ТРАНСГЕННЫЙ ОБЪЕКТ ПШЕНИЦЫ IND-∅∅412-7 Российский патент 2025 года по МПК C12N15/82 C07K14/415 A01H5/10 A01G22/20 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к области получения, разведения и сельскохозяйственного использования растений. Более конкретно, оно относится к трансгенному объекту пшеницы IND-∅∅412-7, к нуклеотидным последовательностям, растениям, частям растений, семенам, клеткам, сельскохозяйственным продуктам, и к способам детекции и получения, связанным с трансгенным объектом пшеницы IND-∅∅412-7.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ДЛЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Улучшение урожайности культур и их характеристик стало необходимым для удовлетворения спроса на продовольствие. Благодаря биотехнологическим разработкам в сочетании с сельскохозяйственным использованием, разработаны новые сельскохозяйственные культуры со способностью адаптации к разнообразным условиям внешней среды и/или экологическим условиям.

Во время роста, растения подвергаются воздействию множества абиотических стрессов: засухи, засоления, высоких и низких температур, избыточной радиации, низкой доступности питательных веществ, уплотнения почвы, предотвращающего развитие корней, и т.д. (Duque et al., 2013; Sayed, 2003). Все из них могут влиять в некоторой точке на рост и развитие растения, так же как на урожайность. Разумно предполагать, что любой из этих факторов внешней среды может встретиться в ходе жизненных циклов сельскохозяйственной культуры в поле. В этом случае, запускаются комплексные механизмы ответа, которые впоследствии могут отражаться на проводимых измерениях, поскольку их получают в результате накопления таких эффектов стресса.

Один из наиболее общеупотребительных способов смягчения отрицательных эффектов на сельскохозяйственные культуры основан на трансгенных объектах, т.е., вставке представляющих интерес генов в геном сельскохозяйственной культуры-мишени. Однако, получение и отбор коммерчески пригодного трансгенного объекта требует обширных исследования, анализа и характеризации большого количества индивидуальных объектов трансформации. Это делает возможным отбор объекта, содержащего желательный признак, возможным разработку фенотипических и сельскохозяйственных характеристик, необходимых для такого объекта, чтобы являться пригодным для коммерческих целей, без отрицательного эффекта на другие признаки сельскохозяйственной культуры.

Этот способ требует получения трансгенных объектов, которые можно молекулярно и фенотипически характеризовать, для идентификации и отбора объекта, экспрессирующего представляющий интерес гетерологичный ген, с учетом желательного фенотипа, подлежащего получению.

Отбор объекта подразумевает стадии лабораторной разработки, так же как тесты, проводимые в контролируемых условиях или в поле и/или в теплицах. Является необходимым анализировать ответ на объект на протяжении нескольких лет, во множестве локализаций и в множестве условий внешней среды, чтобы отобрать объект, соответствующее требуемым фенотипическим и генетическим характеристикам, так же как требуемым коммерческим признакам.

Настоящее изобретение относится к этому типу коммерчески пригодного объекта, обеспечивающего новые преимущественные признаки у пшеницы.

Существует широкое множество генов, которые можно использовать для получения коммерчески пригодного объекта. Ген, экспрессия которого представляет особенный интерес, представляет собой ген, который кодирует фактор транскрипции HAHB4.

HAHB4 (который обозначает гомеобокс-4 Helianthus annuus (Helianthus Annuus Homeobox-4)) представляет собой фактор транскрипции подсолнечника, принадлежащий к семейству HD-Zip. Экспрессия гена HaHB4 регулируется на уровне транскрипции посредством наружных факторов внешней среды, таких как доступность воды и засоление почвы, так же как фитогормонов, связанных с этими факторами, абсцизовой кислоты и этилена.

В патенте AR81216B2 описан ген HaHB4, индуцируемый недостатком воды и абсцизовой кислотой, и кодирующий фактор транскрипции подсолнечника типа HD-Zip. В этом патенте также описаны выделение и характеризация гена, и его введение в модельное растение Arabidopsis thaliana. Однако, в нем не опубликованы ни трансгенные растения, представляющие коммерческий интерес, несущие объект по настоящему изобретению, ни их преимущественные свойства, в отношении сопутствующих абиотических стрессов, которые встречаются в сельскохозяйственных условиях.

В патенте AR81216B2 отсутствует также упоминание, относящееся к конкретному отбору объекта, экспрессирующего ген HaHB4, чтобы сохранять основной представляющий интерес признак, т.е., засухоустойчивость, без влияния на другие сельскохозяйственные признаки.

Кроме того, в патентной заявке AR090110A1 описан модифицированный ген HaHB4, в частности HaHB4.2, индуцируемый недостатком воды и абсцизовой кислотой, и кодирующий модифицированный фактор транскрипции подсолнечника типа HD-Zip, в частности, mod1HaHB4. В этой публикации описано получение и характеризация экспрессирующих модифицированный HaHB4.2 конструкций, и их введение в модельное растение Arabidopsis thaliana. В общих чертах, в этой публикации описано также получение и отбор трансгенных объектов сои, пшеницы и кукурузы, содержащих ген HaHB4.2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к растениям пшеницы, устойчивым к абиотическому стрессу, содержащим объект IND-∅∅412-7. Эти растения представляют преимущества для их роста в неблагоприятных условиях внешней среды, таким образом, обеспечивая более высокую урожайность.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к объекту пшеницы, названному IND-∅∅412-7, имеющему репрезентативное семя, зарегистрированное в Американской коллекции типовых культур (ATCC) под номером доступа PTA-126141, вместе с его потомством.

Настоящее изобретение также относится к растениям пшеницы, содержащим объект IND-∅∅412-7, представленный посредством последовательностей SEQ ID No.: 1 и SEQ ID No.: 2.

Трансгенная вставка, присутствующая в объекте по изобретению и в зарегистрированном семени, содержит ген селективного маркера bar и ген HaHB4, обеспечивающий толерантность к абиотическому стрессу. Ген bar, происходящий из Streptomyces hygroscopicus, кодирует белок PAT (фосфинотрицинацетилтрансферазу). Ген HaHB4 происходит из растения подсолнечника, вида Helianthus annuus, и кодирует белок типа HD-Zip I, имеющий белковый домен типа гомеодомена, ассоциированный с лейциновой молнией, который обеспечивает толерантность к абиотическому стрессу, в основном к засухе. Регуляцией представляющих интерес генов можно управлять посредством различных промоторных последовательностей с различными уровнями экспрессии, чувствительностью и тканеспецифичностью. Эксперту в данной области известно, что любой промотор или терминатор нуклеиновой кислоты, направляющий или регулирующий экспрессию представляющего интерес гена, можно использовать без влияния на сущность изобретения. В частности, объект, разработанный по настоящему изобретению, содержит промотор гена убиквитина 1 (prUBI-1) кукурузы и терминатор Tnos для гена bar, придающего устойчивость к гербициду глюфосинату аммония. Кроме того, объект снова содержит промотор гена убиквитина 1 кукурузы (prUBI-1) и терминатор Tnos для регуляции экспрессии кодирующей области HaHB4 (фигура 1 и фигура 2).

Другие аспекты изобретения относятся к потомству растений пшеницы, семенам и/или возобновляемым частям растений, где семена и потомство содержат объект пшеницы IND-∅∅412-7, так же как к пищевым продуктам для потребления человеком или животными, происходящим из них. Изобретение относится также к частям растений, содержащим объект IND-∅∅412-7, включая, без ограничения, пыльцу, семязачатки, цветы, побеги, корни, листья, клетки вегетативных ядер и другие клетки растений, содержащие объект IND-∅∅412-7. Изобретение также относится к растениям пшеницы, содержащим объект пшеницы IND-∅∅412-7, характеризующимся толерантностью к множеству абиотических стрессов, таких как засуха, засоление, низкие и высокие температуры, избыточная радиация, низкая доступность питательных веществ, уплотнение почвы и т.д., и различные комбинации этих факторов.

Настоящее изобретение частично относится к культивированию растений, толерантных к абиотическим стрессам. Кроме того, оно относится к новому объекту трансформации растения пшеницы, содержащему полинуклеотиды, как описано в настоящем описании, которые вставлены в специфические участки в геноме пшеницы, обеспечивающие специфические генетические и фенотипические признаки.

В некоторых вариантах осуществления, это объект/полинуклеотид может являться «пакетированным» с другими признаками, включая, например, агрономические признаки и толерантность к гербицидам и/или насекомым. Однако, настоящее изобретение относится к растениям, содержащим индивидуальное объект, как описано в настоящем описании.

Дополнительные признаки можно пакетировать в геноме растения или в том же самом локусе, что и объект IND-∅∅412-7, например, посредством скрещивания растений, ретрансформации трансгенного растения, содержащего объект IND-∅∅412-7, или добавления новых признаков посредством интеграции, нацеливаемой гомологичной рекомбинацией.

В одном варианте осуществления, настоящее изобретение включает два хромосомных участка пшеницы, локализованных на хромосоме 2. В некоторых вариантах осуществления, подвергаемые нацеливанию участки содержат гетерологичные нуклеиновые кислоты. Хромосомные участки пшеницы локализованы между фланкирующими последовательностями, определенными на фигуре 3 (SEQ ID No: 7, 8, 9 и 10).

В одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу получения трансгенных растений пшеницы, включающему вставку гетерологичной нуклеиновой кислоты в одном или нескольких специфических положениях в пределах хромосомы 2.

В частности, способ включает трансформацию клетки или культуры клеток с использованием последовательностей ДНК, описанных в SEQ ID No.: 1 и SEQ ID No.: 2, и регенерацию клетки стабильным способом для получения нового цельного растения.

Трансформацию этой клетки растения можно проводить посредством разнообразных способов, вне зависимости от того, физические ли они, вирусные или химические, включая, среди прочих, биобаллистику, электропорацию, бактериальную трансформацию или комбинацию этих способов. Все из них хорошо известны эксперту в данной области.

В частности, по настоящему изобретению используют генную пушку для проталкивания молекул плазмидной ДНК с представляющими интерес последовательностями (фигура 2), более точно, бомбардировки с использованием плазмид pIND4-HB4 и pIND4-BAR (фигура 1 и фигура 2; SEQ ID No: 3 и SEQ ID No: 4).

Кроме того, настоящее изобретение относится к тестам для детекции присутствия этого объекта в образце пшеницы. Тесты могут быть основаны на последовательности ДНК рекомбинантных конструкций, вставленных в геном пшеницы, и на геномных последовательностях, фланкирующих участок вставки. Настоящее изобретение относится к наборам и условиям, которые можно использовать для проведения тестов.

Таким образом, настоящее изобретение частично относится к клонированию и анализу последовательностей ДНК, принадлежащих ко всем вставкам или к их части, и к фланкирующим областям (в трансгенных линиях пшеницы). Эти последовательности являются уникальными. Можно получать специфические для объекта праймеры на основе этих вставок и на основе фланкирующих (и объединенных) последовательностей. Способом ПЦР доказано, что эти объекты можно идентифицировать посредством анализа ампликонов, полученных посредством этих групп специфических для объекта праймеров. Таким образом, эти и другие родственные способы можно использовать для идентификации линий пшеницы, содержащих объект по настоящему изобретению, однозначным образом.

Настоящее изобретение также относится к тестам анализа ПЦР. Эти тесты включают, среди прочего, количественную ПЦР с детекцией в реальном времени (qПЦР) или ПЦР с детекцией в конечной точке, для детекции объекта IND-∅∅412-7, ампликонов и их фрагментов.

Изобретение также относится к молекулам ДНК, содержащим достаточную часть непрерывной нуклеотидной последовательности из SEQ ID No.: 5 и SEQ ID No.: 6, чтобы она действовала в качестве ДНК-зонда, гибридизующегося в строгих условиях с молекулами ДНК, содержащими нуклеотидную последовательность выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.: 5 и SEQ ID No.: 6, и не гибридизующегося в строгих условиях с молекулой ДНК, не содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.: 5 и SEQ ID No.: 6.

В некоторых случаях, используемые зонды можно метить с использованием молекул, подающих поддающийся детекции сигнал. Примером таких молекул являются флуорохромы. То есть, олигонуклеотиды, представляющие флуорохромы на обоих концах и имеющие последовательность, комплементарную части фрагмента ДНК, подлежащего амплификации. Среди прочих, красители FAM, TET, HEX, JOE, CAL Fluor®, Quasar® и Pulsar®.

Настоящее изобретение относится также к паре молекул ДНК, состоящей из первой молекулы ДНК и второй молекулы ДНК, отличной от первой, в которой каждая из первой и второй молекул ДНК содержат достаточную часть непрерывных нуклеотидов из SEQ ID No.: 5 и SEQ ID No.: 6, чтобы она действовала в качестве ДНК-зондов при использовании в реакции амплификации с ДНК, происходящей из объекта IND-∅∅412-7, для получения диагностического ампликона ДНК для трансгенного объекта пшеницы IND-∅∅412-7 в образце.

Изобретение также относится к способу детекции присутствия ДНК, полученной из объекта IND-∅∅412-7, в образце. Способ включает сравнение образца с молекулами ДНК, используемыми в качестве зонда и праймеров, подвергание их воздействию одинаковых строгих условий гибридизации, и затем детекцию гибридизации ДНК-зонда с ДНК в амплифицированном образце с использованием специфических праймеров. Эта гибридизация указывает на присутствие ДНК, происходящей из трансгенного объекта пшеницы IND-∅∅412-7, в этом образце.

Изобретение, кроме того, относится к способу детекции присутствия молекулы ДНК, полученной из трансгенного объекта пшеницы IND-∅∅412-7, в образце, включающему получение ДНК, происходящей из этого образца, с помощью пары олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров, для получения реакции амплификации, достаточной для получения ампликона ДНК, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.: 5 и SEQ ID No.: 6, для детекции присутствия ампликона ДНК в реакции, где присутствие ампликона ДНК указывает на присутствие молекулы ДНК, происходящей из IND-∅∅412-7, в образце.

Кроме того, изобретение относится к набору для детекции ДНК, содержащему по меньшей мере одну молекулу ДНК с достаточным количеством непрерывных нуклеотидов из SEQ ID No.: 5 и SEQ ID No.: 6, чтобы она действовала в качестве праймера или специфического ДНК-зонда для детекции присутствия ДНК, происходящей из трансгенного объекта пшеницы IND-∅∅412-7, где детекция ДНК доказывает присутствие этого объекта в образце.

Изобретение также относится к растению пшеницы, семени, клетке или части этого растения, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.: 5 и SEQ ID No.: 6. Изобретение кроме того, относится к растению пшеницы, семени, клетке или части растения, толерантным к абиотическим стрессам. Кроме того, изобретение относится к растению пшеницы, семени, клетке или части растения, геном которых образует ампликон, содержащий молекулу ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.: 5 и SEQ ID No.: 6, при тестировании с использованием способа амплификации ДНК.

Изобретение, кроме того, относится к растению или семени пшеницы, где растение или семя пшеницы получено из трансгенного объекта пшеницы IND-∅∅412-7, или является гибридным или гетерозиготным, имеющим по меньшей мере одного родителя, происходящего из трансгенного объекта пшеницы IND-∅∅412-7.

Изобретение, кроме того, относится к неживому растительному материалу, содержащему рекомбинантную молекулу ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.: 5 и SEQ ID No.: 6.

Кроме того, изобретение относится к товарному продукту, полученному из трансгенного объекта пшеницы IND-∅∅412-7, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.: 5 и SEQ ID No.: 6, где детекция нуклеотидной последовательности в образце, происходящем из товарного продукта, определяет, что товарный продукт происходит из трансгенного объекта пшеницы IND-∅∅412.7. Изобретение, кроме того, относится к товарному продукту, выбранному из группы, состоящей из цельных или переработанных семян, муки крупного помола, муки, хлопьев, биоэтанола, биогаза или других биологических материалов, среди прочих. Изобретение также относится к способу получения товарного продукта посредством получения растения пшеницы или его части, содержащих трансгенный объект пшеницы IND-∅∅412-7, и к получению товарного продукта пшеницы из растения пшеницы или его части.

Изобретение относится к способу получения растения пшеницы, толерантного к абиотическим стрессам, посредством скрещивания растения с трансгенным объектом пшеницы IND-∅∅412-7, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.: 5 и SEQ ID No.: 6, с вторым растением пшеницы, для получения семян, сбора семян, образующихся в результате скрещивания, выращивания семян для получения множества растений-потомков, и отбора растения-потомка, толерантного к абиотическим стрессам.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1: Схемы плазмид pIND4-HB4 и pIND-Bar, используемых при получении IND-∅∅412-7. На схемах показаны CDS HaHB4 (слева) и bar (справа) с их регуляторными элементами и плазмидными остовами. prUbi-1: промоторная область гена Ubi-1 маиса. Экзон prUbi-1: первый экзон гена Ubi-1 маиса. Интрон prUbi-1: первый интрон гена Ubi-1 маиса. HaHB4: CDS HaHB4. Bar: CDS bar. Tnos: последовательность терминатора гена nos. Точка начала репликации pBR322: точка начала репликации ColE1. bla: ген bla.

Фиг. 2: Плазмидные последовательности и представляющие интерес последовательности.

Фиг. 3: Полученные последовательности точек стыка (JP), поддерживаемые прочтениями посредством illumina и PacBio, и посредством продуктов амплификации ПЦР, секвенированных по Сенгеру. Из JP, показаны полные полученные последовательности для пшеницы, в то время как только первые 100 п.о. для плазмиды. Числа представляют абсолютное положение последовательностей вставки.

Фиг. 4: Урожайность трансгенных линий (объектов) и родительского контроля (дикого типа) в шести полевых исследованиях, проведенных с 2009 до 2011 гг. Тонкие планки представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM).

Фиг. 5: Саузерн-блоты ДНК растения IND-∅∅412-7, расщепленной с использованием HindIII, BamHI и AseI. Блоты гибридизовали с меченными DIG зондами для детекции HaHB4. Полосы ДНК в продуктах расщепления IND-∅∅412-7, гибридизующиеся с зондами, отмечены белыми стрелками. HB4 трансгенного растения сои (IND-∅∅41∅-5), используемый в качестве положительной и гибридизующейся полосы, отмечен красной стрелкой. Размеры лестницы полос меченных DIG маркеров VII и III указаны слева и справа, соответственно, блотов в т.п.о.

Фиг. 6: Саузерн-блоты ДНК растения IND-∅∅412-7, расщепленной с использованием HindIII, BamHI и AseI. Блоты гибридизовали с меченными DIG зондами для детекции bar. Полосы ДНК в продуктах расщепления IND-∅∅412-7, гибридизующиеся с зондами, отмечены белыми стрелками. HB4 трансгенного растения сои (IND-∅∅41∅-5), используемый в качестве положительной и гибридизующейся полосы, отмечен красной стрелкой. Размеры лестницы полос меченных DIG маркеров VII и III указаны слева и справа, соответственно, блотов в т.п.о.

Фиг. 7: Оценка целостности и распределения по размеру образца ДНК, полученного посредством сортировки хромосомы 2D. Средний размер фрагментов 5951 п.о.

Фиг. 8: Распределение по длине прочтений PacBio. Гистограмма, представляющая абсолютную частоту (количество прочтений) в интервалах длины прочтения 1000 п.о.

Фиг. 9: Оценки в баллах качества прочтений PacBio. Верхний график представляет собой оценки в баллах качества распознаваний основания как функцию от положения прочтения в процентах, и нижний график - как функцию от положения прочтения в п.о.

Фиг. 10: Схемы последовательности ДНК длинной вставки IND-∅∅412-7, содержащей полные (c) и неполные (i) кодирующие области HaHB4 (красный) и bar (светло-синий). Эта вставка подразделена на четыре фрагмента для их лучшего понимания. a) Неполная (i) кодирующая область HaHB4 локализована между двумя неполными фрагментами интрона Ubi-1. Помимо этого, присутствуют две кодирующие области bar, полная (c) и неполная (i). Bar (i) находится между двумя областями Tnos. Bar (c) локализован между своими регуляторными элементами в правильных положениях. b) Кодирующая область HaHB4 (c) локализована ниже проксимальной области интрона и 5'-промоторной области ubi-1 и выше его Tnos. Bar (i) локализован между двумя областями интрона ubi-1. c) Bar (c) локализован между инвертированной промоторной областью Ubi-1 и областью Tnos. Bar (i) локализован между частичной промоторной областью ubi-1 и геном bla. d) Две кодирующие области bar (c) локализованы между своими полными регуляторными элементами.

Фиг. 11: Схемы последовательностей ДНК короткой вставки IND-∅∅412-7, содержащей полную (c) кодирующую область HaHB4 и bar. Эта вставка подразделена на три фрагмента для их лучшего понимания. b) Bar (c) локализован между областью инвертированной и короткой последовательности prGBL-1 и областью Tnos. c) Полная (c) кодирующая область HaHB4 локализована между неполным фрагментом интрона Ubi-1 и Tnos.

Фиг. 12: Перекрывание между JP, анализированное посредством blast против T. aestivum (на http://plants.ensembl.org/).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID No. 1: Длинная вставка без фланкирующих областей

SEQ ID No. 2: Короткая вставка без фланкирующих областей

SEQ ID No. 3: pIND4+HB4

SEQ ID No. 4: pIND4+BAR

SEQ ID No. 5: Длинная вставка с фланкирующими областями

SEQ ID No. 6: Короткая вставка с фланкирующими областями

SEQ ID No. 7: 5´-фланкирующая область (длинная вставка)

SEQ ID No. 8: 3´-фланкирующая область (длинная вставка)

SEQ ID No. 9: 5´-фланкирующая область (короткая вставка)

SEQ ID No. 10: 3´-фланкирующая область (короткая вставка)

SEQ ID No. 11: HB4, прямой праймер

SEQ ID No. 12: HB4, обратный праймер

SEQ ID No. 13: Bar, прямой праймер

SEQ ID No. 14: Bar, обратный праймер

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Следующие определения и способы представлены для лучшего определения изобретения и для предоставления специалисту в данной области, обученному этим способам, руководства для его практического осуществления. Если не указано иное, термины, используемые в настоящем описании, следует понимать с таким же значением, какое придает им общепринятым образом специалист в данной области, обученный соответствующему способу.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Конструирование плазмид pIND4-HB4 и pIND4-Bar

Векторы, используемые для получения пшеницы IND-∅∅412-7, основаны на сериях плазмид, в которых используют промотор убиквитина кукурузы для управления экспрессией генов в растениях (Christensen and Quail, 1996). Доказано, что этот промотор является очень эффективным у однодольных (Christensen et al., 1992). В этих плазмидах используют основу вектора pUC8 для проведения клонирования, и они получены в результате клонирования фрагмента Pst1 гена убиквитина кукурузы Ubi-1 из 1992 п.о. Этот фрагмент представляет собой функциональный промотор и состоит из: 899 п.о. последовательности гена Ubi-1, последовательности 83 п.о. 5’-нетранслируемой области из первого экзона и последовательности 1010 п.о. из первого интрона, оканчиваясь реконструкцией участка Pst1. Исходный интрон, присутствующий в 5’-нетранслируемой области гена Ubi-1, сохранен во всех этих векторах, поскольку предшествующие исследования выявили, что интроны стимулируют экспрессию трансгенов в злаковых растениях (Vasil et al.,1993).

Две плазмиды, основанные на этих сериях, pIND4-HB4 и pIND4-Bar, использованы в генетической модификации, присутствующей в IND-∅∅412-7.

pIND4-HB4 (SEQ ID NO:3)

Эта плазмида имеет участок поликлонирования, из которого участок BamHI использован для клонирования кодирующей области гена HaHB4. Этот участок рестрикции локализован после последовательностей промотора гена Ubi-1 кукурузы, первого экзона и первого интрона гена. Эта конструкция prUbi-1/Ubi1-Экзон/Ubi-1Интрон/HaHB4 разработана для получения конститутивной экспрессии HAHB4. После участка поликлонирования и после CDS HaHB4, этот вектор имеет последовательность терминатора гена нопалинсинтазы A. tumefaciens, которая включает сигнал полиаденилирования.

pIND4-Bar (SEQ ID NO: 4)

Эта плазмида также сконструирована посредством связывания регуляторных областей Ubi-1 с кодирующей областью гена bar S. hygroscopicus в участке BamHI. Эта конструкция, prUbi-1/Ubi1-Экзон/Ubi-1Интрон/bar, позволяет отбор трансгенных растений, экспрессирующих PAT и толерантных к гербицидам на основе глюфосината аммония, который становится неактивным, благодаря этому ферменту (Thompson et al., 1987). После кодирующей области bar, этот вектор также содержит терминатор гена нопалинсинтазы A. tumefaciens, который включает сигнал полиаденилирования.

Пример 2: Трансформация растений пшеницы и отбор объекта IND-∅∅412-7

Способ совместной трансформации, используемый для получения объекта IND-∅∅412-7, был основан на способах, разработанных Barcelo and Lazzeri (1995), Pastori et al. (2001), и Rasco-Gaunt et al. (2001). Эти способы также используют в нескольких исследовательских центрах.

Во-первых, зерна пшеницы собирали и стерилизовали. Зерна собирали из колосьев и стерилизовали. Затем, зародыши выделяли, и их рубчики удаляли для избегания преждевременного прорастания. Щитки помещали в подходящую среду, в середине чашки Петри, с неповрежденной областью эксплантата, направленной вверх, для подвергания влиянию микрочастиц.

Для бомбардировки, частицы золота, покрытые ДНК обеих представляющих интерес плазмид, pIND4-HB4 и pIND4-Bar, проталкивали внутрь клеток эксплантатов с использованием генной пушки PDS-1000/He (система для доставки частиц Biolistic® PDS-1000/He, BIO-RAD).

После бомбардировки, обработанные эксплантаты помещали в свежую культуральную среду в гормональных условиях, необходимых для получения эмбриогенных каллюсов. Процесс отбора начинали через три недели, после того, как зародыши уже развились. Селективным средством, используемым в этом случае, являлся глюфосинат аммония.

Сеянцы, пережившие циклы отбора благодаря экспрессии PAT и развившие хорошую корневую систему, переносили и помещали в камеру для выращивания. В этой точке, отбирали образцы для доказательства присутствия bar и HaHb4 с использованием ПЦР. После развития растений, их переносили в более крупные горшки, где их выращивали до сбора.

Отбор объекта

Трансгенные растения получали, следуя биолистическому способу с использованием британского сорта Cadenza. Первое размножение (семя T₁) проводили в камере для выращивания между августом и декабрем 2007 г. Приблизительно из 20 индивидуальных растений, происходящих из каждого трансгенного объекта, отбирали образцы для теста сегрегации путем определения посредством ПЦР (таблица 1).

Таблица 1. Тест сегрегации. Линии со значениями p > 0,15 переводили к следующему поколению. Линия PCR n χ2 (3:1) Значение p Положительных Отрицательных Ta.IV.ii.a.1 2 14 16 33,33 0,00 Ta.IV.ii.a.2 9 8 17 4,41 0,04 Ta.IV.ii.a.3 14 6 20 0,27 0,61 Ta.IV.ii.a.4 12 7 19 1,42 0,23 Ta.IV.ii.a.5 8 10 18 8,96 0,00 Ta.IV.ii.a.6 17 2 19 2,12 0,15 Ta.IV.ii.a.7 3 15 18 32,67 0,00 Ta.IV.ii.a.8 7 11 18 12,52 0,00 Ta.IV.ii.a.9 5 15 20 26,67 0,00 Ta.IV.ii.a.10 5 15 20 28,12 0,00 Ta.IV.ii.a.11 15 5 20 0,00 1,00 Ta.IV.ii.a.12 14 4 18 0,07 0,79

Линии, происходящие из самоопылений отобранных объектов (сегрегация 3:1 в T1), высевали в августе 2008 г. под защитной сеткой от града. Рост и развитие этих линий характеризовали на протяжении сезона вегетации (таблица 2).

Таблица 2. Фенология. Линия Сутки после посева 12 20 27 34 42 49 57 63 70 77 84 91 98 105 111 119 126 131 Значение по шкале Задокса Дикий тип 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Дикий тип 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.1.2 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,3 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 4,7 5,9 7,3 8,3 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.1.5 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.1.12 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.3.1 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 4,5 5,9 7,3 8,3 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.3.2 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.3.6 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.3.7 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.3.10 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.3.11 1,1 1,3 1,4 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,6 3,2 3,7 4,5 5,5 5,9 7,3 7,7 8,5 8,9 Ta.IV.ii.a.3.13 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.3.14 1,1 1,3 1,4 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,6 3,2 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.3.17 1,1 1,3 1,4 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.3.18 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.4.1 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.4.2 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.4.3 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.4.5 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.4.7 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.4.14 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.4.15 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.4.16 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.4.17 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.4.18 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.1 1,1 1,3 1,4 2,1 2,3 2,4 2,5 2,6 2,6 3,2 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.2 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.3 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.4 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.5 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.6 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.7 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.8 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.9 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.11 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.12 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.13 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.14 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.15 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.6.17 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.11.2 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.11.3 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.11.5 1,1 1,3 1,4 2,2 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.11.6 1,1 1,3 1,4 2,2 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 4,3 5,9 7,3 8,3 8,5 8,7 8,9 Ta.IV.ii.a.11.7 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2

Таблица 2. Фенология (продолжение). Линия Сутки после посева 12 20 27 34 42 49 57 63 70 77 84 91 98 105 111 119 126 131 Значение по шкале Задокса Ta.IV.ii.a.11.8 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.11.9 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.11.10 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.11.13 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.11.15 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.11.17 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.12.1 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,2 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.12.3 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,2 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.12.4 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.12.5 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,2 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.12.6 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.12.7 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.12.8 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.12.9 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.12.11 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,2 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.12.13 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2 Ta.IV.ii.a.12.14 1,1 1,3 1,4 2,1 2,2 2,4 2,5 2,6 2,6 3,1 3,7 5,5 5,9 7,3 8,5 8,7 8,9 9,2

На протяжении стадии вегетации, отбирали образцы растений для анализа ПЦР для идентификации гомозиготных линий. С использованием трех отобранных гомозиготных линий, 6 полевых исследований проводили в течение 2009 и 2011 гг. в Монте-Буэй (Кордова, 2009), Гутенберг (Кордова, 2010), Камет (Буэнос-Айрес, 2011), Корраль-де-Бустос (Кордова, 2011), Деро (Буэнос-Айрес, 2011) и Вилья Сабойя (Буэнос-Айрес, 2011).

Исследования включали три гомозиготных линии (объекты) и дикий тип (родительский контроль). Данные урожайности анализировали с использованием ANOVA с полностью рандомизированной блочной схемой при доверительном уровне 95% с использованием Infostat (Di Rienzo et al., 2010). В этом анализе данные пулировали среди участков, и источники изменчивости включали генотипы, условия окружающей среды и взаимодействие генотипа и условий окружающей среды. Средние сравнивали апостериорно с использованием критерия наименьшей значимости Фишера (α=0,05).

Дисперсионный анализ показал статистически значимые различия для эффекта генотипа (p=0,0003, фигура 4). Кроме того, детектировано статистически значимое взаимодействие генотипа и условий окружающей среды (p <0,0001). Это взаимодействие объясняют перекрестом урожайностей линий Ta.IV.ii.a.4 и контроля в одном участке (фигура 4). В комбинированном анализе все трансгенные линии представляли более высокую урожайность, чем родительский контроль. Среди линий, Ta.IV.ii.a.12 представляла наивысшую среднюю урожайность во всех участках. Эта трансгенная линия выбрана для дальнейшей характеризации и переименована кодом: IND-∅∅412-7.

Пример 3: Характеризация последовательностей ДНК в объекте пшеницы IND- ∅∅ 412-7

Из-за комплексного характера генома пшеницы, разработана стратегия для уменьшения фоновой геномной информации, для выяснения структуры, последовательности вставки и ее фланкирующих последовательностей в геноме пшеницы. Хромосому-носитель идентифицировали с использованием платформы технологии DArT (Diversity Arrays Technology, Jaccoudy et al., 2001). После идентификации хромосомы-носителя HaHB4, ее выделяли с использованием способа сортировки хромосом (Doležel et al., 1989; JanVra'na et al., 2000; Suchánková et al., 2006; Šimková et al., 2008). Способ секвенирования для идентификации области вставки IND-∅∅412-7 в выделенной хромосоме состоял из комбинированного способа NGS с использованием двух дополняющих технологий секвенирования: Illumina и Pacific Biosciencies. Посредством Illumina получали высокопроизводительные короткие прочтения 100 п.о. с обоих сторон библиотеки фрагментов 500 п.о. для секвенирования. С другой стороны, посредством PacBio получали низкопроизводительные прочтения отдельных молекул из библиотеки фрагментов 15-20 т.п.о.

По мере увеличения размера вставки, вероятность прохождения полимеразы на протяжении последовательности более одного раза уменьшается. По этой причине, более крупные последовательности имеют более высокую частоту ошибок, чем меньшие. Для преодоления этой проблемы, были разработаны специальные алгоритмы, корректирующие эти последовательности с использованием меньших последовательностей, полученных посредством Illumina. С использованием этого алгоритма, последовательности PacBio RSII корректируют и получают точную и надежную сборку образца (Koren et al., 2012).

a) Анализ Саузерн-блоттинга.

Количество копий представляющих интерес генов определяли в гомозиготных растениях IND-∅∅412-7 посредством анализа Саузерн-блоттинга.

Ткань листа из выращенных в теплице или в поле гомозиготных растений IND-∅∅412-7 или растений Cadenza, использовали для выделения ДНК. Один грамм ткани листа либо из IND-∅∅412-7, либо из Cadenza, мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и размалывали в тонкий порошок с использованием предварительно охлажденных пестика и ступки. ДНК выделяли с использованием набора Qiagen DNeasy Maxi Prep, следуя протоколу производителя. После элюции, ДНК преципитировали посредством добавления 1/10 объема 3M ацетата натрия и 2-3 объемов 100% этанола. Осадок промывали 70% этанолом и суспендировали в 80 мкл 1x буфера TE. ДНК количественно оценивали с использованием флуориметра QuBit. Концентрация ДНК для IND-∅∅412-7 составляла 1100 нг/мкл, и для Cadenza составляла 900 нг/мкл.

Геномную ДНК из объекта IND-∅∅412-7 расщепляли с использованием трех ферментов: HindIII, BamH1 и AseI. Для каждой 50 мкл реакционной смеси для расщепления, 5 мкг геномной ДНК смешивали с любым из ферментов HindIII, BamHI или AseI в концентрациях 10 ед./мкг ДНК. Образцы расщепляли в течение ночи (~16 часов) при 37°C. Для расщеплений контрольной плазмиды, использовали 100-200 пикограмм плазмидной ДНК.

Продукты рестрикционного расщепления геномной ДНК IND-∅∅412-7 и Cadenza наносили в 0,7% агарозный гель вместе с меченным DIG маркером молекулярной массы VII (Roche, кат. No. 1669940910). Образцы анализировали при 50 В в течение ночи. Гель инкубировали в денатурирующем буфере дважды по 30 минут каждый раз. Денатурированный гель промывали в буфере для переноса в течение 15 минут до щелочного переноса (описанного ниже).

Присутствует один участок HindIII в плазмиде pIND-4, локализованный очень близко к 5´-концу prUBI-1. Других участков HindIII не присутствовало в плазмидах (фигура 1). Предполагая наличие одиночных, интактных вставок, содержащих представляющую интерес последовательность, в геноме IND-∅∅412-7, минимальный размер фрагмента при гибридизации с зондом HaHB4 может составлять 2842 т.п.о., и размер фрагмента для зонда bar может составлять 2860 т.п.о.

Кроме того, присутствует один участок BamHI в плазмиде pIND-4, локализованный очень близко к инициирующему кодону CDS HaHB4 и bar. Никаких других участков BamHI не присутствует в плазмидах (фигура 1). И снова, предполагая наличие одиночных, интактных вставок, содержащих представляющую интерес последовательность, в геноме IND-∅∅412-7, минимальный размер фрагмента при гибридизации с зондом HaHB4 может составлять 825 п.о., и размер фрагмента для зонда bar может составлять 843 п.о..

Наконец, присутствуют пять участков рестрикции AseI в плазмиде (фигура 1), два внутри представляющей интерес последовательности, в интроне UBI-1, и три в векторе, два близко к концу Tnos, и другой внутри гена bla. Полное расщепление AseI в вставке должно высвобождать фрагмент ДНК длиной 1313 т.п.о., содержащий мишень связывания для зонда HaHB4. Зонд bar детектирует фрагмент ДНК 1331 т.п.о. Это соображение подразумевает одиночную интактную вставку.

Молекулярные зонды для CDS HaHB4 и bar синтезировали, следуя способу, описанному в наборе для синтеза посредством ПЦР DIG-зондов от Roche (кат. No.11636090910) и с использованием олигонуклеотидов, упомянутых в таблице 3.

Таблица 3. Список праймеров, используемых для получения зондов, используемых в анализах Саузерн-блоттинга. Зонд Размер (п.о.) Гибридизация (°C) Тип праймера Последовательность HB4 200 45 Прямой GGGCTTCATCCTGGTCAAGTGGC Обратный TCTTGATGCTTTTCTGCTACATTTCTCAGC Bar 282 55 Прямой CACGCAACGCCTACGACTGGACGGCC Обратный GTACCGGCAGGCTGAAGTCCAGCT

Щелочной перенос ДНК из агарозного геля проводили с использованием системы для нисходящего переноса Turboblotter-Rapid (Whatman). ДНК переносили на нейлоновую мембрану 12×21 см (Nytran™ Super Charge, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) в течение 4 часов. Мембрану промывали в нейтрализующем буфере (0,2 М фосфат натрия, pH 6,8). ДНК необратимо перекрестно сшивали с мембраной посредством ультрафиолетового устройства Ultraviolet Cross linker (CL-1000) с использованием 2 экспозиций по 1500 мДж.

Мембрану инкубировали в 50 мл буфера для гибридизации Roche DIG EasyHyb (кат. no. 11 603 558 001) при предварительно рассчитанных температурах гибридизации (45°C, 55°C для зондов для гена bar и гена HaHB4, соответственно) в орбитальном встряхивателе.

Аликвоты по 35 мкл и 45 мкл зондов bar и HaHB4 разводили посредством добавления 65 и 55 мкл, соответственно, 1x буфера TE. Растворы зондов инкубировали при 95°C в течение 10 мин и охлаждали до 4°C в течение 2 мин. Их добавляли к 8,75 мл буфера для гибридизации DIG и выливали на дно бутыли для гибридизации. Мембраны инкубировали при описанных температурах гибридизации в течение 16 часов в печи для гибридизации (VWR scientific products) с использованием орбитального встряхивателя.

После гибридизации, мембраны промывали с использованием буфера для промывки, в соответствии с инструкциями, представленными с набором для люминесцентной детекции DIG от Roche. После 1 часа блокирования с использованием 1x блокирующего реагента, мембраны инкубировали в течение 30 мин в растворе, содержащем 50 мл 1x блокирующий реагент и 5 мкл антитела-AP против дигоксигенина. Мембрану промывали дважды с использованием буфера для промывки в течение 30 минут каждый раз и наконец обрабатывали с использованием буфера для детекции в течение 5 минут. В этой точке мембрану помещали в пакет для гибридизации KPL (KPL, кат. No. 60-00-51). 5 мл раствора CSPD из набора для люминесцентной детекции DIG наносили равномерно на мембрану. Мембрану инкубировали с раствором CSPD в течение 5 минут при комнатной температуре. Пакет для гибридизации с мембраной запаивали и инкубировали при 37°C в течение 15 минут. Пакет для гибридизации помещали в кассету с пленкой Kodak Biomax Light (кат. No. 178 8207) в темной комнате и экспонировали в течение 20 минут. Пленки проявляли в темноте с использованием устройства для проявления рентгеновской пленки Konika QX-60A. Последующие экспозиции проводили через 1 час или 2 часа, по необходимости.

Анализ полос гибридизации, полученных с использованием зонда HaHB4, позволял предполагать присутствие трех копий этой CDS (фигура 5).

С другой стороны, анализ полос гибридизации, полученных с использованием зонда bar, позволял авторам настоящего изобретения предполагать присутствие семи копий этой CDS с использованием BamHI (фигура 6). Однако, с учетом HindIII и AseI, количество является более низким, что указывает на возможные внутренние реаранжировки ДНК (фигура 6).

Кратко, результаты Саузерн-блдоттинга показали комплексный паттерн вставки с возможными внутренними реаранжировками ДНК, что позволяет предполагать, что способ геномного секвенирования должен является необходимым для разрешения структуры вставки в объекте IND-∅∅412-7.

b) Идентификация и выделение хромосомы, содержащей последовательности вставки в IND-∅∅412-7

DArT использовали для идентификации того, что ген HaHB4 локализован на хромосоме 2D генома пшеницы. Каждый полиморфный фрагмент ДНК (который соответствует точке на планшете) фактически представляет собой молекулярный маркер, который может служить для генотипирования сегрегирующей популяции продуктов скрещивания двух родителей (присутствия или отсутствия маркера в сегрегирующем материале) и детекции ассоциаций этих маркеров с представляющими агрономический интерес характеристиками (область полиморфизма). В случае объекта IND-∅∅412-7, эту технологию использовали для генотипирования поколения F2 продукта скрещивания IND-∅∅412-7 x Bag17, и для поиска возможной связи этих маркеров с трансгеном HaHB4. Присутствие или отсутствие HaHB4 определяли в каждом F2 индивидуально и, после генотипирования, определяли ассоциации между маркерами DArT и HaHB4. Этот трансген представлял ассоциацию с одним маркером, локализованным на хромосоме 2D (http://www.cerealab.unimore.it/). Тот факт, что только один маркер представлял ассоциацию с HaHB4, может присутствовать, поскольку не существует доступной насыщенной карты маркеров для этой конкретной хромосомы (Jia et al., 2013; http://ccg.murdoch.edu.au/cmap/ccg-live/cgi-bin/cmap/viewer).

CDS HaHB4 была, наиболее вероятно, локализована в длинном плече около центромеры, ассоциированном с маркером Gpw3105.

С использованием этой информации, получили 5 мкг ДНК хромосомы 2D, которая являлась пригодной для получения библиотеки Illumina. Однако, из-за характера процесса амплификации ДНК после сортировки, ДНК являлась частично пригодной для библиотек PacBio (фигура 7).

Панели разнообразия получали с использованием ДНК из IND-∅∅412-7 и дикого генотипа Cadenza.

Геномную ДНК выделяли из сеянцев. Приблизительно 5 нг ДНК для каждого генотипа оценивали посредством расщепления в течение 1 час при 37°C с использованием 2 ед. ферментов рестрикции (EcoRI, PstI и MspI) в конечном объеме 8 мкл. После расщепления, добавляли 2 мкл смеси для лигирования, и образец инкубировали в течение 3 часов при 37°C. Смесь для лигирования состоит из 0,2 мкл T4 лигазы (New England Biolabs), 0,2 мкл 50 мМ ATP, 1,2 мкл воды MilliQ (MQ) и 0,1 мкл подходящего специфического фермента в концентрации 50 пмоль/мкл (MspI) и 5 пмоль/мкл (EcoRI и PstI). После лигирования, смесь разводили до конечного объема 500 мкл с использованием воды MQ, и 2 мкл использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР. Реакцию проводили в конечном объеме 50 мкл, с 2 ед. полимеразы Red Taq (Sigma) и праймерами. После начальной инкубации при 95°C в течение 3 минут, реакция следовала следующему протоколу: 30 циклов по 94°C в течение 30 секунд, 60°C в течение 45 секунд и 72°C в течение 1 минуты. Конечное удлинение проводили при 72°C в течение 8 минут.

Полученные таким образом ампликоны лигировали в вектор PCR2.1TOPO (Invitrogen) и затем трансформировали посредством теплового шока клетки E. coli TOP10F' (Invitrogen), следуя инструкциям производителя. Трансформанты отбирали на средах, содержащих ампициллин и X-gal. Индивидуальные белые колонии (содержащие рекомбинантную плазмиду) переносили посредством петли в пробирку, содержащую 20 мкл 10% глицерина. Из каждого образца в глицерине, отбирали аликвоту 5 мкл и переносили в пробирку, содержащую 45 мкл готовой смеси для ПЦР с RedTaq (Sigma) и 15 пмоль каждого из праймеров M13, прямого, и M13, обратного. Используемый профиль циклера представлял собой 1 цикл при 95°C в течение 5 минут; 35 циклов 94°C в течение 30 секунд, 52°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 1 минуты. После амплификации, продукты ПЦР преципитировали с использованием 1 объема изопропанола при комнатной температуре и промывали с использованием 100 мкл 70% этанола. Этанол удаляли, и продукты сушили при комнатной температуре.

Продукты ресуспендировали в воде MQ, 3x SSC или 1x SSC+0,01% саркозил (Sigma) при конечной концентрации ~ 20 нг/мкл. Очищенные фрагменты переносили в 384-луночный планшет (Genetix), и 6 повторов организовывали для переноса на чипы Polysine™ (Menzel Glazer) с использованием системы Affymetrix™ 417. После 1 суток фиксации, чипы обрабатывали, в соответствии со способом, опубликованным на http://microarrays.org/protocols.html (2001) с той небольшой модификацией, что использовали борогидрид натрия (Sigma) вместо использования янтарного ангидрида, и 1-метил-2-пирролидон в качестве блокирующего раствора, полученного в буфере PBS pH 7,4 (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ NaHPO, KHHPO 2 мМ). Чипы погружали в кипящую воду на 30 секунд для денатурации ДНК и затем немедленно погружали в ледяной 100% этанол на 10 секунд. Чипы сушили при комнатной температуре.

После амплификации ПЦР, продукты очищали с использованием колонок (Qiagen) или преципитировали посредством добавления изопропанола для удаления избытка dNTP. Флуоресцентные красители Cy3 и Cy5 (Pharmacia) включали с использованием набора для мечения ДНК Deca-random-prime DNA (Fermentas), в соответствии с инструкциями производителя.

Образцы, меченные с использованием красителей Cy3 и Cy5 (5 мкл), смешивали с 2 мкл раствора 20 мкг/мкл ДНК из спермы сельди (Sigma), растворенной в растворе для гибридизации Express (Clontech) и денатурировали при 96°C. в течение 3 минут. Денатурированные зонды смешивали с 10-15 мкл раствора для гибридизации, переносили непосредственно на поверхность микромассива, и покрывали стеклом (24×24 мм, Mediglass). Чипы немедленно помещали в камеру для увлажнения при 65°C на ночь для гибридизации. После гибридизации, чипы промывали с использованием 1x SSC с 0,1% SDS в течение 5 мин, 1x SSC в течение 2 минут, 0,2x SSC в течение 2 минут и 0,02x SSC в течение 20 секунд.

Чипы сканировали с использованием сканера Affymetrix 418™. Интенсивность каждого сигнала анализировали с использованием программы Scanalyse v.2.44 (Standford University) и GenePix Pro v.3 (Axon instruments).

c) Анализ последовательности стыка и структуры вставки в IND-∅∅412-7 с использованием секвенирования Illumina и PacBio.

Результаты анализа Саузерн-блоттинга позволяли предполагать комплексный паттерн трансгенной вставки. Таким образом, библиотеку выделенной ДНК хромосомы 2D секвенировали с использованием платформы Illumina Hiseq. Авторы настоящего изобретения получили более чем 1,2 миллиардов прочтений в конфигурации спаренных концов 2×100 п.о., представляющих более чем 124 ГБ данных секвенирования. Перекрывание секвенирования полной хромосомы оценивали между 40 и 50X, на основании неизбыточных поддающихся картированию прочтений в однокопийных генах, локализованных на хромосоме 2D, таких как PpoD1b (He et al, 2009). Обогащение образца для хромосомы 2D подтверждали посредством картирования прочтений для известных однокопийных генов, локализованных вне хромосомы, таких как LOX (Feng et al., 2012). В этих случаях, перекрывание оценивали между 1 и 5X, таким образом, подтверждая высоко обогащенную ДНК для последовательностей хромосомы 2D.

Картирование прочтений для плазмид, используемых для трансформации, позволило авторам настоящего изобретения подтвердить результаты Саузерн-блоттинга. Заключили, что авторы настоящего изобретения получили 3 полных или почти полных копии CDS HaHB4, на основании 100X перекрывания и 8 полных или почти полных копии CDS bar, на основании 400X перекрывания.

Несколько других элементов плазмид были идентифицированы с перекрыванием вплоть до 1200X.

Посредством способа анализа последовательностей стыков (JSA) (Kovalic et al., 2012) с использованием прочтений Illumina идентифицировали вплоть до 4 различных фланкирующих последовательностей с ДНК пшеницы и несколько химерных последовательностей стыков, включающих элементы плазмид. Кратко, данные Illumina также показали комплексный паттерн объекта вставки, включающий внутренние реаранжировки плазмид в IND-∅∅412-7.

Следовательно, были получены длинные прочтения секвенирования PacBio, чтобы способствовать процессу построения каркаса для сборки прочтений Illumina. Длинные прочтения PacBio могут позволять прочтение через комплексные внутренние структуры и реаранжировки.

Из-за качества образца ДНК, полученного после сортировки хромосом, которая позволяет авторам настоящего изобретения получение библиотеки со средним размером около 5 т.п.о., использовали химические реакции P4-C2 PacBio. С этими химическими реакциями получают средние длинные прочтения 5,5 т.п.о. Использовали 20 ячеек SMART для получения 1806197 прочтений, объединяющих всего 3,5 ГБ данных секвенирования со средней длиной прочтения приблизительно 2 т.п.о. и максимумом 13 т.п.о. На основании размера хромосомы 2D 800 млн.п.о., оценили 4,7X перекрывание полной хромосомы. Статистика PacBio показана в таблице 4, и распределение длины прочтений и показатели Q показаны на фигуре 8 и фигуре 9.

Таблица 4. Статистика PacBio. Статистика PacBio Средний размер библиотеки 5500 п.о. # ячеек smart: 20 # последовательностей 1806197 Всего оснований 3513329966 п.о. (3,5 ГБ.) Средняя длина последовательности 194332±160546 Минимальная длина 50 п.о. Максимальная длина 32913

На основании комбинированного анализа данных секвенирования для Illumina и PacBio, сначала определяли фланкирующие последовательности вставки.

Устанавливали набор из четырех параметров в качестве порога отсечения для определения истинной идентичности фланкирующей последовательности:

1. Подтверждена данными Illumina,

2. Подтверждена данными PacBio,

3. Подтверждена перекрыванием по Illumina как одиночная копия, и

4. Подтверждена посредством амплификации ПЦР с ДНК IND-∅∅412-7.

Четыре различных фланкирующих последовательности прошли через все фильтры для соответствия избранным критериям, названные JPLa, JPLb, JPSa и JPSb.

Сходный способ использовали для определения всех внутренних химерных последовательностей стыка плазмида-плазмида, но с учетом перекрывания посредством Illumina вовлеченных индивидуальных элементов плазмиды. Внутренние последовательности стыка, которые прошли через все фильтры, продлевали с использованием данных Illumina и картировали на длинных прочтениях PacBio для получения конечной сборки. Качество конечной сборки проверяли, возвращаясь к начальным данным Саузерн-блоттинга, и результаты подтверждали.

Кратко, описаны две различных вставки плазмид в областях с высоким содержанием повторяющихся последовательностей хромосомы 2D в геноме пшеницы. Одна из вставок имеет длину 47611 п.о., а другая имеет длину 20418 п.о., что в сумме составляет 68029 п.о. вставок в объекте IND-∅∅412-7 (фигуры 10 и 11). Вставки насчитывают три копии CDS HaHb4, семь копий CDS bar, 16 копий гена bla и четыре копии CDS gus. В более длинной вставке, фигура 10, является возможным идентифицировать полную кодирующую область HaHB4 (красный) ниже вероятных функциональных регуляторных элементов (панель b). С другой стороны, полную кодирующую область bar (светло-синий) наблюдают на панелях a, b, c и d. На панелях (a) и (d) является возможным идентифицировать, что регуляторные элементы bar полные и в правильном положении. Полные копии CDS Bar потенциально кодируют функциональные белки. В результате, идентифицированы только одна копия HaHB4 и одна копия bar без полных регуляторных элементов.

d) Детекция, структура и количество копий последовательностей вектора, не родственных представляющим интерес генам.

Из анализа объектов вставки было очевидно присутствие последовательностей плазмидного вектора и других кодирующих областей, не родственных представляющим интерес генам и регуляторным областям, введенных в ходе процесса трансформации пшеницы.

Элементы плазмидного остова, детектированные в вставке IND-∅∅412-7, представляют собой ген bla, придающий устойчивость к ампициллину бактериям, и бактериальную точку начала репликации из плазмиды pBR322 (фигуры 10 и 11). Применительно к bla, важно упомянуть, что он не имеет регуляторных элементов для экспрессии в пшенице, так же как ни одна из описанных копий bla не была расположена около эукариотических регуляторных элементов.

Все из последовательностей плазмидного остова в вставке IND-∅∅412-7 имеют подтвержденную точку начала репликации в векторах pIND4-HB4 и pIND4-Bar, используемых для трансформации, как показано по идентичности нуклеотидных последовательностей с использованием blast.

Однако, были детектированы последовательности, соответствующие гену gus (Jefferson et al., 1987) и промотору гена gbl1 пшеницы (Jones, 2005), управляющему его экспрессией. Эти последовательности происходили из третьей плазмиды, используемой для мониторирования эффективности трансформации; тем не менее, эти элементы были включены в ходе процесса интеграции. CDS gus была обнаружена в четырех копиях, в то время как промотор gbl1 был обнаружен в пяти копиях (фигуры 10 и 11). Эта третья плазмида также могла являться производным серий, используемых для вставки HaHB4 и bar в пшеницу.

e) Локализация вставки IND-∅∅412-7 в геноме пшеницы.

Вставки были локализованы на хромосоме 2D пшеницы. Эти вставки были детектированы в не аннотированных последовательностях и является очень маловероятным, что они являлись прерывающими кодирующие последовательности, по причинам, объясненным ниже.

Все из фланкирующих последовательностей пшеницы соответствовали фрагментам ДНК с высоким сходством с ретротранспозонами, указывая на объекты вставки в областях ДНК с высоким содержанием повторяющихся последовательностей (Mayer et al, 2014).

Для подтверждения этого, проводили анализ blast JP (точек стыка) для базы данных проекта IWGSC через веб-сайт EnsemblPlants (http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index). Множество наилучших совпадений с участками хромосом T. aestivum наблюдали в каждом случае. Хотя и неоднородное в некоторых случаях, полное перекрывание последовательности наблюдали для каждой JP (фигура 12). Поскольку этот проект IWGSC еще находится в разработке, проводили другой анализ blast для всех остальных секвенированных геномов злаковых, присутствующих в базе данных EnsemblPlants (Triticum urartu, Aegilops tauschii и Hordeum vulgare), приводящий к такому же паттерну множества наилучших совпадений для множества участков хромосом. Последовательности, которые присутствуют в множестве участков хромосом и являются консервативными в различных организмах, проявляют тенденцию являться повторяющимися последовательностями.

Проводили также анализ blast последовательностей JP для неизбыточной базы данных NCBI. Две из этих последовательностей (JP Короткий, JPSa и JPSb) совпадали с известными элементами ретротранспозонов (таблица 5). В то время как две другие последовательности JP (JP Длинный, JPLa и JPLb) не имели значительных наилучших совпадений в базе данных NCBI, они являются высоко консервативными и повторяющимися множество раз среди множества хромосом в базе данных пшеницы, что дает сильное основание предполагать неизвестные повторяющиеся элементы ДНК.

Таблица 5. Пример наилучших совпадений анализа blast последовательностей JP для неизбыточной базы данных NCBI Запрашиваемая Рассматриваемая Статистика Наимменование Начало Конец Наименование Начало Конец Примечания Балл Значение E %ID L. JPSa 1 266 FN564434 122244 122509 Ретротранспозон gypsy 386 1E-92 89 266 JPSb 1 499 AF326781 144816 145314 Транспозон, подобный gypsy ретротранспозон Fatima 582 7E-146 83 499 JPLa 201 300 IWGSC_CSS_5AS scaff_1551050 364 463 неизвестный повторяющийся элемент 500 4E-15 100 100 JPLb 1 169 IWGSC_CSS_5DS scaff_2755707 2630 2797 неизвестный повторяющийся элемент 507 2E-15 81 174

L.: Длина

Стабильность и целостность вставок IND-∅∅412-7

Сегрегация вставок на протяжении полового переноса.

Гомозиготные растения по вставке IND-∅∅412-7 скрещивали с коммерческим сортом, Baguette 17, для получения поколения F1. После самоопыления растений F1, получили 349 семян F2. Растения, выращенные из этих семян, использовали для анализа сегрегации. ДНК выделяли из молодых листьев. До выделения ДНК, ткань листа замораживали в жидком азоте и перерабатывали в тонкий порошок в ступке с пестиком или в пробирках в гомогенизаторе «96 mill» для препаратов в мини-масштабе. Следующие способы использовали для выделения ДНК растений, в зависимости от количеств ДНК, необходимых для экспериментальных целей:

Способ с использованием CTAB:

Геномную ДНК выделяли, следуя способу на основе бромида гексадецилтриметиламмония (CTAB) (http://irc.igd.cornell.edu/Protocols/DoyleProtocol.pdf). Кратко, 600 мкл буфера CTAB (2% масс./об. CTAB, 100 мМ ТрисHCl, 20 мМ ЭДТА, 1,4 M NaCl и β-меркаптоэтанол) и 5 мкг РНКазы A добавляли к приблизительно 100 мг размолотой ткани листа и инкубировали при 55-60°C в течение 15-20 минут с периодическим перемешиванием. 600 мкл хлороформа добавляли к образцам и перемешивали вручную 2-3 минуты, затем центрифугировали при 10000 об./мин в течение 8 минут. Верхнюю водную фазу помещали в чистую микропробирку, и ДНК преципитировали с использованием 400 мкл изопропанола. Образец центрифугировали при 12500 об./мин в течение 10 минут для осаждения преципитированной ДНК. Осадки ДНК промывали с использованием 300 мкл 70% этанола посредством центрифугирования образцов при 12500 об./мин в течение 5 минут. Осадки ДНК сушили на воздухе, затем ресуспендировали в 100 мкл буфера TE (10 мМ ТрисHCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0). Всю выделенную ДНК хранили в холодильнике при 4°C или в морозильнике при -20°C.

Чтобы убедиться в целостности образцов, ПЦР с детекцией в конечной точке эндогенного контроля пшеницы проводили со специфическим праймером. Затем, ПЦР с детекцией в конечной точке проводили с использованием различных комбинаций праймеров для определения присутствия CDS HaHB4 и bar. Анализ хи-квадрат (χ2) использовали для оценки ожидаемой сегрегации 3:1 (присутствия или отсутствия представляющих интерес CDS).

В таблице 6 обобщены результаты, полученные посредством анализа ПЦР.

Таблица 6. Результаты анализа сегрегации посредством ПЦР. Всего HaHB4+bar+ HaHB4+bar- HaHB4-bar+ HaHB4-bar- 349 259 0 0 90

Всего: количество тестированных индивидуальных растений;

HaHB4+bar+: количество индивидуальных растений, положительных по CDS HaHB4 и bar;

bar-HaHB4+: количество индивидуальных растений, положительных по CDS HaHB4;

HaHB4-bar+: количество индивидуальных растений, положительных по CDS bar;

HaHB4-bar-: количество индивидуальных растений, отрицательных по CDS HaHB4 и bar.

В таблице 7 показан статистический анализ:

Таблица 7. Статистический анализ результатов сегрегации. Ожидаемые результаты (No. растений) Наблюдаемые результаты (No. растений) χ² значение p + - + - 261,75 87,25 259 90 0,11 0,74

Значение χ2 (количество степеней свободы=1, α=0,05) не показало статистически значимого различия между ожидаемыми и наблюдаемыми результатами, что указывает на менделевскую сегрегацию 3:1 для каждой из анализированных CDS (HaHB4 и bar).

Результаты, полученные для поколения F2, показывают, что оба трансгена стабильно наследуются в ходе полового переноса. В сегрегирующей популяции, оба гена имели сегрегацию 3:1, в соответствии с менделевскими принципами. Наконец, даже несмотря на то, что обе CDS поступили в результате процесса совместной трансформации посредством бомбардировки, два гена являются сцепленными, поскольку каждое анализированное индивидуальное F2 представляет одинаковые результаты для обеих CDS, bar и HaHB4.

Предшествующий анализ был выполнен с использованием олигонуклеотидов, которые детектируют почти полные CDS.

После подтверждения стабильности полных CDS bar и HaHB4, было решено переходить к характеризации других генетических элементов или их части, и фланкирующих последовательностей. С целью детекции присутствия/отсутствия копий HaHB4, bar и bla в IND-∅∅412-7, сконструированы олигонуклеотиды, которые гибридизуются со всеми копиями (полными и неполными). Также, детектировали четыре стыка вставка-растение для определения их сегрегации в поколении F2. Эти исследования проводили для 92 индивидуальных растений из популяции F2. Результаты показаны в таблице 8.

Таблица 8. Статистический анализ результатов сегрегации. Ожидаемые результаты
(No. растений) Наблюдаемые результаты
(No. растений) χ² значение p + - + - 69 23 65 27 0,9275 0,336

Значение χ2 (d.f.=1, α=0,05) в поколении F2 не показало статистически значимого различия между наблюдаемой и ожидаемой степенью сегрегации 3:1 для анализированных данных.

Все анализированные трансгенные растения представляли согласованные результаты для трех детектированных элементов IND-∅∅412-7 (HaHB4, bar и bla) и для четырех стыков вставка-растение (JPSa, JPSb, JPLa и JPLb). Эти результаты поддерживают заключение, что конструкция IND-∅∅412-7 находится в одном локусе в геноме пшеницы и наследуется в соответствии с менделевскими принципами наследования.

Пример 4: Увеличение урожайности как показатель толерантности к абиотическому стрессу.

Пятнадцать полевых исследований проводили для множества тестируемых участков и дат посадки для оценки урожайности и компонентов урожайности трансгенного объекта IND-∅∅412-7 и родительских нетрансгенных контрольных линий (cv Cadenza). Участки были локализованы в главных областях продукции пшеницы Аргентины, лежащих в диапазоне между 32° южной широты и 38° южной широты. Область покрывает разнообразные условия внешней среды для аргентинской продукции сельскохозяйственной культуры пшеницы. Исследования включали репрезентативные локализации из регионов пампы для пшеницы, описанных в Kugler and Godoy (1974): IIN (7 исследований), IIS (6 исследований) и IV (два исследования). На каждом участке дату посадки корректировали в соответствии с обычной практикой сельскохозяйственных работников, начиная в мае/июне в северных участках и в июле в южных участках. Даты посадки и сбора представлены в таблице 9.

Таблица 9: Избранные локализации для полевых исследований и даты посадки и сбора. ID участка Локализация участка Провинция Регион для пшеницы Дата посадки Дата сбора A12-1 Монте-Буэй Кордова IIN 31-5-2012 26-12-2012 A12-2 Монте-Буэй Кордова IIN 19-6-2012 26-12-2012 A13 Монте-Буэй Кордова IIN 14-6-2013 12-12-2013 D12 Корраль-де-Бустос Кордова IIN 30-5-2012 12-12-2012 D13 Корраль-де-Бустос Кордова IIN 17-6-2013 17-12-2013 F12 Вилья Сабойя Буэнос-Айрес IIS 7-6-2012 22-12-2012 F13 Вилья Сабойя Буэнос-Айрес IIS 26-6-2013 12-12-2013 G12-1 Кармен-де-Ареко Буэнос-Айрес IIS 14-6-2012 04-01-2013 G12-2 Кармен-де-Ареко Буэнос-Айрес IIS 6-7-2012 04-01-2013 H12 Деро Буэнос-Айрес IIS 12-6-2012 28-12-2012 H13 Деро Буэнос-Айрес IIS 27-6-2013 19-12-2013 I12 Балькарсе Буэнос-Айрес IV 25-7-2012 7-1-2013 I13 Балькарсе Буэнос-Айрес IV 26-7-2013 13-1-2014 P12 Ландета Санта-Фе IIN 3-6-2012 -^a P13 Ландета Санта-Фе IIN 10-6-2013 11-12-2013 ^a Исследование потеряно из-за наводнения при созревании

Погодные условия регистрировали во время сезона вегетации для каждого участка. Годовое количество осадков, зарегистрированное среди участков, лежало в диапазоне от 424 мм до 1497 мм для исследований H13 и G12 соответственно (таблица 10), что показывает широкую изменчивость погоды среди участков и лет. В ходе 2013 г., для количества осадков, суммированного за время периода вегетации (июнь-декабрь), зарегистрированы значения ниже 500 мм для всех участков. Исследования с посадкой в 2013 г. имели более высокую вероятность условий стресса засухи, чем исследования с посадкой в 2012 г. Для 2012 г. значения количества осадков были выше 500 мм для того же самого периода во всех участках (таблица 10).

ТАБЛИЦА 10. Погодные данные (количество осадков) для каждого участка в ходе 2012 г. и 2013 г. для полевых участков пшеницы. Месяц ID участка^a A12 A13 D12 D13 F12 F13 G12 H12 H13 I12 I13 P12 P13 Январь 47 36 103 25 110 0 75,5 112 32 46 69 98 17 Февраль 214 87 282 159 227 5 211 111 10 66 33 164 106 Март 212 68 211 42,9 104 96 166 184 46 78 98 211 55 Апрель 9 106 19 83 105 30 57 33 70 46 45 83 112 Май 48 44 49 33 56 31 120 166 17,5 85 10 44 35 Июнь 0 16 0 24,5 0 0 7 0 6 0 23 2 17 Июль 0 12 0 13,5 0 8 11 0 45 0 50 0 5 Август 68 0 56 0 48 0 203 135 3 295 17 87 0 Сентябрь 135 2,5 132 4,5 55 15 72,5 70 36 42 141 115 16 Октябрь 321 162 291 126 245 58 285 252 37,5 27 50,5 236 33 Ноябрь 73 131 155 184 165 150 98 87 111 77 183 64 294 Декабрь 128 97 156 24,1 41 54 191 179 11 150 10 314 0 Июнь-декабрь^b 725 421 790 377 554 285 868 723 250 591 452 818 365 Год 1255 762 1453 720 1156 447 1497 1328 425 912 730 1418 690 ^a A12=Монте-Буэй, две даты посадки, год 2012; A13=Монте-Буэй, год 2013; D12=Корраль-де-Бустос, год 2012; D13=Корраль-де-Бустос, год 2013; F12=Вилья Сабойя, год 2012; F13=Вилья Сабойя, год 2013; G12=Кармен-де-Ареко, две даты посадки, год 2012; H12=Деро, год 2012; H13=Деро, год 2013; I12=Балькарсе, год 2012; I13=Балькарсе, год 2013; P12=Ландета, год 2012; P13=Ландета, год 2013.
^b Период вегетации

Полевые исследования организовывали в каждом участке, следуя полностью рандомизированной блочной схеме. Четыре повтора оценивали во всех локализациях. Делянки состояли из семи рядов, отделенных промежутками 0,2 м и длиной пять метров. Все полевые исследования были ограничены делянками из 7 рядов и длиной 5 метров. До посадки, пул семян IND-∅∅412-7 и Cadenza тестировали посредством ПЦР для подтверждения присутствия и отсутствия Hahb4, соответственно. Все семена обрабатывали с использованием инсектицида (тиаметоксама, 0,4 мл кг^-1) и фунгицида (дифеноконазола, 0,2 мл кг^-1 и металаксила-M, 0,15 мл кг^-1) с использованием протокола, указанного на соответствующей этикетке продукта.

Все введения химикатов в сельскохозяйственную культуру проводили в соответствии с обычной практикой сельскохозяйственных работников. Гербициды, наносимые осенью перед посадкой, состояли из глифосата (2,0 л га^-1) и метсульфурон-метила (6,8 г га^-1). Фунгицид наносили для борьбы с грибковыми заболеваниями листьев в исследованиях P12, D12, A12-1, A12-2, F12, H12, G12-1, G12-2 и I12. Фунгицид распыляли один раз в каждом исследовании, когда 50% делянок достигали стадии роста 5,1 (Zadoks, 1974). Инсектицидный спрей для борьбы со щитниками (видов Nezara, видов Piezodorus и видов Dichelops) наносили на стадии роста Задокса 3,1 в исследованиях A12-1, A12-2, D12, F12, P12. В отличие от этого, в исследованиях P13, D13, A13, F13, H13 и I13 выращивание проводили без фунгицидного или инсектицидного спрея из-за низкой нагрузки заболеваний и вредителей. Удобрения и химические вещества, вводимые в каждом исследовании, описаны в таблице 11.

Таблица 11. Введение удобрений и химических веществ для борьбы с вредителями в каждом исследовании ID участка Химическое вещество Стадия роста^a Уровень Единицы Назначение A12-1 Фосфат моноаммония^b GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина^c GS 2,4 150 кг га^-1 Удобрение Циперметрин 25 EC GS 3,1 25 г га^-1 Инсектицид Азоксистробин+ципроконазол (Amistar Xtra ® 28 SC) GS 5,1 0,5 л га^-1 Фунгицид A12-2 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,3 150 кг га^-1 Удобрение Циперметрин 25 EC GS 3,1 25 г га^-1 Инсектицид Азоксистробин+ципроконазол (Amistar Xtra ® 28 SC) GS 5,1 0,5 л га^-1 Фунгицид A13 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 0 150 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,6 150 кг га^-1 Удобрение D12 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,3 150 кг га^-1 Удобрение Циперметрин 25 EC GS 3,1 25 г га^-1 Инсектицид Азоксистробин+ципроконазол (Amistar Xtra ® 28 SC) GS 5,1 0,5 л га^-1 Фунгицид D13 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 0 150 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,6 150 кг га^-1 Удобрение F12 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,3 150 кг га^-1 Удобрение Циперметрин 25 EC GS 3,1 25 г га^-1 Инсектицид Азоксистробин+ципроконазол (Amistar Xtra ® 28 SC) GS 5,1 0,5 l га^-1 Фунгицид F13 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 0 150 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,6 150 кг га^-1 Удобрение ^a GS: Шкала Задокса (Zadoks, 1974)
^b Эквивалентая градация 11-52-0
^b Эквивалентая градация 46-0-0
Примечание: Доза в таблице соответствует коммерческому продукту

Таблица 11. Введение удобрений и химических веществ для борьбы с вредителями в каждом исследовании. Продолжение. ID участка Химическое вещество Стадия роста^a Уровень Единицы Назначение G12-1 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,3 150 кг га^-1 Удобрение Азоксистробин+ципроконазол (Amistar Xtra ® 28 SC) GS 5,1 0,5 л га^-1 Фунгицид G12-2 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,3 150 кг га^-1 Удобрение Азоксистробин+ципроконазол (Amistar Xtra ® 28 SC) GS 5,1 0,5 л га^-1 Фунгицид H12 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 3,1 300 кг га^-1 Удобрение Азоксистробин+ципроконазол (Amistar Xtra ® 28 SC) GS 5,1 0,5 л га^-1 Фунгицид H13 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 0 150 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,6 150 кг га^-1 Удобрение I12 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,3 150 кг га^-1 Удобрение Азоксистробин+ципроконазол (Amistar Xtra ® 28 SC) GS 5,1 0,5 л га^-1 Фунгицид I13 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 0 150 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,6 150 кг га^-1 Удобрение P12 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 2,3 150 кг га^-1 Удобрение Циперметрин 25 EC GS 3,1 25 г га^-1 Инсектицид Азоксистробин+ципроконазол (Amistar Xtra ® 28 SC) GS 5,1 0,5 л га^-1 Фунгицид P13 Фосфат моноаммония GS 0 160 кг га^-1 Удобрение Мочевина GS 0 150 кг га^-1 Удобрение

Агрономические данные оценивали в каждом полевом исследовании. Агрономические переменные состояли из раннего травостоя (NPL), количества колосьев на м^-2 (NE), количества зерен на колос^-1 (NGE), массы тысячи зерен (PMG), тестовой массы (PH), урожайности (REND), надземной биомассы (BMA) и уборочного индекса (IC).

Ранний травостой оценивали посредством подсчета появившихся растений на центральной площади делянки 0,6 м² до ветвления. NE, BMA, массу зерен (PG), PMG и IC оценивали при сборе для образца центральной делянки 0,6 м². PMG оценивали для образца 10 г зерен, собранных на каждой делянке. NGE рассчитывали в соответствии с:

NGE=(PG/NE) x 1000/PMG Ур. [1]

PH оценивали с использованием аргентинского стандартного протокола, используемого для коммерциализации пшеницы (шкала зерна Шоппера). Урожайность оценивали на пяти центральных рядах каждой делянки для исследований A12-1, A12-2, D12, F12 и H12. В остальных исследованиях, урожайность оценивали на полной делянке (7 рядов). Урожайность корректировали на влажность зерна (13,5%) и выражали как кг га^-1.

Данные для трансгенного объекта и контроля Cadenza анализировали с использованием ANOVA с полностью рандомизированной блочной схемой при доверительном уровне 95%, с использованием Infostat (Di Rienzo et al., 2010). Сравнения между трансгенным объектом и Cadenza проводили в комбинированном анализе участков по REND, PMG, PH, NPL, NE, NGE, BMA и IC. В этом анализе данные пулировали среди участков, и источники изменчивости включали генотипы (трансгенные и контрольные), условия окружающей среды и взаимодействие генотипа и условий окружающей среды.

В комбинированном анализе участков, детектированы три статистически значимых различия из 8 сравнений между IND-∅∅412-7 и контролем (таблица 12). Статистически значимое различие детектировано между IND-∅∅412-7 и общепринятым контролем для REND (p=0,0103), PMG (p=0,0039) и PH (p=0,0430). Кроме того, не детектировано статистически значимых взаимодействий исследования с генотипом.

REND IND-∅∅412-7 была на 133 кг га^-1 выше, чем для контроля, что представляет собой среднее увеличение урожайности 5%. И наоборот, для PMG и PH показаны более низкие значения для IND-∅∅412-7, по сравнению с контролем. Воспроизводимых различий не наблюдали для цикла или ответа на биотический стресс между объектом и родительским контролем. В целом, значимые различия в урожайности между IND-∅∅412-7 и контролем позволяют предполагать, что трансгенное объект образует больше семян на единицу площади земли. Меньший размер семени может возникать в результате более низкого соотношения источника-стока в ходе налива зерна, которое также приводит к более низкой PH. Различия между IND-∅∅412-7 и контролем представляли собой 5% и 2% для PMG и PH, соответственно.

Таблица 12. Сравнение между IND-∅∅412-7 и родительским контролем Cadenza в комбинированном анализе участков по урожайности и компонентам урожайности. Переменная^a Единица Среднее (MSE)^b IND-∅∅412-7 Cadenza NPL Растений м^-2 225 (6,7) 221 (6,7) NE Колосьев м^-2 412 (11,1) 410 (9,7) NGE Зерен колос^-1 21,7 (0,8) 21,8 (0,7) PMG г 28,3 (0,8) 29,7 (0,7) * PH кг гл^-1 63,7 (1,1) 64,8 (1,0) * УРОЖАЙНОСТЬ кг га^-1 2641 (163) 2508 (156) * BMA кг га^-1 10583 (743) 10081 (750) IC - 0,31 (0,01) 0,31 (0,01) ^a NPL= растений на м²; NE=колосьев на м²; NG=зерен колос^-1; PH=тестовая масса; PMG=масса тысячи зерен; REND=урожайность; BMA= надземная биомасса; IC=уборочный индекс. n=60 для NPL; n=56 для PMG, PH и REND; n=52 для NG и NE; n=24 для BMA и IC.
^b SE: стандартная ошибка среднего
* Статистически значимые различия (α=0,05) между контролем Cadenza и объектом IND-∅∅412-7

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Bioceres LLC

<120> ТРАНСГЕННОЕ СОБЫТИЕ ПШЕНИЦЫ IND-∅∅412-7

<130> 22108

<160> 14

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 47126

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Длинная вставка без фланкирующих областей

<400> 1

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 60

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 120

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 180

atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 240

aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 300

gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 360

catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 420

ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc 480

agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 540

gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 600

atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 660

attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc 720

caagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag 780

cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag 840

tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact ctacgaataa tataatctat 900

agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa tgaacagtta gacatggtct 960

aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg 1020

tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat acttcatcca ttttattagt 1080

acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact aattttttta gtacatctat 1140

tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact ctattttagt ttttttattt 1200

aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt 1260

aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt 1320

taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc 1380

caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct ggacccctct cgagagttcc 1440

gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga 1500

cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg gcaccggcag ctacggggga 1560

ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc 1620

ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc 1680

tcccccaaat ccacccgtcg gcgtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct 1740

tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt 1800

tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc 1860

tgtacgtcag acacgtaacg tccggagagt tcgtaaaccg atcatccgat tcttcaccgc 1920

tgccactact actagttttc tcttgatgct tttcggctac atttctcagc acctccaatt 1980

gattgagtag ggcctgattc tctttcttta gagactcgga tttagacgca agcgtctcgt 2040

agttatgctt tagcgcgtta tactcttgct caatctgcct cgactttgat cgcgcgcgtt 2100

tgttctggaa ccatatcgcc acttgacgag gatgaagccc gagtttatgt gccaactggt 2160

gtttcatcct taactcgggt ctcgactgtg tctcaaacat gtactctagg aaacttattt 2220

gtttgtcggt aaatcgtctc cgcccctcgt ttcggttctt cctggtggtt gttacttgtt 2280

gaagagacat ggatccgggt gtgatcctct atagtcgacc tgcagaagta acaccaaaca 2340

acagggtgag catcgacaaa agaaacagta ccaagcaaat aaatagcgta tgaaggcagg 2400

gctaaaaaaa tccacatata gctgctgcat atgccatcat ccaagtatat caagatcaaa 2460

ataattataa aacatacttg tttattataa tagataggta ctcaaggtta gagcatatga 2520

atagatgctg catatgccat catgtatatg catcagtaaa acccacatca acatgtatac 2580

ctatcctaga tcgatatttc catccatctt aaactcgtaa ctatgaagat gtatgacaca 2640

cacatacagt tccaaaatta ataaatacac caggtagttt gaaacagtat tctactccga 2700

tctagaacga atgaacgacc gcccaaccac accacatcat cacaaccaag cgaacaaaaa 2760

gcatctctgt atatgcatca gtaaaacccg catcaacatg tatacctatc ctagatcgat 2820

atttccatcc atcatcttca attcgtaact atgaatatgt atggcacaca catacagatc 2880

caaaattaat aaatccacca ggtagtttga aacagaattg gaattcgtaa tcatggtcat 2940

agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 3000

gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc 3060

gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 3120

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 3180

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 3240

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 3300

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 3360

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 3420

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 3480

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 3540

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 3600

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 3660

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 3720

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 3780

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 3840

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 3900

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 3960

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 4020

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 4080

aaacttggtc tgacagtttt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 4140

gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 4200

tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 4260

aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 4320

cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 4380

agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 4440

ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 4500

tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 4560

tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 4620

caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 4680

accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 4740

attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 4800

ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 4860

taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 4920

taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 4980

aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaaa actgtcagac 5040

caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 5100

taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 5160

cactgagcgt cagaccccgt agaaagatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag 5220

attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa 5280

gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag 5340

agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga 5400

taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg atccatgagc ccagaacgac 5460

gcccggccga catccgccgt gccaccgagg cggacatgcc ggcggtctgc accatcgtca 5520

accactacat cgagacaagc acggtcaact tccgtaccga gccgcaggaa ccgcaggagt 5580

ggacggacga cctcgtccgt ctgcgggagc gctatccctg gctcgtcgcc gaggtggacg 5640

gcgaggtcgc cggcatcgcc tacgcgggcc cctggaaggc acgcaacgcc tacgactgga 5700

cggccgagtc gaccgtgtac gtctcccccc gccaccagcg gacgggactg ggctccacgc 5760

tctacaccca cctgctgaag tccctggagg cacagggctt caagagcgtg gtcgctgtca 5820

tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg 5880

gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg ggaactggca tgacgtgggt ttctggcagc 5940

tggacttcag cctgccggta ccgccccgtc cggtcctgcc cgtcaccgag atcgatcgtt 6000

caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 6060

tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 6120

tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 6180

aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 6240

tagatcggaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 6300

caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 6360

tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 6420

cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 6480

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 6540

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 6600

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 6660

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 6720

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 6780

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 6840

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 6900

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 6960

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 7020

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 7080

ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 7140

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 7200

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 7260

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 7320

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 7380

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 7440

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 7500

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 7560

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 7620

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 7680

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 7740

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 7800

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 7860

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 7920

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 7980

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 8040

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 8100

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 8160

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 8220

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 8280

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 8340

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 8400

gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 8460

ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac 8520

acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 8580

cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat 8640

cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 8700

ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 8760

gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc 8820

gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg 8880

caagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag 8940

cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag 9000

tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact ctacgaataa tataatctat 9060

agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa tgaacagtta gacatggtct 9120

aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg 9180

tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat acttcatcca ttttattagt 9240

acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact aattttttta gtacatctat 9300

tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact ctattttagt ttttttattt 9360

aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt 9420

aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt 9480

taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc 9540

caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct ggacccctct cgagagttcc 9600

gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga 9660

cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg gcaccggcag ctacggggga 9720

ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc 9780

ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc 9840

tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc 9900

ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg gttagggccc ggtagttcta 9960

cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc tagcgttcgt 10020

acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct aacttgccag tgtttctctt 10080

tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca tgattttttt 10140

tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact 10200

tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtctggt 10260

tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg gatttattaa 10320

ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg 10380

gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg catatacaga 10440

gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt 10500

ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt 10560

atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag 10620

gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca 10680

tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata 10740

attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt 10800

ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac 10860

cctgttgttt ggtgttactt ctgcagggat ccatgagccc agaacgacgc ccggccgaca 10920

tccgccgtgc caccgaggcg gacatgccgg cggtctgcac catcgtcaac cactacatcg 10980

agacaagcac ggtcaacttc cgtaccgagc cgcaggaacc gcaggagtgg acggacgacc 11040

tcgtccgtct gcgggagcgc tatccctggc tcgtcgccga ggtggacggc gaggtcgccg 11100

gcatcgccta cgcgggcccc tggaaggcac gcaacgccta cgactggacg gccgagtcga 11160

ccgtgtacgt ctccccccgc caccagcgga cgggactggg ctccacgctc tacacccacc 11220

tgctgaagtc cctggaggca cagggcttca agagcgtggt cgctgtcatc gggctgccca 11280

acgacccgag cgtgcgcatg cacgaggcgc tcggatatgc cccccgcggc atgctgcggg 11340

cggccggctt caagcacggg aactggcatg acgtgggttt ctggcagctg gacttcagcc 11400

tgccggtacc gccccgtccg gtcctgcccg tcaccgagat cgatcgttca aacatttggc 11460

aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 11520

tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 11580

gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 11640

agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatctgctac 11700

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 11760

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 11820

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 11880

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 11940

aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 12000

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 12060

ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 12120

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 12180

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 12240

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 12300

atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 12360

aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 12420

gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 12480

catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 12540

ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc 12600

agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 12660

gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 12720

atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 12780

attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc 12840

caagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag 12900

cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag 12960

tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact ctacgaataa tataatctat 13020

agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa tgaacagtta gacatggtct 13080

aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg 13140

tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat acttcatcca ttttattagt 13200

acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact aattttttta gtacatctat 13260

tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact ctattttagt ttttttattt 13320

aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt 13380

aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt 13440

taaacgccgt ttgttgaata gaatacaaac cctagaaaaa caaggcacat ctcggcgccg 13500

ccaatagaag gcagaaaccc tagccgtcat ttttcttgaa gaatatagag cgacgtcgat 13560

aggaagatac ttaaatgttg aatccaagca cctagaataa tgagttagat tagaagaaaa 13620

ctatcaactt cgaaatcaag aagaaatgtt ttattctgtt gcataaaact ttcgcgtgga 13680

gaagctctgt tcagagcccg ggtagccact gggcacgtct cctagatact ggactcatcg 13740

gacgctctcc tcgagccatt aatatggtcc gtcctgtaga aaccccaacc cgtgaaatca 13800

aaaaactcga cggcctgtgg gcattcagtc tggatcgcga aaactgtgga attgatcagc 13860

gttggtggga aagcgcgtta caagaaagcc gggcaattgc tctcctgttc cgaccctgcc 13920

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 13980

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctcggca tccggtcagt 14040

ggcagtgaag ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg 14100

tcgtcatgaa gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga 14160

ccacgcattg atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc 14220

tgaagagatg ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc 14280

tgtcggcttt aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact 14340

gtacagcgaa gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga 14400

gctgatagcg cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc 14460

ggatacccgt ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa 14520

actcgacccg acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg ttctgcgacg ctcacaccga 14580

taccatcagc gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca 14640

aagcggcgat ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga 14700

gaaactgcat cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg gatacgttag ccgggctgca 14760

ctcaatgtac accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca 14820

ccgcgtcttt gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt 14880

tgcgacctcg caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct tcactcgcga 14940

ccgcaaaccg aagtcggcgg ctcgctcagt gtgtgtgact ctgctggtgc tggggaatgg 15000

agctcggggc accgtatttg tagcgcgcgc gccgctgtac gtggcgccct ggcgcggcta 15060

cgtggagggg agctgcgtgc cagaggggag gcgggccgcc acgtcgcacg gccgtgctta 15120

tcgggccatc ggcgaggtgc gtgccagctt gggcgtcgcg tgtcgtggag cgctcctgct 15180

cgcggcggag ctggttgagt ggattgcgat gcggtgcttg gtacagagct cgatggacaa 15240

ctcgaggaga gcgtccgatg agtccagtat ctaggagacg tgcccagtgg ctacccgggc 15300

tctgaacaga gcttctccac gcgaaagttt tatgcaacag aataaaacat ttcttcttga 15360

tttcgaagtt gatagttttc ttctaatcta actcattatt ctaggtgctt ggattcaaca 15420

tttaagtatc ttcctatcga cgtcgctcta tattcttcaa gaaaaatgac ggctagggtt 15480

tctgccttct attggtcatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 15540

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 15600

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 15660

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttttac caatgcttaa tcagtgaggc 15720

acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 15780

gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 15840

cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 15900

cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 15960

tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 16020

cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 16080

gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 16140

cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 16200

ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 16260

gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 16320

taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 16380

gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 16440

acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 16500

aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 16560

cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 16620

atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 16680

gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat 16740

cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 16800

gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 16860

gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca 16920

gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 16980

ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 17040

gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 17100

ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct 17160

tgcatgcctg cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc 17220

atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt 17280

ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat ctatagtact 17340

acaatgtacg ccgctcgtcc tccccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc 17400

cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt 17460

tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt 17520

ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc 17580

gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt 17640

ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt 17700

ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc 17760

tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat 17820

tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 17880

gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg 17940

tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta 18000

cctggtgtat ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga 18060

gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact 18120

gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta 18180

tctattataa taaacaagta tgttttataa ttattttgat cttgatatac ttggatgatg 18240

gcatatgcag cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc 18300

ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagtcgac 18360

tcgtagagga tccatcccga ttaggaaagt agagcatgag cccagaacga cgcccggccg 18420

acatccgccg tgccaccgag gcggacatgc cggcggtctg caccatcgtc aaccactaca 18480

tcgagacaag cacggtcaac ttccgtaccg agccgcagga accgcaggag tggacggacg 18540

acctcgtccg tctgcgggag cgctatccct ggctcgtcgc cgaggtggac ggcgaggtcg 18600

ccggcatcgc ctacgcgggc ccctggaagg cacgcaacgc ctacgactgg acggccgagt 18660

cgaccgtgta cgtctccccc cgccaccagc ggacgggact gggctccacg ctctacaccc 18720

acctgctgaa gtccctggag gcacagggct tcaagagcgt ggtcgctgtc atcgggctgc 18780

ccaacgaccc gagcgtgcgc atgcacgagg cgctcggata tgccccccgc ggcatgctgc 18840

gggcggccgg cttcaagcac gggaactggc atgacgtggg tttctggcag ctggacttca 18900

gcctgccggt accgccccgt ccggtcctgc ccgtcaccga gatcatatga atagatgctg 18960

catatgccat catgtatatg catcagtaaa acccacatca acatgtatac ctatcctaga 19020

tcgatatttc catccatctt aaactcgtaa ctatgaagat gtatgacaca cacatacagt 19080

tccaaaattt ataaatacac caggtagttt gaaacagtat tctactccga tctagaacga 19140

atgaacgacc gcccaaccac accacatcat cacaaccaag cgaacaaaaa gcatctctgt 19200

atatgcatca gtaaaacccg catcaacatg tatacctatc ctagatcgat atttccatcc 19260

atcatcttca attcgtaact atgaatatgt atggcacaca catacagatc caaaattaat 19320

aaatccacca ggtagtttga aacagaattc tactccgatc tagaacgacc gcccaaccag 19380

accacatcat cacaaccaag acaaaaaaaa gcatgaaaag atgacccgac aaacaagtgc 19440

acggcatata ttgaaataaa ggaaaagggc aaaccaaacc ctatgcaacg aaacaaaaaa 19500

aatcatgaaa tcgatcccgt ctgcggaacg gctagagcca tcccaggatt ccccaaagag 19560

aaacactggc aagttagcaa tcagaacgtg tctgacgtac aggtcgcatc cgtgtacgaa 19620

cgctagcagc acggatctaa cacaaacacg gatctaacac aaacatgaac agaagtagaa 19680

ctaccgggcc ctaaccatgg accggaacgc cgatctagag aaggtagaga gggggggggg 19740

gggaggacga gcggcgtacg ccgacgggtg gatttggggg agatctggtt gtgtgtgtgt 19800

gcgctccgaa caacacgagg ttggggaaag agggtgtgga gggggtgtct atttattacg 19860

gcgggcgagg aagggaaagc gaaggagcgg tgggaaagga atcccccgta gctgccggtg 19920

ccgtgagagg aggaggaggc cgcctgccgt gccggctcac gtctgccgct ccgccacgca 19980

atttctggat gccgacagcg gagcaagtcc aacggtggag cggaactctc gagaggggtc 20040

cagaggcagc gacagagatg ccgtgccgtc tgcttcgctt ggcccgacgc gacgctgctg 20100

gttcgctggt tggtgtccgt tagactcgtc gacggcgttt aacaggctgg cattatctac 20160

tcgaaacaag aaaaatgttt ccttagtttt tttaatttct taaagggtat ttgtttaatt 20220

tttagtcact ttattttatt ctattttata tctaaattat taaataaaaa aactaaaata 20280

gagttttagt tttcttaatt tagaggctaa aatagaataa aatagatgta ctaaaaaaat 20340

tagtctataa aaaccattaa ccctaaaccc taaatggatg tactaataaa atggatgaag 20400

tattatatag gtgaagctat ttgcaaaaaa aaaggagaac acatgcacac taaaaagata 20460

aaactgtaga gtcctgttgt caaaatactc aattgtcctt tagaccatgt ctaactgttc 20520

atttatatga ttctctaaaa cactgatatt attgtagtac tatagattat attattcgta 20580

gagtaaagtt taaatatatg tataaagata gataaactgc acttcaaaca agtgtgacaa 20640

aaaaaatatg tggtaatttt ttataactta gacatgcaat gctcattatc tctagagagg 20700

ggcacgaccg ggtcacgctg cactgcaggc atgcaagctt gcactggccg tcgttttaca 20760

acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc 20820

tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg 20880

cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 20940

ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca 21000

gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc 21060

cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc 21120

atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt 21180

catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 21240

ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 21300

ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt 21360

cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 21420

ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 21480

tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag 21540

cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 21600

actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga 21660

aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag 21720

tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 21780

ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 21840

tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 21900

gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 21960

gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt 22020

tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg 22080

gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat 22140

ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact 22200

gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa 22260

aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 22320

ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 22380

ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 22440

tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 22500

gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 22560

agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 22620

taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 22680

gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 22740

gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 22800

caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 22860

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 22920

tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 22980

acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 23040

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 23100

gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc 23160

tctccccgcg cgttggccga ttcatttatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 23220

agcgggcagt gagcgcaacg caatttatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc 23280

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt aagcttgcat gcctgcagtg cagcgtgacc 23340

cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca 23400

catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta 23460

aactttactc tacgaataat ataatctata gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa 23520

tcatataaat gaacagttag acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac 23580

tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac 23640

ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt 23700

ttatagacta atttttttag tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa 23760

actaaaactc tattttagtt tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa 23820

agtgactaaa aattaaacaa atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt 23880

cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt aaacgccgtc gacgagtcta acggacacca 23940

accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc aagcgaagca gacggcacgg catctctgtc 24000

gctgcctctg gacccctctc gagagttccg ctccaccgtt ggacttgctc cgctgtcggc 24060

atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac gtgagccggc acggcaggcg gcctcctcct 24120

cctctcacgg caccggcagc tacgggggat tcctttccca ccgctccttc gctttccctt 24180

cctcgcccgc cgtaataaat agacacccga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag 24240

ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt 24300

tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag 24360

tacctatcta ttataataaa caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg 24420

atgatggcat atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt 24480

atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt tacttctgca 24540

gggatccatg tctcttcaac aagtaacaac caccaggaag aaccgaaacg aggggcggag 24600

acgatttacc gacaaacaaa taagtttcct agagtacatg tttgagacac agtcgagacc 24660

cgagttaagg atgaaacacc agttggcaca taaactcggg cttcatcctc gtcaagtggc 24720

gatatggttc cagaacaaac gcgcgcgatc aaagtcgagg cagattgagc aagagtataa 24780

cgcgctaaag cataactacg agacgcttgc gtctaaatcc gagtctctaa agaaagagaa 24840

tcaggcccta ctcaatcaat tggaggtgct gagaaatgta gccgaaaagc atcaagagaa 24900

aactagtagt agtggcagcg gtgaagaatc ggatgatcgg tttacgaact ctccggacgt 24960

tatgtttggt caagaaatga atgttccgtt ttgcgacggt tttgcgtacc ttgaagaagg 25020

aaacagtttg ttggagattg aagaacaact gccagacctt caaaagtggt gggagttcga 25080

tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat 25140

gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat 25200

gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc 25260

gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat 25320

gttactagat cggaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 25380

gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 25440

atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 25500

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 25560

tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 25620

agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 25680

aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 25740

gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 25800

tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 25860

cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 25920

ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 25980

cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 26040

atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 26100

agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 26160

gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 26220

gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 26280

tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 26340

agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 26400

gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 26460

aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt gatcgttggg 26520

aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 26580

tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 26640

aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 26700

cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 26760

ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 26820

gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gatagaactg tcagaccaag 26880

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 26940

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 27000

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 27060

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 27120

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 27180

ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 27240

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 27300

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 27360

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 27420

agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 27480

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 27540

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 27600

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc gacgctgggc cgccttttta 27660

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 27720

tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata gtgtcacgca gatcctatga 27780

aatttggtcg atgattgtct tttatggatc cgttcagacc aagtcttcgt gtgtctatgt 27840

tatcgtgcct ttaaattgaa tcctttcgat ttatgcttct ttttgtcagc ggtggttgat 27900

cttctgatgt gctggttaca aagggtctta gcataacaat tttccaattg tctactacaa 27960

caagttttgt ctaacttcga tgaagcctag gtgatgacga tttcaacttg cttcggtgct 28020

tgtaactgtt attagatggt ctacggatct aaatgtaact tctattattt gttgtgtttt 28080

ttgtattatt atgatggatg atgaatagat taaaagatcc cgcaaataaa accttaaatg 28140

ataaatgtca cacgtcacgt gcatggcact ccggccctaa tgccttttgt agctattcta 28200

gtaacgcaag gatagcaaat ttccgtgaca cgacgcaagt ttttgttaaa aataaattaa 28260

agcaagaaaa ttgtcatact tgctaacgaa aattgccatc cttgcctatt catcatccat 28320

cataataata caaaaaacac aacaaataat agaagttaca tttagatccg tagaccatct 28380

aataacagtt acaagcaccg aagcaagttg gtgccgtctg cttcgcttgg cccgacgcga 28440

cgctgctggt tcgctggttg gtgtccgtta gactcgtcga cggcgtttaa caggctggca 28500

ttatctactc gaaacaagaa aaatgtttcc ttagtttttt taatttctta aagggtattt 28560

gtttaatttt tagtcacttt attttattct attttatatc taaattatta aataaaaaaa 28620

ctaaaataga gttttagttt tcttaattta gaggctaaaa tagaataaaa tagatgtact 28680

aaaaactcaa ttgtccttta gaccatgtct aactgttcat ttatatgatt ctctaaggca 28740

ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc 28800

cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 28860

ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt 28920

acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 28980

gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 29040

tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 29100

cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta 29160

tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 29220

ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattacca atgcttaatc 29280

agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 29340

gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 29400

ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 29460

gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 29520

cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 29580

acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 29640

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 29700

cctccgaata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 29760

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 29820

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 29880

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 29940

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 30000

tacatatttg aagatctcgg tgacgggcag gaccggacgg ggcggtaccg gcaggctgaa 30060

gtccagctgc cagaaaccca cgtcatgcca gttcccgtgc ttgaagccgg ccgcccgcag 30120

catgccgcgg ggggcatatc cgagcgcctc gtgcatgcgc acgctcgggt cgttgggcag 30180

cccgatgaca gcgaccacgc tcttgaagcc ctgtgcctcc agggacttca gcaggtgggt 30240

gtagagcgtg gagcccagtc ccgtccgctg gtggcggggg gagacgtaca cggtcgactc 30300

ggccgtccag tcgtaggcgt tgcgtgcctt ccaggggccc gcgtaggcga tgccggcgac 30360

ctcgccgtat ggatgaagta ttatataggt gaagctattt gcaaaaaaaa aggagaacac 30420

atgcacacta aaaagataaa actgtagagt cctgttgtca aaatactcaa ttgtccttta 30480

gaccatgtct aactgttcat ttatatgatt ctctaaaaca ctgatattat tgtagtacta 30540

tagattatat tattcgtaga gtaaagttta aatatatgta taaagataga taaactgcac 30600

ttcaaacaag tgtgacaaaa aaaatatgtg gtaatttttt ataacttaga catgcaatgc 30660

tcattatctc tagagagggg cacgaccggg tcacgctgca ctgcaggcat gcaagcttct 30720

gcagaagtaa caccaaacaa cagggtgagc atcgacaaaa gaaacagtac caagcaaata 30780

aatagcgtat gaaggcaggg ctaaaaaaat ccacatatag ctgctgcata tgccatcatc 30840

caagtatatc aagatcaaaa taattataaa acatacttgt ttattataat agataggtac 30900

tcaaggttag agcatatgaa tagatgctgc atatgccatc atgtatatgc atcagtaaaa 30960

cccacatcaa catgtatacc tatcctagat cgatatttcc atccatctta aactcgtaac 31020

tatgaagatg tatgacacac acatacagtt ccaaaattaa taaatacacc aggtagtttg 31080

aaacagtatt ctactccgat ctagaacgaa tgaacgaccg cccaaccaca ccacatcatc 31140

acaaccaagc gaacaaaaag catctctgta tatgcatcag taaaacccgc atcaacatgt 31200

atacctatcc tagatcgata tttccatcca tcatcttcaa ttcgtaacta tgaatatgta 31260

tggcacacac atacagatcc aaaattaata aatccaccag gtagtttgaa acagaattct 31320

actccgatct agaacgaccg cccaaccaga ccacatcatc acaaccaaga caaaaaaaag 31380

catgaaaaga tgacccgaca aacaagtgca cggcatatat tgaaataaag gaaaagggca 31440

aaccaaaccc tatgcaacga aacaaaaaaa atcatgaaat cgatcccgtc tgcggaacgg 31500

ctagagccat cccaggattc cccaaagaga aacactggca agttagcaat cagaacgtgt 31560

ctgacgtaca ggtcgcatcc gtgtacgaac gctagcagca cggatctaac acaaacacgg 31620

atctaacaca aacatgaaca gaagtagaac taccgggccc taaccatgga ccggaacgcc 31680

gatctagaga aggtagagag gggggggggg ggaggacgag cggcgtacct tgaagcggag 31740

gtgccgacgg gtggatttgg gggagatctg gttgtgtgtg tgtgcgctcc gaacaacacg 31800

aggttgggga aagagggtgt ggagggggtg tctatttatt acggcgggcg aggaagggaa 31860

agcgaaggag cggtgggaaa ggaatccccc gtagctgccg gtgccgtgag aggaggagga 31920

ggccgcctgc cgtgccggct cacgtctgcc gctccgccac gcaatttctg gatgccgaca 31980

gcggagcaag tccaacggtg gagcggaact ctcgagaggg gtccagaggc agcgacagag 32040

atgccgtgcc gtctgcttcg cttggcccga cgcgacgctg ctggttcgct ggttggtgtc 32100

cgttagactc gtcgacggcg tttaacaggc tggcattatc tactcgaaac aagaaaaatg 32160

tttccttagt ttttttaatt tcttaaaggg tatttgttta atttttagtc actttatttt 32220

attctatttt atatctaaat tattaaataa aaaaactaaa atagagtttt agttttctta 32280

atttagaggc taaaatagaa taaaatagat gtactaaaaa aattagtcta taaaaaccat 32340

taaccctaaa ccctaaatgg atgtactaat aaaatggatg aagtattata taggtgaagc 32400

tatttgcaaa aaaaaaggag aacacatgca cactaaaaag ataaaactgt agagtcctgt 32460

tgtcaaaata ctcaattgtc ctttagacca tgtctaactg ttcatttata tgattctcta 32520

aaacactgat attattgtag tactatagat tatattattc gtagagtaaa gtttaaatat 32580

atgtataaag atagataaac tgcacttcaa acaagtgtga caaaaaaaat atgtggtaat 32640

tttttataac ttagacatgc aatgctcatt atctctagag aggggcacga ccgggtcacg 32700

ctgcactgca ggcatgcaag cttgcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 32760

accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 32820

atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 32880

ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 32940

gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 33000

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 33060

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 33120

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 33180

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 33240

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 33300

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 33360

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 33420

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 33480

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 33540

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 33600

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 33660

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 33720

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 33780

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 33840

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 33900

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 33960

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 34020

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 34080

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 34140

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 34200

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 34260

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 34320

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 34380

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 34440

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 34500

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 34560

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 34620

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 34680

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 34740

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 34800

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 34860

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 34920

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 34980

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 35040

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 35100

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 35160

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 35220

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 35280

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 35340

accatgatta cgaattccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat 35400

cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta 35460

ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg 35520

caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta 35580

tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgatctcggt gacgggcagg accggacggg 35640

gcggtaccgg caggctgaag tccagctgcc agaaacccac gtcatgccag ttcccgtgct 35700

tgaagccggc cgcccgcagc atgccgcggg gggcatatcc gagcgcctcg tgcatgcgca 35760

cgctcgggtc gttgggcagc ccgatgacag cgaccacgct cttgaagccc tgtgcctcca 35820

gggacttcag caggtgggtg tagagcgtgg agcccagtcc cgtccgctgg tggcgggggg 35880

agacgtacac ggtcgactcg gccgtccagt cgtaggcgtt gcgtgccttc caggggcccg 35940

cgtaggcgat gccggcgacc tcgccgtcca cctcggcgac gagccaggga tagcgctccc 36000

gcagacggac gaggtcgtcc gtccactcct gcggttcctg cggctcggta cggaagttga 36060

ccgtgcttgt ctcgatgtag tggttgacga tggtgcagac cgccggcatg tccgcctcgg 36120

tggcacggcg gatgtcggcc gggcgtcgtt ctgggctcat ggatccaagc ttgcatgcct 36180

gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag 36240

ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc 36300

tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata 36360

tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt 36420

attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt 36480

ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt 36540

ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag 36600

cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata 36660

aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa 36720

ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg 36780

agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg 36840

gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac 36900

ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg 36960

caggcggcct cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc 37020

tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt 37080

ccccaacctc gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc 37140

cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc cccccccccc tctctacctt 37200

ctctagatcg gcgttccggt ccatggttag ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt 37260

gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg gatgcgacct 37320

gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga 37380

tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag 37440

ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat 37500

cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta 37560

gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg 37620

tgtgtgccat acatattcat agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag 37680

gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg 37740

cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga 37800

atactgtttc aaactacctg gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac 37860

atcttcatag ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt 37920

tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc 37980

taaccttgag tacctatcta ttataataaa caagtatgtt ttataattat tttgatcttg 38040

atatacttgg atgatggcat atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc cctgccttca 38100

tacgctattt atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt 38160

tacttctgca gggatccatg agcccagaac gacgcccggc cgacatccgc cgtgccaccg 38220

aggcggacat gccggcggtc tgcaccatcg tcaaccacta catcgagaca agcacggtca 38280

acttccgtac cgagccgcag gaaccgcagg agtggacgga cgacctcgtc cgtctgcggg 38340

agcgctatcc ctggctcgtc gccgaggtgg acggcgaggt cgccggcatc gcctacgcgg 38400

gcccctggaa ggcacgcaac gcctacgact ggacggccga gtcgaccgtg tacgtctccc 38460

cccgccacca gcggacggga ctgggctcca cgctctacac ccacctgctg aagtccctgg 38520

aggcacaggg cttcaagagc gtggtcgctg tcatcgggct gcccaacgac ccgagcgtgc 38580

gcatgcacga ggcgctcgga tatgcccccc gcggcatgct gcgggcggcc ggcttcaagc 38640

acgggaactg gcatgacgtg ggtttctggc agctggactt cagcctgccg gtaccgcccc 38700

gtccggtcct gcccgtcacc gagatctgat ccgtcgacct gcagatcgtt caaacatttg 38760

gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt 38820

tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag 38880

atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat 38940

atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatcggaa 39000

ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 39060

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 39120

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 39180

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 39240

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 39300

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 39360

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 39420

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 39480

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 39540

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 39600

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 39660

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 39720

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 39780

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 39840

cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 39900

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 39960

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 40020

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 40080

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 40140

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 40200

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 40260

aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 40320

acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 40380

aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 40440

agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 40500

ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 40560

agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 40620

tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 40680

tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 40740

attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 40800

taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 40860

aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 40920

caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 40980

gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 41040

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 41100

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 41160

acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 41220

gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 41280

cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 41340

cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat 41400

tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata 41460

ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg 41520

ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg 41580

ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg caagcttgca 41640

tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag cattgcatgt 41700

ctaagttata aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat 41760

ctatctttat acatatattt aaactttact ctacgaataa tataatctat agtactacaa 41820

taatatcagt gttttagaga atcatataaa tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat 41880

tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt 41940

tttttttgca aatagcttca cctatataat acttcatcca ttttattagt acatccattt 42000

agggtttagg gttaatggtt tttatagact aattttttta gtacatctat tttattctat 42060

tttagcctct aaattaagaa aactaaaact ctattttagt ttttttattt aataatttag 42120

atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa 42180

aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt taaacgccgt 42240

cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc 42300

agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt 42360

tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg 42420

cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc 42480

accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc 42540

tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc tcccccaaat 42600

ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc ccccctctct 42660

accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg gttagggccc ggtagttcta cttctgttca 42720

tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc tagcgttcgt acacggatgc 42780

gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct aacttgccag tgtttctctt tggggaatcc 42840

tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca tgattttttt tgtttcgttg 42900

catagggttt ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact tgtttgtcgg 42960

gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtctggt tgggcggtcg 43020

ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg gatttattaa ttttggatct 43080

gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg gaaatatcga 43140

tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg catatacaga gatgcttttt 43200

gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt ctagatcgga 43260

gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt atgtgtgtgt 43320

catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag gataggtata 43380

catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca tctattcata 43440

tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata attattttga 43500

tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt ttagccctgc 43560

cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac cctgttgttt 43620

ggtgttactt ctgcaggtcg actctagagg atccatcgat taggaagtaa ccatgagccc 43680

agaacgacgc ccggccgaca tccgccgtgc caccgaggcg gacatgccgg cggtctgcac 43740

catcgtcaac cactacatcg agacaagcac ggtcaacttc cgtaccgagc cgcaggaacc 43800

gcaggagtgg acggacgacc tcgtccgtct gcgggagcgc tatccctggc tcgtcgccga 43860

ggtggacggc gaggtcgccg gcatcgccta cgcgggcccc tggaaggcac gcaacgccta 43920

cgactggacg gccgagtcga ccgtgtacgt ctccccccgc caccagcgga cgggactggg 43980

ctccacgctc tacacccacc tgctgaagtc cctggaggca cagggcttca agagcgtggt 44040

cgctgtcatc gggctgccca acgacccgag cgtgcgcatg cacgaggcgc tcggatatgc 44100

cccccgcggc atgctgcggg cggccggctt caagcacggg aactggcatg acgtgggttt 44160

ctggcagctg gacttcagcc tgccggtacc gccccgtccg gtcctgcccg tcaccgagat 44220

ctgatccgtc gacctgcaga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat 44280

cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta 44340

ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg 44400

caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta 44460

tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cggaattcgt aatcatggtc atagctgttt 44520

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 44580

tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 44640

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 44700

gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 44760

tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 44820

acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 44880

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 44940

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 45000

gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 45060

tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 45120

tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 45180

cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 45240

gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 45300

ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt 45360

ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 45420

ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 45480

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 45540

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 45600

atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 45660

tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 45720

tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 45780

tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 45840

gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 45900

tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 45960

ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 46020

gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 46080

aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 46140

ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 46200

tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 46260

ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 46320

aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 46380

ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 46440

ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 46500

agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 46560

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 46620

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt 46680

atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc 46740

ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 46800

taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 46860

cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg 46920

tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc 46980

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 47040

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 47100

cgacgttgta aaacgacggc cagtgc 47126

<210> 2

<211> 19598

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Короткая вставка без фланкирующих областей

<400> 2

ttggaacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga 60

actacttact ctagcttccc ggtaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgt 120

aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc 180

cggactctag gcttcccggg caacaaatta attagactgg atggagggat aaagtttgca 240

gaccactttc tgcgctcggc ccttccgctg ggctgttcta tgcccgctga aatcaccagt 300

ctctctctac aaatctatct ctctctataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa 360

ttagggttct tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat 420

ttgtatttgg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 480

atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg 540

ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 600

cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc 660

cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gcaagcttgc atgcctgcag tgcagcgtga 720

cccggtcgtg cccctctcta gagataatga gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac 780

cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta tacatatatt 840

taaactttac tctacgaata atataatcta tagtactaca ataatatcag tgttttagag 900

aatcatataa atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg 960

actctacagt tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc 1020

acctatataa tacttcatcc attttattag tacatccatt tagggtttag ggttaatggt 1080

ttttatagac taattttttt agtacatcta ttttattcta ttttagcctc taaattaaga 1140

aaactaaaac tctattttag tttttttatt taataattta gatataaaat agaataaaat 1200

aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt 1260

ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac 1320

caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg 1380

tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg 1440

gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc 1500

ctcctctcac ggcaccggca gctacggggg attcctttcc caccgctcct tcgctttccc 1560

ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt 1620

tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcgtacgcc 1680

gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt 1740

agggcccggt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc 1800

gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac 1860

ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc 1920

gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc 1980

aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttcctgt 2040

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 2100

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 2160

agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 2220

tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 2280

tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 2340

cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 2400

aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 2460

tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 2520

tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactgtt attgccggga aaagtgtacg 2580

tatcaccgtt tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact atcccctgca gaagtaacac 2640

caaacaacag ggtgagcatc gacaaaagaa acagtaccaa gcaaataaat agcgtatgaa 2700

ggcagggcta aaaaaatcca catatagctg ctgcatatgc catcatccaa gtatatcaag 2760

atcaaaataa ttataaaaca tacttgttta ttataataga taggtactca aggttagagc 2820

atatgaatag atgctgcata tgccatcatg tatatgcatc agtaaaaccc acatcaacat 2880

gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcttaaac tcgtaactat gaagatgtat 2940

gacacacaca tacagttcca aaattaataa atacaccagg tagtttgaaa cagtattcta 3000

ctccgatcta gaacgaatga acgaccgccc aaccacacca catcatcaca accaagcgaa 3060

caaaaagcat ctctgtatat gcatcagtaa aacccgcatc aacatgtata cctatcctag 3120

aagtactata gattatatta ttcgtagagt aaagtttaaa tatatgtata aagatagata 3180

aactgcactt caaacaagtg tgacaaaaaa aatatgtggt aattttttat aacttagaca 3240

tgcaatgctc attatctcta gagaggggca cgaccgggtc acgctgcact gcaggcatgc 3300

aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 3360

acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 3420

caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta 3480

ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat 3540

ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc 3600

ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag 3660

ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt 3720

gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg 3780

cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattacca 3840

atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 3900

ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 3960

tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 4020

agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 4080

taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 4140

tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 4200

cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 4260

ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 4320

tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 4380

tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 4440

cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 4500

tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 4560

gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 4620

tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 4680

atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 4740

tctcatgagc ggatacatat ttgaaaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 4800

attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 4860

ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 4920

aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taagccaata gaaggcagaa 4980

accctagccg tcatttttct tgaagaatat agagcgacgt cgataggaag atacttaaat 5040

gttgaatcca agcacctaga ataatgagtt agattagaag aaaactatca acttcgaaat 5100

caagaagaaa tgttttattc tgttgcataa aactttcgcg tggagaagct ctgttcagag 5160

cccgggtagc cactgggcac gtctcctaga tactggactc atcggacgct ctcctcgagt 5220

tgtccatcga gctctgtacc aagcaccgca tcgcaatcca ctcaaccagc tccgccgcga 5280

gcaggagcgc tccacgacac gcgacgccca agctggcacg cacctcgccg atggcccgat 5340

aagcacggcc gtgcgacgtg gcggcccgcc tcccctctgg cacgcagctc ccctccacgt 5400

agccgcgcca gggcgccacg tacagcggcg cgcgcgctac aaatacggtg ccccgagctc 5460

cattccccag caccagcaga gtcacacaca ctgagcgagc taaaccatca ggaagtgatg 5520

gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca cgccgtatgt tattgccggg 5580

aaaagtgtac gtatcaccgt ttgtgccgga atccatcgca gcgtaatgct ctacaccacg 5640

ccgaacacct gggtggacga tatcaccgtg gtgacgcatg tcgcgcaaga ctgtaaccac 5700

gcgtctgttg actggcaggt ggtggccaat ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg 5760

gatcaacagg tggttgcaac tggacaaggc actagcggga ctttgcaagt ggtgaatccg 5820

cacctctggc aaccgggtga aggttatctc tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag 5880

acagagtgtg atatctaccc gcttcgcgtc ggcatccggt cagtggcagt gaagggcgaa 5940

cagttcctga ttaaccacaa accgttctac tttactggct ttggtcgtca tgaagatgcg 6000

gacttgcgtg gcaaaggatt cgataacgtg ctgttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 6060

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 6120

aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 6180

acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 6240

aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 6300

agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 6360

ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 6420

agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 6480

tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 6540

tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 6600

attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 6660

taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 6720

aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 6780

caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 6840

gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 6900

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 6960

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 7020

acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 7080

gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 7140

cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 7200

cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat 7260

tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata 7320

ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg 7380

ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg 7440

ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg caagcttgca 7500

tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag cattgcatgt 7560

ctaagttata aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat 7620

ctatctttat acatatattt aaactttact ctacgaataa tataatctat agtactacaa 7680

taatatcagt gttttagaga atcatataaa tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat 7740

tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt 7800

tttttttgca aatagcttca cctatataat acttcatcca ttttattagt acatccattt 7860

agggtttagg gttaatggtt tttatagact aattttttta gtacatctat tttattctat 7920

tttagcctct aaattaagaa aactaaaact ctattttagt ttttttattt aataatttag 7980

atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa 8040

aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt taaacgccgt 8100

cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc 8160

agacggcacg gcatctctgt ctgaatagaa tacaaaccct agaaaaacaa ggcacatctc 8220

ggcgccgcca atagaaggca gaaaccctag ccgtcatttt tcttgaagaa tatagagcga 8280

cgtcgatagg aagatactta aatgttgaat ccaagcacct agaataatga gttagattag 8340

aagaaaacta tcaacttcga aatcaagaag aaatgtttta ttctgttgca taaaactttc 8400

gcgtggagaa gctctgttca gagcccgggt agccactggg cacgtctcct agatactgga 8460

ctcatcggac gctctcctcg agttgtccat cgagctctgt accaagcacc gcatcgcaat 8520

ccactcaacc agctccgccg cgagcaggag cgctccacga cacgcgacgc ccaagctggc 8580

acgcacctcg ccgatggccc gataagcacg gccgtgcgac gtggcggccc gcctcccctc 8640

tggcacgcag ctcccctcca cgtagccgcg ccagggcgcc acgtacagcg gcgcgcgcgc 8700

tacaaatacg gtgccccgag ctccattccc cagcaccagc agagtcacac acactgagcg 8760

agctaaacca tggtatagcc gccctgatgc tccatcactt cctgattatt gacccacact 8820

ttgccgtaat gagtgaccgc atcgaaacgc agcacgatac gctggcctgc ccaacctttc 8880

ggtataaaga cttcgcgctg ataccagacg ttgcccgcat aattacgaat atctgcatcg 8940

gcgaactgat cgttaaaact gcctggcaca gcaattgccc ggctttcttg taacgcgctt 9000

tcccaccaac gctgatcaat tccacagttt tcgcgatcca gactgaatgc ccacaggccg 9060

tcgagttttt tgatttcacg ggttggggtt tctacaggac gctattaatt gttgccggga 9120

agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 9180

catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 9240

aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 9300

gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttcact gtcagaccaa 9360

gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 9420

gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac 9480

tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc 9540

gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 9600

caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 9660

actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 9720

acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 9780

cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 9840

gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta 9900

cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 9960

gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 10020

tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc 10080

tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg 10140

gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat 10200

aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc 10260

agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg 10320

cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt 10380

gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt 10440

atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac 10500

agctatgacc atgattacga attccgatct agtaacatag atgacaccgc gcgcgataat 10560

ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt attaaatgta taattgcggg 10620

actctaatca taaaaaccca tctcataaat aacgtcatgc attacatgtt aattattaca 10680

tgcttaacgt aattcaacag aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc 10740

aatcttaaga aactttattg ccaaatgttt gaacgatctg caggtcgacg gatcagatct 10800

cggtgacggg caggaccgga cggggcggta ccggcaggct gaagtccagc tgccagaaac 10860

ccacgtcatg ccagttcccg tgcttgaagc cggccgcccg cagcatgccg cggggggcat 10920

atccgagcgc ctcgtgcatg cgcacgctcg ggtcgttggg cagcccgatg acagcgacca 10980

cgctcttgaa gccctgtgcc tccagggact tcagcaggtg ggtgtagagc gtggagccca 11040

gtcccgtccg ctggtggcgg ggggagacgt acacggtcga ctcggccgtc cagtcgtagg 11100

cgttgcgtgc cttccagggg cccgcgtagg cgatgccggc gacctcgccg tccacctcgg 11160

cgacgagcca gggatagcgc tcccgcagac ggacgaggtc gtccgtccac tcctgcggtt 11220

cctgcggctc ggtacggaag ttgaccgtgc ttgtctcgat gtagtggttg acgatggtgc 11280

agaccgccgg catgtccgcc tcggtggcac ggcggatgtc ggccgggcgt cgttctgggc 11340

tcatggatcc agctccgccg cgagcaggag cgctccacga cacgcgacgc ccaagctggc 11400

acgcacctcg ccgatggccc gataaggcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 11460

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 11520

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 11580

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 11640

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 11700

ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 11760

aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 11820

atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 11880

ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 11940

tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 12000

agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 12060

taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 12120

tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 12180

cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 12240

ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 12300

tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 12360

tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 12420

cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 12480

tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 12540

gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 12600

tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 12660

atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 12720

tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 12780

cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 12840

ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 12900

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 12960

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa 13020

ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca 13080

cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg 13140

ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg 13200

tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac 13260

gacggccagt gcaagcttgc atgcctgcag tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta 13320

gagataatga gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca 13380

cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta tacatatatt taaactttac tctacgaata 13440

atataatcta tagtactaca ataatatcag tgttttagag aatcatataa atgaacagtt 13500

agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg actctacagt tttatctttt 13560

tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc acctatataa tacttcatcc 13620

attttattag tacatccatt tagggtttag ggttaatggt ttttatagac taattttttt 13680

agtacatcta ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac tctattttag 13740

tttttttatt taataattta gatataaaat agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac 13800

aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa 13860

tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac caaccagcga accagcagcg 13920

tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc 13980

tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc 14040

ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc ctcctctcac ggcaccggca 14100

gctacggggg attcctttcc caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa 14160

atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac 14220

acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcgtacgcc gctcgtcctc cccccccccc 14280

cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt 14340

ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca 14400

cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg 14460

ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt 14520

ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt 14580

ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg 14640

gcggtcgttc tagatcggag tagaattccc cgatctagta acatagatga caccgcgcgc 14700

gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat 14760

tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcatta catgttaatt 14820

attacatgct taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca 14880

ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa attcgagctc 14940

ttagaactcc caccactttt ggaactccca ccacttttga aggtctggca gttgttcttc 15000

aatctccaac aaactgtttc cttcttcaag gtacgcaaaa ccgtcgcaaa acggaacatt 15060

catttcttga ccaaacataa cgtccggaga gttcgtaaac cgatcatccg attcttcacc 15120

gctgccacta ctactagttt tctcttgatg cttttcggct acatttctca gcacctccaa 15180

ttgattgagt agggcctgat tctctttctt tagagactcg gatttagacg caagcgtctc 15240

gtagttatgc tttagcgcgt tatactcttg ctcaatctgc ctcgactttg atcgcgcgcg 15300

tttgttctgg aaccatatcg ccacttgacg aggatgaagc ccgagtttat gtgccaactg 15360

gtgtttcatc cttaactcgg gtctcgactg tgtctcaaac atgtactcta ggaaacttat 15420

ttgtttgtcg gtaaatcgtc tccgcccctc gtttcggttc ttcctggtgg ttgttacttg 15480

ttgaagagac atggatccga gtcgacctgc agaagtaaca ccaaacaaca gggtgacact 15540

cgacaaaaga aacagtacca agcaaataaa tagcgtatga aggcagggct aaaaaaatcc 15600

acatatagct gctgcatatg ccatcatcca agtatatcaa gatcaaaata attataaaac 15660

atacttgttt attataatag ataggtactc aaggttagag catatgaata gatgctgcat 15720

atgccatcat gtatatgcat cagtaaaacc cacatcaaca tgtataccta tcctagatcg 15780

atatttccat ccatcttaaa ctcgtaacta tgaacgctgt cttgacacac acatacagtt 15840

ccaaaattaa taaatacacc aggtagtttg aaacagtatt ctactccgat ctagaacgaa 15900

tgaacgaccg cccaaccaca ccacatcatc acaaccaagc gaacaaaaag catctctgta 15960

tatgcatcag taaaacccgc atcaacatgt atacctatcc tagatcgata tttccatcca 16020

tcatcttcaa ttcgtaacta tgaatatgta tggcacacac atacagatcc aaaattaata 16080

aatccaccag gtagtttgaa acagaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 16140

aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 16200

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 16260

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 16320

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 16380

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 16440

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 16500

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 16560

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 16620

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 16680

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 16740

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 16800

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 16860

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 16920

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 16980

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 17040

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 17100

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 17160

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 17220

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 17280

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagtttga ggcacctatc tcagcgatct 17340

gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 17400

agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 17460

cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 17520

ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 17580

cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 17640

cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 17700

ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 17760

tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 17820

catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 17880

gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 17940

gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 18000

tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 18060

catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 18120

aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 18180

attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 18240

aaaataaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag 18300

tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta 18360

tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc 18420

agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc 18480

agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc 18540

agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa 18600

aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg 18660

tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa 18720

gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc 18780

ttgcatgcct gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg 18840

catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag 18900

tttatctatc tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac 18960

tacaataata tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg 19020

acaattgagt attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc 19080

tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc 19140

catttagggt ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat 19200

tctattttag cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa 19260

tttagatata aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa 19320

attaaaaaaa ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac 19380

gccgtcgacg agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc 19440

gaagcagacg gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc 19500

accgttggac ttgctccctt tattttattc tattttatat ctaaattatt aaataaaaaa 19560

actaaaatag agttttagtt ttcttaattt agaggcta 19598

<210> 3

<211> 5470

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pIND4+HB4

<400> 3

aagcttgcat gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc 60

attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt 120

gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata 180

gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta 240

aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt 300

gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta 360

catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt 420

ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta 480

ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta 540

agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt 600

aaacgccgtc gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc 660

aagcgaagca gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg 720

ctccaccgtt ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac 780

gtgagccggc acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg caccggcagc tacgggggat 840

tcctttccca ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc 900

tccacaccct ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct 960

cccccaaatc cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc 1020

cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac 1080

ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta 1140

cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt 1200

ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt 1260

gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt 1320

gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt 1380

gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat 1440

tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg 1500

aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag 1560

atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc 1620

tagatcggag tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat ttattaattt tggaactgta 1680

tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg 1740

ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcagcat 1800

ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860

ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920

tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc 1980

ctgttgtttg gtgttacttc tgcaggtcga ctctagagga tccgatccac catgtctctt 2040

caacaagtaa caaccaccag gaagaaccga aacgaggggc ggagacgatt taccgacaaa 2100

caaataagtt tcctagagta catgtttgag acacagtcga gacccgagtt aaggatgaaa 2160

caccagttgg cacataaact cgggcttcat cctcgtcaag tggcgatatg gttccagaac 2220

aaacgcgcgc gatcaaagtc gaggcagatt gagcaagagt ataacgcgct aaagcataac 2280

tacgagacgc ttgcgtctaa atccgagtct ctaaagaaag agaatcaggc cctactcaat 2340

caattggagg tgctgagaaa tgtagccgaa aagcatcaag agaaaactag tagtagtggc 2400

agcggtgaag aatcggatga tcggtttacg aactctccgg acgttatgtt tggtcaagaa 2460

atgaatgttc cgttttgcga cggttttgcg taccttgaag aaggaaacag tttgttggag 2520

attgaagaac aactgccaga ccttcaaaag tggtgggagt tctaagagct cgaatttccc 2580

cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 2640

gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 2700

catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 2760

cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 2820

tatgttacta gatcggaatt cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta 2880

tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc 2940

ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 3000

aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 3060

tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 3120

gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 3180

cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 3240

gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 3300

aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 3360

ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 3420

cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 3480

ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 3540

cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 3600

agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 3660

gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 3720

gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 3780

tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 3840

agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 3900

agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 3960

atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 4020

cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 4080

actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 4140

aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 4200

cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 4260

ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 4320

cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 4380

ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 4440

cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 4500

ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 4560

tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 4620

ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 4680

aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 4740

gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 4800

gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 4860

ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4920

catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 4980

atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 5040

taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa 5100

cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag 5160

cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta 5220

tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag 5280

atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg 5340

ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc 5400

tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac 5460

ggccagtgcc 5470

<210> 4

<211> 5496

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pIND4+BAR

<400> 4

aagcttgcat gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc 60

attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt 120

gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata 180

gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta 240

aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt 300

gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta 360

catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt 420

ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta 480

ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta 540

agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt 600

aaacgccgtc gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc 660

aagcgaagca gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg 720

ctccaccgtt ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac 780

gtgagccggc acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg caccggcagc tacgggggat 840

tcctttccca ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc 900

tccacaccct ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct 960

cccccaaatc cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc 1020

cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac 1080

ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta 1140

cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt 1200

ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt 1260

gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt 1320

gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt 1380

gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat 1440

tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg 1500

aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag 1560

atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc 1620

tagatcggag tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat ttattaattt tggaactgta 1680

tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg 1740

ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcagcat 1800

ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860

ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920

tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc 1980

ctgttgtttg gtgttacttc tgcaggtcga ctctagagga tccatcgatt aggaagtaac 2040

catgagccca gaacgacgcc cggccgacat ccgccgtgcc accgaggcgg acatgccggc 2100

ggtctgcacc atcgtcaacc actacatcga gacaagcacg gtcaacttcc gtaccgagcc 2160

gcaggaaccg caggagtgga cggacgacct cgtccgtctg cgggagcgct atccctggct 2220

cgtcgccgag gtggacggcg aggtcgccgg catcgcctac gcgggcccct ggaaggcacg 2280

caacgcctac gactggacgg ccgagtcgac cgtgtacgtc tccccccgcc accagcggac 2340

gggactgggc tccacgctct acacccacct gctgaagtcc ctggaggcac agggcttcaa 2400

gagcgtggtc gctgtcatcg ggctgcccaa cgacccgagc gtgcgcatgc acgaggcgct 2460

cggatatgcc ccccgcggca tgctgcgggc ggccggcttc aagcacggga actggcatga 2520

cgtgggtttc tggcagctgg acttcagcct gccggtaccg ccccgtccgg tcctgcccgt 2580

caccgagatc tgatccgtcg acctgcagat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta 2640

agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt 2700

aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt 2760

agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag 2820

gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc ggaattcgta atcatggtca 2880

tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 2940

agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 3000

cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 3060

caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 3120

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 3180

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 3240

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 3300

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 3360

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 3420

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 3480

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 3540

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 3600

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 3660

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 3720

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 3780

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 3840

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 3900

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 3960

ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 4020

taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 4080

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 4140

ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 4200

gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 4260

ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 4320

gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 4380

tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 4440

atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 4500

gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 4560

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 4620

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 4680

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 4740

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 4800

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 4860

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 4920

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 4980

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 5040

accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc 5100

gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 5160

gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 5220

ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 5280

catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat 5340

tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta 5400

cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt 5460

tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgcc 5496

<210> 5

<211> 47611

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Длинная вставка с фланкирующими областями

<400> 5

taatggtgag tgtatgcgct tgcgtctgta ttgtgtttaa aaaactcatt ctaagaaact 60

cgtcatacag tgtccaccgt caaggagcca tctagtaggg tgtggatggg catgtgacag 120

gaaccttgtc gtgtgcacgt tgtatgtcgg tcttgttcaa tatgtcgtct gtttcctcgg 180

cttacatgct cttttacgtg tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 240

agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 300

acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 360

ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 420

gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 480

acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat 540

gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 600

gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 660

tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 720

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 780

cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 840

gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt 900

tgtaaaacga cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc 960

ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt 1020

tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact 1080

ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa 1140

tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt 1200

ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat 1260

acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact 1320

aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact 1380

ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa 1440

aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg 1500

agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa 1560

ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct 1620

ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa 1680

ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg 1740

gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg 1800

ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg 1860

cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcgtacgccg ctcgtcctcc 1920

cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta 1980

gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc 2040

gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgtaacg tccggagagt tcgtaaaccg 2100

atcatccgat tcttcaccgc tgccactact actagttttc tcttgatgct tttcggctac 2160

atttctcagc acctccaatt gattgagtag ggcctgattc tctttcttta gagactcgga 2220

tttagacgca agcgtctcgt agttatgctt tagcgcgtta tactcttgct caatctgcct 2280

cgactttgat cgcgcgcgtt tgttctggaa ccatatcgcc acttgacgag gatgaagccc 2340

gagtttatgt gccaactggt gtttcatcct taactcgggt ctcgactgtg tctcaaacat 2400

gtactctagg aaacttattt gtttgtcggt aaatcgtctc cgcccctcgt ttcggttctt 2460

cctggtggtt gttacttgtt gaagagacat ggatccgggt gtgatcctct atagtcgacc 2520

tgcagaagta acaccaaaca acagggtgag catcgacaaa agaaacagta ccaagcaaat 2580

aaatagcgta tgaaggcagg gctaaaaaaa tccacatata gctgctgcat atgccatcat 2640

ccaagtatat caagatcaaa ataattataa aacatacttg tttattataa tagataggta 2700

ctcaaggtta gagcatatga atagatgctg catatgccat catgtatatg catcagtaaa 2760

acccacatca acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc catccatctt aaactcgtaa 2820

ctatgaagat gtatgacaca cacatacagt tccaaaatta ataaatacac caggtagttt 2880

gaaacagtat tctactccga tctagaacga atgaacgacc gcccaaccac accacatcat 2940

cacaaccaag cgaacaaaaa gcatctctgt atatgcatca gtaaaacccg catcaacatg 3000

tatacctatc ctagatcgat atttccatcc atcatcttca attcgtaact atgaatatgt 3060

atggcacaca catacagatc caaaattaat aaatccacca ggtagtttga aacagaattg 3120

gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 3180

acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 3240

actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 3300

gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 3360

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 3420

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 3480

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 3540

ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 3600

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 3660

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 3720

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 3780

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 3840

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 3900

caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 3960

ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 4020

cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 4080

ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 4140

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 4200

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 4260

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagtttt caaatatgta tccgctcatg 4320

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 4380

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 4440

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 4500

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 4560

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 4620

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 4680

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 4740

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 4800

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 4860

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 4920

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 4980

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 5040

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 5100

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 5160

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 5220

cattggtaaa actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 5280

atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 5340

cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaagatcg ttcaaacatt 5400

tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 5460

tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 5520

agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 5580

atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg 5640

atccatgagc ccagaacgac gcccggccga catccgccgt gccaccgagg cggacatgcc 5700

ggcggtctgc accatcgtca accactacat cgagacaagc acggtcaact tccgtaccga 5760

gccgcaggaa ccgcaggagt ggacggacga cctcgtccgt ctgcgggagc gctatccctg 5820

gctcgtcgcc gaggtggacg gcgaggtcgc cggcatcgcc tacgcgggcc cctggaaggc 5880

acgcaacgcc tacgactgga cggccgagtc gaccgtgtac gtctcccccc gccaccagcg 5940

gacgggactg ggctccacgc tctacaccca cctgctgaag tccctggagg cacagggctt 6000

caagagcgtg gtcgctgtca tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca tgcacgaggc 6060

gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg ggaactggca 6120

tgacgtgggt ttctggcagc tggacttcag cctgccggta ccgccccgtc cggtcctgcc 6180

cgtcaccgag atcgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt 6240

tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat 6300

taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 6360

atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 6420

cgcggtgtca tctatgttac tagatcggaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 6480

gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 6540

agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 6600

tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 6660

aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 6720

cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 6780

atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 6840

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 6900

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 6960

tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 7020

gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 7080

cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 7140

cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 7200

atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 7260

tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 7320

ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 7380

acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 7440

aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 7500

aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 7560

tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 7620

cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 7680

catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 7740

ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 7800

aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 7860

ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 7920

caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 7980

attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 8040

agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 8100

actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 8160

ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 8220

ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 8280

gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 8340

atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 8400

cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 8460

gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 8520

gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 8580

ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 8640

gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga 8700

tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc 8760

ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 8820

ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga 8880

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 8940

gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 9000

agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 9060

ttgtaaaacg acggccagtg caagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc 9120

ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt 9180

tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact 9240

ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa 9300

tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt 9360

ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat 9420

acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact 9480

aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact 9540

ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa 9600

aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg 9660

agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa 9720

ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct 9780

ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa 9840

ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg 9900

gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg 9960

ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg 10020

cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac 10080

gccgctcgtc ctcccccccc ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg 10140

gttagggccc ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga 10200

tccgtgctgc tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct 10260

aacttgccag tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg 10320

atcgatttca tgattttttt tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat 10380

ttcaatatat gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg 10440

ttgtgatgat gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa 10500

ctacctggtg gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta 10560

cgaattgaag atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt 10620

tttactgatg catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt 10680

tgggcggtcg ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta 10740

tttattaatt ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat 10800

ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat 10860

acatgatggc atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata 10920

ataaacaagt atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca 10980

gcagctatat gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg 11040

tttcttttgt cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcagggat ccatgagccc 11100

agaacgacgc ccggccgaca tccgccgtgc caccgaggcg gacatgccgg cggtctgcac 11160

catcgtcaac cactacatcg agacaagcac ggtcaacttc cgtaccgagc cgcaggaacc 11220

gcaggagtgg acggacgacc tcgtccgtct gcgggagcgc tatccctggc tcgtcgccga 11280

ggtggacggc gaggtcgccg gcatcgccta cgcgggcccc tggaaggcac gcaacgccta 11340

cgactggacg gccgagtcga ccgtgtacgt ctccccccgc caccagcgga cgggactggg 11400

ctccacgctc tacacccacc tgctgaagtc cctggaggca cagggcttca agagcgtggt 11460

cgctgtcatc gggctgccca acgacccgag cgtgcgcatg cacgaggcgc tcggatatgc 11520

cccccgcggc atgctgcggg cggccggctt caagcacggg aactggcatg acgtgggttt 11580

ctggcagctg gacttcagcc tgccggtacc gccccgtccg gtcctgcccg tcaccgagat 11640

cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 11700

gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 11760

catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 11820

cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 11880

tatgttacta gatctgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 11940

ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 12000

gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 12060

ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 12120

tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 12180

tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 12240

ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 12300

tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 12360

agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 12420

acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 12480

ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 12540

gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 12600

acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat 12660

gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 12720

gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 12780

tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 12840

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 12900

cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 12960

gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt 13020

tgtaaaacga cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc 13080

ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt 13140

tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact 13200

ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa 13260

tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt 13320

ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat 13380

acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact 13440

aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact 13500

ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa 13560

aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg 13620

agtagataat gccagcctgt taaacgccgt ttgttgaata gaatacaaac cctagaaaaa 13680

caaggcacat ctcggcgccg ccaatagaag gcagaaaccc tagccgtcat ttttcttgaa 13740

gaatatagag cgacgtcgat aggaagatac ttaaatgttg aatccaagca cctagaataa 13800

tgagttagat tagaagaaaa ctatcaactt cgaaatcaag aagaaatgtt ttattctgtt 13860

gcataaaact ttcgcgtgga gaagctctgt tcagagcccg ggtagccact gggcacgtct 13920

cctagatact ggactcatcg gacgctctcc tcgagccatt aatatggtcc gtcctgtaga 13980

aaccccaacc cgtgaaatca aaaaactcga cggcctgtgg gcattcagtc tggatcgcga 14040

aaactgtgga attgatcagc gttggtggga aagcgcgtta caagaaagcc gggcaattgc 14100

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 14160

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 14220

aagctcggca tccggtcagt ggcagtgaag ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg 14280

ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat 14340

aacgtgctga tggtgcacga ccacgcattg atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt 14400

acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg 14460

gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg 14520

ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg 14580

cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg 14640

tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca 14700

ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg 14760

ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt 14820

tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa 14880

gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg 14940

gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt 15000

gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag 15060

gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag 15120

aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg aagtcggcgg ctcgctcagt gtgtgtgact 15180

ctgctggtgc tggggaatgg agctcggggc accgtatttg tagcgcgcgc gccgctgtac 15240

gtggcgccct ggcgcggcta cgtggagggg agctgcgtgc cagaggggag gcgggccgcc 15300

acgtcgcacg gccgtgctta tcgggccatc ggcgaggtgc gtgccagctt gggcgtcgcg 15360

tgtcgtggag cgctcctgct cgcggcggag ctggttgagt ggattgcgat gcggtgcttg 15420

gtacagagct cgatggacaa ctcgaggaga gcgtccgatg agtccagtat ctaggagacg 15480

tgcccagtgg ctacccgggc tctgaacaga gcttctccac gcgaaagttt tatgcaacag 15540

aataaaacat ttcttcttga tttcgaagtt gatagttttc ttctaatcta actcattatt 15600

ctaggtgctt ggattcaaca tttaagtatc ttcctatcga cgtcgctcta tattcttcaa 15660

gaaaaatgac ggctagggtt tctgccttct attggtcatt acgcgcagaa aaaaaggatc 15720

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 15780

ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 15840

aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttttac 15900

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 15960

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 16020

gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 16080

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 16140

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 16200

gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 16260

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 16320

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 16380

gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 16440

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 16500

tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 16560

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 16620

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 16680

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 16740

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 16800

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 16860

cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 16920

acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt 16980

gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc 17040

gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt 17100

aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg 17160

cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac 17220

tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga 17280

tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa 17340

acgacggcca gtgccaagct tgcatgcctg cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct 17400

ctagagataa tgagcattgc atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc 17460

acacttgttt gaagtgcagt ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga 17520

ataatataat ctatagtact acaatgtacg ccgctcgtcc tccccccccc cccctctcta 17580

ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat 17640

gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg 17700

acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct 17760

gggatggctc tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc 17820

atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg 17880

tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt 17940

tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttggatctg 18000

tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat 18060

ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttg 18120

ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag 18180

tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc 18240

atacatcttc atagttacga gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac 18300

atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat 18360

gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa ttattttgat 18420

cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt tagccctgcc 18480

ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg 18540

gtgttacttc tgcagtcgac tcgtagagga tccatcccga ttaggaaagt agagcatgag 18600

cccagaacga cgcccggccg acatccgccg tgccaccgag gcggacatgc cggcggtctg 18660

caccatcgtc aaccactaca tcgagacaag cacggtcaac ttccgtaccg agccgcagga 18720

accgcaggag tggacggacg acctcgtccg tctgcgggag cgctatccct ggctcgtcgc 18780

cgaggtggac ggcgaggtcg ccggcatcgc ctacgcgggc ccctggaagg cacgcaacgc 18840

ctacgactgg acggccgagt cgaccgtgta cgtctccccc cgccaccagc ggacgggact 18900

gggctccacg ctctacaccc acctgctgaa gtccctggag gcacagggct tcaagagcgt 18960

ggtcgctgtc atcgggctgc ccaacgaccc gagcgtgcgc atgcacgagg cgctcggata 19020

tgccccccgc ggcatgctgc gggcggccgg cttcaagcac gggaactggc atgacgtggg 19080

tttctggcag ctggacttca gcctgccggt accgccccgt ccggtcctgc ccgtcaccga 19140

gatcatatga atagatgctg catatgccat catgtatatg catcagtaaa acccacatca 19200

acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc catccatctt aaactcgtaa ctatgaagat 19260

gtatgacaca cacatacagt tccaaaattt ataaatacac caggtagttt gaaacagtat 19320

tctactccga tctagaacga atgaacgacc gcccaaccac accacatcat cacaaccaag 19380

cgaacaaaaa gcatctctgt atatgcatca gtaaaacccg catcaacatg tatacctatc 19440

ctagatcgat atttccatcc atcatcttca attcgtaact atgaatatgt atggcacaca 19500

catacagatc caaaattaat aaatccacca ggtagtttga aacagaattc tactccgatc 19560

tagaacgacc gcccaaccag accacatcat cacaaccaag acaaaaaaaa gcatgaaaag 19620

atgacccgac aaacaagtgc acggcatata ttgaaataaa ggaaaagggc aaaccaaacc 19680

ctatgcaacg aaacaaaaaa aatcatgaaa tcgatcccgt ctgcggaacg gctagagcca 19740

tcccaggatt ccccaaagag aaacactggc aagttagcaa tcagaacgtg tctgacgtac 19800

aggtcgcatc cgtgtacgaa cgctagcagc acggatctaa cacaaacacg gatctaacac 19860

aaacatgaac agaagtagaa ctaccgggcc ctaaccatgg accggaacgc cgatctagag 19920

aaggtagaga gggggggggg gggaggacga gcggcgtacg ccgacgggtg gatttggggg 19980

agatctggtt gtgtgtgtgt gcgctccgaa caacacgagg ttggggaaag agggtgtgga 20040

gggggtgtct atttattacg gcgggcgagg aagggaaagc gaaggagcgg tgggaaagga 20100

atcccccgta gctgccggtg ccgtgagagg aggaggaggc cgcctgccgt gccggctcac 20160

gtctgccgct ccgccacgca atttctggat gccgacagcg gagcaagtcc aacggtggag 20220

cggaactctc gagaggggtc cagaggcagc gacagagatg ccgtgccgtc tgcttcgctt 20280

ggcccgacgc gacgctgctg gttcgctggt tggtgtccgt tagactcgtc gacggcgttt 20340

aacaggctgg cattatctac tcgaaacaag aaaaatgttt ccttagtttt tttaatttct 20400

taaagggtat ttgtttaatt tttagtcact ttattttatt ctattttata tctaaattat 20460

taaataaaaa aactaaaata gagttttagt tttcttaatt tagaggctaa aatagaataa 20520

aatagatgta ctaaaaaaat tagtctataa aaaccattaa ccctaaaccc taaatggatg 20580

tactaataaa atggatgaag tattatatag gtgaagctat ttgcaaaaaa aaaggagaac 20640

acatgcacac taaaaagata aaactgtaga gtcctgttgt caaaatactc aattgtcctt 20700

tagaccatgt ctaactgttc atttatatga ttctctaaaa cactgatatt attgtagtac 20760

tatagattat attattcgta gagtaaagtt taaatatatg tataaagata gataaactgc 20820

acttcaaaca agtgtgacaa aaaaaatatg tggtaatttt ttataactta gacatgcaat 20880

gctcattatc tctagagagg ggcacgaccg ggtcacgctg cactgcaggc atgcaagctt 20940

gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 21000

cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 21060

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc 21120

cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct 21180

gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg 21240

gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 21300

tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc 21360

ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt 21420

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 21480

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 21540

agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 21600

tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 21660

gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 21720

gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 21780

attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 21840

gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 21900

agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 21960

ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 22020

cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 22080

gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 22140

cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 22200

gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 22260

ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 22320

acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 22380

ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 22440

aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 22500

aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 22560

ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 22620

ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 22680

actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc 22740

caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 22800

gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 22860

ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 22920

cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 22980

cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 23040

acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 23100

ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 23160

gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 23220

tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 23280

accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag 23340

cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcatttatg cagctggcac 23400

gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caatttatgt gagttagctc 23460

actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt aagcttgcat 23520

gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc attgcatgtc 23580

taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt gcagtttatc 23640

tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata gtactacaat 23700

aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta aaggacaatt 23760

gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt gttctccttt 23820

ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta 23880

gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt ttattctatt 23940

ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta ataatttaga 24000

tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta agaaattaaa 24060

aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt aaacgccgtc 24120

gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc aagcgaagca 24180

gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg ctccaccgtt 24240

ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac gtgagccggc 24300

acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg caccggcagc tacgggggat tcctttccca 24360

ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacacccga actgtatgtg 24420

tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag 24480

gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat 24540

tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa caagtatgtt ttataattat 24600

tttgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc 24660

cctgccttca tacgctattt atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt 24720

tgtttggtgt tacttctgca gggatccatg tctcttcaac aagtaacaac caccaggaag 24780

aaccgaaacg aggggcggag acgatttacc gacaaacaaa taagtttcct agagtacatg 24840

tttgagacac agtcgagacc cgagttaagg atgaaacacc agttggcaca taaactcggg 24900

cttcatcctc gtcaagtggc gatatggttc cagaacaaac gcgcgcgatc aaagtcgagg 24960

cagattgagc aagagtataa cgcgctaaag cataactacg agacgcttgc gtctaaatcc 25020

gagtctctaa agaaagagaa tcaggcccta ctcaatcaat tggaggtgct gagaaatgta 25080

gccgaaaagc atcaagagaa aactagtagt agtggcagcg gtgaagaatc ggatgatcgg 25140

tttacgaact ctccggacgt tatgtttggt caagaaatga atgttccgtt ttgcgacggt 25200

tttgcgtacc ttgaagaagg aaacagtttg ttggagattg aagaacaact gccagacctt 25260

caaaagtggt gggagttcga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat 25320

cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta 25380

ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg 25440

caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta 25500

tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cggaattcgt aatcatggtc atagctgttt 25560

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 25620

tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 25680

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 25740

gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 25800

tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 25860

acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 25920

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 25980

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 26040

gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 26100

tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 26160

tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 26220

cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 26280

gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 26340

ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt 26400

ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 26460

ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 26520

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 26580

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 26640

atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 26700

tctgacagtt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 26760

caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 26820

tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 26880

acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 26940

gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 27000

agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 27060

gatagaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 27120

ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 27180

acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 27240

agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 27300

ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 27360

cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 27420

gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 27480

cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 27540

gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 27600

caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 27660

aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 27720

tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 27780

gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 27840

gacgctgggc cgccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 27900

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 27960

gtgtcacgca gatcctatga aatttggtcg atgattgtct tttatggatc cgttcagacc 28020

aagtcttcgt gtgtctatgt tatcgtgcct ttaaattgaa tcctttcgat ttatgcttct 28080

ttttgtcagc ggtggttgat cttctgatgt gctggttaca aagggtctta gcataacaat 28140

tttccaattg tctactacaa caagttttgt ctaacttcga tgaagcctag gtgatgacga 28200

tttcaacttg cttcggtgct tgtaactgtt attagatggt ctacggatct aaatgtaact 28260

tctattattt gttgtgtttt ttgtattatt atgatggatg atgaatagat taaaagatcc 28320

cgcaaataaa accttaaatg ataaatgtca cacgtcacgt gcatggcact ccggccctaa 28380

tgccttttgt agctattcta gtaacgcaag gatagcaaat ttccgtgaca cgacgcaagt 28440

ttttgttaaa aataaattaa agcaagaaaa ttgtcatact tgctaacgaa aattgccatc 28500

cttgcctatt catcatccat cataataata caaaaaacac aacaaataat agaagttaca 28560

tttagatccg tagaccatct aataacagtt acaagcaccg aagcaagttg gtgccgtctg 28620

cttcgcttgg cccgacgcga cgctgctggt tcgctggttg gtgtccgtta gactcgtcga 28680

cggcgtttaa caggctggca ttatctactc gaaacaagaa aaatgtttcc ttagtttttt 28740

taatttctta aagggtattt gtttaatttt tagtcacttt attttattct attttatatc 28800

taaattatta aataaaaaaa ctaaaataga gttttagttt tcttaattta gaggctaaaa 28860

tagaataaaa tagatgtact aaaaactcaa ttgtccttta gaccatgtct aactgttcat 28920

ttatatgatt ctctaaggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 28980

gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 29040

aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc 29100

tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc 29160

tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg 29220

ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 29280

tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa 29340

agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga 29400

cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 29460

tacattacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 29520

ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 29580

gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 29640

taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 29700

tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 29760

gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 29820

cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 29880

aagcggttag ctccttcggt cctccgaata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 29940

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 30000

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 30060

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 30120

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 30180

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aagatctcgg tgacgggcag gaccggacgg 30240

ggcggtaccg gcaggctgaa gtccagctgc cagaaaccca cgtcatgcca gttcccgtgc 30300

ttgaagccgg ccgcccgcag catgccgcgg ggggcatatc cgagcgcctc gtgcatgcgc 30360

acgctcgggt cgttgggcag cccgatgaca gcgaccacgc tcttgaagcc ctgtgcctcc 30420

agggacttca gcaggtgggt gtagagcgtg gagcccagtc ccgtccgctg gtggcggggg 30480

gagacgtaca cggtcgactc ggccgtccag tcgtaggcgt tgcgtgcctt ccaggggccc 30540

gcgtaggcga tgccggcgac ctcgccgtat ggatgaagta ttatataggt gaagctattt 30600

gcaaaaaaaa aggagaacac atgcacacta aaaagataaa actgtagagt cctgttgtca 30660

aaatactcaa ttgtccttta gaccatgtct aactgttcat ttatatgatt ctctaaaaca 30720

ctgatattat tgtagtacta tagattatat tattcgtaga gtaaagttta aatatatgta 30780

taaagataga taaactgcac ttcaaacaag tgtgacaaaa aaaatatgtg gtaatttttt 30840

ataacttaga catgcaatgc tcattatctc tagagagggg cacgaccggg tcacgctgca 30900

ctgcaggcat gcaagcttct gcagaagtaa caccaaacaa cagggtgagc atcgacaaaa 30960

gaaacagtac caagcaaata aatagcgtat gaaggcaggg ctaaaaaaat ccacatatag 31020

ctgctgcata tgccatcatc caagtatatc aagatcaaaa taattataaa acatacttgt 31080

ttattataat agataggtac tcaaggttag agcatatgaa tagatgctgc atatgccatc 31140

atgtatatgc atcagtaaaa cccacatcaa catgtatacc tatcctagat cgatatttcc 31200

atccatctta aactcgtaac tatgaagatg tatgacacac acatacagtt ccaaaattaa 31260

taaatacacc aggtagtttg aaacagtatt ctactccgat ctagaacgaa tgaacgaccg 31320

cccaaccaca ccacatcatc acaaccaagc gaacaaaaag catctctgta tatgcatcag 31380

taaaacccgc atcaacatgt atacctatcc tagatcgata tttccatcca tcatcttcaa 31440

ttcgtaacta tgaatatgta tggcacacac atacagatcc aaaattaata aatccaccag 31500

gtagtttgaa acagaattct actccgatct agaacgaccg cccaaccaga ccacatcatc 31560

acaaccaaga caaaaaaaag catgaaaaga tgacccgaca aacaagtgca cggcatatat 31620

tgaaataaag gaaaagggca aaccaaaccc tatgcaacga aacaaaaaaa atcatgaaat 31680

cgatcccgtc tgcggaacgg ctagagccat cccaggattc cccaaagaga aacactggca 31740

agttagcaat cagaacgtgt ctgacgtaca ggtcgcatcc gtgtacgaac gctagcagca 31800

cggatctaac acaaacacgg atctaacaca aacatgaaca gaagtagaac taccgggccc 31860

taaccatgga ccggaacgcc gatctagaga aggtagagag gggggggggg ggaggacgag 31920

cggcgtacct tgaagcggag gtgccgacgg gtggatttgg gggagatctg gttgtgtgtg 31980

tgtgcgctcc gaacaacacg aggttgggga aagagggtgt ggagggggtg tctatttatt 32040

acggcgggcg aggaagggaa agcgaaggag cggtgggaaa ggaatccccc gtagctgccg 32100

gtgccgtgag aggaggagga ggccgcctgc cgtgccggct cacgtctgcc gctccgccac 32160

gcaatttctg gatgccgaca gcggagcaag tccaacggtg gagcggaact ctcgagaggg 32220

gtccagaggc agcgacagag atgccgtgcc gtctgcttcg cttggcccga cgcgacgctg 32280

ctggttcgct ggttggtgtc cgttagactc gtcgacggcg tttaacaggc tggcattatc 32340

tactcgaaac aagaaaaatg tttccttagt ttttttaatt tcttaaaggg tatttgttta 32400

atttttagtc actttatttt attctatttt atatctaaat tattaaataa aaaaactaaa 32460

atagagtttt agttttctta atttagaggc taaaatagaa taaaatagat gtactaaaaa 32520

aattagtcta taaaaaccat taaccctaaa ccctaaatgg atgtactaat aaaatggatg 32580

aagtattata taggtgaagc tatttgcaaa aaaaaaggag aacacatgca cactaaaaag 32640

ataaaactgt agagtcctgt tgtcaaaata ctcaattgtc ctttagacca tgtctaactg 32700

ttcatttata tgattctcta aaacactgat attattgtag tactatagat tatattattc 32760

gtagagtaaa gtttaaatat atgtataaag atagataaac tgcacttcaa acaagtgtga 32820

caaaaaaaat atgtggtaat tttttataac ttagacatgc aatgctcatt atctctagag 32880

aggggcacga ccgggtcacg ctgcactgca ggcatgcaag cttgcactgg ccgtcgtttt 32940

acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc 33000

ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt 33060

gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg 33120

tatttcacac cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 33180

ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 33240

atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 33300

gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa 33360

tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 33420

aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 33480

accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 33540

tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 33600

gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 33660

ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 33720

gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 33780

gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 33840

agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 33900

gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 33960

cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 34020

gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 34080

gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 34140

ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 34200

gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 34260

ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 34320

tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 34380

actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 34440

taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 34500

gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 34560

tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 34620

ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 34680

gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 34740

tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 34800

cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 34860

gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 34920

actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 34980

ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 35040

gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 35100

atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 35160

tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 35220

tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 35280

aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 35340

gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 35400

gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca 35460

ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 35520

tcacacagga aacagctatg accatgatta cgaattccga tcgttcaaac atttggcaat 35580

aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 35640

tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 35700

tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 35760

gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgatctcggt 35820

gacgggcagg accggacggg gcggtaccgg caggctgaag tccagctgcc agaaacccac 35880

gtcatgccag ttcccgtgct tgaagccggc cgcccgcagc atgccgcggg gggcatatcc 35940

gagcgcctcg tgcatgcgca cgctcgggtc gttgggcagc ccgatgacag cgaccacgct 36000

cttgaagccc tgtgcctcca gggacttcag caggtgggtg tagagcgtgg agcccagtcc 36060

cgtccgctgg tggcgggggg agacgtacac ggtcgactcg gccgtccagt cgtaggcgtt 36120

gcgtgccttc caggggcccg cgtaggcgat gccggcgacc tcgccgtcca cctcggcgac 36180

gagccaggga tagcgctccc gcagacggac gaggtcgtcc gtccactcct gcggttcctg 36240

cggctcggta cggaagttga ccgtgcttgt ctcgatgtag tggttgacga tggtgcagac 36300

cgccggcatg tccgcctcgg tggcacggcg gatgtcggcc gggcgtcgtt ctgggctcat 36360

ggatccaagc ttgcatgcct gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata 36420

atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt 36480

tgaagtgcag tttatctatc tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa 36540

tctatagtac tacaataata tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat 36600

ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt 36660

gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta 36720

ttagtacatc catttagggt ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca 36780

tctattttat tctattttag cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt 36840

tatttaataa tttagatata aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac 36900

cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag 36960

cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt 37020

cgggccaagc gaagcagacg gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga 37080

gttccgctcc accgttggac ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg 37140

gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg 37200

ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac 37260

accccctcca caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc 37320

agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc 37380

cccccccccc tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt ccatggttag ggcccggtag 37440

ttctacttct gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt gctgctagcg 37500

ttcgtacacg gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt 37560

ctctttgggg aatcctggga tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt 37620

ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt 37680

gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt 37740

ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt 37800

attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat agttacgaat tgaagatgat 37860

ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat 37920

acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat 37980

tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc aaactacctg gtgtatttat taattttgga 38040

actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga 38100

tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg 38160

cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa caagtatgtt 38220

ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc tatatgtgga 38280

tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg 38340

ctcaccctgt tgtttggtgt tacttctgca gggatccatg agcccagaac gacgcccggc 38400

cgacatccgc cgtgccaccg aggcggacat gccggcggtc tgcaccatcg tcaaccacta 38460

catcgagaca agcacggtca acttccgtac cgagccgcag gaaccgcagg agtggacgga 38520

cgacctcgtc cgtctgcggg agcgctatcc ctggctcgtc gccgaggtgg acggcgaggt 38580

cgccggcatc gcctacgcgg gcccctggaa ggcacgcaac gcctacgact ggacggccga 38640

gtcgaccgtg tacgtctccc cccgccacca gcggacggga ctgggctcca cgctctacac 38700

ccacctgctg aagtccctgg aggcacaggg cttcaagagc gtggtcgctg tcatcgggct 38760

gcccaacgac ccgagcgtgc gcatgcacga ggcgctcgga tatgcccccc gcggcatgct 38820

gcgggcggcc ggcttcaagc acgggaactg gcatgacgtg ggtttctggc agctggactt 38880

cagcctgccg gtaccgcccc gtccggtcct gcccgtcacc gagatctgat ccgtcgacct 38940

gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 39000

gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 39060

tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 39120

tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 39180

tctatgttac tagatcggaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 39240

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 39300

gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 39360

ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 39420

cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 39480

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 39540

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 39600

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 39660

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 39720

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 39780

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 39840

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 39900

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 39960

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 40020

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 40080

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 40140

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 40200

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 40260

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 40320

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 40380

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 40440

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 40500

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 40560

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 40620

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 40680

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 40740

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 40800

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 40860

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 40920

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 40980

ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 41040

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 41100

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 41160

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 41220

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 41280

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 41340

acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 41400

tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 41460

aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 41520

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac 41580

tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac 41640

agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt 41700

tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 41760

gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 41820

acggccagtg caagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag 41880

agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt tttgtcacac 41940

ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact ctacgaataa 42000

tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa tgaacagtta 42060

gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt 42120

agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat acttcatcca 42180

ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact aattttttta 42240

gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact ctattttagt 42300

ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca 42360

aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat 42420

gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa ccagcagcgt 42480

cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct ggacccctct 42540

cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa ttgcgtggcg 42600

gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg gcaccggcag 42660

ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg ccgtaataaa 42720

tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca 42780

caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc 42840

ctcccccccc ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg gttagggccc 42900

ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc 42960

tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct aacttgccag 43020

tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca 43080

tgattttttt tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat 43140

gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat 43200

gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg 43260

gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag 43320

atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg 43380

catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg 43440

ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt 43500

ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat 43560

atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc 43620

atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt 43680

atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat 43740

gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt 43800

cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcaggtcg actctagagg atccatcgat 43860

taggaagtaa ccatgagccc agaacgacgc ccggccgaca tccgccgtgc caccgaggcg 43920

gacatgccgg cggtctgcac catcgtcaac cactacatcg agacaagcac ggtcaacttc 43980

cgtaccgagc cgcaggaacc gcaggagtgg acggacgacc tcgtccgtct gcgggagcgc 44040

tatccctggc tcgtcgccga ggtggacggc gaggtcgccg gcatcgccta cgcgggcccc 44100

tggaaggcac gcaacgccta cgactggacg gccgagtcga ccgtgtacgt ctccccccgc 44160

caccagcgga cgggactggg ctccacgctc tacacccacc tgctgaagtc cctggaggca 44220

cagggcttca agagcgtggt cgctgtcatc gggctgccca acgacccgag cgtgcgcatg 44280

cacgaggcgc tcggatatgc cccccgcggc atgctgcggg cggccggctt caagcacggg 44340

aactggcatg acgtgggttt ctggcagctg gacttcagcc tgccggtacc gccccgtccg 44400

gtcctgcccg tcaccgagat ctgatccgtc gacctgcaga tcgttcaaac atttggcaat 44460

aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 44520

tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 44580

tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 44640

gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cggaattcgt 44700

aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 44760

tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 44820

taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 44880

aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 44940

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 45000

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 45060

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 45120

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 45180

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 45240

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 45300

ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 45360

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 45420

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 45480

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 45540

acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 45600

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 45660

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 45720

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 45780

caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 45840

gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 45900

cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 45960

cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 46020

caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 46080

gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 46140

gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 46200

cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 46260

catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 46320

gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 46380

ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 46440

gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 46500

cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 46560

tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 46620

gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 46680

atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 46740

ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 46800

gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 46860

acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 46920

cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 46980

agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 47040

cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 47100

tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 47160

tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 47220

cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 47280

cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgcgtcg actctagagg 47340

tccctcgacc atggctgtaa ggtcgccgaa tacaagggca tgggtggcga ggcctaagag 47400

gagtataatt tcttagacat ttgtcaatta taaacttctt ggtaaaagag catgtaagcc 47460

gaggaaacag acgacatatt gaacaagacc gacatacaac gtgcacacga caaggttcct 47520

gtcacatgcc catccacacc ctactagatg gctccttgac ggtggacact gtatgacgag 47580

tttcttagaa tgagtttttt aaacacaata c 47611

<210> 6

<211> 20418

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Короткая вставка с фланкирующими областями

<400> 6

gagcgcgctt tcctatttag gatccaaatt ggcactgata ctaaactgct tagacgaatc 60

gcctggagta aaatcaacaa gctcggtttc agcagccgac ttaaacttca tcgccgggtc 120

atgctcggtg gttggcttct ttagagacgt catatccgcc aggtcaacat tattttgata 180

aaaattcatc tcctctgccg cacaaacaga ctcagcataa gccgcatcgc cttcttcaca 240

ttctagggct acctttcgac tcccattgag ggagtcccgg attagggggt gtttggaaca 300

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 360

ctctagcttc ccggtaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gtaggaccac 420

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggactct 480

aggcttcccg ggcaacaaat taattagact ggatggaggg ataaagtttg cagaccactt 540

tctgcgctcg gcccttccgc tgggctgttc tatgcccgct gaaatcacca gtctctctct 600

acaaatctat ctctctctat aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg aattagggtt 660

cttatagggt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt 720

gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg 780

tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag 840

gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc 900

gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg 960

acgttgtaaa acgacggcca gtgcaagctt gcatgcctgc agtgcagcgt gacccggtcg 1020

tgcccctctc tagagataat gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt 1080

ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt tatctatctt tatacatata tttaaacttt 1140

actctacgaa taatataatc tatagtacta caataatatc agtgttttag agaatcatat 1200

aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca ggactctaca 1260

gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct tcacctatat 1320

aatacttcat ccattttatt agtacatcca tttagggttt agggttaatg gtttttatag 1380

actaattttt ttagtacatc tattttattc tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa 1440

actctatttt agttttttta tttaataatt tagatataaa atagaataaa ataaagtgac 1500

taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt 1560

tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc 1620

gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc 1680

tctggacccc tctcgagagt tccgctccac cgttggactt gctccgctgt cggcatccag 1740

aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc 1800

acggcaccgg cagctacggg ggattccttt cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc 1860

ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga 1920

gcgcacacac acacaaccag atctccccca aatccacccg tcggcgtacg ccgctcgtcc 1980

tccccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg 2040

gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct 2100

agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt 2160

gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat 2220

gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg 2280

ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttcct gtttttgctc 2340

acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 2400

acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 2460

ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 2520

ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 2580

caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 2640

ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 2700

aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 2760

aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 2820

tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg ttattgccgg gaaaagtgta cgtatcaccg 2880

tttgtgtgaa caacgaactg aactggcaga ctatcccctg cagaagtaac accaaacaac 2940

agggtgagca tcgacaaaag aaacagtacc aagcaaataa atagcgtatg aaggcagggc 3000

taaaaaaatc cacatatagc tgctgcatat gccatcatcc aagtatatca agatcaaaat 3060

aattataaaa catacttgtt tattataata gataggtact caaggttaga gcatatgaat 3120

agatgctgca tatgccatca tgtatatgca tcagtaaaac ccacatcaac atgtatacct 3180

atcctagatc gatatttcca tccatcttaa actcgtaact atgaagatgt atgacacaca 3240

catacagttc caaaattaat aaatacacca ggtagtttga aacagtattc tactccgatc 3300

tagaacgaat gaacgaccgc ccaaccacac cacatcatca caaccaagcg aacaaaaagc 3360

atctctgtat atgcatcagt aaaacccgca tcaacatgta tacctatcct agaagtacta 3420

tagattatat tattcgtaga gtaaagttta aatatatgta taaagataga taaactgcac 3480

ttcaaacaag tgtgacaaaa aaaatatgtg gtaatttttt ataacttaga catgcaatgc 3540

tcattatctc tagagagggg cacgaccggg tcacgctgca ctgcaggcat gcaagcttgg 3600

cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 3660

gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 3720

gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc 3780

ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 3840

atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg 3900

cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt 3960

gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc 4020

tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc 4080

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattac caatgcttaa 4140

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 4200

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 4260

taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 4320

gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 4380

gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 4440

ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 4500

aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 4560

gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 4620

cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 4680

actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 4740

caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 4800

gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 4860

ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 4920

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 4980

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 5040

gcggatacat atttgaaaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 5100

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 5160

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 5220

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaagccaa tagaaggcag aaaccctagc 5280

cgtcattttt cttgaagaat atagagcgac gtcgatagga agatacttaa atgttgaatc 5340

caagcaccta gaataatgag ttagattaga agaaaactat caacttcgaa atcaagaaga 5400

aatgttttat tctgttgcat aaaactttcg cgtggagaag ctctgttcag agcccgggta 5460

gccactgggc acgtctccta gatactggac tcatcggacg ctctcctcga gttgtccatc 5520

gagctctgta ccaagcaccg catcgcaatc cactcaacca gctccgccgc gagcaggagc 5580

gctccacgac acgcgacgcc caagctggca cgcacctcgc cgatggcccg ataagcacgg 5640

ccgtgcgacg tggcggcccg cctcccctct ggcacgcagc tcccctccac gtagccgcgc 5700

cagggcgcca cgtacagcgg cgcgcgcgct acaaatacgg tgccccgagc tccattcccc 5760

agcaccagca gagtcacaca cactgagcga gctaaaccat caggaagtga tggagcatca 5820

gggcggctat acgccatttg aagccgatgt cacgccgtat gttattgccg ggaaaagtgt 5880

acgtatcacc gtttgtgccg gaatccatcg cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac 5940

ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa gactgtaacc acgcgtctgt 6000

tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt cagcgttgaa ctgcgtgatg cggatcaaca 6060

ggtggttgca actggacaag gcactagcgg gactttgcaa gtggtgaatc cgcacctctg 6120

gcaaccgggt gaaggttatc tctatgaact gtgcgtcaca gccaaaagcc agacagagtg 6180

tgatatctac ccgcttcgcg tcggcatccg gtcagtggca gtgaagggcg aacagttcct 6240

gattaaccac aaaccgttct actttactgg ctttggtcgt catgaagatg cggacttgcg 6300

tggcaaagga ttcgataacg tgctgttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 6360

cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 6420

tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac 6480

cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 6540

ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 6600

gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 6660

gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 6720

gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 6780

gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 6840

tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 6900

aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc 6960

cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 7020

caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 7080

cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 7140

ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 7200

aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 7260

tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg 7320

tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 7380

ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga 7440

cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag 7500

cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga 7560

gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 7620

ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt 7680

cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc 7740

cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgcaagcttg catgcctgca 7800

gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta 7860

taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt 7920

atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca 7980

gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt 8040

ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg 8100

caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta 8160

gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct 8220

ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa 8280

tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta 8340

aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt 8400

ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca 8460

cggcatctct gtctgaatag aatacaaacc ctagaaaaac aaggcacatc tcggcgccgc 8520

caatagaagg cagaaaccct agccgtcatt tttcttgaag aatatagagc gacgtcgata 8580

ggaagatact taaatgttga atccaagcac ctagaataat gagttagatt agaagaaaac 8640

tatcaacttc gaaatcaaga agaaatgttt tattctgttg cataaaactt tcgcgtggag 8700

aagctctgtt cagagcccgg gtagccactg ggcacgtctc ctagatactg gactcatcgg 8760

acgctctcct cgagttgtcc atcgagctct gtaccaagca ccgcatcgca atccactcaa 8820

ccagctccgc cgcgagcagg agcgctccac gacacgcgac gcccaagctg gcacgcacct 8880

cgccgatggc ccgataagca cggccgtgcg acgtggcggc ccgcctcccc tctggcacgc 8940

agctcccctc cacgtagccg cgccagggcg ccacgtacag cggcgcgcgc gctacaaata 9000

cggtgccccg agctccattc cccagcacca gcagagtcac acacactgag cgagctaaac 9060

catggtatag ccgccctgat gctccatcac ttcctgatta ttgacccaca ctttgccgta 9120

atgagtgacc gcatcgaaac gcagcacgat acgctggcct gcccaacctt tcggtataaa 9180

gacttcgcgc tgataccaga cgttgcccgc ataattacga atatctgcat cggcgaactg 9240

atcgttaaaa ctgcctggca cagcaattgc ccggctttct tgtaacgcgc tttcccacca 9300

acgctgatca attccacagt tttcgcgatc cagactgaat gcccacaggc cgtcgagttt 9360

tttgatttca cgggttgggg tttctacagg acgctattaa ttgttgccgg gaagctagag 9420

taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 9480

tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 9540

ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 9600

tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttca ctgtcagacc aagtttactc 9660

atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 9720

cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 9780

agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 9840

ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 9900

accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 9960

tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 10020

cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 10080

gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 10140

gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 10200

gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 10260

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 10320

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 10380

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 10440

ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 10500

taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc 10560

agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc 10620

gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa 10680

cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc 10740

ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga 10800

ccatgattac gaattccgat ctagtaacat agatgacacc gcgcgcgata atttatccta 10860

gtttgcgcgc tatattttgt tttctatcgc gtattaaatg tataattgcg ggactctaat 10920

cataaaaacc catctcataa ataacgtcat gcattacatg ttaattatta catgcttaac 10980

gtaattcaac agaaattata tgataatcat cgcaagaccg gcaacaggat tcaatcttaa 11040

gaaactttat tgccaaatgt ttgaacgatc tgcaggtcga cggatcagat ctcggtgacg 11100

ggcaggaccg gacggggcgg taccggcagg ctgaagtcca gctgccagaa acccacgtca 11160

tgccagttcc cgtgcttgaa gccggccgcc cgcagcatgc cgcggggggc atatccgagc 11220

gcctcgtgca tgcgcacgct cgggtcgttg ggcagcccga tgacagcgac cacgctcttg 11280

aagccctgtg cctccaggga cttcagcagg tgggtgtaga gcgtggagcc cagtcccgtc 11340

cgctggtggc ggggggagac gtacacggtc gactcggccg tccagtcgta ggcgttgcgt 11400

gccttccagg ggcccgcgta ggcgatgccg gcgacctcgc cgtccacctc ggcgacgagc 11460

cagggatagc gctcccgcag acggacgagg tcgtccgtcc actcctgcgg ttcctgcggc 11520

tcggtacgga agttgaccgt gcttgtctcg atgtagtggt tgacgatggt gcagaccgcc 11580

ggcatgtccg cctcggtggc acggcggatg tcggccgggc gtcgttctgg gctcatggat 11640

ccagctccgc cgcgagcagg agcgctccac gacacgcgac gcccaagctg gcacgcacct 11700

cgccgatggc ccgataaggc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 11760

ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 11820

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 11880

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 11940

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 12000

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 12060

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 12120

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 12180

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 12240

taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 12300

gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 12360

gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 12420

ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 12480

aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 12540

gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 12600

cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 12660

actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 12720

caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 12780

gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 12840

ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 12900

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 12960

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 13020

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 13080

cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 13140

ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 13200

gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 13260

aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg 13320

catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg 13380

taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag 13440

ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa 13500

ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca 13560

gtgcaagctt gcatgcctgc agtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat 13620

gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg 13680

aagtgcagtt tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc 13740

tatagtacta caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg 13800

tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc 13860

atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt 13920

agtacatcca tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc 13980

tattttattc tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta 14040

tttaataatt tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc 14100

tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc 14160

tgttaaacgc cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg 14220

ggccaagcga agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt 14280

tccgctccac cgttggactt gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc 14340

agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcaccgg cagctacggg 14400

ggattccttt cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc ccgccgtaat aaatagacac 14460

cccctccaca ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga gcgcacacac acacaaccag 14520

atctccccca aatccacccg tcggcgtacg ccgctcgtcc tccccccccc cccctctcta 14580

ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat 14640

gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg 14700

acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct 14760

gggatggctc tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc 14820

atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg 14880

tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt 14940

tctagatcgg agtagaattc cccgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt 15000

atcctagttt gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac 15060

tctaatcata aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg 15120

cttaacgtaa ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa 15180

tcttaagaaa ctttattgcc aaatgtttga acgatcgggg aaattcgagc tcttagaact 15240

cccaccactt ttggaactcc caccactttt gaaggtctgg cagttgttct tcaatctcca 15300

acaaactgtt tccttcttca aggtacgcaa aaccgtcgca aaacggaaca ttcatttctt 15360

gaccaaacat aacgtccgga gagttcgtaa accgatcatc cgattcttca ccgctgccac 15420

tactactagt tttctcttga tgcttttcgg ctacatttct cagcacctcc aattgattga 15480

gtagggcctg attctctttc tttagagact cggatttaga cgcaagcgtc tcgtagttat 15540

gctttagcgc gttatactct tgctcaatct gcctcgactt tgatcgcgcg cgtttgttct 15600

ggaaccatat cgccacttga cgaggatgaa gcccgagttt atgtgccaac tggtgtttca 15660

tccttaactc gggtctcgac tgtgtctcaa acatgtactc taggaaactt atttgtttgt 15720

cggtaaatcg tctccgcccc tcgtttcggt tcttcctggt ggttgttact tgttgaagag 15780

acatggatcc gagtcgacct gcagaagtaa caccaaacaa cagggtgaca ctcgacaaaa 15840

gaaacagtac caagcaaata aatagcgtat gaaggcaggg ctaaaaaaat ccacatatag 15900

ctgctgcata tgccatcatc caagtatatc aagatcaaaa taattataaa acatacttgt 15960

ttattataat agataggtac tcaaggttag agcatatgaa tagatgctgc atatgccatc 16020

atgtatatgc atcagtaaaa cccacatcaa catgtatacc tatcctagat cgatatttcc 16080

atccatctta aactcgtaac tatgaacgct gtcttgacac acacatacag ttccaaaatt 16140

aataaataca ccaggtagtt tgaaacagta ttctactccg atctagaacg aatgaacgac 16200

cgcccaacca caccacatca tcacaaccaa gcgaacaaaa agcatctctg tatatgcatc 16260

agtaaaaccc gcatcaacat gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcatcttc 16320

aattcgtaac tatgaatatg tatggcacac acatacagat ccaaaattaa taaatccacc 16380

aggtagtttg aaacagaatt cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta 16440

tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc 16500

ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 16560

aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 16620

tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 16680

gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 16740

cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 16800

gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 16860

aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 16920

ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 16980

cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 17040

ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 17100

cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 17160

agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 17220

gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 17280

gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 17340

tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 17400

agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa acttttctac 17460

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 17520

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 17580

tatatatgag taaacttggt ctgacagttt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 17640

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 17700

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 17760

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 17820

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 17880

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 17940

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 18000

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 18060

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 18120

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 18180

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 18240

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 18300

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 18360

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 18420

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 18480

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 18540

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 18600

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 18660

ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 18720

gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 18780

tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta 18840

ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc 18900

atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc 18960

tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 19020

acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc 19080

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 19140

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 19200

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 19260

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 19320

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 19380

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 19440

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 19500

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 19560

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 19620

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 19680

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 19740

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 19800

acttgctccc tttattttat tctattttat atctaaatta ttaaataaaa aaactaaaat 19860

agagttttag ttttcttaat ttagaggcta gtcccgaaca gtgtcctgga ggccgcacac 19920

gcttcggccc cgaccctcga ttcggagccc gctgcgttcg ttgaggaaga acgattggac 19980

gtcacctcag aggctgcgac attaaaggcg gtcgagtcga acgccgaccc cgcactccgc 20040

gctgcccatt actccgagga gccggattct tctccggcct ccgggccttc catgcccctg 20100

ccgaccgaat ccgattgggc acctgtaatg gagttcaccg ccgcggacat ctttcagtgt 20160

tcacctttca gtgacatcct gaattatctc aagtctctct ctttatcagg agagcccagg 20220

ccggattatg gtctgcgagg ttgggattcg gacgatgaag aaattcaaag cccacccacc 20280

acccacttaa tagccactgt cgacgattta accgacatgc tcgacttcgg ctccgaagac 20340

ttcgacggta tggacgacga aggaggagac gaaccggaac cagcacccac agggcactgg 20400

atatccacca cacacaat 20418

<210> 7

<211> 300

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5´-фланкирующая область (длинная вставка)

<400> 7

taatggtgag tgtatgcgct tgcgtctgta ttgtgtttaa aaaactcatt ctaagaaact 60

cgtcatacag tgtccaccgt caaggagcca tctagtaggg tgtggatggg catgtgacag 120

gaaccttgtc gtgtgcacgt tgtatgtcgg tcttgttcaa tatgtcgtct gtttcctcgg 180

cttacatgct cttttacgtg tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 240

agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 300

<210> 8

<211> 385

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3´-фланкирующая область (длинная вставка)

<400> 8

tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag 60

ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc gtcgactcta gaggtccctc 120

gaccatggct gtaaggtcgc cgaatacaag ggcatgggtg gcgaggccta agaggagtat 180

aatttcttag acatttgtca attataaact tcttggtaaa agagcatgta agccgaggaa 240

acagacgaca tattgaacaa gaccgacata caacgtgcac acgacaaggt tcctgtcaca 300

tgcccatcca caccctacta gatggctcct tgacggtgga cactgtatga cgagtttctt 360

agaatgagtt ttttaaacac aatac 385

<210> 9

<211> 392

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5´-фланкирующая область (короткая вставка)

<400> 9

gagcgcgctt tcctatttag gatccaaatt ggcactgata ctaaactgct tagacgaatc 60

gcctggagta aaatcaacaa gctcggtttc agcagccgac ttaaacttca tcgccgggtc 120

atgctcggtg gttggcttct ttagagacgt catatccgcc aggtcaacat tattttgata 180

aaaattcatc tcctctgccg cacaaacaga ctcagcataa gccgcatcgc cttcttcaca 240

ttctagggct acctttcgac tcccattgag ggagtcccgg attagggggt gtttggaaca 300

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 360

ctctagcttc ccggtaacaa ttaatagact gg 392

<210> 10

<211> 628

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 3´-фланкирующая область (короткая вставка)

<400> 10

ccaccgttgg acttgctccc tttattttat tctattttat atctaaatta ttaaataaaa 60

aaactaaaat agagttttag ttttcttaat ttagaggcta gtcccgaaca gtgtcctgga 120

ggccgcacac gcttcggccc cgaccctcga ttcggagccc gctgcgttcg ttgaggaaga 180

acgattggac gtcacctcag aggctgcgac attaaaggcg gtcgagtcga acgccgaccc 240

cgcactccgc gctgcccatt actccgagga gccggattct tctccggcct ccgggccttc 300

catgcccctg ccgaccgaat ccgattgggc acctgtaatg gagttcaccg ccgcggacat 360

ctttcagtgt tcacctttca gtgacatcct gaattatctc aagtctctct ctttatcagg 420

agagcccagg ccggattatg gtctgcgagg ttgggattcg gacgatgaag aaattcaaag 480

cccacccacc acccacttaa tagccactgt cgacgattta accgacatgc tcgacttcgg 540

ctccgaagac ttcgacggta tggacgacga aggaggagac gaaccggaac cagcacccac 600

agggcactgg atatccacca cacacaat 628

<210> 11

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HB4, прямой праймер

<400> 11

gggcttcatc ctggtcaagt ggc 23

<210> 12

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HB4, обратный праймер

<400> 12

tcttgatgct tttctgctac atttctcagc 30

<210> 13

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Bar, прямой праймер

<400> 13

cacgcaacgc ctacgactgg acggcc 26

<210> 14

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Bar, обратный праймер

<400> 14

gtaccggcag gctgaagtcc agct 24

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантной молекуле ДНК для улучшения урожайности сельскохозяйственной культуры пшеницы в условиях абиотического стресса. Также раскрыты трансгенное растение пшеницы или его часть с улучшенной урожайностью в условиях абиотического стресса, трансгенное семя, содержащие указанную молекулу ДНК; ДНК-зонд или ДНК-праймер для распознавания рекомбинантной молекулы ДНК; вектор, содержащий указанную молекулу ДНК; набор для детекции ДНК. Раскрыты способ получения указанного растения пшеницы; способ детекции присутствия указанной рекомбинантной молекулы ДНК. Изобретение позволяет улучшать урожайность сельскохозяйственной культуры пшеницы в условиях абиотического стресса. 12 н. и 5 з.п. ф-лы, 12 табл., 17 ил., 4 пр.

1. Рекомбинантная молекула ДНК для улучшения урожайности сельскохозяйственной культуры пшеницы в условиях абиотического стресса, отличающаяся содержанием последовательностей в SEQ ID No: 7, 8, 9 и 10.

2. Рекомбинантная молекула ДНК по п.1, отличающаяся тем, что была сформирована посредством сплайсинга гетерологичных молекул нуклеиновой кислоты из последовательностей в SEQ ID No: 7, 8, 9 и 10 и геномной ДНК растения пшеницы, клетки растения или семени.

3. Рекомбинантная молекула ДНК по п.1, отличающаяся тем, что была обнаружена в растении пшеницы, клетке растения, семени, растении-потомке, части растения или товарном продукте, происходящих из трансгенного растения пшеницы.

4. Трансгенное растение пшеницы с улучшенной урожайностью в условиях абиотического стресса, содержащее рекомбинантную молекулу ДНК по п.1.

5. Трансгенное семя, содержащее рекомбинантную молекулу ДНК по п.1 для выращивания трансгенного растения пшеницы с улучшенной урожайностью в условиях абиотического стресса по п.4.

6. Часть трансгенного растения, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК по п.1, для выращивания трансгенного растения пшеницы с улучшенной урожайностью в условиях абиотического стресса, где часть растения определена как клетка, семязачаток, цветок, побег, корень или лист.

7. Трансгенное растение пшеницы по п.4, где геном растения содержит молекулы ДНК, содержащие SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2.

8. Трансгенное растение пшеницы по п.7, где ДНК, происходящая из указанного растения, образует диагностический ампликон для трансгенного растения при тестировании в способе амплификации ДНК, содержащий указанный ампликон SEQ ID No: 7, 8, 9 и 10.

9. Трансгенное семя по п.5, где ДНК семени образует диагностический ампликон для трансгенного растения пшеницы при тестировании в способе амплификации ДНК, где указанный ампликон содержит SEQ ID No: 7, 8, 9 и 10.

10. ДНК-зонд, используемый для распознавания рекомбинантной молекулы ДНК по п.1, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную достаточной части непрерывной нуклеотидной последовательности из SEQ ID No: 5 или SEQ ID No: 6, чтобы действовать в качестве ДНК-зонда, гибридизующегося в строгих условиях с молекулой ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из SEQ ID No: 5 или SEQ ID No: 6, и не гибридизующегося в строгих условиях с молекулой ДНК, не содержащей нуклеотидную последовательность из SEQ ID No: 5 или SEQ ID No: 6.

11. ДНК-праймер, используемый для распознавания рекомбинантной молекулы ДНК по п.1, отличающийся тем, что ДНК-праймер содержит последовательность из SEQ ID No: 11, 12, 13 и 14, который можно использовать в способе амплификации ДНК для получения диагностического ампликона для трансгенного растения пшеницы.

12. Вектор экспрессии, функционирующий в растениях, отличающийся содержанием рекомбинантной молекулы ДНК по п.1.

13. Применение вектора экспрессии по п.12 для трансформации растений пшеницы.

14. Набор для детекции ДНК, используемый для распознавания рекомбинантной молекулы ДНК по п.1, содержащий по меньшей мере два ДНК-праймера по п.11 и ДНК-зонд по п.10 для детекции присутствия ДНК, происходящей из трансгенного растения пшеницы, где детекция этой ДНК доказывает присутствие этого трансгенного растения пшеницы в образце.

15. Способ получения растения пшеницы по п.4, включающий следующие стадии:

(a) введение молекулы ДНК по п.1 в геном клетки пшеницы;

(b) отбор клеток, содержащих маркерный ген bar; и

(c) регенерация растения пшеницы из клетки по пункту (b), содержащей рекомбинантную молекулу ДНК по п.1.

16. Способ детекции присутствия рекомбинантной молекулы ДНК по п.1 в образце, характеризующийся:

(a) сравнением образца, содержащего ДНК пшеницы, с использованием группы праймеров по п.11, образующих диагностический ампликон для трансгенного растения пшеницы, при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, с геномной ДНК из трансгенного растения пшеницы; и

(b) проведением реакции амплификации нуклеиновой кислоты, таким образом, получением диагностического ампликона; и

(c) детекцией диагностического ампликона.

17. Способ получения товарного продукта, изготовленного из растения пшеницы по п.4, который включает

(a) получение растения пшеницы по п.4 или части трансгенного растения по п.6; и

(b) изготовление товарного продукта из растения пшеницы по п.4 или из части трансгенного растения по п.6.