Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент, который имеет ингибирующий домен, ингибирующий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена, и обладающему более длительным временем полужизни, чем время полужизни антигенсвязывающего домена, в том случае, если он присутствует индивидуально, к способам получения и скрининга полипептида, фармацевтической композиции, которая содержит полипептид, способам получения и скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VL-, VH- или VHH-доменом, и к библиотеке слитых полипептидов, в которые включено однодоменное антитело, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VL, VH или VHH.

Предпосылки создания изобретения

Антитела привлекают внимание в качестве лекарственных средств благодаря их высокой стабильности в плазме и небольшому количеству побочных действий. Среди них большое количество лекарственных средства на основе антител IgG-типа поступают в продажу, и в настоящее время много лекарственных средств на основе антител находится в разработке (непатентные документы 1 и 2).

Ритуксан против CD20, цетуксимаб против EGFR, герцептин против HER2, и т.п. к настоящему времени одобрены в качестве терапевтических лекарственных средств в виде лекарственных средств на основе антител против рака (непатентный документ 3). Указанные молекулы антител связываются с их антигенами, экспрессируемыми на раковых клетках, и в результате проявляют цитотоксическую активность в отношении раковых клеток посредством ADCC, ингибирования сигнала и т.д. Известно, что указанная цитотоксическая активность, основанная на ADCC-активности и т.д., зависит от количества антигенов, экспрессируемых на клетках, которые являются мишенями терапевтических антител (непатентный документ 4). Кроме того, высокие уровни экспрессии таргетных антигенов являются предпочтительными с точки зрения воздействий терапевтических антител. Однако, если антиген, хотя и имеющий высокий уровень экспрессии, экспрессируется в здоровых тканях, то цитотоксическая активность, основанная на ADCC-активности и т.д., оказывает воздействие на здоровые клетки. В результате нежелательные реакции становятся серьезной проблемой. В связи с этим, предпочтительно, чтобы антигены, таргетируемые терапевтическими антителами, которые применяют в качестве терапевтических лекарственных средств при раке, экспрессировались специфически на раковых клетках. Например, молекула антитела против ЕрСАМ (молекула клеточной адгезии эпителия), которая известна в качестве ракового антигена, рассматривалась в качестве перспективной в качестве терапевтического лекарственного средства при раке. Однако, известно, что ЕрСАМ экспрессируется также в поджелудочной железе. Так, описано, что по результатам клинических испытаний введение антитела к ЕрСАМ вызывает панкреатит в качестве нежелательной реакции из-за цитотоксической активности в отношении поджелудочной железы (непатентный документ 5).

После успехов, достигнутых в отношении лекарственных средств на основе антител, обладающих цитотоксической активностью, основанной на ADCC-активности, опубликованы данные о втором поколении улучшенных молекул антител, обладающих сильной цитотоксической активностью, обусловленной, например, повышением ADCC-активности путем удаления фукозы из N-связанного олигосахарида встречающейся в естественных условиях Fc-области человеческого IgG1 (непатентный документ 6) или повышением ADCC-активности путем усиления связывания с FcγRIIIa посредством аминокислотной замены во встречающейся в естественных условиях Fc-области человеческого IgG1 (непатентный документ 7). Улучшенные молекулы антител, обладающие более сильной цитотоксической активностью, такие как конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC), содержащий антитело, конъюгированное с лекарственным средством, которое обладает сильной цитотоксической активностью (непатентный документ 8), и низкомолекулярное антитело, обладающее цитотоксической активностью в отношении раковых клеток в результате рекрутинга Т-клеток к раковым клеткам (непатентный документ 9), описаны также в качестве лекарственных средств на основе антител, обладающих цитотоксической активностью в отношении раковых клеток, с использованием механизма, отличного от упомянутой выше опосредуемой NK-клетками ADCC-активности.

Указанные молекулы антител, обладающие более сильной цитотоксической активностью, могут проявлять цитотоксическую активность даже в отношении раковых клеток, которые экспрессирует невысокие уровни антигена, но также проявлять цитотоксическую активность в отношении здоровых тканей, в которых экспрессируются низкие уровни антигена, аналогичного антигену раковых клеток. Так, EGFR-BiTE, биспецифическое антитело против CD3 и EGFR, может проявлять сильную цитотоксическую активность в отношении раковых клеток и обладать противоопухолевым действием путем рекрутинга Т-клеток к раковым клеткам, сравнимого с действием цетуксимаба, встречающегося в естественных условиях человеческого IgG1 против EGFR. С другой стороны, установлено также, что серьезные нежелательные реакции проявляются при введении EGFR-BiTE обезьянам циномолгус, поскольку EGFR экспрессируется также в здоровых тканях (непатентный документ 10). Кроме того, в клинических условиях обнаружено, что ADC биватузумаба с мертансином, который содержит мертансин, конъюгированный с антителом против CD44v6, отличающегося высоким уровнем экспрессии на раковых клетках, вызывает серьезную кожную токсичность и гепатотоксичность, поскольку CD44v6 экспрессируется также в здоровых тканях (непатентный документ 11).

Как отмечалось выше, применение антитела, которое может обладать сильной цитотоксической активностью даже в отношении раковых клеток, экспрессирующих низкие уровни антигена, требует, чтобы антиген-мишень экспрессировался исключительно специфическим для рака образом. Однако с учетом того, что антиген-мишень HER2 герцептина или антиген-мишень EGFR цетуксимаба экспрессируется также в здоровых тканях, лишь ограниченное количество раковых антигенов может экспрессироваться исключительно специфическим для рака образом. Поэтому нежелательные реакции, вызываемые цитотоксическим действием на здоровые ткани, могут стать проблемой, хотя цитотоксическая активность в отношении раковых клеток может повышаться.

В настоящее время установлено, что ипилимумаб, который повышает опухолевый иммунитет путем ингибирования CTLA4, участвующего в иммуносупрессии при раке, удлиняет общую выживаемость при метастатической меланоме (непатентный документ 12). Однако ипилимумаб системно ингибирует CTLA4 и поэтому вызывает напоминающие аутоиммунитет серьезные нежелательные реакции из-за системной активации иммунитета, хотя повышает опухолевый иммунитет (непатентный документ 13).

При этом лекарственные средства на основе антител, обладающие терапевтическим действием путем ингибирования воспалительных цитокинов при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях, известны в качестве лекарственных средств на основе антител, предназначенных для лечения болезней, отличных от рака (непатентный документ 14). Известно, что, например, ремикад или хумира, таргетирующие TNF, и актемра, таргетирующая IL-6R, обладают высоким терапевтическим действием в отношении ревматоидного артрита, при этом инфекционное заболевание проявляется в качестве нежелательной реакции, связанной с системной нейтрализацией этих цитокинов (непатентный документ 15).

В качестве методов, пригодных для второго поколения лекарственных средств на основе антител, разработаны различные методы. Например, опубликованы данные о методах, повышающих эффекторные функции, способность связывать антиген, фармакокинетические параметры или стабильность, или снижающих риск иммуногенности (непатентный документ 16). Однако к настоящему времени известно лишь небольшое количество сведений о методах, которые позволяют лекарственным средствам на основе антител действовать специфически на ткань-мишень для разрешения проблемы, обусловленной нежелательными реакциями указанными выше. Описанные методы включают метод, в котором: соединяют антитело с маскирующим пептидом через линкер, который расщепляется протеазой, которая экспрессируется в пораженной области, такой как раковая ткань или воспалительная ткань, маскируя тем самым антигенсвязывающий сайт антитела с помощью маскирующего пептида и ингибируя антигенсвязывающую активность антитела; и отделяют от него в результате диссоциации маскирующий пептид с помощью расщепления протеазой этого линкера так, что антитело сохраняет свою антигенсвязывающую активность и приобретает способность связываться с антигеном в патологической ткани-мишени (непатентные документы 17 и18 и патентный документ 1).

Перечень процитированных документов

[Патентные документы]

[Патентный документ 1] Публикация международной заявки на патент WO 2010/081173.

[Непатентные документы]

[Непатентный документ 1] Janice М. Reichert, Clark J. Rosensweig, Laura В. Faden и Matthew С. Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic. Nat. Biotechnol. 23, 2005, cc. 1073-1078.

[Непатентный документ 2] Pavlou А.K., Belsey M.J., The therapeutic antibodies market to 2008. Eur. J. Pharm. Biopharm. 59 (3), 2005, cc. 389-396.

[Непатентный документ 3] Weiner L.M., Surana R., Wang S., Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat. Rev. Immunol. 10 (5), 2010, cc. 317-327.

[Непатентный документ 4] Lewis G.D, Figari I., Fendly В., Wong W.L., Carter P., Gorman C., Shepard H.M., Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol. Immunotherapy 37, 1993, cc. 255-263.

[Непатентный документ 5] de Bono J.S., Tolcher A.W., Forero A., Vanhove G.F., Takimoto C., Bauer R.J., Hammond L.A., Patnaik A., White M.L., Shen S., Khazaeli M.B., Rowinsky E.K., LoBuglio A.F., ING-1, a monoclonal antibody targeting Ep-CAM in patients with advanced adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 10 (22), 2004, cc. 7555-7565.

[Непатентный документ 6] Satoh M., Iida S., Shitara K., Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies. Expert Opin. Biol. Ther. 6 (11), 2006, cc. 1161-1173.

[Непатентный документ 7] Desjarlais J.R., Lazar G.A., Zhukovsky E.A., Chu S.Y., Optimizing engagement of the immune system by anti-tumor antibodies: an engineer's perspective. Drug Discov. Today 12 (21-22), 2007, cc. 898-910.

[Непатентный документ 8] Alley S.C., Okeley N.M., Senter P.D., Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Curr. Opin. Chem. Biol. 14 (4), 2010, cc. 529-537.

[Непатентный документ 9] BiTE: Teaching antibodies to engage T-cells for cancer therapy. Baeuerle P.A., Kufer P., Bargou R., Curr. Opin. Mol. Ther. 11 (1), 2009, cc. 22-30.

[Непатентный документ 10] Lutterbuese R., Raum Т., Kischel R., Hoffmann P., Mangold S., Rattel В., Friedrich M., Thomas O., Lorenczewski G., Rau D., Schaller E., Herrmann I., Wolf A., Urbig Т., Baeuerle P.A., Kufer P., T cell-engaging BiTE antibodies specific for EGFR potently eliminate KRAS- and BRAF-mutated colorectal cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (28), 2010, cc. 12605-12610.

[Непатентный документ 11] Riechelmann H., Sauter A., Golze W., Hanft G., Schroen C., Hoermann K., Erhardt Т., Gronau S., Phase I trial with the CD44v6-targeting immunoconjugate bivatuzumab mertansine in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 44 (9), 2008, cc. 823-829.

[Непатентный документ 12] Trinh V.A., Hwu W.J., Ipilimumab in the treatment of melanoma. Expert Opin. Biol. Ther., 14 апреля 2012 г. (doi: 10.1517/14712598.2012.675325).

[Непатентный документ 13] Juszczak A., Gupta A., Karavitaki N., Middleton M.R., Grossman A., IPILIMUMAB - A NOVEL IMMUNOMODULATING THERAPY CAUSING AUTOIMMUNE HYPOPHYSITIS: A CASE REPORT AND REVIEW. Eur. J. Endocrinol. 10 апреля 2012 г. (doi: 10.1530/EJE-12-0167).

[Непатентный документ 14] Takeuchi Т., Kameda H., The Japanese experience with biologic therapies for rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 6 (11), 2010, cc. 644-652.

[Непатентный документ 15] Nam J.L., Winthrop K.L., van Vollenhoven R.F., Pavelka K., Valesini G., Hensor E.M., Worthy G., Landewe R., Smolen J.S., Emery P., Buch M.H., Current evidence for the management of rheumatoid arthritis with biological disease-modifying antirheumatic drugs: a systematic literature review informing the EULAR recommendations for the management of RA. Ann. Rheum. Dis. 69 (6), 2010, cc. 976-986.

[Непатентный документ 16] Kim S.J., Park Y., Hong H.J., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies. Mol. Cells. 20 (1), 2005, cc. 17-29.

[Непатентный документ 17] Desnoyers L.R., Vasiljeva O., Richardson J.H., Yang A., Menendez E.E., Liang T.W., Wong C., Bessette P.H., Kamath K., Moore S.J., Sagert J.G., Hostetter D.R., Han F., Gee J., Flandez J., Markham K., Nguyen M., Krimm M., Wong K.R., Liu S., Daugherty P.S., West J.W., Lowman H.B., Tumor-specific activation of an EGFR-targeting probody enhances therapeutic index. Sci Transl Med. 5(207), 16 октября 2013 г,, 207ra144.

[Непатентный документ 18] Polu K.R., Lowman H.B., Probody therapeutics for targeting antibodies to diseased tissue. Expert Opin Biol Ther. 14(8), август 2014 г., cc. 1049-1053.

Краткое изложение сущности изобретения

Задача, положенная в основу изобретения

При создании настоящего изобретения высказано предположение о том, что описанные выше методики диссоциации путем расщепления протеазой маскирующего пептида, который ингибирует антигенсвязывающую активность антитела так, что антитело сохраняет свою антигенсвязывающую активность, могут вызывать нежелательные реакции, поскольку антитело, расщепленное в пораженной области, можно попадать в здоровые ткани с кровотоком, поскольку расщепление протеазой является необратимым.

Настоящее изобретение создано на основе указанной идеи. Объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, которую можно применять для лечения заболевания, снижая при этом нежелательную реакцию, и ее действующее вещество. Другим объектом настоящего изобретения являются способы скрининга и получения фармацевтической композиции и действующего вещества.

Решение указанной задачи

При создании настоящего изобретения проведены широкие исследования и в результате был разработан полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент, который имеет ингибирующий домен, ингибирующий связывающую активность антигенсвязывающего домена, и обладающий более длительным временем полужизни, чем время полужизни антигенсвязывающего домена в том случае, когда он присутствует индивидуально. Предполагается, что применение полипептида может обеспечивать восстановление у антигенсвязывающего домена его антигенсвязывающей активности в пораженной болезнью ткани и проявление антигенсвязывающую активность в пораженной болезнью ткани. Кроме того, системное распределение активированной формы антигенсвязывающего домена может подавляться благодаря различию во времени полужизни между полипептидом, содержащим антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого ингибируется, и полипептидом, содержащим антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого восстанавливается. Кроме того, при создании настоящего изобретения установлено, что полипептид или фармацевтическую композицию, содержащую полипептид, можно применять для лечения заболевания, и установлено также, что: полипептид или фармацевтическую композицию можно применять для лечения заболевания, где применение включает введение полипептида; и полипептид можно применять для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания. И, наконец, при создании настоящего изобретения разработаны также способы скрининга и получения полипептида, способы получения и скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, и библиотека, включающая однодоменное антитело, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VL, VH или VHH.

Настоящее изобретение базируется на указанных данных, и оно конкретно включает представленные ниже варианты осуществления изобретения.

(1) Полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент, где транспортирующий фрагмент имеет ингибирующий домен, ингибирующий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена, и антигенсвязывающий домен, который имеет более короткое время полужизни в крови, чем транспортирующий фрагмент.

(2) Полипептид по п. (1), котором молекулярная масса антигенсвязывающего домена меньше, чем молекулярная масса транспортирующего фрагмента.

(3) Полипептид по п. (1) или п. (2), в котором молекулярная масса антигенсвязывающего домена составляет 60 кДа или менее.

(4) Полипептид по одному из п.п. (1)-(3), в котором транспортирующий фрагмент обладает FcRn-связывающей активностью, а антигенсвязывающий домен не обладает FcRn-связывающей активностью или имеет более слабую FcRn-связывающую активность, чем транспортирующий фрагмент.

(5) Полипептид по одному из п.п. (1)-(4), в котором антигенсвязывающий домен обладает способностью высвобождаться из полипептида, и антигенсвязывающий домен, высвободившийся из полипептида, имеет более высокую антигенсвязывающую активность, чем его активность до высвобождения.

(6) Полипептид по одному из п.п. (1)-(5), в котором ингибирующий домен транспортирующего фрагмента находится в ассоциации с антигенсвязывающим доменом и тем самым ингибирует антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена.

(7) Полипептид по п. (5), где полипептид содержит сайт расщепления, при этом сайт расщепления расщепляется таким образом, что антигенсвязывающий домен приобретает способность высвобождаться из полипептида.

(8) Полипептид по п. (6), где полипептид содержит сайт расщепления, при этом сайт расщепления расщепляется таким образом, что аннулируется ассоциация ингибирующего домена транспортирующего фрагмента с антигенсвязывающим доменом.

(9) Полипептид по п. (7) или п. (8), в котором сайт расщепления содержит расщепляемую протеазой последовательность.

(10) Полипептид по п. (9), в котором протеаза представляет собой протеазу, специфическую для ткани-мишени.

(11) Полипептид по п. (10), где ткань-мишень представляет собой раковую ткань или воспалительную ткань.

(12) Полипептид по п. (9), где протеаза представляет собой по меньшей мере одну протеазу, выбранную из матриптазы, урокиназы (uPA) и металлопротеиназы.

(13) Полипептид по п. (12), где протеаза представляет собой по меньшей мере одну протеазу, выбранную из MT-SP1, uPA, ММР2, ММР9, ADAMTS5, ММР7 и ММР13.

(14) Полипептид по п. (9), в котором расщепляемая протеазой последовательность содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12, 25, 34, 35, 70-73, 75, 76, 91, 178 и 193-195.

(15) Полипептид по одному из п.п. (9)-(14), в котором к одному концу расщепляемой протеазой последовательности дополнительно присоединен первый гибкий линкер.

(16) Полипептид по п. (15), в котором к другому концу расщепляемой протеазой последовательности дополнительно присоединен второй гибкий линкер.

(17) Полипептид по п. (15), в котором первый гибкий линкер представляет собой гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера.

(18) Полипептид по п. (16), в котором второй гибкий линкер представляет собой гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера.

(19) Полипептид по одному из п.п. (1)-(18), в котором антигенсвязывающий домен содержит однодоменное антитело или представляет собой однодоменное антитело, в котором ингибирующий домен транспортирующего фрагмента ингибирует антигенсвязывающую активность однодоменного антитела.

(20) Полипептид по п. (19), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, VH, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, или VL, который сам обладает антигенсвязывающей активностью.

(21) Полипептид по одному из п.п. (1)-(20), в котором антигенсвязывающий домен содержит однодоменное антитело, и ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VHH, VH антитела или VL антитела, в котором антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется VHH, VH антитела или VL антитела.

(22) Полипептид по одному из п.п. (1)-(21), в котором антигенсвязывающий домен содержит однодоменное антитело, и ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VHH, VH антитела или VL антитела, в котором антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется путем ассоциации с VHH, VH антитела или VL антитела.

(23) Полипептид по одному из п.п. (19)-(22), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH или VH, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, и ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VL антитела, в котором антигенсвязывающая активность VHH или VH, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, ингибирует путем ассоциации с VL антитела.

(24) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH имеет аминокислотную замену по меньшей мере в одном положении, выбранном из аминокислотных положений 37, 44, 45 и 47 (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).

(25) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из аминокислот 37V, 44G, 45L и 47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).

(26) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из аминокислотных замен F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, L47W, T47W и S47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).

(27) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH имеет аминокислотные замены по меньшей мере в одном наборе положений, выбранном из положений 37/44, положений 37/45, положений 37/47, положений 44/45, положений 44/47, положений 45/47, положений 37/44/45, положений 37/44/47, положений 37/45/47, положений 44/45/47 и положений 37/44/45/47 (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).

(28) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH содержит по меньшей мере один набор аминокислот, выбранный из 37V/44G, 37V/45L, 37V/47W, 44G/45L, 44G/47W, 45L/47W, 37V/44G/45L, 37V/44G/47W, 37V/45L/47W, 44G/45L/47W и 37V/44G/45L/47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).

(29) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH содержит по меньшей мере один набор аминокислотных замен, выбранный из F37V/R45L, F37V/G47W, R45L/G47W и F37V/R45L/G47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).

(30) Полипептид по одному из п.п. (19)-(22), в котором однодоменное антитело представляет собой VL, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, а ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VH антитела, в котором антигенсвязывающая активность VL, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, ингибируется путем ассоциации с VH антитела.

(31) Полипептид по одному из п.п. (1)-(30), в котором транспортирующий фрагмент имеет FcRn-связывающую область.

(32) Полипептид по одному из п.п. (1)-(31), в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела.

(33) Полипептид по п. (32), в котором константная область антитела транспортирующего фрагмента и антигенсвязывающий домен слиты через линкер или без линкера.

(34) Полипептид по п. (32), в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи антитела, в котором константная область тяжелой цепи антитела и антигенсвязывающий домен слиты через линкер или без линкера.

(35) Полипептид по п. (32), в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область легкой цепи антитела, в котором константная область легкой цепи антитела и антигенсвязывающий домен слиты через линкер или без линкера.

(36) Полипептид по п. (34), где в полипептиде N-конец константной области тяжелой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована в последовательности антигенсвязывающего домена или на стороне антигенсвязывающего домена относительно аминокислотного положения 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.

(37) Полипептид по п. (35), где в полипептиде N-конец константной области легкой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована в последовательности антигенсвязывающего домена или на стороне антигенсвязывающего домена относительно аминокислотного положения 113 (EU-нумерация) (положение 113 согласно нумерации Кэбота) константной области легкой цепи антитела.

(38) Полипептид по одному из п.п. (33)-(35), где в полипептиде N-конец константной области антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH или VHH, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована в последовательности константной области антитела или на стороне константной области антитела относительно аминокислотного положения 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена.

(39) Полипептид по п. (33), где в полипептиде N-конец константной области антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела.

(40) Полипептид по (34), где в полипептиде N-конец константной области тяжелой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью тяжелой цепи антитела.

(41) Полипептид по (35), где в полипептиде N-конец константной области легкой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью легкой цепи антитела.

(42) Полипептид по п. (40), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH, или VHH, и сайт расщепления протеазой локализован в любом положении между аминокислотным положением 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотным положением 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.

(43) Полипептид по п. (41), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH, или VHH, и сайт расщепления протеазой локализован в любом положении между аминокислотным положением 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотным положением 113 (EU-нумерация) (положение 113 согласно нумерации Кэбота) константной области легкой цепи антитела.

(44) Полипептид по п. (40), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, и сайт расщепления протеазой локализован в любом положении между аминокислотным положением 104 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотным положением 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.

(45) Полипептид по п. (41), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, и сайт расщепления протеазой локализован в любом положении между аминокислотным положением 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотным положением 113 (EU-нумерация) (положение 113 согласно нумерации Кэбота) константной области легкой цепи антитела.

(46) Полипептид по одному из п.п. (32)-(45), в котором константная область антитела полипептида представляет собой константную область антитела IgG-типа.

(47) Полипептид по одному из п.п. (1)-(46), где полипептид представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа.

(48) Полипептид по одному из п.п. (1)-(47), в котором при анализе антигенсвязывающего домена в нерасщепленном состоянии с использованием BLI (интерферометрия биослоя) (система Octet) связывание антигенсвязывающего домена с антигеном не обнаружено.

(49) Полипептид по одному из п.п. (1)-(48), в котором второй антигенсвязывающий домен дополнительно связан с антигенсвязывающим доменом.

(50) Полипептид по п. (49), в котором второй антигенсвязывающий домен имеет антигенсвязывающую специфичность, отличную от специфичности антигенсвязывающего домена.

(51) Полипептид по п. (49) или п. (50), в котором второй антигенсвязывающий домен содержит второе однодоменное антитело.

(52) Полипептид по п. (51), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, второй антигенсвязывающий домен представляет собой второе однодоменное антитело, и антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен обладают способностью высвобождаться из полипептида, в котором однодоменное антитело и второе однодоменное антитело образуют биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, когда антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен находятся в высвободившихся состояниях.

(53) Полипептид по одному из п.п. (49)-(52), в котором второй антигенсвязывающий домен направлен против HER2 или GPC3 в качестве антигена-мишени.

(54) Полипептид по одному из п.п. (1)-(53), где полипептид имеет также дополнительный антигенсвязывающий домен, отличный от антигенсвязывающего домена, при этом антигенсвязывающая активность дополнительного антигенсвязывающего домена также ингибируется связыванием с транспортирующим фрагментом полипептида.

(55) Полипептид по п. (54), в котором дополнительный антигенсвязывающий домен и антигенсвязывающий домен отличаются по антигенсвязывающей специфичности.

(56)Полипептид по одному из п.п. (1)-(55), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, направленный против плексина A1, IL6R или CD3 в качестве антигена-мишени.

(57) Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по одному из п.п. (1)-(56).

(58) Способ получения полипептида по одному из п.п. (1)-(56).

(59) Способ получения по п. (58), включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с транспортирующим фрагментом таким образом, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется ингибирующим доменом транспортирующего фрагмента, с получением полипептида-предшественника; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в полипептид-предшественник.

(60) Способ получения по п. (58), включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с транспортирующим фрагментом таким образом, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется ингибирующим доменом транспортирующего фрагмента, с получением полипептида-предшественника; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между однодоменным антителом и транспортирующим фрагментом.

(61) Способ получения по п. (58), включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с транспортирующим фрагментом через расщепляемую протеазой последовательность таким образом, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется ингибирующим доменом транспортирующего фрагмента, с получением полипептида.

(62) Способ получения по одному из п.п. (59)-(61), дополнительно включающий следующую стадию:

(г) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, включенного в полипептид или полипептид-предшественник, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.

(63) Способ получение по одному из п.п. (59)-(62), дополнительно включающий следующую стадию:

(д) высвобождение однодоменного антитела посредством расщепления протеазой расщепляемой протеазой последовательности и подтверждение того, что высвободившееся однодоменное антитело связывается с антигеном.

(64) Способ получения по п. (58), в котором полипептид представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа.

(65) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;

(б) ассоциация однодоменного антитела, полученного на стадии (а), в качестве замены VH антитела IgG-типа с VL, или ассоциация однодоменного антитела в качестве замены VL антитела IgG-типа с VH, так, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет однодоменное антитело; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, которая несет однодоменное антитело.

(66) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;

(б) ассоциация однодоменного антитела, полученного на стадии (а), в качестве замены VH антитела IgG-типа с VL, или ассоциация однодоменного антитела в качестве замены VL антитела IgG-типа с VH, так, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет однодоменное антитело; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между однодоменным антителом и константной областью антитела в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника.

(67) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), в качестве замены VH или VL антитела IgG-типа с константной областью тяжелой цепи или константной областью легкой цепи через расщепляемую протеазой последовательность, так, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет однодоменное антитело.

(68) Способ получения по одному из п.п. (65)-(67), дополнительно включающий следующую стадию:

(г) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, находящегося в подобной антителу IgG-типа молекуле или подобной антителу IgG-типа молекуле-предшественнике, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.

(69) Способ получения по одному из п.п. (65)-(68), дополнительно включающий следующую стадию:

(д) высвобождение однодоменного антитела посредством расщепления протеазой расщепляемой протеазой последовательности и подтверждение того, что высвободившееся однодоменное антитело связывается с антигеном-мишенью.

(70) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, участвующего в ассоциации однодоменного антитела с VH, антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, участвующего в ассоциации однодоменного антитела с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела с антигеном-мишенью;

(б) ассоциация варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VL антитела или ассоциация варианта однодоменного антитела с VH антитела так, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела ингибируется, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела.

(71) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, участвующего в ассоциации с VH антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, участвующего в ассоциации однодоменного антитела с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела с антигеном-мишенью;

(б) ассоциация варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VL антитела или ассоциация варианта однодоменного антитела с VH антитела так, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела ингибируется, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между вариантом однодоменного антитела и константной областью в подобной антителу IgG-типа молекулу-предшественника.

(72) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, участвующего в ассоциации с VH антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, участвующего в ассоциации однодоменного антитела с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела с антигеном-мишенью; и

(б) сцепление варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с константной областью тяжелой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность или сцепление варианта однодоменного антитела с константной областью легкой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность так, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела ингибируется, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела.

(73) Способ получения по одному из п.п. (70)-(72), дополнительно включающий следующую стадию:

(г) подтверждение того, что связывающая активность варианта однодоменного антитела, находящегося в подобной антителу IgG-типа молекуле, или связывающая активность варианта однодоменного антитела, находящегося в подобной антителу IgG-типа молекуле-предшественнике, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.

(74) Способ получения по одному из п.п. (70)-(73), дополнительно включающий следующую стадию:

(д) высвобождение варианта однодоменного антитела посредством расщепления протеазой расщепляемой протеазой последовательности и подтверждение того, что высвободившийся вариант однодоменного антитела связывается с антигеном-мишенью.

(75) Полинуклеотид, кодирующий полипептид по одному из п.п. (1)-(56).

(76) Вектор, содержащий полинуклеотид по п. (75).

(77) Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. (75) или вектор по п. (76).

(78) Способ получения полипептида по одному из п.п. (1)-(56), включающий стадию культивирования клетки-хозяина по п. (77).

(79) Способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VL, ассоциации с конкретным VH или ассоциации с конкретным VHH.

(80) Способ скрининга по п. (79), где способ представляет способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VL.

(81) Способ скрининга по п. (80), включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, имеющего целевую антигенсвязывающую активность (активность в отношении антигена-мишени);

(б) ассоциация однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VL; и

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VL на стадии (б), в отношении антигена ослабляется или утрачивается по сравнению с активностью до ассоциации.

(82) Способ скрининга по п. (80), включающий следующие стадии:

(а) ассоциация однодоменного антитела с конкретным VL;

(б) выбор ассоциации VL и однодоменного антитела на основе того, что однодоменное антитело, ассоциированное с конкретным VL на стадии (а), не обладает антигенсвязывающей активностью или связывающая активность в отношении антигена соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и

(в) подтверждение того, что однодоменное антитело в ассоциации, выбранной на стадии (б), имеет более сильную связывающую активность в отношении антигена в неассоциированном с конкретным VL состоянии, чем в ассоциированном с ним состоянии.

(83) Способ скрининга по п. (79), где способ представляет собой способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VH.

(84) Способ скрининга по п. (83), включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, имеющего целевую антигенсвязывающую активность;

(б) ассоциация однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VH; и

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VH на стадии (б), в отношении антигена ослабляется или утрачивается по сравнению с активностью до ассоциации.

(85) Способ скрининга по п. (83), включающий следующие стадии:

(а) ассоциация однодоменного антитела с конкретным VH;

(б) выбор ассоциации VH и однодоменного антитела на основе того, что однодоменное антитело, ассоциированное с конкретным VH на стадии (а), не обладает антигенсвязывающей активностью или связывающая активность в отношении антигена соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и

(в) подтверждение того, что однодоменное антитело в ассоциации, выбранной на стадии (б), имеет более сильную связывающую активность в отношении антигена в неассоциированном с конкретным VH состоянии, чем в ассоциированном с ним состоянии.

(86) Способ скрининга по п. (79), где способ представляет собой способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VHH.

(87) Способ скрининга по п. (86), включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, имеющего целевую антигенсвязывающую активность;

(б) ассоциация однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VHH; и

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VHH на стадии (б), в отношении антигена ослабляется или утрачивается по сравнению с активностью до ассоциации.

(88) Способ скрининга по п. (86), включающий следующие стадии:

(а) ассоциация однодоменного антитела с конкретным VHH;

(б) выбор ассоциации VHH и однодоменного антитела на основе того, что однодоменное антитело, ассоциированное с конкретным VHH на стадии (а), не обладает антигенсвязывающей активностью или связывающая активность в отношении антигена соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и

(в) подтверждение того, что однодоменное антитело в ассоциации, выбранной на стадии (б), имеет более сильную связывающую активность в отношении антигена в неассоциированном с конкретным VHH состоянии, чем в ассоциированном с ним состоянии.

(89) Способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VL, ассоциации с конкретным VH или ассоциации с конкретным VHH.

(90) Способ получения по п. (89), где способ представляет собой способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VL.

(91) Способ получения по п. (90), включающий следующую стадию:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, участвующего в ассоциации с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени.

(92) Способ получения по п. (91), дополнительно включающий следующие стадии:

(б) ассоциация варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VL; и

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с VL, ослабляется или утрачивается по сравнению с активностью до ассоциации.

(93) Способ получения по п. (89), где способ представляет собой способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VH.

(94) Способ получения по п. (93), включающий следующую стадию:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, участвующего в ассоциации с VH подобной антителу IgG-типа молекулы, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени.

(95) Способ получения по п. (94), дополнительно включающий следующие стадии:

(б) ассоциация варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VH; и

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с VH, ослабляется или утрачивается по сравнению с активностью до ассоциации.

(96) Способ получения по п. (89), где способ представляет собой способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VHH.

(97) Способ получения по п. (96), включающий следующую стадию:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, участвующего в ассоциации с VHH, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени.

(98) Способ получения по п. (97), дополнительно включающий следующие стадии:

(б) ассоциация варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VHH; и

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с VHH, ослабляется или утрачивается по сравнению с активностью до ассоциации.

(99) Библиотека, содержащая множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых слито с первым поддерживающим ассоциацию доменом, где однодоменные антитела включают однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при ассоциации с конкретным VL, однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при ассоциации с конкретным VH, или однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при ассоциации с конкретным VHH.

(100) Библиотека по п. (99), где фрагменты однодоменных антител слитых полипептидов в библиотеке включают однодоменное антитело, полученное из животного семейства верблюдовых (Camelidae) или трансгенного животного, несущего ген, который может кодировать однодоменное антитело или гуманизированное антитело, однодоменное антитело, полученное иммунизацией животного семейства Camelidae или трансгенного животного, несущего ген, который может кодировать однодоменное антитело или гуманизированное антитело, или искусственно созданное однодоменное антитело, полученное из VH или VL человеческого антитела.

(101) Библиотека по п. (99) или п. (100), представляющая собой библиотеку, которая содержит множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых слито с первым поддерживающим ассоциацию доменом, где однодоменные антитела включают однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при ассоциации с конкретным VL.

(102) Библиотека по п. (99) или п. (100), представляющая собой библиотеку, которая содержит множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых слито с первым поддерживающим ассоциацию доменом, где однодоменные антитела включают однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при ассоциации с конкретным VH.

(103) Библиотека по п. (99) или п. (100), представляющая собой библиотеку, которая содержит множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых слито с первым поддерживающим ассоциацию доменом, где однодоменные антитела включают однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при ассоциации с конкретным VHH.

(104) Способ скрининга библиотеки по п. (99) или п. (100) в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться путем ассоциации с конкретным VL, однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться путем ассоциации с конкретным VH, или однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при ассоциации с конкретным VHH.

(105) Способ скрининга библиотеки по п. (101) в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при ассоциации с конкретным VL.

(106) Способ скрининга по п. (105), включающий следующие стадии

(а) экспонирование in vitro слитых полипептидов библиотеки;

(б) получение партнера по ассоциации второго поддерживающего ассоциацию домена, слитого с конкретным VL;

(в) ассоциация слитых полипептидов, экспонированных на стадии (а), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого полипептида, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, при ассоциации однодоменного антитела с VL; и

(г) выбор из слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или находится ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело, входящее в него, не находится в ассоциации с VL.

(107) Способ скрининга по п. (106), в котором партнер по ассоциации, полученный на стадии (б), дополнительно содержит расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление партнера по ассоциации посредством обработки протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VL аннулируется.

(108) Способ скрининга по п. (107), в котором расщепляемая протеазой последовательность партнера по ассоциации, полученного на стадии (б), локализована вблизи границы между конкретным VL и вторым поддерживающим ассоциацию доменом.

(109) Способ скрининга по п. (106), в котором слитые полипептиды библиотеки дополнительно содержат расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление слитых полипептидов обработкой протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VL аннулируется.

(110) Способ скрининга по п. (109), в котором расщепляемая протеазой последовательность, входящая в каждый слитый полипептид, локализована вблизи границы между однодоменным антителом и первым поддерживающим ассоциацию доменом.

(111) Способ скрининга по п. (106), в котором стадия (г) включает повторное экспонирование in vitro полноразмерых слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), или их фрагментов, содержащих однодоменные антитела.

(112) Способ скрининга по п. (106), в котором стадия (г) включает повторное экспонирование in vitro полноразмерых слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), и отбор слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или превышает его в состоянии, ассоциированном только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.

(113) Способ скрининга библиотеки по п. (102) в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при ассоциации с конкретным VH.

(114) Способ скрининга по п. (113), включающий следующие стадии:

(а) экспонирование in vitro слитых полипептидов библиотеки;

(б) получение партнера по ассоциации второго поддерживающего ассоциацию домена, слитого с конкретным VH;

(в) ассоциация слитых полипептидов, экспонированных на стадии (а), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого полипептида, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или находится ниже его при ассоциации однодоменного антитела с VH; и

(г) выбор из слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или находится ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело, входящее в него, не находится в ассоциации с VH.

(115) Способ скрининга по п. (114), в котором партнер по ассоциации, полученный на стадии (б), дополнительно содержит расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление партнера по ассоциации посредством обработки протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VH аннулируется.

(116) Способ скрининга по п. (115), в котором расщепляемая протеазой последовательность партнера по ассоциации, полученного на стадии (б), локализована вблизи границы между конкретным VH и вторым поддерживающим ассоциацию доменом.

(117) Способ скрининга по п. (114), в котором слитые полипептиды библиотеки дополнительно содержат расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление слитых полипептидов посредством обработки протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VH аннулируется.

(118) Способ скрининга по п. (117), в котором расщепляемая протеазой последовательность, входящая в каждый слитый полипептид, локализована вблизи границы между однодоменным антителом и первым поддерживающим ассоциацию доменом.

(119) Способ скрининга по п. (114), в котором стадия (г) включает повторное экспонирование in vitro полноразмерых слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), или их фрагментов, содержащих однодоменные антитела.

(120) Способ скрининга по п. (114), в котором стадия (г) включает повторное экспонирование in vitro полноразмерых слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), и отбор слитого полипептида, который связывается с антигеном или который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или превышает его в состоянии, ассоциированном только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.

(121) Способ скрининга библиотеки по п. (103) в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при ассоциации с конкретным VHH.

(122) Способ скрининга по п. (121), включающий следующие стадии

(а) экспонирование in vitro слитых полипептидов библиотеки;

(б) получение партнера по ассоциации второго поддерживающего ассоциацию домена, слитого с конкретным VHH;

(в) ассоциация слитых полипептидов, экспонированных на стадии (а), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого полипептида, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или находится ниже его при ассоциации однодоменного антитела с VHH; и

(г) выбор из слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или превышает его в состоянии, в котором однодоменное антитело, входящее в него, не находится в ассоциации с VHH.

(123) Способ скрининга по п. (122), в котором партнер по ассоциации, полученный на стадии (б), дополнительно содержит расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление партнера по ассоциации посредством обработки протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VHH аннулируется.

(124) Способ скрининга по п. (123), в котором расщепляемая протеазой последовательность партнера по ассоциации, полученного на стадии (б), локализована вблизи границы между конкретным VHH и вторым поддерживающим ассоциацию доменом.

(125) Способ скрининга по п. (122), в котором слитые полипептиды библиотеки дополнительно содержат расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление слитых полипептидов посредством обработки протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VHH аннулируется.

(126) Способ скрининга по п. (125), в котором расщепляемая протеазой последовательность, входящая в каждый слитый полипептид, локализована вблизи границы между однодоменным антителом и первым поддерживающим ассоциацию доменом.

(127) Способ скрининга по п. (122), в котором стадия (г) включает повторное экспонирование in vitro полноразмерых слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), или их фрагментов, содержащих однодоменные антитела.

(128) Способ скрининга по п. (122), в котором стадия (г) включает повторное экспонирование in vitro полноразмерых слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), и отбор слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или превышает его в состоянии, ассоциированным только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.

(129) Способ скрининга по одному из п.п. (106)-(112), (114)-(120) и (122)-(128), в котором стадия получения партнера по ассоциации, указанная на стадии (б), представляет собой стадию совместного экспонирования партнера по ассоциации и слитых полипептидов.

(130) Библиотека по одному из п.п. (99)-(103), в которой первый поддерживающий ассоциацию домен содержит СН1-домен антитела IgG-типа или константную область легкой цепи антитела.

(131) Способ скрининга по одному из п.п. (106)-(112), (114)-(120) и (122)-(128), в котором первый поддерживающий ассоциацию домен содержит СН1-домен антитела IgG-типа, а второй поддерживающий ассоциацию домен содержит константную область легкой цепи антитела.

(132) Способ скрининга по одному из п.п. (106)-(112), (114)-(120) и (122)-(128), в котором первый поддерживающий ассоциацию домен содержит константную область легкой цепи антитела, а второй поддерживающий ассоциацию домен содержит СН1-домен антитела IgG-типа.

(133) Способ скрининга по п. (105), включающий следующие стадии:

(а) экспонирование in vitro слитых полипептидов библиотеки;

(б) получение партнера по ассоциации второго поддерживающего ассоциацию домена, слитого с конкретным VL;

(в) отбор слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или превышает его; и

(г) ассоциация слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого полипептида, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или находится ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело находится в ассоциации с VL.

(134) Способ скрининга по п. (129), в котором стадия (г) включает повторное экспонирование in vitro слитых полипептидов, отобранных на стадии (в).

(135) Способ скрининга по п. (133), в котором стадия (в) включает ассоциацию слитого полипептида только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом или подтверждение того, что связывание антигена однодоменным антителом, входящим в слитый полипептид, ассоциировано только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.

(136) Способ скрининга по п. (113), включающий следующие стадии:

(а) экспонирование in vitro слитых полипептидов библиотеки;

(б) получение партнера по ассоциации второго поддерживающего ассоциацию домена, слитого с конкретным VH;

(в) отбор слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или превышает его; и

(г) ассоциация слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого полипептида, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или находится ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело находится в ассоциации с VH.

(137) Способ скрининга по п. (136), в котором стадия (г) включает повторное экспонирование in vitro слитых полипептидов, отобранных на стадии (в).

(138) Способ скрининга по п. (136), в котором стадия (в) включает ассоциацию слитого полипептида только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом или подтверждение того, что связывание антигена однодоменным антителом, входящим в слитый полипептид, ассоциировано только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.

(139) Способ скрининга по п. (121), включающий следующие стадии:

(а) экспонирование in vitro слитых полипептидов библиотеки;

(б) получение партнера по ассоциации второго поддерживающего ассоциацию домена, слитого с конкретным VHH;

(в) отбор слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или превышает его; и

(г) ассоциация слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого полипептида, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или находится ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело находится в ассоциации с VHH.

(140) Способ скрининга по п. (139), в котором стадия (г) включает повторное экспонирование in vitro слитых полипептидов, отобранных на стадии (в).

(141) Способ скрининга по п. (139), в котором стадия (в) включает ассоциацию слитого полипептида только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом или подтверждение того, что связывание антигена однодоменным антителом, входящим в слитый полипептид, ассоциировано только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.

(142) Способ скрининга по одному из п.п. (133)-(141), в котором стадия ассоциации слитых полипептидов с партнером по ассоциации, указанная на стадии (г), представляет собой стадию совместного экспонирования партнера по ассоциации и слитых полипептидов.

(143) Способ скрининга по одному из п.п. (133)-(142), в котором первый поддерживающий ассоциацию домен содержит СН1-домен антитела IgG-типа, а второй поддерживающий ассоциацию домен содержит константную область легкой цепи антитела.

(144) Способ скрининга по одному из п.п. (133)-(142),, в котором первый поддерживающий ассоциацию домен содержит константную область легкой цепи антитела, а второй поддерживающий ассоциацию домен содержит СН1-домен антитела IgG-типа.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - диаграмма, демонстрирующая концепцию технологии Probody™. Probody представляет собой молекулу антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем соединения антитела с пептидом, маскирующим антигенсвязывающий сайт антитела, через линкер, который расщепляется протеазой, экспрессируемой в области повреждения;

на фиг. 2 - диаграмма, демонстрирующая причину нежелательных реакций, которые могут обусловливаться Probody. Активированное Probody при накоплении в крови может вызывать нежелательные реакции при связывании с антигеном, который экспрессируется в здоровой ткани;

на фиг. 3 - диаграмма, демонстрирующая причину нежелательных реакций, которые могут обусловливаться Probody. Probody находится в равновесии между состоянием, в котором маскирующий пептид, сцепленный через линкер, связан с антигенсвязывающим сайтом, и состоянием, в котором маскирующий пептид диссоциирован. Молекула в диссоциированном состоянии может связываться с антигеном;

на фиг. 4 - диаграмма, демонстрирующая причину нежелательных реакций, которые могут обусловливаться Probody. Антитело к лекарственному средству против маскирующего пептида (антитело к маскирующему пептиду) может связываться с маскирующим пептидом Probody до активации и тем самым активировать Probody без расщепления протеазой;

на фиг. 5 - диаграмма, демонстрирующая концепцию, касающуюся полипептида, который содержит антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент. (А) Полипептид с антигенсвязывающим доменом, сцепленным с транспортирующим фрагментом, имеет продолжительное время полужизни и не связывается с антигеном. (Б) Антигенсвязывающий домен, который высвобождают, например, в результате расщепления в сайте расщепления, для связывания с антигеном, и высвободившийся таким образом домен имеет короткое время полужизни;

на фиг. 6 - диаграмма, демонстрирующая один из вариантов способа получения полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении. В настоящем варианте осуществления изобретения представляющий интерес полипептид представляет собой подобную антителу IgG-типа молекулу. (А) Получают однодоменное антитело, связывающееся с антигеном-мишенью. (Б) Осуществляют ассоциацию однодоменного антитела в качестве заместителя VH антитела IgG-типа с VL, таким образом, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется. (В) Расщепляемую протеазой последовательность интродуцируют в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, которая несет однодоменное антитело;

на фиг. 7 - диаграмма, демонстрирующая один из вариантов полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении. В настоящем варианте осуществления изобретения полипептид представляет собой подобную антителу IgG-типа молекулу, а антигенсвязывающие домены создают соответственно на фрагментах, которые соответствуют двум вариабельным областям антитела IgG-типа. Два антигенсвязывающих домена могут иметь одинаковую антигенсвязывающую специфичность или могут отличаться их антигенсвязывающей специфичностью;

на фиг. 8 - диаграмма, демонстрирующая вариант осуществления изобретения, в котором второй антигенсвязывающий домен дополнительно сцеплен с антигенсвязывающим доменом, предлагаемым в настоящем изобретении. В этом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен образуют после высвобождения биспецифическую антигенсвязывающую молекулу. На фиг. 8(A) показана диаграмма, демонстрирующая полипептид в невысвободившемся состоянии. Антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена ингибируется. На фиг. 8(Б) показана диаграмма высвобождения биспецифической антигенсвязывающей молекулы, образованной антигенсвязывающим доменом и вторым антигенсвязывающим доменом. На фиг. 8(B) показана диаграмма, демонстрирующая биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, направленную, например, против поверхностного антигена Т-клеток и поверхностного антигена раковых клеток, в качестве примера биспецифической антигенсвязывающей молекулы после высвобождения;

на фиг. 9А - диаграмма, демонстрирующая один пример способа скрининга слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться в результате ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, из библиотеки, которая содержит множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. На фиг. 9А(1) показана диаграмма, на которой продемонстрирована библиотека, содержащая множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. На фиг. 9А(2) показана диаграмма, демонстрирующая, что антигенсвязывающая активность каждого однодоменного антитела подтверждена в состоянии, в котором слитый полипептид ассоциирован с партером по ассоциации. Отобран слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое не связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии ассоциации. На фиг. 9А(3) показана диаграмма, демонстрирующая, что ассоциация однодоменного антитела в слитом полипептиде, отобранном на фиг. 9А(2), с ингибирующим доменом в партнере по ассоциации аннулирована, и антигенсвязывающая активность однодоменного антитела подтверждена. Отобран слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в указанном состоянии отсутствия ассоциации. На фиг. 9А(2') показана диаграмма, на которой продемонстрировано подтверждение антигенсвязывающей активности однодоменного антитела в каждом слитом полипептиде. Отобран слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в указанном состоянии его индивидуального существования. На фиг. 9А(3') показана диаграмма, демонстрирующая, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела подтверждена в состоянии, в котором слитый полипептид, отобранный на фиг. 9А(2'), находится в ассоциации с партнером по ассоциации. Отобран слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое не связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии ассоциации;

на фиг. 9Б - диаграмма, демонстрирующая один более конкретный пример способа скрининга слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться при ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. (1) Слитые полипептиды, каждый из которых содержит однодоменное антитело и первый поддерживающий ассоциацию домен, и партнера по ассоциации, который несет расщепляемую протеазой последовательность между ингибирующим доменом и вторым поддерживающим ассоциацию доменом, экспонировали совместно в форме Fab-подобной структуры; (2) отбирали из экспонированных таким образом Fab-подобных структур структуру, которая не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и (3) расщепляли партнера по ассоциации протеазой и отбирали фрагмент, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его;

на фиг. 9В - диаграмма, демонстрирующая другой более конкретный пример способа скрининга слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться при ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. (1) Слитые полипептиды, каждый из которых содержит расщепляемую протеазой последовательность между однодоменным антителом и первым поддерживающим ассоциацию доменом, и партнера по ассоциации ингибирующего домена, сцепленного со вторым поддерживающим ассоциацию доменом, экспонировали совместно в форме Fab-подобной структуры; (2) отбирали из экспонированных таким образом Fab-подобных структур структуру, которая не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и (3) расщепляли слитый полипептид протеазой и отбирали фрагмент, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его;

на фиг. 9Г - диаграмма, демонстрирующая альтернативный пример способа скрининга слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться при ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. (1) Слитые полипептиды, каждый из которых содержит однодоменное антитело и первый поддерживающий ассоциацию домен, и партнера по ассоциации ингибирующего домена, сцепленного со вторым поддерживающим ассоциацию доменом, экспонировали совместно в форме Fab-подобной структуры, и отбирали из экспонированных таким образом Fab-подобных структур структуру, которая не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и (2) отобранные таким образом, указанные на фиг. 9Г(1) фрагменты, содержащие однодоменные антитела в виде Fab-подобный структур, экспонировали вновь так, чтобы в это же время не происходила экспрессия ингибирующего домена, и отбирали фрагмент, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его. На каждой из фиг. 9Г(2') и 9Г(2'') показана диаграмма, демонстрирующая альтернативный вариант, в котором фрагменты, содержащие однодоменные антитела, которые указаны на фиг. 9Г(2), экспонировали вновь так, чтобы вместе с ними не происходила экспрессия ингибирующего домена. Порядок осуществления (1) и (2), (2') или (2'') может представлять собой осуществление (2), (2') или (2'') до осуществления (1). В частности, фрагменты, содержащие однодоменные антитела, экспонируют таким образом, чтобы вместе с ними не происходила экспрессия ингибирующего домена, и отбирают фрагмент, имеющий антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его. Далее слитые полипептиды, каждый из которых содержит однодоменное антитело, содержащее фрагмент, имеющий связывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, и первый поддерживающий ассоциацию домен, и партнера по ассоциации ингибирующего домена, сцепленного со вторым поддерживающим ассоциацию доменом, экспонируют совместно с получением Fab-подобной структуры, и отбирают из экспонированных таким образом Fab-подобных структур структуру, которая не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его;

на фиг. 10 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL6R подобных антителу молекул, полученных путем ассоциации различных легких цепей с конструкцией IL6R90-G1m, содержащей VHH к человеческому IL6R (IL6R90), слитый с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3). Время начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном обозначено как исходная точка на оси абсцисс;

на фиг. 11(А) - диаграмма, на которой продемонстрирована модель подобной антителу молекулы, полученная путем встраивания расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью в IL6R90-G1m. На фиг. 11(Б) показана диаграмма, на которой представлены обозначения каждой полученной тяжелой цепи антитела, сайт инсерции аминокислотной последовательности и встроенная аминокислотная последовательность. Сайт инсерции обозначен как [вставка];

на фиг. 12-1 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки степени расщепления, полученные с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях после обработки протеазой (MT-SP1) IL6R90-G1m или подобной антителу молекулы, полученной путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью в IL6R90-G1m. Из двух новых полос, образовавшихся в результате обработки протеазой, полоса, соответствующая 25 кДа или менее, представляет собой полосу, полученную из VHH, а полоса, соответствующая 25-50 кДа, представляет собой полосу, полученную из константной области;

на фиг. 12-2 - диаграмма, на которой представлено продолжение фиг. 12-1;

на фиг. 13 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL6R конструкции IL6R90-G1m или подобных антителу молекул, полученных путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью в IL6R90-G1m, или результаты оценки этих образцов после обработки протеазой (MT-SP1). На сенсограммах, обозначенных как протеаза-, представлены результаты оценки связывания с антигеном необработанных протеазой подобных антителу молекул, а на сенсограммах, обозначенных как протеаза+, представлены результаты оценки связывания с антигеном обработанных протеазой подобных антителу молекул. Момент времени, соответствующий 30 с до начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, обозначен как исходная точка на оси абсцисс;

на фиг. 14 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL6R подобных антителу молекул, полученных путем ассоциации различных легких цепей с конструкцией 20A11-G1m, содержащей VHH к человеческому IL6R (20А11), слитый с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3). Момент времени, соответствующий 30 с до начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, обозначен как исходная точка на оси абсцисс;

на фиг. 15 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL6R конструкции 20A11-G1m или подобных антителу молекул, полученных путем интродукции мутаций в аминокислоты, присутствующие на поверхности раздела между 20А11 и VL, и ассоциации различных легких цепей с конструкцией 20A11hu-G1m, содержащей полученную таким образом конструкцию 20A11hu, слитую с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3). Момент времени, соответствующий 60 с до начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, обозначен как исходная точка на оси абсцисс;

на фиг. 16 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки степени расщепления, полученные с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях после обработки протеазой (MT-SP1) 20A11-G1m или 4 типов подобных антителу молекул, полученных путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между 20A11hu и константной областью в 20A11hu-G1m. Из двух новых полос, образовавшихся в результате обработки протеазой, полоса, соответствующая 25 кДа или менее, представляет собой полосу, полученную из VHH, а полоса, соответствующая 25-50 кДа, представляет собой полосу, полученную из константной области;

на фиг. 17 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL6R конструкции 20A11-G1m или подобных антителу молекул, полученных путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью в 20A11hu-G1m, или результаты оценки этих образцов после обработки протеазой (MT-SP1). На сенсограммах, обозначенных как протеаза-, представлены результаты оценки связывания с антигеном необработанных протеазой подобных антителу молекул, а на сенсограммах, обозначенных как протеаза+, представлены результаты оценки связывания с антигеном обработанных протеазой подобных антителу молекул. Момент времени, соответствующий 60 с до начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, обозначен как исходная точка на оси абсцисс. Образец, обозначенный как «не изучен», соответствует образцу, который не анализировали;

на фиг. 18 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки степени расщепления на основе миграции, полученные с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и детекции с помощью СВВ (кумасси бриллиантовый голубой), после обработки протеазой (MT-SP1) подобных антителу молекул, которые имели VHH к человеческому CD3 в вариабельных областях их тяжелых цепей и которые получали путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью тяжелой цепи. Из двух новых полос, образовавшихся в результате обработки протеазой, полоса, соответствующая 10-15 кДа, представляет собой полосу, полученную из VHH, а полоса, соответствующая примерно 37 кДа, представляет собой полосу, полученную из константной области тяжелой цепи;

на фиг. 19 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим CD3ed-Fc образцов после обработки протеазой (МТ-SP1) подобных антителу молекул, которые имели VHH к человеческому CD3 в вариабельных областях их тяжелых цепей и которые получали путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью тяжелой цепи. На сенсограммах, обозначенных как протеаза-, представлены результаты оценки связывания с антигеном необработанных протеазой подобных антителу молекул, а на сенсограммах, обозначенных как протеаза+, представлены результаты оценки связывания с антигеном обработанных протеазой подобных антителу молекул. Момент времени, соответствующий 30 с до начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, обозначен как исходная точка на оси абсцисс. При оценке связывания ответ до начала связывания антигена принимали за 0, а ответ перед началом действия антител принимали за 100. Время указано от момента, соответствующего 30 с до начала действия антител.

на фиг. 20 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки степени расщепления на основе миграции, полученные с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и детекции с помощью СВВ после обработки протеазой (MT-SP1) молекулы, которая имеет IL6R90-G1m в качестве тяжелой цепи и Vk1-39-k0MT в качестве легкой цепи, или подобных антителу молекул, полученных путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между вариабельной областью легкой цепи и константной областью легкой цепи молекулы, которая имеет IL6R90-G1m в качестве тяжелой цепи и Vk1-39-k0MT в качестве легкой цепи. Две полосы, происходящие из легкой цепи, образовались в результате обработки протеазой, и легкая цепь расщеплялась протеазой;

на фиг. 21 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL6R образцов после обработки протеазой (MT-SP1) молекулы, имеющей IL6R90-G1m в качестве тяжелой цепи и Vk1-39-k0MT в качестве легкой цепи, или подобных антителу молекул, полученных путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между вариабельной областью легкой цепи и константной областью легкой цепи молекулы, которая имеет IL6R90-G1m в качестве тяжелой цепи и Vk1-39-k0MT в качестве легкой цепи. На сенсограммах, обозначенных как протеаза-, представлены результаты оценки связывания с антигеном необработанных протеазой подобных антителу молекул, а на сенсограммах, обозначенных как протеаза+, представлены результаты оценки связывания с антигеном обработанных протеазой подобных антителу молекул. Антитело (MRA), для которого подтверждено связывание с IL6R, применяли в качестве положительного контроля. Момент времени, соответствующий началу действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, представляет собой исходную точку на оси абсцисс;

на фиг. 22 - диаграмма, на которой продемонстрированы полученные с помощью ДСН-ПААГ результаты оценки расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул с включенным VHH, который связывается с человеческим плексином А1. Дорожка, обозначенная как протеаза (+), соответствует обработанным протеазой образцам, а дорожка, обозначенная как протеаза (-), соответствует необработанным протеазой образцам, которые используют в качестве отрицательного контроля;

на фиг. 23 - диаграмма, на которой продемонстрированы полученные с помощью системы Octet сенсограммы оценки связывания с человеческим плексином A1 VHH, который высвободился в результате расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул с включенным VHH, который связывается с человеческим плексином А1. Сенсограмма, обозначенная как протеаза (+), соответствует обработанным протеазой образцам, а сенсограмма, обозначенная как протеаза (-), соответствует необработанным протеазой образцам. Концентрации, в которых применяли подобные антителу IgG-типа молекулы, указаны на левой стороне диаграммы;

на фиг. 24 - диаграмма, на которой продемонстрированы полученные с помощью ДСН-ПААГ результаты оценки расщепления протеазой полипептидов, содержащих биспецифические VHH-VHH;

на фиг. 25 - диаграмма, на которой продемонстрированы данные о люциферазной активности до и после расщепления протеазой. Пунктирной линией обозначены образцы, необработанные протеазой, а сплошной линией обозначены образцы, обработанные протеазой;

на фиг. 26 - диаграмма, на которой продемонстрированы данные о люциферазной активности до и после расщепления протеазой. Пунктирной линией обозначены образцы, необработанные протеазой, а сплошной линией обозначены образцы, обработанные протеазой;

на фиг. 27 - диаграмма, на которой продемонстрированы полученные с помощью ДСН-ПААГ результаты оценки расщепления протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы, содержащей VHH к человеческому IL6R;

на фиг. 28 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул, несущих расщепляемую протеазой последовательность в их легких цепях;

на фиг. 29 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки степени активации в зависимости от присутствия или отсутствия обработки протеазой подобных антителу IgG-типа молекул, несущих расщепляемую протеазой последовательность в их легких цепях;

на фиг. 30А - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул, несущих расщепляемую протеазой последовательность в их тяжелых цепях;

на фиг. 30Б - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул, несущих расщепляемую протеазой последовательность в их тяжелых цепях. Расщепление протеазой осуществляли, используя буфер для анализа (набор для анализа активности ММР (флуорометрический - зеленый) (ab112146), компонент С: буфер для анализа).

Описание вариантов осуществления изобретения

Согласно настоящему изобретению полипептид, как правило, представляет собой пептид, имеющий длину порядка 4 аминокислот или более, и белок. Кроме того, согласно настоящему изобретению полипептид, как правило, состоит из искусственно созданной последовательности (но, не ограничиваясь только ею). Например, можно применять полученный из организма полипептид. Альтернативному этому, полипептид согласно настоящему изобретению может представлять собой любой встречающийся в естественных условиях полипептид, синтетический полипептид, рекомбинантный полипептид и т.п. Кроме того, согласно настоящему изобретению фрагменты указанных полипептидов также подпадают под понятие полипептид.

В настоящем описании каждую аминокислоту обозначают однобуквенным или трехбуквенным кодом или ими обоими, например, следующим образом: Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I или Val/V. Для обозначения аминокислоты, локализованной в конкретном положении, можно применять соответственно обозначение с использованием номера, соответствующего конкретному положению, в сочетании с однобуквенным кодом или трехбуквенным кодом аминокислоты. Например, аминокислота 37V, которая представляет собой аминокислоту, содержащуюся в однодоменном антителе, представляет собой Val, локализованный в положении 37 согласно нумерации Кэбота.

Для изменения аминокислоты в аминокислотной последовательности полипептида можно соответствующим образом адаптировать известный в данной области метод, такой как сайтнаправленный мутагенез (Kunkel и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, cc. 488-492) или ПЦР с удлинением перекрытий. Множество методов, известных в данной области, можно также адаптировать в качестве альтернативных методов замены аминокислот на аминокислоты, отличные от встречающихся в естественных условиях аминокислот (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 2006, cc. 225-249; и Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(11), 2003, cc. 6353-6357). Можно применять, например, бесклеточную систему трансляции, содержащую тРНК, в которой не встречающаяся в естественных условиях аминокислота слита с супрессорной тРНК, подавляющей амбер-мутацию, комплементарной UAG-кодону (амбер-кодон), который представляет собой стоп-кодон (фирма Clover Direct (Protein Express)). В настоящем описании примеры изменения включают (но, не ограничиваясь только ими) замену.

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «и/или», применяемое для обозначения сайтов аминокислотных изменений, включает каждую комбинацию, к которой применимо «и» и «или». В частности, например, фраза «аминокислоты в положениях 37, 45 и/или 47 заменены» включает следующие вариации аминокислотных изменений:

(а) положение 37, (б) положение 45, (в) положение 47, (г) положения 37 и 45, (д) положения 37 и 47, (е) положения 45 и 47 и (ж) положения 37, 45 и 47.

В настоящем описании выражение, в котором однобуквенные коды или трехбуквенные коды аминокислот до и после изменения указаны перед или после номера, обозначающего конкретное положение, можно применять соответственно для обозначения аминокислотного изменения. Например, изменение F37V или Phe37Val, применяемое для обозначения замены аминокислоты, содержащейся в вариабельной области антитела или однодоменном антителе, обозначает замену Phe в положении 37 согласно нумерации Кэбота на Val. В частности, номер обозначает аминокислотное положение согласно нумерации Кэбота; однобуквенный или трехбуквенный код аминокислоты, предшествующий номеру, означает аминокислоту до замены; а однобуквенный код или трехбуквенный код аминокислоты после номера означает аминокислоту после замены. Аналогично этому, изменение Р238А или Pro238Ala, применяемое для обозначения замены аминокислоты в Fc-области, содержащейся в константной области антитела, означает замену Pro в положении 238 согласно EU-нумерации на Ala. В частности, номер обозначает аминокислотное положение согласно EU-нумерации; однобуквенный или трехбуквенный код аминокислоты, предшествующий номеру, означает аминокислоту до замены; а однобуквенный код или трехбуквенный код аминокислоты после номера означает аминокислоту после замены.

В настоящем описании понятие «антитело» используется в его наиболее широком смысле и относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональное антитело, поликлональное антитело, мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело), однодоменное антитело и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.

Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от полного антитела, которая содержит часть полного антитела и связывается с антигеном, с которым связывается полное антитело. Примеры фрагментов антитела включают (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, димерные антитела (диабоди), линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Понятия «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, практически сходную со структурой встречающегося в естественных условиях антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат представленную в настоящем описании Fc-область.

Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с его антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (CDR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена.

Понятие «гипервариабельный участок» или «CDR» в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательность которого является гипервариабельной и/или формирует петли определенной структуры («гипервариабельные петли»), и/или относится к контактирующим с антигеном остаткам («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть CDR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Согласно настоящему описанию примеры HVR включают

(а) гипервариабельные петли, включающие аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917);

(б) CDR, включающие аминокислотные остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (Н3) (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, публикация NIH 91-3242);

(в) области контакта с антигеном, включающие аминокислотные остатки 27с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum и др., J. Mol. Biol. 262, 1996, сс. 732-745); и

(г) комбинации остатков, указанных в подпунктах (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).

Если специально не указано иное, то в настоящем описании остатки в CDR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки в FR) нумеруют согласно Kabat и др., выше.

«Каркасный участок» или «FR», означает остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка (CDR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности CDR и FR, как правило, имеют следующее расположение в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

В настоящем описании понятие «константная область» или «константный домен» относится к области или домену, отличному от вариабельных областей антитела. Например, антитело IgG-типа представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящий из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. В направлении от N-конца к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следует три константных домена (CH1, СН2 и СН3). Аналогично этому, в направлении от N-конца к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен легкой цепи (CL). Легкая цепь антитела в зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена может принадлежать к одному из двух типов, которые обозначают каппа (κ) и лямбда (λ).

В настоящем описании понятие «Fc-область» применяют для обозначения С-концевой области тяжелых цепей иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константных областей. Это понятие включает Fc-область, имеющую встречающуюся в естественных условиях последовательность, и мутант Fc-области. В одном из объектов изобретения Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается с Cys226 или с Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) или глицин-лизин (Gly446-Lys447) Fc-области может присутствовать или отсутствовать. Если специально не указано иное, то в настоящем описании нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU (которую обозначают также как EU-индекс), описанной у Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, который/которая входит в его тяжелую цепь. Известно пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из этих классов можно подразделять дополнительно на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулина, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно.

В настоящем описании «антигенсвязывающий домен» ограничен только способностью связываться с представляющим интерес антигеном. Антигенсвязывающий домен может представлять собой домен, имеющий любую структуру, если применяемый домен связывается с представляющим интерес антигеном. Примеры указанного домена включают (но, не ограничиваясь только ими), вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH), вариабельную область легкой цепи антитела (VL), однодоменное антитело (scAт), модуль, состоящий примерно из 35 аминокислот, обозначенный как А-домен, который входит в авимер (Avimer), белок клеточной мембраны, присутствующий in vivo (публикации международных заявок на патент WO 2004/044011 и WO 2005/040229), аднектин (Adnectin), содержащий 10Fn3-домен, служащий в качестве связывающего белок домена, полученного из гликопротеина фибронектина, экспрессируемого на клеточных мембранах (публикация международной заявки на патент WO 2002/032925), аффибоди (Affibody), имеющий каркас IgG-связывающего домена, состоящий из трехспирального пучка, включающего 58 аминокислот белка А (публикация международной заявки на патент WO 1995/001937), DARPin (сконструированные белки с анкириновыми повторами), которые представляют собой области анкириновых повторов (AR), экспонируемые на молекулярной поверхности, каждый из которых имеет структуру, в которой повторно уложена субъединица с изгибом, содержащая 33 аминокислотных остатка, две антипараллельные спирали и петлю (публикация международной заявки на патент WO 2002/020565), антикалин (Anticalin), который имеет состоящие из четырех петель области, поддерживающие одну сторону центрально закрученной бочкообразной структуры, состоящей из восьми антипараллельных цепей, которые являются высоко консервативными среди молекул липокаинов, таких как липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL) (публикация международной заявки на патент WO 2003/029462), и вогнутую область, образованную структурой в виде параллельных тяжей внутри подковообразной структуры, образованной уложенными повторами, которые состоят из богатых лейцином повторяющихся (LRR) модулей вариабельного рецептора лимфоцитов (VLR), который не имеет иммуноглобулиновой структуры и применяется в системе приобретенной устойчивости у бесчелюстных позвоночных, таких как миноги или миксины (публикация международной заявки на патент WO 2008/016854).

Предпочтительные примеры антигенсвязывающего домена, предлагаемого в настоящем изобретении, включают антигенсвязывающий домен, который может проявлять антигенсвязывающую функцию молекулы, состоящей только из антигенсвязывающего домена, и антигенсвязывающий домен сам может проявлять антигенсвязывающую функцию после освобождения от дополнительного пептидного линкера, связанного с ним. Примеры такого антигенсвязывающего домена включают (но, не ограничиваясь только ими) однодоменное антитело, scFv, Fv, Fab, Fab' и F(ab')₂.

Одним из предпочтительных примеров антигенсвязывающего домена, предлагаемого в настоящем изобретении, является антигенсвязывающий домен с молекулярной массой 60 кДа или менее. Примеры такого антигенсвязывающего домена включают (но, не ограничиваясь только ими) однодоменные антитела, scFv, Fab и Fab'. По-видимому, антигенсвязывающий домен с молекулярной массой 60 кДа или менее, как правило, выводится почками в результате клиренса, когда присутствует в виде мономера в крови (см. J Biol Chem. 263 (29), 15 октября 1988 г., сс. 15064-15070).

С другой точки зрения, один из предпочтительных примеров антигенсвязывающего домена, предлагаемого в настоящем изобретении, включает антигенсвязывающий домен, который имеет время полужизни в крови 12 ч или менее. Примеры такого антигенсвязывающего домена включают (но, не ограничиваясь только ими) однодоменные антитела, scFv, Fab и Fab'.

Один из предпочтительных примеров антигенсвязывающего домена, предлагаемого в настоящем изобретении, включает однодоменное антитело (sdAT).

В настоящем описании понятие «однодоменное антитело» не ограничено его структурой, если домен может сам обладать антигенсвязывающей активностью. Известно, что обычное антитело, например, антитело IgG-типа, обладает антигенсвязывающей активностью в состоянии, в котором вариабельная область образуется путем спаривания VH и VL, в то время как собственная структура домена однодоменного антитела сама может обладать антигенсвязывающей активностью без спаривания с другим доменом. Как правило, однодоменное антитело имеет относительно низкую молекулярную массу и присутствует в форме мономера.

Примеры однодоменного антитела включают (но, не ограничиваясь только ими) антигенсвязывающие молекулы, в которых исходно отсутствует легкая цепь, такие как VHH животного семейства Camelidae и акульи V_NAR, и фрагменты антител, которые содержат полный VH-домен антитела или его часть или полный VL-домен антитела или его часть. Примеры однодоменного антитела, которое представляет собой фрагмент антитела, содержащий полный VH-домен или VL-домен антитела или его часть, включают (но, не ограничиваясь только ими) искусственно созданные однодоменные антитела, происходящие из VH человеческого антитела или VL человеческого антитела, которые описании в US №6248516 В1 и др. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения одно однодоменное антитело имеет три CDR (CDR1, CDR2 и CDR3).

Однодоменное антитело можно получать из животного, в организме которого может продуцироваться однодоменное антитело, или путем иммунизации животного, в организме которого может продуцироваться однодоменное антитело. Примеры животного, в организме которого может продуцироваться однодоменное антитело, включают (но, не ограничиваясь только ими) животных семейства Camelidae и трансгенных животных, несущих ген, который может кодировать однодоменное антитело. Животные семейства Camelidae включают верблюдов, лам, альпак, одногорбых верблюдов и гуанако и др. Примеры трансгенных животных, несущих ген, который может кодировать однодоменное антитело, включают (но, не ограничиваясь только ими) трансгенных животных, которые описаны в публикации международной заявки на патент WO 2015/143414 и публикации патента США US 2011/0123527 А1. Каркасные последовательности однодоменного антитела, полученного из животного, можно превращать в последовательности человеческих зародышевых линий или в сходные с ними последовательности с получением гуманизированного однодоменного антитела. Гуманизированное однодоменное антитело (например, гуманизированный VHH) также является одним из вариантов однодоменного антитела, предлагаемого в настоящем изобретении.

Альтернативно этому, однодоменное антитело можно получать с помощью ELISA, пэннинга или т.п. из полипептидной библиотеки, содержащей однодоменные антитела. Примеры полипептидных библиотек, содержащих однодоменные антитела, включают (но, не ограничиваясь только ими) библиотеки наивных антител, полученных из различных животных или людей (см., например, Methods in Molecular Biology 911, 2012, cc. 65-78; и Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 1764: 8, 2006, 1307-1319), библиотеки антител, полученных путем иммунизации различных животных (см., например, Journal of Applied Microbiology 117: 2, 2014, cc. 528-536), и библиотеки синтетических антител, полученных из генов антител различных животных или людей (см., например, Journal of Biomolecular Screening 21: 1, 2016, cc. 35-43; Journal of Biological Chemistry 291:24, 2016, cc. 12641-12657; и AIDS 30: 11, 2016, cc. 1691-1701).

В настоящем описании «антиген» ограничен только наличием эпитопа, с которым связывается антигенсвязывающий домен. Предпочтительные примеры антигена включают (но, не ограничиваясь только ими) пептиды, полипептиды и белки животного или человеческого происхождения. Предпочтительные примеры антигена, предназначенного для применения для лечения заболевания, вызываемого тканью-мишенью, включают (но, не ограничиваясь только ими) молекулы, экспрессируемые на поверхности клеток-мишеней (например, раковых клеток и воспалительных клеток), молекулы, экспрессируемые на поверхности других клеток в тканях, содержащих клетки-мишени, молекулы, экспрессируемые на поверхности клеток, которые играют иммунологическую роль в отношении клеток-мишеней и тканей, содержащих клетки-мишени, и крупные молекулы, присутствующие в строме тканей, содержащих клетки-мишени.

Примеры антигена могут включать следующие молекулы: 17-IA, 4-1ВВ, 4Dc, 6-кето-PGF1a, 8-изо-PGF2a, 8-оксо-dG, А1 аденозиновый рецептор, А33, АСЕ, АСЕ-2, активин, активин А, активин АВ, активин В, активин С, активин RIA, активин RIA ALK-2, активин RIB ALK-4, активин RIIA, активин RIIB, ADAM, ADAM 10, ADAM 12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, адрессин, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсин, антагонист альфа-V/бета-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, артемин, анти-Id, ASPARTIC, предсердный натрийуретический фактор, интегрин av/b3, Axl, b2M, В7-1, В7-2, В7-Н, стимулятор В-лимфоцитов (BlyS), ВАСЕ, ВАСЕ-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Вах, ВСА-1, ВСАМ, Bcl, ВСМА, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 остеогенин, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, бомбезин, нейротрофический фактор костного мозга, BPDE, BPDE-DNA, ВТС, фактор системы комплемента 3 (С3), С3а, С4, С5, С5а, С10, СА125, CAD-8, кальцитонин, цАМФ, карциноэмбриональный антиген (СЕА), ассоциированные с раком антигены, катепсин А, катепсин В, катепсин C/DPPI, катепсин D, катепсин Е, катепсин Н, катепсин L, катепсин О, катепсин S, катепсин V, катепсин X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белок р67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (В7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, цГМФ, CINC, ботулинический токсин, токсин Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, PD1, PDL1, LAG3, TIM3, галектин-9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, антигены, ассоциированные с цитокератином опухоли, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, регулирующий комплемент фактор (фактор ускорения диссоциации), des(1-3)-IGF-I (IGF-1 головного мозга), Dhh, дигоксин, DNAM-1, ДНКаза, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, эндотелиновый рецептор, энкефалиназа, eNOS, Eot, эотаксин 1, EpCAM, эфрин B2/EphB4, EPO, ERCC, Е-селектин, ET-1, фактор IIa, фактор VII, фактор VIIIc, фактор IX, фибробласт-активирующий белок (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ферритин, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, фибрин, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующий гормон, фракталкин, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа 1, GFR-альфа 2, GFR-альфа 3, GITR, глюкагон, Glut4, гликопротеин IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, релизин-фактор ростового гормона, гаптен (NP-кэп или NIP-кэп), HB-EGF, НСС, оболочечный гликопротеин HCMV gB, оболочечный гликопротеин HCMV gH, HCMV UL, гематопоэтический фактор роста (HGF), Hep В gp120, гепараназа, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеин вируса герпеса простого (HSV) gB, гликопротеин HSV gDn, HGFA, высокомолекулярный ассоциированный с меланомой антиген (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG РЕМ, HRG, Hrk, человеческий сердечный миозин, человеческий цитомегаловирус (HCMV), человеческий гормон роста (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA-рецептор, IgE, IGF, IGF-связывающий белок, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-21, IL-23, IL-27, интерферон (INF)-альфа, INF-бета, INF-гамма, ингибин, iNOS, А-цепь инсулина, В-цепь инсулина, инсулиноподобный фактор роста 1, интегрин альфа 2, интегрин альфа 3, интегрин альфа 4, интегрин альфа 4/бета 1, интегрин альфа 4/бета 7, интегрин альфа 5 (альфа V), интегрин альфа 5/бета 1, интегрин альфа 5/бета 3, интегрин альфа 6, интегрин бета 1, интегрин бета 2, интерферон гамма, IP-10, I-TAC, JE, калликреин 2, калликреин 5, калликреин 6, калликреин 11, калликреин 12, калликреин 14, калликреин 15, калликреин L1, калликреин L2, калликреин L3, калликреин L4, KC, KDR, фактор роста кератиноцитов (KGF), ламинин 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), латентный TGF-1, латентный TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, фактор Lefty, антиген Льюис-Y, антиген, ассоциированный с системой Льюис, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеин, LIX, LKN, Lptn, L-селектин, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, антиген поверхности легкого, лютеинизирующий гормон, рецептор лимфотоксина бета, Мас-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеазы, MGDF-рецептор, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, муцин (Mucl), MUC18, ингибирующее вещество Мюллера, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-кадхерин, NCA 90, NCAM, неприлизин, нейротрофин-3, -4 или -6, нейротурин, фактор роста нерва (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, pi50, p95, PADPr, паратиреоидный гормон, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, Р-кадхерин, PCNA, PDGF, PDK-1, PECAM, РЕМ, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, плацентарная щелочная фосфатаза (PLAP), PIGF, PLP, PP14, проинсулин, прорелаксин, белок С, PS, PSA, PSCA, простатспецифический мембранный антиген (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, цепь А релаксина, цепь В релаксина, ренин, респираторно-синцитиальный вирус (RSV) F, RSV Fgp, Ret, ревматоидный фактор, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, сывороточный альбумин, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (ассоциированный с опухолью гликопротеин-72), TARC, ТСА-3, Т-клеточный рецептор (например, Т-клеточный рецептор альфа/бета), TdT, ТЕСК, ТЕМ1, ТЕМ5, ТЕМ7, ТЕМ8, TERT, PLAP-подобная щелочная фосфатаза яичек, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, TGF-бета Pan-специфический, TGF-бетаRI (ALK-5), TGF-бетаRII, TGF-бетаRIIb, TGF-бетаRIII, TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, TGF-бета4, TGF-бета5, тромбин, Ck-1 тимуса, тиреотропный гормон, Tie, TIMP, TIQ, тканевый фактор, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа, бета, TNF-бета2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2-лиганд, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK-лиганд ODF, OPG-лиганд), TNFSF12 (TWEAK Apo-3-лиганд, DR3-лиганд), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM-лиганд, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR-лиганд AITR-лиганд, TL6), TNFSF1A (TNF-а конектин, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ОХ40-лиганд gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD40-лиганд CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas-лиганд Apo-1-лиганд, APT1-лиганд), TNFSF7 (CD27-лиганд CD70), TNFSF8 (CD30-лиганд CD153), TNFSF9 (4-1ВВ-лиганд CD137-лиганд), ТР-1, t-PA, Тро, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептор трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TLR (Toll-подобный рецептор) 1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TSG, TSLP, ассоциированный с опухолью антиген СА125, ассоциированный с опухолью антиген, экспрессирующий ассоциированные с антигеном Льюис-Y углеводы, TWEAK, ТХВ2, Ung, uPAR, uPAR-1, урокиназа, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-кадхерин, УЕ-кадхерин-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, вирусный антиген, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR интегрин, фактор фон Виллебранда, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, А бета, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, окисленный LDL, PCSK9, прекалликреин, RON, TMEM16F, SOD1, хромогранин А, хромогранин В, tau, VAP1, высокомолекулярный кининоген, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, С3, С3а, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, фактор В, фактор D, фактор H, пропердин, склеростин, фибриноген, фибрин, протромбин, тромбин, тканевый фактор, фактор V, фактор Va, фактор VII, фактор VIIa, фактор VIII, фактор VIIIa, фактор IX, фактор IXa, фактор X, фактор Ха, фактор XI, фактор XIa, фактор XII, фактор XIIa, фактор XIII, фактор XIIIa, TFPI, антитромбин III, EPCR, тромбомодулин, TAPI, tPA, плазминоген, плазмин, PAI-1, PAI-2, GPC3, синдекан-1, синдекан-2, синдекан-3, синдекан-4, LPA и S1P; и рецепторы для гормонов и факторов роста.

Учитывая, что перечисленные выше примеры антигенов включают также рецепторы, указанные рецепторы, даже присутствующие в растворимой форме в общей воде организма, можно применять в качестве антигена, с которым связывается антигенсвязывающий домен, предлагаемый в настоящем изобретении. Один из примеров (но, не ограничиваясь только им) растворимой формы такого рецептора может являться белок, представленный в SEQ ID NO: 35, который представляет собой растворимый IL-6R, описанный у Mullberg и др., J. Immunol. 152 (10), 1994, сс. 4958-4968.

Перечисленные выше примеры антигенов включают мембранные молекулы, которые экспрессируются на клеточных мембранах, и растворимые молекулы, которые секретируются из клеток наружу от клеток. Когда антигенсвязывающий домен, предлагаемый в настоящем изобретении, связывается с растворимой молекулой, секретируемой из клеток, то антигенсвязывающий домен предпочтительно обладает нейтрализующей активностью.

Раствор, в котором содержится растворимая молекула, не ограничен, и указанная растворимая молекула может присутствовать в общей воде организма, т.е. в любой жидкости сосудов или любой жидкости, заполняющей пространство между тканями и клетками в живых организмах. Растворимая молекула, с которой антигенсвязывающий домен, предлагаемый в настоящем изобретении, связывается, может присутствовать во внеклеточной жидкости (но, не ограничиваясь только указанным). Внеклеточная жидкость является общим названием плазмы, межклеточной жидкости, лимфы, плотных соединительных тканей, спинномозговой жидкости, спинальной жидкости, аспиратов, синовиальной жидкости или таких компонентов в кости и хряще, альвеолярной жидкости (жидкость бронхоальвеолярного лаважа), асцитной жидкости, плеврального выпота, сердечного выпота, цистной жидкости, внутриглазной жидкости (гидатоид) или указанных трансклеточных жидкостей (различные жидкости в гранулярных полостях, образовавшиеся в результате активного транспорта или секреторной активности клеток, и жидкости в полости кишечника и других полостей в организме) у позвоночных животных.

Эпитоп, который означает антигенную детерминанту, присутствующую в антигене, представляет собой область с которой связывается антигенсвязывающий домен, указанный в настоящем описании. Так, например, эпитоп можно характеризовать на основе его структуры. Альтернативно этому, эпитоп можно характеризовать на основе антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена, который распознает эпитоп. Когда антиген представляет собой пептид или полипептид, то эпитоп можно определять по аминокислотным остаткам, образующим эпитоп. Когда эпитоп представляет собой сахарную цепь, то эпитоп можно определять по специфической для него структуре сахарной цепи.

Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, который содержит эпитоп, который распознается по его первичной последовательности аминокислот. Указанный линейный эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере 3 и наиболее часто по меньшей мере 5, например, примерно от 8 до 10 или от 6 до 20 аминокислотных остатков в его уникальной последовательности.

В отличие от линейного эпитопа конформационный эпитоп представляет собой эпитоп, в котором первичная последовательность аминокислот содержит компонент, который не является единственной детерминантой распознаваемого эпитопа (например, эпитоп, первичная последовательность аминокислот которого может не распознаваться специфическим в отношении эпитопа антителом). Конформационный эпитоп может содержать увеличенное по сравнению с линейными эпитопами количество аминокислот. Для распознавания конформационного эпитопа антигенсвязывающий домен распознает трехмерную структуру пептида или белка. Например, когда белковая молекула уложена и образует трехмерную структуру, то некоторые аминокислоты и/или полипептидный каркас, которые образуют конформационный эпитоп, располагаются параллельно, что обеспечивает распознавание эпитопа. Примеры методов определения конформации эпитопа включают (но, не ограничиваясь только ими) рентгеновскую кристаллографию, двухмерный ядерный магнитный резонанс и сайтспецифическое спиновое мечение, и электронный парамагнитный резонанс (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, под ред. Morris, т. 66, 1996).

Структуру антигенсвязывающего домена, связывающегося с эпитопом, называют паратопом. Паратоп стабильно связывается с эпитопом посредством водородной связи, электростатической силы, Ван-дер-ваальсовой силы, гидрофобной связи или т.п., действующей между эпитопом и паратопом. Указанную силу связывания между эпитопом и паратопом называют аффинностью. Общую силу связывания, когда множество антигенсвязывающих доменов связывается с множеством антигенов называют авидностью. Аффинность действует синергетически, когда, например, антитело, содержащее множество антигенсвязывающих доменов (т.е. многовалентное антитело), связывается с множеством эпитопов. Таким образом, авидность превышает аффинность.

В конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен, представленный в настоящем описании, характеризуется константой диссоциации (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М).

Ниже в качестве примера представлен метод подтверждения связывания антигенсвязывающего домена против IL-6R, или полипептида, содержащего антигенсвязывающий домен, с эпитопом. Однако метод подтверждения связывания антигенсвязывающего домена против антигена, отличного от IL-6R, или полипептида, содержащего антигенсвязывающий домен, с эпитопом, можно осуществлять также соответственно согласно описанному ниже примеру.

Например, для подтверждения того, что антигенсвязывающий домен против IL-6R распознает линейный эпитоп в молекуле IL-6R, можно применять описанный ниже метод: синтезируют для указанной выше цели линейный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая содержит внеклеточный домен IL-6R. Пептид можно синтезировать химически. Альтернативно этому, пептид получают с помощью методов генной инженерии, используя область в кДНК IL-6R, которая кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую внеклеточному домену. Затем оценивают антигенсвязывающий домен против IL-6R в отношении связывающей активности с линейным пептидом, который содержит аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен. Например, иммобилизованный линейный пептид можно применять в качестве антигена при осуществлении ELISA для оценки связывающей активности антигенсвязывающей домена в отношении пептида. Альтернативно этому, связывающую активность в отношении линейного пептида можно оценивать по уровню ингибирования линейным пептидом связывания антигенсвязывающего домена с экспрессирующими IL-6R клетками. С помощью этих анализов можно определять связывающую активность антигенсвязывающего домена в отношении линейного пептида.

Кроме того, способность антигенсвязывающего домена против IL-6R распознавать конформационный эпитоп можно подтверждать следующим методом: для описанной выше цели получали экспрессирующие IL-6R клетки. Считается, например, что антигенсвязывающий домен против IL-6R распознает конформационный эпитоп, если он при контакте отличается сильным связыванием с экспрессирующими IL-6R клетками, но при этом антигенсвязывающий домен в незначительной степени связывается с иммобилизованным линейным пептидом, который содержит аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен IL-6R, или с денатурированным (с помощью обычного денатурирующего агента, такого как гуанидин) линейным пептидом, который содержит аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен IL-6R. В этом контексте понятие «связывается в незначительной степени» означает, что активность связывания составляет 80% или менее, как правило, 50% или менее, предпочтительно 30% или менее и наиболее предпочтительно 15% или менее по сравнению с активностью связывания с клетками, экспрессирующими человеческий IL-6R.

Метод подтверждения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена включает также метод измерения величины Kd, например, с помощью анализа связывания несущего радиоактивную метку антигена (РИА). В одном из вариантов осуществления изобретения РИА осуществляют с использованием представляющего интерес антигенсвязывающего домена и его антигена. Например, измеряют в растворе аффинность связывания антигенсвязывающего домена и его антигена путем уравновешивания антигенсвязывающего домена минимальной концентрацией меченного ¹²⁵I антигена в присутствии полученных титрованием серийных разведений немеченого антигена, и осуществляя затем «захват» связанного антигена с помощью планшета, сенсибилизированного антигенсвязывающим доменом (см., например, Chen и др., J. Mol Biol 293, 1999, сс. 865-881).

В альтернативном варианте осуществления изобретения Kd измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса с помощью устройства BIACORE^®. Например, анализ осуществляют с помощью устройства BIACORE^®-2000 или BIACORE^®-3000 (фирма BIAcore Inc., Пискатавей, шт. Нью-Джерси) при 25°C с использованием антигена, иммобилизованного на СМ5-чипах с уровнем иммобилизации, соответствующим примерно 10 единицам ответа (RU). В одном из вариантов осуществления изобретения биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма BIAcore Inc.) активируют с помощью гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8 до концентрации 5 мкг/мл (примерно 0,2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/мин для достижения связывания белка, соответствующего примерно 10 единицам ответа (RU). После инъекции антигена инъецируют 1 М этаноламин для блокады непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецируют двукратные серийные разведения (от 0,78 до 500 нМ) антигенсвязывающего домена в ЗФР, дополненном 0,05% полисорбата 20 (TWEEN-20™) в качестве сурфактанта (ЗФР-Т), при 25°С со скоростью потока примерно 25 мкл/мин. Скорость реакции ассоциации (k_on) и реакции диссоциации (k_off) рассчитывают с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программное обеспечение Evaluation, версия 3.2, BIACORE®) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции диссоциации (Kd) рассчитывают как соотношение k_off/k_on. Кроме того, кажущуюся константу диссоциации (Kd) можно определять с помощью анализа равновесия. Для осуществления этой процедуры можно применять протокол, прилагаемый к BIACORE® (см., например, Chen и др., J Mol Biol 293, 1999, cc. 865-881 и Methods Enzymol. 323, 2000, cc. 325-340). При осуществлении анализа методом поверхностного плазмонного резонанса специалисты в данной области могут в значительной степени изменять количество иммобилизованного белка, количество применяемого в реакции белка, температуру и состав раствора. Если скорость реакции ассоциации превышает 10⁶ М^-1с^-1 при оценке с помощью описанного выше метода поверхностного плазмонного резонанса, то скорость реакции ассоциации можно определять с помощью метода гашения флуоресценции, который позволяет измерять повышение или снижение интенсивности излучения флуоресценции (длина волны возбуждения 295 нм; длина волны испускания 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С, применяя в концентрации 20 нМ антигенсвязывающий домен в ЗФР, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, осуществляя измерения с помощью спектрометра (например, спектрофотометра, снабженного блоком для остановки потока (фирма Aviv Instruments), или спектрофотометра SLM-AMINCO™ серии 8000 (фирма ThermoSpectronic / Thermo Fisher Scientific Inc.) при перемешивании содержимого кюветы).

Кроме того, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена можно измерять с помощью известного метода измерения взаимодействия типа молекула-молекула, такого как электрогенерированная хемилюминесценция.

Примеры метода измерения связывающей активности антигенсвязывающего домена с IL-6R в отношении экспрессирующих IL-6R клеток включают методы, описанные в: Antibodies: A Laboratory Manual, под ред. Harlow, David Lane, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, cc. 359-420. В частности, оценку связывающей активности можно осуществлять на основе принципа ELISA или метода FACS (разделение клеток на основе возбуждения флуоресценции), используя экспрессирующие IL-6R клетки в качестве антигена.

В формате ELISA связывающую активность антигенсвязывающего домена с IL-6R в отношении экспрессирующих IL-6R клеток, можно оценивать количественно путем сравнения уровней сигналов, возникающих в процессе ферментативной реакции. В частности, тестируемый полипептид с ассоциированными компонентами (полипептидный комплекс) добавляют в планшет для ELISA, на котором иммобилизованы экспрессирующие IL-6R клетки. Затем тестируемый антигенсвязывающий домен, связанный с клетками, выявляют с помощью меченного ферментом антитела, которое распознает тестируемый антигенсвязывающий домен. Альтернативно этому, когда применяют FACS, приготавливают серийные разведения тестируемого антигенсвязывающего домена, и титр антитела, связывающегося с экспрессирующими IL-6R клетками, можно определять путем сравнения активности тестируемого антигенсвязывающего домена с экспрессирующими IL-6R клетками.

Связывание тестируемого антигенсвязывающего домена с антигеном, который экспрессируется на поверхности клеток, суспендированных в буферном растворе или аналогичной среде, можно выявлять с помощью проточного цитометра. Известными проточными цитометрами являются, например, следующие устройства:

FACSCanto™ II,

FACS Aria™,

FACS Array™,

FACS Vantage™ SE

FACSCalibur™ (все товарные знаки фирмы BD Biosciences),

EPICS ALTRA HyPerSort,

Cytomics FC 500,

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC,

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (все товарные знаки фирмы Beckman Coulter).

Одним из предпочтительных примеров метода измерения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в отношении IL-6R является следующий метод: сначала экспрессирующие IL-6R клетки, подвергнутые взаимодействию с тестируемым антигенсвязывающим доменом, окрашивают меченным с помощью ФИТЦ вторичным антителом, которое распознает тестируемый антигенсвязывающий домен. Тестируемый антигенсвязывающий домен соответствующим образом разводят приемлемым буферным раствором с получением антигенсвязывающего домена в требуемой для применения концентрации. Например, антигенсвязывающий домен можно применять в концентрации, составляющей от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Затем определяют интенсивность флуоресценции и количество клеток с помощью FACSCalibur (фирма Becton, Dickinson and Company). Интенсивность флуоресценции, определенная с помощью анализов на основе программы CELL QUEST (фирма Becton, Dickinson and Company), а именно, выраженная в виде средних геометрических значений, отражает количество связанного тестируемого антигенсвязывающего домена. В целом, активность связывания антигенсвязывающего домена, выраженную в количестве связанного тестируемого антигенсвязывающего домена, можно оценивать, определяя среднее геометрическое значение.

Имеет ли антигенсвязывающий домен против IL-6R общий эпитоп с каким-либо антигенсвязывающим доменом, можно оценивать по конкуренции между этими антигенсвязывающими домена за один и тот же эпитоп. Конкуренцию между антигенсвязывающими доменами определяют путем анализа перекрестной блокады или с помощью аналогичного анализа. Например, предпочтительным анализом перекрестной блокады является конкурентный ELISA-анализ.

В частности, при осуществлении анализа перекрестной блокады белок IL-6R, иммобилизованный в лунках титрационного микропланшета, предварительно инкубируют в присутствии антигенсвязывающего домена, рассматриваемого в качестве конкурента-кандидата, или без него. Затем вносят тестируемый антигенсвязывающий домен. Количество связанного с белком IL-6R тестируемого антигенсвязывающего домена в лунках находится в обратной корреляции с активностью связывания антигенсвязывающего домена, рассматриваемого в качестве конкурента-кандидата, который конкурирует за связывание с этим же эпитопом. В целом, это означает, что чем выше аффинность антигенсвязывающего домена, рассматриваемого в качестве конкурента-кандидата, к одному и тому же эпитопу, тем ниже активность связывания тестируемого антигенсвязывающего домена с сенсибилизированными белком IL-6R лунками.

Количество тестируемого антигенсвязывающего домена, связанного через белок IL-6R с лунками, легко определять путем предварительного мечения антигенсвязывающего домена. Например, меченный биотином антигенсвязывающий домен оценивают с использованием конъюгата авидин/пероксидаза и соответствующего субстрата. В частности, анализ перекрестной блокады, в котором применяют в качестве меток ферменты, такие как пероксидаза, называют «ELISA-анализом в конкурентных условиях (конкурентный анализ)». Антигенсвязывающий домен можно метить также с помощью других предназначенных для мечения субстанций, которые можно выявлять или оценивать. В частности, в данной области известны радиоактивные метки, флуоресцентные метки и т.п.

Когда антигенсвязывающий домен, рассматриваемый в качестве конкурента-кандидата, может блокировать связывание антигенсвязывающего домена против IL-6R по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 20-50% и предпочтительно по меньшей мере на 50% по сравнению со связывающей активностью установленной в контрольном эксперименте, который проводят в отсутствии антигенсвязывающего домена, рассматриваемого в качестве конкурента-кандидата, то считается, что для тестируемого антигенсвязывающего домена характерна выраженная способность к связыванию с тем же эпитопом, с которым связывается антигенсвязывающий домен, рассматриваемый в качестве конкурента, или он конкурирует за связывание с тем же самым эпитопом.

Если структура эпитопа, с которым связывается антигенсвязывающий домен против IL-6R, уже идентифицирована, то для решения вопроса о том, имеют ли тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен один и тот же эпитоп, можно сравнивать связывающие активности двух указанных антигенсвязывающих доменов с пептидом или полипептидом, полученным путем интродукции аминокислотной мутации в пептид, образующий эпитоп.

При осуществлении указанного метода измерения связывающих активностей, например, можно сравнивать связывающие активности тестируемого антигенсвязывающего домена и контрольного антигенсвязывающего домена с линейным пептидом, в который интродуцирована мутация, с помощью описанного выше формата ELISA. Помимо метода ELISA связывающую активность в отношении мутантного пептида, связанного с колонкой, можно определять, пропуская через колонку тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен и затем оценивая количество антигенсвязывающего домена, элюированное в раствор для элюции. Известны методы адсорбции мутантного пептида на колонке, например, в форме слитого с GST пептида.

Когда идентифицированный эпитоп представляет собой конформационный эпитоп, то для решения вопроса о том, имеют ли тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен общий эпитоп, можно применять следующий метод: сначала получают экспрессирующие IL-6R клетки и клетки, экспрессирующие IL-6R с мутацией, интродуцированной в эпитоп. Тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен добавляют в клеточные суспензии, полученные путем суспендирования этих клеток в приемлемом буферном растворе, таком как ЗФР. Затем клеточные суспензии соответствующим образом промывают буферным раствором и добавляют меченное с помощью ФИТЦ антитело, которое распознает тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен. Определяют интенсивность флуоресценции и количество клеток, окрашенных меченым антителом, используя FACSCalibur (фирма Becton, Dickinson and Company). Тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен соответствующим образом разводят приемлемым буферным раствором и применяют в требуемой концентрации. Указанные антигенсвязывающие домены применяют, например, в любой из концентраций от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Интенсивность флуоресценции определяют с помощью анализа, для оценки результатов которого применяют программу CELL QUEST (фирма Becton, Dickinson and Company), а именно, определяют среднее геометрическое значение, которое отражает количество меченого антитела, связанного с клетками. В целом, это означает, что связывающую активность тестируемого антигенсвязывающего домена и контрольного антигенсвязывающего домена, которые характеризуются количеством связанного меченого антитела, можно определять, оценивая среднее геометрическое значение.

Конкуренцию антигенсвязывающего домена с другими антигенсвязывающим доменом за один и тот же эпитоп помимо описанных выше анализов ELISA или FACS можно определять также с помощью анализа связывания несущего радиоактивную метку антигена (РИА), анализа поверхностного плазмонного резонанса BIACORE®, электрогенерированной хемилюминисценции или т.п.

При осуществлении описанного выше метода для решения вопроса о том, имеет ли место «незначительное связывание с клетками, которые экспрессируют мутантный IL-6R», можно применять, например, следующий метод: сначала тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен, связанные с клетками, которые экспрессируют мутантный IL-6R, окрашивают меченым антителом. Затем определяют интенсивность флуоресценции в клетках. Когда для оценки флуоресценции с помощью проточной цитометрии используют FACSCalibur, то полученную интенсивность флуоресценции можно анализировать с помощью программы CELL QUEST. На основе средних геометрических значений в присутствии полипептидного комплекса и без него можно рассчитывать согласно приведенной ниже формуле I используемое для сравнения значение (ΔGeo-Mean), характеризующее степень увеличения интенсивности флуоресценции в результате связывания с антигенсвязывающим доменом.

(Формула I)

ΔGeo-Mean = Geo-Mean (в присутствии полипептидного комплекса)/Geo-Mean (в отсутствии полипептидного комплекса)

Используемое для сравнения среднее геометрическое значение (значение ΔGeo-Mean для мутантной молекулы IL-6R), определенное с помощью описанного выше анализа, которое отражает количество тестируемого антигенсвязывающего домена, связанного с клетками, которые экспрессируют мутантный IL-6R, сравнивают с используемым для сравнения значением ΔGeo-Mean, которое отражает количество тестируемого антигенсвязывающего домена, связанного с экспрессирующими IL-6R клетками. В этом случае концентрации тестируемого антигенсвязывающего домена, применяемые для определения используемых для сравнения (относительных) значений ΔGeo-Mean для экспрессирующих IL-6R клеток и клеток, экспрессирующих мутантный IL-6R, наиболее предпочтительно регулируют таким образом, чтобы концентрации были одинаковыми или практически одинаковыми. Антигенсвязывающий домен, для которого уже подтверждена способность распознавать эпитоп в IL-6R, применяют в качестве контрольного антигенсвязывающего домена.

Если используемое для сравнения значение ΔGeo-Mean тестируемого антигенсвязывающего домена в отношении клеток, экспрессирующих мутантный IL-6R, ниже чем используемое для сравнения значение ΔGeo-Mean тестируемого антигенсвязывающего домена в отношении клеток, экспрессирующих IL-6R, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 50%, более предпочтительно на 30% и наиболее предпочтительно на 15%, то считают, что тестируемый антигенсвязывающий домен «незначительно связывается с клетками, которые экспрессируют мутантный IL-6R». Формула для определения значения Geo-Mean (среднее геометрическое значение) описана в руководстве по применению программы CELL QUEST (фирма BD biosciences). Когда путем сравнения установлено, что используемые для сравнения значения являются практически эквивалентными, то можно считать, что тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен имеют одинаковый эпитоп.

В настоящем описании понятие «транспортирующий фрагмент» относится к фрагменту, отличному от антигенсвязывающего домена в полипептиде. Транспортирующий фрагмент, предлагаемый в настоящем изобретении, как правило, представляет собой пептид или полипептид, состоящий из аминокислот. В конкретном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент представляет собой полипептид, сцепленный с антигенсвязывающим доменом через сайт расщепления. Транспортирующий фрагмент, предлагаемый в настоящем изобретении, может представлять собой серию пептидов или полипептидов, соединенных через амидную связь, или может представлять собой комплекс, образованный из множества пептидов или полипептидов с помощью ковалентной связи, такой как дисульфидная связь, или нековалентной связи, такой как водородная связь или гидрофобное взаимодействие.

Транспортирующий фрагмент, предлагаемый в настоящем изобретении, имеет ингибирующий домен, который ингибирует антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена. В настоящем описании понятие «ингибирующий домен» ограничено только ингибированием антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена. Ингибирующий домен может представлять собой домен, имеющий любую структуру, если применяемый домен может ингибировать антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена. Примеры указанного ингибирующего домена включают (но, не ограничиваясь только ими) вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH), вариабельную область легкой цепи антитела (VL), рецепторы пре-В-клеток и однодоменные антитела. Ингибирующий домен может полностью образовывать транспортирующий фрагмент или может образовывать часть транспортирующего фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения высвободившийся из полипептида антигенсвязывающий домен имеет более высокую антигенсвязывающую активность по сравнению с активностью до высвобождения. Другими словами, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена ингибируется с помощью ингибирующего домена в невысвободившемся из полипептида состоянии антигенсвязывающего домена. Решение вопроса о том, ингибируется ли антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена с помощью ингибирующего домена, осуществляют с помощью такого метода как FACS ((разделение клеток на основе возбуждения флуоресценции), ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), ECL (электрогенерированная хемилюминисценция), метод SPR (поверхностный плазмонный резонанс) (система Biacore), BLI (интерферометрия биослоя) (система Octet). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена, высвободившегося из полипептида, имеет величину, равную или превышающую в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 или 3000 раз связывающую активность антигенсвязывающего домена, невысвободившегося из полипептида. В некоторых более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения связывание антигенсвязывающего домена с антигеном до высвобождения не поддается обнаружению, когда антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена измеряют с помощью одного из методов, выбранного из перечисленных выше методов.

В некоторых объектах настоящего изобретения сайт расщепления расщепляется так, что антигенсвязывающий домен приобретает способность высвобождаться из полипептида. Таким образом, в указанных объектах изобретения антигенсвязывающую активность можно сравнивать до и после расщепления полипептида. В частности, антигенсвязывающая активность, измеренная при использовании расщепленного полипептида, имеет величину равную или превышающую в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 или 3000 раз антигенсвязывающую активность, измеренную с использованием нерасщепленного полипептида. В некоторых более конкретных вариантах осуществления изобретения связывание с антигеном антигенсвязывающего домена нерасщепленного полипептида не поддается обнаружению, когда антигенсвязывающую активность измеряют с помощью одного из методов, выбранного из перечисленных выше методов.

В некоторых объектах настоящего изобретения сайт расщепления расщепляется протеазой. Таким образом, в указанных объектах изобретения антигенсвязывающую активность можно сравнивать до и после обработки полипептида протеазой. В частности, антигенсвязывающая активность, измеренная с использованием полипептида после обработки протеазой, имеет величину равную или превышающую в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 или 3000 раз антигенсвязывающую активность, измеренную с использованием полипептида, не обработанного протеазой. В некоторых более конкретных вариантах осуществления изобретения связывание с антигеном антигенсвязывающего домена необработанного протеазой полипептида не поддается обнаружению, когда антигенсвязывающую активность измеряют с помощью одного из методов, выбранного из перечисленных выше методов.

В настоящем изобретении полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент, имеет более продолжительное время полужизни в крови, чем антигенсвязывающий домен, присутствующий в индивидуальном виде. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения для удлинения времени полужизни полипептида транспортирующий фрагмент создают так, чтобы он имел более продолжительное время полужизни в крови. В указанных вариантах осуществления изобретения примеры подхода, удлиняющего время полужизни в крови транспортирующего фрагмента, включают (но, не ограничиваясь только ими) большую молекулярную массу транспортирующего фрагмента, FcRn-связывающую активность, которой наделен транспортирующий фрагмент, альбуминсвязывающую активность, которой наделен транспортирующий фрагмент, и ПЭГилирование транспортирующего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент имеет более продолжительное время полужизни в крови, чем антигенсвязывающий домен (другими словами, антигенсвязывающий домен имеет более короткое время полужизни в крови, чем транспортирующий фрагмент).

В настоящем изобретения время полужизни антигенсвязывающего домена индивидуально и полипептида или время полужизни в крови антигенсвязывающего домена и транспортирующего фрагмента предпочтительно сравнивают, как время их полужизни в крови людей. Если время полужизни в крови трудно измерять в организме человека, то его можно прогнозировать на основе времени их полужизни в крови мышей (например, обычных мышей, трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий антиген, и трансгенных мышей, экспрессирующий человеческий FcRn) или обезьян (например, обезьян циномолгус).

В одном из вариантов осуществления изобретения подход, обеспечивающий удлинение времени полужизни в крови транспортирующего фрагмента, включает применение транспортирующего фрагмента, имеющего большую молекулярную массу. В одном из вариантов осуществления изобретения подход, обеспечивающий более длительное время полужизни транспортирующего фрагмента по сравнению с антигенсвязывающим доменом, включает большую молекулярную массу транспортирующего фрагмента по сравнению с антигенсвязывающим доменом.

В одном из вариантов осуществления изобретения подход, обеспечивающий удлинение времени полужизни в крови транспортирующего фрагмента, включает FcRn-связывающую активность, которой наделен транспортирующий фрагмент. Транспортирующий фрагмент можно, как правило, наделять FcRn-связывающей активностью с помощью метода создания FcRn-связывающей области в транспортирующем фрагменте. FcRn-связывающая область означает область, которая обладает связывающей активностью в отношении FcRn, и она может иметь любую структуру, если применяемая область обладает связывающей активностью в отношении FcRn.

Транспортирующий фрагмент, содержащий FcRn-связывающую область, обладает способностью проникать в клетки и затем расщепляться в плазме через путь спасения FcRn. Например, молекула IgG имеет относительно продолжительное время циркуляции в плазме (медленно исчезновение), благодаря функции FcRn, известного в качестве рецептора спасения молекулы IgG. Молекула IgG, поглощенная эндосомой посредством пиноцитоза, связывается с FcRn, который экспрессируется в эндосоме в условиях кислой среды внутри эндосомы. Молекула IgG, которая не может связываться с FcRn, передвигается в лизосому и расщепляется в ней, в то время как молекула IgG, связанная с FcRn, переносится на клеточную поверхность, затем отщепляется в результате диссоциации от FcRn в нейтральных условиях в плазме и затем возвращается в плазму.

FcRn-связывающая область предпочтительно представляет собой область, которая непосредственно связывается с FcRn. Предпочтительные примеры FcRn-связывающей области могут включать Fc-области антител. Однако область, обладающая способностью связываться с полипептидом, таким как альбумин, или IgG, который обладает способностью связываться с FcRn, может непосредственно связываться с FcRn через альбумин, IgG или т.п.Таким образом, FcRn-связывающая область, предлагаемая в настоящем изобретении, может представлять собой область, которая связывается с указанным полипептидом, обладающим FcRn-связывающей способностью.

Связывающую активность FcRn-связывающей области, предлагаемой в настоящем изобретении, в отношении FcRn, прежде всего человеческого FcRn, можно измерять с помощью метода, известного специалистам в данной области, который упомянут выше в разделе, в котором описана связывающая активность. Пригодные для этой цели условия могут определять соответственно специалисты в данной области. Связывающую активность в отношении человеческого FcRn можно оценивать в виде KD (константа диссоциации), кажущаяся KD (кажущаяся константа диссоциации), kd (скорость реакции диссоциации) или кажущаяся kd (кажущаяся скорость реакции диссоциации) и т.д. Указанные величины можно измерять методами, известными специалистам в данной области. Например, можно использовать Biacore (фирма GE Healthcare Japan Corp.), метод Скэтчарда, проточную цитометрию и т.п.

Условия измерения связывающей активности FcRn-связывающей области в отношении FcRn не ограничены конкретно, и их могут выбирать соответственно специалисты в данной области. Связывающую активность можно измерять в условиях, включающих, например, MES-буфер при 37°С, как описано, например, в WO 2009/125825. Кроме того, связывающую активность FcRn-связывающей области, предлагаемой в настоящем изобретении, в отношении FcRn можно измерять методом, известным специалистам в данной области, и можно оценивать с использованием, например, Biacore (фирма GE Healthcare Japan Corp.). При измерении связывающей активности FcRn-связывающей области в отношении FcRn можно инъецировать в качестве аналита FcRn и FcRn-связывающую область или транспортирующий фрагмент, содержащий FcRn-связывающую область, на чипы, на которых иммобилизованы FcRn-связывающая область или транспортирующий фрагмент, содержащий FcRn-связывающую область, и FcRn соответственно, с последующей их оценкой.

Что касается значения рН, применяемого в условиях измерения, то связывающую активность FcRn-связывающей области с FcRn можно оценивать при любом рН от 4,0 до 6,5. Предпочтительно применяют значение рН от 5,8 до 6,0, близкое к рН в ранней эндосоме in vivo, для определения аффинности связывания FcRn-связывающей области с человеческим FcRn. Что касается температуры, применяемой в условиях измерения, то связывающую активность FcRn-связывающей области с FcRn можно оценивать при любой температуре от 10°С до 50°С. Для определения аффинности связывания FcRn-связывающей области с человеческим FcRn применяют предпочтительно температуру от 15°С до 40°С. Более предпочтительно для определения аффинности связывания FcRn-связывающей области с FcRn применяют также любую температуру от 20°С до 35°С, например, любую температуру 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35°С,. Согласно настоящему изобретению температура 25°С является одним из не ограничивающих объем изобретения примеров температуры.

Один из примеров FcRn-связывающей области включает (но, не ограничиваясь только ею) Fc-область антитела IgG-типа. В случае применения Fc-области антитела IgG-типа, ее тип не ограничен только указанным и можно применять, например, Fc-область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Например, можно применять Fc-область, содержащую одну из последовательностей, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 21, 22, 23, и 24.

Можно применять встречающуюся в естественных условиях Fc-область антитела IgG-типа, а также вариант Fc-области, имеющий одну или несколько аминокислотных замен, если Fc-область обладает FcRn-связывающей активностью.

Например, можно применять вариант Fc-области, который содержит аминокислотную последовательность, полученную из Fc-области антитела IgG-типа путем замены по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислоты, находящейся в следующих положениях согласно EU-нумерации: 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436, на другую аминокислоту.

Более конкретно вариант Fc-области содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из следующих замен:

аминокислотная замена для замены Gly в положении 237 на Met,

аминокислотная замена для замены Pro в положении 238 на Ala,

аминокислотная замена для замены Ser в положении 239 на Lys,

аминокислотная замена для замены Lys в положении 248 на Ile,

аминокислотная замена для замены Thr в положении 250 на Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp или Tyr,

аминокислотная замена для замены Met в положении 252 на Phe, Trp или Tyr,

аминокислотная замена для замены Ser в положении 254 на Thr,

аминокислотная замена для замены Arg в положении 255 на Glu,

аминокислотная замена для замены Thr в положении 256 на Asp, Glu или Gln,

аминокислотная замена для замены Pro в положении 257 на Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr или Val,

аминокислотная замена для замены Glu в положении 258 на His,

аминокислотная замена для замены Asp в положении 265 на Ala,

аминокислотная замена для замены Asp в положении 270 на Phe,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 286 на Ala или Glu,

аминокислотная замена для замены Thr в положении 289 на His,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 297 на Ala,

аминокислотная замена для замены Ser в положении 298 на Gly,

аминокислотная замена для замены Val в положении 303 на Ala,

аминокислотная замена для замены Val в положении 305 на Ala,

аминокислотная замена для замены Thr в положении 307 на Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp или Tyr,

аминокислотная замена для замены Val в положении 308 на Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln или Thr,

аминокислотная замена для замены Leu или Val в положении 309 на Ala, Asp, Glu, Pro или Arg,

аминокислотная замена для замены Gln в положении 311 на Ala, His или Ile,

аминокислотная замена для замены Asp в положении 312 на Ala или His,

минокислотная замена для замены Leu в положении 314 на Lys или Arg,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 315 на Ala или His,

аминокислотная замена для замены Lys в положении 317 на Ala,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 325 на Gly,

аминокислотная замена для замены Ile в положении 332 на Val,

аминокислотная замена для замены Lys в положении 334 на Leu,

аминокислотная замена для замены Lys в положении 360 на His,

аминокислотная замена для замены Asp в положении 376 на Ala,

аминокислотная замена для замены Glu в положении 380 на Ala,

аминокислотная замена для замены Glu в положении 382 на Ala,

аминокислотная замена для замены Asn или Ser в положении 384 на Ala,

минокислотная замена для замены Gly в положении 385 на Asp или His,

аминокислотная замена для замены Gln в положении 386 на Pro,

аминокислотная замена для замены Pro в положении 387 на Glu,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 389 на Ala или Ser,

аминокислотная замена для замены Ser в положении 424 на Ala,

аминокислотная замена для замены Met в положении 428 на Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr,

аминокислотная замена для замены His в положении 433 на Lys,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 434 на Ala, Phe, His, Ser, Trp или Tyr и

аминокислотная замена для замены Tyr или Phe в положении 436 на His (все согласно EU-нумерации)

в Fc-области антитела IgG-типа.

С другой точки зрения, можно применять Fc-область, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из

Met в качестве аминокислоты в положении 237,

Ala в качестве аминокислоты в положении 238,

Lys в качестве аминокислоты в положении 239,

Ile в качестве аминокислоты в положении 248,

Ala, Phe, Не, Met, Gln, Ser, Val, Trp или Tyr в качестве аминокислоты в положении 250,

Phe, Trp или Tyr в качестве аминокислоты в положении 252,

Thr в качестве аминокислоты в положении 254,

Glu в качестве аминокислоты в положении 255,

Asp, Glu или Gln в качестве аминокислоты в положении 256,

Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr или Val в качестве аминокислоты в положении 257,

His в качестве аминокислоты в положении 258,

Ala в качестве аминокислоты в положении 265,

Phe в качестве аминокислоты в положении 270,

Ala или Glu в качестве аминокислоты в положении 286,

His в качестве аминокислоты в положении 289,

Ala в качестве аминокислоты в положении 297,

Gly в качестве аминокислоты в положении 298,

Ala в качестве аминокислоты в положении 303,

Ala в качестве аминокислоты в положении 305,

Ala, Asp, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Val, Trp или Tyr в качестве аминокислоты в положении 307,

Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln или Thr в качестве аминокислоты в положении 308,

Ala, Asp, Glu, Pro или Arg в качестве аминокислоты в положении 309,

Ala, His или Ile в качестве аминокислоты в положении 311,

Ala или His в качестве аминокислоты в положении 312,

Lys или Arg в качестве аминокислоты в положении 314,

Ala или His в качестве аминокислоты в положении 315,

Ala в качестве аминокислоты в положении 317,

Gly в качестве аминокислоты в положении 325,

Val в качестве аминокислоты в положении 332,

Leu в качестве аминокислоты в положении 334,

His в качестве аминокислоты в положении 360,

Ala в качестве аминокислоты в положении 376,

Ala в качестве аминокислоты в положении 380,

Ala в качестве аминокислоты в положении 382,

Ala в качестве аминокислоты в положении 384,

Asp или His в качестве аминокислоты в положении 385,

Pro в качестве аминокислоты в положении 386,

Glu в качестве аминокислоты в положении 387,

Ala или Ser в качестве аминокислоты в положении 389,

Ala в качестве аминокислоты в положении 424,

Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr в качестве аминокислоты в положении 428,

Lys в качестве аминокислоты в положении 433,

Ala, Phe, His, Ser, Trp или Tyr в качестве аминокислоты в положении 434 и

His в качестве аминокислоты в положении 436 (все согласно EU-нумерации),

в Fc-области антитела IgG-типа.

Тот факт, что транспортирующий фрагмент обладает FcRn-связывающей активностью, не означает, что антигенсвязывающий домен не обладает FcRn-связывающей активностью. В вариантах осуществления изобретения, в которых транспортирующий фрагмент имеет более продолжительное время полужизни в крови, чем антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающий домен, как должно быть очевидно, может не обладать FcRn-связывающей активностью, или антигенсвязывающий домен может обладать FcRn-связывающей активностью, если FcRn-связывающая активность слабее, чем активность транспортирующего фрагмента.

В одном из вариантов осуществления изобретения метод удлинения времени полужизни в крови транспортирующего фрагмента включает связывание транспортирующего фрагмента с альбумином. Поскольку альбумин не поддается экскреции почками и обладает FcRn-связывающей активностью, его время полужизни в крови составляет от 17 до 19 дней (J Clin Invest. 32 (8), август 1953 г., сс. 46-768). В соответствии с указанным известно, что белок, связанный с альбумином, становится более объемным и обладает способностью опосредованно связываться с FcRn и поэтому имеет удлиненное время полужизни в крови (Antibodies 4 (3), 2015, сс. 141-156).

В одном из вариантов осуществления изобретения альтернативный метод удлинения времени полужизни в крови транспортирующего фрагмента включает ПЭГилирование транспортирующего фрагмента. Считается, что ПЭГилирование белка придает белку объем и подавляет также его расщепление протеазой в крови, тем самым удлиняя время полужизни белка в крови (J Pharm Sci. 97 (10), октябрь 2008 г., сс. 4167-4183).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент содержит Fc-область антитела. В конкретном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент содержит СН2-домен и СН3-домен человеческого антитела IgG-типа. В конкретном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент содержит фрагмент, простирающийся от Cys226 или Pro230 тяжелой цепи человеческого антитела IgG1-изотипа до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) или глицин-лизин (Gly446-Lys447) Fc-области может присутствовать или отсутствовать.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела IgG-типа. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент содержит константную область человеческого антитела IgG-типа.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент содержит: область, практически сходную по структуре с константной областью тяжелой цепи антитела; и область, практически сходную по структуре с легкой цепью антитела, соединенную с областью через ковалентную связь, такую как дисульфидная связь, или нековалентную связь, такую как водородная связь или гидрофобное взаимодействие.

В настоящем описании «полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент», как правило, представляет собой серию полипептидов, соединенных через амидную связь, или белок, содержащий множество полипептидов, соединенных через амидную связь.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен обладает способностью высвобождаться из полипептида, и антигенсвязывающий домен, высвободившийся из полипептида, имеет более высокую антигенсвязывающую активность. В настоящем описании понятие «высвобождается» относится к взаимному разделению двух фрагментов полипептида. Высвобождение антигенсвязывающего домена из полипептида может быть связано с упразднением взаимодействия между антигенсвязывающим доменом и транспортирующим фрагментом. Антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена, включенного в полипептид, ингибируется. Следовательно, тот факт, что антигенсвязывающий домен высвободился из полипептида, можно подтверждать путем измерения антигенсвязывающей активности в организме индивидуума и сравнения ее с антигенсвязывающей активностью антигенсвязывающего домена, включенного в полипептид.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид содержит сайт расщепления, и сайт расщепления расщепляется так, что антигенсвязывающий домен высвобождается из полипептида. Сайт расщепления можно расщеплять, например, ферментом, можно восстанавливать восстановителем или можно подвергать фоторазложению. Сайт расщепления можно помещать в любое положение в полипептиде, если антигенсвязывающий домен может высвобождаться и не утрачивает свою антигенсвязывающую активность после высвобождения. Полипептид может содержать также дополнительный сайт расщепления, отличный от сайт расщепления, предназначенного для высвобождения антигенсвязывающего домена. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сайт расщепления содержит расщепляемую протеазой последовательность и может расщепляться протеазой.

В настоящем описании понятие «расщепляются» относится к состоянию, в котором антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент отделяются друг от друга после изменения сайта расщепления протеазой, восстановления цистеин-цистеиновой дисульфидной связи в сайте расщепления и/или фотоактивации. В настоящем описании понятие «нерасщепленный» относится к состоянию антигенсвязывающего домена, в котором он сцеплен с транспортирующим фрагментом в отсутствии расщепления протеазой сайта расщепления, в отсутствии восстановления цистеин-цистеиновой дисульфидной связи в сайте расщепления и/или в отсутствии света.

Расщепление сайта расщепления можно определять, подвергая раствор, содержащий полипептид, имеющий сайт расщепления, ДСН-ПААГ (электрофорез в полиакриламидном геле) и измеряя молекулярные массы фрагментов или определяя изменения в молекулярной массе до и после расщепления.

Сайт расщепления может быть специфически модифицирован (расщеплен, восстановлен или расщеплен в результате воздействия света) агентом (т.е. протеазой, восстановителем или светом) со скоростью, составляющей примерно от 0,001 до 1500×10⁴ M^-1c^-1, или по меньшей мере 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250 или 1500×10⁴ M^-1c^-1.

Специфическое расщепление протеазой осуществляют путем контакта между протеазой и сайтом расщепления или молекулой, содержащей сайт расщепления. Сайт расщепления может расщепляться в присутствии достаточной ферментативной активности. Достаточная ферментативная активность может означать способность фермента осуществлять расщепление при контакте с сайтом расщепления.

В настоящем описании понятие «протеаза» относится к ферменту, такому как эндопептидаза или экзопептидаза, который гидролизует пептидную связь, как правило, эндопептидаза. Протеаза, применяемая в настоящем изобретении, ограничена только способностью расщеплять последовательность, расщепляемую протеазой, и практически не ограничена ее типом. В некоторых вариантах осуществления изобретения применяют специфическую для ткани-мишени протеазу. Специфическая для ткани-мишени протеаза может представлять собой, например, любую из следующих протеаз:

(1) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в ткани-мишени, чем в обычных тканях,

(2) протеазу, которая обладает более высокой активностью в ткани-мишени, чем в обычных тканях,

(3) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в клетках-мишенях, чем в обычных клетках, и

(4) протеазу, которая обладает более высокой активностью в клетках-мишенях, чем в обычных клетках.

В более конкретном варианте осуществления изобретения применяют специфическую для раковой ткани протеазу или специфическую для воспалительной ткани протеазу.

В настоящем описании понятие «ткань-мишень» относится к ткани, содержащей по меньшей мере одну клетку-мишень. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ткань-мишень представляет собой раковую ткань. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ткань-мишень представляет собой воспалительную ткань.

Понятие «раковая ткань» относится к ткани, содержащей по меньшей мере одну раковую клетку. Таким образом, с учетом того, что, например, раковая ткань содержит раковые клетки и кровеносные сосуды, каждый тип клеток, который принимает участие в формировании опухолевой массы, содержащей раковые клетки и эндотелиальные клетки, подпадает под объем настоящего изобретения. В настоящем описании опухолевая масса относится к очагу опухолевой ткани. Понятие «опухоль», как правило, применяют для обозначения доброкачественной неоплазмы или злокачественной неоплазмы.

В настоящем описании примеры «воспалительной ткани» включают:

суставную ткань при ревматоидном артрите или остеоартрите,

легочную (альвеолярную) ткань при бронхиальной астме или COPD,

ткань органа пищеварительной системы при воспалительном заболевании кишечника, болезни Крона или неспецифическом язвенном колите,

фиброзную ткань при фиброзе печени, почки или легкого,

ткань, образующуюся при отторжении трансплантата органа,

ткань кровеносного сосуда или сердца (сердечная мышца) при артериосклерозе или сердечной недостаточности,

висцеральную жировую ткань при метаболическом синдроме,

кожную ткань при атопическом дерматите и других дерматидах, и

ткань спинномозгового нерва при грыже диска или хроническом люмбаго.

В частности, специфически экспрессируемая или специфически активируемая протеаза или протеаза, которая рассматривается в качестве связанной с болезненным состоянием ткани-мишени (специфическая для ткани-мишени протеаза), известна для некоторых типов тканей-мишеней. Например, в публикациях международных заявок на патент WO 2013/128194, WO 2010/081173 и WO 2009/025846 описана протеаза, специфически экспрессируемая в раковой ткани. Кроме того, в J Inflamm (Lond). 7, 2010, с. 45, Nat Rev Immunol. 6 (7), июль 2006 г., сс. 541-550, Nat Rev Drug Discov. 13 (12), декабрь 2014 г., сс. 904-927, Respir Res. 17, 4 марта 2016 г., с. 23, Dis Model Mech. 7 (2), февраль 2014 г., сс. 193-203 и Biochim Biophys Acta. 1824 (1), январь 2012 г., сс. 133-145 описана протеаза, которая, как считается, связана с воспалением.

Помимо протеазы, специфически экспрессируемой в ткани-мишени, существует также протеаза, специфически активируемая в ткани-мишени. Например, протеаза может экспрессироваться в неактивной форме и затем превращаться в активную форму. Многие ткани содержат субстанцию, ингибирующую активную протеазу и контролирующую активность в результате процесса активации и присутствия ингибитора (Nat Rev Cancer. 3 (7), июль 2003 г., сс. 489-501). В ткани-мишени активная протеаза может специфически активироваться, избегая ингибирования.

Активную протеазу можно оценивать путем применения метода с использованием антитела, распознающего активную протеазу (PNAS 110 (1), 2 января 2013 г., сс. 93-98), или метода с использованием флуоресцентно меченого пептида, распознаваемого протеазой, флуоресцентность которого гасится перед расщеплением, но испускается после расщепления (Nat Rev Drug Discov. 9 (9), сентябрь 2010, сс. 690-701. doi: 10.1038/nrd3053).

Согласно одной из точек зрения понятие «специфическая для ткани-мишени протеаза» может относиться к любой из следующих протеаз:

(I) протеаза, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в ткани-мишени, чем в обычных тканях,

(II) протеаза, которая обладает более высокой активностью в ткани-мишени, чем в обычных тканях,

(III) протеаза, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в клетках-мишенях, чем в обычных клетках, и

(IV) протеаза, которая обладает более высокой активностью в клетках-мишенях, чем в обычных клетках.

Конкретные примеры протеазы включают (но, не ограничиваясь только ими) цистеиновую протеазу (включая семейства катепсина В, L, S и т.д.), аспартилпротеазу (катепсины D, Е, K, О и т.д.), сериновую протеазу (включая матриптазу (в том числе MT-SP1), катепсины А и G, тромбин, плазмин, урокиназу (uPA), тканевый активатор плазминогена (tPA), эластазу, протеиназу 3, тромбин, калликреин, триптазу и химазу), металлопротеиназу (металлопротеиназу (ММР1-28), включая как связанные с мембраной формы (ММР14-17 и ММР24-25), так и секретируемые формы (ММР1-13, ММР18-23 и ММР26-28), дизинтегрин А и металлопротеиназу (ADAM), дизинтегрин А и металлопротеиназу с мотивами тромбоспондина (ADAMTS), меприн (меприн альфа и меприн бета), CD10 (CALLA), простатический антиген (PSA), легумаин, TMPRSS3, TMPRSS4, человеческую эластазу нейтрофилов (HNE), бета секретазу (ВАСЕ), фибробласт-активирующий белок альфа (FAP), гранзим В, гуанидинобензоатазу (GB), гепсин, неприлизин, NS3/4A, HCV-NS3/4, калпаин, ADAMDEC1, ренин, катепсин С, катепсин V/L2, катепсин X/Z/P, крузипаин, отубаин 2, родственные калликреину пептидазы (KLKs (KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK10, KLK11, KLK13 и KLK14)), белок, участвующий в остеогенезе 1 (ВМР-1), активированный белок С, связанную с коагуляцией крови протеазу (фактор VIIa, фактор IXa, фактор Ха, фактор XIa и фактор XIIa), HtrA1, лактоферрин, марапсин, РАСЕ4, DESC1, дипептидилпептидазу 4 (DPP-4), TMPRSS2, катепсин F, катепсин Н, катепсин L2, катепсин О, катепсин S, гранзим А, гепсин, калпаин 2, глутаматкарбоксипептидазу 2, AMSH-подобные протеазы, AMSH, гамма секретазу, антиплазминрасщепляющий фермент (АРСЕ), децисин 1, фермент, подобный N-ацетилированной альфа-связанной кислой дипептидазе 1 (NAALADL1), и фурин.

Согласно другой точке зрения понятие «специфическая для ткани-мишени протеаза» может относиться к специфической для раковой ткани протеазе или специфической для воспалительной ткани протеазе.

Примеры специфической для раковой ткани протеазы включают протеазу, которая специфически экспрессируется в раковой ткани, описанную в публикациях международных заявок на патент WO 2013/128194, WO 2010/081173 и WO2009/025846.

Касательно типа специфической для раковой ткани протеазы обработка протеазой, которая обладает более высокой специфичностью экспрессии в раковой ткани, является более эффективной для снижения нежелательных реакций. Предпочтительная специфическая для раковой ткани протеаза имеет концентрацию в раковой ткани, превышающую по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 500 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз ее концентрацию в здоровых тканях. Кроме того, предпочтительная специфическая для раковой ткани протеаза имеет активность в раковой ткани, превышающую по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, особенно предпочтительно по меньшей мере в 500 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз ее активность в здоровых тканях.

Специфическая для раковой ткани протеаза может находиться в форме, связанной с мембраной раковой клетки, или может находиться в секретируемой внеклеточной форме, не связанной с клеточной мембраной. Когда специфическая для раковой ткани протеаза не связана с мембраной раковой клетки, то это является предпочтительным для опосредуемой иммуноцитами цитотоксичности, специфической для раковых клеток, поскольку специфическая для раковой ткани протеаза должна присутствовать в раковой ткани или в непосредственной близости от нее. В настоящем описании понятие «в непосредственной близости от раковой ткани» означает местоположение, в котором расщепляемая протеазой последовательность, специфическая для раковой ткани, расщепляется таким образом, чтобы антигенсвязывающий домен проявлял антигенсвязывающую активность. Однако предпочтительно, чтобы повреждение здоровых клеток в данном местоположении было минимизировано.

Согласно альтернативной точки зрения специфическая для раковой ткани протеаза представляет собой любую из следующих протеаз:

(I) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в раковой ткани, чем в здоровых тканях,

(II) протеазу, которая обладает более высокой активностью в раковой ткани, чем в здоровых тканях,

(III) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в раковых клетках, чем в здоровых клетках, и

(IV) протеазу, которая обладает более высокой активностью в раковых клетках, чем в здоровых клетках.

Один тип специфической для раковой ткани протеазы можно применять индивидуально или можно объединять два или большее количество типов специфических для раковой ткани протеаз. Количество типов специфической для раковой ткани протеазы могут определять соответственно специалисты в данной области с учетом типа рака, подлежащего лечению.

Исходя из указанных точек зрения, специфическая для раковой ткани протеаза предпочтительно представляет собой сериновую протеазу или металлопротеиназу, более предпочтительно матриптазу (включая MT-SP1), урокиназу (uPA) или металлопротеиназу, предпочтительно также MT-SP1, uPA, ММР2 или ММР9, из перечисленных выше протеаз.

Касательно типа специфической для воспалительной ткани протеазы обработка протеазой, которая обладает более высокой специфичностью экспрессии в воспалительной ткани, является более эффективной для снижения нежелательных реакций. Предпочтительная специфическая для воспалительной ткани протеаза имеет концентрацию в воспалительной ткани, превышающую по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 500 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз ее концентрацию в здоровых тканях. Кроме того, предпочтительная специфическая для воспалительной ткани протеаза имеет активность в воспалительной ткани, превышающую по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, особенно предпочтительно по меньшей мере в 500 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз ее активность в здоровых тканях.

Специфическая для воспалительной ткани протеаза может находиться в форме, связанной с мембраной воспалительной клетки, или может находиться в секретируемой внеклеточной форме, не связанной с клеточной мембраной. Когда специфическая для воспалительной ткани протеаза не связана с мембраной воспалительной клетки, то это является предпочтительным для опосредуемой иммуноцитами цитотоксичности, специфической для воспалительных клеток, поскольку специфическая для воспалительной ткани протеаза должна присутствовать в воспалительной ткани или в непосредственной близости от нее. В настоящем описании понятие «в непосредственной близости от воспалительной ткани» означает местоположение, в котором расщепляемая протеазой последовательность, специфическая для воспалительной ткани, расщепляется таким образом, чтобы антигенсвязывающий домен проявлял антигенсвязывающую активность. Однако предпочтительно, чтобы повреждение здоровых клеток в данном местоположении было минимизировано.

Согласно альтернативной точки зрения специфическая для воспалительной ткани протеаза представляет собой любую из следующих протеаз:

(I) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в воспалительной ткани, чем в здоровых тканях,

(II) протеазу, которая обладает более высокой активностью в воспалительной ткани, чем в здоровых тканях,

(III) протеазу которая отличается более высоким уровнем экспрессии в воспалительных клетках, чем в здоровых клетках, и

(IV) протеазу, которая обладает более высокой активностью в воспалительных клетках, чем в здоровых клетках.

Один тип специфической для воспалительной ткани протеазы можно применять индивидуально или можно объединять два или большее количество типов специфических для воспалительной ткани протеаз. Количество типов специфической для воспалительной ткани протеазы могут определять соответственно специалисты в данной области с учетом патологического состояния, подлежащего лечению.

Исходя из указанных точек зрения, специфическая для воспалительной ткани протеаза предпочтительно из перечисленных выше протеаз представляет собой металлопротеиназу. Металлопротеиназа более предпочтительно представляет собой ADAMTS5, ММР2, ММР7, ММР9 или ММР13.

Расщепляемая протеазой последовательность представляет собой конкретную аминокислотную последовательность, которая специфически распознается специфической для ткани-мишени протеазой, когда полипептид гидролизуется специфической для ткани-мишени протеазой в водном растворе.

Расщепляемая протеазой последовательность предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, которая гидролизуется с высокой специфичностью протеазой, специфической для ткани-мишени, более специфически экспресируемой в ткани-мишени или клетках-мишенях, подлежащих обработке, или более специфически активируемой в ткани/клетках-мишенях, подлежащих обработке, с точки зрения снижения нежелательных реакций.

Конкретные примеры расщепляемой протеазой последовательности включают последовательности-мишени, которые специфически гидролизуются с помощью указанной выше протеазы, специфически экспрессируемой в раковой ткани, которые описаны в публикациях международных заявок на патент WO 2013/128194, WO 2010/081173 и WO 2009/025846, специфической для воспалительной ткани протеазой и т.п. Можно применять также последовательность, искусственно измененную, например, путем соответствующей интродукции аминокислотной мутации в последовательность-мишень, которая специфически гидролизуется известной протеазой. Альтернативно этому, можно применять расщепляемую протеазой последовательность, идентифицированную с помощью метода, известного специалистам в данной области, который описан в Nature Biotechnology 19, 2001, сс. 661-667.

Кроме того, можно применять встречающуюся в естественных условиях расщепляемую протеазой последовательность. Например, TGFβ превращают в латентную форму путем расщепления протеазой. Аналогично этому, можно применять расщепляемую протеазой последовательность в белке, который изменяет молекулярную форму при расщеплении протеазой.

Примеры расщепляемой протеазой последовательности, которую можно применять, включают (но, не ограничиваясь только ими) последовательности, описанные в публикациях международных заявок на патент WO 2015/116933, WO 2015/048329, WO 2016/118629, WO 2016/179257, WO 2016/179285, WO 2016/179335, WO 2016/179003, WO 2016/046778, WO 2016/014974, в публикациях патентов США US 2016/0289324, US 2016/0311903, в PNAS 97, 2000, сс. 7754-7759, Biochemical Journal 426, 2010, сс. 219-228 и Beilstein J Nanotechnol. 7, 2016, сс. 364-373.

Расщепляемая протеазой последовательность более предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, которая специфически гидролизуется с помощью приемлемой для ткани-мишени специфической протеазы, упомянутой выше. Аминокислотная последовательность, которая специфически гидролизуется с помощью специфической для ткани-мишени протеазы, предпочтительно представляет собой любую из следующих аминокислотных последовательностей:

LSGRSDNH (SEQ ID NO: 12, расщепляемая MT-SP1 или uPA),

PLGLAG (SEQ ID NO: 25, расщепляемая MMP2 или ММР9) и

VPLSLTMG (SEQ ID NO: 26, расщепляемая MMP7).

Любую из приведенных ниже последовательностей можно применять также в качестве расщепляемой протеазой последовательности:

TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 74, расщепляемая MT-SP1 или uPA),

ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 75, расщепляемая MT-SP1 или uPA),

AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 76, расщепляемая MT-SP1 или uPA),

GAGVPMSMRGGAG (SEQ ID NO: 77, расщепляемая MMP1),

GAGIPVSLRSGAG (SEQ ID NO: 78, расщепляемая MMP2),

GPLGIAGQ (SEQ ID NO: 79, расщепляемая MMP2),

GGPLGMLSQS (SEQ ID NO: 80, расщепляемая MMP2),

PLGLWA (SEQ ID NO: 81, расщепляемая MMP2),

GAGRPFSMIMGAG (SEQ ID NO: 82, расщепляемая MMP3),

GAGVPLSLTMGAG (SEQ ID NO: 83, расщепляемая MMP7),

GAGVPLSLYSGAG (SEQ ID NO: 84, расщепляемая MMP9),

AANLRN (SEQ ID NO: 85, расщепляемая MMP11),

AQAYVK (SEQ ID NO: 86, расщепляемая MMP11),

AANYMR (SEQ ID NO: 87, расщепляемая MMP11),

AAALTR (SEQ ID NO: 88, расщепляемая MMP11),

AQNLMR (SEQ ID NO: 89, расщепляемая MMP11),

AANYTK (SEQ ID NO: 90, расщепляемая MMP11),

GAGPQGLAGQRGIVAG (SEQ ID NO: 91, расщепляемая MMP13),

PRFKIIGG (SEQ ID NO: 92, расщепляемая проурокиназой),

PRFRIIGG (SEQ ID NO: 93, расщепляемая проурокиназой),

GAGSGRSAG (SEQ ID NO: 94, расщепляемая uPA),

SGRSA (SEQ ID NO: 95, расщепляемая uPA),

GSGRSA (SEQ ID NO: 96, расщепляемая uPA),

SGKSA (SEQ ID NO: 97, расщепляемая uPA),

SGRSS (SEQ ID NO: 98, расщепляемая uPA),

SGRRA (SEQ ID NO: 99, расщепляемая uPA),

SGRNA (SEQ ID NO: 100, расщепляемая uPA),

SGRKA (SEQ ID NO: 101, расщепляемая uPA),

QRGRSA (SEQ ID NO: 102, расщепляемая tPA),

GAGSLLKSRMVPNFNAG (SEQ ID NO: 103, расщепляемая катепсином В)

TQGAAA (SEQ ID NO: 104, расщепляемая катепсином В),

GAAAAA (SEQ ID NO: 105, расщепляемая катепсином В),

GAGAAG (SEQ ID NO: 106, расщепляемая катепсином В),

AAAAAG (SEQ ID NO: 107, расщепляемая катепсином В),

LCGAAI (SEQ ID NO: 108, расщепляемая катепсином В),

FAQALG (SEQ ID NO: 109, расщепляемая катепсином В),

LLQANP (SEQ ID NO: 110, расщепляемая катепсином В),

LAAANP (SEQ ID NO: 111, расщепляемая катепсином В),

LYGAQF (SEQ ID NO: 112, расщепляемая катепсином В),

LSQAQG (SEQ ID NO: 113, расщепляемая катепсином В),

ASAASG (SEQ ID NO: 114, расщепляемая катепсином В),

FLGASL (SEQ ID NO: 115, расщепляемая катепсином В),

AYGATG (SEQ ID NO: 116, расщепляемая катепсином В),

LAQATG (SEQ ID NO: 117, расщепляемая катепсином В),

GAGSGVVIATVIVITAG (SEQ ID NO: 118, расщепляемая катепсином L),

APMAEGGG (SEQ ID NO: 119, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),

EAQGDKII (SEQ ID NO: 120, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),

LAFSDAGP (SEQ ID NO: 121, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),

YVADAPK (SEQ ID NO: 122, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),

RRRRR (SEQ ID NO: 123, расщепляемая фурином),

RRRRRR (SEQ ID NO: 124, расщепляемая фурином),

GQSSRHRRAL (SEQ ID NO: 125, расщепляемая фурином),

SSRHRRALD (SEQ ID NO: 126),

RKSSIIIRMRDVVL (SEQ ID NO: 127, расщепляемая плазминогеном),

SSSFDKGKYKKGDDA (SEQ ID NO: 128, расщепляемая стафилокиназой),

SSSFDKGKYKRGDDA (SEQ ID NO: 129, расщепляемая стафилокиназой),

IEGR (SEQ ID NO: 130, расщепляемая фактором Xa),

IDGR (SEQ ID NO: 131, расщепляемая фактором Xa),

GGSIDGR (SEQ ID NO: 132, расщепляемая фактором Xa),

GPQGIAGQ (SEQ ID NO: 133, расщепляемая коллагеназой),

GPQGLLGA (SEQ ID NO: 134, расщепляемая коллагеназой),

GIAGQ (SEQ ID NO: 135, расщепляемая коллагеназой),

GPLGIAG (SEQ ID NO: 136, расщепляемая коллагеназой),

GPEGLRVG (SEQ ID NO: 137, расщепляемая коллагеназой),

YGAGLGVV (SEQ ID NO: 138, расщепляемая коллагеназой),

AGLGVVER (SEQ ID NO: 139, расщепляемая коллагеназой),

AGLGISST (SEQ ID NO: 140, расщепляемая коллагеназой),

EPQALAMS (SEQ ID NO. 141, расщепляемая коллагеназой),

QALAMSAI (SEQ ID NO: 142, расщепляемая коллагеназой),

AAYHLVSQ (SEQ ID NO: 143, расщепляемая коллагеназой),

MDAFLESS (SEQ ID NO: 144, расщепляемая коллагеназой),

ESLPVVAV (SEQ ID NO: 145, расщепляемая коллагеназой),

SAPAVESE (SEQ ID NO: 146, расщепляемая коллагеназой),

DVAQFVLT (SEQ ID NO: 147, расщепляемая коллагеназой),

VAQFVLTE (SEQ ID NO: 148, расщепляемая коллагеназой),

AQFVLTEG (SEQ ID NO: 149, расщепляемая коллагеназой),

PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 150, расщепляемая коллагеназой),

LVPRGS (SEQ ID NO: 151, расщепляемая тромбином) и

TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 178, расщепляемая uPA или MT-SP1).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения к одному из концов или к обоим концам расщепляемой протеазой последовательности дополнительно присоединяют гибкий линкер. Гибкий линкер на одном конце расщепляемой протеазой последовательности можно обозначать как первый гибкий линкер, а гибкий линкер на другом конце можно обозначать как второй гибкий линкер. В конкретном варианте осуществления применяют одну из следующих комбинаций расщепляемой протеазой последовательности и гибкого линкера:

(расщепляемая протеазой последовательность),

(первый гибкий линкер)-(расщепляемая протеазой последовательность),

(расщепляемая протеазой последовательность)-(второй гибкий линкер), и

(первый гибкий линкер)-(расщепляемая протеазой последовательность)-(второй гибкий линкер).

Гибкий линкер, указанный в данном варианте осуществления изобретения, предпочтительно представляет собой пептидный линкер. Первый гибкий линкер и второй гибкий линкер каждый присутствует независимо и произвольно, и они представляют собой идентичные или различные гибкие линкеры, каждый из которых содержит по меньшей мере одну гибкую аминокислоту (Gly и т.д.). Гибкий линкер содержит, например, достаточное количество остатков (аминокислоты, произвольно выбранные из Arg, Ile, Gln, Glu, Cys, Tyr, Trp, Thr, Val, His, Phe, Pro, Met, Lys, Gly, Ser, Asp, Asn, Ala и т.д., прежде всего Gly, Ser, Asp, Asn и Ala, в частности, Gly и Ser, особенно предпочтительно Gly и т.д.) для расщепляемой протеазой последовательности для получения требуемой доступности протеазы.

Гибкий линкер, который можно применять на обоих концах расщепляемой протеазой последовательности, как правило, представляет собой гибкий линкер, который облегчает доступ протеазы к расщепляемой протеазой последовательности и повышает расщепляющую эффективность протеазы. Приемлемый гибкий линкер можно легко выбирать и его можно предпочтительно выбирать из линкеров различной длины, таких как имеющие длину от 1 аминокислоты (Gly и т.д.) до 20 аминокислот, от 2 аминокислот до 15 аминокислот или от 3 аминокислот до 12 аминокислот, в том числе от 4 аминокислот до 10 аминокислот, от 5 аминокислот до 9 аминокислот, от 6 аминокислот до 8 аминокислот или от 7 аминокислот до 8 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гибкий линкер представляет собой пептидный линкер, состоящий из 1-7 аминокислот.

Примеры гибкого линкера включают (но, не ограничиваясь только ими) глициновые полимеры (G)n, глицин-сериновые полимеры (включая, например, (GS)n, (GSGGS: SEQ ID NO: 27)n и (GGGS: SEQ ID NO: 28)n, в которых n обозначает целое число, равное по меньшей мере 1), глицин-аланиновые полимеры, аланин-сериновые полимеры и другие гибкие линкеры, широко применяемые в общепринятых методиках.

Среди них глициновые и глицин-сериновые полимеры заслуживают внимания в связи с тем, что эти аминокислоты являются относительно неструктурированными и способны функционировать в виде нейтральных связок между компонентами.

Примеры гибкого линкера, состоящего из глицин-серинового полимера, могут включать (но, не ограничиваясь только ими)

В настоящем описании понятие «ассоциация» может относиться, например, к состоянию, в котором две или большие количество полипептидных областей взаимодействуют друг с другом. Как правило, гидрофобная связь, водородная связь, ионная связь или т.п. образуется между требуемыми пептидными областям с формированием ассоциации (образованием ассоциата). В качестве одного из примеров обычной ассоциации, известно, что антитело, представляющее собой встречающееся в естественных условиях антитело, сохраняет спаренную структуру вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) благодаря нековалентной связи или т.п. между ними.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ингибирующий домен транспортирующего фрагмента находится в ассоциации с антигенсвязывающим доменом. Ингибирующий домен может представлять собой часть транспортирующего фрагмента или может состоять полностью из транспортирующего фрагмента. С другой точки зрения, ингибирующий домен можно определять также как фрагмент, вступающий в ассоциацию с антигенсвязывающим доменом в транспортирующем фрагменте.

В более конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен, который представляет собой однодоменное антитело, и ингибирующий домен, который представляет собой VL, VH или VHH, образуют такую же ассоциацию, как и ассоциация, присутствующая между VH антитела и VL антитела. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен, который представляет собой однодоменное антитело, и ингибирующий домен, который представляет собой VL, VH или VHH, образуют такую же ассоциацию, как и ассоциация, присутствующая между VH антитела и VL антитела, и в состоянии созданной таким образом ассоциации ингибирующий домен конформационно ингибирует связывание антигенсвязывающего домена с антигеном или конформационно изменяет антигенсвязывающий сайт антигенсвязывающего домена так, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется с помощью VL, VH или VHH. В варианте осуществления изобретения, в котором VHH применяют в качестве однодоменного антитела, считается, что связывание VHH с антигеном конформационно ингибируется с помощью ингибирующего домена, когда CDR3, основной антигенсвязывающий сайт VHH, или соседний к нему сайт присутствует на поверхности раздела ассоциации с ингибирующим доменом.

Ассоциацию антигенсвязывающего домена с ингибирующим доменом можно аннулировать, например, путем расщепления сайта расщепления. Аннулирование (упразднение) ассоциации можно применять взаимозаменяемо, например, с аннулированием состояния, в котором два или большее количество полипептидных областей взаимодействуют друг с другом. Взаимодействие между двумя или большим количеством полипептидных областей можно полностью аннулировать или взаимодействие между двумя или большим количеством полипептидных областей можно частично аннулировать.

В настоящем описании понятие «поверхность раздела», как правило, относится к границе, на которой происходит ассоциация или взаимодействие двух областей друг с другом. Аминокислотные остатки, формирующие поверхность раздела, представляют собой, как правило, один или несколько аминокислотных остатков, которые содержатся в каждой полипептидной области, подвергаемой ассоциации, и более предпочтительно представляют собой аминокислотные остатки, которые соприкасаются друг с другом при ассоциации и участвуют в образовании взаимодействия. В частности, взаимодействие включает нековалентную связь, такую как водородная связь, электростатическое взаимодействие или образование соляного мостика между аминокислотными остатками, соприкасающимися друг с другом при ассоциации.

В настоящем описании понятие «аминокислотные остатки, формирующие поверхность раздела» относится, в частности, к аминокислотным остаткам, содержащимся в полипептидных областях, образующих поверхность раздела. Например, полипептидные области, образующие поверхность раздела, означают полипептидные области, ответственные за внутримолекулярное или межмолекулярное избирательное связывание антител, лигандов, рецепторов, субстратов и т.д. Конкретные примеры таких полипептидных областей в антителах могут включать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения примеры указанных полипептидных областей могут включать антигенсвязывающий домен и ингибирующий домен.

Примеры аминокислотных остатков, формирующих поверхность раздела, включают (но, не ограничиваясь только ими) аминокислотные остатки, сближающиеся друг с другом при ассоциации. Аминокислотные остатки, сближающиеся друг с другом при ассоциации, можно выявлять, например, анализируя конформации полипептидов и изучая аминокислотные последовательности полипептидных областей, формирующих поверхность раздела при ассоциации полипептидов.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аминокислотный остаток, участвующий в ассоциации в антигенсвязывающем домене, или аминокислотный остаток, участвующий в ассоциации в ингибирующем домене, можно изменять для усиления ассоциации антигенсвязывающего домена с ингибирующим доменом. В другом конкретном варианте осуществления изобретения можно изменять аминокислотный остаток, формирующий поверхность раздела с ингибирующим доменом в антигенсвязывающем домене, или аминокислотный остаток, формирующий поверхность раздела с антигенсвязывающим доменом в ингибирующем домене. В предпочтительном варианте осуществления изобретения аминокислотный остаток, формирующий поверхность раздела, можно изменять с помощью метода интродукции мутации в аминокислотный остаток на поверхности раздела, таким образом, чтобы два или большее количество аминокислотных остатков, формирующих поверхность раздела, приобретали различные заряды. Изменение аминокислотного остатка, приводящее в различным зарядам, включает изменение положительно заряженного аминокислотного остатка на отрицательно заряженный аминокислотный остаток или незаряженный аминокислотный остаток, изменение отрицательно заряженного аминокислотного остатка на положительно заряженный аминокислотный остаток или незаряженный аминокислотный остаток, и изменение незаряженного аминокислотного остатка на положительно или отрицательно заряженный аминокислотный остаток. Указанное аминокислотное изменение осуществляют с целью усиления ассоциации, и оно не ограничено положением аминокислотного изменения или типом аминокислоты, если при этом можно достигать цели, состоящей в усилении ассоциации. Примеры изменения включают (но, не ограничиваясь только указанным) замену.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения имеет место ассоциация между VHH, служащим в качестве антигенсвязывающего домена, и VL, служащим в качестве ингибирующего домена. Аминокислотный остаток в VHH, участвующий в ассоциации с VL, можно обозначать, например, как аминокислотный остаток, формирующий поверхность раздела между VHH и VL. Примеры аминокислотного остатка в VHH, участвующего в ассоциации с VL, включают (но, не ограничиваясь только ими) аминокислотные остатки в положениях 37, 44, 45 и 47 (J. Mol. Biol. 350, 2005, сс. 112-125). Активность VHH ингибируется в результате усиления ассоциации между VHH и VL. Аналогично этому, аминокислотный остаток в VL, участвующий в ассоциации с VHH, можно обозначать, например, как аминокислотный остаток, формирующий поверхность раздела между VHH и VL.

Аминокислотный остаток в VHH, участвующий в ассоциации с VL, можно изменять для усиления ассоциации между VHH и VL. Примеры указанной аминокислотной замены включают (но, не ограничиваясь только ими) F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, L47W, T47W или/и S47W. Вместо изменения указанного остатка в VHH, можно применять VHH, в котором исходно присутствует аминокислотный остаток 37V, 44G, 45L или/и 47W.

Вместо аминокислоты в VHH можно изменять аминокислотный остаток в VL, участвующий в ассоциации с VHH, и аминокислотные изменения можно интродуцировать также и в VHH, и в VL, если при этом можно достигать цели, состоящей в усилении ассоциации между VHH и VL.

В некоторых альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения можно осуществлять ассоциацию антигенсвязывающего домена и ингибирующего домена друг с другом, используя VHH в качестве антигенсвязывающего домена и используя VH или VHH в качестве ингибирующего домена. Аминокислотный остаток, участвующий в ассоциации с VH или VHH, служащим в качестве ингибирующего домена, в VHH, служащим в качестве антигенсвязывающего домена, можно идентифицировать и изменять для усиления ассоциации антигенсвязывающего домена VHH с ингибирующим доменом VH или VHH. Кроме того, можно идентифицировать и изменять аминокислотный остаток, участвующий в ассоциации с VHH, служащим в качестве антигенсвязывающего домена, в VH или VHH, служащих в качестве ингибирующего домена.

В случае применения однодоменного антитела, отличного от VHH, в качестве антигенсвязывающего домена, аминокислотный остаток, участвующий в ассоциации, в антигенсвязывающем домене или в ингибирующем домене, можно также идентифицировать и изменять аналогично описанному выше.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент и антигенсвязывающий домен сливают через линкер. В более конкретном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент и антигенсвязывающий домен сливают через линкер, содержащий сайт расщепления. В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент и антигенсвязывающий домен сливают через линкер, полученный таким образом слитый белок содержит сайт расщепления.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент и антигенсвязывающий домен сливают без линкера. В более конкретном варианте осуществления изобретения формируют аминную связь между N-концевой аминокислотой транспортирующего фрагмента и С-концевой аминокислотой антигенсвязывающего домена, получая слитый белок. Образовавшийся слитый белок содержит сайт расщепления. В конкретном варианте осуществления изобретения от одной до нескольких N-концевых аминокислот транспортирующего фрагмента или/и от одной до нескольких С-концевых аминокислот антигенсвязывающего домена изменяют, и N-конец транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена сливают с получением сайта расщепления вблизи положения слияния. Более конкретно, сайт расщепления можно формировать, например, путем превращения четырех С-концевых аминокислот антигенсвязывающего домена в последовательность LSGR и превращения четырех N-концевых аминокислот транспортирующего фрагмента в последовательность SDNH.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сайт расщепления полипептида, содержащего транспортирующий фрагмент и антигенсвязывающий домен, содержит расщепляемую протеазой последовательность. Расщепляемую протеазой последовательность можно помещать в любое положение в полипептиде, если антигенсвязывающий домен высвобождается расщеплением протеазой и не утрачивает свою антигенсвязывающую активность после высвобождения.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент ссодержит константную область антитела, и N-конец константной области антитела и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера.

В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в константной области антитела, входящей в транспортирующий фрагмент. В этом случае расщепляемая протеазой последовательность может быть локализована в константной области антитела так, чтобы антигенсвязывающий домен высвобождался расщеплением протеазой. В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в константной области тяжелой цепи антитела, входящей в транспортирующий фрагмент, и более конкретно локализована на стороне антигенсвязывающего домена относительно аминокислотного положения 140 (EU-нумерация) в константной области тяжелой цепи антитела, предпочтительно на стороне антигенсвязывающего домена относительно аминокислотного положения 122 (EU-нумерация) в константной области тяжелой цепи антитела. В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в константной области легкой цепи антитела, входящей в транспортирующий фрагмент, и более конкретно локализована на стороне антигенсвязывающего домена относительно аминокислотного положения 130 (EU-нумерация) (нумерация положения 130 по Кэботу) в константной области легкой цепи антитела, предпочтительно на стороне антигенсвязывающего домена относительно аминокислотного положения 113 (EU-нумерация) (нумерация положения 113 по Кэботу) в константной области легкой цепи антитела.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, и С-конец однодоменного антитела и N-конец транспортирующего фрагмента слиты через линкер или без линкера.

В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в однодоменном антителе. В более конкретном варианте осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH или VHH, и расщепляемая протеазой последовательность локализована на стороне транспортирующего фрагмента относительно аминокислотного положения 35b (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела, предпочтительно на стороне транспортирующего фрагмента относительно аминокислотного положения 95 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела, более предпочтительно на стороне транспортирующего фрагмента относительно аминокислотного положения 109 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела. В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, и расщепляемая протеазой последовательность локализована на стороне транспортирующего фрагмента относительно аминокислотного положения 32 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела, предпочтительно на стороне транспортирующего фрагмента относительно аминокислотного положения 91 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела, более предпочтительно на стороне транспортирующего фрагмента относительно аминокислотного положения 104 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела, антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, и константная область антитела и однодоменное антитело слиты через линкер или без линкера. В более конкретном варианте осуществления изобретения N-конец константной области антитела и С-конец однодоменного антитела слиты через линкер или без линкера. В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения С-конец константной области антитела и N-конец однодоменного антитела слиты через линкер или без линкера.

В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в константной области антитела, входящей в транспортирующий фрагмент. В более конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована на стороне однодоменного антитела относительно аминокислотного положения 140 (EU-нумерация) в константной области тяжелой цепи антитела, предпочтительно на стороне однодоменного антитела относительно аминокислотного положения 122 (EU-нумерация) в константной области тяжелой цепи антитела. В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована на стороне антигенсвязывающего домена относительно аминокислотного положения 130 (EU-нумерация) (нумерация положения 130 по Кэботу) в константной области легкой цепи антитела, предпочтительно на стороне антигенсвязывающего домена относительно аминокислотного положения 113 (EU-нумерация) (нумерация положения 113 по Кэботу) в константной области легкой цепи антитела.

В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в однодоменном антителе. В более конкретном варианте осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH или VHH, и расщепляемая протеазой последовательность локализована на стороне константной области антитела относительно аминокислотного положения 35b (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела, предпочтительно на стороне константной области антитела относительно аминокислотного положения 95 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела, более предпочтительно на стороне константной области антитела относительно аминокислотного положения 109 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела. В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, и расщепляемая протеазой последовательность локализована на стороне константной области антитела относительно аминокислотного положения 32 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела, предпочтительно на стороне константной области антитела относительно аминокислотного положения 91 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела, более предпочтительно на стороне константной области антитела относительно аминокислотного положения 104 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела.

В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и транспортирующим фрагментом. Фраза «вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и транспортирующим фрагментом» относится к фрагменту, расположенному в прямом направлении или в обратном направлении от сайта сцепления между антигенсвязывающим доменом и транспортирующим фрагментом, и который не влияет существенно на вторичную структуру антигенсвязывающего домена.

В более конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен сцеплен с константной областью антитела, входящей в транспортирующий фрагмент, и расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела. Фраза «вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела» может относиться к положению вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью тяжелой цепи антитела или вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью легкой цепи антитела. Когда антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH или VHH, и он соединен с константной областью тяжелой цепи антитела, то фраза «вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела» может относиться к положению между аминокислотным положением 101 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела и аминокислотным положением 140 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела и может предпочтительно относиться к положению между аминокислотным положением 109 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела и аминокислотному положению 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела. Когда антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH или VHH, и оно соединено с константной областью легкой цепи антитела, то фраза «вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью легкой цепи антитела» может относиться к положению между аминокислотным положением 101 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела и аминокислотным положением 130 (EU-нумерация) (нумерация положения 130 по Кэботу) константной области легкой цепи антитела и может предпочтительно относиться к положению между аминокислотным положением 109 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела и аминокислотным положением 113 (EU-нумерация) (нумерация положения 113 по Кэботу) константной области легкой цепи антитела. Когда антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, то фраза «вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела» может относиться к положению между аминокислотным положением 96 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела и предписанным положением константной области антитела, предпочтительно между аминокислотным положением 104 (нумерация по Кэботу) однодоменного антитела и предписанным положением константной области антитела.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полипептид представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа. Примеры таких вариантов осуществления изобретения включают (но, не ограничиваясь только ими): вариант осуществления изобретения, в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела IgG-типа, однодоменное антитело, служащее в качестве антигенсвязывающего домена, занимает место VH антитела IgG-типа, и антигенсвязывающая активность ингибируется VL; вариант осуществления изобретения, в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела IgG-типа, однодоменное антитело, служащее в качестве антигенсвязывающего домена, занимает место VL антитела IgG-типа, и антигенсвязывающая активность ингибируется VH; и вариант осуществления изобретения, в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела IgG-типа, однодоменное антитело, служащее в качестве антигенсвязывающего домена, занимает место одного из VH и VL антитела IgG-типа, и дополнительное однодоменное антитело, ингибирующее антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена, занимает место другого домена антитела IgG-типа.

Понятие «молекула, подобная антителу IgG-типа», применяемое в настоящем описании, используют для обозначения молекулы, которая имеет фрагменты, практически такие же по структуре, что и константные домены или константные области в антителе IgG-типа, и фрагменты, практически такие же по структуре, что и вариабельные домены или вариабельные области в антителе IgG-типа, и которая имеет конформационное практическое сходство с антителом IgG-типа. Однако в настоящем описании «молекула, подобная антителу IgG-типа» может проявлять или может не проявлять антигенсвязывающую активность, сохраняя при этом структуры, сходные со структурами антитела IgG-типа.

Полипептид может содержать один или несколько антигенсвязывающих доменов. Один или несколько ингибирующих доменов может(гут) ингибировать антигенсвязывающую активность множества антигенсвязывающих доменов. Каждый из множества антигенсвязывающих доменов может быть ассоциирован с ингибирующим доменом. Каждый из множества антигенсвязывающих доменов может быть слит с транспортирующим фрагментом. Каждый из множества антигенсвязывающих доменов может обладать способностью высвобождаться из полипептидов. Сайт(ы) расщепления для высвобождения множества антигенсвязывающих доменов может(ут) представлять собой множество сайтов расщепления, соответствующих количеству антигенсвязывающих доменов.

Когда полипептид представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа, антигенсвязывающие домены можно создавать соответственно на фрагментах, которые соответствуют двум вариабельным областям антитела IgG-типа, как продемонстрировано на фиг. 7. Указанный вариант осуществления изобретения должен быть очевиден специалистам в данной области после ознакомления с настоящим изобретением. Антигенсвязывающие домены, включенные в оба плеча, могут иметь одинаковую антигенсвязывающую специфичность или могут отличаться по антигенсвязывающей специфичности. Указанный вариант осуществления изобретения должен быть очевиден специалистам в данной области после ознакомления с настоящим изобретением. Очевидно, что указанные варианты осуществления изобретения включены в объем настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен дополнительно сцеплен со вторым антигенсвязывающим доменом. Примеры второго антигенсвязывающего домена включают (но, не ограничиваясь только ими) однодоменные антитела, фрагменты антител, модуль, состоящий примерно из 35 аминокислот, обозначенный как А-домен, который входит в авимер (Avimer), белок клеточной мембраны, присутствующий in vivo (публикации международных заявок на патент WO 2004/044011 и WO 2005/040229), аднектин (Adnectin), содержащий 10Fn3-домен, служащий в качестве связывающего белок домена, полученного из гликопротеина фибронектина, экспрессируемого на клеточных мембранах (публикация международной заявки на патент WO 2002/032925), аффибоди (Affibody), имеющий каркас IgG-связывающего домена, состоящий из трехспирального пучка, включающего 58 аминокислот белка А (публикация международной заявки на патент WO 1995/001937), DARPin (сконструированные белки с анкириновыми повторами), которые представляют собой области, экспонируемые на молекулярной поверхности анкириновых повторов (AR), каждый из которых имеет структуру, в которой повторно уложена субъединица с изгибом, содержащая 33 аминокислотных остатка, две антипараллельной спирали и петлю (публикация международной заявки на патент WO 2002/020565), антикалины (Anticalin), которые имеют состоящие из четырех петель области, поддерживающие одну сторону центрально закрученной бочкообразной структуры, состоящей из восьми антипараллельных цепей, которые являются высоко консервативными среди молекул липокалинов, таких как липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL) (публикация международной заявки на патент WO 2003/029462), и вогнутую область, образованную структурой в виде параллельных тяжей внутри подковообразной структуры, образованной уложенными повторами, которые состоят из богатых лейцином повторяющихся (LRR) модулей вариабельного рецептора лимфоцитов (VLR), который не имеет иммуноглобулиновой структуры и применяется в системе приобретенной устойчивости у бесчелюстных позвоночных, таких как миноги или миксины (публикация международной заявки на патент WO 2008/016854). В предпочтительном варианте осуществления изобретения второй антигенсвязывающий домен имеет антигенсвязывающую специфичность, отличную от специфичности антигенсвязывающего домена. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулярная масса антигенсвязывающего домена и второго сцепленного антигенсвязывающего домена составляет 60 кДа или менее.

В некоторых более конкретных вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен представляют собой однодоменные антитела, отличающиеся по антигенсвязывающей специфичности, антигенсвязывающий домен и второй сцепленный антигенсвязывающий домен обладают способностью высвобождаться из полипептида, и антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен образуют биспецифическую антигенсвязывающую молекулу после высвобождения. Примеры такой биспецифической антигенсвязывающей молекулы включают (но не ограничиваясь только ими) биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, которая имеет антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с поверхностным антигеном клетки-мишени, и второй антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с поверхностным антигеном иммуноцита, биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, которая имеет антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, связывающийся с другими субъединицами одного и того же антигена, и биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, которая имеет антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, которые связываются с различными эпитопами одного и того же антигена. Указанная биспецифическая антигенсвязывающая молекула может обеспечивать рекрутинг иммуноцитов в окрестность клеток-мишеней, и поэтому считается, что является ценным для лечения заболевания, вызываемого клетками-мишенями.

Антигенсвязывающая активность второго антигенсвязывающего домена может ингибироваться или может не ингибироваться транспортирующим фрагментом. Второй антигенсвязывающий домен может находиться в ассоциации или может не находиться в ассоциации со структурой, являющейся частью транспортирующего фрагмента. В частности, когда антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен отличаются по антигенсвязывающей специфичности, то антигенсвязывающий домен в невысвободившемся состоянии не может проявлять антигенсвязывающую активность, что продемонстрировано, например, на фиг. 8, даже, если антигенсвязывающая активность второго антигенсвязывающего домена не ингибируется, и даже, если второй антигенсвязывающий домен не находится в ассоциации со структурой, являющейся частью транспортирующего фрагмента. Указанная биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен, сцепленный со вторым антигенсвязывающим доменом, не может проявлять функцию, состоящую в биспецифическом связывании с двумя типами антигенов.

На фиг. 8 продемонстрирована одна приведенная в качестве примера форма, в которой антигенсвязывающий домен дополнительно сцеплен со вторым антигенсвязывающим доменом.

В настоящем описании понятие «специфичность» относится к способности, с помощью которой одна из специфически связывающихся молекул не может связываться в значительной степени с молекулой, отличной от одной или нескольких молекул, которые являются ее партнерами по связыванию. Это понятие используют также, когда антигенсвязывающий домен обладает специфичностью в отношении эпитопа, входящего в конкретный антиген. Это понятие используют также, когда антигенсвязывающий домен обладает специфичностью в отношении конкретного эпитопа среди множества эпитопов, входящих в антиген. В этом контексте понятие «не связывается специфически» при определении с помощью метода, описанного в разделе, касающемся активности связывания, означает, что связывающая активность специфически связывающейся молекулы в отношении молекулы, отличной от ее партнера(ов) по связыванию, составляет 80% или менее, как правило, 50% или менее, предпочтительно 30% или менее, особенно предпочтительно 15% или менее, от ее связывающей активности в отношении молекул, которые являются ее партнером(ами) по связыванию.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции (лекарственному средству), которая содержит полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель.

Применяемое в настоящем описании понятие «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «процесс лечения») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики, либо в процессе развития клинического патологического состояния. Требуемыми действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, применяют для замедления возникновения заболевания или замедления развития заболевания.

В настоящем изобретении понятие «фармацевтическая композиция» относится, как правило, к лекарственному средству, предназначенному для лечения или предупреждения заболевания или для обследования или постановки диагноза. В настоящем изобретении понятие «фармацевтическая композиция, содержащая полипептид» можно применять взаимозаменяемо с понятием «способ лечения заболевания, включающий введение полипептида индивидууму, подлежащему лечению» и можно применять взаимозаменяемо с понятием «применение полипептида для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания». Кроме того, понятие «фармацевтическая композиция, содержащая полипептид» можно применять взаимозаменяемо с понятием «применение полипептида для лечения заболевания».

Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно приготавливать для применения методом, известным специалистам в данной области. Например, фармацевтическую композицию можно применять парентерально, например, в форме стерильного раствора или суспензии для инъекции в воде или любых других фармацевтически приемлемых жидкостях. Фармацевтическую композицию можно приготавливать, например, путем объединения соответственно полипептида с фармакологически приемлемым носителем или средой, в частности, стерильной водой или физиологическим соляным раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспендирующим агентом, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, корригентом, эксципиентом, наполнителем, антисептиком, связывающим агентом и т.д., и смешивать их с получением стандартной дозы лекарственного средства, требуемой для общепринятой фармацевтической практики. Количество действующего вещества в указанных композициях регулируют так, чтобы получать приемлемый объем в предварительно определенном диапазоне.

Стерильную композицию для инъекции можно приготавливать согласно общепринятой фармацевтической практике с использованием такого наполнителя, как дистиллированная вода, пригодная для инъекций. Примеры пригодного для инъекций водного раствора включают изотонические растворы, которые содержат физиологический соляной раствор, глюкозу или другие адъюванты (например, D-сорбит, D-маннозу, D-маннит и хлорид натрия). Водный раствор можно применять в комбинации с соответствующим солюбилизатором, например, спиртом (этанол и т.д.), многоатомным спиртом (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.д.) или неионогенным поверхностно-активным веществом (Polysorbate 80™, НСО-50 и т.д.).

Примеры масляного раствора включают кунжутное масло и соевое масло. Масляный раствор можно применять также в комбинации с бензилбензоатом и/или бензиловым спиртом в качестве солюбилизатора. Масляный раствор можно дополнять буфером (например, раствором фосфатного буфера и раствором натрий-ацетатного буфера), смягчающим агентом (например, гидрохлоридом прокаина), стабилизатором (например, бензиловым спиртом и фенолом) и антиоксидантом. Полученным раствором для инъекции, как правило, заполняют соответствующую ампулу.

Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, предпочтительно вводят парентеральным путем. Например, вводят композицию в лекарственной форме, пригодной для инъекции, трансназального, транспульмонального или чрескожного введения. Фармацевтическую композицию можно вводить системно или применять место, например, путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции или подкожной инъекции.

Метод введения можно выбирать соответственно в зависимости от возраста и симптомов у пациента. Дозу фармацевтической композиции, содержащей полипептид, можно выбирать из диапазона, составляющего, например, от 0,0001 до 1000 мг на кг веса тела на дозу. Альтернативно этому, дозу фармацевтической композиции, содержащей полипептид, можно выбирать из дозы, составляющей, например, от 0,001 до 100000 мг на пациента. Однако настоящее изобретение не обязательно ограничено указанными численными величинам. Хотя доза и метод введения варьируются в зависимости от веса тела, возраста, симптомов и т.д. пациента, специалисты в данной области могут определять соответствующую дозу и метод введения с учетом указанных обстоятельств.

Настоящее изобретение относится также к способу получения полипептида, содержащего транспортирующий фрагмент, который имеет ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен.

Один из способов получения полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, является способ, который включает: получение антигенсвязывающего домена, обладающего антигенсвязывающей активностью; сцепление антигенсвязывающего домена с транспортирующим фрагментом так, чтобы антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена ингибировалась ингибирующим доменом, с получением полипептида-предшественника; и дополнительная инсерция сайта расщепления в полипептид-предшественник или замена части полипептида-предшественника на сайт расщепления. Метод интродукции сайта расщепления может представлять собой любую инсерцию сайта расщепления и изменение части полипептида-предшественника так, чтобы сайт расщепление мог быть интродуцирован в полипептид-предшественник. Альтернативно этому, сайт изменения можно интродуцировать в полипептид-предшественник путем объединения обоих подходов. Указанный вариант осуществления изобретения должен быть очевиден специалистам в данной области после ознакомления с настоящим описанием и включен в объем настоящего изобретения.

Другой способ получения полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, представляет собой способ, который включает: получение антигенсвязывающего домена, обладающего антигенсвязывающей активность; и сцепление антигенсвязывающего домена с транспортирующим фрагментом через сайт расщепления так, чтобы антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена ингибировалась ингибирующим доменом, с получением полипептида. Когда антигенсвязывающий домен сцеплен с транспортирующим фрагментом через сайт расщепления, то сайт расщепления может представлять собой «прослойку» между антигенсвязывающим доменом и транспортирующим фрагментом, или часть антигенсвязывающего домена или/и часть транспортирующего фрагмента может быть изменена и применяться в качестве части сайта расщепления.

Способ получения полипептида, представляющего собой вариант осуществления изобретения, в котором используют однодоменное антитело в качестве антигенсвязывающего домена и используют расщепляемую протеазой последовательность в качестве сайт расщепления, будет описан ниже.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, который содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с транспортирующим фрагментом так, чтобы антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибировалась ингибирующим доменом транспортирующего фрагмента, с получением полипептида-предшественника; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в полипептид-предщественник.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, который содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с транспортирующим фрагментом так, чтобы антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибировалась ингибирующим доменом транспортирующего фрагмента, с получением полипептида-предшественника; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между однодоменным антителом и транспортирующим фрагментом.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, который содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с транспортирующим фрагментом через расщепляемую протеазой последовательность так, чтобы антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибировалась ингибирующим доменом транспортирующего фрагмента, с получением полипептида.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, который содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий дополнительно следующую стадию:

(г) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, включенного в полипептид или полипептид-предшественник, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до сцепления, и уровень указанного снижения не ограничен.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, который содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий дополнительно следующую стадию:

(д) высвобождение однодоменного антитела посредством расщепления протеазой расщепляемой протеазой последовательности и подтверждение того, что высвободившееся однодоменное антитело связывается с антигеном-мишенью.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, который представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;

(б) ассоциация однодоменного антитела, полученного на стадии (а), в качестве замены VH антитела IgG-типа с VL, или ассоциация однодоменного антитела в качестве замены VL антитела IgG-типа с VH, так, чтобы антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибировалась, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет однодоменное антитело; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, которая несет однодоменное антитело.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, который представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;

(б) ассоциация однодоменного антитела, полученного на стадии (а), в качестве замены VH антитела IgG-типа с VL, или ассоциация однодоменного антитела в качестве замены VL антитела IgG-типа с VH, так, чтобы антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибировалась, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет однодоменное антитело; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между однодоменным антителом и константной областью антитела в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, который представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью; и

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), в качестве замены VH или VL антитела IgG-типа с константной областью тяжелой цепи или с константной областью легкой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность так, чтобы антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибировалась, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы, которая несет однодоменное антитело.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, который представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий дополнительно следующую стадию:

(г) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, интродуцированного в подобную антителу IgG-типа молекулу предшественника или подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до ассоциации, и уровень указанного снижения не ограничен.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, представляющего собой подобную антителу IgG-типа молекулу, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий дополнительно следующую стадию:

(д) высвобождение однодоменного антитела посредством расщепления протеазой расщепляемой протеазой последовательности и подтверждение того, что высвободившееся однодоменное антитело связывается с антигеном-мишенью.

В случае применения VH, VL или VHH в качестве ингибирующего домена способ ингибирования антигенсвязывающей активности однодоменного антитела с помощью ингибирующего домена транспортирующего фрагмента включает способ ассоциации однодоменного антитела с VH, VL или VHH. VH, VL или VHH, который ингибирует антигенсвязывающую активность полученного однодоменного антитела, можно отбирать с помощью скрининга в отношении ассоциации известного VH, VL или VHH с однодоменным антителом и сравнения антигенсвязывающей активности однодоменного антитела до и после ассоциации.

В другом способе для ингибирования антигенсвязывающей активности однодоменного антитела с помощью конкретного VH, VL или VHH аминокислотный остаток, участвующий в ассоциации с VH, VL или VHH в однодоменном антителе, можно заменять для усиления ассоциации, или пару однодоменное антитело/ингибирующий домен, обладающую требуемым уровнем различия в антигенсвязывающей активности до и после ассоциации, можно получать также, используя однодоменное антитело, которое в исходном состоянии имеет в качестве аминокислотного остатка остаток, который может усиливать ассоциацию.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, представляющего собой подобную антителу IgG-типа молекулу, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VH антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени;

(б) ассоциация варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VL антитела или ассоциация варианта однодоменного антитела с VH антитела так, чтобы антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела ингибировалась, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, представляющего собой подобную антителу IgG-типа молекулу, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VH антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени;

(б) ассоциация варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VL антитела или ассоциация варианта однодоменного антитела с VH антитела так, чтобы антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела ингибировалась, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела; и

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между вариантом однодоменного антитела и константной областью подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, представляющего собой подобную антителу IgG-типа молекулу, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VH антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени;

(б) сцепление варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с константной областью тяжелой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность или сцепление варианта однодоменного антитела с константной областью легкой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность так, чтобы антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела ингибировалсь, с получением подобной антителу IgG-типа молекулы, которая несет вариант однодоменного антитела.

В конкретном варианте осуществления изобретения способ получения полипептида, представляющего собой подобную антителу IgG-типа молекулу, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий дополнительно следующую стадию:

(г) подтверждение того, что связывающая активность варианта однодоменного антитела, находящегося в подобной антителу IgG-типа молекуле или подобной антителу IgG-типа молекуле-предшественнике, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до ассоциации, и уровень указанного снижения не ограничен.

В конкретном варианте осуществления изобретения способ получения полипептида, представляющего собой подобную антителу IgG-типа молекулу, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий дополнительно следующую стадию:

(д) высвобождение варианта однодоменного антитела посредством расщепления протеазой расщепляемой протеазой последовательности и подтверждение того, что высвободившийся вариант однодоменного антитела связывается с антигеном-мишенью.

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотиду, который кодирует полипептид, содержащий транспортирующий фрагмент, который имеет ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен.

Полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, как правило, присутствует в (или встроен в) соответствующем векторе и им трансфектируют клетки-хозяева. Вектор не ограничен конкретным вектором, если он стабильно сохраняет встроенную нуклеиновую кислоту. Например, когда в качестве хозяина применяют Е. coli, то вектор pBluescript (производства фирмы Stratagene Corp.) или подобные векторы являются предпочтительными в качестве вектора для клонирования. Можно применять различные поступающие в продажу векторы. В случае применения вектора для получения полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, наиболее ценным является экспрессионный вектор. Экспрессионный вектор не ограничен конкретным вектором, если он сохраняет способность обеспечивать экспрессию полипептида in vitro, в Е. coli, в культивируемых клетках или организме индивидуумов. Например, предпочтительно можно применять экспрессионный вектор, такой как вектор pBEST (производства фирмы Promega Corp.) для экспрессии in vitro; вектор рЕТ (производства фирмы Invitrogen Corp.) для экспрессии в Е. coli; вектор pME18S-FL3 (GenBank, код доступа № АВ009864) для экспрессии в культуре клеток и вектор pME18S (Takebe и др., Mol. Cell Biol. 8, 1988, сс. 466-472) для экспрессии в организме индивидуумов. Встраивание ДНК, предлагаемой в настоящем изобретении, в вектор можно осуществлять общепринятым методом, например, с помощью реакции в присутствии лигазы с использованием сайтов, распознаваемых рестриктазами (Current protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel и др., изд-во Publish. John Wiley & Sons, раздел 11.4-11.11, 1987).

Клетки-хозяева не ограничены конкретными клетками и различные клетки-хозяева можно применять в зависимости от поставленной цели. Примеры клеток для экспрессии полипептида могут включать бактериальные клетки (например, Streptococcus, Staphylococcus, Е. coli, Streptomyces и Bacillus subtilis), грибные клетки (например, дрожжей и Aspergillus), клетки насекомых (например, Drosophila S2 и Spodoptera SF9), клетки животных (например, СНО, COS, HeLa, С127, 3Т3, BHK, HEK293 и клетки бычьей меланомы) и клетки растений. Трансфекцию вектором клеток-хозяев можно осуществлять с помощью метода, известного в данной области, например, метода осаждения фосфатом кальция, метода электропорации (Current protocols in Molecular Biology под ред. Ausubel и др., изд-во Publish. John Wiley & Sons, раздел 9.1-9.9, 1987), метода с использованием липофектамина (производства фирмы GIBCO-BRL/Thermo Fisher Scientific Inc.) или метода микроинъекции.

Соответствующий секреторный сигнал можно включать в представляющий интерес полипептид для того, чтобы секретировать полипептид, экспрессируемый в клетках-хозяевах, в полость эндоплазматического ретикулума, периплазматическое пространство или внеклеточное окружение. Сигнал может быть эндогенным для представляющего интерес полипептида или может представлять собой чужеродный сигнал.

Когда полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, секретируется в среду, то выделение полипептида в процессе производства осуществляют путем выделения среды. Когда полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, получают в клетках, то клетки сначала лизируют, а затем выделяют полипептид.

Метод, известный в данный области, включающий осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобных взаимодействий, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатите и хроматографию лектинов можно применять для выделения и очистки полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, из культур рекомбинантных клеток.

Примеры антигенсвязывающего домена, применяемого в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, включают однодоменное антитело. В указанных вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающую активность однодоменного антитела можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VL, ассоциации с конкретным VH или ассоциации с конкретным VHH. Настоящее изобретение относится также к способу скрининга указанного однодоменного антитела.

VL, VH или VHH, имеющий известную последовательность, например, VL, VH или VHH, имеющий последовательность, которая зарегистрирована в IMGT или базе данных Кэбота, можно применять в качестве VL, VH или VHH, который ингибирует антигенсвязывающую активность однодоменного антитела. Кроме того, можно примерять последовательность VL, VH или VHH, впервые идентифицированную в библиотеке человеческих антител или т.п. VL, VH или VHH, который ингибирует связывающую активность однодоменного антитела, можно отбирать, получая белок путем комбинации этих последовательностей и измеряя связывающую активность с помощью описанного выше метода.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно применять VL, VH или VHH, имеющий последовательность человеческой зародышевой линии, в качестве VL, VH или VHH, который ингибирует антигенсвязывающую активность однодоменного антитела. Например, в случае применения VL в качестве ингибирующего домена, можно применять VL, имеющий каркасные последовательности каппа-цепи, или VL, имеющий каркасные последовательности лямбда-цепи. Кроме того, можно применять VL, имеющий модифицированные каркасные последовательности, такие как объединенные каркасные последовательности каппа-цепи и лямбда-цепи.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VL, включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, обладающего связывающей активностью в отношении антигена-мишени;

(б) ассоциация однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VL; и

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VL на стадии (б), в отношении антигена ослабляется или утрачивается.

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до ассоциации, и уровень указанного снижения не ограничен.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VH, включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, обладающего связывающей активностью в отношении антигена-мишени;

(б) ассоциация однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VH; и

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VH на стадии (б), в отношении антигена ослабляется или утрачивается.

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до ассоциации, и уровень указанного снижения не ограничен.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VHH, включающий следующие стадии:

(а) получение однодоменного антитела, обладающего связывающей активностью в отношении антигена-мишени;

(б) ассоциация однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VHH; и

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VHH на стадии (б), в отношении антигена ослабляется или утрачивается.

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до ассоциации, и уровень указанного снижения не ограничен.

Примеры метода осуществления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VL, VH или VHH включают метод создания молекулы, имеющей последовательность однодоменного антитела в качестве замены последовательности одного из VH и VL в антителе или фрагменте антитела, который содержит и VH, и VL, таком как полное антитело, Fab, Fab' или (Fab)₂, и который экспрессирует полипептид, имеющий указанную последовательность.

Настоящее изобретение относится также к способу получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем усиления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VL, VH или VHH, усиления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VL, усиления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VH или усиления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VHH, в дополнение к скринингу однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем ассоциации с конкретным VL, ассоциации с конкретным VH или ассоциации с конкретным VHH.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем ассоциации с конкретным VL, включающий следующую стадию:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем ассоциации с конкретным VL, включающий следующие стадии:

(б) ассоциация варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VL; и

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VL, ослабляется или утрачивается.

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до ассоциации, и уровень указанного снижения не ограничен.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем ассоциации с конкретным VH, включающий следующую стадию:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VH антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем ассоциации с конкретным VH, включающий следующие стадии:

(б) ассоциация варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VH; и

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VH, ослабляется или утрачивается.

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до ассоциации, и уровень указанного снижения не ограничен.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем ассоциации с конкретным VHH, включающий следующую стадию:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VHH антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем ассоциации с конкретным VHH, включающий следующие стадии:

(б) ассоциация варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VHH; и

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VHH, ослабляется или утрачивается.

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до ассоциации, и уровень указанного снижения не ограничен.

Стадию ассоциации однодоменного антитела с конкретным VL, VH или VHH осуществляют с помощью метода создания молекулы, имеющей последовательность однодоменного антитела в качестве замены последовательности одного из VH и VL в антителе или фрагменте антитела, который содержит и VH, и VL, таком как полное антитело, Fab, Fab' или (Fab)₂, и который экспрессирует полипептид, имеющий указанную последовательность.

Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения однодоменное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, можно получать из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом.

Согласно настоящему описанию вариант «библиотеки» может представлять собой библиотеку, обеспечивающую эффективное получение однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при ассоциации с конкретным VL, VH или VHH.

В настоящем описании понятие «библиотека» относится к набору множества слитых полипептидов, имеющих различные последовательности, или нуклеиновых кислот или полинуклеотидов, кодирующих эти слитые полипептиды. Множество слитых полипептидов, находящихся в библиотеке, представляют собой слитые полипептиды, отличающиеся по последовательности друг от друга, не имеющие сигнальной последовательности.

В настоящем описании понятие «отличающиеся по последовательности друг от друга» касательно слитых полипептидов, отличающихся по последовательности друг от друга, означает, что индивидуальные слитые полипептиды в библиотеке имеют различные последовательности. Более предпочтительно, понятие означает, что фрагменты однодоменных антител в индивидуальных слитых полипептидах в библиотеке имеют различные последовательности. В частности, количество различных последовательностей в библиотеке отражает количество независимых клонов, отличающихся по последовательности, в библиотеке, и это обозначают также как «размер библиотеки». Размер библиотеки обычной фаговой дисплейной библиотеки составляет от 10⁶ до 10¹² и может быть увеличен до 10¹⁴ с помощью методики, известной в данной области, такой как метод рибосомного дисплея. Однако фактическое количество фаговых частиц для применения в селекции с помощью пэннинга фаговой библиотеки, как правило, в 10-10000 раз превышает размер библиотеки. Указанная чрезмерная кратность, которую обозначают также как «количество эквивалентов библиотеки», означает, что от 10 до 10000 индивидуальных клонов могут иметь одинаковую аминокислотную последовательность. Таким образом, понятие «отличающиеся по последовательности друг от друга» согласно настоящему изобретению означает, что индивидуальные полипептиды в библиотеке, исключая количество эквивалентов библиотеки, имеют различные последовательности, и более конкретно означает, что библиотека имеет от 10⁶ до 10¹⁴ молекул, предпочтительно от 10⁷ до 10¹² молекул полипептидов, отличающихся по последовательности друг от друга.

Понятие «множество» применительно к библиотеке, состоящей в основном из множества слитых полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, относится к набору из двух или большего типов субстанций, таких, например, как полипептид, полинуклеотидная молекула, вектор или вирус, предлагаемые в настоящем изобретении. При условии, что, например, две или большее количество субстанций отличаются друг от друга конкретным признаком, это означает, что субстанции относятся к двум или большему количеству типов. Их примеры могут включать мутантную аминокислоту, обнаруженную в конкретном аминокислотном положении в аминокислотной последовательности. Например, два или большее количество полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые имеют практически одинаковые, предпочтительно идентичные последовательности, за исключением конкретных мутантных аминокислот, экспонируемых на поверхности, в совершенно различных аминокислотных положениях, рассматриваются в качестве множества полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении. В другом примере две или большее количество молекул полинуклеотидов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые имеют практически одинаковые, предпочтительно идентичные последовательности, за исключением оснований, кодирующих конкретные мутантные аминокислоты, экспонируемые на поверхности, в совершенно различных аминокислотных положениях, рассматриваются в качестве множества молекул полинуклеотидов, предлагаемых в настоящем изобретении.

Метод пэннинга, который применяют для фаговых векторов, предпочтительно применяют также в качестве метода скрининга слитых полипептидов с применением с качестве показателя связывающей активности. Ген, кодирующий каждое однодоменное антитело, и ген, кодирующий CH1-домен или константную область легкой цепи антитела IgG-типа, можно соединять в соответствующей форме с получением слитого полипептида. Гены, кодирующие полученные таким образом слитые полипептиды, можно встраивать в фаговые векторы с получением фагов, которые экспрессируют на поверхности слитые полипептиды. После контакта фагов с требуемым антигеном фаги, связанные с антигеном, можно выделять, выделяя ДНК, кодирующие слитые полипептиды, которые имеют представляющую интерес связывающую активность. Эту операцию можно при необходимости повторять для обогащения слитыми полипептидами, которые имеют требуемую связывающую активность.

В дополнение к методу фагового дисплея методика, основанная на применении бесклеточной системы трансляции, методика презентации слитых полипептидов на поверхности клетки или вируса, методика, основанная на применении эмульсии, и т.п., известны в качестве методик получения слитых полипептидов путем пэннинга с применением библиотеки. Например, метод рибосомного дисплея, включающий формирование комплекса мРНК и транслируемого белка с участием рибосомы путем удаления стоп-кодона и т.д., метод дисплея кДНК или мРНК, включающий ковалентное связывание генной последовательности с транслируемым белком с использованием такого соединения, как пуромицин, или метод CIS-дисплея, включающий формирование комплекса гена и транслируемого белка с использованием связывающей белок нуклеиновой кислоты, можно применять в качестве методики, основанной на применении бесклеточной системы трансляции. Например, можно применять метод фагового дисплея, а также метод дисплея на Е. coli, метод дисплея на грамположительных бактериях, метод дрожжевого дисплея, метод дисплея на клетках млекопитающих или метод вирусного дисплея, в качестве методики презентации слитых полипептидов на поверхности клетки или вируса. Например, метод вирусного дисплея in vitro с использованием эмульсии, содержащей ген и связанную с трансляцией молекулу, можно применять в качестве методики, основанной на применении эмульсии. Эти методы уже известные в данной области (Nat Biotechnol. 18(12), декабрь 2000 г., сс. 1287-1292, Nucleic Acids Res. 34(19), 2006, е127, Proc Natl Acad Sci USA. 101(9), 2 марта 2004 г., сс. 2806-2810, Proc Natl Acad Sci USA. 101(25), 22 июня 2004 г., сс. 9193-9198, Protein Eng Des Sel. 21(4), апреля 2008 г., сс. 247-255, Proc Natl Acad Sci USA. 97(20), 26 сентября 2000 г., сс. 10701-10705, MAbs. 2(5), сентябрь-октябрь 2010 г., сс. 508-518, Methods Mol Biol. 911, 2012, сс. 183-198).

Партнера по ассоциации ингибирующего домена, сцепленного со вторым поддерживающим ассоциацию доменом, можно применять в способе получения представляющего интерес однодоменного антитела из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом.

В настоящем описании понятие «первый поддерживающий ассоциацию домен» и «второй поддерживающий ассоциацию домен» относится к доменам, которые могут взаимодействовать друг с другом через связь, такую как гидрофобная связь, водородная связь или ионная связь, с образованием ассоциата. Предпочтительные примеры первого поддерживающего ассоциацию домена и второго поддерживающего ассоциацию домена включают (но, не ограничиваясь только ими) константную область легкой цепи (CL) и константный домен тяжелой цепи СН1.

Первый поддерживающий ассоциацию домен и второй поддерживающий ассоциацию домен могут взаимодействовать друг с другом и образовывать ассоциацию слитого полипептида с партнером по ассоциации, вне зависимости от степени способности к ассоциации (степени сочетательности) между однодоменным антителом и ингибирующим доменом.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения предложена библиотека, содержащая множество слитых полипептидов однодоменных антител, сцепленных с константной областью легкой цепи антитела IgG-типа, в которой однодоменные антитела включают однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, и способ скрининга библиотеки в отношении однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать, или она может утрачиваться при ассоциации с конкретным VL, VH или VHH.

В конкретном варианте осуществления изобретения, который представлен на фиг. 9А(1), 9А(2), 9А(3), 9Б и 9В,

(1) слитые полипептиды однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом, экспонируют на поверхности фагов или т.п. с использованием метода дисплея, такого как фаговый дисплей.

(2) Получают партнера по ассоциации ингибирующего домена, сцепленного со вторым поддерживающим ассоциацию доменом, и осуществляют ассоциацию слитых полипептидов с партнером по ассоциации. Отбирают слитый полипептид, который не связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии слитого полипептида, ассоциированного с партнером по ассоциации.

(3) Ассоциацию однодоменного антитела в слитом полипептиде, отобранном в подпункте (2), с ингибирующим доменом в партнере по ассоциации аннулируют. Отбирают слитый полипептид, который связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в состоянии, в котором однодоменное антитело не находится в ассоциации с ингибирующим доменом.

В этом контексте, например, способ расщепления партнера по ассоциации вблизи границы между ингибирующим доменом и вторым поддерживающим ассоциацию доменом, который проиллюстрирован на фиг. 9Б, или способ расщепления слитого полипептида вблизи границы между однодоменным антителом и первым поддерживающим ассоциацию доменом, который проиллюстрирован на фиг. 9В, можно применять в качестве способа аннулирования ассоциации однодоменного антитела с ингибирующим доменом.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ, включающий, как продемонстрировано на фиг. 9Г, сравнение различия в связывающей активности однодоменного антитела в случае, когда однодоменное антитело и ингибирующий домен экспрессируют совместно, и в случае, когда однодоменное антитело экспрессируют таким образом, чтобы не имела место его совместная экспрессия с ингибирующим доменом, вместо сравнения различия в связывающей активности однодоменного антитела в случае аннулированной ассоциации и неаннулированной ассоциации однодоменного антитела с ингибирующим доменом, как продемонстрировано на фиг. 9А-9В.

Как продемонстрировано на фиг. 9Г(1), однодоменное антитело и ингибирующий домен экспрессируют совместно таким образом, чтобы происходила ассоциация. Отбирают слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии. Как продемонстрировано на фиг. 9Г(2), 9Г(2') и 9Г(2''), однодоменное антитело экспрессируют так, чтобы вместе с ним не экспрессировался ингибирующий домен. Отбирают слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в указанном состоянии. Таким образом, в результате в результате скрининга можно отбирать однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, например, VH, VL или VHH, из библиотеки, которая содержит множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. Альтернативно этому, однодоменное антитело экспрессируют так, чтобы вместе с ним не экспрессировался ингибирующий домен. Отбирают слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в указанном состоянии. Затем однодоменное антитело и ингибирующий домен экспрессируют совместно таким образом, чтобы происходила ассоциации. Отбирают полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии. С помощью этого способа можно также отбирать в результате скрининга однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, например, VH, VL или VHH, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. Альтернативно этому как продемонстрировано на фиг. 9Г(2), 9Г(2') и 9Г(2''), однодоменное антитело экспрессируют так, чтобы вместе с ним не экспрессировался ингибирующий домен (экспрессируют только однодоменное антитело; экспрессируют только слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело и первый поддерживающий ассоциацию домен; или слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело и первый поддерживающий ассоциацию домен, объединяют путем ассоциации только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом), и отбирают слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в указанном состоянии. Затем, как продемонстрировано на фиг. 9Г(1), экспрессируют совместно однодоменное антитело в отобранном слитом полипептиде и ингибирующий домен с образованием ассоциации. Отбирают слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии. В результате можно также отбирать с помощью скрининга однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, например, VH, VL или VHH, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом.

«Антигенсвязывающий активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его» может означать, например, антигенсвязывающую активность, которая снижается ниже предварительно установленного референс-уровня, когда антигенсвязывающую активность измеряют с помощью метода, указанного в настоящем описании. Аналогично этому, «антигенсвязывающий активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его» может означать, например, антигенсвязывающую активность, которая превышает предварительно установленный референс-уровень, когда антигенсвязывающую активность измеряют с помощью метода, указанного в настоящем описании. Слитый полипептид, имеющий антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, связывается сильнее с антигеном, чем слитый полипептид, имеющий антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его.

Слитый полипептид, отобранный в описанном выше подпункте (3), содержит однодоменное антитело, которое не обладает или обладает слабой антигенсвязывающей активностью в состоянии ассоциации с ингибирующим доменом и имеет (сильную) антигенсвязывающую активность в состоянии отсутствия ассоциации с ингибирующим доменом. Последовательность слитого полипептида, отобранного указанным способом, можно анализировать для дополнительного получения данных о последовательности однодоменного антитела, содержащегося в нем. Таким образом можно получать однодоменное антитело.

Для способа скрининга в отношении слитого полипептида, содержащего представляющее интерес однодоменное антитело, путем использования слитых полипептидов и партнера по ассоциации, важно сравнивать антигенсвязывающую активность однодоменного антитела в состоянии ассоциации и в состоянии отсутствия ассоциации с ингибирующим доменом. Как продемонстрировано на фиг. 9А(2') и 9А(3'), сначала подтверждают антигенсвязывающую активность экспонированных слитых полипептидов и отбирают слитый полипептид, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его. Затем осуществляют ассоциацию отобранных таким образом слитых полипептидов с партнером по ассоциации. Отбирают слитый полипептид, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его в указанном состоянии. С помощью указанного способа можно получать также слитый полипептид, содержащий представляющее интерес однодоменное антитело.

Ниже в настоящем описании представлено несколько вариантов осуществления изобретения, в которых использовали СН1-домен антитела IgG-типа в качестве первого поддерживающего ассоциацию домена и использовали CL антитела IgG-типа в качестве второго поддерживающего ассоциацию домена.

Слитый полипептид, содержащий представляющее интерес однодоменное антитело, можно подвергать скринингу, используя библиотеку, содержащую множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с СН1-доменом антитела IgG-типа.

Некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения является библиотека, содержащая множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с СН1-доменом антитела IgG-типа, где однодоменные антитела включают однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, и способ скрининга библиотеки в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при ассоциации с конкретным VL, VH или VHH.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является способ скрининга в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться при ассоциации с конкретным VL, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с СН1-доменом антитела IgG-типа. В частности, в настоящем изобретении предложен способ скрининга в отношении однодоменного антитела, включающий следующие стадии:

(а) экспонирование in vitro слитых полипептидов из библиотеки, предлагаемой в настоящем изобретении;

(б) получение партнера по ассоциации, включающего константную область легкой цепи антитела IgG-типа, слитую с конкретным VL;

(в) ассоциация слитых полипептидов, экспонированных на стадии (а), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого полипептида, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело ассоциировано с VL; и

(г) выбор из слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или выше его в состоянии, в котором содержащееся в нем однодоменное антитело не находится в ассоциации с VL.

Партнер по ассоциации, полученный на стадии (б), дополнительно содержит расщепляемую протеазой последовательность. В этом случае на стадии (г) ассоциацию однодоменного антитела с VL аннулируют обработкой протеазой, и антигенсвязывающую активность однодоменного антитела можно подтверждать в состоянии, в котором однодоменное антитело не находится в ассоциации с VL. Расщепляемая протеазой последовательность в партнере по ассоциации не ограничена ее положением, если ассоциация однодоменного антитела с VL аннулируется расщеплением. В качестве примера положения расщепляемая протеазой последовательность может быть локализована, например, вблизи границы между VL и константной областью легкой цепи антитела IgG-типа в партнере по ассоциации, предпочтительно в любом положении между аминокислотным положением 96 (нумерация по Кэботу) VL и аминокислотным положением 130 (EU-нумерация) (нумерация положения 130 по Кэботу) константной области легкой цепи антитела, более предпочтительно в любом положении между аминокислотным положением 104 (нумерация по Кэботу) VL и аминокислотным положением 113 (EU-нумерация) (нумерация положения 113 по Кэботу) константной области легкой цепи антитела.

Вместо применения партнера по ассоциации, содержащего расщепляемую протеазой последовательность, расщепляемую протеазой последовательность можно интродуцировать в слитые полипептиды в библиотеке, и слитые полипептиды можно расщеплять протеазой так, чтобы аннулировать ассоциацию однодоменного антитела с VL. Положение расщепляемой протеазой последовательности в каждом слитом полипептиде не ограничено ее положением, если ассоциация однодоменного антитела с VL аннулируется расщеплением и однодоменное антитело сохраняет свою антигенсвязывающую активность после расщепления. В качестве примера положения расщепляемая протеазой последовательность может быть локализована, например, вблизи границы между однодоменным антителом и СН1-доменом антитела IgG-типа в слитом полипептиде.

На стадии (г) полноразмерные слитые полипептиды, отобранные на стадии (в), или их фрагменты, содержащие однодоменные антитела, можно вновь экспонировать и антигенсвязывающую активность однодоменного антитела можно подтверждать в состоянии, в котором однодоменное антитело не находится в ассоциации с VL.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является способ скрининга в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться при ассоциации с конкретным VH, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с константной областью легкой цепи антитела IgG-типа. В частности, в настоящем изобретении предложен способ скрининга в отношении однодоменного антитела, включающий следующие стадии:

(а) экспонирование in vitro слитых полипептидов из библиотеки, предлагаемой в настоящем изобретении;

(б) получение партнера по ассоциации, включающего СН1-домен антитела IgG-типа, слитый с конкретным VH;

(в) ассоциация слитых полипептидов, экспонированных на стадии (а), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого полипептида, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело ассоциировано с VH; и

(г) выбор из слитых полипептидов, отобранных на стадии (в), слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или выше его в состоянии, в котором содержащееся в нем однодоменное антитело не находится в ассоциации с VH.

Партнер по ассоциации, полученный на стадии (б), дополнительно содержит расщепляемую протеазой последовательность. В этом случае на стадии (г) ассоциацию однодоменного антитела с VH аннулируют обработкой протеазой, и антигенсвязывающую активность однодоменного антитела можно подтверждать в состоянии, в котором однодоменное антитело не находится в ассоциации с VH. Расщепляемая протеазой последовательность в партнере по ассоциации не ограничена ее положением, если ассоциация однодоменного антитела с VH аннулируется расщеплением. В качестве примера положения расщепляемая протеазой последовательность может быть локализована, например, вблизи границы между VH и СН1-доменом антитела IgG-типа в партнере по ассоциации, предпочтительно в любом положении между аминокислотным положением 101 (нумерация по Кэботу) VH и аминокислотным положением 140 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела, более предпочтительно в любом положении между аминокислотным положением 109 (нумерация по Кэботу) VH и аминокислотным положением 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.

Вместо применения партнера по ассоциации, содержащего расщепляемую протеазой последовательность, расщепляемую протеазой последовательность можно интродуцировать в слитые полипептиды в библиотеке, и слитые полипептиды можно расщеплять протеазой так, чтобы аннулировать ассоциацию однодоменного антитела с VH. Положение расщепляемой протеазой последовательности в каждом слитом полипептиде не ограничено ее положением, если ассоциация однодоменного антитела с VH аннулируется расщеплением и однодоменное антитело сохраняет свою антигенсвязывающую активность после расщепления. В качестве примера положения расщепляемая протеазой последовательность может быть локализована, например, вблизи границы между однодоменным антителом и константной областью легкой цепи антитела IgG-типа в слитом полипептиде.

На стадии (г) полноразмерные слитые полипептиды, отобранные на стадии (в), или их фрагменты, содержащие однодоменные антитела, можно вновь экспонировать и антигенсвязывающую активность однодоменного антитела можно подтверждать в состоянии, в котором однодоменное антитело не находится в ассоциации с VH.

Аминокислоту, содержащуюся в каждой аминокислотной последовательности, указанной в настоящем описании, можно подвергать посттрансляционной модификации (например, модификация N-концевого глутамина в пироглутаминовую кислоту путем пироглутамилирования представляет собой модификацию, хорошо известную специалистам в данной области). Как должно быть очевидно, указанная аминокислотная последовательность, содержащая подвергнутую пост-трансляционной модификации аминокислоту, также относится к аминокислотной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении.

Специалистам в данной области должно быть очевидно, что произвольные комбинации одного или нескольких вариантов осуществления изобретения, представленных в настоящем описании, можно включать также в настоящее изобретение, если это технически не противоречит основам, известным специалистам в данной области техники.

Примеры

Ниже представлены примеры способа и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении. Должно быть очевидно, что можно осуществлять различные другие варианты в свете упомянутого выше общего описания изобретения.

Пример 1. Проблема, связанная с известным активируемым протеазой антителом

Описан способ получения антитела, которое проявляет антигенсвязывающую активность только после расщепления протеазой, которая экспрессируется в области повреждения, такой как раковая ткань или воспалительная ткань. Указанное антитело, называемое Probody, представляет собой молекулу антитела, представленную на фиг. 1, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем соединения антитела с пептидом, маскирующим антигенсвязывающий сайт антитела, через линкер, который расщепляется протеазой, экспрессируемой в области повреждения (непатентный документ 18). Маскирующий пептид отделяется от Probody в результате расщепления компонента линкера с помощью протеазы, которая экспрессируется в патологически измененной области-мишени, так, что полученная в результате молекула антитела восстанавливает свою антигенсвязывающую активность и приобретает способность связываться с антигеном в патологически измененной ткани-мишени.

Предполагается, что Probody может связываться с антигеном избирательно в патологически измененной области-мишени с помощью описанного выше механизма и поэтому имеет расширенное терапевтическое окно. Однако, поскольку расщепление антитела протеазой является необратимым в случае Probody, то существует вероятность того, что антитело, расщепленное в патологически измененной области, может возвращаться в кровь из патологически измененной области и связываться с антигеном, который экспрессируется в здоровой ткани, в результате попадания антитела в здоровые ткани через кровоток. Probody, активированное протеазой, сохраняет Fc-область, такую же как у Probody до активации и поэтому обладает длительным временем циркуляции в крови. Поэтому антитело, активированное протеазой, которая экспрессируется в патологически измененной области, может длительное время циркулировать в крови. Протеаза, даже если она характеризуется повышенным уровнем экспрессии в патологически измененной области, экспрессируется также и в здоровых тканях, и свободная протеаза, продуцируемая в патологически измененной области, может проникать в кровь (The Chinese-German Journal of Clinical Oncology т. 3, №. 2, июнь 2004 г., cc. 78-80). Таким образом, Probody может активироваться указанной свободной протеазой. Следовательно, существует вероятность того, что Probody будет активироваться в области, отличенной от патологически измененной области. Активированное таким образом Probody также циркулирует в крови в течение длительного времени. Таким образом, существует возможность того, что происходит постоянная активация Probody в патологически измененной области, в здоровых тканях и в крови, и активированное Probody, если имеет продолжительный период циркуляции в крови, накапливается в крови. Активированное Probody, накопленное в крови, может вызывать нежелательные реакции путем связывания с антигеном который экспрессируется в здоровых тканях (фиг. 2).

Антигенсвязывающая активность Probody ингибируется маскирующим пептидом, сцепленным с антителом через линкер, однако антигенсвязывающая активность не полностью ингибируется. Probody находится в равновесии между состоянием, в котором маскирующий пептид, сцепленный через линкер, связан с антигенсвязывающим сайтом, и состоянием, в котором маскирующий пептид отделен в результате диссоциации. Молекула в диссоциированном состоянии может связываться с антигеном (фиг. 3). Фактически, Probody, представляющее собой антитело к EGFR, описанное в непатентном документе 17, обладает связывающей активностью в отношении EGFR даже до расщепления протеазой линкера. Хотя антигенсвязывающая активность повышается в 30-100 раз в результате расщепления линкера протеазой, Probody, которое присутствует в высокой концентрации до активации, может вызывать нежелательные реакции при связывании с антигеном, который экспрессируется в здоровых тканях, поскольку связывающая активность Probody до активации составляет от 1/30 до 1/100 от связывающей активности активированного Probody.

В Probody применяют искусственный пептид для маскировки антигенсвязывающего сайта антитела. Искусственный пептид имеет последовательность, которая отсутствует во встречающихся в естественных условиях человеческих белках, и поэтому может обладать иммуногенностью для людей. Известно, что указанная иммуногенность снижает воздействия лекарственных средств на основе антител путем индукции антител к лекарственным средствам (Blood. 127 (13), 31 марта 2016 г., сс. 1633-1641).

Возможные антитела к Probody, представляющие собой антитела к лекарственным средствам, представляют собой антитело к лекарственному средству против комплекса антитела и маскирующего пептида (Probody до активации), антитело к лекарственному средству против антитела, отделившегося в результате диссоциации от маскирующего пептида (активированное Probody), антитело к лекарственному средству против маскирующего пептида (маскирующий пептид, отделившийся в результате диссоциации от активированного Probody) и т.п. Среди них антитело к лекарственному средству против маскирующего пептида (антитело к маскирующему пептиду) может связываться с маскирующим пептидом Probody до активации и тем самым активировать Probody без расщепления протеазой (фиг. 4). Probody, активированное антителом к маскирующему пептиду, может вызывать нежелательные реакции при связывании с антигеном, который экспрессируется в здоровых тканях.

Пример 2. Концепция, касающаяся активируемого протеазой полипептида, содержащего однодоменное антитело

Как продемонстрировано в примере 1, с технологией Probody связаны следующие проблемы:

1. Probody, активированное расщеплением протеазой, имеет длительное время циркуляции в крови

2. Даже до расщепления протеазой Probody имеет связывающую активность в отношении антигена.

3. Маскирующий пептид представляет собой искусственную нечеловеческую последовательность и может индуцировать антитело против маскирующего пептида.

При создании изобретения высказано предположение о том, что путь, который можно применять для решения указанных проблем и создания лекарственного средства на основе антитела, обладающего активностью в патологически измененной области, должен удовлетворять следующим условиям:

1. Антигенсвязывающий домен, активированный расщеплением протеазой, имеет короткое время полужизни в крови.

2. Антигенсвязывающая активность молекулы до расщепления протеазой является минимизированной.

3. Маскирующий пептид, имеющий искусственную нечеловеческую последовательность, не применяется.

При создании настоящего изобретения создана молекула, представленная на фиг. 5, в качестве одного примера полипептида, который удовлетворяет описанным выше условиям. Полипептид с антигенсвязывающим доменом, сцепленным с транспортирующим фрагментом, имеет длительное время полужизни и не связывается с антигеном, поскольку антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена заингибирована (А). Антигенсвязывающий домен высвобождается и высвободившийся таким образом антигенсвязывающий домен восстанавливает свою антигенсвязывающую активность и кроме того, имеет короткое время полужизни (Б).

Полипептид, представленный на фиг. 5, имеет различные варианты. В случае применения подобной антителу IgG-типа молекулы, полипептид можно получать с помощью способа получения, проиллюстрированного на фиг. 6. Сначала получают однодоменное антитело (например, VH или VHH), связывающееся с антигеном-мишенью (А). Полученное однодоменное антитело объединяют путем ассоциации, используя его в качестве замены одного из доменов VH и VL в антителе IgG-типа, которое имеет последовательность зародышевой линии, с одним другим доменом (VL или VH) с получением подобной антителу IgG-типа молекулы (Б). Расщепляемую протеазой последовательность интродуцируют в подобную антителу IgG-типа молекулу (В). Примеры положения, в которое осуществляют интродукцию, включают положение вблизи границы между включенным однодоменным антителом (VH или VHH) и константной областью (СН1 или CL).

Однодоменное антитело имеет антигенсвязывающую активность в индивидуальном состоянии, но утрачивает свою антигенсвязывающую активность после формирования вариабельной области с использованием VL, VH, VHH или т.п. VL или VH имеет последовательность встречающегося в естественных условиях антитела, имеющего последовательность зародышевой линии, и поэтому имеет низкий риск иммуногенности и с низкой долей вероятности может индуцировать антитело к лекарственному средству, распознающее указанный домен VL или VH. В случае формирования вариабельной области однодоменного антитела с использованием VHH, гуманизация VHH снижает риск иммуногенности и снижает вероятность индукции антитела к лекарственному средству, распознающего гуманизированный VHH. Расщепляемая протеазой последовательность, встроенная в подобную антителу IgG-типа молекулу, расщепляется протеазой таким образом, чтобы высвобождалось однодоменное антитело. Высвободившееся однодоменное антитело обладает антигенсвязывающей активностью. Подобная антителу IgG-типа молекула до расщепления структурно схожа с каноническими молекулами IgG и поэтому имеет продолжительное время циркуляции в крови, в то время как однодоменное антитело, высвободившееся в результате расщепления протеазой, имеет молекулярную массу примерно 13 кДа, у него не сохраняется Fc-область и поэтому оно быстро выводится посредством почечной экскреции. Фактически время полужизни полноразмерного IgG составляет порядка 2-3 недель (Blood. 127 (13), 31 марта 2016 г., 1633-1641), в то время как время полужизни однодоменного антитела составляет примерно 2 ч (Antibodies 4 (3), 2015, сс. 141-156). Поэтому антигенсвязывающая молекула, активированная протеазой, имеет короткое время полужизни в крови и с низкой долей вероятности может связываться с антигеном в здоровых тканях.

Когда однодоменное антитело представляет собой VL, то можно применять описанную выше концепцию, например, интродуцируя расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между VL и CL.

Пример 3. Получение активируемого протеазой полипептида с использованием VHH, связывающегося с IL6R

3-1 Получение полипептида с включенным VHH, который связывается с IL6R

Экспрессионный вектор, кодирующий конструкцию IL6R90-G1m (SEQ ID NO: 2), которая содержит IL6R90 (SEQ ID NO: 1), VHH, который обладает связывающей и нейтрализующей активностью в отношении человеческого IL6R, описанный в публикации международной заявки на патент WO 2010/115998, слитый с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3), получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.

Экспрессионные векторы, кодирующие VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3), VK2-28-k0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20-k0MT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14-lamL (SEQ ID NO: 8), VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9), k0 (SEQ ID NO: 10) и lamL (SEQ ID NO: 11) в качестве легких цепей (вариабельная область - константная область) различных подклассов, имеющих последовательность человеческой зародышевой линии, получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.

Подобные антителу IgG-типа молекулы IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 4), IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO:; 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 5), IL6R90-G1m/VL1-40-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 6), IL6R90-G1m/VL1-44-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 7), IL6R90-G1m/VL2-14-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 8), IL6R90-G1m/VL3-21-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 9), IL6R90-G1m/k0 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 10) и IL6R90-G1m/lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 11) экспрпрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

3-2 Оценка связывания с IL6R полипептида, в который включен VHH, связывающийся с человеческим IL6R

Связывающую активность IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT, IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT, IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT, IL6R90-G1m/VL1-40-lamL, IL6R90-G1m/VL1-44-lamL, IL6R90-G1m/VL2-14-lamL, IL6R90-G1m/VL3-21-lamL, IL6R90-G1m/k0 и IL6R90-G1m/lamL в отношении IL6R оценивали следующим методом.

Применяемый в качестве антигена рекомбинантный человеческий IL6R получали следующим образом: линию СНО, стабильно экспрессирующую растворимый человеческий IL-6R (ниже в настоящем описании обозначен также как hsIL-6R, IL6R или IL-6R), состоящий из аминокислотной последовательности, простирающейся от положения 1 до 357, начиная с N-конца, который описан в J. Immunol. 152, 1994, сс.4958-4968, конструировали с помощью метода, известного специалистам в данной области, культивировали и обеспечивали экспрессию hsIL-6R. hsIL-6R очищали из полученного супернатанта культуры с помощью 2 стадий, таких как хроматография на колонке Blue Сефароза 6 FF и гель-фильтрация. Фракцию, элюированную в качестве основного пика на финальной стадии, применяли в качестве конечного очищенного продукта.

Оценку связывания с hsIL-6R каждой молекулы осуществляли с помощью системы Octet НТХ (фирма Pall ForteBio Corp.). В частности, каждую молекулу связывали с биосенсором/белком А (ProA) (фирма Pall ForteBio Corp., 18-5013) и давали hsIL-6R взаимодействовать с ней, после чего оценивали связывание при 30°С. Сенсограммы, на которых продемонстрированы ответы, характеризующие связывание в реальном времени, полученные с помощью Octet НТХ, представлены на фиг. 10. Установлено, что IL6R90-G1m/k0 и IL6R90-G1m/lamL, у которых отсутствовал VL, связывались с hsIL-6R, в то время как IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT, IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT, IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT, IL6R90-G1m/VL1-40-lamL, IL6R90-G1m/VL1-44-lamL и IL6R90-G1m/VL2-14-lamL содержащие вариабельную область, сформированную с использованием VL, не обладали способностью связываться с hsIL-6R. Исходя из этого, установлено, что VHH, обладающий связывающей активностью в отношении человеческого IL6R, может утрачивать свою IL6R-связывающую активность при формировании вариабельной области посредством ассоциации с VL.

3-3 Интродукция расщепляемой протеазой последовательности в полипептид с включенным VHH, связывающимся с IL6R

Проводили исследование, в котором осуществляли инсерцию расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между IL6R90 VHH антитела к человеческому IL6R и СН1. Создавали шесть типов тяжелых цепей, которые продемонстрированы на фиг. 11, при этом последовательность пептида A (SEQ ID NO: 12), описанную последовательность, расщепляемую специфически экспрессируемой при раке урокиназой (uPA) и MT-SP1, встраивали в 3 сайта вблизи границы между IL6R90 и СН1 с помощью глицин-серинового линкера или без него. Экспрессионные векторы, кодирующие IL6R90H1001 (SEQ ID NO: 13), IL6R90H1002 (SEQ ID NO: 14), IL6R90H1003 (SEQ ID NO: 15), IL6R90H1004 (SEQ ID NO: 16), IL6R90H1005 (SEQ ID NO: 17) и IL6R90H1006 (SEQ ID NO: 18), получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.

Подобные антителу IgG-типа молекулы IL6R90H1001/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 13, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1002/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 14, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1003/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 15, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1004/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 16, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1005/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 17, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) и IL6R90H1006/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 18, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием указанных тяжелых цепей и VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3) в качестве легкой цепи, применяя клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.), с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

3-4 Активация полипептида, несущего расщепляемую протеазой последовательность, с помощью расщепления протеазой

Проверяли, будет ли происходить высвобождение VHH конструкциями IL6R90H1001/VK1-39-k0MT, IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1003/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT и IL6R90H1006/VK1-39-k0MT, обладающими связывающей активностью в отношении IL6R, при расщеплении протеазой.

Растворимый человеческий IL6R получали с помощью метода, известного специалистам в данной области. Полученный растворимый человеческий IL6R биотинилировали с помощью метода, известного специалистам в данной области.

Для присоединения биотина к С-концу растворимого человеческого IL-6R (который обозначают также как hsIL-6R или растворимый человеческий IL6R; SEQ ID NO: 35) генный фрагмент, кодирующий конкретную последовательность (последовательность AviTag (Avi-метка); SEQ ID NO: 36), подлежащую биотинилированию с помощью биотинлигазы, связывали через генной фрагмент, кодирующий линкер, в прямом направлении относительно генного фрагмента, кодирующего hsIL-6R. Генный фрагмент, кодирующий белок, который содержит hsIL-6R, сцепленный с последовательностью Avi-метки (hsIL-6R-Avitag; SEQ ID NO: 37), встраивали в вектор для экспрессии в клетках животных. Сконструированным плазмидным вектором трансфектировали клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.), используя 293Fectin (фирма Invitrogen Corp.). При осуществлении этой операции клетки совместно трансфектировали геном для экспрессии EBNA1 (SEQ ID NO: 57) и геном для экспрессии биотинлигазы (BirA; SEQ ID NO: 58), и к ним дополнительно добавляли биотин для мечения с помощью биотина hsIL-6R-Avitag. Клетки, трансфектированные с использованием описанных выше процедур, культивировали при 37°С в атмосфере с 8% СО₂ и представляющий интерес белок (hsIL-6R-BAP1) секретировался в супернатант культуры. Раствор указанной клеточной культуры фильтровали, используя емкость с 0,22-микрометровым верхним фильтром, для получения супернатанта культуры.

Антитело к человеческому IL-6R иммобилизовывали на HiTrap NHS-активированной HP (фирма GE Healthcare Japan Corp.) согласно протоколу производителя для получения колонки (колонка с антителом к человеческому IL-6R). Супернатант культуры вносили на колонку с антителом к человеческому IL-6R, уравновешенную TBS, с последующей элюцией связанного hsIL-6R с помощью 2М аргинина (рН 4,0). Затем элюат из колонки с антителом к человеческому IL-6R разводили TBS и затем вносили на авидиновую колонку SoftLink (фирма Promega Corp.), уравновешенную TBS, с последующей элюцией hsIL-6R-BAP1 с помощью 5 мМ биотина, 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и 2М аргинина (рН 4,0). Из этого элюата удаляли агрегаты hsIL-6R-BAP1 с помощью гель-фильтрации, используя Супердекс 200 (фирма GE Healthcare Japan Corp.) для получения очищенного hsIL-6R-BAP1, осуществляя замену буфера на D-ЗФР и 0,05% CHAPS.

В качестве протеазы использовали рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). 12,5 нМ протеазу и 100 мкг/мл каждой подобной антителу IgG-типа молекулы инкубировали в ЗФР при 37°С в течение 20 ч. Затем расщепление протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 12. В результате для конструкций IL6R90H1002/VK1-3 9-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT и IL6R90H1006/VK1-39-k0MT подтверждено расщепление протеазой расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью тяжелой цепи.

Затем осуществляли оценку связывания IL6R VHH, высвободившимся после обработки протеазой, с использованием Octet НТХ (фирма Pall ForteBio Corp.). В частности, hsIL-6R-BAP1 связывали со стрептавидиновым сенсором (фирма Pall ForteBio Corp., 18-5021) и каждой расщепленной подобной антителу IgG-типа молекуле давали взаимодействовать с ним, после чего оценивали связывание при 30°С. Сенсограммы, на которых продемонстрированы ответы, характеризующие связывание в реальном времени, полученные с помощью Octet НТХ, представлены на фиг.13. В результате связывание было подтверждено для IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT и IL6R90H1006/VK1-39-k0MT. Для IL6R90-G1m/k0 и IL6R90-G1m/lamL установлено двухвалентное связывание, для оценки которого использовали авидность, в то время как связывание высвободившегося VHH оценивали на основе аффинности. Таким образом, для обработанных протеазой IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT и IL6R90H1006/VK1-39-k0MT характерна более высокая скорость диссоциации от IL6R, чем для IL6R90-G1m/k0 и IL6R90-G1m/lamL. Кроме того, VHH имел меньшую молекулярную массу по сравнению с IL6R90-G1m/k0 и IL6R90-G1m/lamL. Поэтому его ответ в виде уровня связывания был более низким.

Эти результаты продемонстрировали, что IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT или IL6R90H1006/VK1-39-k0MT не обладали связывающей активностью в отношении IL6R, в отличие от варианта, в котором последовательность пептида А, встроенная вблизи границы между VHH и константной областью тяжелой цепи, расщеплялась при обработке протеазой, в результате чего VHH-домен высвобождался, и высвободившейся VHH мог связываться с IL6R. Исходя из указанного, можно заключить, что фактически удалось получить молекулу, подтверждающую концепцию, описанную в примере 2.

Пример 4. Получение активируемого протеазой полипептида путем изменения с использованием VHH, связывающегося с IL6R

4-1 Оценка связывания с IL6R полипептида с включенным VHH, который связывается с IL6R

Получали экспрессионный вектор, кодирующий конструкцию 20A11-G1m (SEQ ID NO: 38), которая содержит 20А11 (SEQ ID NO: 19), VHH, который обладает связывающей и нейтрализующей активностью в отношении IL6R, описанный в публикации международной заявки на патент WO 2010/115998, слитый с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3), аналогично методу, описанному в примере 3, с использованием методики, известной специалистам в данной области.

Полипептиды 20А11-G1m/VK1-39-k0MT, 20А11-G1m/VK2-28-k0MT, 20А11-G1m/VK3-20-k0MT, 20А11-G1m/VL1-40-lamL, 20А11-G1m/VL1-44-lamL, 20A11-G1m/VL2-14-lamL и 20А11-G1m/VL3-21-lamL экспрессировали и очищали аналогично методу, описанному в примере 3, используя указанную тяжелую цепь и конструкции VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3), VK2-28-k0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20-k0MT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14-lamL (SEQ ID NO: 8) и VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9) в качестве легких цепей.

Оценивали полученные конструкции 20А11-G1m/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), 20А11-G1m/VK2-28-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 4), 20A11-G1m/VK3-20-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 5), 20A11-G1m/VL1-40-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 6), 20A11-G1m/VL1-44-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 7), 20A11-G1m/VL2-14-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 8) и 20A11-G1m/VL3-21-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 9) в отношении их связывания с IL6R аналогично методу, описанному в примере 3. Результаты представлены на фиг. 14. В результате установлено, что ни одна из легких цепей, примененных в этом примере, не ингибировала IL6R-связывающую активность 20А11 при ассоциации с тяжелой цепью, содержащей 20А11, слитый с константной областью IgG1 человеческой зародышевой линии (СН1-шарнир-СН2-СН3).

Это, вероятно, является следствием того, что 20А11 не образовывал стабильную вариабельную область с VL, применяемыми в этом примере.

4-2 Интродукция аминокислотного изменения в сайт поверхности раздела между VHH и VL в полипептиде с включенным VHH, у которого не утрачена антигенсвязывающая способность

Для формирования стабильной вариабельной области между 20А11 и VL интродуцировали мутации в аминокислоты, присутствующие на поверхности раздела между 20А11 и VL. Получали экспрессионный вектор, кодирующий конструкцию 20A11hu-G1m (SEQ ID NO: 39), содержащую 20A11hu (получен из 20А11 путем интродукции мутаций, приводящих к замене F в положении 37 на V (F37V), R в положении 45 на L и G в положении 47 на W (вся нумерация по Кэботу)) (SEQ ID NO: 20), слитый с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3), аналогично методу, описанному в примере 3, с помощью методики, известной специалистам в данной области.

Полипептиды 20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), 20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 4), 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 5), 20A11hu-G1m/VL1-40-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 6), 20A11hu-G1m/VL1-44-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 7), 20A11hu-G1m/VL2-14-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 8) и 20A11hu-G1m/VL3-21-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 9) экспрессировали и очищали аналогично методу, описанному в примере 3, используя указанную тяжелую цепь и VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3), VK2-28-k0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20-k0MT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14-lamL (SEQ ID NO: 8) и VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9) в качестве легких цепей.

4-3 Оценка связывания с IL6R полипептида с включенным VHH, который содержит аминокислотное изменение в сайте поверхности раздела между VHH и VL

Полученные конструкции 20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT, 20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT, 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT, 20A11hu-G1m/VL1-40-lamL, 20A11hu-G1m/VL1-44-lamL, 20A11hu-G1m/VL2-14-lamL и 20A11hu-G1m/VL3-21-lamL оценивали в отношении их связывания с IL6R при 30°С или 25°С, аналогично методу, описанному в примере 3. Результаты представлены на фиг. 15.

В результате установлено, что 20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT, 20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT, 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT, 20A11hu-G1m/VL1-40-lamL, 20A11hu-G1m/VL1-44-lamL и 20A11hu-G1m/VL2-14-lamL не обладали способностью связываться с IL6R.

Указанные результаты продемонстрировали, что VHH 20А11, который не утратил свою IL6R-связывающую активность при ассоциации с VL, применяемым в примере 3, может формировать стабильную вариабельную область с VL и может утрачивать свою IL6R-связывающую активность путем изменения аминокислот, присутствующих в сайте поверхности раздела между VHH и VL на 37V, 45L и 47W (нумерация по Кэботу) и, изменяясь тем самым с 20А11 на 20A11hu.

4-4 Интродукция расщепляемой протеазой последовательности в полипептид с включенным VHH, который содержит аминокислотное изменение в сайте поверхности раздела между VHH и VL

Тяжелые цепи 20A11huH1001 (SEQ ID NO: 40), 20A11huH1002 (SEQ ID NO: 41), 20A11huH1004 (SEQ ID NO: 42) и 20A11huH1006 (SEQ ID NO: 43) получали аналогично методу, описанному в примере 3, встраивая расщепляемую протеазой последовательность (SEQ ID NO: 12) или расщепляемую протеазой последовательность, сцепленную с гибким линкером (SEQ ID NO: 44), вблизи границы между 20A11hu и СН1.

Полипептиды 20A11huH1001/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 40, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), 20A11huH1002/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 41, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), 20A11huH1004/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 42, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) и 20A11huH1006/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 43, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) экспрессировали и очищали аналогично методу, описанному в примере 3, применяя эти тяжелые цепи и VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3) в качестве легкой цепи.

4-5 Активация полипептида, несущего расщепляемую протеазой последовательность, путем расщепления протеазой

20A11huH1001/VK1-39-k0MT, 20A11huH1002/VK1-39-k0MT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT и 20A11huH1006/VK1-39-k0MT расщепляли протеазой аналогично методу, описанному в примере 3, и уровень расщепления оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 16.

В результате подтверждено, что 20A11huH1002/VK1-39-k0MT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT и 20A11huH1006/VK1-39-k0MT подвергались расщеплению протеазой вблизи границы между VHH и СН1.

Затем оценку связывания с IL6R VHH, высвободившегося в результате обработки протеазой, проводили при 30°С или 25°С аналогично методу, описанному в примере 3. Полученные с помощью Octet сенсограммы представлены на фиг. 17.

В результате связывание с IL6R продемонстрировано для 20A11huH1002/VK1-39-k0MT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT и 20A11huH1006/VK1-39-k0MT, для которых подтверждено расщепление вблизи границы между VHH и СН1 при обработке протеазой.

Эти результаты продемонстрировали, что, даже, если VHH, включенный в полипептид, не утрачивает свою антигенсвязывающую активность немедленно после ассоциации с конкретным VL, антигенсвязывающая активность может утрачиваться путем интродукции усиливающей ассоциацию мутации в аминокислоту, присутствующую на поверхности раздела между VHH и VL.

Исходя из указанных результатов, можно заключить, что молекулу, удовлетворяющую концепции, которая описана в примере 2, можно получать также методом объединения легкой цепи с VHH, который содержит замененную аминокислоту, участвующую в ассоциации с легкой цепью, в дополнение к методу объединения легкой цепи с VHH, получение которого описано выше в примере 3.

Пример 5. Создание активируемого протеазой полипептида с использованием VHH, полученного из иммунизированных альпак

5-1 Получение VHH из иммунизированных альпак

Альпак иммунизировали IL6R, CD3 или плексином А1 с помощью метода, известного специалистам в данной области. Через 4 и 8 недель собирали РВМС. Из собранных РВМС ген VHH амплифицировали аналогично методу, описанному в J. Immunol. Methods 324, 2007, с. 13. Амплифицированный фрагмент гена VHH соединяли с геном 3 и встраивали в фагмидный вектор. Фагмидным вектором, имеющим вставку в виде VHH-фрагмента, трансфектировали Е. coli с помощью метода электропорации, и фаги, презентирующие VHH, получали методом, уже известным специалистам в данной области. Полученные фаги оценивали в отношении их связывания с IL6R, CD3 или плексином А1 с помощью ELISA. Последовательность связанного клона анализировали с помощью метода, известного специалистам в данной области для идентификации VHH, связывающегося с антигеном.

5-2 Увеличение количества (обогащение) VHH, связывающегося с CD3

VHH, связывающийся с человеческим CD3, идентифицировали из библиотеки VHH, конструирование которой описано в примере 5-1. Клоны VHH, обладающие способностью связываться с человеческим CD3, обогащали, используя меченный биотином белок, содержащий s-цепь человеческого CD3 (CD3ε) и δ-цепь человеческого CD3 (CD3δ), сцепленные с константной областью человеческого антитела (человеческий CD3ed-Fc), в качестве антигена. Человеческий CD3ed-Fc получали следующими образом: экспрессионным вектором для клеток животных, имеющим ген, который кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59, ген, который кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60, и ген, который кодирует BirA (SEQ ID NO: 58), трансфектировали клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.). После трансфекции к ним добавляли L-биотин и биотинилирование осуществляли в культуральном растворе. Клетки культивировали в виде встряхиваемой культуры при 37°С согласно протоколу. Через 4-5 дней собирали супернатант. Из супернатанта получали белок, слитый с константной областью антитела, с помощью колонки с белком A (Eshmuno А (фирма Merck KGaA)). Для дополнительного получения только гетеродимера CD3εδ фракцию гетеродимера CD3εδ, слитого с константной областью антитела (обозначенную как CD3ed-Fc), отделяли с помощью колонки с антителом к FLAG М2. Затем осуществляли гель-фильтрацию (Супердекс 200, фирма GE Healthcare Japan Corp.) с получением представляющей интерес фракции гетеродимера CD3εδ (обозначен как человеческий CD3ed-Fc).

Производство фага осуществляли из Е. coli, сохраняя сконструированные фагмиды для фагового дисплея. Популяцию фага осаждали, добавляя 2,5М NaCl/10% ПЭГ к культуральному раствору Е. coli после производства фага, а затем разводили TBS с получением раствора, содержащего фагововую библиотеку. Затем добавляли БСА в раствор, содержащий фаговую библиотеку, с получением конечной концентрация БСА 4%. Пэннинг осуществляли согласно принятому методу пэннинга, используя антиген, иммобилизованный на магнитных гранулах (J. Immunol. Methods. 332 (1-2), 2008, сс. 2-9; J. Immunol. Methods. 247 (1-2), 2001, сс. 191-203; Biotechnol. Prog. 18 (2), 2002, cc. 212-220; и Mol. Cell Proteomics 2 (2), 2003, cc. 61-69). Применяемые магнитные гранулы представляли собой покрытые нейтравидином (NeutrAvidin) гранулы (FG bead NeutrAvidin) или покрытые стрептавидином гранулы (Dynabeads MyOne Streptavidin T1).

В частности, 100 пмолей меченного биотином антигена добавляли в полученный раствор фаговой библиотеки, и раствор фаговой библиотеки приводили в контакт с антигеном при комнатной температуре в течение 60 мин. К ним добавляли магнитные гранулы, блокированные БСА, и комплексам антигена и фагов давали связываться с магнитными гранулами при комнатной температуре в течение 15 мин. Гранулы промывали дважды 0,5 мл TBST (TBS, содержащий 0,1% Твин 20; TBS производства фирмы Takara Bio Inc.) и затем дополнительно промывали однократно 0,5 мл TBS. Затем к ним добавляли 0,5 мл трипсина в концентрации 1 мг/мл и гранулы суспендировали при комнатной температуре в течение 15 мин и после этого немедленно разделяли, используя магнитный стенд для выделения раствора фагов. Восстановленный раствора фагов добавляли к 20 мл линии Е. coli ER2738 на экспоненциальной стадии роста (ОП₆₀₀: 0,4-0,5). Е. coli культивировали при слабом перемешивании при 37°С в течение 1 ч, осуществляя тем самым заражение фагами. Зараженными Е. coli инокулировали планшет размером 225 мм × 225 мм. Затем фаги выделяли из культурального раствора инокулированных Е. coli с получением раствора фаговой библиотеки. Указанный цикл, называемый пэннингом, повторяли дважды. Во втором цикле пэннинга гранулы промывали три раза TBST и затем дважды TBS. Кроме того, в случае пэннинга в отношении человеческого CD3ed-Fc добавляли 4 нмоля человеческой Fc-области.

5-3 Получение активируемой протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы с включенным VHH, который связывается CD3

Нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность VHH (таблица 1) каждого связывающегося с человеческим CD3 клона, полученного согласно методу, описанному в примере 5-1 или 5-2, соединяли с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сайт расщепления протеазой и константную область, с помощью метода, описанного в примере 3, и встраивали в экспрессионный вектор для клеток животных. Полученный продукт применяли в качестве тяжелой цепи подобной антителу IgG-типа молекуле.

Активируемые протеазой подобные антителу IgG-типа молекулы, которые представлены ниже в таблице 2, экспрессировали путем кратковременной экспрессии, используя клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.), с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

5-4 Активация активируемой протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы путем расщепления протеазой

Подобные антителу IgG-типа молекулы, полученные согласно методу, описанному в примере 5-3, расщепляли протеазой аналогично методу, описанному в примере 3, и уровень расщепления оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 18. Концентрацию протеазы доводили до 25 нМ, и в этом анализе применяли Octet RED (фирма Pall ForteBio Corp.).

В результате подтверждено, что подобные антителу IgG-типа молекулы подвергались расщеплению протеазой в расщепляемой протеазой последовательности.

Затем осуществляли оценку CD3-связывающей способности VHH, высвободившегося в результате обработки протеазой, аналогично методу, описанному в примере 3. Полученные с помощью Octet сенсограммы представлены на фиг. 19.

В результате установлено, что подобные антителу IgG-типа молекулы bC3edL1R1N160H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT, bC3edL1R1N161H01-G1MISHI01/VK1-39-k0MT и bC3edL1R1N164H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT не обладали способностью связывать антиген до обработки протеазой, при этом их способность связывать антиген подтверждена после обработки протеазой. Множество молекул VHH, связывающихся с CD3, полученных таким же образом, что и VHH, представленные в таблице 1, применяли также для получения подобной антителу IgG-типа молекулы, содержащей такой же сайт расщепления протеазой, что и подобные антителу IgG-типа молекулы, представленные в таблице 2. В результате способность связывать антиген была подтверждена после обработки протеазой. Эти результаты продемонстрировали, что помимо полипептидов, описанных в примерах 3 и 4, подобная антителу IgG-типа молекула, несущая расщепляемую протеазой последовательность, может подвергаться расщеплению в расщепляемой протеазой последовательности при обработке протеазой и тем самым высвобождать антигенсвязывающий домен, а высвободившейся антигенсвязывающий домен может связываться с антигеном.

Пример 6. Полипептид, несущий расщепляемую протеазой последовательность в легкой цепи

Легкие цепи VK1-39P-2-Pk0MT (SEQ ID NO: 67), VK1-39P-1-Pk0MT (SEQ ID NO: 68), VK1-39P-Pk0MT (SEQ ID NO: 69), VK1-39P+2-Pk0MT (SEQ ID NO: 70), VK1-39P+3-Pk0MT (SEQ ID NO: 71), VK1-39P+4-Pk0MT (SEQ ID NO: 72) и VK1-39P+5-Pk0MT (SEQ ID NO: 73), несущие расщепляемую протеазой последовательность в любом положении, получали аналогично методу, описанному в примере 3.

Подобные антителу IgG-типа молекулы экспрессировали и очищали аналогично методу, описанному в примере 3, используя указанные легкие цепи и IL6R90-G1m (SEQ ID NO: 2) в качестве тяжелой цепи. Концентрацию протеазы доводили до 25 нМ. IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) применяли в качестве подобной антителу IgG-типа молекулы, не имеющей расщепляемой последовательности.

Затем полученные подобные антителу IgG-типа молекулы расщепляли протеазой аналогично методу, описанному в примере 3, и уровень расщепления оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 20. В результате подтверждено, что VK1-39P+2-Pk0MT (SEQ ID NO: 70), VK1-39P+3-Pk0MT (SEQ ID NO: 71), VK1-39P+4-Pk0MT (SEQ ID NO: 72) и VK1-39P+5-Pk0MT (SEQ ID NO: 73) подвергались расщеплению протеазой в расщепляемой протеазой последовательности. Дополнительно проводили оценку способности связывать IL6R для VHH, обработанного протеазой, аналогично методу, описанному в примере 3. Полученные с помощью Octet сенсограммы представлены на фиг. 21. В результате связывание подтверждено также при обработке протеазой, когда расщепляемую последовательность интродуцировали в легкую цепь, демонстрируя, что активируемый протеазой полипептид, несущий расщепляемую протеазой последовательность в его легкой цепи, можно получать так, чтобы антигенсвязывающий домен экспонировался, проявляя антигенсвязывающую способность при расщеплении протеазой легкой цепи.

Пример 7. Библиотека, содержащая тяжелую цепь, которая имеет антигенсвязывающий домен, и легкую цепь, несущую расщепляемую протеазой последовательность, и получение активируемого протеазой полипептида методом фагового дисплея с использованием библиотеки

Как установлено в примере 6, даже, когда расщепляемую протеазой последовательность интродуцировали в легкую цепь активируемого протеазой полипептида, антигенсвязывающий домен экспонировался после расщепления легкой цепи, связываясь с антигеном.

Соответственно тяжелую цепь, содержащую антигенсвязывающий домен, такой как однодоменное антитело, легкую цепь, несущую расщепляемую протеазой последовательность, включали в фагмиду и презентовали с помощью фага. Конструировали множество фагмид для фагового дисплея, содержащих различные типы антигенсвязывающих доменов, с последующим получением фагов из Е. coli, в которых сохранялись эти фагмиды. Популяцию фага осаждали, добавляя 2,5М NaCl/10% ПЭГ к культуральному раствору Е. coli после производства фага, а затем разводили TBS с получением раствора фаговой библиотеки. Затем добавляли БСА в раствор фаговой библиотеки с получением конечной концентрация БСА 4%.

Таким образом получали активируемый протеазой полипептид путем пэннинга из созданной фаговой библиотеки. Пэннинг осуществляли согласно принятому метода пэннинга, используя антиген, иммобилизованный на магнитных гранулах (J. Immunol. Methods. 332 (1-2), 2008, сс. 2-9; J. Immunol. Methods. 247 (1-2), 2001, сс. 191-203; Biotechnol. Prog. 18 (2), 2002, cc. 212-220; и Mol. Cell Proteomics 2 (2), 2003, cc. 61-69). Фаги, несвязанные с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами, извлекали до добавления протеазы, а фаги, связанные с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами, извлекали после добавления протеазы. Применяемые магнитные гранулы представляли собой покрытые нейтравидином гранулы (Sera-Mag SpeedBead NeutrAvidin-coated FG bead NeutrAvidin) или покрытые стрептавидином гранулы (Dynabeads М-280 Streptavidin). Антигенсвязывающий клон можно отбирать из извлеченных фагов с помощью ELISA для фагов, который описан в предыдущем разделе, или можно ген антитела субклонировать в векторе для экспрессии в животных и экспрессировать с использованием клеток животных и связывающую активность сравнивать до и после обработки протеазой для селекции связывающего клона.

Пример 8. Библиотека, содержащая тяжелую цепь, которая имеет антигенсвязывающий домен, и легкую цепь, и получение тяжелой цепи, антигенсвязывающая способность которой контролируется легкой цепью, методом фагового дисплея из библиотеки

Как установлено в примере 3, антигенсвязывающая способность тяжелой цепи, содержащей антигенсвязывающий домен, контролируется путем ассоциации с легкой цепью. Таким образом, методом фагового дисплея получали тяжелую цепь, которая утрачивала свою антигенсвязывающую способность при ассоциации с легкой цепью и проявляла антигенсвязывающую способность при презентации индивидуально или в комбинации с константной областью легкой цепи.

Тяжелую цепь, содержащую антигенсвязывающий домен, такой как однодоменное антитело, включали в фагмиду и презентовали с помощью фага. Конструировали множество фагмид для фагового дисплея, содержащих различные типы антигенсвязывающих доменов, с последующим получением фагов из Е. coli, в которых сохранялись эти фагмиды. Популяцию фага осаждали, добавляя 2,5М NaCl/10% ПЭГ к культуральному раствору Е. coli после производства фага, а затем разводили TBS с получением раствора фаговой библиотеки. Затем добавляли БСА в раствор, содержащий фаговую библиотеку, с получением конечной концентрация БСА 4%.

Тяжелую цепь, которая проявляет антигенсвязывающую способность, когда презентируется индивидуально или в комбинации с константной областью легкой цепи и утрачивает свою антигенсвязывающую способность при ассоциации с вариабельной областью легкой цепи, получали с помощью пэннинга из созданной таким образом фаговой библиотеки. Пэннинг осуществляли в соответствии с методом пэннинга, используя антиген, иммобилизованный на магнитных гранулах, согласно методу, описанному в примере 5. Фаги, связанные с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами, извлекали из фаговой библиотеки, презентирующей тяжелые цепи или тяжелые цепи с константными областями легких цепей. Указанным извлеченным фагам давали инфицировать Е. coli, и фаги, презентирующие тяжелые и легкие цепи, получали с использованием хелперного фага, экспрессирующего легкую цепь. Фаги, презентирующие тяжелую цепь, которая содержит антигенсвязывающий домен, и легкую цепь, получали описанным выше методом из культурального раствора Е. coli после производства фага. Фаги, несвязанные с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами, извлекали из популяции фагов, презентирующих тяжелые и легкие цепи.

Как продемонстрировано на фиг. 9Г, пэннинг можно осуществлять путем изменения порядка извлечения популяции фага, презентирующего тяжелую цепь, либо индивидуально, либо в комбинации с константной областью легкой цепи, связывающегося с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами, и извлечения популяции фага, презентирующего тяжелые и легкие цепи, несвязывающегося с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами. В дополнение в методу экспрессии легкой цепи с использованием хелперного фага, область, кодирующую легкую цепь, и область, кодирующую тяжелую цепь, можно включать, как обычно, в одну и ту же фагмиду, и можно включать ген, кодирующий только константную область легкой цепи или полноразмерную легкую цепь, и применять в каждом цикле пэннинга.

Антигенсвязывающий клон можно отбирать из извлеченных фагов с помощью ELISA для фагов, который описан в предыдущем разделе, или можно ген антитела субклонировать в векторе для экспрессии в животных и экспрессировать с использованием клеток животных и связывающую активность сравнивать до и после обработки протеазой для селекции связывающего клона.

Пример 9. Получение VHH, антигенсвязывающая способность которого контролируется легкой цепью, путем применения метода фагового дисплея, и получение подобной антителу IgG-типа молекулы, содержащей VHH

В примере 3 установлено, что антигенсвязывающая способность VHH, который входит в качестве заместителя VH в тяжелую цепь, контролируется путем ассоциации с легкой цепью. Соответственно VHH, который утрачивал свою антигенсвязывающую способность при ассоциации с конкретной легкой цепью, и проявлял антигенсвязывающую способность при презентации тяжелой цепи индивидуально или в комбинации с константной областью легкой цепи, т.е. без ассоциации с вариабельной областью легкой цепи, получали из фаговой библиотеки, презентирующей СН1, сцепленный с VHH, полученным из РВМС иммунизированных альпак. Получали подобную антителу IgG-типа молекулу, содержащую VHH.

9-1 Конструирование экспрессирующего легкую цепь хелперного фага с интегрированной экспрессионной единицей легкой цепи

На основе метода, описанного в публикации международной заявки на патент WO 2015/046554, промотор, сигнальную последовательность, гены вариабельной области легкой цепи и константной области легкой цепи антитела или ген константной области легкой цепи и т.д. интегрировали в геном хелперного фага, создавая экспрессирующий легкую цепь хелперный фаг. Е. coli, инфицированные указанным хелперным фагом, могли экспрессировать вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи антитела или только константную область легкой цепи.

В частности, геном выводили из хелперного фага M13KO7TC, сконструированного согласно методу, описанному в публикации международной заявки на патент WO 2015/046554, и интродуцировали в геном экспрессионную единицу легкой цепи. Ген, кодирующий вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи (VK1-39-k0MTdC; SEQ ID NO: 152), или ген. кодирующий константную область легкой цепи (k0MTdC; SEQ ID NO: 153), применяли в качестве гена легкой цепи, подлежащего интродукции. Конструкцию lac промотор-pelB сигнальная последовательность-ген легкой цепи встраивали в M13KO7TC/SacI с помощью описанного выше метода и трансфектировали линию Е. coli ER2738 методом электропорации.

Полученные Е. coli культивировали и в супернатант культуры добавляли 2,5М NaCl/10% ПЭГ для очистки хелперных фагов методом осаждения с помощью ПЭГ. Титры полученных хелперных фагов M13KO7TC-Vk1-39-kOMTdC и M13KO7TC-k0MTdC определяли с помощью общепринятого метода бляшкообразования.

9-2 Получение библиотеки, содержащей множество молекул VHH-CH1

Альпак иммунизировали методом, известным специалистам в данной области, используя 4 типа иммуногенов: внеклеточный домен человеческого IL6R, гетеродимер человеческого CD3εγ, гетеродимер обезьяньего CD3εγ и клеточный домен человеческого плексина А1. Через 4 недели собирали РВМС. Гетеродимеры CD3εγ получали согласно методу, описанному в Journal of Molecular Biology 302, 2000, cc. 899-916. Из собранных РВМС ген VHH амплифицировали согласно методу, описанному в J. Immunol. Methods 324, 2007, с. 13. Амплифицированный фрагмент гена VHH соединяли с геном 3 CH1-гена и встраивали с фагмидые векторы с получением библиотеки, содержащей множество молекул VHH-CH1, содержащих VHH, сцепленный с СН1.

9-3 Метод получения популяции фага, презентирующего конструкцию VHH-CH1/полноразмерная легкая цепь или VHH-CH1/константная область легкой цепи

Фагмидным вектором, имеющим вставку в виде гена, кодирующего VHH-СН1, трансфектировали Е. coli методом электропорации. Полученных Е. coli можно культивировать и инфицировать хелперным фагом M13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC, полученным согласно методу, описанному в примере 9-1, в результате чего конструкция VHH-CH1, экспрессированная фагмидным вектором, и полноразмерная легкая цепь, экспрессированная хелперным фагом, формировали Fab-структуру, для получения популяции фага, презентирующего VHH-CH1/полноразмерная легкая цепь (VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC) на поверхности фагмид, содержащих ген, кодирующий VHH-CH1. Кроме того, Е. coli, несущих фагмидный вектор, который имеет вставку в виде гена, кодирующего VHH-CH1, можно культивировать и инфицировать хелперным фагом M13KO7TC-k0MTdC, полученным согласно методу, описанному в примере 9-1, в результате чего конструкция VHH-CH1, экспрессированная фагмидным вектором, и константная область легкой цепь, экспрессированная хелперным фагом, формировали структуру в виде ассоциированных VHH-CH1 и CL, для получения популяции фага, презентирующего VHH-CH1/константная область легкой цепи (VHH-CH1/k0MTdC). Можно добавлять в супернатант культуры 2,5М NaCl/10% ПЭГ для очистки фагов методом осаждения ПЭГ. Титры полученных фагов можно определять с помощью общепринятого метода бляшкообразования.

9-4 Получение конструкции VHH-CH1, содержащей связывающийся с плексином A1 VHH, антигенсвязывающая способность которого ингибируется при ассоциации с вариабельной областью легкой цепи, и который обладает антигенсвязывающей способностью в отсутствии вариабельной области легкой цепи, из фаговой библиотеки VHH-CH1

Получали конструкцию VHH-CH1, содержащую VHH, антигенсвязывающая способность которого ингибируется при ассоциации с вариабельной областью легкой цепи, и который обладает антигенсвязывающей способностью в отсутствии вариабельной области легкой цепи, путем пэннинга из библиотеки VHH-CH1, полученной согласно методу, описанному в примере 9-2.

Применяемый антиген представлял собой меченный биотином человеческий плексин А1, получение которого описано в приведенном для справки примере (референс-пример).

Метод пэннинга осуществляли с использованием следующих стадий:

(1) Популяцию фага, презентирующего VHH-CH1/константная область легкой цепи (VHH-CH1/k0MTdC), получали согласно методу, описанному в примере 9-3, из фаговой библиотеки VHH-CH1, полученной согласно методу, описанному в примере 9-2, и из популяции извлекали фаги, связанные с магнитными гранулами с иммобилизованным антигеном.

(2) Популяцию фага, презентирующего VHH-CH1/полноразмерная легкая цепь (VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC), получали согласно методу, описанному в примере 9-3, из извлеченных фагов, и из популяции извлекали фаги, несвязанные с магнитными гранулами с иммобилизованным антигеном.

(3) Извлеченные фаги повторно подвергали стадиям (1) и (2) для извлечения требуемого фага.

С помощью пэннинга можно отбирать множество молекул VHH-CH1, связывание которых с плексином А1 ингибировалось в результате ассоциации с легкой цепью Vk1-39-k0MTdC, и которые обладали связывающей способностью в отношении плексина А1 в отсутствии вариабельной области легкой цепи.

Другой метод пэннинга осуществляли с использованием следующих стадий:

(1) Популяцию фага, презентирующего VHH-CH1/константная область легкой цепи (VHH-CH1/k0MTdC), получали согласно методу, описанному в примере 9-3, из фаговой библиотеки VHH-CH1, полученной согласно методу, описанному в примере 9-2, и из популяции извлекали фаги, связанные с магнитными гранулами с иммобилизованным антигеном.

(2) Популяцию фага, презентирующего VHH-CH1/полноразмерная легкая цепь (VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC), получали согласно методу, описанному в примере 9-3, из извлеченных фагов, и из популяции извлекали фаги, несвязанные с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами. Дополнительно из извлеченных фагов выделяли фаги, связывающиеся с магнитными гранулами с иммобилизованным антителом к легкой цепи (фирма EY Laboratories, Inc., Cat. ВАТ-2107-2).

(3) Извлеченные фаги повторно подвергали стадиям (1) и (2) для извлечения требуемого фага.

С помощью пэннинга можно отбирать множество молекул VHH-CH1, связывание которых с плексином А1 ингибировалось в результате ассоциации с легкой цепью Vk1-39-k0MTdC, и которые обладали связывающей способностью в отношении плексина А1 в отсутствии вариабельной области легкой цепи.

VHH в VHH-CH1, отобранный с помощью пэннинга, можно применять для получения подобных антителу IgG-типа молекул.

9-5 Получение активируемой протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы с включенным VHH, который связывается с плексином А1

Нуклеотидную последовательность, кодирующую VHH, который содержится в каждой молекуле VHH-CH1, отобранной согласно методу, описанному в примере 9-4, соединяли с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сайт расщепления протеазой и константную область тяжелой цепи, согласно методу, описанному в примере 3. Образовавшуюся конструкцию применяли в качестве тяжелой цепи подобной антителу IgG-типа молекулы и объединяли с полноразмерной легкой цепью VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3). Подобные антителу IgG-типа молекулы экспрессировали путем кратковременной экспрессии, используя клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.), с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

Полученные подобные антителу IgG-типа молекулы представлены в таблице 3.

9-6 Активация активируемой протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы путем расщепления протеазой

Подобные антителу IgG-типа молекулы, полученные согласно методу, описанному в примере 9-4, расщепляли протеазой, аналогично методу, описанному в примере 3, и уровень расщепления оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 22. Концентрацию протеазы доводили до 25 нМ.

В результате установлено, что каждая из полученных подобных антителу IgG-типа молекул подвергалась расщеплению протеазой в расщепляемой протеазой последовательности.

Далее оценивали связывание с человеческим плексином A1 VHH, высвободившегося в результате обработки протеазой, аналогично методу, описанному в примере 3. Полученные с помощью Octet сенсограммы представлены на фиг. 23.

В результате установлено, что каждая из полученных подобных антителу IgG-типа молекул не проявляла антигенсвязывающую способность до обработки протеазой, однако подтверждена антигенсвязывающая способность высвободившегося VHH после обработки протеазой.

Пример 10. Полипептид, содержащий биспецифическую молекулу VHH-VHH

10-1 Биспецифическая конструкция VHH-VHH, связывающаяся с раковым антигеном и CD3, и получение полипептида, содержащего биспецифическую молекулу VHH-VHH

Как продемонстрировано на фиг. 8, активируемый протеазой антигенсвязывающий домен может образовывать биспецифическую антигенсвязывающую молекулу со вторым антигенсвязывающим доменом.

VHH HN3 (SEQ ID NO: 159), распознающий человеческий глипикан 3, и VHH G03 (SEQ ID NO: 160), распознающий CD3, соединяли через линкер, состоящий из глицина и серина, с получением биспецифической конструкции VHH-VHH HN3 G03. Константную область тяжелой цепи антитела, представленную в SEQ ID NO: 161, дополнительно соединяли с ней через расщепляемую протеазой последовательность, и образовавшуюся тяжелую цепь HN3G03-cF760mnHIF (SEQ ID NO: 162), содержащую биспецифическую конструкцию VHH-VHH, встраивали в вектор для экспрессии в животных.

VHH HerF07 (SEQ ID NO: 163), распознающий Her2, и VHH G03 (SEQ ID NO: 160), распознающий CD3, соединяли через линкер, состоящий из глицина и серина, с получением биспецифической конструкции VHH-VHH HerF07G03. Константную область тяжелой цепи антитела, представленную в SEQ ID NO: 161, дополнительно соединяли с ней через расщепляемую протеазой последовательность, и образовавшуюся тяжелую цепь HerF07G03-cF760mnHIF (SEQ ID NO: 164), содержащую биспецифическую конструкцию VHH-VHH, встраивали в вектор для экспрессии в животных.

Клетки Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) совместно трансфектировали каждой тяжелой цепью, содержащей биспецифическую конструкцию VHH-VHH, и векторами для экспрессии в животных соответственно, которые имели вставки в виде легкой цепи VK1.39-k0MT (SEQ ID NO: 3), человеческой последовательностью константной области VHn-Kn010dGK (SEQ ID NO: 166), простирающейся от шарнирной области до С-конца, для экспрессии полипептида, содержащего биспецифическую конструкцию VHH-VHH. Затем, полипептид, содержащий биспецифическую конструкцию VHH-VHH, очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя 96-луночный планшет типа MonoSpin ProA (фирма GL Sciences Inc., каталожный №7510-11312). Полипептид, содержащий биспецифическую конструкцию VHH-VHH HN3G03, представлял собой HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, а полипептид, содержащий биспецифическую конструкцию VHH-VHH HerF07G03, представлял собой HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT.

Для обработки протеазой uPA (рекомбинантный активатор человеческого u-плазминогена, фирма R&D Systems, Inc.) (конечная концентрация: 25нМ) добавляли к 40 мкг каждого очищенного полипептида, содержащего биспецифическую конструкцию VHH-VHH, и инкубировали при 37°С в течение 20 ч или более. Необработанные протеазой образцы инкубировали после добавления ЗФР вместо протеазы в таком же количестве, что и протеаза. Подвергается ли расщепляемый протеазой полипептид, содержащий биспецифическую конструкцию VHH-VHH, требуемому расщеплению, определяли с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 24. Как продемонстрировано на фиг. 24, можно предположить, что биспецифическая конструкция VHH-VHH отделялась от цельной молекулы путем расщепления протеазой.

10-2 Оценка активации CD3 полипептидом, содержащим биспецифическую конструкцию VHH-VHH, направленную против GPC3 и CD3, путем расщепления протеазой

Агонистическую активность в отношении CD3 оценивали с использованием репортерных клеток Jurkat-NFAT (клетки линии NFAT luc2_jurkat). Репортерные клетки Jurkat-NFAT представляют собой клеточную линию экспрессирующих CD3 полученных из человеческого острого Т-клеточного лейкоза клеток, слитую с респондерным элементом NFAT и люциферазой (luc2P), и экспрессирующую люциферазу при активации сигнала, действующего в прямом направлении относительно CD3. Клетки-мишени, применяемые для антител к GPC3, представляли собой клетки линии SK-рса60, созданные путем усиления способности экспрессировать человеческий GPC3 в полученной из клеток человеческого рака печени линии SK-HEP-1. Клетки-мишени и эффекторные клетки добавляли из расчета 1,25Е+04 клеток/лунку и 7,50Е+04 клеток/лунку соответственно в каждую лунку 96-луночного планшета для анализа с белым дном (фирма Costar, 3917). Конструкцию HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, обработанную или необработанную протеазой, добавляли в лунку в конечной концентрации 1, 10 или 100 нМ. После 24-часовой инкубации при 37°С в присутствии 5% СО₂ активность фермента люциферазы измеряли по интенсивности люминисценции, используя систему для анализа люциферазы Bio-Glo (фирма Promega Corp., G7940) согласно прилагаемому протоколу. Для детекции использовали устройство 2104 En Vision. Результаты представлены на фиг. 25. Никакого повышения люциферазной активности не обнаружено в образце, необработанном протеазой, в то время как повышение люциферазной активности выявлено при использовании конструкции HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, обработанной протеазой. В частности, для обработанной протеазой конструкции HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, удалось подтвердить наличие агонистической активности в отношении CD3, в то время как биспецифическая конструкция VHH-VHH, направленная против GPC3 и CD3, высвобождалась из HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT при расщеплении протеазой и проявляла CD3-связывающую активность, заингибированную в отсутствии расщепления.

10-3 Оценка активации CD3 полипептидом, содержащим биспецифическую конструкцию VHH-VHH, направленную против Her2 и CD3, путем расщепления протеазой

Агонистическую активность в отношении CD3 оценивали с использованием репортерных клеток Jurkat-NFAT (клетки линии NFAT luc2_jurkat). Репортерные клетки Jurkat-NFAT (эффекторные клетки) представляют собой клеточную линию экспрессирующих CD3 полученных из человеческого острого Т-клеточного лейкоза клеток, слитую с респондерным элементом NFAT и люциферазой (luc2P), и экспрессирующую люциферазу при активации сигнала, действующего в прямом направлении относительно CD3. Применяемые клетки-мишени представляли собой клеточную линию LS1034. Клетки-мишени и эффекторные клетки добавляли из расчета 2,50Е+04 клеток/лунку и 7,50Е+04 клеток/лунку соответственно в каждую лунку 96-луночного планшета для анализа с белым дном (фирма Costar, 3917). Конструкцию HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, обработанную или необработанную протеазой, добавляли в лунку в конечной концентрации 0,01, 0,1 и 1 нМ. После 24-часовой инкубации при 37°С в присутствии 5% СО₂ активность фермента люциферазы измеряли по интенсивности люминисценции, используя систему для анализа люциферазы Bio-Glo (фирма Promega Corp., G7940) согласно прилагаемому протоколу. Для детекции использовали устройство 2104 En Vision. Результаты представлены на фиг. 26. Никакого повышения люциферазной активности не обнаружено в образце, необработанном протеазой, в то время как повышение люциферазной активности выявлено при использовании конструкции HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, обработанной протеазой. В частности, для обработанной протеазой конструкции HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, удалось подтвердить наличие агонистической активности в отношении CD3, в то время как биспецифическая конструкция VHH-VHH, направленная против Her2 и CD3, высвобождалась из HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT при расщеплении протеазой и проявляла CD3-связывающую активность, заингибированную в отсутствии расщепления.

Пример 11. Интродукция сайта расщепления протеазой в полипептид с включенным VHH

11-1 Интродукция расщепляемой протеазой последовательности в полипептид с включенным VHH, который связывается с IL6R

Получали экспрессионный вектор, кодирующий конструкцию IL6R90-G1T4 (SEQ ID NO: 167), которая содержит IL6R90 (SEQ ID NO: 1), т.е. VHH, который обладает связывающей и нейтрализующей активностью в отношении человеческого IL6R, описанный в публикации международной заявки на патент WO 2010/115998, слитый с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3), с использованием метода, известного специалистам в данной области. Подобную антителу IgG-типа молекулу IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 167, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) или клеток Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

Расщепляемую протеазой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 178, встраивали вблизи границы между VHH и СН1 в тяжелую цепь IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT с получением содержащей VHH тяжелой цепи IL6R90.12aa-G1T4 (SEQ ID NO: 189), несущей расщепляемую протеазой последовательность. Экспрессионный вектор IL6R90.12aa-G1T4 получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.

IL6R90.12aa-G1T4 объединяли с легкой цепью, которая представлена в SEQ ID NO: 3. Подобную антителу IgG1-типа молекулу IL6R90.12aa-G1T4/VK1-39-k0MT, несущую расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между VHH и СН1, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) или клеток Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

11-2 Оценка расщепления протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы, содержащей VHH к человеческому IL6R и несущей расщепляемую протеазой последовательность в области ее тяжелой цепи

Изучали, может ли подобная антителу IgG-типа молекула, полученная согласно методу, описанному в примере 11-1, расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (MT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). Подвергали взаимодействию 10 нМ протеазу и 50 мкг/мл антитела в ЗФР при 37°С в течение 20 ч, после чего осуществляли ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 27. Установлено, что обработка протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы IL6R90.12aa приводила к созданию новой полосы, соответствующей молекулярной массе порядка 37 кДа. Таким образом, подтверждено, что подобная антителу IgG-типа молекула подвергалась расщеплению протеазой в расщепляемой протеазой последовательности (SEQ ID NO: 178), встроенной вблизи границы между VHH и СН1. Кроме того, подтверждено, что расщепляемая протеазой последовательность, представленная в SEQ ID NO: 178, могла расщепляться человеческой uPA и мышиной uPA, при ее встраивании в антитело IgG-типа аналогичным методом.

Пример 12. Оценка уровня активации в результате расщепления протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы, несущей расщепляемую протеазой последовательность в ее легкой цепи

Получали экспрессионный вектор, кодирующий конструкцию IL6R75-G1m (SEQ ID NO: 191), которая содержит IL6R75 (SEQ ID NO: 190), т.е. VHH, который обладает связывающей и нейтрализующей активностью в отношении человеческого IL6R, описанный в публикации международной заявки на патент WO 2010/115998, слитый с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3), с использованием метода, известного специалистам в данной области. IL6R75hu-G1m (SEQ ID NO: 192) получали путем интродукции аминокислотных изменений в сайте на поверхности раздела между VHH и VL, аналогично методу, описанному в примере 4-2. Подобные антителу IgG-типа молекулы IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 72), 20A11hu-G1m/K1-39P+4-Pk0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 72) и IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 192, легкая цепь: SEQ ID NO: 72) экспрессировали и очищали, аналогично методу, описанному в примере 3, используя легкую цепь с включенной расщепляемой протеазой последовательностью VK1-39P+4-Pk0MT (SEQ ID NO: 72), и IL6R90-G1m (SEQ ID NO: 2), 20A11hu-G1m (SEQ ID NO: 39) и IL6R75hu-G1m (SEQ ID NO: 192) в качестве тяжелых цепей.

IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT, 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT и IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT расщепляли протеазой, аналогично методу, описанному в примере 3, и оценивали уровень расщепления. Результаты представлены на фиг. 28. В частности, в качестве протеазы применяли рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (МТ-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). Подвергали взаимодействию 50 нМ протеазу и 50 мкг/мл каждой из подобных антителу IgG-типа молекул в ЗФР при 37°С в течение 20 ч. Затем расщепление протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. В результате подтверждено, что IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT, 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT и IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT подвергались расщеплению протеазой вблизи границы между VL и CL.

Затем способность VHH, высвободившегося в результате обработки протеазой, связываться с IL6R оценивали с помощью ELISA. В частности, конструкцию hsIL-6R-BAP1, применяемую в примере 3, иммобилизовывали на покрытом стрептавидином 384-луночном планшете (фирма Greiner Bio-One GmbH, 781990) и каждой расщепленной подобной антителу IgG-типа молекуле давали связываться с ним при комнатной температуре. После осуществления реакции в течение 30 мин конструкции давали взаимодействовать с меченным HRP антителом к человеческому IgG (фирма Sigma-Aldrich Co. LLC, SAB3701362-2MG) при комнатной температуре в течение 10 мин и добавляли для взаимодействия хромогенный раствор ТМВ (фирма Life Technologies Corp., 002023). После осуществления реакции при комнатной температуре в течение 30 мин реакцию прекращали с помощью серной кислоты, а затем измеряли абсорбцию при 450 нм с помощью мультимодального ридера Synergy НТХ (фирма BioTek Instruments, Inc.). Рассчитывали соотношение для иммобилизованных антителом лунок и неиммобилизованных лунок и применяли в качестве отношения S/N. Строили график зависимости отношения S/N (среднее), установленного с помощью ELISA, отложенного на оси ординат, от концентрации каждой подобной антителу IgG-типа молекулы, отложенной на оси абсцисс. Результаты представлены на фиг. 29. Эти результаты продемонстрировали, что обработанная протеазой подобная антителу IgG-типа молекула 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT, несущая расщепляемую последовательность в ее легкой цепи, в 10 или более раз превышала по IL6R-связывающей активности необработанную протеазой подобную антителу IgG-типа молекулу, а обработанная протеазой подобная антителу IgG-типа молекула IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT в 1000 или более раз превышала по IL6R-связывающей активности необработанную протеазой молекулу.

Пример 13. Получение и оценка подобных антителу IgG-типа молекул, несущих различные расщепляемые протеазой последовательности

13-1 Получение полипептидов, несущих различные расщепляемые протеазой последовательности

Подобные антителу IgG-типа молекулы получали аналогично методу, описанному в примере 3, используя последовательности, распознаваемые протеазами, отличными от урокиназы или матриптазы. Каждую из различных пептидных последовательностей, для которой известно, что она расщепляется MMP-2, MMP-7, MMP-9 или MMP-13, встраивали вблизи границы между вариабельной и константной областями IL6R90-G1m, и пептидную последовательность, которая содержит гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера, встраивали в непосредственной близости от указанных расщепляемых последовательностей. Встроенные последовательности представлены в таблице 4.

Таблица 4

Различные встроенные последовательности

Протеаза Встроенная последовательность SEQ ID NO MMP-2 MMP-9 PLGLAG 25 MMP-2 GAGIPVSLRSGAG 78 MMP-2 GPLGIAGQ 79 MMP-2 GGPLGMLSQS 80 MMP-2 PLGLWA 81 MMP-7 VPLSLTMG 26 MMP-7 GAGVPLSLTMGAG 83 MMP-9 GAGVPLSLYSGAG 84 MMP-13 GAGPQGLAGQRGIVAG 91 MMP-2 MMP-9 GGGGSPLGLAGGGGGS 193 MMP-2 GGGGSGPLGIAGQGGGGS 194 MMP-9 GGGGSGAGVPLSLYSGAGGGGGS 195

Тяжелые цепи создавали так, чтобы эти последовательности были встроены вблизи границы между вариабельными и константными областями IL6R90-G1m.

Экспрессионные векторы, кодирующие варианты тяжелых цепей 6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m (SEQ ID NO: 165), 6R90EIVHEMP2.2- 6R90EICHEMP2.2G1m (SEQ ID NO: 202), 6R90EIVHEMP2.3- 6R90EICHEMP2.3G1m (SEQ ID NO: 203), 6R90EIVHEMP2.4- 6R90EICHEMP2.4G1m (SEQ ID NO: 204), 6R90EIVHEMP7.1- 6R90EICHEMP7.1G1m (SEQ ID NO: 205), 6R90EIVHEMP7.2- 6R90EICHEMP7.2G1m (SEQ ID NO: 206), 6R90EIVHEMP13- 6R90EICHEMP13G1m (SEQ ID NO: 207), 6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S- 6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m (SEQ ID NO: 196), 6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EIVHEG4SMP2.2G4SG1m (SEQ ID NO: 197) и 6R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EIVHEG4SMP9G4SG1m (SEQ ID NO: 198), получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.

В таблице 5 представлены подобные антителу IgG-типа молекулы, в которых объединены указанные варианты тяжелых цепей с легкой цепью и которые несут расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между вариабельной и константной областями тяжелой цепи. Указанные подобные антителу IgG-типа молекулы экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) или клеток Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.

13-2 Оценка расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул, несущих различные расщепляемые протеазой последовательности

Изучали, могут ли подобные антителу IgG-типа молекулы, полученные согласно методу, описанному в примере 13-1, расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли рекомбинантную человеческую ММР-2 (фирма R&D Systems, Inc., 902-МР-010), рекомбинантную человеческую ММР-7 (фирма R&D Systems, Inc., 907-МР-010), рекомбинантную человеческую ММР-9 (фирма R&D Systems, Inc., 911-МР-010) или рекомбинантную человеческую ММР-13 (фирма R&D Systems, Inc., 511-ММ-010). Каждую из ММР-2, ММР-7, ММР-9 и ММР-13 применяли после смешения с 1 мМ ацетатом пара-аминофенилртути (АРМА; фирма Abcam PLC, ab112146) и активировали при 37°С в течение 1 ч или 24 ч. Повергали взаимодействию протеазу в концентрации 50, 100 или 500 нМ и каждую подобную антителу IgG-типа молекулу в концентрации 50 мкг/мл или 100 мкг/мл в ЗФР или 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl и 5 мМ CaCl₂ (рН 7,2) (ниже в контексте настоящего описания обозначен как Трис), при 37°С в течение 20 ч. Затем расщепление протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 30А и 30Б. На 30Б представлены результаты, полученные при осуществлении расщепления протеазой в буфере для анализа (набор для оценки активности ММР (флуорометрический - зеленый) (ab112146), компонент С: буфер для анализа).

В результате установлено, что 6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.2-6R90EICHEMP2.2G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.3-6R90EICHEMP2.3G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.4-6R90EICHEMP2.4G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT и 6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EICHEG4SMP2.2G4SG1m/VK1-39-k0MT расщеплялись MMP-2.

Установлено, что 6R90EIVHEMP7.1-6R90EICHEMP7.1G1m/VK1-39-k0MT и 6R90EIVHEMP7.2-6R90EICHEMP7.2G1m/VK1-39-k0MT расщеплялись ММР-7.

Установлено, что 6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT и 6R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EICHEG4SMP9G4SG1m/VK1-39-k0MT расщеплялись ММР-9. Установлено, что конструкция 6R90EIVHEMP13-6R90EICHEMP13G1m/VK1-39-k0MT расщеплялась ММР-13.

Референс-пример 1. Получение биотинилированного плексина А1

Биотинилированный плексин А1 (обозначенный также как меченный биотином человеческий плексин А1) получали с помощью метода, известного специалистам в данной области. В частности, генный фрагмент, кодирующий конкретную последовательность (последовательность Avi-метки последовательность; SEQ ID NO: 36), подлежащую биотинилированию с помощью биотинлигазы, и генный фрагмент, кодирующий последовательность FLAG-метки (SEQ ID NO: 199; DYKDDDDK), соединяли через генный фрагмент, кодирующий линкер, состоящий из глицина и серина, в прямом направлении относительно генного фрагмента, кодирующего внеклеточную область плексина А1. Генный фрагмент, кодирующий белок, который содержит плексин А1, сцепленный с последовательностью Avi-метки и последовательностью FLAG-метки (SEQ ID NO: 200), встраивали в вектор для экспрессии в клетках животных. Сконструированным плазмидным вектором трансфектировали клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.), используя 293Fectin (фирма Invitrogen Corp.). При осуществлении указанной операции клетки совместно трансфектировали геном для экспрессии EBNA1 (SEQ ID NO: 57), геном для экспрессии биотинлигазы (BirA; SEQ ID NO: 58) и к ним дополнительно добавляли биотин для мечения с помощью биотина плексина А1. Клетки, трансфектированные с помощью упомянутых выше процедур, культивировали при 37°С в атмосфере с 8% СО₂ и в результате происходила секреция представляющего интерес белка (биотинилированный плексин А1) в супернатант культуры. Этот раствор клеточной культуры фильтровали, используя емкость с 0,22-микрометровым верхним фильтром, для получения супернатанта культуры.

Колонку упаковывали агарозой с антителом к FLAG М2 (Анти FLAG М2) (фирма Sigma-Aldrich Co. LLC, №А2220) с получением колонки для FLAG. Колонку для FLAG уравновешивали предварительно D-ЗФР(-). В нее вносили супернатант культуры для связывания биотинилированного плексина А1 с колонкой. Затем биотинилированный плексин А1 элюировали, используя пептид FLAG, растворенный в D-ЗФР(-). Агрегаты удаляли из этого элюата с помощью гель-фильтрации, используя HiLoad 26/600 Супердекс 200 пг, 320 мл (фирма GE Healthcare Japan Corp., 28-9893-36), с получением очищенного биотинилированного плексина А1.

С целью лучшего понимания упомянутые выше варианты осуществления изобретения описаны подробно со ссылкой на фактические примеры и иллюстративные примеры. Однако описание и иллюстрации, представленные в настоящем описании, не следует интерпретировать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Содержание всей патентной литературы и научной литературы, процитированной в настоящем описании, специально полностью включено в него в качестве ссылки.

Промышленная применимость

Полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, который содержит антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент, обладающий более длительным временем полужини в крови по сравнению с антигенсвязывающим доменом, и имеющий ингибирующий домен, который ингибирует связывающую активность антигенсвязывающего домена, а также фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, могут транспортировать антигенсвязывающий домен в кровь, ингибируя при этом антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена. Кроме того, применение полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, может позволять антигенсвязывающему домену проявлять свою антигенсвязывающую активность конкретно в пораженной болезнью области. Кроме того, поскольку антигенсвязывающий домен имеет более короткое время полужизни в момент проявления свой антигенсвязывающей активности по сравнению со временем транспортировки, то снижается риск системного действия. Таким образом, полипептид и фармацевтическая композиция, предлагаемые в настоящем изобретении, являются очень ценными для лечения заболевания.

Однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется при ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, можно подвергать скринингу или получать в качестве одного примера антигенсвязывающего домена, предназначенного для эффективного получения полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении. Кроме того, необходимый антигенсвязывающий домен можно эффективно получать, когда полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, получают с использованием библиотеки, включающей однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется при ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, в качестве одного пример антигенсвязывающего домена, который можно применять в полипептиде, предлагаемом в настоящем изобретении.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Чугаи Сейяку Кабусики Кайся

<120> Полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен и

транспортирующий сегмент

<130> C1-A1614P

<150> JP 2016-229794

<151> 2016-11-28

<160> 207

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 455

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

130 135 140

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

210 215 220

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 235 240

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

245 250 255

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

260 265 270

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

275 280 285

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

290 295 300

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315 320

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

325 330 335

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

340 345 350

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

355 360 365

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375 380

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

405 410 415

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

420 425 430

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Asp Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 4

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg

85 90 95

Leu His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 5

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 5

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 6

<211> 217

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 6

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser

85 90 95

Leu Asn Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 7

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 7

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Gly Gly Val

85 90 95

Thr Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 8

<211> 217

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 8

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Ser Gly

85 90 95

Tyr Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 9

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 9

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Asp Val

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala

115 120 125

Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala

130 135 140

Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val

145 150 155 160

Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser

165 170 175

Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr

180 185 190

Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala

195 200 205

Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 11

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 12

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

1 5

<210> 13

<211> 463

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

145 150 155 160

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

165 170 175

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

180 185 190

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

210 215 220

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

225 230 235 240

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

370 375 380

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 14

<211> 473

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser

130 135 140

Ser Gly Gly Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

145 150 155 160

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

165 170 175

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

180 185 190

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

195 200 205

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

210 215 220

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

225 230 235 240

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

245 250 255

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

325 330 335

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

355 360 365

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

370 375 380

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

385 390 395 400

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

405 410 415

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

435 440 445

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470

<210> 15

<211> 464

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Leu Ser Gly

115 120 125

Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 16

<211> 473

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser

130 135 140

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

145 150 155 160

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

165 170 175

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

180 185 190

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

195 200 205

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

210 215 220

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

225 230 235 240

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

245 250 255

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

325 330 335

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

355 360 365

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

370 375 380

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

385 390 395 400

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

405 410 415

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

435 440 445

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470

<210> 17

<211> 464

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 18

<211> 473

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

130 135 140

Gly Ser Ser Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

145 150 155 160

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

165 170 175

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

180 185 190

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

195 200 205

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

210 215 220

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

225 230 235 240

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

245 250 255

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

325 330 335

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

355 360 365

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

370 375 380

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

385 390 395 400

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

405 410 415

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

435 440 445

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470

<210> 19

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 22

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 23

<211> 377

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

115 120 125

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys

130 135 140

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

145 150 155 160

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

165 170 175

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

180 185 190

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

195 200 205

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

210 215 220

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

225 230 235 240

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

245 250 255

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

260 265 270

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

275 280 285

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

290 295 300

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

305 310 315 320

Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

325 330 335

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile

340 345 350

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

355 360 365

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 24

<211> 327

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 25

Pro Leu Gly Leu Ala Gly

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 26

Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly

1 5

<210> 27

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 27

Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 28

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 28

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 29

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 29

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 30

Gly Gly Ser Gly Gly

1 5

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 31

Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 32

Gly Ser Gly Gly Gly

1 5

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 33

Gly Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 34

Gly Ser Ser Ser Gly

1 5

<210> 35

<211> 338

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg Gly Val Leu

1 5 10 15

Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro Gly Val Glu

20 25 30

Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys Pro Ala Ala

35 40 45

Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg Leu Leu Leu

50 55 60

Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Tyr Arg Ala

65 70 75 80

Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val Pro Pro Glu

85 90 95

Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser Asn Val Val

100 105 110

Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr Lys Ala Val

115 120 125

Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp Phe Gln Glu

130 135 140

Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys Gln Leu Ala

145 150 155 160

Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met Cys Val Ala

165 170 175

Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe Gln Gly Cys

180 185 190

Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val Thr Ala Val

195 200 205

Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp Pro His Ser

210 215 220

Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Ala

225 230 235 240

Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp Leu Gln His

245 250 255

His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His Val Val Gln

260 265 270

Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser Glu Trp Ser

275 280 285

Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser Pro Pro Ala

290 295 300

Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr Asn Lys Asp

305 310 315 320

Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr Ser Leu Pro

325 330 335

Val Gln

<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 36

Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

1 5 10 15

<210> 37

<211> 358

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 37

Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg Gly Val Leu

1 5 10 15

Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro Gly Val Glu

20 25 30

Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys Pro Ala Ala

35 40 45

Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg Leu Leu Leu

50 55 60

Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Tyr Arg Ala

65 70 75 80

Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val Pro Pro Glu

85 90 95

Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser Asn Val Val

100 105 110

Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr Lys Ala Val

115 120 125

Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp Phe Gln Glu

130 135 140

Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys Gln Leu Ala

145 150 155 160

Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met Cys Val Ala

165 170 175

Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe Gln Gly Cys

180 185 190

Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val Thr Ala Val

195 200 205

Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp Pro His Ser

210 215 220

Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Ala

225 230 235 240

Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp Leu Gln His

245 250 255

His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His Val Val Gln

260 265 270

Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser Glu Trp Ser

275 280 285

Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser Pro Pro Ala

290 295 300

Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr Asn Lys Asp

305 310 315 320

Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr Ser Leu Pro

325 330 335

Val Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln

340 345 350

Lys Ile Glu Trp His Glu

355

<210> 38

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro

<210> 39

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 39

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro

<210> 40

<211> 457

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 40

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Leu Ser Gly Arg Ser

115 120 125

Asp Asn His Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

130 135 140

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

145 150 155 160

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

165 170 175

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

195 200 205

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

210 215 220

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

225 230 235 240

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

275 280 285

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

290 295 300

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

305 310 315 320

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

325 330 335

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

340 345 350

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

355 360 365

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

370 375 380

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385 390 395 400

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

405 410 415

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

420 425 430

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

435 440 445

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455

<210> 41

<211> 467

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 41

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro

465

<210> 42

<211> 467

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 42

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg

115 120 125

Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro

465

<210> 43

<211> 467

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 43

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro

465

<210> 44

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 44

Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser

1 5 10 15

Gly Gly

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 45

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly

1 5

<210> 46

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 46

Gly Ser Gly Gly

1

<210> 47

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 47

Ser Gly Gly Gly

1

<210> 48

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 48

Gly Ser Ser Gly

1

<210> 49

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 49

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 50

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 50

Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 51

Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 52

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 52

Gly Ser Ser Gly Gly

1 5

<210> 53

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 53

Ser Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 54

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 54

Ser Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 55

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 56

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 57

<211> 641

<212> PRT

<213> Human herpesvirus 4

<400> 57

Met Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu

1 5 10 15

Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln

20 25 30

Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly

35 40 45

Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro

50 55 60

Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile

65 70 75 80

Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly

85 90 95

Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly

100 105 110

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly

115 120 125

Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala

130 135 140

Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly

165 170 175

Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly

180 185 190

Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly

195 200 205

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala

210 215 220

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala

225 230 235 240

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly

245 250 255

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly

260 265 270

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly

275 280 285

Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly

290 295 300

Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly

305 310 315 320

Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly

325 330 335

Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu Arg

355 360 365

Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro

370 375 380

Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro

385 390 395 400

Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu

405 410 415

Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly

420 425 430

Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr

435 440 445

Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp

450 455 460

Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn

465 470 475 480

Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg

485 490 495

Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly

500 505 510

Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile

515 520 525

Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala

530 535 540

Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys

545 550 555 560

Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys

565 570 575

Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn

580 585 590

Ile Arg Val Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro

595 600 605

Trp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly

610 615 620

Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln

625 630 635 640

Glu

<210> 58

<211> 321

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 58

Met Lys Asp Asn Thr Val Pro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala Asn

1 5 10 15

Gly Glu Phe His Ser Gly Glu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met Ser

20 25 30

Arg Ala Ala Ile Asn Lys His Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly Val

35 40 45

Asp Val Phe Thr Val Pro Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro Ile

50 55 60

Gln Leu Leu Asn Ala Lys Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly Ser

65 70 75 80

Val Ala Val Leu Pro Val Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu Asp

85 90 95

Arg Ile Gly Glu Leu Lys Ser Gly Asp Ala Cys Ile Ala Glu Tyr Gln

100 105 110

Gln Ala Gly Arg Gly Arg Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly

115 120 125

Ala Asn Leu Tyr Leu Ser Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala

130 135 140

Ala Ala Ile Gly Leu Ser Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val

145 150 155 160

Leu Arg Lys Leu Gly Ala Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp

165 170 175

Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr

180 185 190

Gly Lys Thr Gly Asp Ala Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn

195 200 205

Met Ala Met Arg Arg Val Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile

210 215 220

Thr Leu Gln Glu Ala Gly Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala

225 230 235 240

Met Leu Ile Arg Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu

245 250 255

Gly Leu Ala Pro Tyr Leu Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile

260 265 270

Asn Arg Pro Val Lys Leu Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile

275 280 285

Ser Arg Gly Ile Asp Lys Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly

290 295 300

Ile Ile Lys Pro Trp Met Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu

305 310 315 320

Lys

<210> 59

<211> 373

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 59

Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys

1 5 10 15

Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro

20 25 30

Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp

35 40 45

Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys

50 55 60

Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg

65 70 75 80

Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg

85 90 95

Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp

100 105 110

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

115 120 125

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

130 135 140

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

145 150 155 160

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

165 170 175

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

180 185 190

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

195 200 205

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

210 215 220

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

225 230 235 240

Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

245 250 255

Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

260 265 270

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

275 280 285

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

290 295 300

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

305 310 315 320

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

325 330 335

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Glu Asn Leu Tyr

340 345 350

Phe Gln Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys

355 360 365

Ile Glu Trp His Glu

370

<210> 60

<211> 323

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 60

Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys

1 5 10 15

Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser

20 25 30

Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly

35 40 45

Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr

50 55 60

Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu Asp Asp

65 70 75 80

Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

85 90 95

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

100 105 110

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

115 120 125

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

130 135 140

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

145 150 155 160

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

165 170 175

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

180 185 190

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

195 200 205

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

210 215 220

Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys

225 230 235 240

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

245 250 255

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

260 265 270

Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

275 280 285

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

290 295 300

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp Tyr Lys Asp Asp

305 310 315 320

Asp Asp Lys

<210> 61

<211> 123

<212> PRT

<213> Vicugna pacos

<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn His Cys

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Asn Thr Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Trp Ala Pro Leu Val Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly

115 120

<210> 62

<211> 121

<212> PRT

<213> Vicugna pacos

<400> 62

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asp Asn Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Pro Arg Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly

115 120

<210> 63

<211> 118

<212> PRT

<213> Vicugna pacos

<400> 63

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Val Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg His Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Phe Ala Pro Trp Asp Gly Asp Met Glu Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Gly

115

<210> 64

<211> 469

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn His Cys

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Asn Thr Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Trp Ala Pro Leu Val Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser

115 120 125

Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro

465

<210> 65

<211> 467

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asp Asn Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Pro Arg Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg

115 120 125

Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro

465

<210> 66

<211> 464

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 66

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Val Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg His Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Phe Ala Pro Trp Asp Gly Asp Met Glu Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn

115 120 125

His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 67

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 67

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Asp Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn

100 105 110

His Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 68

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 68

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Asp Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Leu Ser Gly Arg Ser Asp

100 105 110

Asn His Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 69

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 69

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Asp Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Leu Ser Gly Arg Ser

100 105 110

Asp Asn His Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 70

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 70

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Asp Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Leu Ser Gly

100 105 110

Arg Ser Asp Asn His Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 71

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 71

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Asp Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Leu Ser

100 105 110

Gly Arg Ser Asp Asn His Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 72

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 72

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Asp Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Leu

100 105 110

Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 73

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 73

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Asp Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 74

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 74

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 10

<210> 75

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 75

Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

1 5 10

<210> 76

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 76

Ala Val Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp

1 5 10 15

Asn His

<210> 77

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 77

Gly Ala Gly Val Pro Met Ser Met Arg Gly Gly Ala Gly

1 5 10

<210> 78

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 78

Gly Ala Gly Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly Ala Gly

1 5 10

<210> 79

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 79

Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln

1 5

<210> 80

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 80

Gly Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln Ser

1 5 10

<210> 81

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 81

Pro Leu Gly Leu Trp Ala

1 5

<210> 82

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 82

Gly Ala Gly Arg Pro Phe Ser Met Ile Met Gly Ala Gly

1 5 10

<210> 83

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 83

Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly Ala Gly

1 5 10

<210> 84

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 84

Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Ala Gly

1 5 10

<210> 85

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 85

Ala Ala Asn Leu Arg Asn

1 5

<210> 86

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 86

Ala Gln Ala Tyr Val Lys

1 5

<210> 87

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 87

Ala Ala Asn Tyr Met Arg

1 5

<210> 88

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 88

Ala Ala Ala Leu Thr Arg

1 5

<210> 89

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 89

Ala Gln Asn Leu Met Arg

1 5

<210> 90

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 90

Ala Ala Asn Tyr Thr Lys

1 5

<210> 91

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 91

Gly Ala Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val Ala Gly

1 5 10 15

<210> 92

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 92

Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly

1 5

<210> 93

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 93

Pro Arg Phe Arg Ile Ile Gly Gly

1 5

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 94

Gly Ala Gly Ser Gly Arg Ser Ala Gly

1 5

<210> 95

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 95

Ser Gly Arg Ser Ala

1 5

<210> 96

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 96

Gly Ser Gly Arg Ser Ala

1 5

<210> 97

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 97

Ser Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 98

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 98

Ser Gly Arg Ser Ser

1 5

<210> 99

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 99

Ser Gly Arg Arg Ala

1 5

<210> 100

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 100

Ser Gly Arg Asn Ala

1 5

<210> 101

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 101

Ser Gly Arg Lys Ala

1 5

<210> 102

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 102

Gln Arg Gly Arg Ser Ala

1 5

<210> 103

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 103

Gly Ala Gly Ser Leu Leu Lys Ser Arg Met Val Pro Asn Phe Asn Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 104

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 104

Thr Gln Gly Ala Ala Ala

1 5

<210> 105

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 105

Gly Ala Ala Ala Ala Ala

1 5

<210> 106

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 106

Gly Ala Gly Ala Ala Gly

1 5

<210> 107

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 107

Ala Ala Ala Ala Ala Gly

1 5

<210> 108

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 108

Leu Cys Gly Ala Ala Ile

1 5

<210> 109

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 109

Phe Ala Gln Ala Leu Gly

1 5

<210> 110

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 110

Leu Leu Gln Ala Asn Pro

1 5

<210> 111

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 111

Leu Ala Ala Ala Asn Pro

1 5

<210> 112

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 112

Leu Tyr Gly Ala Gln Phe

1 5

<210> 113

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 113

Leu Ser Gln Ala Gln Gly

1 5

<210> 114

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 114

Ala Ser Ala Ala Ser Gly

1 5

<210> 115

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 115

Phe Leu Gly Ala Ser Leu

1 5

<210> 116

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 116

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly

1 5

<210> 117

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 117

Leu Ala Gln Ala Thr Gly

1 5

<210> 118

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 118

Gly Ala Gly Ser Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 119

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 119

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly

1 5

<210> 120

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 120

Glu Ala Gln Gly Asp Lys Ile Ile

1 5

<210> 121

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 121

Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro

1 5

<210> 122

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 122

Tyr Val Ala Asp Ala Pro Lys

1 5

<210> 123

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 123

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 124

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 124

Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 125

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 125

Gly Gln Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu

1 5 10

<210> 126

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 126

Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp

1 5

<210> 127

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 127

Arg Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu

1 5 10

<210> 128

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 128

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala

1 5 10 15

<210> 129

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 129

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Arg Gly Asp Asp Ala

1 5 10 15

<210> 130

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 130

Ile Glu Gly Arg

1

<210> 131

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 131

Ile Asp Gly Arg

1

<210> 132

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 132

Gly Gly Ser Ile Asp Gly Arg

1 5

<210> 133

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 133

Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln

1 5

<210> 134

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 134

Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala

1 5

<210> 135

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 135

Gly Ile Ala Gly Gln

1 5

<210> 136

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 136

Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly

1 5

<210> 137

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 137

Gly Pro Glu Gly Leu Arg Val Gly

1 5

<210> 138

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 138

Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Val Val

1 5

<210> 139

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 139

Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Arg

1 5

<210> 140

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 140

Ala Gly Leu Gly Ile Ser Ser Thr

1 5

<210> 141

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 141

Glu Pro Gln Ala Leu Ala Met Ser

1 5

<210> 142

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 142

Gln Ala Leu Ala Met Ser Ala Ile

1 5

<210> 143

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 143

Ala Ala Tyr His Leu Val Ser Gln

1 5

<210> 144

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 144

Met Asp Ala Phe Leu Glu Ser Ser

1 5

<210> 145

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 145

Glu Ser Leu Pro Val Val Ala Val

1 5

<210> 146

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 146

Ser Ala Pro Ala Val Glu Ser Glu

1 5

<210> 147

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 147

Asp Val Ala Gln Phe Val Leu Thr

1 5

<210> 148

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 148

Val Ala Gln Phe Val Leu Thr Glu

1 5

<210> 149

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 149

Ala Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly

1 5

<210> 150

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 150

Pro Val Gln Pro Ile Gly Pro Gln

1 5

<210> 151

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 151

Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5

<210> 152

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 152

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Asp Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Ala

210

<210> 153

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 153

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala

100 105

<210> 154

<211> 464

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 154

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ser Ile Ser

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asn Ser Met Lys

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Thr Lys Phe Pro Trp Ser Thr Asp Trp Asp Ser Arg Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn

115 120 125

His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 155

<211> 464

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 155

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ser Ile Ser

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asn Ser Met Lys

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Thr Lys Phe Pro Trp Ser Thr Asp Trp Asp Ser Arg Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn

115 120 125

His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 156

<211> 464

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 156

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ser Ile Ser

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asn Ser Met Lys

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Thr Lys Phe Pro Trp Ser Thr Asp Trp Asn Ala Arg Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn

115 120 125

His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 157

<211> 464

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 157

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ser Ile Ser

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ala Ser Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Thr Lys Phe Pro Trp Ser Thr Asp Trp Asn Ala Arg Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn

115 120 125

His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 158

<211> 464

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 158

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ser Ile Ser

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ala Ser Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Tyr Ala Glu Asn Thr Val Phe Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Thr Lys Phe Pro Trp Ser Thr Asp Trp Asn Ala Arg Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn

115 120 125

His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 159

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 159

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Asp Phe Asp Ser Tyr

20 25 30

Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Asn Met Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 160

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 160

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Arg Gly Tyr

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Val Trp Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Ile Arg Pro Tyr Ile Phe Lys Ile Ala Gly Gln Tyr Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 161

<211> 354

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 161

Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

20 25 30

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

35 40 45

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

50 55 60

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

65 70 75 80

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

85 90 95

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

100 105 110

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe

130 135 140

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

145 150 155 160

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

165 170 175

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

180 185 190

Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

195 200 205

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

210 215 220

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

225 230 235 240

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

245 250 255

Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly

260 265 270

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

275 280 285

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

290 295 300

Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

305 310 315 320

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

325 330 335

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

340 345 350

Asp Lys

<210> 162

<211> 629

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 162

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Asp Phe Asp Ser Tyr

20 25 30

Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Asn Met Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

165 170 175

Gly Arg Thr Tyr Arg Gly Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro

180 185 190

Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Val Trp Ser Gly Gly Asn

195 200 205

Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

210 215 220

Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu

225 230 235 240

Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Ile Arg Pro Tyr Ile Phe

245 250 255

Lys Ile Ala Gly Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

260 265 270

Val Ser Ser Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser

275 280 285

Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

290 295 300

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

305 310 315 320

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

325 330 335

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

340 345 350

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

355 360 365

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

385 390 395 400

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val

405 410 415

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

420 425 430

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

435 440 445

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

450 455 460

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

465 470 475 480

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

485 490 495

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

500 505 510

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

515 520 525

Pro Ser Arg Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

530 535 540

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

545 550 555 560

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

565 570 575

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

580 585 590

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

595 600 605

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp Tyr Lys

610 615 620

Asp Asp Asp Asp Lys

625

<210> 163

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 163

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys

85 90 95

Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 164

<211> 631

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 164

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys

85 90 95

Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

145 150 155 160

Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

165 170 175

Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Arg Gly Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln

180 185 190

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Val Trp Ser Gly

195 200 205

Gly Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

210 215 220

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys

225 230 235 240

Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Ile Arg Pro Tyr

245 250 255

Ile Phe Lys Ile Ala Gly Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

260 265 270

Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

275 280 285

Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

290 295 300

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

305 310 315 320

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

325 330 335

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

340 345 350

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

355 360 365

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

370 375 380

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

385 390 395 400

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro

405 410 415

Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

420 425 430

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

435 440 445

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

450 455 460

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val

465 470 475 480

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

485 490 495

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

500 505 510

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

515 520 525

Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

530 535 540

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

545 550 555 560

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

565 570 575

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

580 585 590

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

595 600 605

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp

610 615 620

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

625 630

<210> 165

<211> 468

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 165

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Gly Ala Gly Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly Ala Gly Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro

465

<210> 166

<211> 230

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 166

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro

225 230

<210> 167

<211> 455

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 167

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

130 135 140

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

210 215 220

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 235 240

Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

245 250 255

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

260 265 270

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

275 280 285

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

290 295 300

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315 320

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

325 330 335

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

340 345 350

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

355 360 365

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375 380

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

405 410 415

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

420 425 430

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455

<210> 168

<400> 168

000

<210> 169

<400> 169

000

<210> 170

<400> 170

000

<210> 171

<400> 171

000

<210> 172

<400> 172

000

<210> 173

<400> 173

000

<210> 174

<400> 174

000

<210> 175

<400> 175

000

<210> 176

<400> 176

000

<210> 177

<400> 177

000

<210> 178

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 178

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 10

<210> 179

<400> 179

000

<210> 180

<400> 180

000

<210> 181

<400> 181

000

<210> 182

<400> 182

000

<210> 183

<400> 183

000

<210> 184

<400> 184

000

<210> 185

<400> 185

000

<210> 186

<400> 186

000

<210> 187

<400> 187

000

<210> 188

<400> 188

000

<210> 189

<211> 467

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 189

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

340 345 350

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro

465

<210> 190

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 190

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu

100 105 110

Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 191

<211> 455

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 191

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu

100 105 110

Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

130 135 140

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

210 215 220

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 235 240

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

245 250 255

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

260 265 270

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

275 280 285

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

290 295 300

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315 320

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

325 330 335

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

340 345 350

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

355 360 365

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375 380

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

405 410 415

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

420 425 430

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455

<210> 192

<211> 455

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 192

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu

100 105 110

Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

130 135 140

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

210 215 220

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 235 240

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

245 250 255

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

260 265 270

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

275 280 285

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

290 295 300

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315 320

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

325 330 335

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

340 345 350

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

355 360 365

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375 380

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

405 410 415

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

420 425 430

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455

<210> 193

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 193

Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 194

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 194

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 195

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 195

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly

1 5 10 15

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser

20

<210> 196

<211> 471

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 196

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

145 150 155 160

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

165 170 175

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

180 185 190

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

195 200 205

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

210 215 220

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

225 230 235 240

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

245 250 255

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

260 265 270

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

275 280 285

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

290 295 300

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

305 310 315 320

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

325 330 335

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

340 345 350

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

355 360 365

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

370 375 380

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

385 390 395 400

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

405 410 415

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

420 425 430

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

435 440 445

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

450 455 460

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470

<210> 197

<211> 473

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 197

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

145 150 155 160

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

165 170 175

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

180 185 190

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

195 200 205

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

210 215 220

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

225 230 235 240

Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

245 250 255

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

325 330 335

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

340 345 350

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

355 360 365

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

370 375 380

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

385 390 395 400

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

405 410 415

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

435 440 445

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470

<210> 198

<211> 478

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 198

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly

130 135 140

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

145 150 155 160

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

165 170 175

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

180 185 190

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

195 200 205

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

210 215 220

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

225 230 235 240

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

245 250 255

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

260 265 270

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

275 280 285

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

290 295 300

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

305 310 315 320

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

340 345 350

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

355 360 365

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

370 375 380

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

385 390 395 400

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

420 425 430

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

435 440 445

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

450 455 460

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470 475

<210> 199

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 199

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 200

<211> 1267

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 200

Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Pro Met Val Trp Ala Glu Ala Gly Leu Pro Arg Ala Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Gln Pro Pro Phe Arg Thr Phe Ser Ala Ser Asp Trp Gly Leu Thr His

35 40 45

Leu Val Val His Glu Gln Thr Gly Glu Val Tyr Val Gly Ala Val Asn

50 55 60

Arg Ile Tyr Lys Leu Ser Gly Asn Leu Thr Leu Leu Arg Ala His Val

65 70 75 80

Thr Gly Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Cys Tyr Pro Pro Pro Ser Val

85 90 95

Gln Ser Cys Pro His Gly Leu Gly Ser Thr Asp Asn Val Asn Lys Leu

100 105 110

Leu Leu Leu Asp Tyr Ala Ala Asn Arg Leu Leu Ala Cys Gly Ser Ala

115 120 125

Ser Gln Gly Ile Cys Gln Phe Leu Arg Leu Asp Asp Leu Phe Lys Leu

130 135 140

Gly Glu Pro His His Arg Lys Glu His Tyr Leu Ser Ser Val Gln Glu

145 150 155 160

Ala Gly Ser Met Ala Gly Val Leu Ile Ala Gly Pro Pro Gly Gln Gly

165 170 175

Gln Ala Lys Leu Phe Val Gly Thr Pro Ile Asp Gly Lys Ser Glu Tyr

180 185 190

Phe Pro Thr Leu Ser Ser Arg Arg Leu Met Ala Asn Glu Glu Asp Ala

195 200 205

Asp Met Phe Gly Phe Val Tyr Gln Asp Glu Phe Val Ser Ser Gln Leu

210 215 220

Lys Ile Pro Ser Asp Thr Leu Ser Lys Phe Pro Ala Phe Asp Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Val Tyr Ser Phe Arg Ser Glu Gln Phe Val Tyr Tyr Leu Thr Leu

245 250 255

Gln Leu Asp Thr Gln Leu Thr Ser Pro Asp Ala Ala Gly Glu His Phe

260 265 270

Phe Thr Ser Lys Ile Val Arg Leu Cys Val Asp Asp Pro Lys Phe Tyr

275 280 285

Ser Tyr Val Glu Phe Pro Ile Gly Cys Glu Gln Ala Gly Val Glu Tyr

290 295 300

Arg Leu Val Gln Asp Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Gly Arg Ala Leu Ala

305 310 315 320

His Gln Leu Gly Leu Ala Glu Asp Glu Asp Val Leu Phe Thr Val Phe

325 330 335

Ala Gln Gly Gln Lys Asn Arg Val Lys Pro Pro Lys Glu Ser Ala Leu

340 345 350

Cys Leu Phe Thr Leu Arg Ala Ile Lys Glu Lys Ile Lys Glu Arg Ile

355 360 365

Gln Ser Cys Tyr Arg Gly Glu Gly Lys Leu Ser Leu Pro Trp Leu Leu

370 375 380

Asn Lys Glu Leu Gly Cys Ile Asn Ser Pro Leu Gln Ile Asp Asp Asp

385 390 395 400

Phe Cys Gly Gln Asp Phe Asn Gln Pro Leu Gly Gly Thr Val Thr Ile

405 410 415

Glu Gly Thr Pro Leu Phe Val Asp Lys Asp Asp Gly Leu Thr Ala Val

420 425 430

Ala Ala Tyr Asp Tyr Arg Gly Arg Thr Val Val Phe Ala Gly Thr Arg

435 440 445

Ser Gly Arg Ile Arg Lys Ile Leu Val Asp Leu Ser Asn Pro Gly Gly

450 455 460

Arg Pro Ala Leu Ala Tyr Glu Ser Val Val Ala Gln Glu Gly Ser Pro

465 470 475 480

Ile Leu Arg Asp Leu Val Leu Ser Pro Asn His Gln Tyr Leu Tyr Ala

485 490 495

Met Thr Glu Lys Gln Val Thr Arg Val Pro Val Glu Ser Cys Val Gln

500 505 510

Tyr Thr Ser Cys Glu Leu Cys Leu Gly Ser Arg Asp Pro His Cys Gly

515 520 525

Trp Cys Val Leu His Ser Ile Cys Ser Arg Arg Asp Ala Cys Glu Arg

530 535 540

Ala Asp Glu Pro Gln Arg Phe Ala Ala Asp Leu Leu Gln Cys Val Gln

545 550 555 560

Leu Thr Val Gln Pro Arg Asn Val Ser Val Thr Met Ser Gln Val Pro

565 570 575

Leu Val Leu Gln Ala Trp Asn Val Pro Asp Leu Ser Ala Gly Val Asn

580 585 590

Cys Ser Phe Glu Asp Phe Thr Glu Ser Glu Ser Val Leu Glu Asp Gly

595 600 605

Arg Ile His Cys Arg Ser Pro Ser Ala Arg Glu Val Ala Pro Ile Thr

610 615 620

Arg Gly Gln Gly Asp Gln Arg Val Val Lys Leu Tyr Leu Lys Ser Lys

625 630 635 640

Glu Thr Gly Lys Lys Phe Ala Ser Val Asp Phe Val Phe Tyr Asn Cys

645 650 655

Ser Val His Gln Ser Cys Leu Ser Cys Val Asn Gly Ser Phe Pro Cys

660 665 670

His Trp Cys Lys Tyr Arg His Val Cys Thr His Asn Val Ala Asp Cys

675 680 685

Ala Phe Leu Glu Gly Arg Val Asn Val Ser Glu Asp Cys Pro Gln Ile

690 695 700

Leu Pro Ser Thr Gln Ile Tyr Val Pro Val Gly Val Val Lys Pro Ile

705 710 715 720

Thr Leu Ala Ala Arg Asn Leu Pro Gln Pro Gln Ser Gly Gln Arg Gly

725 730 735

Tyr Glu Cys Leu Phe His Ile Pro Gly Ser Pro Ala Arg Val Thr Ala

740 745 750

Leu Arg Phe Asn Ser Ser Ser Leu Gln Cys Gln Asn Ser Ser Tyr Ser

755 760 765

Tyr Glu Gly Asn Asp Val Ser Asp Leu Pro Val Asn Leu Ser Val Val

770 775 780

Trp Asn Gly Asn Phe Val Ile Asp Asn Pro Gln Asn Ile Gln Ala His

785 790 795 800

Leu Tyr Lys Cys Pro Ala Leu Arg Glu Ser Cys Gly Leu Cys Leu Lys

805 810 815

Ala Asp Pro Arg Phe Glu Cys Gly Trp Cys Val Ala Glu Arg Arg Cys

820 825 830

Ser Leu Arg His His Cys Ala Ala Asp Thr Pro Ala Ser Trp Met His

835 840 845

Ala Arg His Gly Ser Ser Arg Cys Thr Asp Pro Lys Ile Leu Lys Leu

850 855 860

Ser Pro Glu Thr Gly Pro Arg Gln Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Thr

865 870 875 880

Gly Glu Asn Leu Gly Leu Arg Phe Glu Asp Val Arg Leu Gly Val Arg

885 890 895

Val Gly Lys Val Leu Cys Ser Pro Val Glu Ser Glu Tyr Ile Ser Ala

900 905 910

Glu Gln Ile Val Cys Glu Ile Gly Asp Ala Ser Ser Val Arg Ala His

915 920 925

Asp Ala Leu Val Glu Val Cys Val Arg Asp Cys Ser Pro His Tyr Arg

930 935 940

Ala Leu Ser Pro Lys Arg Phe Thr Phe Val Thr Pro Thr Phe Tyr Arg

945 950 955 960

Val Ser Pro Ser Arg Gly Pro Leu Ser Gly Gly Thr Trp Ile Gly Ile

965 970 975

Glu Gly Ser His Leu Asn Ala Gly Ser Asp Val Ala Val Ser Val Gly

980 985 990

Gly Arg Pro Cys Ser Phe Ser Trp Arg Asn Ser Arg Glu Ile Arg Cys

995 1000 1005

Leu Thr Pro Pro Gly Gln Ser Pro Gly Ser Ala Pro Ile Ile Ile

1010 1015 1020

Asn Ile Asn Arg Ala Gln Leu Thr Asn Pro Glu Val Lys Tyr Asn

1025 1030 1035

Tyr Thr Glu Asp Pro Thr Ile Leu Arg Ile Asp Pro Glu Trp Ser

1040 1045 1050

Ile Asn Ser Gly Gly Thr Leu Leu Thr Val Thr Gly Thr Asn Leu

1055 1060 1065

Ala Thr Val Arg Glu Pro Arg Ile Arg Ala Lys Tyr Gly Gly Ile

1070 1075 1080

Glu Arg Glu Asn Gly Cys Leu Val Tyr Asn Asp Thr Thr Met Val

1085 1090 1095

Cys Arg Ala Pro Ser Val Ala Asn Pro Val Arg Ser Pro Pro Glu

1100 1105 1110

Leu Gly Glu Arg Pro Asp Glu Leu Gly Phe Val Met Asp Asn Val

1115 1120 1125

Arg Ser Leu Leu Val Leu Asn Ser Thr Ser Phe Leu Tyr Tyr Pro

1130 1135 1140

Asp Pro Val Leu Glu Pro Leu Ser Pro Thr Gly Leu Leu Glu Leu

1145 1150 1155

Lys Pro Ser Ser Pro Leu Ile Leu Lys Gly Arg Asn Leu Leu Pro

1160 1165 1170

Pro Ala Pro Gly Asn Ser Arg Leu Asn Tyr Thr Val Leu Ile Gly

1175 1180 1185

Ser Thr Pro Cys Thr Leu Thr Val Ser Glu Thr Gln Leu Leu Cys

1190 1195 1200

Glu Ala Pro Asn Leu Thr Gly Gln His Lys Val Thr Val Arg Ala

1205 1210 1215

Gly Gly Phe Glu Phe Ser Pro Gly Thr Leu Gln Val Tyr Ser Asp

1220 1225 1230

Ser Leu Leu Thr Leu Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly

1235 1240 1245

Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile

1250 1255 1260

Glu Trp His Glu

1265

<210> 201

<211> 347

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 201

Met Val Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ile His Thr Met Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Met Leu Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Lys Asp Asn Thr Val

20 25 30

Pro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala Asn Gly Glu Phe His Ser Gly

35 40 45

Glu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met Ser Arg Ala Ala Ile Asn Lys

50 55 60

His Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly Val Asp Val Phe Thr Val Pro

65 70 75 80

Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro Ile Gln Leu Leu Asn Ala Lys

85 90 95

Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly Ser Val Ala Val Leu Pro Val

100 105 110

Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu Asp Arg Ile Gly Glu Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Asp Ala Cys Ile Ala Glu Tyr Gln Gln Ala Gly Arg Gly Arg

130 135 140

Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly Ala Asn Leu Tyr Leu Ser

145 150 155 160

Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala Ala Ala Ile Gly Leu Ser

165 170 175

Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val Leu Arg Lys Leu Gly Ala

180 185 190

Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp Leu Tyr Leu Gln Asp Arg

195 200 205

Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr Gly Lys Thr Gly Asp Ala

210 215 220

Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn Met Ala Met Arg Arg Val

225 230 235 240

Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile Thr Leu Gln Glu Ala Gly

245 250 255

Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala Met Leu Ile Arg Glu Leu

260 265 270

Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu Gly Leu Ala Pro Tyr Leu

275 280 285

Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile Asn Arg Pro Val Lys Leu

290 295 300

Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile Ser Arg Gly Ile Asp Lys

305 310 315 320

Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly Ile Ile Lys Pro Trp Met

325 330 335

Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu Lys

340 345

<210> 202

<211> 463

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 202

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

145 150 155 160

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

165 170 175

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

180 185 190

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

210 215 220

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

225 230 235 240

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

370 375 380

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 203

<211> 465

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 203

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Gly Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro

465

<210> 204

<211> 461

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 204

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Pro Leu Gly Leu Trp Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

130 135 140

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

145 150 155 160

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

165 170 175

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

180 185 190

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

195 200 205

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

210 215 220

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

225 230 235 240

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

260 265 270

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

275 280 285

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

305 310 315 320

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

325 330 335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

355 360 365

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

370 375 380

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

385 390 395 400

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

420 425 430

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 205

<211> 463

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 205

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

145 150 155 160

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

165 170 175

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

180 185 190

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

210 215 220

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

225 230 235 240

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

370 375 380

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

<210> 206

<211> 468

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 206

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly Ala Gly Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro

465

<210> 207

<211> 471

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> an artificially synthesized sequence

<400> 207

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Gly Ala Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val Ala Gly

130 135 140

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

145 150 155 160

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

165 170 175

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

180 185 190

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

195 200 205

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

210 215 220

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

225 230 235 240

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

245 250 255

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

260 265 270

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

275 280 285

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

290 295 300

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

305 310 315 320

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

325 330 335

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

340 345 350

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

355 360 365

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

370 375 380

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

385 390 395 400

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

405 410 415

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

420 425 430

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

435 440 445

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

450 455 460

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к активируемым протеазой полипептидам, и может быть использовано для их рекомбинантного получения. Предложен специфичный для ткани-мишени полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен, сайт расщепления и транспортирующий фрагмент, где транспортирующий фрагмент содержит константную область и ингибирующий домен, который ингибирует антигенсвязывающую активность антитела, и где антигенсвязывающий домен имеет более короткое время полужизни в крови по сравнению с транспортирующим фрагментом, в котором сайт расщепления содержит расщепляемую протеазой последовательность, которая расщепляется специфичной для ткани-мишени протеазой, в котором сайт расщепления расположен вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела. Изобретение обеспечивает получение специфичного для ткани-мишени полипептида, в котором сайт расщепления расщепляется так, что антигенсвязывающий домен способен высвобождаться из полипептида и/или ассоциация ингибирующего домена и антигенсвязывающего домена разрушается, в котором высвобождающийся антигенсвязывающий домен имеет более высокую антигенсвязывающую активность, чем до высвобождения. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 37 ил., 5 табл., 14 пр.

1. Специфичный для ткани-мишени полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен, сайт расщепления и транспортирующий фрагмент, где транспортирующий фрагмент содержит константную область и ингибирующий домен, который ингибирует антигенсвязывающую активность антитела, и где антигенсвязывающий домен имеет более короткое время полужизни в крови по сравнению с транспортирующим фрагментом, в котором сайт расщепления содержит расщепляемую протеазой последовательность, которая расщепляется специфичной для ткани-мишени протеазой, в котором сайт расщепления расположен вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела, в котором сайт расщепления расщепляется так, что антигенсвязывающий домен способен высвобождаться из полипептида и/или ассоциация ингибирующего домена и антигенсвязывающего домена разрушается, в котором высвобождающийся антигенсвязывающий домен имеет более высокую антигенсвязывающую активность, чем до высвобождения.

2. Полипептид по п. 1, в котором ингибирующий домен транспортирующего фрагмента образует ассоциацию с антигенсвязывающим доменом и тем самым ингибирует антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена.

3. Полипептид по п. 1, в котором антигенсвязывающий домен содержит однодоменное антитело или представляет собой однодоменное антитело, в котором ингибирующий домен транспортирующего фрагмента ингибирует антигенсвязывающую активность однодоменного антитела.

4. Полипептид по п. 1, в котором антигенсвязывающий домен содержит однодоменное антитело, и ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VHH, VH антитела или VL антитела, в котором антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется с помощью VHH, VH антитела или VL антитела.

5. Полипептид по п. 1, в котором (i) молекулярный вес антигенсвязывающего домена составляет 60 кДа или менее, (ii) молекулярный вес антигенсвязывающего домена меньше молекулярного веса транспортирующего фрагмента, (iii) транспортирующий фрагмент обладает FcRn связывающей активностью или (iv) антигенсвязывающий домен не обладает FcRn связывающей активностью или обладает более слабой FcRn связывающей активностью по сравнению с транспортирующим фрагментом.

6. Полипептид по п. 1, в котором константная область антитела содержит константную область антитела IgG.

7. Полипептид по п. 1, в котором антигенсвязывающий домен является антигенсвязывающим доменом, направленным против плексина A1, IL6R или CD3 в качестве антигена-мишени.

8. Полипептид по п. 4, в котором

(i) антигенсвязывающий домен содержит VHH или VH антитело, имеющее антигенсвязывающую активность, и ингибирующий домен является VL антитела, и в котором антигенсвязывающая активность VHH или VH антитела, имеющего антигенсвязывающую активность, ингибируется его ассоциацией с VL антитела; или

(ii) антигенсвязывающий домен содержит VL, имеющую антигенсвязывающую активность, и ингибирующий домен является VHH или VH антителом, и в котором антигенсвязывающая активность VL, имеющей антигенсвязывающую активность, ингибируется его ассоциацией с VHH или VH антителом.

9. Полипептид по п. 4, в котором антигенсвязывающий домен включает VH, имеющую антигенсвязывающую активность, или VHH, и последовательность, расщепляемая протеазой, расположена в любом положении между аминокислотой 109 (по нумерации Кабат) антигенсвязывающего домена однодоменного антитела и аминокислотой 122 (нумерация EU) константной области тяжелой цепи антитела.

10. Полипептид по п. 4, в котором антигенсвязывающий домен включает VL, имеющую антигенсвязывающую активность, и последовательность, расщепляемая протеазой, расположена в любом положении между аминокислотой 104 (по нумерации Кабат) антигенсвязывающего домена однодоменного антитела и аминокислотой 122 (нумерация EU) константной области тяжелой цепи антитела.

11. Способ получения активируемого протеазой полипептида, включающий этапы трансформации клетки-хозяина вектором экспрессии, в который встроен полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 1-10, культивирование трансформированной клетки-хозяина и выделение целевого полипептида.

название	год	авторы	номер документа
ПОЛИПЕПТИД, ВКЛЮЧАЮЩИЙ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН И ТРАНСПОРТИРУЮЩИЙ СЕГМЕНТ	2018	Игава Томоюки Исикава Хироюки Хиронива Наока Кава Тацуя	RU2815452C2
МОНОВАЛЕНТНЫЕ АНТИТЕЛА К ПРОПЕРДИНУ И ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ	2018	Шеридан, Дуглас Л. Тамбурини, Пол П. Мак, Танейша Энн-Танара Фегтли, Вальтер К.	RU2790103C2
ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПОЛИПЕПТИДНЫЕ КОНСТРУКЦИИ, ОБЛАДАЮЩИЕ ОГРАНИЧЕННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ С СD3, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2018	Экельман, Брендан П. Каплан, Майкл Д. Виллис, Кетлин М. Деверо, Куинн Тиммер, Джон К.	RU2813816C2
МОЛЕКУЛЫ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА СИСТЕМУ СЕКРЕЦИИ ТИПА III	2016	Холландс, Эндрю Тиммер, Джон К. Деверо, Куинн Экельман, Брендан П.	RU2759949C2
ПОЛИВАЛЕНТНЫЕ И ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ОХ40-СВЯЗЫВАЮЩИЕ СЛИТЫЕ БЕЛКИ	2017	Экельман Брендан П. Тиммер Джон К. Хата Челси Джонс Кайл С. Хуссейн Абрахим Разаи Амир С. Беклунд Брайан Пандит Раджай Каплан Майк Рэскон Лукас Деверо Куинн	RU2773052C2
ИММУНОГЛОБУЛИНЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ АГГРЕКАН	2018	Стеффенсен, Сорен Бесте, Геральд Херманс, Гай Гюринг, Ханс Ладель, Кристоф Толайкис, Ларс	RU2771818C2
АКТИВИРУЕМЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ ИНТЕРЛЕЙКИНА 12 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2019	Уинстон, Уилльям Хиклин, Дэниэл Бхаскар, Винай Эвнин, Люк Баеуерле, Патрик Салмерон Гарсия, Хосе Андрес Бродкин, Хизер Веше, Холгер Линь, Шоуэнь Джек Сейдел-Дуган, Синтия	RU2826183C2
ИММУНОЦИТОКИНЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2021	Ву Эллен Ву Сяоюнь Уэйкфилд Джон	RU2818371C1
ОДНОДОМЕННЫЕ АНТИТЕЛА, НАПРАВЛЕННЫЕ ПРОТИВ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ АНТИГЕНОВ	2015	Сингх Сунанда	RU2810002C2
ИНДУЦИБЕЛЬНЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ	2017	Баюерле, Патрик Дьюбридж, Роберт, Б. Веше, Хольгер Ивнин, Льюк Гено, Жанмари Панчал, Ананд Виноградова, Майя	RU2800034C2

WO 2014052462 A2, 03.04.2014
WO 2010081173 A2, 15.07.2010
WO 2013128194 A1, 06.09.2013
ERSTER O
et al
Site-specific targeting of antibody activity mediated by disease-associated proteases, Journal Of Controlled Release, 2012, v.161, n.3, p.804-812
WO 2010115998 А2, 14.10.2010
ИММУНОКОНЪЮГАТЫ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ	2010	Ральф Хоссе Эккехард Мёсснер Микела Силаччи-Мелькко Пабло Умана	RU2583876C2
РОЙТ А
и др
Иммунология, М: Мир,

ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН И ТРАНСПОРТИРУЮЩИЙ СЕГМЕНТ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/00 C07K16/28 C07K19/00 C12P21/00

Описание патента на изобретение RU2827545C2

Похожие патенты RU2827545C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 827 545 C2

Реферат патента 2024 года ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН И ТРАНСПОРТИРУЮЩИЙ СЕГМЕНТ

Формула изобретения RU 2 827 545 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2827545C2

RU 2 827 545 C2