего домена, состоящего из трехспирального пучка, включающего 58 аминокислот белка А (публикация международной заявки на патент WO 1995/001937), DARPin (сконструированные белки с анкириновыми повторами), которые представляют собой области, экспонируемые на молекулярной поверхности анкириновых повторов (AR), каждый из которых имеет структуру, в которой повторно уложена субъединица с изгибом, содержащая 33 аминокислотных остатка, две антипараллельной спирали и петлю (публикация международной заявки на патент WO 2002/020565), антикалины (Anticalin), которые имеют состоящие из четырех петель области, поддерживающие одну сторону центрально закрученной бочкообразной структуры, состоящей из восьми антипараллельных цепей, которые являются высоко консервативными среди молекул липокаинов, таких как липокаин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL) (публикация международной заявки на патент WO 2003/029462), и вогнутую область, образованную структурой в виде параллельных тяжей внутри подковообразной структуры, образованной уложенными повторами, которые состоят из богатых лейцином повторяющихся (LRR) модулей вариабельного рецептора лимфоцитов (VLR), который не имеет иммуноглобулиновой структуры и применяется в системе приобретенной устойчивости у бесчелюстных позвоночных, таких как миноги или миксины (публикация международной заявки на патент WO 2008/016854).

В настоящем описании понятие «антитело» используется в его наиболее широком смысле и относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.

Метод получения антитела, обладающего требуемой связывающей активностью, известен в данной области. Ниже в качестве примера приведен метод получения антитела, связывающегося с IL-6R (антитело к IL-6R). Антитела, связывающиеся с антигенами, отличными от IL-6R, можно также получать соответственно с помощью представленного ниже примера.

Антитело к IL-6R можно получать в виде поликлонального или моноклонального антитела, применяя подход, известный в данной области. Происходящее из млекопитающих моноклональное антитело можно получать в качестве антитела к IL-6R. Происходящие из млекопитающих моноклональные антитела включают, например, антитела, продуцируемые гибридомами, или антитела, продуцируемые клетками-хозяевами, трансформированными с помощью методов генетической инженерии экспрессионными векторами, которые несут ген антитела. Антитело, указанное в настоящем описании, включает «гуманизированное антитело» и «химерное антитело».

Продуцирующие моноклональные антитела гибридомы можно получать с помощью методики, известной в данной области, например, следующим образом: млекопитающих иммунизируют белком IL-6R, который применяют в качестве сенсибилизирующего антигена, согласно принятому методу иммунизации. Полученные таким образом иммуноциты сливают с родительскими клетками, известными в данной области, согласно принятому методу клеточного слияния. Затем клетки, продуцирующие моноклональное антитело, можно подвергать скринингу согласно принятому методу скрининга для отбора гибридом, продуцирующих антитело к IL-6R.

В частности, моноклональное антитело получают, например, следующим образом: сначала можно экспрессировать ген IL-6R для получения белка IL-6R, который применяют в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела. В частности, последовательность гена, кодирующую IL-6R, встраивают с экспрессионный вектор, известный в данной области, которым затем трансформируют приемлемые клетки-хозяева. Требуемый человеческий белок IL-6R очищают из клеток-хозяев или из супернатанта их культуры с помощью метода, известного в данной области. Для получения растворимого IL-6R из супернатанта культуры, например, экспрессируют растворимый IL-6R согласно методу, описанному у Mullberg и др., J. Immunol. 152 (10), 1994, cc. 4958-4968. Альтернативно этому, в качестве сенсибилизирующего антигена можно применять очищенный встречающийся в естественных условиях белок IL-6R.

Очищенный белок IL-6R можно применять в качестве сенсибилизирующего антигена для иммунизации млекопитающих. В качестве сенсибилизирующего антигена можно применять также частичный пептид IL-6R. Указанный частичный пептид можно получать путем химического синтеза из аминокислотной последовательности человеческого IL-6R. Альтернативно этому, частичный пептид можно получать путем интеграции части гена IL-6R в экспрессионный вектор с последующей его экспрессией. Кроме того, частичный пептид можно получать также путем расщепления белка IL-6R протеолитическим ферментом. Область и размер пептида IL-6R, применяемого в качества частичного пептида, не ограничена конкретно специфическими вариантами. Количество аминокислотных остатков, образующих пептид, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена, предпочтительно составляет по меньшей мере 5 или более, например, 6 или более или 7 или более. Более конкретно пептид, состоящий из 8-50, предпочтительно 10-30 остатков, можно применять в качестве сенсибилизирующего антигена.

Кроме того, в качестве сенсибилизирующего антигена можно применять слитый белок, состоящий из требуемого частичного полипептида или пептида белка IL-6R, слитого с другим полипептидом. Например, Fc-фрагмент антитела или пептидную метку можно предпочтительно применять для получения слитого белка, предназначенного для применения в качестве сенсибилизирующего антигена. Вектор для экспрессии слитого белка можно получать путем слияния в рамке считывания генов, кодирующих два или большее количество типов требуемых полипептидных фрагментов и встраивания слитого гена в экспрессионный вектор, описанный выше. Метод получения слитого белка описан во 2-ом издании Molecular Cloning (Sambrook J. и др., Molecular Cloning, 2-ое изд., 1989, 9.47-9.58, изд-во Cold Spring Harbor Lab. Press). Метод получения IL-6R для применения в качестве сенсибилизирующего антигена и метод иммунизации с использованием указанного сенсибилизирующего антигена описаны также конкретно в WO 2003/000883, WO 2004/022754, WO 2006/006693 и т.д.

Млекопитающие, подлежащие иммунизации сенсибилизирующим антигеном, не ограничены конкретными животными. Млекопитающих, подлежащих иммунизации, предпочтительно выбирают с учетом совместимости с родительскими клетками, предназначенными для применения для слияния клеток. Как правило, предпочтительно используют грызунов (например, мышей, крыс и хомяков), кроликов, обезьян или т.п.

Указанных животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном согласно методу, известному в данной области. Например, обычный метод иммунизации включает введение сенсибилизирующего антигена млекопитающим путем внутрибрюшинной или подкожной инъекции. В частности, сенсибилизирующий антиген, разбавленный в ЗФР (забуференный фосфатом соляной раствор), физиологическом растворе или т.п., в требуемой степени разведения смешивают при необходимости с обычным адъювантом, например, полным адъювантом Фрейнда, и эмульгируют. Затем полученный сенсибилизирующий антиген вводят млекопитающим несколько раз с 4-21-дневными интервалами. Кроме того, при иммунизации сенсибилизирующим антигеном можно применять соответствующий носитель. В частности, в случае применения низкомолекулярного частичного пептида в качестве сенсибилизирующего антигена в некоторых случаях может требоваться иммунизация сенсибилизирующим антигенным пептидом, связанным с белком-носителем, таким как альбумин или гемоцианин лимфы улитки.

Альтернативно этому, можно получать также продуцирующие требуемое антитело гибридомы, согласно описанному ниже методу с использованием иммунизации ДНК. ДНК-иммунизация представляет собой метод иммунизации, который включает иммуностимуляцию иммунизированных животных путем экспрессии in vivo сенсибилизирующего антигена в иммунизированных животных, которым вводили определенный ДНК-вектор, который был сконструирован в форме, обладающей способностью экспрессировать ген, который кодирует антигенный белок в иммунизированных животных. Можно ожидать, что ДНК-иммунизация должна обладать преимуществами по сравнению с обычным методом иммунизации, в котором применяют введение белкового антигена животным, подлежащим иммунизации, по следующим причинам:

- ДНК-иммунизация может обеспечивать иммуностимуляцию с сохранением структуры мембранного белка (например, IL-6R); и

- при ДНК-иммунизации отпадает необходимость в очистке иммунизирующего антигена.

Для получения моноклонального антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, с помощью ДНК-иммунизации, сначала животным, подлежащим иммунизации, вводят ДНК для экспрессии белка IL-6R. ДНК, кодирующую IL-6R, можно синтезировать методом, известным в данной области, таким как ПЦР. Полученную ДНК встраивают в пригодный экспрессионный вектор, который затем вводят животным, подлежащим иммунизации. Например, предпочтительно в качестве экспрессионного вектора можно применять поступающий в продажу экспрессионный вектор, такой как pcDNA3.1. Общепринятый метод можно использовать в качестве метода введения вектора в организмы. Например, золотыми частицами с адсорбированным на них экспрессионным вектором трансфектируют клетки животных, подлежащих иммунизации, с использованием генной пушки, осуществляя тем самым ДНК-иммунизацию. Кроме того, антитело, распознающее IL-6R, можно получать также, используя метод, описанный в публикации международной заявки на патент WO 2003/104453.

Повышение титра антитела, связывающегося с IL-6R, подтверждают в сыворотке млекопитающих, иммунизированных таким образом. Затем получают из организма млекопитающих иммуноциты и подвергают клеточному слиянию. В частности, клетки селезенки можно применять в качестве предпочтительных иммуноцитов.

Для клеточного слияния с иммуноцитами применяют клетки миеломы млекопитающих. Клетки миеломы предпочтительно имеют пригодный маркер для селекции, который можно применять для скрининга. Понятие «маркер для селекции» относится к признаку, при котором имеет место выживание (или не может иметь место выживание) в конкретных условиях культуры. Например, дефицит гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (обозначено ниже в настоящем описании как дефицит HGPRT) или дефицит тимидинкиназы (обозначено ниже в настоящем описании как дефицит TK) известен в данной области в качестве маркера для селекции. Клетки с дефицитом HGPRT или TK являются чувствительными к гипоксантин-аминоптерин-тимидину (обозначено ниже в настоящем описании как НАТ-чувствительность). НАТ-чувствительные клетки погибают в элективной среде HAT, поскольку клетки не могут синтезировать ДНК. В противоположность этому, эти клетки, слитые с обычными клетками, приобретают способность расти даже в элективной среде HAT, поскольку слитые клетки могут продолжать осуществлять синтез ДНК благодаря применению пути «спасения» обычных клеток.

Клетки с дефицитом HGPRT или TK можно отбирать в среде, содержащей 6-тиогуанин или 8-азагуанин (сокращенно обозначен ниже в настоящем описании как 8AG) в случае дефицита HGPRT или 5'-бромдезоксиуридин в случае дефицита TK. Обычные клетки погибают при включении указанных пиримидиновых аналогов в их ДНК. В противоположность этому, клетки с дефицитом указанных ферментов могут выживать в элективной среде, поскольку эти клетки не могут включать в их ДНК пиримидиновые аналоги. Кроме того, маркер для селекции, обозначенный как «устойчивость к G418», придает устойчивость к антибиотику 2-дезоксистрептамину (аналог гентамицина) посредством гена устойчивости к неомицину. Различные клетки миеломы, которые можно применять для клеточного слияния, известны в данной области.

Например, в качестве указанных клеток миеломы предпочтительно можно применять клетки Р3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. 123 (4), 1979, cc. 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1978, cc. 1-7), NS-1 (C. Eur. J. Immunol.6 (7), 1976, cc. 511-519), MPC-11 (Cell 8 (3), 1976, cc. 405-415), SP2/0 (Nature 276 (5685), 1978, cc. 269-270), FO (J. Immunol. Methods 35 (1-2), 1980, cc. 1-21), S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. 148 (1), 1978, cc. 313-323) и R210 (Nature 277 (5692), 1979, cc. 131-133).

Как правило, клеточное слияние иммуноцитов с клетками миеломы осуществляют с помощью известного в данной области метода, например, метода Kohler и Milstein и др., Methods Enzymol. 73, 1981, cc. 3-46.

Более конкретно, клеточное слияние можно осуществлять, например, в обычной питательной среде в присутствии агента, усиливающего клеточное слияние. Например, в качестве агента, усиливающего слияние, применяют полиэтиленгликоль (ПЭГ) или гемагглютинирующий японский вирус (HVJ). Кроме того, при применении к ним добавляют при необходимости вспомогательную субстанцию, такую как диметилсульфоксид, для повышения эффективности слияния.

Кроме того, применяемое соотношение между иммуноцитами и клетками миеломы является произвольным. Например, иммуноциты предпочтительно применяют в количестве, составляющее от 1 до 10 относительно количества клеток миеломы. Например, среду RPMI1640 или среду MEM, пригодную для роста линии клеток миеломы, а также обычную среду для указанного типа клеточной культуры применяют в качестве среды для клеточного слияния. Предпочтительно в среду можно дополнительно добавлять раствор, дополненный сывороткой (например, фетальной телячьей сывороткой (FCS)).

Для осуществления клеточного слияния иммуноциты и клетки миеломы тщательно перемешивают в среде в предварительно определенных количествах. Раствор ПЭГ (например, ПЭГ со средней молекулярной массой: порядка 1000-6000), предварительно нагретый примерно до 37°С, как правило, добавляют в концентрации 30-60% (мас./об.). Раствор смеси осторожно перемешивают так, чтобы образовывались требуемые слитые клетки (гибридомы). Затем соответствующую указанную выше среду постепенно добавляют к клеточным культурам и супернатант удаляют центрифугированием. Указанную операцию можно повторять для удаления применяемых для слияния клеток агентов или т.п., непригодных для роста гибридом.

Полученные таким образом гибридомы можно культивировать в обычной элективной среде, например, среде HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин), для селекции. Культивирование с использованием среды HAT можно продолжать в течение времени, достаточного для уничтожения клеток (неслитых клеток), отличных от требуемых гибридом (как правило, достаточная продолжительность времени составляет от нескольких дней до нескольких недель). Затем гибридомы, продуцирующие требуемое антитело, можно подвергать скринингу и клонировать единичные клетки с помощью общепринятого метода серийных разведений.

Полученные таким образом гибридомы можно отбирать с помощью элективной среды, соответствующей маркеру для селекции клеток миеломы, применяемых в клеточном слиянии. Например, клетки с дефицитом HGPRT или TK можно отбирать путем культивирования в среде HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). В частности, в случае применения для клеточного слияния чувствительных к HAT клеток миеломы, только клетки, успешно слитые с нормальными клетками, могут избирательно расти в среде HAT. Культивирование с использованием среды HAT можно продолжать в течение времени, достаточного для уничтожения клеток (неслитых клеток), отличных от требуемых гибридом. В частности, для отбора требуемых гибридом культивирование, как правило, осуществляют в течение промежутка времени, составляющего от нескольких дней до нескольких недель. Затем гибридомы, продуцирующие требуемое антитело, можно подвергать скринингу и клонировать единичные клетки с помощью общепринятого метода серийных разведений.

Скрининг в отношении требуемого антитела и клонирование единичных клеток можно осуществлять методом скрининга, основанным на взаимодействии антиген-антитело, известным в данной области. Например, моноклональное антитело, связывающееся с IL-6R, можно связывать с IL-6R, экспрессируемым на клеточной поверхности. Для скрининга указанного моноклонального антитела можно применять, например, FACS (флуоресцентно-активированный клеточный сортинг). FACS представляет собой систему, позволяющую измерять связывание антитела с клеточной поверхностью путем анализа клеток, контактирующих с флуоресцентным антителом, с использованием лазерного луча и измерять флуоресценцию, испускаемую индивидуальными клетками.

Для скрининга гибридом, продуцирующих моноклональное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, с помощью FACS сначала получают экспрессирующие IL-6R клетки. Предпочтительными для скрининга клетками являются клетки млекопитающих с усиленной экспрессией IL-6R. Нетрансформированные клетки млекопитающих, применяемые в качестве клеток-хозяев, можно применять в качестве контроля для избирательного определения активности связывания антитела к IL-6R на клеточной поверхности. В частности, гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело к IL-6R, можно получать путем отбора гибридом, продуцирующих антитело, которое связывается с клетками с усиленной экспрессией IL-6R, но не связывается с клетками-хозяевами.

Альтернативно этому, можно оценивать связывающую активность антитела с иммобилизованными экспрессирующими IL-6R клетками на основе принципа ELISA. Экспрессирующие IL-6R клетки иммобилизуют на каждой лунке, например, планшета для ELISA. Супернатант культуры гибридомы приводят в контакт с иммобилизованными клетками в лунке для определения связывания антитела с иммобилизованными клетками. Когда моноклональное антитело имеет мышиное происхождение, антитело, связанное с клеткой, можно выявлять с использованием антитела к мышиному иммуноглобулину. Гибридомы, продуцирующие требуемое антитело, которое обладает способностью связывать антиген, отобранные с помощью указанного скрининга, можно клонировать методом серийных разведений или т.п.

Полученные таким образом продуцирующие моноклональные антитела гибридомы можно пересевать в обычную среду. Гибридомы можно также хранить в течение длительного времени в жидком азоте.

Гибридомы культивируют общепринятым методом и требуемое моноклональное антитело можно получать из супернатанта культуры. Альтернативно этому, гибридомы можно вводить млекопитающим, пригодным для указанной процедуры, и выращивать и моноклональное антитело можно получать из его асцитных жидкостей. Первый метод пригоден для получения высокоочищенных антител.

Предпочтительно можно применять также антитело, кодируемое геном антитела, клонированным в продуцирующих антитело клетках, таких как гибридомы. Клонированный ген антитела интегрируют в соответствующий вектор, которым затем трансфектируют хозяев так, чтобы экспрессировалось антитело, кодируемое геном. Методы выделения гена антитела, интеграции в вектор и трансформации клеток-хозяев уже известны и описаны, например, у Vandamme и др., Eur. J. Biochem. 192 (3), 1990, cc. 767-775. Метод получения рекомбинантного антитела, описанный ниже, также известен в данной области.

Например, кДНК, кодирующую вариабельную область (V-область) антитела к IL-6R, получают из клеток гибридомы, продуцирующих антитело к IL-6R. Для этой цели, как правило, сначала экстрагируют из гибридом общую РНК. Например, любой из следующих методов можно применять для экстракции мРНК из клеток:

- метод ультрацентрифугирования в присутствии гуанидида (Biochemistry 18, (24), 1979, cc. 5294-5299) и

- AGPC-метод (Anal. Biochem. 162 (1), 1987, cc. 156-159).

Экстрагированную мРНК можно очищать с использованием набора для очистки мРНК (производства фирмы GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) или т.п. Альтернативно этому, в продажу поступает также набор для непосредственной экстракции общей мРНК из клеток, такой как набор для очистки мРНК QuickPrep (производства фирмы GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). мРНК можно получать из гибридом с использованием указанного набора. Из полученной мРНК можно синтезировать кДНК, кодирующую V-область антитела, с использованием обратной транскриптазы. кДНК можно синтезировать, например, с помощью набора для синтеза первой цепи кДНК с использованием обратной транскриптазы AMV (AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit) (производства фирмы Seikagaku Corp.). Альтернативно этому, можно применять соответственно для синтеза и амплификации кДНК метод 5'-RACE (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (23), 1988, cc. 8998-9002; и Nucleic Acids Res. 17 (8), 1989, cc. 2919-2932) с использованием набора для амплификации кДНК SMART RACE (производства фирмы Clontech Laboratories, Inc.) и ПЦР. В процессе такого синтеза кДНК можно дополнительно интродуцировать на оба конца кДНК соответствующие сайты рестрикции, упомянутые ниже.

Представляющий интерес фрагмент кДНК очищают из полученного с помощью ПЦР продукта и затем встраивают путем лигирования в ДНК-вектор. Полученным таким образом рекомбинантным вектором трансфектируют Е. coli или т.п. После отбора колонии требуемый рекомбинантный вектор можно получать из клеток E. coli, которые образовали колонию. Затем подтверждают, имеет ли рекомбинантный вектор нуклеотидную последовательность представляющей интерес кДНК, с помощью метода, известного в данной области, например, метода терминации дидезоксинуклеотидной цепи.

Метод 5'-RACE с использованием праймеров для амплификации гена вариабельной области удобно применять для получения гена, кодирующего вариабельную область. Сначала получают созданную с помощью метода быстрой амплификации концов кДНК (5'-RACE) библиотеку кДНК путем синтеза кДНК с РНК, экстрагированными из клеток гибридом, в качестве матриц. Можно применять поступающий в продажу набор, такой как набор для амплификации кДНК SMART RACE для синтеза 5'-RACE-библиотеки кДНК.

Ген антитела амплифицируют с помощью ПЦР с получением 5'-RACE-библиотеки кДНК в качестве матрицы. Праймеры для амплификации гена мышиного антитела можно создавать на основе последовательности гена антитела, известного в данной области. Эти праймеры имеют нуклеотидные последовательности, отличающиеся друг от друга в зависимости от подклассов иммуноглобулинов. Таким образом, предварительно требуется определить подкласс с использованием поступающего в продажу набора, такого как набор для изотипирования мышиных моноклональных антител Iso Strip (фирма Roche Diagnostics K.K.).

В частности, можно применять, например, праймеры, обладающие способностью обеспечивать амплификацию генов, кодирующих тяжелые цепи γ1, γ2а, γ2b и γ3 и легкие цепи κ и λ, для получения гена, кодирующего мышиный IgG. Для амплификации гена вариабельной области IgG в качестве 3'-праймера, как правило, применяют праймер, гибридизующийся с фрагментом, соответствующим константной области, примыкающей к вариабельной области. С другой стороны, в качестве 5'-праймера применяют праймер, входящий в набор для получения 5' RACE-библиотеки кДНК.

Полученные таким образом с помощью амплификации ПЦР-продукты можно применять для реконструирования иммуноглобулинов, состоящих из комбинации тяжелых и легких цепей. Требуемое антитело можно подвергать скринингу в отношении активности связывания реконструированного иммуноглобулина против IL-6R в качестве показателя. Более предпочтительно связывание антитела с IL-6R является специфическим, например, для цели получения антитела к IL-6R. Можно осуществлять скрининг связывания антитела с IL-6R, например, используя следующие стадии:

(1) приведение в контакт антитела, содержащего V-область, кодируемую кДНК, полученной из гибридом, с экспрессирующими IL-6R клетками;

(2) детекцию связывания антитела с экспрессирующими IL-6R клетками; и

(3) отбор антитела, связывающегося с экспрессирующими IL-6R клетками. Метод детекции связывания антитела с экспрессирующими IL-6R клетками известен в данной области. В частности, связывание антитела с экспрессирующими IL-6R клетками можно определять с помощью такого подхода как FACS, упомянутый выше. Фиксированный препарат экспрессирующих IL-6R клеток можно применять соответственно для оценки активности связывания антитела.

Метод пэннинга с использованием фаговых векторов также предпочтительно применяют в качестве метода скрининга антитела в отношении связывающей активности в качестве показателя. Когда гены антител получают в виде библиотек подклассов тяжелых цепей и легких цепей из экспрессирующей поликлональное антитело клеточной популяции, предпочтительным является метод скрининга с использованием фаговых векторов. Гены, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, можно связывать через соответствующую линкерную последовательность с получением гена, кодирующего одноцепочечный Fv (scFv). Ген, кодирующий scFv, можно встраивать в фаговые векторы с получением фагов, которые экспрессируют scFv на их поверхности. После контакта фагов с требуемым антигеном фаги, связанные с антигеном, можно выделять с получением ДНК, кодирующей scFv, который обладает представляющей интерес активностью связывания. Указанную операцию можно повторять при необходимости для увеличения количества scFv, которые обладают требуемой активностью связывания.

После получения кДНК, кодирующей V-область представляющего интерес антитела к IL-6R, указанную кДНК расщепляют рестриктазами, которые распознают сайты рестрикции, встроенные на оба конца кДНК. Указанные рестриктазы предпочтительно распознают и расщепляют нуклеотидную последовательность, состоящую из гена антитела. Инсерция сайтов, распознаваемых рестрикатазами, которые создают «липкие» концы, является предпочтительной для встраивания одной копии расщепленного фрагмента в правильной ориентации в вектор. Расщепленную таким образом кДНК, которая кодирует V-область антитела к IL-6R, можно встраивать в соответствующий экспрессионный вектор с получением экспрессионного вектора антитела. В этом случае ген, кодирующий константную область антитела (С-область), и ген, кодирующий V-область, сливают в рамке считывания с получением химерного антитела. В этом контексте понятие «химерное антитело» относится к антителу, имеющему константные и вариабельные области из различных источников. Таким образом, гетерогенные (например, мышиные-человеческие» химерные антитела, а также человеческие-человеческие гомогенные химерные антитела также подпадают под понятие химерное антитело согласно настоящему изобретению. Ген V-области можно встраивать в экспрессионный вектор, уже имеющий ген константной области, для создания экспрессионного вектора химерного антитела. В частности, например, последовательности, распознаваемые рестриктазами, которые расщепляют ген V-области, можно помещать соответственно в 5'-область экспрессионного вектора, который несет ДНК, кодирующую константную область (С-область) требуемого антитела. Указанный экспрессионный вектор, имеющий ген С-области и ген V-области, расщепляют с помощью такой же комбинации рестриктаз и сливают в рамке считывания с созданием экспрессионного вектора химерного антитела.

Для получения моноклонального антитела к IL-6R ген антитела интегрируют в экспрессионный вектор так, чтобы ген антитела экспрессировался под контролем контролирующих экспрессию областей. Контролирующие экспрессию области для экспрессии антитела включают, например, энхансер и промотор. Кроме того, соответствующую сигнальную последовательность можно добавлять на аминоконец для внеклеточной секреции экспрессируемого антитела. Например пепид, имеющий аминокислотную последовательность MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 536), можно применять в качестве сигнальной последовательности. Можно добавлять любые другие приемлемые сигнальные последовательности. Экспрессируемый полипептид расщепляют на карбокскоцевом фрагменте указанной последовательности. Расщепленный полипептид может секретироваться вне клетки в виде зрелого полипептида. Затем приемлемые клетки-хозяева можно трансформировать указанным экспрессионным вектором с получением рекомбинантных клеток, экспрессирующих ДНК, которая кодирует антитело к IL-6R.

Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от полного антитела, которая содержит часть полного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается полное антитело. Примеры фрагментов антитела включают (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, димерные антитела (диабоди), линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Понятия «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, практически сходную со структурой встречающегося в естественных условиях антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат представленную в настоящем описании Fc-область.

Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с его антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (CDR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена.

Понятие «гипервариабельный участок» или «CDR» в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательность которого является гипервариабельной и/или формирует петли определенной структуры («гипервариабельные петли»), и/или относится к контактирующим с антигеном остаткам («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть CDR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Согласно настоящему описанию примеры HVR включают

(а) гипервариабельные петли, включающие аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917);

(б) CDR, включающие аминокислотные остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (Н3) (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, публикация NIH 91-3242);

(в) области контакта с антигеном, включающие аминокислотные остатки 27с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum и др., J. Mol. Biol. 262, 1996, cc. 732-745); и

(г) комбинации остатков, указанных в подпунктах (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).

Если специально не указано иное, то в настоящем описании остатки в CDR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки в FR) нумеруют согласно Kabat и др., выше.

«Каркасный участок» или «FR», означает остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка (CDR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности CDR и FR, как правило, имеют следующее расположение в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. В настоящем описании понятие «константная область» или «константный домен» относится к области или домену, отличному от вариабельных областей антитела. Например, антитело IgG-класса представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящий из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. В направлении от N-конца к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следует три константных домена (CH1, СН2 и СН3). Аналогично этому, в направлении от N-конца к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен легкой цепи (CL). Легкая цепь антитела в зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена может принадлежать к одному из двух типов, которые обозначают каппа (κ) и лямбда (λ).

Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, который/которая входит в его тяжелую цепь. Известно пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из этих классов можно подразделять дополнительно на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулина, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно.

В настоящем описании понятие «Fc-область» применяют для обозначения С-концевой области тяжелых цепей иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константных областей. Это понятие включает Fc-область, имеющую встречающуюся в естественных условиях последовательность, и мутант Fc-области. В одном из объектов изобретения Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается с Cys226 или с Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) или глицин-лизин (Gly446-Lys447) Fc-области может присутствовать или отсутствовать. Если специально не указано иное, то в настоящем описании нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU (которую обозначают также как EU-индекс), описанной у Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Лигандсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой полипептид, содержащий сайт расщепления. Сайт расщепления можно расщеплять, например, ферментом, можно восстанавливать восстановителем или можно подвергать фоторазложению. Сайт расщепления можно помещать в любое положение в полипептиде, если связывание лиганда лигандсвязывающей молекулой может ослаблять расщеплением сайта расщепления. Полипептид может содержать один или несколько сайтов расщепления.

Лигандсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, связывается с лигандом слабее (т.е. связывание лиганда ослабляется) в расщепленном состоянии по сравнению с нерасщепленным состоянием. В одном из вариантов осуществления изобретения, в котором связывание лиганда лигандсвязывающей молекулой основано на взаимодействии антиген-антитело, ослабление связывания лиганда можно оценивать на основе лигандсвязывающей активности лигандсвязывающей молекулы.

Лигандсвязывающую активность лигандсвязывающей молекулы можно проверять с помощью хорошо известного метода, такого как FACS, формат ELISA, скрининга методом BIACORE с использованием ALPHA (гомогенный анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции) или явления поверхностного плазмонного резонанса (SPR), или BLI (интерферометрия биослоя) (система Octet) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (11), 2006, cc. 4005-4010).

Скрининг на основе ALPHA осуществляют с применением технологии ALPHA, которая основана на описанном ниже принципе, с использованием двух типов гранул, доноров и акцепторов. Люминесцентные сигналы поддаются обнаружению только тогда, когда молекулы, связанные с гранулами-донорами, физически взаимодействуют с молекулами, связанными с гранулами-акцепторами, и когда обе гранулы находятся в непосредственной близости друг от друга. Возбужденный лазерным пучком фотосенсибилизатор в грануле-доноре превращает кислород окружающей среды в возбужденный синглетный кислород. Когда синглетный кислород диффундирует из гранулы-донора и достигает гранулы-акцептора, локализованной в непосредственной близости, то в грануле индуцируется хемилюминесцентная реакция, что в итоге приводит к испусканию света. Если молекула, связанная с гранулой-донором, не взаимодействует с молекулой, связанной с гранулой-акцептором, то хемилюминесцентная реакция не происходит, поскольку синглетный кислород, который продуцируется гранулой-донором, не достигает гранулы-акцептора.

Например, меченную биотином лигандсвязывающую молекулу связывают с гранулой-донором, а меченный глутатион-S-трансферазой (GST) лиганд связывают с гранулой-акцептором. В отсутствии немеченой конкурирующей лигандсвязывающей молекулы лигандсвязывающая молекула взаимодействует с лигандом и генерирует сигналы с длиной волны от 520 до 620 нм. Немеченая лигандсвязывающая молекула конкурирует с меченой лигандсвязывающей молекулой за взаимодействие с лигандом. Относительную аффинность связывания можно оценивать, определяя количественно снижение флуоресценции в результате конкуренции. Биотинилирование лигандсвязывающей молекулы, такой как антитело, с помощью сульфо-NHS-биотина или подобных агентов хорошо известно в данной области. Метод, который включает, например: слияние полинуклеотида, кодирующего лиганд, в рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим GST; экспрессию слитого с GST лиганда из клеток или т.п., несущих вектор, который обеспечивает экспрессию образовавшего слитого гена; и очистку слитого с GST лиганда с помощью содержащей глутатион колонки, можно соответствующим образом адаптировать, в качестве метода мечения лиганда с помощью GST. Полученные сигналы предпочтительно анализируют, например, с использованием такого программного обеспечения, как GRAPHPAD PRISM GRAPHPAD PRISM (фирма GraphPad Software, Inc., Сан-Диего), адаптированного для односайтовой модели конкуренции на основе нелинейного регрессионного анализа.

Одну из субстанций (лиганд), предназначенных для исследования взаимодействия, иммобилизуют на тонкой золотой пленке сенсорного чипа. Сенсорный чип освещают светом с задней поверхности таким образом, чтобы имело место полное отражение на границе раздела между тонкой золотой пленкой и стеклом. В результате этого в части отраженного света формируется область с пониженной интенсивностью отражения (SPR-сигнал). Другую субстанцию (аналит), предназначенную для исследования взаимодействия пропускают по поверхности сенсорного чипа, и при связывании лиганда с аналитом масса иммобилизованной молекулы-лиганда возрастает и показатель преломления растворителя на поверхности сенсорного чипа изменяется. В результате указанного изменения показателя преломления положение SPR-сигнала сдвигается (и наоборот, сигнал возвращается в исходное положение, если происходит диссоциация связанных молекул). С помощью Biacore-системы строят график, откладывая по оси ординат величину сдвига, т.е. изменение массы на поверхности сенсорного чипа, и таким образом получают в качестве результатов анализа зависимость изменения массы от времени (сенсограмму). Кинетические параметры, такие как константы скорости ассоциации (ka) и константы скорости диссоциации (kd), определяют из представленных в виде кривых сенсограмм, и рассчитывают константу диссоциации (KD) как отношение указанных констант. В качестве метода для анализа ингибирования или равновесия предпочтительно применяют также BIACORE-метод. Примеры такого метода для анализа ингибирования описаны в Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11), 2006, cc. 4005-4010, а примеры анализов равновесия описаны в Methods Enzymol. 323, 2000, cc. 325-340.

Фраза «лигандсвязывающая функция лигандсвязывающей молекулы ослабляется» означает, что количество тестируемой лигандсвязывающей молекулы, связанной с лигандом, составляет 50% или менее, предпочтительно 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 20% или менее, или 15% или менее, наиболее предпочтительно 10% или менее, 9% или менее, 8% или менее, 7% или менее, 6% или менее, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее, или 1% или менее, от количества контрольной лигандсвязывающей молекулы, связанной с лигандом, установленного на основе описанного выше метода измерения. Нужный показатель можно применять соответственно в качестве показателя активности связывания. Например, можно использовать константу диссоциации (KD). В случае применения константы диссоциации (KD) в качестве показателя при оценке активности связывания, более высокая величина константы диссоциации (KD), характеризующей связывание лиганда тестируемой лигандсвязывающей молекулой, по сравнению с величиной, характеризующей связывание лиганда контрольной лигандсвязывающей молекулой, означает, что тестируемая лигандсвязывающая молекула обладает более слабой активностью связывания лиганда, чем контрольная лигандсвязывающая молекула. Фраза «лигандсвязывающая функция ослабляется» означает, что величина константы диссоциации (KD), характеризующей связывание лиганда тестируемой лигандсвязывающей молекулой, выше по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере 5 раз или по меньшей мере в 10 раз, особенно предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, чем величина константы диссоциации (KD), характеризующей связывание лиганда контрольной лигандсвязывающей молекулой.

Примеры контрольной лигандсвязывающей молекулы включают нерасщепленную форму лигандсвязывающей молекулы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения лиганд высвобождается из лигандсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, в результате расщепления сайта расщепления в лигандсвязывающей молекуле. В этом контексте, когда лиганд, связан с участком лигандсвязывающей молекулы через линкер, который не имеет сайта расщепления, то лиганд высвобождается, будучи соединенным с указанным участком лигандсвязывающей через линкер (см. фиг. 1). Даже, когда лиганд высвобождается вместе с участком лигандсвязывающей молекулы, как указано выше, то можно считать, что лиганд высвобождается из лигандсвязывающей молекулы, если лиганд освобожден от большей части лигандсвязывающей молекулы.

Метод детекции высвобождения лиганда из лигандсвязывающей молекулы путем расщепления сайта расщепления включает метод детекции с использованием лиганда, например, антитела для детекции лиганда, которое распознает лиганд. Когда лигандсвязывающая молекула представляет собой фрагмент антитела, то антитело для детекции лиганда предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что и эпитоп для лигандсвязывающей молекулы. Лиганд, выявленный с использованием антитела для детекции лиганда, можно определять с помощью хорошо известного метода, такого как FACS, формат ELISA, скрининга методом BIACORE с использованием ALPHA (гомогенный анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции) или явления поверхностного плазмонного резонанса (SPR), или BLI (интерферометрия биослоя) (система Octet) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (11), 2006, cc. 4005-4010).

В случае, когда для оценки высвобождения лиганда используют, например, систему Octet, то антитело, предназначенное для детекции лиганда, которое распознает лиганд, биотинилируют и приводят в контакт с биосенсором. Затем можно измерять связывание лиганда в образце для оценки высвобождения лиганда. В частности, количество лиганда измеряют в образце, содержащем лигандсвязывающую молекулу до обработки протеазой и после обработки протеазой и лиганд, с использованием антитела, предназначенного для детекции лиганда. Количество лиганда, обнаруженное в образце, можно сравнивать до и после обработки протеазой, определяя высвобождение лиганда. Альтернативно этому, количество лиганда измеряют в образце, содержащем протеазу, лигандсвязывающую молекулу и лиганд, и образце, содержащем лигандсвязывающую молекулу и лиганд, но не содержащем протеазу, применяя антитело, предназначенное для детекции лиганда. Количество лиганда, обнаруженное в образце, можно сравнивать в присутствии протеазы и без нее для оценки высвобождения лиганда. Более конкретно, высвобождение лиганда можно оценивать с помощью метода, описанного в разделе «Примеры» в настоящем описании. Когда лигандсвязывающую молекулу сливают с лигандом с получением слитого белка, то количество лиганда измеряют в образце, содержащем слитый белок, до обработки протеазой или после обработки протеазой, используя антитело, применяемое для детекции лиганда. Для оценки высвобождения лиганда можно сравнивать количества лиганда, обнаруженные в образце до и после обработки протеазой. Альтернативно этому, количество лиганда измеряют в образце, содержащем протеазу и слитый белок, и в образце, содержащем слитый белок, но не содержащем протеазу, применяя антитело, предназначенное для детекции лиганда. Количество лиганда, обнаруженное в образце, можно сравнивать в присутствии протеазы и без нее для оценки высвобождения лиганда. Более конкретно, высвобождение лиганда можно оценивать с помощью метода, описанного в разделе «Примеры» в настоящем описании.

В варианте осуществления изобретения, в котором физиологическую активность лиганда ингибируют посредством связывания с лигандсвязывающей молекулой, высвобождение из лигандсвязывающей молекулы можно оценивать с помощью метода измерения физиологической активности лиганда в образце. В частности, физиологическую активность лиганда можно измерять в образце, содержащем лигандсвязывающую молекулу, до обработки протеазой и после обработки протеазой и лиганд, и осуществляя сравнение до и после обработки протеазой для оценки высвобождения лиганда. Альтернативно этому, физиологическую активность лиганда можно измерять в образце, содержащем протеазу, лигандсвязывающую молекулу и лиганд, и в образце, содержащем лигандсвязывающую молекулу и лиганд, но не содержащем протеазу, осуществляя сравнение этих образцов для оценки высвобождения лиганда. Когда лигандсвязывающую молекулу сливают с лигандом с получением слитого белка, физиологическую активность лиганда можно измерять в образце, содержащем слитый белок, до обработки протеазой или после обработки протеазой, и осуществляя сравнение до и после обработки протеазой для оценки высвобождения лиганда. Альтернативно этому, физиологическую активность лиганда можно измерять в образце, содержащем протеазу и слитый белок, и в образце, содержащем слитый белок, но не содержащем протеазу, и осуществлять сравнение между этими образцами для оценки высвобождения лиганда.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сайт расщепления содержит расщепляемую протеазой последовательность и расщепляется протеазой.

В настоящем описании понятие «протеаза» относится к ферменту, такому как эндопептидаза или экзопептидаза, который гидролизует пептидную связь, как правило, эндопептидаза. Протеаза, применяемая в настоящем изобретении, ограничена только способностью расщеплять последовательность, расщепляемую протеазой, и практически не ограничена ее типом. В некоторых вариантах осуществления изобретения применяют специфическую для ткани-мишени протеазу. Специфическая для ткани-мишени протеаза может представлять собой, например, любую из следующих протеаз:

(1) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в ткани-мишени, чем в обычных тканях,

(2) протеазу, которая обладает более высокой активностью в ткани-мишени, чем в обычных тканях,

(3) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в клетках-мишенях, чем в обычных клетках, и

(4) протеазу, которая обладает более высокой активностью в клетках-мишенях, чем в обычных клетках.

В более конкретном варианте осуществления изобретения применяют специфическую для раковой ткани протеазу или специфическую для воспалительной ткани протеазу.

В настоящем описании понятие «ткань-мишень» относится к ткани, содержащей по меньшей мере одну клетку-мишень. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ткань-мишень представляет собой раковую ткань. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ткань-мишень представляет собой воспалительную ткань.

Понятие «раковая ткань» относится к ткани, содержащей по меньшей мере одну раковую клетку. Таким образом, с учетом того, что, например, раковая ткань содержит раковые клетки и кровеносные сосуды, каждый тип клеток, который принимает участие в формировании опухолевой массы, содержащей раковые клетки и эндотелиальные клетки, подпадает под объем настоящего изобретения. В настоящем описании опухолевая масса относится к очагу опухолевой ткани. Понятие «опухоль», как правило, применяют для обозначения доброкачественной неоплазмы или злокачественной неоплазмы.

В настоящем описании примеры «воспалительной ткани» включают:

суставную ткань при ревматоидном артрите или остеоартрите,

легочную (альвеолярную) ткань при бронхиальной астме или COPD,

ткань органа пищеварительной системы при воспалительном заболевании кишечника, болезни Крона или неспецифическом язвенном колите,

фиброзную ткань при фиброзе печени, почки или легкого,

ткань после отторжения трансплантата органа,

ткань кровеносного сосуда или сердца (сердечная мышца) при артериосклерозе или сердечной недостаточности,

висцеральную жировую ткань при метаболическом синдроме,

кожную ткань при атопическом дерматите и других дерматитах, и

ткань спинномозгового нерва при грыже диска или хроническом люмбаго.

В частности, специфически экспрессируемая или специфически активируемая протеаза или протеаза, которая рассматривается в качестве связанной с болезненным состоянием ткани-мишени (специфическая для ткани-мишени протеаза), известна для некоторых типов тканей-мишеней. Например, в публикациях международных заявок на патент WO 2013/128194, WO 2010/081173 и WO 2009/025846 описана протеаза, специфически экспрессируемая в раковой ткани. Кроме того, в J Inflamm (Lond). 7, 2010, с. 45, Nat Rev Immunol. 6 (7), июль 2006 г., cc. 541-550, Nat Rev Drug Discov. 13 (12), декабрь 2014 г., cc. 904-927, Respir Res. 17, 4 марта 2016 г., с. 23, Dis Model Mech. 7 (2), февраль 2014 г., cc. 193-203 и Biochim Biophys Acta. 1824 (1), январь 2012 г., cc. 133-145 описана протеаза, которая, как считается, связана с воспалением.

Помимо протеазы, специфически экспрессируемой в ткани-мишени, существует также протеаза, специфически активируемая в ткани-мишени. Например, протеаза может экспрессироваться в неактивной форме и затем превращаться в активную форму. Многие ткани содержат субстанцию, ингибирующую активную протеазу и контролирующую активность в результате процесса активации и присутствия ингибитора (Nat Rev Cancer. 3 (7), июль 2003 г., cc. 489-501). В ткани-мишени активная протеаза может специфически активироваться, избегая ингибирования.

Активную протеазу можно оценивать путем применения метода с использованием антитела, распознающего активную протеазу (PNAS 110 (1), 2 января 2013 г., сс. 93-98), или метода с использованием флуоресцентно меченого пептида, распознаваемого протеазой, флуоресцентность которого гасится перед расщеплением, но испускается после расщепления (Nat Rev Drug Discov. 9 (9), сентябрь 2010, cc. 690-701. doi: 10.1038/nrd3053).

Согласно одной из точек зрения понятие «специфическая для ткани-мишени протеаза» может относиться к любой из следующих протеаз:

(I) протеаза, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в ткани-мишени, чем в обычных тканях,

(II) протеаза, которая обладает более высокой активностью в ткани-мишени, чем в обычных тканях,

(III) протеаза, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в клетках-мишенях, чем в обычных клетках, и

(IV) протеаза, которая обладает более высокой активностью в клетках-мишенях, чем в обычных клетках.

Конкретные примеры протеазы включают (но, не ограничиваясь только ими) цистеиновую протеазу (включая семейства катепсина В, L, S и т.д.),

аспартилпротеазу (катепсины D, Е, K, О и т.д.), сериновую протеазу (включая матриптазу (в том числе MT-SP1), катепсины А и G, тромбин, плазмин, урокиназу (uPA), тканевый активатор плазминогена (tPA), эластазу, протеиназу 3, тромбин, калликреин, триптазу и химазу), металлопротеиназу (металлопротеиназу (ММР1-28), включая как связанные с мембраной формы (ММР14-17 и ММР24-25), так и секретируемые формы (ММР1-13, ММР18-23 и ММР26-28), дизинтегрин и металлопротеиназа (ADAM), дизинтегрин и металлопротеиназу с мотивами тромбоспондина (ADAMTS), меприн (меприн альфа и меприн бета), CD 10 (CALLA), простатический антиген (PSA), легумаин, TMPRSS3, TMPRSS4, человеческую эластазу нейтрофилов (HNE), бета секретазу (ВАСЕ), фибробласт-активирующий белок альфа (FAP), гранзим В, гуанидинобензоатазу (GB), гепсин, неприлизин, NS3/4A, HCV-NS3/4, калпаин, ADAMDEC1, ренин, катепсин С, катепсин V/L2, катепсин X/Z/P, крузипаин, отубаин 2, родственные калликреину пептидазы (KLKs (KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK10, KLK11, KLK13 и KLK14)), белок, участвующий в остеогенезе 1 (ВМР-1), активированный белок С, связанную с коагуляцией крови протеазу (фактор VIIa, фактор IXa, фактор Ха, фактор XIa и фактор XIIa), HtrA1, лактоферрин, марапсин, РАСЕ4, DESC1, дипептидилпептидазу 4 (DPP-4), TMPRSS2, катепсин F, катепсин Н, катепсин L2, катепсин О, катепсин S, гранзим А, гепсин, калпаин 2, глутаматкарбоксипептидазу 2, AMSH-подобные протеазы, AMSH, гамма секретазу, антиплазминрасщепляющий фермент (АРСЕ), децисин 1, фермент, подобный N-ацетилированной альфа-связанной кислой дипептидазе 1 (NAALADL1) и фурин.

Согласно другой точке зрения понятие «специфическая для ткани-мишени протеаза» может относиться к специфической для раковой ткани протеазе или специфической для воспалительной ткани протеазе.

Примеры специфической для раковой ткани протеазы включают протеазу, которая специфически экспрессируется в раковой ткани, описанную в публикациях международных заявок на патент WO 2013/128194, WO 2010/081173 и WO 2009/025846.

Касательно типа специфической для раковой ткани протеазы обработка протеазой, которая обладает более высокой специфичностью экспрессии в раковой ткани, является более эффективной для снижения нежелательных реакций. Предпочтительная специфическая для раковой ткани протеаза имеет концентрацию в раковой ткани, превышающую по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 500 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз ее концентрацию в здоровых тканях. Кроме того, предпочтительная специфическая для раковой ткани протеаза имеет активность в раковой ткани, превышающую по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, особенно предпочтительно по меньшей мере в 500 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз ее активность в здоровых тканях.

Специфическая для раковой ткани протеаза может находиться в форме, связанной с мембраной раковой клетки, или может находиться в секретируемой внеклеточной форме, не связанной с клеточной мембраной. Когда специфическая для раковой ткани протеаза не связана с мембраной раковой клетки, то это является предпочтительным для опосредуемой иммуноцитом цитотоксичности, специфической для раковых клеток, поскольку специфическая для раковой ткани протеаза должна присутствовать в раковой ткани или в непосредственной близости от нее. В настоящем описании понятие «в непосредственной близости от раковой ткани» означает местоположение, в котором расщепляемая протеазой последовательность, специфическая для раковой ткани, расщепляется таким образом, чтобы проявлять эффект снижения лигандсвязывающей активности. Однако предпочтительно, чтобы повреждение здоровых клеток в данном местоположении было минимизировано.

Согласно другой точки зрения специфическая для раковой ткани протеаза представляет собой любую из следующих протеаз:

(I) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в раковой ткани, чем в здоровых тканях,

(II) протеазу, которая обладает более высокой активностью в раковой ткани, чем в здоровых тканях,

(III) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в раковых клетках, чем в здоровых клетках, и

(IV) протеазу, которая обладает более высокой активностью в раковых клетках, чем в здоровых клетках.

Один тип специфической для раковой ткани протеазы можно применять индивидуально или можно объединять два или большее количество типов специфических для раковой ткани протеаз. Количество типов специфической для раковой ткани протеазы могут определять соответственно специалисты в данной области с учетом типа рака, подлежащего лечению.

Исходя из указанных точек зрения, специфическая для раковой ткани протеаза предпочтительно представляет собой сериновую протеазу или металлопротеиназу, более предпочтительно матриптазу (включая MT-SP1), урокиназу (uPA) или металлопротеиназу, предпочтительно также MT-SP1, uPA, ММР2 или ММР9, из перечисленных выше протеаз.

Касательно типа специфической для воспалительной ткани протеазы обработка протеазой, которая обладает более высокой специфичностью экспрессии в воспалительной ткани, является более эффективной для снижения нежелательных реакций. Предпочтительная специфическая для воспалительной ткани протеаза имеет концентрацию в воспалительной ткани, превышающую по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 500 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз ее концентрацию в здоровых тканях. Кроме того, предпочтительная специфическая для воспалительной ткани протеаза имеет активность в воспалительной ткани, превышающую по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, особенно предпочтительно по меньшей мере в 500 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз ее активность в здоровых тканях.

Специфическая для воспалительной ткани протеаза может находиться в форме, связанной с мембраной воспалительной клетки, или может находиться в секретируемой внеклеточной форме, не связанной с клеточной мембраной. Когда специфическая для воспалительной ткани протеаза не связана с мембраной воспалительной клетки, то это является предпочтительным для опосредуемой иммуноцитом цитотоксичности, специфической для воспалительных клеток, поскольку специфическая для воспалительной ткани протеаза должна присутствовать в воспалительной ткани или в непосредственной близости от нее. В настоящем описании понятие «в непосредственной близости от воспалительной ткани» означает местоположение, в котором расщепляемая протеазой последовательность, специфическая для воспалительной ткани, расщепляется таким образом, чтобы проявлять эффект снижения лигандсвязывающей активности. Однако предпочтительно, чтобы повреждение здоровых клеток в данном местоположении было минимизировано.

Согласно другой точки зрения специфическая для раковой ткани протеаза представляет собой любую из следующих протеаз:

(I) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в воспалительной ткани, чем в здоровых тканях,

(II) протеазу, которая обладает более высокой активностью в воспалительной ткани, чем в здоровых тканях,

(III) протеазу которая отличается более высоким уровнем экспрессии в воспалительных клетках, чем в здоровых клетках, и

(IV) протеазу, которая обладает более высокой активностью в воспалительных клетках, чем в здоровых клетках.

Один тип специфической для воспалительной ткани протеазы можно применять индивидуально или можно объединять два или большее количество типов специфических для воспалительной ткани протеаз. Количество типов специфической для воспалительной ткани протеазы могут определять соответственно специалисты в данной области с учетом патологического состояния, подлежащего лечению.

Исходя из указанных точек зрения, специфическая для воспалительной ткани протеаза предпочтительно из перечисленных выше протеаз представляет собой металлопротеиназу. Металлопротеиназа более предпочтительно представляет собой ADAMTS5, ММР2, ММР7, ММР9 или ММР13.

Расщепляемая протеазой последовательность представляет собой конкретную аминокислотную последовательность, которая специфически распознается специфической для ткани-мишени протеазой, когда полипептид гидролизуется специфической для ткани-мишени протеазой в водном растворе.

Расщепляемая протеазой последовательность предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, которая гидролизуется с высокой специфичностью протеазой, специфической для ткани-мишени, более специфически экспрессируемой в ткани-мишени или клетках-мишенях, подлежащих обработке, или более специфически активируемой в ткани/клетках-мишенях, подлежащих обработке, с точки зрения снижения нежелательных реакций.

Конкретные примеры расщепляемой протеазой последовательности включают последовательности-мишени, которые специфически гидролизуются с помощью указанной выше протеазы, специфически экспрессируемой в раковой ткани, которые описаны в публикациях международных заявок на патент WO 2013/128194, WO 2010/081173 и WO 2009/025846, специфической для воспалительной ткани протеазой и т.п. Можно применять также последовательность, искусственно измененную, например, путем соответствующей интродукции аминокислотной мутации в последовательность-мишень, которая специфически гидролизуется известной протеазой. Альтернативно этому, можно применять расщепляемую протеазой последовательность, идентифицированную с помощью метода, известного специалистам в данной области, который описан в Nature Biotechnology 19, 2001, cc. 661-667.

Кроме того, можно применять встречающуюся в естественных условиях расщепляемую протеазой последовательность. Например, TGFβ превращают в латентную форму путем расщепления протеазой. Аналогично этому, можно применять расщепляемую протеазой последовательность в белке, который изменяет молекулярную форму при расщеплении протеазой.

Примеры расщепляемой протеазой последовательности, которые можно применять, включают (но, не ограничиваясь только ими) последовательности, описанные в публикациях международных заявок на патент WO 2015/116933, WO 2015/048329, WO 2016/118629, WO 2016/179257, WO 2016/179285, WO 2016/179335, WO 2016/179003, WO 2016/046778, WO 2016/014974, в публикациях патентов США US 2016/0289324, US 2016/0311903, в PNAS 97, 2000, cc. 7754-7759, Biochemical Journal 426, 2010, cc. 219-228, и Beilstein J Nanotechnol. 7, 2016, cc. 364-373.

Расщепляемая протеазой последовательность более предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, которая специфически гидролизуется с помощью приемлемой для ткани-мишени специфической протеазы, упомянутой выше. Аминокислотная последовательность, которая специфически гидролизуется с помощью специфической для ткани-мишени протеазы, предпочтительно представляет собой любую из следующих аминокислотных последовательностей:

LSGRSDNH (SEQ ID NO: 3, расщепляемая MT-SP1 или uPA),

PLGLAG (SEQ ID NO: 34, расщепляемая MMP2 или ММР9) и

VPLSLTMG (SEQ ID NO: 35, расщепляемая MMP7).

Любую из приведенных ниже последовательностей можно применять также в качестве расщепляемой протеазой последовательности:

TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 66, расщепляемая MT-SP1 или uPA),

ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 67, расщепляемая MT-SP1 или uPA),

AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 68, расщепляемая MT-SP1 или uPA),

GAGVPMSMRGGAG (SEQ ID NO: 69, расщепляемая MMP1),

GAGIPVSLRSGAG (SEQ ID NO: 70, расщепляемая MMP2),

GPLGIAGQ (SEQ ID NO: 71, расщепляемая MMP2),

GGPLGMLSQS (SEQ ID NO: 72, расщепляемая MMP2),

PLGLWA (SEQ ID NO: 73, расщепляемая MMP2),

GAGRPFSMIMGAG (SEQ ID NO: 74, расщепляемая MMP3),

GAGVPLSLTMGAG (SEQ ID NO: 75, расщепляемая MMP7),

GAGVPLSLYSGAG (SEQ ID NO: 76, расщепляемая MMP9),

AANLRN (SEQ ID NO: 77, расщепляемая MMP11),

AQAYVK (SEQ ID NO: 78, расщепляемая MMP11),

AANYMR (SEQ ID NO: 79, расщепляемая MMP11),

AAALTR (SEQ ID NO: 80, расщепляемая MMP11),

AQNLMR (SEQ ID NO: 81, расщепляемая MMP11),

AANYTK (SEQ ID NO: 82, расщепляемая MMP11),

GAGPQGLAGQRGIVAG (SEQ ID NO: 83, расщепляемая MMP13),

PRFKIIGG (SEQ ID NO: 84, расщепляемая проурокиназой),

PRFRIIGG (SEQ ID NO: 85, расщепляемая проурокиназой),

GAGSGRSAG (SEQ ID NO: 86, расщепляемая uPA),

SGRSA (SEQ ID NO: 87, расщепляемая uPA),

GSGRSA (SEQ ID NO: 88, расщепляемая uPA),

SGKSA (SEQ ID NO: 89, расщепляемая uPA),

SGRSS (SEQ ID NO: 90, расщепляемая uPA),

SGRRA (SEQ ID NO: 91, расщепляемая uPA),

SGRNA (SEQ ID NO: 92, расщепляемая uPA),

SGRKA (SEQ ID NO: 93, расщепляемая uPA),

QRGRSA (SEQ ID NO: 94, расщепляемая tPA),

GAGSLLKSRMVPNFNAG (SEQ ID NO: 95, расщепляемая катепсином В)

TQGAAA (SEQ ID NO: 96, расщепляемая катепсином В),

GAAAAA (SEQ ID NO: 97, расщепляемая катепсин В),

GAGAAG (SEQ ID NO: 98, расщепляемая катепсином В),

AAAAAG (SEQ ID NO: 99, расщепляемая катепсином В),

LCGAAI (SEQ ID NO: 100, расщепляемая катепсином В),

FAQALG (SEQ ID NO: 101, расщепляемая катепсином В),

LLQANP (SEQ ID NO: 102, расщепляемая катепсином В),

LAAANP (SEQ ID NO: 103, расщепляемая катепсином В),

LYGAQF (SEQ ID NO: 104, расщепляемая катепсином В),

LSQAQG (SEQ ID NO: 105, расщепляемая катепсином В),

ASAASG (SEQ ID NO: 106, расщепляемая катепсином В),

FLGASL (SEQ ID NO: 107, расщепляемая катепсином В),

AYGATG (SEQ ID NO: 108, расщепляемая катепсином В),

LAQATG (SEQ ID NO: 109, расщепляемая катепсином В),

GAGSGVVIATVIVITAG (SEQ ID NO: 110, расщепляемая катепсином L),

APMAEGGG (SEQ ID NO: 111, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),

EAQGDKII (SEQ ID NO: 112, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),

LAFSDAGP (SEQ ID NO: 113, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),

YVADAPK (SEQ ID NO: 114, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),

RRRRR (SEQ ID NO: 115, расщепляемая фурином),

RRRRRR (SEQ ID NO: 116, расщепляемая фурином),

GQSSRHRRAL (SEQ ID NO: 117, расщепляемая фурином),

SSRHRRALD (SEQ ID NO: 118),

RKSSIIIRMRDVVL (SEQ ID NO: 119, расщепляемая плазминогеном),

SSSFDKGKYKKGDDA (SEQ ID NO: 120, расщепляемая стафилокиназой),

SSSFDKGKYKRGDDA (SEQ ID NO: 121, расщепляемая стафилокиназой),

IEGR (SEQ ID NO: 122, расщепляемая фактором IXa),

IDGR (SEQ ID NO: 123, расщепляемая фактором IXa),

GGSIDGR (SEQ ID NO: 124, расщепляемая фактором IXa),

GPQGIAGQ (SEQ ID NO: 125, расщепляемая коллагеназой),

GPQGLLGA (SEQ ID NO: 126, расщепляемая коллагеназой),

GIAGQ (SEQ ID NO: 127, расщепляемая коллагеназой),

GPLGIAG (SEQ ID NO: 128, расщепляемая коллагеназой),

GPEGLRVG (SEQ ID NO: 129, расщепляемая коллагеназой),

YGAGLGVV (SEQ ID NO: 130, расщепляемая коллагеназой),

AGLGVVER (SEQ ID NO: 131, расщепляемая коллагеназой),

AGLGISST (SEQ ID NO: 132, расщепляемая коллагеназой),

EPQALAMS (SEQ ID NO: 133, расщепляемая коллагеназой),

QALAMSAI (SEQ ID NO: 134, расщепляемая коллагеназой),

AAYHLVSQ (SEQ ID NO: 135, расщепляемая коллагеназой),

MDAFLESS (SEQ ID NO: 136, расщепляемая коллагеназой),

ESLPVVAV (SEQ ID NO: 137, расщепляемая коллагеназой),

SAPAVESE (SEQ ID NO: 138, расщепляемая коллагеназой),

DVAQFVLT (SEQ ID NO: 139, расщепляемая коллагеназой),

VAQFVLTE (SEQ ID NO: 140, расщепляемая коллагеназой),

AQFVLTEG (SEQ ID NO: 141, расщепляемая коллагеназой),

PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 142, расщепляемая коллагеназой),

LVPRGS (SEQ ID NO: 143, расщепляемая тромбином) и

TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 345).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения к одному из концов или к обоим концам распознаваемой протеазой последовательности дополнительно присоединяют гибкий линкер. Гибкий линкер на одном конце расщепляемой протеазой последовательности можно обозначать как первый гибкий линкер, а гибкий линкер на другом конце можно обозначать как второй гибкий линкер. В конкретном варианте осуществления применяют одну из следующих комбинаций расщепляемой протеазой последовательности и гибкого линкера:

(расщепляемая протеазой последовательность),

(первый гибкий линкер)-(расщепляемая протеазой последовательность),

(расщепляемая протеазой последовательность)-(второй гибкий линкер), и

(первый гибкий линкер)-(расщепляемая протеазой последовательность)-(второй гибкий линкер).

Гибкий линкер, указанный в данном варианте осуществления изобретения, предпочтительно представляет собой пептидный линкер. Первый гибкий линкер и второй гибкий линкер каждый присутствует независимо и произвольно, и они представляют собой идентичные или различные гибкие линкеры, каждый из которых содержит по меньшей мере одну гибкую аминокислоту (Gly и т.д.). Гибкий линкер содержит, например, достаточное количество остатков (аминокислоты, произвольно выбранные из Arg, Ile, Gln, Glu, Cys, Tyr, Trp, Thr, Val, His, Phe, Pro, Met, Lys, Gly, Ser, Asp, Asn, Ala и т.д., прежде всего Gly, Ser, Asp, Asn и Ala, в частности, Gly и Ser, особенно предпочтительно Gly и т.д.) для расщепляемой протеазой последовательности для получения требуемой доступности протеазы.

Гибкий линкер, который можно применять на обоих концах расщепляемой протеазой последовательности, как правило, представляет собой гибкий линкер, который облегчает доступ протеазы к расщепляемой протеазой последовательности и повышает расщепляющую эффективность протеазы. Приемлемый гибкий линкер можно легко выбирать и его можно предпочтительно выбирать из линкеров различной длины, таких как имеющие длину от 1 аминокислоты (Gly и т.д.) до 20 аминокислот, от 2 аминокислот до 15 аминокислот или от 3 аминокислот до 12 аминокислот, в том числе от 4 аминокислот до 10 аминокислот от 5 аминокислот до 9 аминокислот, от 6 аминокислот до 8 аминокислот или от 7 аминокислот до 8 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гибкий линкер представляет собой пептидный линкер, состоящий из 1-7 аминокислот.

Примеры гибкого линкера включают (но, не ограничиваясь только ими) глициновые полимеры (G)n, глицин-сериновые полимеры (включая, например, (GS)n, (GSGGS: SEQ ID NO: 45)n и (GGGS: SEQ ID NO: 36)n, в которых n обозначает целое число, равное по меньшей мере 1), глицин-аланиновые полимеры, аланин-сериновые полимеры и другие гибкие линкеры, широко применяемые в общепринятых методиках.

Среди них глициновые и глицин-сериновые полимеры заслуживают внимания в связи с тем, что эти аминокислоты являются относительно неструктурированными и способны функционировать в виде нейтральных связок между компонентами.

Примеры гибкого линкера, состоящего из глицин-серинового полимера, могут включать (но, не ограничиваясь только ими)

где n обозначает целое число 1 или более.

Однако длину и последовательность пептидного линкера могут выбирать соответственно специалисты в данной области в зависимости от цели.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лигандсвязывающая молекула содержит VH антитела и VL антитела. Примеры лигандсвязывающей молекулы, содержащей VH и VL, включают (но, не ограничиваясь только ими) Fv, scFv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ и полные антитела.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лигандсвязывающая молекула содержит Fc-область. В случае применения Fc-области антитела IgG-класса, ее тип не ограничен, и, например, можно использовать Fc-область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Можно применять, например, Fc-область, содержащую одну последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 55, 56, 57 и 58, или мутантную Fc-область, полученную путем внесения изменения в Fc-область. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лигандсвязывающая молекула содержит константную область антитела.

В некоторых более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения лигандсвязывающая молекула представляет собой антитело. В случае применения антитела в качестве лигандсвязывающей молекулы, связывание с лигандом обеспечивается вариабельной областью. В некоторых дополнительных конкретных вариантах осуществления изобретения лигандсвязывающая молекула представляет собой антитело IgG-класса. В случае применения антитела IgG-класса в качестве лигандсвязывающей молекулы его тип не ограничен и можно применять IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или т.п. В случае применения антитела IgG-класса в качестве лигандсвязывающей молекулы связывание с лигандом также обеспечивается вариабельной областью. Одна из двух вариабельных областей или обе вариабельные области антитела IgG-класса могут обеспечивать связывание с лигандом.

В некоторых более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения домен, обладающий лигандсвязывающей активностью, отделяют от лигандсвязывающей молекулы путем расщепления сайта расщепления или расщепляемой протеазой последовательности в лигандсвязывающей молекулы, в результате чего связывание с лигандом ослабляется. В одном из вариантов осуществления изобретения при применении антитела IgG-класса в качестве лигандсвязывающей молекулы, например, сайт расщепления или расщепляемую протеазой последовательность создают в вариабельной области антитела, и полная вариабельная область антитела не может образовываться в расщепленном состоянии, в результате связывание с лигандом ослабляется.

В настоящем описании понятие «ассоциация» может относиться, например, к состоянию, в котором две или большие количество полипептидных областей взаимодействуют друг с другом. Как правило, гидрофобная связь, водородная связь, ионная связь или т.п. образуется между требуемыми пептидными областям с формированием ассоциации. В качестве одного из примеров обычной ассоциации, известно, что антитело, представляющее собой встречающееся в естественных условиях антитело, сохраняет спаренную структуру вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) благодаря нековалентной связи или т.п. между ними.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения VH и VL, содержащиеся в лигандсвязывающей молекуле, ассоциируют друг с другом. Ассоциация между VH антитела и VL антитела может аннулироваться, например, путем расщепления сайта расщепления или расщепляемой протеазой последовательности. Аннулирование ассоциации можно применять взаимозаменяемо, например, с полным или частичным аннулированием состояния, при котором две или большее количество полипептидных областей взаимодействуют друг с другом. Для аннулирования ассоциации между VH и VL взаимодействие между VH и VL может быть полностью аннулировано, или взаимодействие между VH и VL может быть частично аннулировано.

Лигандсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой лигандсвязывающую молекулу, в которой ассоциация между VL антитела или ее частью и VH антитела или ее частью аннулирована посредством расщепления сайта расщепления или аннулирована посредством расщепления протеазой расщепляемой протеазой последовательности.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лигандсвязывающая молекула содержит VH антитела и VL антитела, и VH антитела и VL антитела в лигандсвязывающей молекуле ассоциированы друг с другом в состоянии, в котором сайт расщепления или расщепляемая протеазой последовательность лигандсвязывающей молекулы не расщеплены, при этом ассоциация между VH антитела и VL антитела в лигандсвязывающей молекуле аннулируется расщеплением сайта расщепления или расщепляемой протеазой последовательности. Сайт расщепления или расщепляемую протеазой последовательность в лигандсвязывающей молекуле можно помещать в любое положение в лигандсвязывающей молекуле, если связывание лиганда лигандсвязывающей молекулой может ослабляться путем расщепления сайта расщепления или расщепляемой протеазой последовательности.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лигандсвязывающая молекула содержит VH антитела, VL антитела и константную область антитела.

Как отмечено у Rothlisberger и др., J Mol Biol. 347 (4), 8 апреля 2005 г., сс. 773-789, известно, что VH- и VL-домены или СН- и CL-домены антитела взаимодействуют друг с другом через несколько боковых цепей аминокислот. Известно, что VH-CH1 и VL-CL обладают способностью образовывать стабильную структуру в виде Fab-домена. Как описано ранее, как правило, взаимодействие между VH и VL осуществляется через боковые цепи аминокислот и характеризуется константной диссоциации, составляющей от 10^-5М до 10^-8М. Когда присутствуют только VH- и VL-домены, то лишь небольшая их часть может находиться в ассоциированном состоянии.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лигандсвязывающую молекулу создают так, чтобы сайт расщепления или расцепляемая протеазой последовательность присутствовал/присутствовала в лигандсвязывающей молекуле, содержащей VH антитела и VL антитела, и чтобы полное взаимодействие тяжелая цепь-легкая цепь имело место между двумя пептидами в Fab-структуре до расщепления, при этом взаимодействие между пептидом, содержащим VH (или часть VH), и пептидом, содержащим VL (или часть VL), ослаблялось посредством расщепления сайта расщепления или расщепляемой протеазой последовательности, в результате чего ассоциация между VH и VL аннулировалась.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сайт расщепления или расщепляемая протеазой последовательность локализован/локализована в константной области антитела. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения сайт расщепления или расщепляемая протеазой последовательность локализован/локализована со стороны вариабельной области относительно аминокислотного положения 140 (EU-нумерация) в константной области тяжелой цепи антитела, предпочтительно со стороны вариабельной области относительно аминокислотного положения 122 (EU-нумерация) в константной области тяжелой цепи антитела. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения сайт расщепления или расщепляемую протеазой последовательность встраивают в любое положение в последовательности от аминокислотного положения 118 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела до аминокислотного положения 140 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения сайт расщепления или расщепляемую протеазой последовательность локализован/локализована со стороны вариабельной области относительно аминокислотного положения 130 (EU-нумерация) (номер положения 130 по Кэботу) в константной области легкой цепи антитела, предпочтительно со стороны вариабельной области относительно аминокислотного положения 113 (EU-нумерация) (номер положения 113 по Кэботу) в константной области легкой цепи антитела, или со стороны вариабельной области относительно аминокислотного положения 112 (EU-нумерация) (номер положения 112 по Кэботу) в константной области легкой цепи антитела. В некоторых более конкретных вариантах осуществления изобретения сайт расщепления или расщепляемую протеазой последовательность встраивают в любое положение в последовательности от аминокислотного положения 108 (EU-нумерация) (номер положения 108 по Кэботу) в константной области легкой цепи антитела до аминокислотного положения 131 (EU-нумерация) (номер положения 131 по Кэботу) в константной области легкой цепи антитела.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сайт расщепления или расщепляемая протеазой последовательность локализован/локализована в VH антитела или VL антитела. В более конкретном варианте осуществления изобретения сайт расщепления или расщепляемая протеазой последовательность локализован/локализована со стороны константной области антитела относительно аминокислотного положения 7 (нумерация по Кэботу) VH антитела, предпочтительно со стороны константной области антитела относительно аминокислотного положения 40 (нумерация по Кэботу) VH антитела, более предпочтительно со стороны константной области антитела относительно аминокислотного положения 101 (нумерация по Кэботу) VH антитела, еще более предпочтительно со стороны константной области антитела относительно аминокислотного положения 109 (нумерация по Кэботу) VH антитела, или со стороны константной области антитела относительно аминокислотного положения 111 (нумерация по Кэботу) VH антитела. В более конкретном варианте осуществления изобретения сайт расщепления или расщепляемая протеазой последовательность локализован/локализована со стороны константной области антитела относительно аминокислотного положения 7 (нумерация по Кэботу) VL антитела, предпочтительно со стороны константной области антитела относительно аминокислотного положения 39 (нумерация по Кэботу) VL антитела, более предпочтительно со стороны константной области антитела относительно аминокислотного положения 96 (нумерация по Кэботу) VL антитела, еще более предпочтительно со стороны константной области антитела относительно аминокислотного положения 104 (нумерация по Кэботу) VL антитела, или со стороны константной области антитела относительно аминокислотного положения 105 (нумерация по Кэботу) VL антитела.

В некоторых более конкретных вариантах осуществления изобретения сайт расщепления или расщепляемую протеазой последовательность встраивают в положение остатков, которые образуют структуру типа петли в VH антитела или в VL антитела, и остатков, примыкающих к структуре типа петли. Структура типа петли в VH антитела или VL антитела означает фрагмент, который не образует вторичную структуру, такую как α-спираль или β-складка, в VH антитела или VL антитела. В частности, положение остатков, образующих структуру типа петли, и остатков, примыкающих к структуре типа петли, может означать диапазон от аминокислотного положения 7 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 16 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 40 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 47 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 55 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 69 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 73 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 79 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 83 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 89 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 95 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 99 (нумерация по Кэботу) или от аминокислотного положения 101 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 113 (нумерация по Кэботу) в VH антитела, или от аминокислотного положения 7 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 19 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 39 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 46 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 49 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 62 (нумерация по Кэботу) или от аминокислотного положения 96 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 107 (нумерация по Кэботу) в VL антитела.

В некоторых более конкретных вариантах осуществления изобретения сайт расщепления или расщепляемую протеазой последовательность встраивают в любое положение в последовательности от аминокислотного положения 7 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 16 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 40 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 47 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 55 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 69 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 73 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 79 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 83 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 89 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 95 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 99 (нумерация по Кэботу) или от аминокислотного положения 101 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 113 (нумерация по Кэботу) в VH антитела.

В некоторых более конкретных вариантах осуществления изобретения сайт расщепления или расщепляемую протеазой последовательность встраивают в любое положение в последовательности от аминокислотного положения 7 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 19 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 39 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 46 (нумерация по Кэботу), от аминокислотного положения 49 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 62 (нумерация по Кэботу) или от аминокислотного положения 96 (нумерация по Кэботу) до аминокислотного положения 107 (нумерация по Кэботу) в VL антитела.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сайт расщепления или расщепляемая протеазой последовательность локализован/локализована вблизи границы между VH антитела и константной областью антитела. Фраза «вблизи границы между VH антитела и константной областью тяжелой цепи антитела» может означать положение, находящееся между аминокислотным положением 101 (нумерация по Кэботу) VH антитела и аминокислотным положением 140 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела, и предпочтительно может означать положение, находящееся между аминокислотным положением 109 (нумерация по Кэботу) VH антитела и аминокислотным положением 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела или между аминокислотным положением 111 (нумерация по Кэботу) VH антитела и аминокислотным положением 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела. Когда VH антитела сливают с константной областью легкой цепи антитела, то фраза «вблизи границы между VH антитела и константной областью легкой цепи антитела» может означать положение, находящееся между аминокислотным положением 101 (нумерация по Кэботу) VH антитела и аминокислотным положением 130 (EU-нумерация) (нумерация положения 130 по Кэботу) константной областей легкой цепи антитела, и может предпочтительно означать положение, находящееся между аминокислотным положением 109 (нумерация по Кэботу) VH антитела и аминокислотным положением 113 (EU-нумерация) (нумерация положения 113 по Кэботу) константной областей легкой цепи антитела, или между аминокислотным положением 111 (нумерация по Кэботу) VH антитела и аминокислотным положением 112 (EU-нумерация) (нумерация положения 112 по Кэботу) константной областей легкой цепи антитела.

В одном из вариантов осуществления изобретения сайт расщепления или расщепляемая протеазой последовательность локализован/локализована вблизи границы между VL антитела и константной областью антитела. Фраза «вблизи границы между VL антитела и константной областью легкой цепи антитела» может означать положение, находящееся между аминокислотным положением 96 (нумерация по Кэботу) VL антитела и аминокислотным положением 130 (EU-нумерация) (нумерация положения 130 по Кэботу) константной области легкой цепи антитела и предпочтительно может означать положение, находящееся между аминокислотным положением 104 (нумерация по Кэботу) VL антитела и аминокислотным положением 113 (EU-нумерация) (нумерация положения 113 по Кэботу) константной области легкой цепи антитела или между аминокислотным положением 105 (нумерация по Кэботу) VL антитела и аминокислотным положением 112 (EU-нумерация) (нумерация положения 112 по Кэботу) константной области легкой цепи антитела. Когда VL антитела сливают с константной областью тяжелой цепи антитела», то фраза «вблизи границы между VL антитела и константной областью тяжелой цепи антитела» может означать положение, находящееся между аминокислотным положением 96 (нумерация по Кэботу) VL антитела и аминокислотным положением 140 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела, и может предпочтительно означать положение, находящееся между аминокислотным положением 104 (нумерация по Кэботу) VL антитела и аминокислотным положением 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела или между аминокислотным положением 105 (нумерация по Кэботу) VL антитела и аминокислотным положением 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.

Сайт расщепления или расщепляемую протеазой последовательность можно создавать во множестве положений в лигандсвязывающей молекуле и можно создавать во множестве положений, выбранных, например, в константной области антитела, VH антитела, VL антитела, вблизи границы между VH антитела и константной областью антитела и вблизи границы между VL антитела и константной областью антитела. Специалисты в данной области с учетом настоящего описания могут изменять форму молекулы, содержащей VH антитела, VL антитела и константную область антитела, например, путем замены VH антитела на VL антитела. Указанная молекулярная форма подпадает под объем настоящего изобретения.

В настоящем описании понятие «лиганд» означает молекулу, обладающую биологической активностью. Молекула, обладающая биологической активностью, как правило, функционирует путем взаимодействия с рецептором на клеточной поверхности и осуществляет тем самым биологическую стимуляцию, ингибирование или модуляцию в других режимах. Эти функции, как правило, вероятно, участвуют во внеклеточных путях передачи сигналов клеток, несущих рецептор.

В настоящем описании лиганд представляет собой требуемую молекулу, которая обладает биологической активностью при взаимодействии с биомолекулой. Например, лиганд означает не только молекулу, которая взаимодействует с рецептором, но также включает молекулу, которая проявляет биологическую активность при взаимодействии с молекулой, например, рецептором, который взаимодействует с молекулой, или ее связывающий фрагмент. Например, лигандсвязывающий сайт белка, известный как рецептор, и белок, содержащий сайт взаимодействия рецептора с другой молекулой, подпадают под понятие «лиганд» согласно настоящему изобретению. В частности, например, растворимый рецептор, растворимый фрагмент рецептора, внеклеточный домен трансмембранного рецептора и содержащие их полипептиды подпадают под понятие «лиганд» согласно настоящему изобретению.

Лиганд, предлагаемый в настоящем изобретении, может, как правило, проявлять требуемую биологическую активность при связывании с одним или несколькими партнерами по связыванию. Партнер по связыванию лиганда может представлять собой внеклеточный, внутриклеточный или трансмембранный белок. В одном из вариантов осуществления изобретения партнер по связыванию лиганда представляет собой внеклеточный белок, например, растворимый рецептор. В другом варианте осуществления изобретения партнер по связыванию лиганда представляет собой связанный с мембраной рецептор.

Лиганд, предлагаемый в настоящем изобретении, может специфическим связываться с партнером по связыванию с константной диссоциации (KD), составляющей 10мкМ, 1 мкМ, 100нМ, 50нМ, 10нМ, 5нМ, 1нМ, 500пМ, 400пМ, 350пМ, 300пМ, 250пМ, 200пМ, 150пМ, 100пМ, 50пМ, 25пМ, 10пМ, 5пМ, 1пМ, 0,5пМ или 0,1пМ или менее.

Примеры молекул, обладающих биологической активностью, включают (но, не ограничиваясь только ими) цитокины, хемокины, полипептидные гормоны, факторы роста, индуцирующие апоптоз факторы, PAMP, DAMP, нуклеиновые кислоты и их фрагменты. В конкретном варианте осуществления изобретения в качестве лиганда можно применять интерлейкин, интерферон, гематопоэтический фактор, член суперсемейства TNF, хемокин, фактор роста клеток, член семейства TGF-β, миокин, адипокин или нейроторофический фактор. В более конкретном варианте осуществления изобретения в качестве лиганда можно применять CXCL10, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFN-α, IFN-β, IFN-g, MIG, I-TAC, RANTES, MIP-1a или MIP-1b.

Хемокины представляют собой гомогенное семейство сывороточных белков с молекулярной массой от 7 до 16 кДа, исходно отличающихся их способностью индуцировать миграцию лейкоцитов. Большинство хемокинов имеют четыре характерных остатка цистеина (Cys) и их классифицируют как СХС или альфа-, СС или бета-, С или гамма- и СХ3С или дельта- классы хемокинов в зависимости от мотивов, образованных первыми двумя цистеинами. Две дисульфидные связи образуются между первым и третьим цистеином и между вторым и четвертым цистеином. Как правило, дисульфидные мостики считаются необходимыми. Clark-Lewis с соавторами описали, что дисульфидные связи имеют решающее значение для активности хемокина, по меньшей мере CXCL10 (Clark-Lewis и др., J. Biol. Chem. 269, 1994, cc. 16075-16081). Одним единственным исключением наличия четырех цистеинов является лимфотактин, который имеет только два остатка цистеина. Таким образом, лимфотактин строго поддерживает свою структуру с помощью только одной дисульфидной связи.

Подсемейства СХС или альфа дополнительно классифицируют по присутствию ELR-мотива (Glu-Leu-Arg) перед первым цистеином, на две группы: хемокины ELR-CXC и хемокины не-ELR-CXC (см., например, Clark-Lewis, выше; и Belperio и др., «СХС Chemokines in Angiogenesis», J. Leukoc. Biol. 68, 2000, cc. 1-8).

Индуцируемый интерфероном белок-10 (IP-10 или CXCL10) индуцируется интерфероном-γ и TNF-α и продуцируется кератиноцитами, эндотелиальными клетками, фибробластами и моноцитами. Считается, что IP-10 играет роль в мобилизации активированных Т-клеток к области воспаления ткани (Dufour и др., «IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10; CXCL10)-deficient mice reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking)), J Immunol., 168, 2002, cc. 3195-3204). Кроме того, существует возможность того, что IP-10 участвует в реакции гиперчувствительности. Имеется возможность того, что IP-10 играет также роль во встречаемости воспалительных димиелинизирующих нейропатий (Kieseier и др., «Chemokines and chemokine receptors in inflammatory demyelinating neuropathies: a central role for IP-10», Brain 125, 2002, cc. 823-834).

Исследования продемонстрировали возможность того, что IP-10 является ценным для приживления стволовых клеток после трансплантации (Nagasawa Т., Int. J. Hematol. 72, 2000, cc. 408-411), для мобилизации стволовых клеток (Gazitt Y., J. Hematother Stem Cell Res 10, 2001, cc. 229-236; и Hattori и др., Blood 97, 2001, cc. 3354-3359) и для противоопухолевого гипериммунитета (Nomura и др., Int. J. Cancer 91, 2001, cc. 597-606; и Mach и Dranoff, Curr. Opin. Immunol. 12, 2000, cc. 571-575). Например, в проведенных ранее исследованиях, известных специалистам в данной области, обсуждается биологическая активность хемокинов (Bruce L. и др., «Radiolabeled Chemokine binding assays)), Methods in Molecular Biology т. 138, 2000, cc. 129-134; Raphaele В. и др., «Calcium Mobilization)), Methods in Molecular Biology, т. 138, 2000, cc. 143-148; и Paul D. Ponath и др., «Transwell Chemotaxis», Methods in Molecular Biology, т. 138, 2000, cc. 113-120, изд-во Humana Press. Totowa, New Jersey).

Примеры биологической активности CXCL10 включают связывание с CXCL10-рецептором (CXCR3), индуцируемый CXCL10 поток кальция, индуцируемый CXCL10 клеточный хемотаксис, связывание CXCL10 с гликозаминогликаном и олигомеризацию CXCL10.

Примеры метода измерения физиологической активности CXCL10 включают метод измерения клеточной хемотаксической активности CXCL10, репортерный анализ с использованием клеточной линии, стабильно экспрессирующей CXCR3 (см. PLoS One. 5 (9), 13 сентября 2010 г., е12700), и PathHunter™-анализ рекрутмента β-аррестина с использованием рекрутмента В-аррестина, индуцированного на ранней стадии трансдукции сигнала GPCR.

Интерлейкин 12 (IL-12) представляет собой гетеродимерный цитокин, состоящий из связанных дисульфидом гликозилированных полипептидных цепей с молекулярной массой 30 и 40 кДа. Цитокины синтезируются и затем секретируются дендритными клетками, моноцитами, макрофагами, В-клетками, клетками Лангерганса и кератиноцитами, и антигенпрезентирующими клетками, включая естественные клетки-киллеры (NK-клетки). IL-12 опосредует различные биологические процессы и упомянут в качестве стимуляторного фактора NK-клеток (NKSF), стимуляторного фактора Т-клеток, фактора созревания цитотоксических Т-лимфоцитов и фактора трансформированной EBV линии В-клеток.

Интерлейкин 12 может связываться с рецептором IL-12, который экспрессируется на цитоплазматических мембранах клеток (например, Т-клеток и NK-клеток) и тем самым изменять (например, инициировать или блокировать) биологический процесс. Например, связывание IL-12 с рецептором IL-12 стимулирует рост предварительно активированных Т-клеток и NK-клеток, усиливает цитотоксическую активность цитотоксических Т-клеток (CTL), NK-клеток и LAK (активируемых лимфокинами клеток-киллеров), индуцирует производство γ-интерферона (IFNγ) Т-клетками и NK-клетками и индуцирует дифференцировку наивных Th0-клеток в Th1-клетки, продуцирующие IFNγ и IL-2. В частности, IL-12 совершенно необходим для регуляции производства и клеточного иммунного ответа (например, опосредуемого Th1-клетками иммунного ответа) цитотоксических клеток (например, NK и CTL). Таким образом, IL-12 совершенно необходим для создания и регуляции как защитного иммунитета (например, для излечения инфекционного заболевания) и патологического иммунного ответа (например, аутоиммунитета).

Примеры метода измерения физиологической активности IL12 включают метод измерения активности IL12 в отношении клеточного роста, репортерный анализ STAT4, метод измерения активации клеток (экспрессия маркера клеточной поверхности, производство цитокинов и т.д.) с помощью IL12 и метод измерения усиления при использовании IL12 дифференцировки клеток.

Белок запрограммированной гибели клеток 1 (PD-1) является обладающим ингибирующей активностью членом семейства рецепторов CD28. Семейство CD28 включает также CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и клетках костного мозга (Okazaki и др., Curr. Opin. Immunol. 14, 2002, cc. 391779-391782; и Bennett и др., J Immunol 170, 2003, cc. 711-718). CD28 и ICOS, первые члены семейства были описаны на основе функционального воздействия на усиление роста Т-клеток после добавления моноклонального антитела (Hutloff и др., Nature 397, 1999, cc. 263-266; и Hansen и др., Immunogenics 10, 1980, cc. 247-260). PD-1 обнаружен путем скрининга в отношении дифференциальной экспрессии в апоптозных клетках (Ishida и др., EMBO J 11, 1992, cc. 3887-3895). CTLA-4 и BTLA, другие члены семейства, обнаружены путем скрининга в отношении дифференциальной экспрессии в цитотоксических Т-лимфоцитах и ТН1-клетках соответственно. CD28, ICOS и CTLA-4 все имеют неспаренный остаток цистеина, который обеспечивает гомодимеризацию. В противоположность этому, считается, что PD-1 присутствует в виде мономера и у него нет неспаренного остатка цистеина, что характерно для других членов семейства CD28.

Ген PD-1 кодирует трансмембранный белок типа I с молекулярной массой 55 кДа, который является частью суперсемейства Ig. PD-1 содержит ближайший к мембране ингибирующий мотив иммунорецептора на основе рецептора тирозина (ITIM) и отдаленный от мембраны мотив-переключатель на основе тирозина (ITSM). PD-1 структурно схож с CTLA-4, но у него отсутствует мотив MYPPPY (SEQ ID NO: 537), важный для связывания В7-1 и В7-2. Два лиганда, PD-L1 и PD-L2, для PD-1 были идентифицированы и установлено, что они негативно регулируют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman и др., J Exp Med 192, 2000, cc. 1027-1034; Latchman и др., Nat Immunol 2, 2001, cc. 261-268; и Carter и др., Eur J Immunol 32, 2002, cc. 634-643). Оба PD-L1 и PD-L2 являются гомологами B7, которые связываются с PD-1, но не связываются с другими членами семейства CD28. PD-L1, один из лигандов PD-1, присутствует в большом количестве при различных раках человека (Dong и др., Nat. Med. 8, 2002, cc. 787-789). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводит к уменьшению количества инфильтрующих опухоль лимфоцитов, снижению опосредуемого Т-клеточным рецептором роста и ускользанию раковых клеток от иммунологического надзора (Dong и др., J. Mol. Med. 81, 2003, cc. 281-287; Blank и др., Cancer Immunol. Immunother. 54, 2005, cc. 307-314; и Konishi и др., Clin. Cancer Res. 10, 2004, cc. 5094-5100). Иммуносупрессию можно обращать путем ингибирования местного взаимодействия PD-1 с PD-L1, и этот эффект является аддитивным, когда ингибируют также взаимодействие PD-2 с PD-L2 (Iwai и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, cc. 12293-12297; и Brown и др., J. Immunol. 170, 2003, cc. 1257-1266).

PD-1 является обладающим ингибирующим действием членом семейства CD28, который экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и клетках костного мозга. У животных с дефицитом PD-1 развиваются различные аутоиммунные фенотипы, включая аутоиммунную кардиомиопатию и синдром волчаночного типа с артритом и нефритом (Nishimura и др., Immunity 11, 1999, cc. 141-151; и Nishimura и др., Science 291, 2001, cc. 319-322). Кроме того, установлено, что PD-1 играет важную роль при аутоиммунном энцефаломиелите, системной красной волчанке, реакции трансплантат-против-хозяина (GVHD), сахарном диабете типа I и ревматоидном артрите (Salama и др., J Exp Med 198, 2003, cc. 71-78; Prokunia и Alarcon-Riquelme Hum Mol Genet 13, 2004, R143; и Nielsen и др., Lupus 13, 2004, с. 510). На мышиной линии В-клеточной опухоли установлено, что ITSM в PD-1 является важным для ингибирования опосредованного BCR потока Са²⁺ и фосфорилирования тирозина расположенными в прямом направлении эффекторными молекулами (Okazaki и др., PNAS 98, 2001, сс. 13866-13871).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лиганд представляет собой цитокин.

Цитокины представляют собой семейства секретируемых клеткой сигнальных белков, которые участвуют в процессах иммуномодуляции и воспаления. Указанные цитокины секретируются глиальными клетками нервной системы и многими клетками иммунной системы. Цитокины можно классифицировать как белки, пептиды и гликопротеины, и к ним относятся семейства регуляторов, отличающиеся большим разнообразием. Цитокины могут индуцировать трансдукцию внутриклеточных сигналов посредством связывания с их расположенным на клеточной поверхности рецепторами, вызывая тем самым регуляцию ферментативной активности, повышающую регуляцию или понижающую регуляцию некоторых генов и их факторов транскрипции или ингибирование по типу обратной связи и т.д.

В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин, предлагаемый в настоящем изобретении, включает иммуномодулирующие факторы, такие как интерлейкины (IL) и интерфероны (IFN). Приемлемый цитокин может содержать белок, полученный из одного или нескольких следующих типов: семейства в виде четырех α-спиральных пучков (которые включают подсемейство IL-2, подсемейство IFN и подсемейство IL-10); семейство IL-1 (которое включает IL-1 и IL-8); и семейство IL-17. Цитокин может включать также цитокины, классифицированные как цитокины типа 1 (например, IFN-γ иа TGF-β), которые повышают клеточный иммунный ответ, или цитокины типа 2 (например, IL-4, IL-10 и IL-13), которые оказывают благоприятное воздействие на гуморальный ответ.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лиганд представляет собой хемокин. Хемокины, как правило, действуют в качестве хемоаттрактантов, которые мобилизуют иммунные эффекторные клетки к областям экспрессии хемокинов. Считается благоприятной экспрессия конкретного гена хемокина, например, в сочетании с геном цитокина, для целей мобилизации других компонентов иммунной системы к подлежащей лечению области. Указанные хемокины включают CXCL10, RANTES, MCAF, MIP-α и MIP1-β. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что некоторые цитокины обладают также хемоаттрактивным действием и допускается, что указанные цитокины можно классифицировать как «хемокины».

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в качестве лиганда можно применять вариант цитокина, вариант хемокина или т.п. (например, Annu Rev Immunol. 33, 2015, cc. 139-167) или слитый белок, содержащий варианты (например, Stem Cells Transl Med. 4 (1), январь 2015 г., cc. 66-73).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лиганд выбирают из CXCL10, PD1, IL12 и IL6R. CXCL10, PD1, IL12 или IL6R могут иметь такую же последовательность, что и встречающиеся в естественных условиях CXCL10, PD1, IL12 или IL6R, или могут представлять собой вариант лиганда, последовательность которого отличается от последовательности встречающегося в естественных условиях CXCL10, PD1, IL12 или IL6R, но сохраняет физиологическую активность соответствующего природного лиганда. Для получения варианта лиганда изменение можно искусственно добавлять в последовательность лиганда для различных целей. Предпочтительно добавляют изменение, приводящее к устойчивости к расщеплению протеазой (изменение устойчивости к протеазе), для получения варианта лиганда.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биологическую активность лиганда ингибируют путем связывания с нерасщепленной лигандсвязывающей молекулой. Примеры вариантов осуществления изобретения, в которых биологическую активность лиганда ингибируют, включают (но, не ограничиваясь только ими) варианты осуществления изобретения, в которых связывание лиганда с нерасщепленной лигандсвязывающей молекулой в существенной или в значительной степени препятствует или конкурирует за связывание лиганда с его партнером по связыванию. В случае применения в качестве лигандсвязывающей молекулы антитела или его фрагмента, обладающего нейтрализующей лиганд активностью, лигандсвязывающая молекула, связанная с лигандом, обладает способностью ингибировать биологическую активность лиганда путем осуществления ее нейтрализующей активности.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительно нерасщепленная лигандсвязывающая молекула может существенно нейтрализовать биологическую активность лиганда путем связывания с лигандом. В частности, биологическая активность лиганда, связанного с нерасщепленной лигандсвязывающей молекулой, представленной ниже, чем лиганда, не связанного с нерасщепленной лигандсвязывающей молекулой. Биологическая активность лиганда, связанного с нерасщепленной лигандсвязывающей молекулой, может составлять (но, не ограничиваясь только указанным), например, 90% или менее, предпочтительно 80% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, или 30% или менее, особенно предпочтительно 20% или менее, 10% или менее, 9% или менее, 8% или менее, 7% или менее, 6% или менее, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее, или 1% или менее, от биологической активности лиганда, не связанного с нерасщепленной лигандсвязывающей молекулой. Можно ожидать, что введение лигандсвязывающей молекулы, которая существенно нейтрализует биологическую активность лиганда, препятствует проявлению биологической активности лиганда до его поступления в ткань-мишень.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активность связывания расщепленной лигандсвязывающей молекулы с лигандом предпочтительно ниже, чем активность связывания лиганда in vivo встречающегося в естественных условиях партнера по связыванию лиганда (например, встречающегося в естественных условиях рецептора для лиганда). Активность связывания расщепленной лигандсвязывающей молекулы с лигандом составляет (но, не ограничиваясь только указанным), например, 90% или менее, предпочтительно 80% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, или 30% или менее, особенно предпочтительно 20% или менее, 10% или менее, 9% или менее, 8% или менее, 7% или менее, 6% или менее, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее, или 1% или менее, от количества лиганда, связанного in vivo встречающегося в естественных условиях партнера по связыванию (не единицу партнера по связыванию). Выбранный показатель можно применять соответственно в качестве показателя активности связывания. Например, можно использовать константу диссоциации (KD). В случае применения константы диссоциации (KD) в качестве показателя для оценки активности связывания, более высокая величина константы диссоциации (KD) расщепленной лигандсвязывающей молекулы, характеризующая связывание лиганда, чем величина встречающегося в естественных условиях партнера по связыванию лиганда in vivo, означает, что расщепленная лигандсвязывающая молекула обладает более слабой связывающей лиганд активностью, чем встречающегося в естественных условиях партнера по связыванию in vivo. Константа диссоциации (KD) расщепленной лигандсвязывающей молекулы, характеризующая связывание с лигандом, превышает по меньшей мере в 1,1 раза, предпочтительно по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз, особенно предпочтительно по меньшей мере в 100 раз константу диссоциации (KD), характеризующую связывание встречающегося в естественных условиях партнера по связыванию лиганда in vivo. Лигандсвязывающая молекула, обладающая лишь низкой активностью связывания лиганда или едва обладающая связывающей лиганд активностью после расщепления, обеспечивает высвобождение лиганда в результате расщепления лигандсвязывающей молекулы, и можно ожидать, что существует препятствие связыванию молекулы вновь с другим лигандом.

Предпочтительно лиганд сохраняет подавленную биологическую активность после расщепления лигандсвязывающей молекулы. Предпочтительно связывание лиганда расщепленной лигандсвязывающей молекулой ослабляется, в результате чего функция ингибирования биологической активности лиганда лигандсвязывающей молекулы ослабляется. Специалисты в данной области могут определять биологическую активность лиганда с помощью известного метода, например, метода оценки связывания лиганда с его партнером по связыванию.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нерасщепленная лигандсвязывающая молекула образует комплекс с лигандом посредством связывания по типу антиген-антитело. В более конкретном варианте осуществления изобретения комплекс лигандсвязывающей молекулы и лиганда образуется посредством нековалентной связи, например, путем связывания по типу антиген-антитело, между лигандсвязывающей молекулой и лигандом.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нерасщепленную лигандсвязывающую молекулу сливают с лигандом с образованием слитого белка. Фрагмент, представляющий собой лигандсвязывающую молекулу, и фрагмент, представляющий собой лиганд, в слитом белке дополнительно взаимодействуют друг с другом посредством связывания по типу антиген-антитело. Лигандсвязывающую молекулу и лиганд можно сливать через линкер или без линкера. Даже, когда лигандсвязывающая молекула и лиганд в слитом белке слиты через линкер или без линкера, нековалентная связь все еще присутствует между фрагментом лигандсвязывающей молекулы и фрагментом лиганда. Другими словами, даже в тех вариантах осуществления изобретения, в которых лигандсвязывающая молекула слита с лигандом, нековалентная связь между фрагментом лигандсвязывающей молекулы и фрагментом лиганда сходна с теми вариантами осуществления изобретения, в которых лигандсвязывающая молекула не слита с лигандом. Нековалентная связь ослабляется расщеплением лигандсвязывающей молекулы. В целом, связывание лиганда лигандсвязывающей молекулой ослабляется.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лигандсвязывающая молекула и лиганд слиты через линкер. Например, можно интродуцировать путем генетического конструирования произвольный пептидный линкер или можно применять линкер, представляющий собой синтетическое соединение (см., например, Protein Engineering, 9 (3), 1996, cc. 299-305), в качестве линкера для слияния лигандсвязывающей молекулы с лигандом. В настоящем варианте осуществления изобретения предпочтительным является пептидный линкер. На длину пептидного линкера не накладывается ограничение, и соответственно специалисты в данной области могут выбирать ее в зависимости от цели. Примеры пептидного линкера могут включать (но, не ограничиваясь только ими):

где n обозначает целое число 1 или более.

Однако длину и последовательность пептидного линкера могут выбирать соответственно специалисты в данной области в зависимости от цели.

Синтетический линкер (химический перекрестносшивающий агент) представляет собой перекрестносшивающий агент, который обычно применяют для перекрестного сшивания пептидов, например, N-гидроксисукцинимид (NHS), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS3), дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP), дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), этиленгликольбис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), этиленгликольбис(сульфосукцинимидилсукцинат) (сульфо-EGS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST), бис[2-(сукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (BSOCOES) или бис[2-(сульфосукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (сульфо-BSOCOES). Эти перекрестносшивающие агенты поступают в продажу.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции (лекарственному средству), содержащей лигандсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель, фармацевтической композиции (лекарственному средству), содержащей лигандсвязывающую молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, лиганд и фармацевтически приемлемый носитель, и фармацевтической композиции (лекарственному средству), содержащей слитый белок лигандсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, с лигандом, и фармацевтически приемлемый носитель.

В контексте настоящего описания понятие «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «процесс лечения») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики, либо в процессе развития клинического патологического состояния. Требуемыми действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления изобретения лигандсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, может контролировать биологическую активность лиганда и ее применяют для замедления возникновения заболевания или замедления развития заболевания.

В настоящем изобретении понятие «фармацевтическая композиция» относится, как правило, к лекарственному средству, предназначенному для лечения или предупреждения заболевания или для обследования или постановки диагноза.

В настоящем изобретении понятие «фармацевтическая композиция, содержащая лигандсвязывающую молекулу» можно применять взаимозаменяемо с понятием «способ лечения заболевания, включающий введение лигандсвязывающей молекулы индивидууму, подлежащему лечению» и можно применять взаимозаменяемо с понятием «применение лигандсвязывающей молекулы для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания». Кроме того, понятие «фармацевтическая композиция, содержащая лигандсвязывающую молекулу» можно применять взаимозаменяемо с понятием «применение лигандсвязывающей молекулы для лечения заболевания».

Понятие «фармацевтическая композиция, содержащая лигандсвязывающую молекулу и лиганд» можно применять взаимозаменяемом с понятием «способ лечения заболевания, включающий введение лигандсвязывающей молекулы и лиганда индивидууму, подлежащему лечению» и можно применять взаимозаменяемо с понятием «применение лигандсвязывающей молекулы и лиганда для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания». Кроме того, понятие «фармацевтическая композиция, содержащая лигандсвязывающую молекулу и лиганд» можно применять взаимозаменяемо с понятием «применение лигандсвязывающей молекулы и лиганда для лечения заболевания».

Понятие «фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок» можно применять взаимозаменяемом с понятием «способ лечения заболевания, включающий введение слитого белка индивидууму, подлежащему лечению» и можно применять взаимозаменяемо с понятием «применение слитого белка для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания». Кроме того, понятие «фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок» можно применять взаимозаменяемо с понятием «применение слитого белка для лечения заболевания».

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композицию, содержащую лигандсвязывающую молекулу, можно вводить индивидууму. Лигандсвязывающая молекула, вводимая индивидууму, связывается лигандом, исходно присутствующим в организме индивидуума, например, в крови или ткани, и лигандсвязывающая молекула в указанном связанном состоянии с лигандом далее транспортируется in vivo. Лигандсвязывающая молекула, транспортируемая к ткани-мишени, может расщепляться в ткани-мишени, в результате ее связывание с лигандом может ослабляется с высвобождением связанного лиганда в ткани-мишени. Высвободившийся лиганд может проявлять биологическую активность в ткани-мишени и лечить заболевание, связанное с тканью-мишенью. В вариантах осуществления изобретения, в которых лигандсвязывающая молекула подавляет биологическую активность лиганда при связывании с лигандом и расщепляется специфически в ткани-мишени, лиганд не обладает биологической активностью во время транспортировки и проявляет биологическую активность только, когда лигандсвязывающая молекула расщепляется в ткани-мишени. В результате заболевание можно лечить при пониженных системных нежелательных реакциях.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композицию, содержащую лигандсвязывающую молекулу, и композицию, содержащую лиганд, можно вводить индивидууму раздельно или одновременно. Альтернативно этому, можно вводить индивидууму композицию, содержащую и лигандсвязывающую молекулу, и лиганд. В случае введения индивидууму композиции, содержащей и лигандсвязывающую молекулу, и лиганд, лигандсвязывающая молекула и лиганд в композиции могут образовывать комплекс. В случае введения индивидууму и лигандсвязывающей молекулы, и лиганда лигандсвязывающая молекула связывается с лигандом, введенном индивидууму, и лигандсвязывающая молекула в указанном связанном с лигандом состоянии транспортируется in vivo. Лигандсвязывающая молекула, транспортированная к ткани-мишени, может расщепляться в ткани-мишени, в результате чего связывание лиганда ослабляется, что приводит к высвобождению связанного лиганда в ткани-мишени. Высвободившийся лиганд может проявлять биологическую активность в ткани-мишени и лечить заболевание, связанное с тканью-мишенью. В одном из вариантов осуществления изобретения, в котором лигандсвязывающая молекула подавляет биологическую активность лиганда при связывании с лигандом и расщепляется специфически в ткани-мишени, лиганд не проявляет биологическую активность в процессе транспортировки и проявляется биологическую активность только при расщеплении лигандсвязывающей молекулы в ткани-мишени. В результате заболевание можно лечить при пониженных системных нежелательных реакциях. Вводимая индивидууму лигандсвязывающая молекула обладает также способностью связываться с лигандом, исходно присутствующем в организме индивидуума, в дополнение к лиганду, который вводят индивидууму. Лигандсвязывающая молекула в состоянии, связанном с лигандом, который исходно присутствует в организме индивидуума, или с лигандом, введенным индивидууму, может транспортироваться in vivo.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок, содержащий лигандсвязывающую молекулу, связанную с лигандом, можно вводить индивидууму. В указанных некоторых вариантах осуществления изобретения лигандсвязывающая молекула и лиганд в слитом белке слиты через линкер или без него. Нековалентная связь все еще присутствует между фрагментом, представляющим собой лигандсвязывающую молекулу, и фрагментом, представляющим собой лиганд. В случае введения индивидууму слитого белка, содержащего лигандсвязывающую молекулу, слитую с лигандом, слитый белок транспортируется in vivo. Фрагмент лигандсвязывающей молекулы в слитом белке расщепляется в ткани-мишени, в результате нековалентная связь, связывающая фрагмент лигандсвязывающей молекулы с лигандом, ослабляется, высвобождая лиганд и часть лигандсвязывающей молекулы из слитого белка. Высвободившийся лиганд и высвободившаяся часть лигандсвязывающей молекулы могут проявлять биологическую активность лиганда в ткани-мишени и лечить заболевание, связанное с тканью-мишенью. В вариантах осуществления изобретения, в которых лигандсвязывающая молекула подавляет биологическую активность лиганда при связывании с лигандом и расщепляется специфически в ткани-мишени, лиганд в слитом белке не проявляет биологическую активность в процессе транспортировки и проявляется биологическую активность только при расщеплении слитого белка в ткани-мишени. В результате заболевание можно лечить при пониженных системных нежелательных реакциях.

Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно приготавливать для применения методом, хорошо известным специалистам в данной области. Например, фармацевтическую композицию можно применять парентерально, например, в форме стерильного раствора или суспензии для инъекции в воде или любых других фармацевтически приемлемых жидкостях. Фармацевтическую композицию можно приготавливать, например, путем объединения соответственно полипептида с фармакологически приемлемым носителем или средой, в частности, стерильной водой или физиологическим соляным раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспендирующим агентом, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, корригентом, эксципиентом, наполнителем, антисептиком, связывающим агентом и т.д., и смешивать их с получением стандартной дозы лекарственного средства, требуемой для общепринятой фармацевтической практики. Количество действующего вещества в указанных композициях регулируют так, чтобы получать приемлемый объем в предварительно определенном диапазоне.

Стерильную композицию для инъекции можно приготавливать согласно общепринятой фармацевтической практике с использованием такого наполнителя, как дистиллированная вода, пригодная для инъекций. Примеры пригодного для инъекций водного раствора включают изотонические растворы, которые содержат физиологический соляной раствор, глюкозу или другие адъюванты (например, D-сорбит, D-маннозу, D-маннит и хлорид натрия). Водный раствор можно применять в комбинации с соответствующим стабилизатором, например, спиртом (этанол и т.д.), многоатомным спиртом (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.д.) или неионогенным поверхностно-активным веществом (Polysorbate 80™, НСО-50 и т.д.).

Примеры масляного раствора включают кунжутное масло и соевое масло. Масляный раствор можно применять также в комбинации с бензилбензоатом и/или бензиловым спиртом в качестве солюбилизатора. Масляный раствор можно дополнять буфером (например, раствором фосфатного буфера и раствором натрий-ацетатного буфера), смягчающего агента (например, гидрохлоридом прокаина), стабилизатором (например, бензиловый спирт и фенол) и антиоксидантом. Полученным раствором для инъекции, как правило, заполняют соответствующую ампулу.

Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, предпочтительно вводят парентеральным путем. Например, вводят композицию в лекарственной форме, пригодной для инъекции, трансназального, транспульмонального или чрескожного введения. Фармацевтическую композицию можно вводить системно или применять место, например, путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции или подкожной инъекции.

Метод введения можно выбирать соответственно в зависимости от возраста и симптомов у пациента. Дозу фармацевтической композиции, содержащей лигандсвязывающую молекулу, можно выбирать из диапазона, составляющего, например, от 0,0001 до 1000 мг на кг веса тела на дозу. Альтернативно этому, дозу фармацевтической композиции, содержащей полипептид, можно выбирать из дозы, составляющей, например, от 0,001 до 100000 мг на пациента. Однако настоящее изобретение не обязательно ограничено указанными численными величинам. Хотя доза и метод введения варьируются в зависимости от веса тела, возраста, симптомов и т.д. пациента, специалисты в данной области могут определять соответствующую дозу и метод введения с учетом указанных обстоятельств.

Настоящее изобретение относится также к способу получения лигандсвязывающей молекулы, связывание лиганда в которой ослабляется расщеплением, или слитого белка, содержащего лигандсвязывающую молекулу, слитую с лигандом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения лигандсвязывающей молекулы или слитого белка, включающий интродукцию расщепляемой протеазой последовательности в молекулу, которая обладает способностью связываться с лигандом.

Примеры способа интродукции расщепляемой протеазой последовательности в молекулу, которая обладает способностью связываться с лигандом, включают способ встраивания расщепляемой протеазой последовательности в аминокислотную последовательность полипептида, который обладает способностью связываться с лигандом, и способ замены части аминокислотной последовательности полипептида, который обладает способностью связываться с лигандом, на расщепляемую протеазой последовательность.

Примеры способа получения молекулы, которая обладает способностью связываться с лигандом, включают способ получения лигандсвязывающей области, которая обладает способностью связываться с лигандом. Лигандсвязывающую область получают, способом с использованием, например, известного в данной области метода создания антитела.

Антитело, созданное указанным методом получения, можно применять непосредственно в лигандсвязывающей области или можно применять только Fv-область полученного антитела. Когда Fv-область находится в одноцепочечной (обозначенной также как «sc») форме, обладающей способностью распознавать антиген, то можно использовать только одну цепь. Альтернативно этому, можно применять Fab-область, содержащую Fv-область.

Конкретный метод получения антитела хорошо известен специалистам в данной области. Например, моноклональные антитела можно получать методом гибридом (Kohler и Milstein, Nature 256, 1975, с. 495) или методом рекомбинации (US №4816567). Альтернативно этому, моноклональные антитела можно выделять из фаговых дисплейных библиотек антител (Clackson и др., Nature 352, 1991, cc. 624-628); и Marks и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, cc. 581-597). Кроме того, моноклональные антитела можно выделять из единичных В-клеточных клонов (N. Biotechnol. 28 (5), 2011, cc. 253-457).

Гуманизированные антитела называют также реконструированными человеческими антителами. В частности, в данной области известны, например, гуманизированное антитело, состоящее из CDR антитела животного кроме человека (например, мыши), трансплантированных в человеческое антитело. Общие подходы на основе рекомбинации генов известны также для получения гуманизированных антител. В частности, например, ПЦР с перекрывающимися праймерам представляет собой известный в данной области метод транслантации CDR мышиного антитела в человеческие FR.

ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, которая содержит сцепленные три CDR и четыре FR, и ДНК, кодирующую константную область человеческого антитела, можно встраивать в экспрессионный вектор, так, чтобы эти ДНК были слиты в рамке считывания, с получением вектора для экспрессии гуманизированного антитела. Вектором, имеющим вставки, трансфектируют хозяев для создания рекомбинантный клеток. Затем рекомбинантные клетки культивируют для экспрессии ДНК, кодирующей гуманизированное антитело, с получением гуманизированного антитела в культурах культивируемых клеток (см. публикацию европейского патента №239400 и публикацию международной заявки на патент WO 1996/002576).

При необходимости можно заменять аминокислотные остатки FR, так, чтобы CDR реконструированного человеческого антитела образовывали соответствующий антигенсвязывающий сайт. Например, можно интродуцировать мутацию в аминокислотную последовательность FR с помощью метода ПЦР, известного для трансплантации мышиного CDR в человеческие FR.

Требуемое человеческое антитело можно получать с помощью иммунизации ДНК с использованием в качестве подлежащих иммунизации животных трансгенных животных, имеющих весь спектр генов человеческих антител (см. публикации международных заявок на патент WO 1993/012227, WO 1992/003918, WO 1994/002602, WO 1994/025585, WO 1996/034096 и WO 1996/033735).

Кроме того, известны методики получения человеческих антител путем пэннинга с использованием библиотек человеческих антител. Например, Fv-область человеческого антитела экспрессируют в виде одноцепочечного антитела (scFv) на поверхности фага с использованием метода фагового дисплея. Можно отбирать фаги, экспрессирующие scFv, который связывается с антигеном. Последовательность ДНК, кодирующую Fv-область человеческого антитела, которая связывается с антигеном, можно определять путем анализа генов отобранных фагов. После определения последовательности ДНК антигенсвязывающего scFv последовательность Fv-области можно сливать в рамке считывания с последовательностью С-области требуемого человеческого антитела и затем встраивать в соответствующий экспрессионный вектор с получением экспрессионного вектора. Экспрессионным вектором трансфектируют предпочтительные для экспрессии клетки, описанные выше для экспрессии гена, кодирующего человеческое антитело, с получением человеческого антитела. Такие методы уже известны в данной области (см. публикации международных заявок на патент WO 1992/001047, WO 1992/020791, WO 1993/006213, WO 1993/011236, WO 1993/019172, WO 1995/001438 и WO 1995/015388).

Молекула, несущая расщепляемую протеазой последовательность в молекуле, которая обладает способностью связываться с лигандом, служит в качестве лигандсвязывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении. Необязательно можно определять, расщепляется ли лигандсвязывающая молекула обработкой протеазой, приемлемой для расщепляемой протеазой последовательности. Присутствие или отсутствие расщепления в расщепляемой протеазой последовательности можно определять, например, путем приведения в контакт протеазы с молекулой, несущей расщепляемую протеазой последовательность в молекуле, которая обладает способностью связываться с лигандом, и определения молекулярной массы обработанного протеазой продукта электрофоретическим методом, таким как ДСН-ПААГ.

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотиду, кодирующему лигандсвязывающую молекулу, связывание которой лиганда ослабляется расщеплением, или полинуклеотиду, кодирующему слитый белок, содержащий лигандсвязывающую молекулу, слитую с лигандом.

Полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, как правило, присутствует в (или встроен в) соответствующем векторе и им трансфектируют клетки-хозяева. Вектор не ограничен конкретным вектором, если он стабильно сохраняет встроенную нуклеиновую кислоту. Например, когда в качестве хозяина применяют Е. coli, то вектор pBluescript (производства фирмы Stratagene Corp.) или подобные векторы являются предпочтительными в качестве вектора для клонирования. Можно применять различные поступающие в продажу векторы. В случае применения вектора для получения лигандсвязывающей молекулы или слитого белка, предлагаемой/предлагаемого в настоящем изобретении, наиболее ценным является экспрессионный вектор. Экспрессионный вектор не ограничен конкретным вектором, если он сохраняет способность обеспечивать экспрессию лигандсвязывающей молекулы in vitro, в Е. coli, в культивируемых клетках или организме индивидуумов. Например, предпочтительно можно применять экспрессионный вектор, такой как вектор pBEST (производства фирмы Promega Corp.) для экспрессии in vitro; вектор рЕТ (производства фирмы Invitrogen Corp.)) для экспрессии в Е. coli; вектор pME18S-FL3 (GenBank, код доступа № АВ009864) для экспрессии в культуре клеток и вектор pME18S (Takebe и др., Mol. Cell Biol. 8, 1988, cc. 466-472) для экспрессии в организме индивидуумов. Встраивание ДНК, предлагаемой в настоящем изобретении, в вектор можно осуществлять общепринятым методом, например, с помощью реакции в присутствии лигазы с использованием сайтов, распознаваемых рестриктазами (Current protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel и др., изд-во Publish. John Wiley & Sons, раздел 11.4-11.11, 1987).

Клетки-хозяева не ограничены конкретными клетками и различные клетки-хозяева можно применять в зависимости от поставленной цели. Примеры клеток для экспрессии лигандсвязывающей молекулы или слитого белка могут включать бактериальные клетки (например, Streptococcus, Staphylococcus, Е. coli, Streptomyces и Bacillus subtilis), грибные клетки (например, дрожжей и Aspergillus), клетки насекомых (например, Drosophila S2 и Spodoptera SF9), клетки животных (например, СНО, COS, HeLa, С127, 3Т3, BHK, HEK293 и клетки бычьей меланомы) и клетки растений. Трансфекцию вектором клеток-хозяев можно осуществлять с помощью метода, известного в данной области, например, метода осаждения фосфатом кальция и метода электропорации (Current protocols in Molecular Biology под ред. Ausubel и др., изд-во Publish. John Wiley & Sons, раздел 9.1-9.9, 1987), метода с использованием липофектамина (производства фирмы GIBCO-BRL/Thermo Fisher Scientific Inc.), или метода микроинъекции.

Соответствующий секреторный сигнал можно включать в представляющую интерес лигандсвязывающую молекулу или представляющий интерес слитый белок для того, чтобы секретировать лигандсвязывающую молекулу или слитый белок, экспрессируемую/экспрессируемый в клетках-хозяевах, в полость эндоплазматического ретикулума, периплазматическое пространство или внеклеточное окружение. Сигнал может быть эндогенным для представляющей интерес лигандсвязывающей молекулы или представляющего интерес слитого белка или может представлять собой чужеродный сигнал.

Когда представляющая интерес лигандсвязывающая молекула или представляющий интерес слитый белок, предлагаемая/предлагаемый в настоящем изобретении, секретируется в среду, то выход лигандсвязывающей молекулы или слитого белка в процессе производства осуществляют путем выхода в среду. Когда представляющая интерес лигандсвязывающая молекула или представляющий интерес слитый белок, предлагаемая/предлагаемый в настоящем изобретении, получают в клетках, то клетки сначала лизируют, а затем выделяют лигандсвязывающую молекулу или представляющий интерес слитый белок.

Метод, известный в данный области, включающий осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобных взаимодействий, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатите и хроматографию лектинов можно применять для выделения и очистки лигандсвязывающей молекулы или слитого белка, предлагаемой/предлагаемого в настоящем изобретении, из культур рекомбинантных клеток.

Специалистам в данной области должно быть очевидно, что произвольные комбинации одного или нескольких вариантов осуществления изобретения, представленных в настоящем описании, можно включать также в настоящее изобретение, если это технически не противоречит основам, известным специалистам в данной области техники. Равным образом, настоящее изобретение, в котором исключены произвольные комбинации одного или нескольких вариантов осуществления изобретения, представленных в настоящем описании, следует рассматривать в качестве изобретения, представленного в настоящем описании, если это технически не противоречит основам, известным специалистам в данной области техники.

Примеры

Ниже представлены примеры способов и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении. Должно быть очевидно, что можно осуществлять различные другие варианты в свете упомянутого выше общего описания изобретения.

Пример 1. Ранее описанная проблема, связанная с иммуноцитокинами и активируемыми протеазой цитокинами

Иммуноцитокины, таргетирующие антигены, которые экспрессируются в раковых тканях, обычно получали путем слияния представляющего интерес цитокина с концом тпргетирующего IgG или scFv (Expert Opin Investig Drugs. 18 (7), июль 2009 г., cc. 991-1000; и Curr Opin Immunol. 40, июнь 2016 г., cc. 96-102). Поскольку цитокины, включая IL2, IL12 и TNF, обладают сильной токсичностью, то касательно местного действия этих цитокинов на рак ожидается, что их местная доставка к пораженной раком области с помощью антитела будет усиливать их эффективность с уменьшением при этом нежелательных реакций (непатентные документы 4, 5 и 6). Однако со всеми этими цитокинами связаны проблемы, такие, например, как: они не обладают в клинических условиях достаточной эффективностью при системной введении; их терапевтические окна являются узкими; их нельзя вводить системно из-за сильной токсичности. Это в основном связно с тем, что цитокины, включая иммуноцитокины, при системном введении оказывают воздействие на весь организм и поэтому могут проявлять токсичность путем системного действия, или цитокины можно вводить только в очень низких дозах во избежание токсичности. Кроме того, иммуноцитокины, связывающиеся с раковыми антигенами, исчезают в результате интеранализации раковыми клетками в опухолях и поэтому в некоторых случаях имеются трудности в отношении местного воздействия цитокинов на рак. Установлено, что иммуноцитокин, содержащий IL2, слитый с антителом, связывающимся с раковым антигеном, и иммуноцитокин, содержащий IL2, слитый с антителом, которое не связывается с раковым антигеном, не отличались по противоопухолевому действию (непатентный документ 7).

Молекула, содержащая цитокин и цитокиновый рецептор, соединенные через линкер, который расщепляется протеазой, характеризующейся высоким уровнем экспрессии при раке, описана в методе снижения системного действия, что является основной проблемой при применении иммуноцитокинов. Цитокин ингибируется связанным с ним через линкер цитокиновым рецептором, при этом цитокин высвобождается из цитокинового рецептора в результате расщепления линкера протеазой и тем самым приобретает активную форму. В качестве примера описана молекула, содержащая TNF-альфа и TNFR, соединенные через линкер, который расщепляется uPA (непатентный документ 8), и молекула, содержащая IL2 и IL2R, соединенные через линкер, который расщепляется ММР2 (непатентная литература 9). Однако цитокины в этих молекулах обладают биологической активностью даже до расщепления линкера, и расщепление линкера повышает их активность только примерно в 10 раз.

Причиной этому является то, что: цитокины не обладают сильной аффинностью к их рецепторам и поэтому являются активными в некоторой степени даже до расщепления протеазой; и цитокиновые рецепторы могут связываться с цитокинами даже после расщепления линкера протеазой и поэтому могут ингибировать биологическую активность цитокинов.

Описана молекула, содержащая IL2, соединенный с анти-IL2 scFv вместо IL2R, через линкер, который расщепляется ММР-2 (непатентный документ 9). Анти-IL2 scFv, примененный в этой молекуле, содержащей IL2, соединенный с анти-IL2 scFv через расщепляемый протеазой линкер, не обладает сильной аффинностью к IL2, что является очевидным, это позволяет считать, что IL2 высвобождается в результате расщепления линкера, аналогично молекуле, которая содержит цитокин, соединенный с цитокиновым рецептором.

В отличие от упомянутого выше слияния IgG-IL2, эти описанные активируемые протеазой цитокины не имели Fc-области и поэтому, вероятно, обладали коротким временем полужизни. Это затрудняло сохранение высокой экспозиции. Цитокины не различаются существенно по фармакокинетическим параметрам до и после активации путем расщепления протеазой (имеют короткое время полужизни как до, так и после активации). Таким образом, трудно расширять их терапевтические окна.

Пример 2. Проблема, ассоциированная с применением хемокинов в противораковой иммунотерапии

Хемокины (Nature Immunology 9, 2008, cc. 949-952) представляют собой основные белки, которые проявляют их действия посредством сшитых с белком G рецепторов, и относятся к группе цитокинов. Хемокины действуют на определенные лейкоциты, экспрессирующие рецептор, и обладают активностью, связанной с осуществлением миграции (хемотаксис) лейкоцитов в зависимости от концентрационных градиентов агентов (Nat Cell Biol. 18 (1), январь 2016 г., cc. 43-53). Хемокины образуются в больших количествах в областях воспаления и, как известно, вызывают миграцию лейкоцитов из кровеносных сосудов в воспалительные ткани.

Хемокины можно применять в противораковой иммунотерапии, поскольку миграция лейкоцитов может контролироваться хемокинами. Если достигается местная миграция Т-клеток, антигенпрезентирующих клеток, Ml-макрофагов и т.д. к солидной опухоли, то это может вызывать противоопухолевое действие. Цитокины могут функционировать даже при системном введении, в то время как хемокины направляют клетки к тканям в возрастающей концентрации посредством их концентрационных градиентов, и поэтому нельзя ожидать достижения требуемого действия при системном введении. В результате противораковая иммунотерапия с использованием хемокинов с помощью системного введения (хемокиновая терапия) рассматривается как не имеющая практического значения.

Пример 3. Концепция применения лигандсвязывающей молекулы, которая несет расщепляемую протеазой последовательность и обладает способностью высвобождать лиганд, специфический для ткани-мишени

Как указано в примерах 1 и 2, с ранее описанной цитокиновой или хемокиновой терапии связаны следующие проблемы:

1. Иммуноцитокины, даже, если обеспечивают с помощью антитела таргетинг цитокинов при солидном раке, вызывают нежелательные реакции, поскольку цитокины действуют системно, или их вводят лишь в низких дозах во избежание указанных нежелательных реакций, и поэтому они не могут обеспечивать высокую экспозицию опухоли.

2. В случае активируемых протеазой цитокинов, содержащих цитокиновый рецептор (или антитело) и цитокин, соединенные расщепляемым протеазой линкером, цитокин является в некоторой степени активным даже до расщепления протеазой из-за недостаточной нейтрализации активности цитокина.

3. В случае активируемых протеазой цитокинов цитокиновый рецептор (или антитело) может связываться с цитокином даже после расщепления протеазой линкера и поэтому ингибирует биологическую активность цитокина.

4. В случае активируемых протеазой цитокинов необходимая доза является высокой, поскольку неактивный цитокин обладает коротким временем полужизни и имеет короткое время циркуляции в крови.

При создании изобретения было высказано предположение, что для решения указанных проблем важно выполнять следующие условия:

1. Лиганд, такой как цитокин или хемокин, существенно ингибируют (его биологическую активность минимизируют) во всем организме с помощью лигандсвязывающей молекулы.

2. Лиганд сохраняет свою биологическую активность (становится активным лигандом) при расщеплении протеазой.

3. Лигандсвязывающая молекула утрачивает свою лигандсвязывающую активность при расщеплении протеазой.

4. Лиганд, активируемый расщеплением протеазой, имеет более короткое время полужизни по сравнению с лигандом, связанным с лигандсвязывающей молекулой до расщепления протеазой.

В настоящем изобретении предложена молекула, способность которой связывать лиганд ослабляется расщеплением сайта расщепления, в качестве фармацевтической композиции, которая удовлетворяет указанным выше условиям. Указанную лигандсвязывающую молекулу можно создавать, сначала получая связывающую лиганд молекулу, а затем встраивая сайт расщепления в связывающую молекулу.

Пример 4. Пример антитела к лиганду, несущего расщепляемую протеазой последовательность

На фиг. 1, 2 и 3 представлены примеры молекул, полученных с использованием антитела в качестве лигандсвязывающей молекулы. В этих примерах сначала получали нейтрализующее антитело против лиганда. Затем встраивали расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между вариабельной областью (VH или VL) и константной областью (СН1 или CL) нейтрализующего антитела к лиганду. Установлено, что антитело к лиганду сохраняет свою лигандсвязывающую активность после встраивания расщепляемой протеазой последовательности. Установлено, что имеет место диссоциация лиганда из нейтрализующего антитела к лиганду при расщеплении протеазой нейтрализующего антитела к лиганду, слитого или связанного с лигандом. Установлено, что отделенный в результате указанной диссоциации лиганд проявляет биологическую активность.

Как продемонстрировано на фиг. 1, С-конец лиганда и N-конец VH антитела к лиганду соединяли через линкер и расщепляемую протеазой последовательность встраивали вблизи границы между VH и СН1. При условии, что антитело к лиганду обладает достаточно сильной аффинностью к лиганду, биологическая активность лиганда существенно ингибируется. Указанное слияние лиганд-антитело к лиганду не проявляет биологическую активность даже при системном введении, поскольку лиганд является нейтрализованным. Кроме того, слияние лиганд-антитело к лиганду имеет Fc-область и поэтому обладает продолжительным временем полужизни. Из введенного системно слияния лиганд-антитело к лиганду высвобождается молекула лиганд-линкер- VH антитела к лиганду, когда расщепляемая протеазой последовательность вблизи границы между VH и СН1 расщепляется протеазой, для которой характерен высокий уровень экспрессии в опухолевой ткани. Поскольку VH или VL индивидуально не может связываться с лигандом (для связывания с лигандом необходимы обе VH и VL), то нейтрализация лиганда аннулируется, в результате чего лиганд может проявлять свое биологическое действие в опухолевой ткани. Кроме того, указанная высвободившаяся молекула лиганд-линкер- VH антитела к лиганду имеет небольшую молекулярную массу в отсутствии Fc-области и поэтому имеет очень короткое время полужизни и быстро исчезает из целого организма. Следовательно системные нежелательные реакции, вызываемые лигандом, могут минимизироваться.

Как продемонстрировано на фиг. 2, лиганд и антитело к лиганду не соединяли через линкер, в отличие от конструкции, представленной на фиг 1, антитело к лиганду, несущее расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между VH и СН1, смешивали с лигандом и вводили. При условии, что антитело к лиганду обладает достаточно сильной аффинностью к лиганду, и при наличии требуемого уровня концентрации лиганда имеет место существенное ингибирование биологической активности. Указанный комплекс лиганд-антитело к лиганду не проявляет биологическую активность даже при системном введении, поскольку лиганд является нейтрализованным. Кроме того, комплекс лиганд-антитело к лиганду имеет Fc-область и поэтому обладает продолжительным временем полужизни. Из введенного системно комплекса лиганд-антитело к лиганду высвобождается молекула VH антитела к лиганду, когда расщепляемая протеазой последовательность вблизи границы между VH и СН1 расщепляется протеазой, для которой характерен высокий уровень экспрессии в опухолевой ткани. Поскольку VH или VL индивидуально не может связываться с лигандом (для связывания с лигандом необходимы обе VH и VL), то нейтрализация лиганда аннулируется, в результате чего лиганд может проявлять свое биологическое действие в опухолевой ткани. Кроме того, указанная высвободившаяся молекула лиганд-линкер- VH антитела к лиганду имеет небольшую молекулярную массу в отсутствии Fc-области и поэтому имеет очень короткое время полужизни и быстро исчезает из целого организма. Следовательно системные нежелательные реакции, вызываемые лигандом, могут минимизироваться.

Как продемонстрировано на фиг. 3, антитело к лиганду, несущее расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между VH и СН1, вводили системно. Введенное антитело связывалось с лигандом, исходно присутствующим в организме. Последующий процесс соответствовал описанному выше на фиг. 2.

Таким образом, при применении антитела к лиганду, несущего расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между VH и СН1, может иметь место высвобождение лиганда избирательно в экспрессирующей протеазу ткани, и это обеспечивает способность лиганда проявлять его биологическое действие. Когда лиганд представляет собой цитокин, то цитокин может действовать избирательно в экспрессирующей протеазу ткани. Когда лиганд представляет собой хемокин, то хемокин может направлять экспрессирующие рецептор хемокина клетки к экспрессирующей протеазу ткани, поскольку хемокин присутствует в высокой концентрации в экспрессирующей протеазу ткани и имеет низкую концентрацию в периферической крови.

Пример 5. Получение и оценка высвобождающего CXCL10 антитела

5-1. Интродукция расщепляемой протеазой последовательности в нейтрализующее антитело к CXCL10

CXCL10 представляет собой хемокин, обладающий хемотаксическим действием на эффекторные Т-клетки. Получали экспрессионный вектор для нейтрализующего антитела к человеческому CXCL10, т.е. MabCXCL10 (тяжелая цепь: EEIVH (SEQ ID NO: 1), легкая цепь: EEIVL (SEQ ID NO: 2)), с помощью метода, известного специалистам в данной области, и экспрессировали с использованием FreeStyle 293 (фирма Life Technologies Corp.) и очищали с помощью методов, известных специалистам в данной области. Антитело MabCXCL10 содержало следующие CDR-последовательности: H-CDR1 (NNGMH; SEQ ID NO: 380), H-CDR2 (VIWFDGMNKFYVDSVKG; SEQ ID NO: 381), H-CDR3 (EGDGSGIYYYYGMDV; SEQ ID NO: 382), L-CDR1 (RASQSVSSSYLA; SEQ ID NO: 383), L-CDR2 (GASSRAT; SEQ ID NO: 384) и L-CDR3 (QQYGSSPIFT; SEQ ID NO: 385).

Взаимодействие между MabCXCL10 и человеческим CXCL10 (266-IP-010/CF, фирма R&D Systems, Inc.) оценивали с помощью Biacore. В частности, R PROTEIN А (рекомбинантный белок A) (SURE) (28-4018-60, фирма GE Healthcare Japan Corp.) иммобилизовывали на сенсорном чипе СМ3 (BR100536, фирма GE Healthcare Japan Corp.) методом аминного сочетания с использованием NHS⋅EDC. Применяемый подвижный буфер содержал 20мМ ACES, 0,05% Твин 20 и 200 мМ NaCl (рН 7,4). Инъецировали 1,563нМ человеческий CXCL10, растворенный в указанном буфере, в качестве аналита для захваченного антитела и оценивали связывание антитела с антигеном при 37°С. Сенсограмма, демонстрирующая профили SPR-ответа в зависимости от времени, после вычитания «пустого» контроля, в котором использовали аналит, состоящий только из подвижного буфера, представлена на фиг. 4. Момент времени, соответствующий началу инъекции аналита, соответствовал стартовой точке на оси абсцисс. Ответ в каждый момент времени откладывали по оси ординат, принимая ответ в исходный момент времени, когда осуществляли инъекцию аналита, за 0. Как продемонстрировано на сенсограмме, представленной на фиг. 4, связывание MabCXCL10 с человеческим CXCL10 было подтверждено.

Осуществляли исследование для встраивания расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между вариабельной областью тяжелой цепи или легкой цепи и константной областью MabCXCL10. Тяжелые цепи и легкие цепи, представленные на фиг. 5, создавали так, чтобы встраивать пептидную последовательность A (SEQ ID NO: 3), описанную последовательность, расщепляемую специфической для рака экспрессируемой урокиназой (uPA) и матриптазой (MT-SP1), в 7 сайтов вблизи границы между вариабельной областью тяжелой цепи или легкой цепи и константной областью. Создавали также варианты, в которые встраивали расщепляемую последовательность, а гликозилирование устраняли. Экспрессионные векторы, кодирующие варианты тяжелых цепей EEIVHA (SEQ ID NO: 4), EEIVHB (SEQ ID NO: 5), EEIVHC (SEQ ID NO: 6), EEIVHD (SEQ ID NO: 7), EEIVHE (SEQ ID NO: 8), EEIVHF (SEQ ID NO: 9), EEIVHG (SEQ ID NO: 10), EEIVHBG (SEQ ID NO: 11), EEIVHCG (SEQ ID NO: 12), EEIVHDG (SEQ ID NO: 13) и EEIVHEG (SEQ ID NO: 14) и варианты легких цепей EEIVLA (SEQ ID NO: 15), EEIVLB (SEQ ID NO: 16), EEIVLC (SEQ ID NO: 17), EEIVLD (SEQ ID NO: 18), EEIVLE (SEQ ID NO: 19), EEIVLF (SEQ ID NO: 20), EEIVLG (SEQ ID NO: 21) и EEIVLEG (SEQ ID NO: 22), получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.

Антитела IgG1-изотипа EEIVHA/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 4, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEIVHB/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 5, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEIVHC/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 6, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEIVHD/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 7, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEIVHE/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 8, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEIVHF/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 9, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEIVHG/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 10, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEIVHBG/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 11, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEI VHC G/EEI VL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 12, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEI VHD G/EEI VL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 13, легкая цепь: SEQ ID NO: 2) и EEIVHEG/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 14, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), несущие расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между вариабельной областью тяжелой цепи и константной областью, и антитела IgG1-изотипа EEIVH/EEIVLA (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 1, легкая цепь: SEQ ID NO: 15), EEIVH/EEIVLB (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 1, легкая цепь: SEQ ID NO: 16), EEIVH/EEIVLC (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 1, легкая цепь: SEQ ID NO: 17), EEIVH/EEIVLD (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 1, легкая цепь: SEQ ID NO: 18), EEIVH/EEIVLE (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 1, легкая цепь: SEQ ID NO: 19), EEIVH/EEIVLF (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 1, легкая цепь: SEQ ID NO: 20), EEIVH/EEIVLG (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 1, легкая цепь: SEQ ID NO: 21) и EEIVH/EEIVLEG (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 1, легкая цепь: SEQ ID NO: 22), несущие расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между вариабельной областью легкой цепи и константной областью, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием указанных вариантов тяжелой цепи в комбинации с встречающейся в естественных условиях тяжелой цепью или вариантов легкой цепи в комбинации с встречающейся в естественных условиях тяжелой цепью, с использованием FreeStyle 293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

5-2. Оценка активности связывания нейтрализующего антитела к CXCL10, несущего расщепляемую протеазой последовательность

Оценивали антитела, полученные согласно методу, описанному в примере 5-1, в отношении их взаимодействия с человеческим CXCL10 (266-IP-010/CF, фирма R&D Systems, Inc.) с помощью Biacore. Результаты представлены на фиг.6. В частности, R PROTEIN A (SURE) (28-4018-60, фирма GE Healthcare Japan Corp.) иммобилизовывали на сенсорном чипе СМ3 (BR100536, фирма GE Healthcare Japan Corp.) методом аминного сочетания с использованием NHS⋅EDC. Применяемый подвижный буфер содержал 20мМ ACES, 0,05% Твин 20 и 150 мМ NaCl (рН 7,4). Инъецировали в нем 3,125, 1,563 или 0,781нМ человеческий CXCL10 в качестве аналита для каждого захваченного антитела и связывание антитела с антигеном оценивали при 25°С. Сенсограммы, демонстрирующие профили SPR-ответа в зависимости от времени после вычитания «пустого» контроля, в котором использовали аналит, состоящий только из подвижного буфера, представлены на фиг. 6. Момент времени, соответствующий началу инъекции аналита, соответствовал стартовой точке на оси абсцисс. Ответ в каждый момент времени откладывали по оси ординат, принимая ответ в исходный момент времени, когда осуществляли инъекцию аналита, за 0. Как продемонстрировано на сенсограммах на фиг. 6, все антитела связывались с человеческим CXCL10. Таким образом, расщепляемую протеазой последовательность можно встраивать вблизи границы между вариабельной областью и константной областью антитела без снижения антигенсвязывающей активности.

5-3. Оценка расщепления протеазой нейтрализующего антитела к CXCL10, несущего расщепляемую протеазой последовательность

Подтверждали факт того, что антитела, полученные методом, описанным в примере 5-1, могут расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (МТ-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). 20нМ протеазу и 60 или 100 мкг/мл каждого антитела подвергали взаимодействию в ЗФР при 37°С в течение 20 ч. Затем расщепление протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 7. В результате установлено, что обработка протеазой EEIVHA/EEIVL, EEIVHE/EEIVL, EEIVHF/EEIVL, EEIVHG/EEIVL, EEIVHEG/EEIVL и EEIVHBG/EEIVL приводила к возникновению новой полосы, соответствующей молекулярной массе от 25 до 50 кДа. Обработка протеазой EEIVH/EEIVLEG, EEIVH/EEIVLF и EEIVH/EEIVLG приводила к созданию полосы, соответствующей молекулярной массе 25 кДа или менее. Таким образом, для антител EEIVHA/EEIVL, EEIVHE/EEIVL, EEIVHF/EEIVL, EEIVHG/EEIVL, EEIVHEG/EEIVL, EEIVHBG/EEIVL, EEIVH/EEIVLEG, EEIVH/EEIVLF и EEIVH/EEIVLG подтверждено расщепление протеазой.

5-4. Интродукция последовательности гибкого линкера в окрестности расщепляемой протеазой последовательности в нейтрализующее антитело к CXCL10, несущее расщепляемую протеазой последовательность

Осуществляли исследование для встраивания последовательности, содержащий линкер, который состоит из глицин-серинового полимера в окрестности расщепляемой протеазой последовательности в антитело EEIVHC/EEIVL, которое не подвергали расщеплению рекомбинантной человеческой матриптазой/ST14 (MT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010), описанное в примере 5-3. Создавали 5 типов тяжелых цепей, представленных на фиг. 8. Экспрессионные векторы, кодирующие варианты тяжелой цепи EEIVHC002 (SEQ ID NO: 23), EEIVHC003 (SEQ ID NO: 24), EEIVHC004 (SEQ ID NO: 25), EEIVHC005 (SEQ ID NO: 26) и EEIVHC006 (SEQ ID NO: 27), получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.

Антитела IgG1-изотипа EEIVHC002/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 23, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEIVHC003/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 24, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEIVHC004/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 25, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), EEIVHC005/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 26, легкая цепь: SEQ ID NO: 2) и EEIVHC006/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 27, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), несущие расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между вариабельной областью тяжелой цепи и константной областью, экспрессировали с помощью кратковременной экспрессии с использованием указанных вариантов тяжелой цепи в комбинации с встречающейся в естественных условиях легкой цепью и с использованием FreeStyle 293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, применяя белок А.

5-5. Оценка активности связывания нейтрализующего антитела к CXCL10, несущего расщепляемую протеазой последовательность и последовательность гибкого линкера

Оценивали антитела, полученные согласно методу, описанному в примере 5-4, в отношении их взаимодействия с человеческим CXCL10 (266-IP-010/CF, фирма R&D Systems, Inc.) с помощью Biacore. Результаты представлены на фиг. 9. В частности, R PROTEIN A (SURE) (28-4018-60, фирма GE Healthcare Japan Corp.) иммобилизовывали на сенсорном чипе СМЗ (BR100536, фирма GE Healthcare Japan Corp.) методом аминного сочетания с использованием NHSEDC. Применяемый подвижный буфер содержал 20мМ ACES, 0,05% Твин 20 и 300мМ NaCl (рН 7,4). Инъецировали в нем 6,25, 3,125, 1,563 или 0,781нМ человеческий CXCL10 в качестве аналита для каждого захваченного антитела и связывание антитела с антигеном оценивали при 25°С. Сенсограммы, демонстрирующие профили SPR-ответа в зависимости от времени после вычитания «пустого» контроля, в котором использовали аналит, состоящий только из подвижного буфера, представлены на фиг. 9. Момент времени, соответствующий началу инъекции аналита, соответствовал стартовой точке на оси абсцисс. Ответ в каждый момент времени откладывали по оси ординат, принимая ответ в исходный момент времени, когда осуществляли инъекцию аналита, за 0. Как продемонстрировано на сенсограммах на фиг. 9, все антитела связывались с человеческим CXCL10. Таким образом, расщепляемую протеазой последовательность и последовательность гибкого линкера можно встраивать вблизи границы между вариабельной областью и константной областью антитела без снижения антигенсвязывающей активности.

5-6. Оценка расщепления протеазой нейтрализующего антитела к CXCL10, несущего расщепляемую протеазой последовательность и последовательность гибкого линкера

Подтверждали факт того, что антитела, полученные методом, описанным в примере 5-5, могут расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли человеческую урокиназу (uPA) (фирма R&D Systems, Inc., 1310-SE-010) или рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (МТ-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). 12,5нМ протеазу и 133 мкг/мл каждого антитела подвергали взаимодействию в ЗФР при 37°С в течение 2 или 20 ч. Затем расщепление протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 10. В результате установлено, что обработка протеазой EEIVHC002/EEIVL, EEIVHC003/EEIVL, EEIVHC004/EEIVL, EEIVHC005/EEIVL и EEIVHEC006/EEIVL приводила к образованию новой полосы, соответствующей молекулярной массе от 25 и до 50 кДа. Таким образом, подтверждено, что антитела EEIVHC002/EEIVL, EEIVHC003/EEIVL, EEIVHC004/EEIVL, EEIVHC005/EEIVL и EEIVHEC006/EEIVL расщепляются протеазой.

Эти результаты продемонстрировали, что даже антитело, такое как EEIVHC/EEIVL, которое не подвергается расщеплению протеазой, когда несет только сайт расщепления протеазой вблизи границы между вариабельной и константной областями, можно получать в виде расщепляемой протеазой молекулы путем интродукции последовательности гибкого линкера в окрестности расщепляемой последовательности. Описанные выше результаты демонстрируют, что антитело, которое подвергается расщеплению протеазой, можно получать также путем произвольного объединения расщепляемой протеазой последовательности с гибким линкером.

5-7. Активация лиганда путем расщепления протеазой конструкции CXCL10-нейтрализующее антитело к CXCL10

Затем изучали вопрос о том, будет ли человеческий CXCL10, связанный с антителом, полученным согласно методу, описанному в примере 5-5, высвобождаться при обработке протеазой, используя Biacore. В частности, антитело EEIVHC006a/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 33, легкая цепь: SEQ ID NO: 2), полученное с помощью метода, описанного в примере 5-5, применяли для создания аналита антиген(+)/протеаза(+), аналита антиген(-)/протеаза(+) и аналита антиген(+)/протеаза(-). Применяемый аналит антиген(+)/протеаза(+) представлял собой антитело, связанное в человеческим CXCL10, и затем обработанное 20нМ рекомбинантной человеческой матриптазой/каталитический домен ST14 (MT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010) в течение 20 ч.

Применяемый аналит антиген(-)/протеаза(+) представлял собой только антитело, обработанное 20нМ рекомбинантной человеческой матриптазой/каталитический домен ST14 (MT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010) в течение 20 ч. Применяемый аналит антиген(+)/протеаза(-) представлял собой антитело, связанное с человеческим CXCL10. Для контроля системы, подтверждающегося ответы на основе связывания CXCL10, CXCL10 также применяли в качестве аналита, состоящего только из антигена. Антитело к CXCL10 иммобилизовывали на сенсорном чипе СМ3 (BR100536, фирма GE Healthcare Japan Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области. Применяемый подвижный буфер содержал 20мМ ACES и 0,05% Твин 20 (рН 7,4). Инъецировали в нем каждый из четырех типов аналитов, т.е. аналит антиген(+)/протеаза(+), аналит антиген(-)/протеаза(+), аналит антиген(+)/протеаза(-) и только антиген, и связывание человеческого CXCL10 с антителом к CXCL10 на сенсорном чипе оценивали при 25°С.

Антитело MabCXCL10a (тяжелая цепь: EEIVHa (SEQ ID NO: 65), легкая цепь: EEIVL (SEQ ID NO: 2)), имеющее такую же Fab-область, что и антитело MabCXCL10, у которого отсутствовала расщепляемая протеазой последовательность, применяли для получения аналита антиген(+)/протеаза(+), аналита антиген(-)/протеаза(+) и аналита антиген(+)/протеаза(-) таким же образом, как и для антитела EEIVHC006a/EEIVL. Аналогично вышеуказанному, антитело к CXCL10 иммобилизовывали на сенсорном чипе СМ3 (BR100536, фирма GE Healthcare Japan Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области. Применяемый подвижный буфер содержал 20мМ ACES и 0,05% Твин 20 (рН 7,4). Инъецировали в нем каждый из четырех типов аналитов, т.е. аналит антиген(+)/протеаза(+), аналит антиген(-)/протеаза(+), аналит антиген(+)/протеаза(-) и только антиген, и связывание человеческого CXCL10 с антителом к CXCL10 на сенсорном чипе оценивали при 25°С.

Сенсограммы, демонстрирующие профили SPR-ответа в зависимости от времени после вычитания контроля, в котором использовали проточные ячейки без иммобилизованного антитела к CXCL10, представлены на фиг. 11. Момент времени, соответствующий началу инъекции аналита, соответствовал стартовой точке на оси абсцисс. Ответ в каждый момент времени откладывали по оси ординат, принимая ответ в исходный момент времени, когда осуществляли инъекцию аналита, за 100. В результате установлено, что, как продемонстрировано на фиг. 11(A), CXCL10 не высвобождался обработкой протеазой MabCXCL10a, у которого отсутствовала расщепляемая последовательность. В противоположность этому, как продемонстрировано на фиг. 11(Б), подтверждено, что CXCL10 высвобождался при обработке протеазой EEIVHC006a/EEIVL.

5-8. Получение нейтрализующего антитела к CXCL10 путем замены части аминокислотной последовательности вблизи границы между вариабельной областью и константной область антитела на часть расщепляемой протеазой последовательности и последовательность гибкого линкера, и оценка расщепления протеазой

Осуществляли исследование, в котором заменяли часть аминокислотной последовательности вблизи границы между вариабельной областью тяжелой цепи и константной областью MabCXCL10 на часть расщепляемой протеазой последовательности и последовательность гибкого линкера. Тяжелые цепи, представленные на фиг. 12, создавали так, чтобы заменять частично аминокислоты тяжелых цепей на последовательность пептида A (SEQ ID NO: 3), описанную последовательность, расщепляемую специфической для рака экспрессируемой урокиназой (uPA) и матриптазой (MT-SP1). Экспрессионные векторы, кодирующие варианты тяжелых цепей EESVHA009 (SEQ ID NO: 59) и EESVHA012 (SEQ ID NO: 60), получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.

Антитела IgG1-изотипа EESVHA009/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 59, легкая цепь: SEQ ID NO: 2) и EESVHA012/EEIVL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 60, легкая цепь: SEQ ID NO: 2) экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием вариантов этих тяжелых цепей в комбинации с встречающейся в естественных условиях легкой цепью и с использованием FreeStyle 293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

Подтверждали факт того, что EESVHA009/EEIVL и EESVHA012/EEIVL могут расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли человеческую урокиназу (uPA) (фирма R&D Systems, Inc., 1310-SE-010) или рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (MT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). 12,5нМ протеазу и 100 мкг/мл каждого антитела подвергали взаимодействию в ЗФР при 37°С в течение 20 ч. Затем оценивали расщепление протеазой с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 13. В результате установлено, что обработка протеазой EESVHA009/EEIVL и EESVHA012/EEIVL приводила к образованию новой полосы, соответствующей молекулярной массе от 25 до 50 кДа. Таким образом, подтверждено, что антитела EESVHA009/EEIVL и EESVHA012/EEIVL расщепляются протеазой.

Пример 6. Обсуждение приемлемого сайта для инсерции расщепляемой последовательности для элиминации в результате расщепления протеазой способности связывать антиген

Известны сведения о получении и оценке функциональной активности in vitro антитела, несущего расщепляемую протеазой последовательность непосредственно перед аспарагиновой кислотой в положении 216 в тяжелой цепи человеческого антитела IgG1-изотипа (публикация международной заявки на патент WO 2004/021861А2). В этом документе не описаны экспериментальные данные, но заявляется, что после смешивания указанного антитела с его антигеном антиген высвобождался из комплекса антиген-антитело в результате обработки средой, содержащей соответствующую протеазу.

Аминокислота в положении 216 тяжелой цепи человеческого антитела IgG1-изотипа, заявленного в указанном документе, в которое осуществляли инсерцию расщепляемой протеазой последовательности, не представляет собой аспарагиновую кислоту согласно любой из систем нумерации, таких как нумерация Кэбота, EU-нумерация и OU-нумерация, которые описаны у Kabat Е. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд. С другой стороны, аминокислота в положении 216 тяжелой цепи человеческого антитела IgG1-изотипа, вероятно, представляет собой аспарагиновую кислоту, расположенную непосредственно после цистеина, образующего дисульфидную связь между тяжелой и легкой цепями, согласно другим известным из литературы данным (Nature 344, 12 апреля 1990 г., сс. 667-670 и Kabat Е. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4-ое изд.). В случае инсерции расщепляемой протеазой последовательности непосредственно перед указанной аспарагиновой кислотой в положении 216 образовавшееся антитело, подвергнутое расщеплению протеазой, может образовывать такие же Fab-области, что и Fab-области, которые образуются при расщеплении шарнирной области антитела папаином. Обычно считается, что расщепление папаином шарнирной области антитела с низкой степени вероятности может аннулировать способность к связыванию антигена. Следовательно, можно предположить, что указанное антитело, которое несет расщепляемую протеазой последовательность непосредственно перед аспарагиновой кислотой в положении 216, не должно утрачивать способность к связыванию антигена, даже при расщеплении соответствующей протеазой.

Следует обсудить также случай, когда расщепляемую протеазой последовательность встраивают непосредственно перед аминокислотой в положении 216 тяжелой цепи (нумерация Кэбота) человеческого антитела IgG1-изотипа согласно нумерации Кэбота, описанной у Kabat Е. и др, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд. Указанный сайт присутствует на N-концевой стороне на расстоянии нескольких аминокислот относительно цистеина в положении 220 (нумерация Кэбота), образующего дисульфидную связь между тяжелой и легкой цепями. Таким образом, влияние расщепления протеазой тяжелой цепи в этом сайте, вероятно, является сходным с влиянием делеции дисульфидной связи, образованной между тяжелой и легкой цепями. Исходя из последней ссылки, даже Fab-область, не способная образовывать дисульфидную связь между тяжелой и легкой цепями с низкой долей вероятности утрачивает способность связываться с ее антигеном (MAbs. 6 (1), январь-февраль 2014 г., сс. 204-218). Следовательно, можно предположить, что антитело не утрачивает способность к связыванию его антигена при расщеплении протеазой, даже, если расщепляемую протеазой последовательность встраивают непосредственно перед аминокислотой в положении 216 в тяжелой цепи (нумерация Кэбота) человеческого антитела IgG1-изотипа согласно нумерации Кэбота, описанной у Kabat Е. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд.

Пример 7. Оценка хемотаксической активности, ассоциированной с расщеплением протеазой комплекса нейтрализующее антитело к CXCL10 /CXCL10, несущего расщепляемую протеазой последовательность

Изучали вопрос о том, может ли комплекс, образованный CXCL10 и нейтрализующим антителом к CXCL10, которое несет расщепляемую протеазой последовательность, полученное согласно методу, описанному в примере 5, высвобождать CXCL10 при расщеплении протеазой, в результате чего CXCL10 будет проявлять хемотаксическую активность в отношении клеток.

Хемотаксическую активность CXCL10 в отношении клеток оценивали, получая трансфектированные клетки Ba/F3, которые экспрессируют мышиный CXCR3 (mCXCR3) (ниже в настоящем описании обозначены как BaF3/mCXCR3), и применяя эти клетки и проницаемую подложку HTS Transwell™-96 с поликарбонатной мембраной с размером пор 5,0 мкм (каталожный №3387, фирма Corning Inc.). Получали 5 типов аналитов: CXCL10 + протеаза, EEIVHC006a/EEIVL + CXCL10, EEIVHC006a/EEIVL + CXCL10 + протеаза, EEIVHC006a/EEIVL + протеаза и MabCXCL10 + CXCL10 + протеаза. Либо каждое антитело (MabCXCL10 или EEIVHC006a/EEIVL) в концентрации 10 мкг/мл (конечная концентрация), либо hCXCL10 (каталожный №300-12, фирма PeproTech, Inc.) в концентрации 100 нг/мл (конечная концентрация), либо и антитело, и hCXCL10, помещали в 1,5-миллилитровую микропробирку Proteosave (каталожный №MS-4265M, фирма Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) и выдерживали при температуре окружающей среды в течение 30 мин. В аналиты с протеазой после реакции добавляли мышиную MT-SP1 (mMT-SP1, каталожный №4735-SE-010, фирма R&D Systems, Inc.) в конечной концентрации 12,5нМ.

По 235 мкл каждого аналита переносили в нижнюю камеру и 2,0×10⁵ BaF3/mCXCR3-клеток/лунку инокулировали из расчета 75 мкл/лунку верхнюю камеру, давая протекать реакции в течение 6 ч. Реакцию осуществляли при 5% СО₂ и 37°С. После 6-часовой реакции 100 мкл раствора из нижней камеры переносили во флуоресцентно-люминесцентный 96-луночный планшет (каталожный №3912, фирма Corning Inc.) и к нему добавляли 100 мкл люминесцентного раствора для анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo™ (каталожный №G7571, фирма Promega Corp.). После реакции при комнатной температуре в течение 10 мин измеряли интенсивность люминесценции с использованием мультимодального ридера для микропланшетов SpectraMax М3 (фирма Molecular Devices, LLC) для оценки уровня миграции клеток в нижнюю камеру. Результаты представлены на фиг. 14.

Интенсивность люминесценции снижалась при добавлении аналита EEIVHC006a/EEIVL + CXCL10 по сравнению с аналитом CXCL10 + протеаза. Интенсивность люминесценции отражает количество мигрирующих клеток. Следовательно, установлено, что EEIVHC006a/EEIVL образует комплекс с CXCL10 и нейтрализует действие CXCL10. С другой стороны, интенсивность люминесценции восстанавливалась при добавлении аналита EEIVHC006a/EEIVL + CXCL10 + протеаза по сравнению с добавлением аналита EEIVHC006a/EEIVL + CXCL10, это продемонстрировало, что добавление указанного аналита вызывало такую же миграцию клеток, что и добавление аналита CXCL10 + протеаза. Никакого восстановления интенсивности люминесценции не обнаружено, когда добавляли аналит MabCXCL10 + CXCL10 + протеаза, содержащий антитело MabCXCL10, которое не имеет расщепляемой последовательности. Этот результат продемонстрировал, что способность EEIVHC006a/EEIVL нейтрализовать CXCL10 уменьшается при расщеплении антитела протеазой.

Пример 8. Оценка хемотаксической активности, ассоциированной с расщеплением протеазой комплекса нейтрализующее антитело к CXCL10/CXCL10, несущего расщепляемую протеазой последовательность

8-1 Получение и оценка расщепления протеазой слитого белка нейтрализующее антитело к CXCL10-CXCL10

Слитую с лигандом легкую цепь hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 (SEQ ID NO: 371) создавали, используя легкую цепь нейтрализующего антитела против человеческого CXCL10 MabCXCL10_G7 (тяжелая цепь: G7H-G1T4 (SEQ ID NO: 368), легкая цепь: G7L-LT0 (SEQ ID NO: 369)), и сливали с мутантом человеческого CXCL10 hCXCL10R75A (SEQ ID NO: 370), который имеет обусловливающую устойчивость к протеазе мутацию, через линкерную последовательность, состоящую из глицин-серинового полимера, с N -концом легкой цепи. Слитый белок G7H-G1T4/hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 368, слитая с лигандом легкая цепь: SEQ ID NO: 371) экпрессировали путем кратковременной экспрессии, используя слитую с лигандом легкую цепь в комбинации с тяжелой цепью G7H-G1T4 MabCXCL10_G7 и применяя Expi293 (фирма Life Technologies Corp.), с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

MabCXCL10_G7 имело следующие CDR-последовательности: H-CDR1 (SFSIT; SEQ ID NO: 374), H-CDR2 (EITPMFGIANYAQKFQG; SEQ ID NO: 375), H-CDR3 (DGRFDVSDLLTDKPKVTINYNGMDV; SEQ ID NO: 376), L-CDR1 (SGSSSNIGSNTVN; SEQ ID NO: 377), L-CDR2 (NNDQRPS; SEQ ID NO: 378) и L-CDR3 (ASWDDSLNGRV; SEQ ID NO: 379).

Подтверждали факт того, что слитый белок может расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли человеческую урокиназу (человеческая uPA, huPA) (фирма R&D Systems, Inc., 1310-SE-010). Расщепление слитого белка протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. 0,1 мг/мл слитого белка подвергали взаимодействию с 30нМ huPA при 37°С в течение 1 ч. Затем расщепление слитого белка оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Установлено, что антитело G7H-G1T4/hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 не расщеплялось обработкой протеазой (фиг. 15).

8-2 Оценка хемотаксической активности, ассоциированной с расщеплением протеазой слитого белка: нейтрализующее антитело к CXCL10-CXCL10

Изучали вопрос о том, может ли слитый белок: нейтрализующее антитело к CXCL10-CXCL10, содержащий CXCL10, слитый с нейтрализующим антителом к CXCL10, которое несет расщепляемую протеазой последовательность, полученное согласно методу, описанному в примере 5, высвобождать CXCL10 при расщеплении протеазой, в результате чего CXCL10 будет вызывать миграцию клеток.

В качестве эталона для сравнения с активностью hCXCL10R75A, высвободившегося из слитого белка, hCXCL10R75A-His (SEQ ID NO: 373), обладающий активностью только hCXCL10R75A, получали и очищали следующим методом: мутант человеческого CXCL10 hCXCL10R75A (SEQ ID NO: 370), несущий обусловливающую устойчивость к протеазе мутацию, метили на С-конце гистидиновой меткой для получения меченного гистидином мутанта человеческого CXCL10 hCXCL10R75A-His (SEQ ID NO: 373). hCXCL10R75A-His (SEQ ID NO: 373) экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя никель-сефарозу.

Хемотаксическую активность в отношении клеток оценивали, получая трансфектированные клетки Ba/F3, которые экспрессируют мышиный CXCR3 (mCXCR3) (ниже в настоящем описании обозначены как BaF3/mCXCR3), и применяя эти клетки и проницаемую подложку HTS Transwell™-96 с поликарбонатной мембраной с размером пор 5,0 мкм (каталожный №3387, фирма Corning Inc.).

Рекомбинантную huPA (каталожный №1310-SE, фирма R&D Systems, Inc.) добавляли в конечной концентрации 30нМ к hCXCL10R75A-His в концентрации 0,15 мкг/мл или к слитому белку G7H-G1T4/hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0, не имеющему расщепляемой протеазой последовательности, в концентрации 1,5 мкг/мл в 96-луночный планшет с глубиной лунок 2,0 мл (каталожный №P-DW-20-C-S, фирма AxyGen Scientific, Inc.), получая аналиты uPA(+). Доза 1,5 мкг/мл G7H-G1T4/hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 содержала hCXCL10R75A в количестве, соответствующем 0,15 мкг/мл. 0,15 мкг/мл hCXCL10R75A-His и 1,5 мкг/мл слитого белка G7H-G1T4/hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0, не имеющего расщепляемую протеазой последовательность, применяли в качестве аналитов uPA(-).

По 235 мкл каждого анализируемого раствора переносили в нижнюю камеру и 2,0×10⁵ BaF3/mCXCR3-клеток/лунку инокулировали из расчета 75 мкл/лунку верхнюю камеру, давая протекать реакции в течение 6 ч. Реакцию осуществляли при 5% СО₂ и 37°С. После осуществления реакции в течение 6 ч 100 мкл раствора из нижней камеры переносили в планшет OptiPlate-96 (каталожный №6005299, фирма PerkinElmer, Inc.) и к нему добавляли 100 мкл люминесцентного раствора для анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo™ (каталожный №G7571, фирма Promega Corp.). После реакции при комнатной температуре в течение 10 мин измеряли интенсивность люминесценции с использованием мультимодального ридера для микропланшетов SpectraMax М3 (фирма Molecular Devices, LLC) для оценки уровня миграции клеток в нижнюю камеру. Результаты представлены на фиг. 16. Никакого восстановления интенсивности люминесценции не обнаружено, когда антитело G7H-G1T4/hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0, которое не имеет расщепляемой последовательности, обрабатывали протеазой, по сравнению с добавлением CXCL10R75A-His.

8-3 Конструирование слитого белка нейтрализующее антитело к CXCL10 - CXCL10, несущего расщепляемую протеазой последовательность, и оценка хемотаксической активности, ассоциированной с расщеплением протеазой

Создавали аминокислотную последовательность таким образом, чтобы расщепляемая протеазой последовательность находилась вблизи границы между вариабельной и константной областями связанной с лигандом легкой цепи hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 (SEQ ID NO: 371), сконструированной согласно методу, описанному в примере 8-1. Слитый белок экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием связанной с лигандом легкой цепи, несущей расщепляемую протеазой последовательность, в комбинации с тяжелой цепью G7H-G1T4 MabCXCL10_G7 и с использованием Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

Подтверждали факт того, что слитый белок может расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли человеческую урокиназу (человеческая uPA, huPA) (фирма R&D Systems, Inc., 1310-SE-010). Расщепление слитого белка протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. 0,1 мг/мл слитого белка подвергали взаимодействию с 30нМ huPA при 37°С в течение 1 ч. Затем расщепление слитого белка оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях.

Изучали вопрос о том, может ли слитый белок нейтрализующее антитело к CXCL10-CXCL10, содержащий CXCL10, слитый с нейтрализующим антителом к CXCL10, которое несет расщепляемую протеазой последовательность, высвобождать CXCL10 при расщеплении протеазой, вызывая в результате миграцию клеток. Хемотаксическую активность оценивали путем получения трансфектированных клеток Ba/F3, экспрессирующих мышиный CXCR3 (mCXCR3) (далее в настоящем описании обозначены как BaF3/mCXCR3), и использования указанных клеток и HTS Transwell™-96 Permeable Support с поликарбонатной мембраной с размером пор 5,0 мкм.

Рекомбинантную huPA (каталожный №1310-SE, фирма R&D Systems, Inc.) добавляли в конечной концентрации 30нМ к конструкции hCXCL10R75A-His, полученной согласно методу, описанному в примере 8-2, в концентрации 0,15 мкг/мл или к слитому белку, несущему расщепляемую протеазой последовательность, в концентрации 1,5 мкг/мл в объеме 2 мл в 96-луночный планшет с глубокими лунками (каталожный №P-DW-20-C-S, фирма AxyGen Scientific, Inc.), получая аналиты uPA(+). Доза 1,5 мкг/мл слитого белка, имеющего расщепляемую протеазой последовательность, содержала hCXCL10R75A в количестве, соответствующем 0,15 мкг/мл. 0,15 мкг/мл hCXCL10R75A-His и 1,5 мкг/мл слитого белка, имеющего расщепляемую протеазой последовательность, применяли в качестве аналитов uPA(-).

По 235 мкл каждого анализируемого раствора переносили в нижнюю камеру и 2,0×10⁵ BaF3/mCXCR3-клеток/лунку инокулировали из расчета 75 мкл/лунку в верхнюю камеру, давая протекать реакции в течение 6 ч. Реакцию осуществляли при 5% CO₂ и 37°С. После 6-часовой реакции 100 мкл раствора из нижней камеры переносили в планшет OptiPlate-96 (каталожный №6005299, фирма PerkinElmer, Inc.) и к нему добавляли 100 мкл люминесцентного раствора для анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo™ (каталожный №G7571, фирма Promega Corp.). После реакции при комнатной температуре в течение 10 мин измеряли интенсивность люминесценции с использованием мультимодального ридера для микропланшетов SpectraMax М3 (фирма Molecular Devices, LLC) для оценки уровня миграции клеток в нижнюю камеру. Хемотаксическую активность оценивали на основе интенсивности люминесценции.

Пример 9. Получение нейтрализующего антитела к IL-12, несущего расщепляемую протеазой последовательность и последовательность гибкого линкера, и оценка активации IL-12, ассоциированной с расщеплением протеазой

9-1. Получение нейтрализующего антитела к IL-12, несущего расщепляемую протеазой последовательность и последовательность гибкого линкера

IL-12 представляет собой цитокин, обладающий иммуностимулирующим действием. IL-12 активирует иммуноциты и тем самым оказывает противоопухолевое действие, при этом, описано, что при системной экспозиции IL-12 вызывает также серьезные нежелательные реакции (Nat Immunol. 13 (8), 19 июля 2012 г., сс. 722-728).

UstkH-G1T4CYTM1inP 1 (SEQ ID NO: 146) создавали в виде варианта тяжелой цепи устекинумаба, нейтрализующего антитела против человеческого IL-12, путем инсерции последовательности, содержащей последовательность пептида A (SEQ ID NO: 3), которая, как описано, расщепляется урокиназой (uPA) и матриптазом (MT-SP1), и гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера, вблизи границы между вариабельной и константной областями тяжелой цепи (UstkH-G1T4, тяжелая цепь: SEQ ID NO: 144) антитела к IL12, имеющего такую же вариабельную область, что и устекинумаб. Экспрессионный вектор, кодирующий вариант антитела устекинумаб UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 146, легкая цепь: SEQ ID NO: 145), получали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя вариант тяжелой цепи в комбинации с легкой цепью (UstkL-kT0; SEQ ID NO: 145) устекинумаба. Указанный вариант антитела устекинумаб UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0 экспрессировали также путем кратковременной экспрессии с использованием FreeStyle 293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А. В этом примере антитело к IL12 и вариант этого антитела содержали следующие CDR-последовательности: H-CDR1 (TYWLG; SEQ ID NO: 386), H-CDR2 (IMSPVDSDIRYSPSFQG; SEQ ID NO: 387), H-CDR3 (RRPGQGYFDF; SEQ ID NO: 388), L-CDR1 (RASQGISSWLA; SEQ ID NO: 389), L-CDR2 (AASSLQS; SEQ ID NO: 390) и L-CDR3 (QQYNIYPYT; SEQ ID NO: 391).

9-2. Расщепление протеазой нейтрализующего антитела к IL-12, которое несет расщепляемую протеазой последовательность и последовательность гибкого линкера

Подтверждали факт того, что антитело, полученное с помощью метода, описанного в примере 9-1, может расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли полученную из организма человека человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (человеческая MT-SP1, hMT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010), полученную из организма мышей рекомбинантную мышиную матриптазу/каталитический домен ST14 (мышиная MT-SP1, mMT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 4735-SE-010) или полученную из организма человека урокиназу (человеческая uPA, huPA) (фирма R&D Systems, Inc., 1310-SE-010). Для обработки протеазой добавляли hMT-SP1, mMT-SP1 или huPA в конечной концентрации 10,1, 16,9 или 9,17 мкМ к устекинумабу (UstkH-G1T4/UstkL-kT0) или варианту антитела устекинумаб UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0, после чего осуществляли реакцию в течение ночи при 37°С.

9-3. Подтверждение расщепления расщепляемого нейтрализующего антитела к IL-12, которое несет расщепляемую протеазой последовательность и последовательность гибкого линкера, и оценка активации IL-12

Расщепление антитела протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. В результате установлено, что антитело UstkH-G1T4/UstkL-kT0 не подвергалось расщеплению любой из протеаз, в то время как обработка каждой из протеаз UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0, которое несет расщепляемую протеазой последовательность и гибкий линкер, приводила к образованию новой полосы, соответствующей молекулярной массе от 25 до 50 кДа. (фиг. 17). Таким образом, подтверждено, что нейтрализующее антитело к IL-12 (UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0), которое несет расщепляемую протеазой последовательность и последовательность гибкого линкера, расщеплялось протеазой.

Затем изучали вопрос о том, может ли IL-12, высвободившийся из его комплекса с антителом в результате расщепления антитела протеазой, проявлять физиологическую активность. Физиологическую активность IL-12 оценивали на основе производства IFN-γ (который обозначают также как интерферон гамма или IFN-g) человеческой линией клеток NK92. Клетками NK92 инокулировали из расчета 1×10⁵ клеток/лунку 96-луночный планшет для культуры клеток. 10 нг/мл IL-12 и добавляли к нему обработанное протеазой антитело (UstkH-G1T4/UstkL-kT0 или UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0; концентрация окаждого антитела: 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0054 и 0,0013 мкг/мл). Через 48 ч количество продуцированного IFN-γ измеряли с помощью ELISA. Для оценки влияния антитела на активность IL12 эксперимент (без At (No Ab)) осуществляли также, добавляя только обработанный протеазой IL12 без добавления антитела. На фиг. 18 представлены результаты измерения концентрации интерферона гамма. UstkH-G1T4/UstkL-kT0 (которое не имеет расщепляемой протеазой последовательности), обработанное каждой из протеаз, подавляло (или нейтрализовало) производство интерферона гамма с помощью IL-12, и антитело в концентрации 0,8 мкг/мл подавляло производство интерферона гамма до такого же уровня, который имел место в отсутствии IL-12 (без IL-12). С другой стороны, UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0 (содержащее расщепляемую протеазой последовательность), обработанное каждой из протеаз, приводило к производству интерферона гамма при всех концентрациях антитела, в отличие от добавления UstkH-G1T4/UstkL-kT0, не имеющего расщепляемую протеазой последовательность. На основе этого результата подтверждено, что UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0 позволяет IL-12 оказывать воздействие на клетки путем ослабления его способности нейтрализовать IL-12 в сочетании с расщеплением протеазой.

Пример 10. Оценка антитела, несущего расщепляемую протеазой последовательность, в нейтрализующем антителе против человеческого CXCL10

10-1. Интродукция расщепляемой протеазой последовательности в нейтрализующее антитело против человеческого CXCL10

Экспрессионные векторы для нейтрализующих антител к CXCL10 MabCXCL10 (тяжелая цепь: EEIVH (SEQ ID NO: 1), легкая цепь: EEIVL (SEQ ID NO: 2)) и MabCXCL10_G7 (тяжелая цепь: G7H-G1T4 (SEQ ID NO: 368), легкая цепь: G7L-LT0 (SEQ ID NO: 369)) получали с помощью метода, известного специалистам в данной области, и экспрессировали с использованием клеток FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) или клеток Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) и очищали с помощью методов, известных специалистам в данной области.

Расщепляемую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 345, встраивали вблизи границы между вариабельной областью и константной областью тяжелой цепи MabCXCL10 или MabCXCL10_G7 с получением варианта тяжелой цепи MabCXCL10 EldHA0003-G1T4 (SEQ ID NO: 356) и варианта тяжелой цепи MabCXCL10_G7 G7H. 12aa-G1T4 (SEQ ID NO: 367).

Вариант антитела MabCXCL10 EldHA0003 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 356, легкая цепь: SEQ ID NO: 2) и вариант антитела MabCXCL10_G7 G7H. 12aa (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 367, легкая цепь: SEQ ID NO: 369) экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием указанных двух типов вариантов тяжелых цепей в комбинации с легкой цепью и применяли клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) или клетки Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

10-2. Оценка расщепления протеазой нейтрализующего антитела к человеческому CXCL10, несущего расщепляемую протеазой последовательность в области его тяжелой цепи

Подтверждали факт того, что антитела, полученные с помощью метода, описанного в примере 10-1, могут расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (человеческая MT-SP1, hMT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). 10нМ протеазу и каждое антитело в концентрации 50 мкг/мл подвергали взаимодействию в ЗФР при 37°С в течение 20 ч, после чего осуществляли ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 19А и 19Б. Установлено, что обработка hMT-SP1 варианта антитела MabCXCL10 EldHA0003 или варианта антитела MabCXCL10_G7 G7H. 12aa приводила к созданию новой полосы, соответствующей молекулярной массе порядка 37 кДа. Таким образом, подтверждено, что расщепляемая протеазой последовательность, представленная в SEQ ID NO: 345, может расщепляться hMT-SP1. Кроме того, с помощью такого же метода установлено, что расщепляемая протеазой последовательность, представленная в SEQ ID NO: 345, может расщепляться человеческой uPA и мышиной uPA.

Пример 11. Получение и оценка полипептидов, несущих различные расщепляемые протеазой последовательности

11-1 Получение полипептидов, несущих последовательности, распознаваемые различными протеазами

Экспрессионный вектор для нейтрализующего антитела против человеческого IL6R MRA (тяжелая цепь: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 147), легкая цепь: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 148)), получали с помощью метода, известно специалистам в данной области. MRA имеет следующие CDR-последовательности: H-CDR1 (SDHAWS; SEQ ID NO: 398), H-CDR2 (YISYSGITTYNPSLKS; SEQ ID NO: 399), H-CDR3 (SLARTTAMDY; SEQ ID NO: 400), L-CDR1 (RASQDISSYLN; SEQ ID NO: 401), L-CDR2 (YTSRLHS; SEQ ID NO: 402) и L-CDR3 (QQGNTLPYT; SEQ ID NO: 403).

В таблице 1 представлены пептидные последовательности, для которых известно, что они расщепляются ММР-2, ММР-7 или ММР-9, и пептидные последовательности, содержащие гибкий линкер, который состоит из глицин-серинового полимера, в окрестности этих последовательностей.

Создавали варианты тяжелых цепей MEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4 (SEQ ID NO: 153), MEIVHG4SMP2.2G4S-MEIVHG4SMP2.2G4SG1T4 (SEQ ID NO: 154), MEIVHG4SMP2.4G4S-MEIVHG4SMP2.4G4SG1T4 (SEQ ID NO: 155), MEIVHG4SMP9G4S-MEIVHG4SMP9G4SG1T4 (SEQ ID NO: 156), MEIVHMP2.1-MEIVHMP2.1G1T4 (SEQ ID NO: 157), MEIVHMP2.3-MEIVHMP2.3G1T4 (SEQ ID NO: 158) и MEIVHMP7.2-MEIVHMP7.2G1T4 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 159) таким образом, чтобы указанные встроенные последовательности находились вблизи границы между вариабельной областью и константной областью тяжелой цепи антитела MRA. Экспрессионные векторы, кодирующие указанные варианты тяжелой цепи, получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.

Варианты антитела MRA, представленные в таблице 2, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием указанных вариантов тяжелых цепей в комбинации с легкой цепью MRA и применяли клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) или клетки Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

11-2. Оценка расщепления протеазой полипептидов, несущих последовательности, распознаваемые различными протеазами

Подтверждали факт того, что варианты антитела MRA, полученные с помощью метода, описанного в примере 11-1, могут расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли рекомбинантную человеческую ММР-2 (фирма R&D Systems, Inc., 902-МР-010), рекомбинантную человеческую ММР-7 (фирма R&D Systems, Inc., 907-МР-010) или рекомбинантную человеческую ММР-9 (фирма R&D Systems, Inc., 911-МР-010). Каждую протеазу применяли после смешения с 1 мМ ацетатом пара-аминофенилртути (АРМА; фирма Abcam PLC, ab112146) и активировали при 37°С в течение 1 ч или 24 ч. Повергали взаимодействию протеазу в концентрации 50, 100 или 500нМ и каждое антитело в концентрации 50 мкг/мл в буфере для анализа (набор для оценки активности ММР (флуорометрический - зеленый) (ab112146), компонент С: буфер для анализа) или в буфере, содержащем 20мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl и 5 мМ CaCl₂ (рН 7,2) (ниже в контексте настоящего описания обозначен как Трис), при 37°С в течение 20 ч. Затем расщепление протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 20А, 20Б и 21. Каждый из вариантов антитела MRA взаимодействовал с протеазой, представленной в таблице 2. Расщепление с помощью ММР-2 обнаружено для MEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.2G4S-MEIVHG4SMP2.2G4SG1 T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.4G4S-MEIVHG4SMP2.4G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHMP2.1-MEIVHMP2.1G1T4/MRAL-k0 и MEIVHMP2.3-MEIVHMP2.3G1T4/MRAL-k0. Расщепление с помощью ММР-7 обнаружено для MEIVHMP7.2-MEIVHMP7.2G1T4/MRAL-k0. Расщепление с помощью ММР-9 обнаружено для MEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4/MRAL-k0 и MEIVHG4SMP9G4S-MEIVHG4SMP9G4SG1T4/MRAL-k0.

Пример 12. Оценка антител, несущих расщепляемую протеазой последовательность в различных положениях тяжелой цепи

12-1 Получение антител, несущих расщепляемую протеазой последовательность в различных положениях тяжелой цепи

Последовательность пептида Б (SEQ ID NO: 160), для которой установлено, что она расщепляется урокиназой (uPA) и матриптазой (MT-SP1), встраивали в каждое из различных положений в вариабельной области тяжелой цепи MRA (MRAH; SEQ ID NO: 161) с получением вариантов вариабельной области тяжелой цепи MRA, которые представлены в таблице 3. Каждый из указанных вариантов вариабельной области тяжелой цепи MRA сливали с константной областью тяжелой цепи MRA (G1T4; SEQ ID NO: 162) с получением вариантов тяжелой цепи MRA. Получали соответствующие векторы для экспрессии генов с помощью метода, известного специалистам в данной области. Кроме того, последовательность пептида Б (SEQ ID NO: 160) встраивали в каждое из различных положений в константной области тяжелой цепи MRA (G1T4; SEQ ID NO: 162) с получением вариантов константной области тяжелой цепи MRA, которые представлены в таблице 4. Каждый из указанных вариантов константной области тяжелой цепи MRA сливали с вариабельной областью тяжелой цепи MRA (MRAH; SEQ ID NO: 161) с получением вариантов тяжелой цепи MRA. С помощью метода, известного специалистам в данной области получали соответствующие векторы для экспрессии генов. В таблицах 3 и 4 представлены также положения, в которые встроены расщепляемая протеазой последовательность в полученных вариантах вариабельной области тяжелой цепи MRA и вариантах константной области тяжелой цепи MRA. Представленная в таблице 3 встроенная последовательность располагалась так, что она примыкала со стороны константной области к указанному положению (нумерация Кэбота) в вариабельной области тяжелой цепи антитела. Представленная в таблице 4 встроенная последовательность располагалась так, что она примыкала со стороны вариабельной области к указанному положению (EU-нумерация) в константной области тяжелой цепи антитела.

Варианты антитела MRA, представленные в таблице 5, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием полученных указанным методом вариантов тяжелой цепи MRA в комбинации с легкой цепью MRA с использованием клеток FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) или клеток Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, применяя белок А.

12-2. Оценка расщепления протеазой нейтрализующего антитела к человеческому IL6R, несущему расщепляемую протеазой последовательность в тяжелой цепи антитела

Подтверждали факт того, что варианты антитела MRA, полученные методом, описанным в примере 12-1, могут расщепляться протеазой. В качестве протеазы использовали рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (человеческая MT-SP1, hMT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). Подвергали взаимодействию 10нМ протеазу и каждое антитело в концентрации 50 мкг/мл в ЗФР при 37°С в течение 20 ч, после чего осуществляли ДСН-ПААГ в восстанавливающих условия. Результаты представлены на фиг. 22А, 22Б, 22В, 22Г, 22Д, 22Е, 22Ж, 22З, 22И, 23А, 23Б и 23В. Обработанные протеазой варианты антитела MRA подвергались расщеплению в тяжелых цепях и образовывали соответствующую тяжелой цепи полосу в положении с меньшей молекулярной массой по сравнению с полосой, соответствующей тяжелым цепям не обработанных протеазой вариантов антитела MRA (на чертежах полоса соответствует молекулярной массе примерно 50 кДа в дорожке MT-SP1(-)). Указанные результаты подтвердили, что варианты антитела MRA, полученные с помощью метода, указанного в примере 12-1, расщеплялись hMT-SP1.

Пример 13. Оценка антител, несущих расщепляемую протеазой последовательность в различных положениях легкой цепи

13-1 Получение антител, несущих расщепляемую протеазой последовательность в различных положениях легкой цепи

Последовательность пептида Б (SEQ ID NO: 160), для которой установлено, что она расщепляется урокиназой (uPA) и матриптазой (MT-SP1), встраивали в каждое из различных положений в вариабельной области легкой цепи MRA (MRAL; SEQ ID NO: 230) с получением вариантов вариабельной области легкой цепи MRA, которые представлены в таблице 6. Каждый из указанных вариантов вариабельной области легкой цепи MRA сливали с константной областью легкой цепи MRA (k0; SEQ ID NO: 231) с получением вариантов легкой цепи MRA. Получали соответствующие векторы для экспрессии генов с помощью метода, известного специалистам в данной области. Кроме того последовательность пептида Б (SEQ ID NO: 160) встраивали в каждое из различных положений в константной области легкой цепи MRA (k0; SEQ ID NO: 231) с получением вариантов константной области легкой цепи MRA, которые представлены в таблице 7. Каждый из указанных вариантов константной области легкой цепи MRA сливали с вариабельной областью легкой цепи MRA (MRAL; SEQ ID NO: 230) с получением вариантов легкой цепи MRA. Получали соответствующие векторы для экспрессии генов с помощью метода, известного специалистам в данной области. В таблицах 6 и 7 представлены также положения расщепляемой протеазой последовательности в полученных вариантах вариабельной области легкой цепи MRA и вариантах константной области легкой цепи MRA. Представленная в таблице 6 встроенная последовательность располагалась так, что она примыкала со стороны константной области к указанному положению (нумерация Кэбота) в вариабельной области легкой цепи антитела. Представленная в таблице 7 встроенная последовательность располагалась так, что она примыкала со стороны вариабельной области к указанному положению (EU-нумерация) в константной области легкой цепи антитела.

Варианты антитела MRA, представленные в таблице 8, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием полученных указанным методом вариантов легкой цепи MRA в комбинации с тяжелой цепью MRA с использованием клеток FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) или клеток Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, применяя белок А.

13-2. Оценка расщепления протеазой нейтрализующего антитела к человеческому IL6R, несущему расщепляемую протеазой последовательность в вариабельной области легкой цепи антитела

Подтверждали факт того, что варианты антитела MRA, полученные методом, описанным в примере 13-1, могут расщепляться протеазой. В качестве протеазы использовали рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (человеческая MT-SP1, hMT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). Подвергали взаимодействию 10нМ протеазу и каждое антитело в концентрации 50 мкг/мл в ЗФР при 37°С в течение 20 ч, после чего осуществляли ДСН-ПААГ в восстанавливающих условия. Результаты представлены на фиг. 24А, 24Б, 24В, 24Г, 24Д, 25А и 25Б. Обработанные протеазой варианты антитела MRA подвергались расщеплению в легких цепях и образовывали соответствующую легкой цепи полосу в положении с меньшей молекулярной массой по сравнению с полосой, соответствующей легким цепям не обработанных протеазой вариантов антитела MRA (на чертежах полоса соответствует молекулярной массе примерно 25 кДа в дорожке MT-SP1(-)).

Пример 14. Получение нейтрализующего антитела к человеческому PD1, несущего расщепляемую протеазой последовательность, и оценка его связывания с человеческим PD1

14-1. Интродукция расщепляемой протеазой последовательности в нейтрализующее антитело к человеческому PD1

Расщепляемую протеазой последовательность встраивали в тяжелую или легкую цепь нейтрализующего антитела к человеческому PD1 5C4H-G1T4/5C4L-KT0 (тяжелая цепь: 5C4H-G1T4, SEQ ID NO: 297; вариабельная область тяжелой цепи: 5С4Н, SEQ ID NO: 300; константная область тяжелой цепи: G1T4, SEQ ID NO: 301; легкая цепь: 5C4L-KT0, SEQ ID NO: 298; вариабельная область легкой цепи: 5C4L, SEQ ID NO: 302; константная область легкой цепи: KT0, SEQ ID NO: 303; H-CDR1 (NSGMH, SEQ ID NO: 392), H-CDR2 (VIWYDGSKRYYADSVKG, SEQ ID NO: 393), H-CDR3 (NDDY, SEQ ID NO: 394), L-CDR1 (RASQSVSSYLA, SEQ ID NO: 395), L-CDR2 (DASNRAT, SEQ ID NO: 396), L-CDR3 (QQSSNWPRT, SEQ ID NO: 397)) с получением антитела, несущего расщепляемую протеазой последовательность.

Сначала пептидную последовательность (SEQ ID NO: 299), для которой известно, что она расщепляется специфически экспрессируемой при раке матриптазой (MT-SP1), встраивали в тяжелую цепь 5C4H-G1T4 или легкую цепь 5C4L-KT0 указанного выше антитела с получением вариантов тяжелой цепи, которые представлены в таблице 9 и вариантов легкой цепи, которые представлены в таблице 10. Их экспрессировали с помощью метода, известного специалистам в данной области.

Антитела IgG1-изотипа (таблица 11), несущие расщепляемую протеазой последовательность, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием вариантов тяжелой цепи, представленных в таблице 9, в комбинации с легкой цепью 5C4L-KT0 или вариантов легкой цепи, представленных в таблице 10, в комбинации с тяжелой цепью 5C4H-G1T4 и применяли Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А. 5С4Н-G1T4/5C4L-KT0 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, легкая цепь: SEQ ID NO: 298) экспрессировали и очищали в качестве контрольного антитела, не содержащего расщепляемую протеазой последовательность.

14-2. Оценка связывания человеческого PD1 нейтрализующим антителом к человеческому PD1, несущим расщепляемую протеазой последовательность

14-2-1 Обработка протеазой

Для получения обработанных протеазой антител 10 мкл рекомбинантной человеческой матриптазы/каталитический домен ST14 (hMT-SP1, фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010) с концентрацией, доведенной до 1,8 мкг/мл с помощью ЗФР, добавляли к каждому антителу (конечная концентрация: 0,111 мг/мл), полученному согласно методу, описанному в примере 14-1. Для получения необработанных протеазой антител к каждому антителу, полученному согласно методу, описанному в примере 14-1, добавляли 10 мкл только ЗФР (конечная концентрация: 0,111 мг/мл). Объем образца во время осуществления реакции составлял 90 мкл, а конечная концентрация протеазы составляла 0,2 мкг/мл. Каждый образец инкубировали при 37°С в течение 12 ч.

14-2-2 Получение биотинилированного нейтрализующего антитела к человеческому PD1

Получали биотинилированное нейтрализующее антитело к человеческому PD1, которое имеет такую же последовательность вариабельной области, что и 5C4H-G1T4/5C4L-KT0. В частности, получали генный фрагмент, кодирующий 5C4VH-G1dGSBAP (SEQ ID NO: 317), который кодирует константную область тяжелой цепи антитела и биотин (последовательность AviTag (Avi-метки) SEQ ID NO: 316), связанную с вариабельной областью тяжелой цепи 5С4Н (SEQ ID NO: 300), и интегрировали в вектор для экспрессии в клетках животных с помощью метода, известного специалистам в данной области. Сконструированным экспрессионным вектором и вектором для экспрессии легкой цепи 5C4L-KT0B (SEQ ID NO: 298) трансфектировали клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.), используя 293Fectin (фирма Invitrogen Corp.). При осуществлении этой процедуры клетки совместно трансфектировали геном для экспрессии EBNA1 (SEQ ID NO: 318) и геном для экспрессии биотинлигазы (BirA; SEQ ID NO: 319) и к ним добавляли биотин для введения биотиновой метки. Трансфектированные таким образом клетки культивировали при 37°С в атмосфере 8% СО₂ и вызывали секрецию представляющего интерес биотинилированного нейтрализующего антитела к человеческому PD1 (5С4-bio) в супернатант культуры. 5С4-bio очищали из супернатанта культуры с помощью метода, известного специалистам в данной области.

14-2-3 Оценка связывания человеческого PD1 каждым антителом до и после обработки протеазой

Человеческий PD1 добавляли в конечной концентрации 0,67мкМ к 80 мкл каждого обработанного протеазой антитела или необработанного протеазой антитела, полученного согласно методу, описанному в примере 14-2-1, и давали связываться при комнатной температур в течение 30 мин с получением образцов, в которых осуществляли оценку связывания. Определяли количество несвязанного с антителом PD1 для оценки связывания антитела с PD1 при обработке протеазой и без обработки.

В частности, количество несвязанного с антителом PD1 оценивали с помощью интерферометрии биослоя (BLI), используя биотинилированное нейтрализующее антитело к человеческому PD1 (5С4-bio), полученное согласно методу, описанному в примере 14-2-2.

Образцы для оценки связывания, 5С4-bio и ЗФР распределяли в различные лунки микропланшетов с наклонным дном (TW384) (фирма Pall ForteBio Corp., 18-5076). Стрептавидиновый биосенсор (фирма Pall ForteBio Corp., 18-0009) гидрировали с помощью ЗФР с последующим анализом с использованием устройства Octet RED 384, установленного на 30°С. Для оценки исходного уровня измерение осуществляли в течение 30 с в лунках, содержащих ЗФР. Затем 5С4-bio связывали со стрептавидиновым сенсором в течение 200 с. Вновь оценивали исходный уровень в течение 30 с в лунках, содержащих ЗФР. Затем связывание измеряли в течение 180 с в лунках, содержащих образцы, предназначенные для оценки связывания, и определяли диссоциацию в течение 180 с в лунках, содержащих ЗФР. Графики, демонстрирующие схемы связывания в реальном времени, представлены на фиг. 26. Как показано на фиг. 26, в случае антител, несущих расщепляемую протеазой последовательность, измеренное количество человеческого PD1, связанного с 5С4-bio, было больше, чем в образцах, предназначенных для оценки связывания, которые содержали обработанные протеазой антитела, по сравнению с образцами, предназначенными для оценки связывания, которые содержали необработанные протеазой антитела. Таким образом, активность в отношении связывания PD1 любого из антител, несущих расщепляемую протеазой последовательность, ослаблялась обработкой протеазой, в результате чего PD1 высвобождался из него, связываясь с 5С4-bio.

14-2-4 Подтверждение расщепления антитела протеазой (ДСН-ПААГ)

Подвергались ли антитела, применяемые в примере 14-2-3, расщеплению при обработке протеазой подтверждали с помощью ДСН-ПААГ. По 10 мкл каждого расщепленного протеазой антитела или необработанного протеазой антитела, полученного согласно методу, описанному в примере 14-2-3, смешивали с 3,3 мкл буфера для образца и инкубировали при 95°С в течение 5 мин. Затем осуществляли электрофорез, используя гель Mini-PROTEAN TGX (4-20%, 15 лунок) (фирма Bio-Rad Laboratories, Inc., №456-1096), и белки окрашивали с помощью безопасного синего красителя для образцов (Sample Blue Safe Stain) (фирма Novex, LC6065). Результаты представлены на фиг. 27. Как продемонстрировано на фиг. 27, каждое антитело, несущее расщепляемую протеазой последовательность, расщеплялось обработкой протеазой.

14-2-5 Оценка связывания PD1 антителом до и после обработки протеазой

Связывающую активность в отношении PD1 каждого антитела, несущего расщепляемую протеазой последовательность, до и после обработки протеазой измеряли также с помощью другого метода.

По 10 мкл каждого обработанного протеазой антитела или необработанного протеазой антитела, полученного согласно методу, описанному в примере 14-2-1, смешивали с 70 мкл ЗФР с получением образцов для анализа связывания PD1. Связывание PD1 в образцах оценивали с помощью интерферометрии биослоя (BLI). Обработанные протеазой антитела или необработанные протеазой антитела, полученные согласно методу, описанному в примере 14-2-1, и человеческий PD1 (250 нМ) распределяли в различные лунки микропланшетов с наклонным дном (TW384) (фирма Pall ForteBio Corp., 18-5076). Сенсор с белком G (фирма Pall ForteBio Corp., 18-0022) гидрировали с помощью ЗФР с последующим анализом с использованием устройства Octet RED 384, установленного на 30°С. Для оценки исходного уровня измерение осуществляли в течение 30 с в лунках, содержащих ЗФР. Затем антитела связывали на сенсоре с белком G в течение 200 с. Вновь оценивали исходный уровень в течение 30 с в лунках, содержащих ЗФР. Затем связывание измеряли в течение 180 с в лунках, содержащих человеческий PD1, и определяли диссоциацию в течение 180 с в лунках, содержащих ЗФР. Графики, демонстрирующие схемы связывания в реальном времени, представлены на фиг. 28. Как показано на фиг. 28, в случае применения каждого из антител, несущих расщепляемую протеазой последовательность, количество связанного человеческого PD1 снижалось при использовании обработанного протеазой антитела по сравнению с не обработанным протеазой антителом.

14-3. Оценка опосредуемого протеазой высвобождения лиганда из комплекса, содержащего лиганд (человеческий PD1) и нейтрализующее антитело к человеческому PD1, несущее расщепляемую протеазой последовательность

14-3-1 Обработка протеазой в присутствии лиганда По 10 мкл человеческого PD1, концентрацию которого доводили до 6,67 мкМ с помощью ЗФР, добавляли к каждому антителу (конечная концентрация: 0,100 мг/мл), полученному согласно методу, описанному в примере 14-1, с получением растворов комплекса антитело-PD1. Для приготовления обработанных протеазой образцов 10 мкл рекомбинантной человеческой матриптазы/ каталитический домен ST14 (hMT-SP1, фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010), концентрацию которой доводили до 5,28 мкг/мл с помощью ЗФР, добавляли к каждому раствору комплекса антитело-PD1. Для приготовления необработанных протеазой образцов к нему добавляли 10 мкл только ЗФР. Конечная концентрация протеазы в процессе осуществления реакции составляла 0,528 мкг/мл. Каждый образец инкубировали при 37°С в течение 12 ч.

14-3-2 Оценка высвобождения PD1 после обработки протеазой

Количество не входящего в комплекс с антителом PD1 оценивали с помощью интерферометрии биослоя (BLI), применяя биотинилированное нейтрализующее антитело к человеческому PD1 (5С4-bio), полученное согласно методу, описанному в примере 14-2-2.

Каждый образец, полученный согласно методу, описанному в примере 14-3-1, 5С4-bio и ЗФР распределяли в различные лунки микропланшетов с наклонным дном (TW384) (фирма Pall ForteBio Corp., 18-5076). Стрептавидиновый биосенсор (фирма Pall ForteBio Corp., 18-0009) гидрировали с помощью ЗФР с последующим анализом с использованием устройства Octet RED 384, установленного на 30°С. Для оценки исходного уровня измерение осуществляли в течение 30 с в лунках, содержащих ЗФР. Затем 5С4-bio связывали со стрептавидиновым сенсором в течение 200 с. Вновь оценивали исходный уровень в течение 30 с в лунках, содержащих ЗФР. Затем связывание измеряли в течение 180 с в лунках, содержащих обработанные протеазой образцы или необработанные протеазой образцы, и определяли диссоциацию в течение 180 с в лунках, содержащих ЗФР. Графики, демонстрирующие схемы связывания в реальном времени, представлены на фиг. 29. Как показано на фиг. 29, в случае каждого антитела, несущего расщепляемую протеазой последовательность, количество человеческого PD1, связанного с 5С4-bio, возрастало в обработанном протеазой образце по сравнению с необработанным протеазой образцом. Таким образом, активность связывания PD1 каждым из антител ослаблялась обработкой протеазой, в результате чего PD1 высвобождался и отделялся от комплекса антитело-PD1.

Пример 15. Получение и оценка слитого белка, содержащего нейтрализующее антитело к человеческому PD1, которое несет расщепляемую протеазой последовательность, и человеческий PD1 (слитый белок нейтрализующее антитело к PD1-PD1)

15-1. Получение слитого белка, содержащего нейтрализующее антитело к человеческому PD1 и человеческий PD1

Последовательность человеческого PD1 (SEQ ID NO: 320) соединяли с N-концом тяжелой цепи или варианта тяжелой цепи каждого антитела, полученного согласно методу, описанному в примере 14-1, через гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера (SEQ ID NO: 321), с получением слитых с PD1 тяжелых цепей (таблица 12).

Кроме того, последовательность человеческого PD1 (SEQ ID NO: 320) соединяли с N-концом легкой цепи или варианта легкой цепи каждого антитела, полученного согласно методу, описанному в примере 14-1, через гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера (SEQ ID NO: 321) с получением слитых с PD1 легких цепей 13).

Перечисленные ниже слитые белки: нейтрализующее антитело к PD1-PD1:

hPD15C4HA12aa-G1T4/5C4L-KT0 (слитая с PD1 тяжелая цепь: SEQ ID NO: 323, легкая цепь: SEQ ID NO: 298),

hPD15C4HE12aa-G1T4E/5C4L-KT0 (слитая с PD1 тяжелая цепь: SEQ ID NO: 324, легкая цепь: SEQ ID NO: 298),

5C4H-G1T4/hPD15C4LH12aa-KT0 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, легкая цепь: SEQ ID NO: 325),

5C4H-G1T4/hPD15C4LI12aa-KT0 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, слитая с PD1 легкая цепь: SEQ ID NO: 326),

5C4H-G1T4/hPD15C4LC12aa-KT0 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, слитая с PD1 легкая цепь: SEQ ID NO: 327),

5C4H-G1T4/hPD15C4LD12aa-KT0 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, слитая с PD1 легкая цепь: SEQ ID NO: 328),

5C4H-G1T4/hPD15C4LE12aa-KT0E (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, слитая с PD1 легкая цепь: SEQ ID NO: 329),

5C4H-G1T4/hPD15C4LB12aa-KT0B (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, слитая с PD1 легкая цепь: SEQ ID NO: 330),

5C4H-G1T4/hPD15C4LF12aa-KT0F (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, слитая с PD1 легкая цепь: SEQ ID NO: 331),

5C4H-G1T4/hPD15C4LG12aa-KT0G (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, слитая с PD1 легкая цепь: SEQ ID NO: 332),

5C4H-G1T4/hPD15C4LJ12aa-KT0J (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, слитая с PD1 легкая цепь: SEQ ID NO: 333) и

5C4H-G1T4/hPD15C4LK12aa-KT0K (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, слитая с PD1 легкая цепь: SEQ ID NO: 334),

в которых объединяли слитые с PD1 тяжелые цепи, представленные в таблице 12, с легкой цепью 5C4L-KT0, или объединяли слитые с PD1 легкие цепи, представленные в таблице 13, с тяжелой цепью 5C4H-G1T4, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А. Аналогично этому экспрессировали и очищали 5C4H-G1T4/5C4L-KT0 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 297, легкая цепь: SEQ ID NO: 298) в качестве контрольного антитела, несодержащего расщепляемую протеазой последовательность.

15-2. Оценка расщепления протеазой слитого белка нейтрализующее антитело к PD1-PD1

15-2-1 Обработка протеазой

Для получения обработанных протеазой слитых белков добавляли 4,9 мкл рекомбинантной человеческой матриптазы/ST14 каталитический домен (hMT-SP1, фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010) с концентрацией, доведенной до 16,7 мкг/мл с помощью ЗФР, к 30 мкг каждого слитого белка, полученного согласно методу, описанному в примере 15-1. Для получения необработанных протеазой слитых белков добавляли только 4,9 мкл ЗФР к 30 мкг каждого слитого белка, полученного согласно методу, описанному в примере 15-1. Обработанные протеазой слитые белки или необработанные протеазой слитые белки инкубировали при 37°С в течение 12 ч.

15-2-2 Оценка высвобождения PD1 в результате обработки протеазой

Высвобождение PD1 в результате обработки протеазой оценивали с помощью интерферометрии биослоя (BLI), используя биотинилированное нейтрализующее антитело к человеческому PD1 (5С4-bio), полученное согласно методу, описанному в примере 14-2-2.

Обработанные протеазой слитые белки или необработанные протеазой слитые белки, полученные согласно методу, описанному в примере 15-2-1, 5С4-bio и ЗФР распределяли в различные лунки микропланшетов с наклонным дном (TW384) (фирма Pall ForteBio Corp., 18-5076). Стрептавидиновый биосенсор (фирма Pall ForteBio Corp., 18-0009) гидрировали с помощью ЗФР с последующим анализом с использованием устройства Octet RED 384, установленного на 30°С. Для оценки исходного уровня измерение осуществляли в течение 30 с в лунках, содержащих ЗФР. Затем 5С4-bio связывали со стрептавидиновым сенсором в течение 200 с. Вновь оценивали исходный уровень в течение 30 с в лунках, содержащих ЗФР. Затем связывание измеряли в течение 180 с в лунках, содержащих обработанные протеазой слитые белки или необработанные протеазой слитые белки, и определяли диссоциацию в течение 180 с в лунках, содержащих ЗФР. Графики, демонстрирующие схемы связывания в реальном времени, представлены на фиг. 30. Как показано на фиг. 30, в случае каждого слитого белка антитело-PD1, содержащего антитело, которое несло расщепляемую протеазой последовательность, количество человеческого PD1, связанного с 5С4-bio, возрастало в обработанном протеазой образце по сравнению с необработанным протеазой образцом. Таким образом, активность связывания PD1 антитела в каждом из слитых белков ослаблялась обработкой протеазой, в результате чего PD1 высвобождался из слитого белка.

15-2-3 Подтверждение расщепления слитого белка нейтрализующее антитело к PD1-PD1 (ДСН-ПААГ)

Подвергались ли обработанные протеазой слитые белки, полученные согласно методу, описанному в примере 15-2-1, расщеплению при обработке протеазой определяли с помощью ДСН-ПААГ. По 10 мкл каждого обработанного протеазой слитого белка или необработанного протеазой слитого белка, полученного согласно методу, описанному в примере 15-2-1, смешивали с 3,3 мкл буфера для образца и инкубировали при 95°С в течение 5 мин. Затем осуществляли электрофорез, используя гель Mini-PROTEAN TGX (4-20%, 15 лунок) (фирма Bio-Rad Laboratories, Inc., №456-1096), и белки окрашивали с помощью безопасного синего красителя для образцов (Sample Blue Safe Stain) (фирма Novex, LC6065). Результаты представлены на фиг. 31. Как продемонстрировано на фиг. 31, каждый слитый белок, содержащий антитело, несущее расщепляемую протеазой последовательность, расщеплялся обработкой протеазой.

С целью лучшего понимания упомянутые выше варианты осуществления изобретения описаны подробно со ссылкой на фактические примеры и иллюстративные примеры. Однако описание и иллюстрации, представленные в настоящем описании, не следует интерпретировать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Содержание всей патентной литературы и научной литературы, процитированной в настоящем описании, специально полностью включено в него в качестве ссылки.

Промышленная применимость

Лигандсвязывающая молекула, предлагаемая в настоящем изобретении, в связанном с лигандом состоянии может транспортироваться in vivo и расщепляться в пораженной болезнью ткани, в результате чего ее связывание с лигандом ослабляется, что приводит к специфическому высвобождению лиганда в пораженной болезнью ткани. Тем самым пораженная болезнью ткань может специфически подвергаться воздействию лиганда. Кроме того, лигандсвязывающая молекула подавляет биологическую активность лиганда в процессе транспортировки и поэтому снижает риск системного действия лиганда. Таким образом, лигандсвязывающая молекула представляет собой большую ценность для лечения заболевания.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЧУГАИ СЕЙЯКУ КАБУСИКИ КАЙСЯ

5 <120> ЛИГАНДСВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА С РЕГУЛИРУЕМОЙ ЛИГАНДСВЯЗЫВАЮЩЕЙ

АКТИВНОСТЬЮ

<130> C1-A1615P

10 <150> JP 2016-229882

<151> 2016-11-28

<160> 537

15 <170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 452

<212> PRT

20 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

25 <400> 1

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

30

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

35 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

40 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

45

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

50

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

5

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

10

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

15 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

20 180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

25

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

30

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

35 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

40 260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

45

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

50

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

5

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

10

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

15 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

20 385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

25

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

30

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

35 Ser Leu Ser Pro

450

<210> 2

40 <211> 216

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

45 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

50 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

5 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

10 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

15

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

20

Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val

100 105 110

25 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

30 130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

35

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

40

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

45 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

50 210 215

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

5

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 3

10

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

1 5

15 <210> 4

<211> 460

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

20 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 4

25 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

30 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

35

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

40

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

45 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

50 100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Ser Gly Arg

115 120 125

5 Ser Asp Asn His Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

10 145 150 155 160

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

15

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

20

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

25 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

30 225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

35

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

40

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

50 305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

5 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

10 355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

15

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

20

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

25 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

30 435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

35

<210> 5

<211> 460

<212> PRT

40 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

45 <400> 5

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

50

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

5

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

10

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

15 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

20 100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Leu Ser

115 120 125

25

Gly Arg Ser Asp Asn His Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

30

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

35 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

40 180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

45

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

50

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

5

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

10

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

15 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

20 305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

25

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

30

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

35 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

40 385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

45

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

50

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

5

<210> 6

<211> 460

<212> PRT

10 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

15 <400> 6

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

20

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

25 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

30 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

35

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

40

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

45 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Leu Ser Gly Arg Ser Asp

115 120 125

Asn His Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

50 130 135 140

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

5 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

10 180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

15

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

20

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

25 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

30 260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

35

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

40

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

45 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

50 340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

5 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

10 385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

15

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

20

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

25 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 7

30 <211> 460

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

35 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 7

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

40 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

45

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

50

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

5

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

10

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

15 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Leu Ser Gly Arg Ser

115 120 125

Asp Asn His Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

20 130 135 140

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

25

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

30

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

35 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

40 210 215 220

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

45

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

50

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

5

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

10

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

15 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

20 340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

25

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

30

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

35 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

40 420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

45

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

50

<210> 8

<211> 460

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

5 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 8

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

10 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

15

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

20

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

25 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

30 85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

35

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Gly

115 120 125

40

Arg Ser Asp Asn His Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

45 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

50 165 170 175

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

5 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

10 210 215 220

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

15

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

20

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

25 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

30 290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

35

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

40

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

45 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

50 370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

5 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

10 420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

15

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

20

<210> 9

<211> 460

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

25

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 9

30

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

35 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

40 35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

45

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

50

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

5

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Leu

115 120 125

10

Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

15 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

20 165 170 175

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

25

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

30

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

35 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

40 245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

45

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

50

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

5

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

10

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

15 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

20 370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

25

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

30

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

35 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

40 450 455 460

<210> 10

<211> 460

45 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

50

<400> 10

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

10 35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

15

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

20

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

25 Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

30 115 120 125

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

35

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

40

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

45 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

50 195 200 205

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

5 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

10 245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

15

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

20

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

25 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

30 325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

35

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

40

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

45 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

50 405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

5 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

10 450 455 460

<210> 11

<211> 460

15 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

20

<400> 11

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

25

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

35 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

40 65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

45

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

50

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Leu Ser

115 120 125

Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

5

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

10

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

15 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

20 195 200 205

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

25

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

30

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

35 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

40 275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

45

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

50

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

5

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

10

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

15 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

20 405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

25

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

30

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

35 <210> 12

<211> 460

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

40 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 12

45 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

50 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

5 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

10 65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

15

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

20

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Leu Ser Gly Arg Ser Asp

115 120 125

25 Asn His Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

30 145 150 155 160

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

35

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

40

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

45 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

50 225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

5 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

10 275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

15

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

20

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

25 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

30 355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

35

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

40

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

45 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

50 435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

5 <210> 13

<211> 460

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

10 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 13

15 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

25

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

30

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

35 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

40 100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Leu Ser Gly Arg Ser

115 120 125

45

Asp Asn His Gly Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

50

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

5

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

10

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

15 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

20 225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

25

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

30

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

35 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

40 305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

45

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

50

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

5

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

10

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

15 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

20 435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

25

<210> 14

<211> 460

<212> PRT

30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

35 <400> 14

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

40

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

45 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

5 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

10 100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Gly

115 120 125

15

Arg Ser Asp Asn His Gly Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

20

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

25 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

30 180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

35

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

40

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

45 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

50 260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

5 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

10 305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

15

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

20

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

25 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

30 385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

35

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

40

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

45 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 15

50 <211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

5 <400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

10

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

15 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

20 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

25

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

30

Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Leu Ser Gly

100 105 110

35 Arg Ser Asp Asn His Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

115 120 125

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

40 130 135 140

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

145 150 155 160

45

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

165 170 175

50

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

180 185 190

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

195 200 205

5

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

10

<210> 16

<211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

15

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 16

20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

25 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

30 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

35

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

40

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

45 Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Leu

100 105 110

Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

50 115 120 125

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

130 135 140

5 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

145 150 155 160

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

10 165 170 175

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

180 185 190

15

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

195 200 205

20

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

25 <210> 17

<211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

30 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 17

35 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

40 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

50

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

5

Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Ser Gly Arg Ser

100 105 110

10

Asp Asn His Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

115 120 125

15 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

130 135 140

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

20 145 150 155 160

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

165 170 175

25

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

180 185 190

30

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

195 200 205

35 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 18

40 <211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

45 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

50 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

5 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

10 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

15

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

20

Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Leu Ser Gly Arg

100 105 110

25 Ser Asp Asn His Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

115 120 125

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

30 130 135 140

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

145 150 155 160

35

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

165 170 175

40

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

180 185 190

45 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

195 200 205

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

50 210 215 220

<210> 19

<211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

5

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 19

10

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

20 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

25

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

30

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

35 Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Leu Ser

100 105 110

Gly Arg Ser Asp Asn His Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

40 115 120 125

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

130 135 140

45

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

145 150 155 160

50

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

165 170 175

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

180 185 190

5

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

195 200 205

10

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

15 <210> 20

<211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

20 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 20

25 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

30 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

35

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

40

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

45 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val

50 100 105 110

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

115 120 125

5 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

130 135 140

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

10 145 150 155 160

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

165 170 175

15

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

180 185 190

20

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

195 200 205

25 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 21

30 <211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

35 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 21

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

40 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

45

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

50

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

5

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

10

Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val

100 105 110

15 Ala Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

115 120 125

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

20 130 135 140

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

145 150 155 160

25

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

165 170 175

30

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

180 185 190

35 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

195 200 205

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

40 210 215 220

<210> 22

<211> 224

45 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

50

<400> 22

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

5 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

10 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

15

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

20

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

25 Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Leu Ser

100 105 110

Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

30 115 120 125

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

130 135 140

35

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

145 150 155 160

40

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

165 170 175

45 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

180 185 190

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

50 195 200 205

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

5 <210> 23

<211> 462

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

10 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 23

15 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

25

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

30

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

35 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

40 100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Gly Leu Ser Gly Arg Ser

115 120 125

45

Asp Asn His Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

130 135 140

50

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

145 150 155 160

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

165 170 175

5

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

180 185 190

10

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

195 200 205

15 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

210 215 220

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

20 225 230 235 240

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

245 250 255

25

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

260 265 270

30

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

275 280 285

35 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

290 295 300

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

40 305 310 315 320

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

325 330 335

45

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

340 345 350

50

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

355 360 365

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

370 375 380

5

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

385 390 395 400

10

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

405 410 415

15 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

20 435 440 445

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

25

<210> 24

<211> 464

<212> PRT

30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

35 <400> 24

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

40

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

45 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

5 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

10 100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Gly Leu Ser Gly Arg

115 120 125

15

Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

20

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

25 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

30 180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

35

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

40

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

45 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

50 260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

5 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

10 305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

15

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

20

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

25 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

30 385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

35

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

40

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

45 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 25

50 <211> 466

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

5 <400> 25

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

10

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

15 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

20 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

25

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

30

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

35 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Gly Ser Gly Leu Ser Gly

115 120 125

Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

40 130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

45

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

50

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

5

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

10

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

15 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

25

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

30

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

35 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

40 340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

45

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

50

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

5

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

10

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

15 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro

20 465

<210> 26

<211> 468

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 26

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

35

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

40

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

50 65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

5 Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Gly Gly Ser Gly Leu Ser

10 115 120 125

Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

15

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

20

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

25 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

30 195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

35

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

225 230 235 240

40

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

45 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

50 275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

5 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

10 325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

15

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

20

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

25 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

30 405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

35

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

40

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

45 Ser Leu Ser Pro

465

<210> 27

50 <211> 470

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

5 <400> 27

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

10

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

15 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

20 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

25

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

30

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

35 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu

115 120 125

Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Thr Ser Ser Ala Ser

40 130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

45

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

50

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

5

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

10

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

225 230 235 240

15 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

25

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

30

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

35 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

40 340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

45

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

370 375 380

50

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

5

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

10

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

15 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro

20 465 470

<210> 28

<211> 10

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 28

Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly

1 5 10

35

<210> 29

<211> 12

<212> PRT

40 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

45 <400> 29

Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser

1 5 10

50

<210> 30

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

5 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 30

Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser

10 1 5 10

<210> 31

<211> 16

15 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

20

<400> 31

Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly

1 5 10 15

25

<210> 32

<211> 18

<212> PRT

30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

35 <400> 32

Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser

1 5 10 15

40

Gly Thr

45 <210> 33

<211> 472

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

50 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 33

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

5

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

10

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

15 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

20 65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

25

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

30

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu

115 120 125

35 Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Thr Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

40 145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

45

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

50

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

5

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

225 230 235 240

10

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

20 275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

25

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

30

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

35 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

40 355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

370 375 380

45

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

50

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

5

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

10

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

15 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 34

20 <211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

25 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 34

Pro Leu Gly Leu Ala Gly

30 1 5

<210> 35

<211> 8

35 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

40

<400> 35

Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly

1 5

45

<210> 36

<211> 4

<212> PRT

50 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 36

5 Gly Gly Gly Ser

1

<210> 37

10 <211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

15 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 37

Gly Gly Ser Gly

20 1

<210> 38

<211> 4

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 38

Gly Ser Gly Gly

1

35

<210> 39

<211> 4

<212> PRT

40 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

45 <400> 39

Ser Gly Gly Gly

1

50

<210> 40

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

5 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 40

Gly Ser Ser Gly

10 1

<210> 41

<211> 5

15 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

20

<400> 41

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

25

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

35 <400> 42

Gly Gly Gly Ser Gly

1 5

40

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

45

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 43

50

Gly Gly Ser Gly Gly

1 5

<210> 44

<211> 5

5 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

10

<400> 44

Gly Ser Gly Gly Gly

1 5

15

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

20 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

25 <400> 45

Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

30

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

35

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 46

40

Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

45 <210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

50 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 47

Gly Ser Ser Gly Gly

1 5

5

<210> 48

<211> 5

<212> PRT

10 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

15 <400> 48

Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

20

<210> 49

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

25

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 49

30

Ser Gly Gly Ser Gly

1 5

35 <210> 50

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

40 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 50

45 Gly Ser Ser Ser Gly

1 5

<210> 51

50 <211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

5 <400> 51

Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

10

<210> 52

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

15

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 52

20

Ser Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

25 <210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

30 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 53

35 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 54

40 <211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

45 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 54

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

50 1 5

<210> 55

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

5

<400> 55

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

10

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

15

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

20 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

25 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

30

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

35

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

40 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

45 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

50

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

5 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

10

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

15

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

20 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

25 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

30

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

35

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

40 <210> 56

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

45 <400> 56

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

50

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

5

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

10

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

15 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

20 100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

25

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

30

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

35 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

40 180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

45

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

50

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

5

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

10

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

15 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

20 305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

25

<210> 57

<211> 377

<212> PRT

30 <213> Homo sapiens

<400> 57

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

35 1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

40

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

50 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

5

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

10 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

115 120 125

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys

15 130 135 140

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

145 150 155 160

20

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

165 170 175

25

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

180 185 190

30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

195 200 205

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

35 210 215 220

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

225 230 235 240

40

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

245 250 255

45

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

260 265 270

50 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

275 280 285

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

290 295 300

5

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

305 310 315 320

10 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

325 330 335

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile

15 340 345 350

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

355 360 365

20

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

25

<210> 58

<211> 327

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30

<400> 58

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

35

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

40

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

50 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

5 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

10 115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

15

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

20

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

25 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

30 195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

35

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

40

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

45 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

50 275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

5 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

10 325

<210> 59

<211> 462

15 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

20

<400> 59

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

25

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

35 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

40 65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

45

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

50

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Leu Ser Gly

115 120 125

Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

130 135 140

5

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

145 150 155 160

10

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

165 170 175

15 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

180 185 190

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

20 195 200 205

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

210 215 220

25

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

225 230 235 240

30

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

245 250 255

35 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

260 265 270

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

40 275 280 285

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

290 295 300

45

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

305 310 315 320

50

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

325 330 335

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

340 345 350

5

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

355 360 365

10

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

370 375 380

15 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

20 405 410 415

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

25

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

435 440 445

30

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

35 <210> 60

<211> 468

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

40 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 60

45 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

50 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

5 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

10 65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

15

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

20

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

25 Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Thr Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

30 145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

35

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

40

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

45 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

50 225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

5 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

10 275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

15

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

20

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

25 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

30 355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

35

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

40

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

45 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

50 435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

5 Ser Leu Ser Pro

4 65

<210> 61

10 <211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

15 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 61

Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser

20 1 5 1о

<210> 62

<211> 20

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 62

Thr Val Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser

1 5 10 15

35

Thr Lys Gly Pro

20

40

<210> 63

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

45

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 63

50

Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly

1 5 10 15

Thr

5

<210> 64

<211> 26

<212> PRT

10 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

15 <400> 64

Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

1 5 10 15

20

Gly Ser Ser Gly Thr Ser Thr Lys Gly Pro

20 25

25 <210> 65

<211> 454

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

30 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 65

35 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

40 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Met Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

50

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

5

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

10

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

15 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

20 145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

25

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

30

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

35 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

40 225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

45

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

50

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

5

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

10

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

15 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

20 355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

25

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

30

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

35 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

40 435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

45

<210> 66

<211> 12

<212> PRT

50 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 66

5 Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 10

<210> 67

10 <211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

15 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 67

Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

20 1 5 10

<210> 68

<211> 18

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 68

Ala Val Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp

1 5 10 15

35

Asn His

40

<210> 69

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

45

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 69

50

Gly Ala Gly Val Pro Met Ser Met Arg Gly Gly Ala Gly

1 5 10

<210> 70

<211> 13

5 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

10

<400> 70

Gly Ala Gly Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly Ala Gly

1 5 10

15

<210> 71

<211> 8

<212> PRT

20 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

25 <400> 71

Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln

1 5

30

<210> 72

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

35

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 72

40

Gly Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln Ser

1 5 10

45 <210> 73

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

50 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 73

Pro Leu Gly Leu Trp Ala

1 5

5

<210> 74

<211> 13

<212> PRT

10 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

15 <400> 74

Gly Ala Gly Arg Pro Phe Ser Met Ile Met Gly Ala Gly

1 5 10

20

<210> 75

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

25

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 75

30

Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly Ala Gly

1 5 10

35 <210> 76

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

40 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 76

45 Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Ala Gly

1 5 10

<210> 77

50 <211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

5 <400> 77

Ala Ala Asn Leu Arg Asn

1 5

10

<210> 78

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

15

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 78

20

Ala Gln Ala Tyr Val Lys

1 5

25 <210> 79

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

30 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 79

35 Ala Ala Asn Tyr Met Arg

1 5

<210> 80

40 <211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

45 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 80

Ala Ala Ala Leu Thr Arg

50 1 5

<210> 81

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

5

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 81

10

Ala Gln Asn Leu Met Arg

1 5

15 <210> 82

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

20 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 82

25 Ala Ala Asn Tyr Thr Lys

1 5

<210> 83

30 <211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

35 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 83

Gly Ala Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val Ala Gly

40 1 5 10 15

<210> 84

<211> 8

45 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

50

<400> 84

Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly

1 5

5 <210> 85

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

10 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 85

15 Pro Arg Phe Arg Ile Ile Gly Gly

1 5

<210> 86

20 <211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

25 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 86

Gly Ala Gly Ser Gly Arg Ser Ala Gly

30 1 5

<210> 87

<211> 5

35 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

40

<400> 87

Ser Gly Arg Ser Ala

1 5

45

<210> 88

<211> 6

<212> PRT

50 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 88

5 Gly Ser Gly Arg Ser Ala

1 5

<210> 89

10 <211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

15 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 89

Ser Gly Lys Ser Ala

20 1 5

<210> 90

<211> 5

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 90

Ser Gly Arg Ser Ser

1 5

35

<210> 91

<211> 5

<212> PRT

40 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

45 <400> 91

Ser Gly Arg Arg Ala

1 5

50

<210> 92

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

5 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 92

Ser Gly Arg Asn Ala

10 1 5

<210> 93

<211> 5

15 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

20

<400> 93

Ser Gly Arg Lys Ala

1 5

25

<210> 94

<211> 6

<212> PRT

30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

35 <400> 94

Gln Arg Gly Arg Ser Ala

1 5

40

<210> 95

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

45

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 95

50

Gly Ala Gly Ser Leu Leu Lys Ser Arg Met Val Pro Asn Phe Asn Ala

1 5 10 15

Gly

5

<210> 96

<211> 6

<212> PRT

10 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

15 <400> 96

Thr Gln Gly Ala Ala Ala

1 5

20

<210> 97

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

25

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 97

30

Gly Ala Ala Ala Ala Ala

1 5

35 <210> 98

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

40 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 98

45 Gly Ala Gly Ala Ala Gly

1 5

<210> 99

50 <211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

5 <400> 99

Ala Ala Ala Ala Ala Gly

1 5

10

<210> 100

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

15

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 100

20

Leu Cys Gly Ala Ala Ile

1 5

25 <210> 101

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

30 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 101

35 Phe Ala Gln Ala Leu Gly

1 5

<210> 102

40 <211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

45 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 102

Leu Leu Gln Ala Asn Pro

50 1 5

<210> 103

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

5

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 103

10

Leu Ala Ala Ala Asn Pro

1 5

15 <210> 104

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

20 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 104

25 Leu Tyr Gly Ala Gln Phe

1 5

<210> 105

30 <211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

35 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 105

Leu Ser Gln Ala Gln Gly

40 1 5

<210> 106

<211> 6

45 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

50

<400> 106

Ala Ser Ala Ala Ser Gly

1 5

5 <210> 107

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

10 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 107

15 Phe Leu Gly Ala Ser Leu

1 5

<210> 108

20 <211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

25 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 108

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly

30 1 5

<210> 109

<211> 6

35 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

40

<400> 109

Leu Ala Gln Ala Thr Gly

1 5

45

<210> 110

<211> 17

<212> PRT

50 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 110

5 Gly Ala Gly Ser Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Ala

1 5 10 15

Gly

10

<210> 111

<211> 8

15 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

20

<400> 111

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly

1 5

25

<210> 112

<211> 8

<212> PRT

30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

35 <400> 112

Glu Ala Gln Gly Asp Lys Ile Ile

1 5

40

<210> 113

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

45

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 113

50

Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro

1 5

<210> 114

<211> 7

5 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

10

<400> 114

Tyr Val Ala Asp Ala Pro Lys

1 5

15

<210> 115

<211> 5

<212> PRT

20 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

25 <400> 115

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

30

<210> 116

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

35

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 116

40

Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

45 <210> 117

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

50 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 117

Gly Gln Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu

1 5 1о

5

<210> 118

<211> 9

<212> PRT

10 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

15 <400> 118

Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp

1 5

20

<210> 119

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

25

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 119

30

Arg Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu

1 5 1о

35 <210> 120

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

40 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 120

45 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala

1 5 10 15

<210> 121

50 <211>

<212>

<213> 15

PRT

Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

5 <400> 121

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Arg Gly Asp Asp Ala

1 5 10 15

10

<210> 122

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

15

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 122

20

Ile Glu Gly Arg

1

25 <210> 123

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

30 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 123

35 Ile Asp Gly Arg

1

<210> 124

40 <211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

45 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 124

Gly Gly Ser Ile Asp Gly Arg

50 1 5

<210> 125

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

5

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 125

10

Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln

1 5

15 <210> 126

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

20 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 126

25 Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala

1 5

<210> 127

30 <211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

35 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 127

Gly Ile Ala Gly Gln

40 1 5

<210> 128

<211> 7

45 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

50

<400> 128

Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly

1 5

5 <210> 129

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

10 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 129

15 Gly Pro Glu Gly Leu Arg Val Gly

1 5

<210> 130

20 <211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

25 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 130

Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Val Val

30 1 5

<210> 131

<211> 8

35 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

40

<400> 131

Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Arg

1 5

45

<210> 132

<211> 8

<212> PRT

50 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 132

5 Ala Gly Leu Gly Ile Ser Ser Thr

1 5

<210> 133

10 <211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

15 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 133

Glu Pro Gln Ala Leu Ala Met Ser

20 1 5

<210> 134

<211> 8

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 134

Gln Ala Leu Ala Met Ser Ala Ile

1 5

35

<210> 135

<211> 8

<212> PRT

40 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

45 <400> 135

Ala Ala Tyr His Leu Val Ser Gln

1 5

50

<210> 136

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

5 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 136

Met Asp Ala Phe Leu Glu Ser Ser

10 1 5

<210> 137

<211> 8

15 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

20

<400> 137

Glu Ser Leu Pro Val Val Ala Val

1 5

25

<210> 138

<211> 8

<212> PRT

30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

35 <400> 138

Ser Ala Pro Ala Val Glu Ser Glu

1 5

40

<210> 139

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

45

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 139

50

Asp Val Ala Gln Phe Val Leu Thr

1 5

<210> 140

<211> 8

5 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

10

<400> 140

Val Ala Gln Phe Val Leu Thr Glu

1 5

15

<210> 141

<211> 8

<212> PRT

20 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

25 <400> 141

Ala Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly

1 5

30

<210> 142

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

35

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 142

40

Pro Val Gln Pro Ile Gly Pro Gln

1 5

45 <210> 143

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

50 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 143

Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5

5

<210> 144

<211> 447

<212> PRT

10 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

15 <400> 144

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

20

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

25 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Met Ser Pro Val Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

30 50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

35

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

40

Ala Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly

100 105 110

45 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

50 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

5 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

10 180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

15

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

20

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro

225 230 235 240

25 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

30 260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

35

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

40

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

45 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

50 340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

5 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

10 385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

15

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

20

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

25 <210> 145

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

30 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 145

35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

40 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

50

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

5

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

10

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

15 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

20 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

25

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

30

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

35 Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 146

40 <211> 461

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

45 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 146

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

50 1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

5 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Met Ser Pro Val Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

10 50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

15

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

20

Ala Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly

100 105 110

25 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg

115 120 125

Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

30 130 135 140

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

145 150 155 160

35

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

165 170 175

40

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

180 185 190

45 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

195 200 205

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

50 210 215 220

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

225 230 235 240

5 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val

245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

10 260 265 270

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

275 280 285

15

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

290 295 300

20

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

305 310 315 320

25 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

325 330 335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

30 340 345 350

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

355 360 365

35

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

370 375 380

40

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

385 390 395 400

45 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

50 420 425 430

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

435 440 445

5 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 147

10 <211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

15 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 147

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

20 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

25

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

30

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

35 Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

40 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

45

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

50

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

5

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

10

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

15 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

20 210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro

225 230 235 240

25

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

30

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

35 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

40 290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

45

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

50

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

5

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

10

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

15 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

20 420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

25

<210> 148

<211> 214

<212> PRT

30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

35 <400> 148

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

40

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

45 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

5 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

10 100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

15

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

20

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

25 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

30 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

35

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

40

<210> 149

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

45

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 149

50

Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 150

<211> 18

5 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

10

<400> 150

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln Gly Gly Gly

1 5 10 15

15

Gly Ser

20

<210> 151

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

25

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 151

30

Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

35 <210> 152

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

40 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 152

45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly

1 5 10 15

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser

50 20

<210> 153

<211> 463

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

5

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 153

10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

20 35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

25

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

30

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

35 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu

40 115 120 125

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

45

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

145 150 155 160

50

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

165 170 175

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

180 185 190

5

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

10

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

210 215 220

15 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

225 230 235 240

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro

20 245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

25

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

30

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

35 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

40 325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

340 345 350

45

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

50

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

370 375 380

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

5

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

10

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

15 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

20 450 455 460

<210> 154

<211> 465

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 154

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

35

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

40

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

45 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

50 65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

5 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Leu Gly

10 115 120 125

Ile Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

15

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

20

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

25 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

30 195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

35

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

40

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg

245 250 255

45 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

50 275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

5 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

10 325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

340 345 350

15

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

20

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

25 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

30 405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

35

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

40

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

45 Pro

465

<210> 155

50 <211> 463

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

5 <400> 155

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

10

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

15 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

20 50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

25

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

30

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

35 Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu

115 120 125

Trp Ala Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

40 130 135 140

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

145 150 155 160

45

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

165 170 175

50

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

180 185 190

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

5

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

210 215 220

10

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

225 230 235 240

15 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

20 260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

25

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

30

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

35 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

40 340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

45

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

370 375 380

50

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

5

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

10

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

15 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 156

20 <211> 470

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

25 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 156

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

30 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

35

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

40

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

45 Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

50 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

5 Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val

115 120 125

Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser

10 130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

15

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

20

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

25 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

30 210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

225 230 235 240

35

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

40

Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

45 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

5 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

10 340 345 350

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

15

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

370 375 380

20

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

25 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

30 420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

435 440 445

35

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

40

Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470

45 <210> 157

<211> 460

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

50 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 157

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

5

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

10

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

15 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

20 65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

25

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

30

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Gly Ile Pro Val Ser Leu Arg

115 120 125

35 Ser Gly Ala Gly Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

40 145 150 155 160

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

45

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

50

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

5

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

10

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

20 275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

25

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

30

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

35 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

40 355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

45

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

50

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

5

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

10

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

15 <210> 158

<211> 457

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

20 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 158

25 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

30 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

35

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

40

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

45 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

50 100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln

115 120 125

5 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

130 135 140

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

10 145 150 155 160

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

165 170 175

15

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

180 185 190

20

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

195 200 205

25 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

210 215 220

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

30 225 230 235 240

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

245 250 255

35

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

260 265 270

40

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

275 280 285

45 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

290 295 300

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

50 305 310 315 320

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

325 330 335

5 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

340 345 350

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

10 355 360 365

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

370 375 380

15

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385 390 395 400

20

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

405 410 415

25 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

420 425 430

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

30 435 440 445

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455

35

<210> 159

<211> 460

<212> PRT

40 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

45 <400> 159

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

50

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

5

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

10

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

15 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

20 100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Thr

115 120 125

25

Met Gly Ala Gly Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

30

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

35 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

40 180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

45

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

50

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

5

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

10

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

15 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

20 305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

25

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

30

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

35 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

40 385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

45

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

50

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

5

<210> 160

<211> 12

<212> PRT

10 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

15 <400> 160

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 10

20

<210> 161

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

25

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 161

30

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

35 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

40 35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

45

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

50

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

5

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

10

<210> 162

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

15

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 162

20

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

25 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

30 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

35

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

40

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

45 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

50 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

5 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

10 165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

15

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

20

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

25 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

30 245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

35

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

40

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

45 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

50 325

<210> 163

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

5

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 163

10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn

1 5 10 15

15 Pro Arg Gly Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser

20 35 40 45

Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

25

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

30

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

35 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

40 115 120 125

Val Ser Ser

130

45

<210> 164

<211> 131

<212> PRT

50 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 164

5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala

1 5 10 15

Asn Pro Arg Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu

10 20 25 30

Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser

35 40 45

15

Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

20

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

25 Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

30 100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

35

Val Ser Ser

130

40

<210> 165

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

45

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 165

50

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser

1 5 10 15

Ala Asn Pro Arg Gly Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu

20 25 30

5

Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser

35 40 45

10

Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

15 Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

20 85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

25

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

30

Val Ser Ser

130

35 <210> 166

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

40 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 166

45 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Ser Gly Arg

1 5 10 15

Ser Ala Asn Pro Arg Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu

50 20 25 30

Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser

35 40 45

5 Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

10 65 70 75 80

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

15

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

20

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

25 Val Ser Ser

130

<210> 167

30 <211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

35 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 167

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Thr Ser Thr Ser Gly

40 1 5 10 15

Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu

20 25 30

45

Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser

35 40 45

50

Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

5

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

10

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

15 Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

20 130

<210> 168

<211> 131

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 168

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Ser Thr Ser

1 5 10 15

35

Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu

20 25 30

40

Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser

35 40 45

45 Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

50 65 70 75 80

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

5 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

10 115 120 125

Val Ser Ser

130

15

<210> 169

<211> 131

<212> PRT

20 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

25 <400> 169

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Thr Ser Thr

1 5 10 15

30

Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu

20 25 30

35 Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser

35 40 45

Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

40 50 55 60

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

45

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

50

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

5

Val Ser Ser

130

10

<210> 170

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

15

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 170

20

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Thr Ser

1 5 10 15

25 Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ser Gln Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser

30 35 40 45

Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

35

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

40

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

45 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

50 115 120 125

Val Ser Ser

130

5 <210> 171

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

10 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 171

15 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Thr

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gln Thr Leu Ser Leu

20 20 25 30

Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser

35 40 45

25

Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

30

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

35 Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

40 100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

45

Val Ser Ser

130

50

<210> 172

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

5 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 172

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

10 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

15

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser

35 40 45

20

Ala Asn Pro Arg Gly Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

25 Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

30 85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

35

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

40

Val Ser Ser

130

45 <210> 173

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

50 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 173

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

5

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

10

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Thr Ser Thr Ser Gly Arg

35 40 45

15 Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

20 65 70 75 80

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

25

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

30

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

35 Val Ser Ser

130

<210> 174

40 <211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

45 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 174

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

50 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

5 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Thr Ser Thr Ser Gly

35 40 45

Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

10 50 55 60

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

15

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

20

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

25 Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

30 130

<210> 175

<211> 131

35 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

40

<400> 175

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

45

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

50

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Thr Ser Thr Ser

35 40 45

Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

5

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

10

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

15 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

20 115 120 125

Val Ser Ser

130

25

<210> 176

<211> 131

<212> PRT

30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

35 <400> 176

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

40

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

45 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Thr Ser Thr

35 40 45

Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 50 55 60

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

5 Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

10 100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

15

Val Ser Ser

130

20

<210> 177

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

25

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 177

30

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

35 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Thr Ser

40 35 40 45

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

50 55 60

45

Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

50

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

5

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

10

Val Ser Ser

130

15 <210> 178

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

20 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 178

25 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

30 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

35

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala

50 55 60

40

Asn Pro Arg Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

45 Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

50 100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

5 Val Ser Ser

130

<210> 179

10 <211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

15 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 179

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

20 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

25

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

30

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser

50 55 60

35 Ala Asn Pro Arg Gly Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

40 85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

45

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

50

Val Ser Ser

130

<210> 180

<211> 131

5 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

10

<400> 180

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

20

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

25 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Ser Thr Ser Gly Arg

50 55 60

Ser Ala Asn Pro Arg Gly Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

30 65 70 75 80

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

35

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

40

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

45 Val Ser Ser

130

<210> 181

50 <211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

5 <400> 181

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

10

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

15 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Thr Ser Thr Ser Gly

20 50 55 60

Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

25

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

30

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

35 Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

40 130

<210> 182

<211> 131

45 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

50

<400> 182

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

5 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

10 35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Thr Ser Thr Ser

50 55 60

15

Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

20

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

25 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

30 115 120 125

Val Ser Ser

130

35

<210> 183

<211> 131

<212> PRT

40 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

45 <400> 183

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

50

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

5

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Thr Ser Thr

50 55 60

10

Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

15 Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

20 100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

25

Val Ser Ser

130

30

<210> 184

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

35

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 184

40

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

45 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

50 35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Thr Ser

50 55 60

5 Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ser Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

10 85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

15

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

20

Val Ser Ser

130

25 <210> 185

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

30 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 185

35 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

40 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Thr

50 55 60

50

Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Leu Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

5

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

10

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

15 Val Ser Ser

130

<210> 186

20 <211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

25 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 186

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

30 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

35

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

40

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

45 Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Lys Ser Arg Val

65 70 75 80

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

50 85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

5 Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

10 130

<210> 187

<211> 131

15 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

20

<400> 187

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

25

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

35 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ser Arg Val

40 65 70 75 80

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

45

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

50

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

5

<210> 188

<211> 131

<212> PRT

10 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

15 <400> 188

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

20

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

25 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

30 50 55 60

Lys Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Arg Val

65 70 75 80

35

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

40

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

45 Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

50 130

<210> 189

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

5

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 189

10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

20 35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

25

Lys Ser Arg Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Val

65 70 75 80

30

Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

35 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

40 115 120 125

Val Ser Ser

130

45

<210> 190

<211> 131

<212> PRT

50 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 190

5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

10 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

15

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

20

Lys Ser Arg Val Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

65 70 75 80

25 Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

30 100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

35

Val Ser Ser

130

40

<210> 191

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

45

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 191

50

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

5

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

10

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

15 Lys Ser Arg Val Thr Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg

65 70 75 80

Gly Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

20 85 90 95

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

25

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

30

Val Ser Ser

130

35 <210> 192

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

40 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 192

45 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

50 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

5 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Thr Ser Thr Ser Gly Arg

10 65 70 75 80

Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

15

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

20

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

25 Val Ser Ser

130

<210> 193

30 <211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

35 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 193

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

40 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

45

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

50

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ser Gly

65 70 75 80

5

Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

10

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

15 Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

20 130

<210> 194

<211> 131

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 194

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

35

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

40

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

45 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Thr Ser Thr Ser

50 65 70 75 80

Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

5 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

10 115 120 125

Val Ser Ser

130

15

<210> 195

<211> 131

<212> PRT

20 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

25 <400> 195

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

30

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

35 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

40 50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ser Thr

65 70 75 80

45

Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

50

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

5

Val Ser Ser

130

10

<210> 196

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

15

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 196

20

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

25 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

30 35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

35

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Thr Ser

65 70 75 80

40

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Phe Ser Leu Arg Leu Ser

85 90 95

45 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

50 115 120 125

Val Ser Ser

130

5 <210> 197

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

10 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 197

15 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

25

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

30

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

35 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn

85 90 95

Pro Arg Gly Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

40 100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

45

Val Ser Ser

130

50

<210> 198

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

5 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 198

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

10 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

15

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

20

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

25 Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala

30 85 90 95

Asn Pro Arg Gly Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

35

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

40

Val Ser Ser

130

45 <210> 199

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

50 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 199

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

5

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

10

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

15 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

20 65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser

85 90 95

25

Ala Asn Pro Arg Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

100 105 110

30

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

35 Val Ser Ser

130

<210> 200

40 <211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

45 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 200

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

50 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

5 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

10 50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

15

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

20

Ala Arg Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Leu

100 105 110

25 Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

30 130

<210> 201

<211> 131

35 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

40

<400> 201

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

45

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

50

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

5

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

10

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

15 Ala Arg Ser Leu Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

100 105 110

Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

20 115 120 125

Val Ser Ser

130

25

<210> 202

<211> 131

<212> PRT

30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

35 <400> 202

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

40

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

45 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

5 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg

10 100 105 110

Gly Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

15

Val Ser Ser

130

20

<210> 203

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

25

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 203

30

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

35 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

40 35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

45

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

50

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

100 105 110

5

Arg Gly Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

10

Val Ser Ser

130

15 <210> 204

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

20 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 204

25 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

30 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

35

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

40

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

45 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Thr Ser Thr

50 100 105 110

Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

5 Val Ser Ser

130

<210> 205

10 <211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

15 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 205

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

20 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

25

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

30

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

35 Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

40 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Thr Ser

100 105 110

45

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

50

Val Ser Ser

130

<210> 206

<211> 131

5 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

10

<400> 206

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

20

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

25 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

30 65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

35

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Thr

100 105 110

40

Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

45 Val Ser Ser

130

<210> 207

50 <211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

5 <400> 207

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

10

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

15 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

20 50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

25

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

30

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

35 Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ser Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

40 130

<210> 208

<211> 131

45 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

50

<400> 208

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

5 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

10 35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

15

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

20

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

25 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Leu Val Thr

30 115 120 125

Val Ser Ser

130

35

<210> 209

<211> 131

<212> PRT

40 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

45 <400> 209

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

50

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

5

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

10

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

15 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

20 100 105 110

Ser Leu Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Val Thr

115 120 125

25

Val Ser Ser

130

30

<210> 210

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

35

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 210

40

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

45 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

50 35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

5 Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

10 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

15

Ser Leu Val Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Thr

115 120 125

20

Val Ser Ser

130

25 <210> 211

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

30 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 211

35 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

40 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

50

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

5

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

10

Ser Leu Val Thr Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

115 120 125

15 Val Ser Ser

130

<210> 212

20 <211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

25 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 212

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

30 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

35

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

40

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

45 Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

50 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

5 Ser Leu Val Thr Val Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg

115 120 125

Gly Ser Ser

10 130

<210> 213

<211> 131

15 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

20

<400> 213

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

25

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

35 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

40 65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

45

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

50

Ser Leu Val Thr Val Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

115 120 125

Arg Gly Ser

130

5

<210> 214

<211> 131

<212> PRT

10 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

15 <400> 214

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

20

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

25 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

30 50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

35

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

40

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

45 Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn

115 120 125

Pro Arg Gly

50 130

<210> 215

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

5

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 215

10

Ala Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ser Thr Lys

1 5 10 15

15 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

20 25 30

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

20 35 40 45

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

25

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

30

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

35 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

40 115 120 125

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

45

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

50

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

5

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

10

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

15 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

20 245 250 255

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

25

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

30

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

35 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

40 325 330 335

Ser Leu Ser Pro

340

45

<210> 216

<211> 340

<212> PRT

50 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 216

5 Ala Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Thr Lys

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

10 20 25 30

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

15

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

20

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

25 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

30 100 105 110

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

35

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

40

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

45 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

50 180 185 190

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

5 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

10 225 230 235 240

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

15

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

20

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

25 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

30 305 310 315 320

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

35

Ser Leu Ser Pro

340

40

<210> 217

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

45

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 217

50

Ala Ser Thr Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Lys

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

20 25 30

5

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

10

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

15 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

20 85 90 95

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

25

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

30

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

35 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

40 165 170 175

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

45

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

50

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

5

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

10

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

15 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

20 290 295 300

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

25

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

30

Ser Leu Ser Pro

340

35 <210> 218

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

40 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 218

45 Ala Ser Thr Lys Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

50 20 25 30

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

5 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

10 65 70 75 80

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

15

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

20

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

25 Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

30 145 150 155 160

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

35

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

40

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

45 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

50 225 230 235 240

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

5 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

10 275 280 285

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

15

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

20

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

25 Ser Leu Ser Pro

340

<210> 219

30 <211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

35 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 219

Ala Ser Thr Lys Gly Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg

40 1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

20 25 30

45

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

50

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

5

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

10

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

15 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 130 135 140

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

25

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

30

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

35 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

40 210 215 220

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

45

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

50

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

5

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

10

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

15 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

Ser Leu Ser Pro

20 340

<210> 220

<211> 340

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 220

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 5 10 15

35

Arg Gly Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

20 25 30

40

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

45 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

50 65 70 75 80

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

5 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

10 115 120 125

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

15

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

20

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

25 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

30 195 200 205

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

35

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

40

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

45 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

50 275 280 285

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

5 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

10 325 330 335

Ser Leu Ser Pro

340

15

<210> 221

<211> 340

<212> PRT

20 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

25 <400> 221

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn

1 5 10 15

30

Pro Arg Gly Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

20 25 30

35 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

40 50 55 60

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

45

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

50

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

5

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

10

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

15 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

20 180 185 190

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

25

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

30

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

35 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

40 260 265 270

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

45

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

50

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

5

Ser Leu Ser Pro

340

10

<210> 222

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

15

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 222

20

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Thr Ser Thr Ser

1 5 10 15

25 Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

20 25 30

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

30 35 40 45

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

35

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

40

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

45 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

50 115 120 125

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

5 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

10 165 170 175

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

15

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

20

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

25 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

30 245 250 255

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

35

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

40

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

45 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

50 325 330 335

Ser Leu Ser Pro

340

5 <210> 223

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

10 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 223

15 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Thr Ser Thr

1 5 10 15

Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

20 20 25 30

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

25

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

30

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

35 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

40 100 105 110

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

45

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

50

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

5

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

10

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

15 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

20 225 230 235 240

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

25

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

30

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

35 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

40 305 310 315 320

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

45

Ser Leu Ser Pro

340

50

<210> 224

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

5 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 224

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Thr Ser

10 1 5 10 15

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ser Lys Ser Thr Ser Gly

20 25 30

15

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

20

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

25 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

30 85 90 95

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

35

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

40

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

45 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 165 170 175

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

5 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

10 210 215 220

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

15

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

20

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

25 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

30 290 295 300

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

35

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

40

Ser Leu Ser Pro

340

45 <210> 225

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

50 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 225

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Thr

1 5 10 15

5

Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Lys Ser Thr Ser Gly

20 25 30

10

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

15 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

20 65 70 75 80

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

25

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

30

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

35 Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

40 145 150 155 160

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

45

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

50

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

5

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

10

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

15 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

20 275 280 285

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

25

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

30

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

35 Ser Leu Ser Pro

340

<210> 226

40 <211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

45 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 226

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

50 1 5 10 15

Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ser Gly

20 25 30

5 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

10 50 55 60

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

15

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

20

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

25 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

30 130 135 140

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

35

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

40

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

45 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

50 210 215 220

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

5 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

10 260 265 270

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

15

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

20

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

25 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

Ser Leu Ser Pro

30 340

<210> 227

<211> 340

35 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

40

<400> 227

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

45

Ser Thr Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ser Gly

20 25 30

50

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

5

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

10

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

15 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

20 115 120 125

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

25

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

30

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

35 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

40 195 200 205

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

45

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

50

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

5

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

10

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

15 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

20 325 330 335

Ser Leu Ser Pro

340

25

<210> 228

<211> 340

<212> PRT

30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

35 <400> 228

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

40

Ser Thr Ser Gly Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

20 25 30

45 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

35 40 45

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 50 55 60

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

5 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

10 100 105 110

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

15

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

20

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

25 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

165 170 175

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

30 180 185 190

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

35

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

40

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

45 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

50 260 265 270

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

5 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

10 305 310 315 320

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

15

Ser Leu Ser Pro

340

20

<210> 229

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

25

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 229

30

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

35 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

20 25 30

Arg Gly Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

40 35 40 45

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

50 55 60

45

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

65 70 75 80

50

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

100 105 110

5

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

115 120 125

10

Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

130 135 140

15 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

145 150 155 160

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

20 165 170 175

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

180 185 190

25

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

195 200 205

30

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

210 215 220

35 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

40 245 250 255

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

45

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

50

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

5

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

10

Ser Leu Ser Pro

340

15 <210> 230

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

20 <220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 230

25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

30 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

35

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

40

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

45 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

50 100 105

<210> 231

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

5

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 231

10

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

20 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

25

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

30

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

35 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 232

40 <211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

45 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 232

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn

50 1 5 10 15

Pro Arg Gly Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

5 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

10 50 55 60

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

15

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

85 90 95

20

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

25 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115

<210> 233

30 <211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

35 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 233

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala

40 1 5 10 15

Asn Pro Arg Gly Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

45

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

50

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

5

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

85 90 95

10

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

15 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115

<210> 234

20 <211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

25 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 234

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser

30 1 5 10 15

Ala Asn Pro Arg Gly Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

35

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

40

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

45 Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

50 85 90 95

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

5 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115

<210> 235

10 <211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

15 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 235

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg

20 1 5 10 15

Ser Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

25

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

30

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

35 Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

40 85 90 95

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

45

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115

50

<210> 236

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

5 <223> an artificially synthesized sequence

<400> 236

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Ser Thr Ser Gly

10 1 5 10 15

Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

15

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

20

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

25 Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

30 85 90 95

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

35

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115

40

<210> 237

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

45

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 237

50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Thr Ser

1 5 10 15

Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

5

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

10

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

15 Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

20 85 90 95

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

25

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115

30

<210> 238

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

35

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 238

40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Thr

1 5 10 15

45 Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

50 35 40 45

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

5 Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

10 85 90 95

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

15

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115

20

<210> 239

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

25

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 239

30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Thr Ser

1 5 10 15

35 Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Val Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

40 35 40 45

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

45

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

50

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

85 90 95

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

5

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115

10

<210> 240

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

15

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 240

20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Thr

1 5 10 15

25 Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

30 35 40 45

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

35

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

40

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

85 90 95

45 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

50 115

<210> 241

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

5

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 241

10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

15 Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

20 35 40 45

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

25

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

30

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

85 90 95

35 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

40 115

<210> 242

<211> 119

45 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

50

<400> 242

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

5 Asp Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Arg Val Thr

20 25 30

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

10 35 40 45

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

15

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

20

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

85 90 95

25 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

30 115

<210> 243

<211> 119

35 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

40

<400> 243

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

45

Asp Arg Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Val Thr

20 25 30

50

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

5

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

10

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

85 90 95

15 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

20 115

<210> 244

<211> 119

25 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

30

<400> 244

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

35

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

40

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn

35 40 45

45 Pro Arg Gly Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

50 65 70 75 80

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

85 90 95

5 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

10 115

<210> 245

<211> 119

15 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

20

<400> 245

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

25

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala

35 40 45

35 Asn Pro Arg Gly Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

50 55 60

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

40 65 70 75 80

Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

85 90 95

45

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln