Способ получения самособирающегося октамерного белкового комплекса на основе апоферритина Российский патент 2025 года по МПК C07K14/00 C07K19/00 C07K1/22 C12N15/70 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медико-биологической промышленности и медицине. Разработан способ биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантного белкового комплекса на основе апоферритина для множественной презентации других белков (как носитель), сборки и контроля сборки белкового комплекса в октамерном состоянии, состоящий в культивировании рекомбинантного штамма-продуцента E. coli на питательной среде CM8, содержащей бактотриптон, дрожжевой экстракт, глицерин и глюкозу в калий-фосфатном буфере, с индукцией биосинтеза L-рамнозой, с последующим выделением белков методом никельафинной хроматографии, отличающийся тем, что при приготовлении среды дрожжевой экстракт, бактотриптон, глицерин, калий-фосфатный буфер и MgSO₄ автоклавируются совместно. Контроль самосборки целевого белкового комплекса может проводиться с использованием метода малоуглового рентгеновского рассеяния, совмещенного с моделированием с помощью программы AlphaFold.

Введение

Сегодня очень остро стоит вопрос быстрого реагирования на эпидемиологические угрозы. Разработка вакцин стандартными методами занимает от 12-18 месяцев до нескольких лет, что при темпах распространения вируса SARS-CoV-2 оказалось критичным для миллионов людей (Cascella et al., 2022). В настоящее время не существует эффективных противовирусных препаратов и методов лечения, которые воздействуют на SARS-CoV-2 или другие коронавирусы, поэтому вакцинация является наиболее перспективным способом профилактики и предотвращения распространения COVID-19. Для эффективной борьбы с эпидемией необходимо использование принципиально новых подходов к созданию вакцин (Lurie et al., 2020).

Ферритиноподобные белки являются универсальной платформой для разработки мультимодальных наночастиц (B. Zhang et al., 2021). Они объединяют свойства разных материалов и могут выполнять несколько функций одновременно. Процессы самосборки обеспечивают мультимерную презентацию антигена на поверхности белка без внешнего вмешательства. Кроме того, расположение N-концов субъединиц апоферритина способствует тримеризации антигенов вблизи 3-фолдных каналов (Sun et al., 2021).

Первая химерная белковая вакцина на основе апоферритина была разработана в 2013 г. против вируса гриппа (Kanekiyo et al., 2013). Гемагглютинин (HA) был соединен с субъединицей апоферритина из H. pylori в единую полипептидную цепь. Самосборка наночастиц из химерного белка HA-апоферритина прошла успешно: формировались полноценные глобулярные молекулы апоферритина из 24 субъединиц с тримерами белка гемагглютинина непосредственно у 3-фолдных каналов. Тримеры HA в точности повторяли нативную структуру вирусных шипов. Титр антител после иммунизации этой вакциной у лабораторных животных был в 10 раз выше, чем после иммунизации стандартной инактивированной вакциной.

Позже были разработаны и другие вакцины на основе апоферритина, в том числе вакцина против других штаммов гриппа (Kanekiyo et al., 2013), вакцина против ВИЧ (Sliepen et al., 2015), вакцина против вируса Эпштейна-Барр (Kanekiyo et al., 2015) и вируса геппатита C (He et al., 2015). Первое клиническое исследование вакцин на основе апоферритина было начато в 2017 г. [https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03814720] и завершилось двумя годами позже. Препарат успешно прошел I фазу клинических испытаний, показав безопасность и иммуногенности при отсутствии серьезных побочных эффектов. В настоящее время проводятся некоторые другие клинические исследования вакцин на основе апоферритина [https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03814720; https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03186781; https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04579250; https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04784767;

https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04645147].

Технология разработки апоферритиновых вакцин все время совершенствуется. Так, в 2014 году была разработана технология SpyTag/SpyCatcher (Liu et al., 2014; Zakeri et al., 2012), предложившая новые возможности для создания вакцин на основе различных белковых наночастиц.

Однако, если антиген не образует тримеры и ковалентно присоединён к субъединице апоферритина, то могут возникнуть стерические затруднения, ведущие к некорректной укладке антигена при высокой заселённости поверхности апоферритина, таким образом накладывая значительные ограничения на размер антигена, используемого для данной платформы. Одним из путей решения данной проблемы может являться использование октамеров на основе субъединиц апоферритина, так называемого тупикового промежуточного состояния при сборке белковых глобул 24-меров (Sudarev et al., 2024). Таким образом, описанный в настоящей работе способ получения октамерных белковых комплексов на основе апоферритина может быть использован для решения данной проблемы.

Несмотря на широкую распространенность апоферритина в биотехнологии и неоднократные упоминания в литературе, протокол получения октамерных олигомеров до сих пор не был описан. Таким образом, предлагаемый нами протокол может найти широкое применение в биотехнологии.

Интересно, что в литературе сообщалось о получении октамеров на основе апоферритина (Wang et al., 2018). Авторы продемонстрировали необычный цилиндрический форм-фактор октамеров на основе значительно укороченной субъединицы апоферритина (около 50 аминокислот). Однако, полученный авторами белковый комплекс является искусственным и далеким от нативных условий, а поскольку он самособирается в нанотрубки, то становится далеко неочевидна возможность создания химерных белковых комплексов на основе таких октамеров.

Полученная же нами с помощью программы AlphaFold модель октамера апоферритина хорошо соответствует модели нативного октамера вокруг четырёхфолдного канала такого же, как и в 24-мерной глобуле апоферритина (RMSD = 0,676 Å) и существует в растворе в гомогенном состоянии, что было подтверждено методом малоуглового рентгеновского рассеяния.

Техническим результатом является биосинтез, выделение и очистка рекомбинантного белкового комплекса на основе апоферритина в качестве носителя для множественной презентации другого белка и контроль сборки белкового комплекса в октамерном состоянии. Октамеры химерных белков апоферритина и на основе апоферритина, как и другие олигомерные состояния, отличные от белкового комплекса из 24 субъединиц, могут иметь широкое применение в биотехнологии и медицине, например, обладать способностью нести большие слитые с ними белки, чем обычные глобулы, а также иметь другие физико-химические свойства из-за открытых сайтов минерализации на их внутренней поверхности, которые переводят железо из токсичного состояния Fe²⁺ в безопасное состояние для организма Fe³⁺.

Задачи заявляемого изобретения:

- разработать способ биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантного белкового комплекса на основе апоферритина для множественной презентации других белков (как носитель), сборки и контроля сборки белкового комплекса в стабильном октамерном состоянии

- произвести контроль сборки белкового комплекса

Задачи решены путем:

- биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантного белкового комплекса на основе апоферритина для множественной презентации других белков (как носитель), сборки и контроля сборки белкового комплекса в стабильном октамерном состоянии, состоящего в культивировании рекомбинантного штамма-продуцента E. coli на питательной среде CM8, содержащей бактотриптон, дрожжевой экстракт, глицерин и глюкозу в калий-фосфатном буфере, с индукцией биосинтеза L-рамнозой, с последующим выделением белков методом никельафинной хроматографии, отличающегося тем, что при приготовлении среды дрожжевой экстракт, бактотриптон, глицерин, калий-фосфатный буфер и MgSO₄ автоклавируются совместно;

- контроля самосборки целевого белкового комплекса методом малоуглового рентгеновского рассеяния, совмещенного с моделированием с помощью программы AlphaFold.

Способ получения химерного белкового комплекса в общем виде

Ген, кодирующий химерную белковую конструкцию на основе апоферритина, получается путём клонирования последовательности, кодирующей ген ftnA из H. pylori, в экспрессионный вектор с добавлением на N-конец гистидиновой метки и гена, кодирующего другой белок/белки.

В экспрессионном векторе конструкция помещается под контроль рамнозного промотора. Для биосинтеза используют богатую автоиндукционную среду CM8, содержащую 1 % (w/v) дрожжевого экстракта, 1 % (w/v) бактотриптона, 0.5 % (w/v) глицерина, 89 мМ калий-фосфатный буфер при pH 7.0, 0.05 % (w/v) глюкозы, 0.2 % (w/v) L-рамнозы, 4 мМ MgSO₄. При приготовлении дрожжевой экстракт, бактотриптон, глицерин, калий-фосфатный буфер и MgSO₄ автоклавируются совместно, с частичным осаждением солей.

Биосинтез целевых белков проводят ферментацией штаммов продуцентов в колбах. Метод позволяет получить культуру оптической плотности OD₆₀₀ = 10-20 и получить выход целевого продукта порядка 5-15 г клеточной биомассы с литра с содержанием целевого белка от 25 до 35% от общего содержания клеточного белка. Общее время ферментации составляет от 4 до 16 часов.

Очистка рекомбинантного белкового комплекса 8xApofSumo из полученной биомассы проходит в несколько стадий. Клетки биомассы лизируют в присутствии ингибиторов протеаз cOmplete™ (Merck KGaA, Германия) и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) на поточном дезинтеграторе. Полученный в результате лизиса клеточный дебрис, мембранную фракцию и нерастворимые белки штамма-продуцента отделяют осаждением с помощью центрифугирования. Осветленный лизат фильтруют (0.22 мкм) и при добавлении 10 мМ имидазола прокачиванием через сорбент наносят на никель-аффинный хроматографический сорбент, например, Ni-NTA Agarose (Qiagen, Нидерланды). Смывка образца проводится в буфере с 20 мМ Tris (pH 8.1) в градиенте имидазола (10–300 мМ).

Контроль самосборки белкового комплекса проводится методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР), совмещенного с моделированием с помощью программы AlphaFold.

Пример 1. Конструирование гена, кодирующего белковую конструкцию ApofSumo

Синтезируется нуклеотидная последовательность, состоящая из последовательности природного гена ftnA из H. pylori, кодирующего апоферритин.

Полученный ген клонируется в вектор pSol SUMO (Steinmetz & Auldridge, 2017). При клонировании в данный вектор к исходной последовательности гена на 3’ конец добавляется гистидиновая метка и ген убиквитин-подобного белка SMT3 из Saccharomyces cerevisiae. Полученный ген Smt3-SGG-ftnA в составе гибридной плазмиды находится под контролем сильного рамнозного промотора. Гибридная плазмида получила название pSumoApof, карта полученной плазмиды приведена на рис. 1.

Клетки штамма Escherichia coli BL21 (DE3) трансформируются плазмидой pSumoApof. Полученный в результате штамм–продуцент E. coli VSB2023 способен синтезировать химерный белок ApofSumo.

Пример 2. Биосинтез и очистка химерного белка с самосборкой белкового комплекса октмамера 8xApofSumo

Биосинтез 8xApofSumo осуществляют в 5 колбах объёмом 2,5 дм³ на среде CM8 с использованием штамма E. coli VSB2023. Данный штамм обеспечивает транскрипцию гена Smt3-SGG-ftnA, находящегося под контролем рамнозного промотора. Стерилизацию компонентов среды CM8 объёмом 2 л проводят в автоклаве. Среда перед автоклавированием имеет следующий состав: триптон, дрожжевой экстракт, глицерин (10, 10 и 5 г/л, соответственно), калий-фосфатный буфер 89 мМ и MgSO₄ 4 мМ. Другие добавки стерилизуются отдельно от среды (фильтрованием) и добавляются к среде непосредственно перед посевом. Полный состав среды CM8: дрожжевой экстракт 1% (w/v), бактотриптон 1% (w/v), глицерин 0.5% (w/v), калий-фосфатный буфер 89 мМ pH 7.0, глюкоза 0.05% (w/v), L-рамноза 0.2% (w/v), MgSO₄ 4 мМ, канамицин 50 мкг/мл.

Посевную культуру выращивают в среде PCM, которая отличается от среды CM8 отсутствием L-рамнозы, количеством глюкозы 0.5% (w/v) и наличием сукцината натрия 10 мМ, в объёме 250 мл при температуре 37°С, с аэрацией 200 об/мин до оптической плотности OD = 2. Рост экспрессионной культуры проводится на 3 л среды CM8 (5 колб по 400 мл) при температуре 37°С, с аэрацией 130 об/мин в течение 5 часов.

В результате получают от 10 г клеточной биомассы с содержанием ApofSumo порядка 30% от общего содержания клеточного белка.

Полученную биомассу используют для выделения целевого белка. Для этого 20 г клеток суспендируют в 200 мл лизирующего буфера (см. табл. 1). Разрушение клеточной биомассы проводят на проточном дезинтеграторе 110P (Microfluidics, США) или APV-1000 (APV Systems, США). Клеточный лизат центрифугируют при 15 000 g 60 минут, полученный в супернатанте осветлённый клеточный лизат фильтруют (0.22 мкм) и добавляют 10 мМ имидазола.

Полученный раствор прокачиванием через сорбент наносят на никель-аффинный хроматографический сорбент, например, Ni-NTA Agarose (Qiagen, Нидерланды). Сорбент предварительно уравновешивают смесью буферов для хранения и смывки (см. табл. 1) с итоговой концентрацией имидазола 10 мМ. Смывка образца с сорбента проводится смесью буферов для хранения и смывки (см. табл. 1) сначала с концентрацией имидазола 30 мМ (промывка 5 объемов колонки), при этом элюируются нецелевые клеточные белки, а затем концентрацией имидазола 300 мМ элюируется целевая белковая фракция. Полученный раствор белка методом диализа переводят в буфер для хранения (20 мМ Tris, pH 8.1). Суммарный выход белка после этой стадии составляет приблизительно 20% по отношению к белку, содержавшемуся в биомассе.

Табл. 1. Растворы для выделения целевого белка

Раствор Вещество Навеска Способ приготовления Буферная основа Tris 121.1 г Соли смешать, растворить в 1 л MQ. Титровать раствор конц. HCl до доведения pH до 8.5. Имидазол (ИМ) Имидазол 61.27 г Растворить сухой имидазол в 100мл MQ. Лизирующий буфер Буферная основа 50 мл Все реагенты смешать, растворить в 1 л MQ. PMSF и cOmplete добавляется непосредственно перед использованием. PMSF 0.087 г cOmplete 20 мкл Буфер для хранения Буферная основа 50 мл Развести буферную основу до 1л MQ. Довести pH до 8.5 конц. HCl или NaOH. Буфер для смывки Буферная основа 15 мл Смешать растворы, довести MQ до 300 мл. Довести pH до 8.5 конц. HCl или NaOH. Итоговая конц. имидазола – 300 мМ. Имидазол 10 мл

Результатом выделения и очистки белка ApofSumo по описанному методу являются белковые комплексы 8xApofSumo в растворе. Результат анализа качества очистки белковой конструкции был проведен методом вестерн блоттинга, представлен на рисунке 2. Дорожка слева соответствует маркеру длин (массы полос в кДа указаны слева), дорожка справа – полученному белковому препарату (полоса, соответствующая ApofSumo, отмечена стрелкой).

Пример 3. Контроль самосборки белкового комплекса 8xApofSumo

Для контроля самосборки целевого белкового комплекса 8xApofSumo проводились исследования полученных образцов методом МУРР, совмещенного с моделированием с помощью программы AlphaFold (Sudarev et al., 2024).

Образцы помещались в капилляры из боросиликатного стекла (Hilgenberg GmbH, диаметр 1.5 мм, толщина стенок 10 мкм). Для одного эксперимента используется 20-30 мкл образца. Капилляры с образцом запаивались при помощи газовой горелки, после чего капилляры с обеих сторон дополнительно запаивались воском. Запаянные капилляры были размещены на держателе, который был помещён в измерительную вакуумную камеру установки МУРР Rigaku Micromax-007HF. Во время измерений в камере поддерживался вакуум ~ 0.1 мбар.

Рентгеновское излучение с длиной волны λ=1.54 Å, рассеянное на исследуемом образце, фиксировалось позиционно-чувствительным детектором ASM DTR Triton 200. Первичная обработка экспериментальных данных (азимутальное усреднение 2D-изображений, калибровка по модулю вектора рассеяния q и нормировка интенсивности на пропускание и длину оптического пути) производилась в программе SAXSGui (Rigaku Innovative Technologies, Inc., and JJ X-ray System Aps). Полученные МУРР кривые I(q) (зависимость интенсивности от модуля вектора рассеяния q) обрабатывались с помощью программного пакета ATSAS (Franke et al., 2017). Построение функций распределения по расстояниям P(r) для исследуемых образцов проводилось в программе GNOM. По имеющимся данным I(q) и P(r) проведено моделирование структуры белкового комплекса.

На рисунке 3 слева представлен 1D-профиль интенсивности малоуглового рентгеновского рассеяния от модуля вектора рассеяния q, а также аппроксимация экспериментальных данных моделью октамера 8xApofSumo, построенной с помощью программы Alphafold, а справа - функция распределения по расстояниям P(r).

Исследование структуры белкового комплекса 8xApofSumo производилось с помощью программы Alphafold. Двадцать пять моделей белковых комплексов были сгенерированы и оценены в соответствии с прогнозируемым TMscore (Y. Zhang & Skolnick, 2004). Первые восемь моделей с наивысшими баллами имели схожую структуру вокруг четырёхфолдного канала). Получившаяся модель 8xApofSumo с наилучшим предсказанным показателем TMscore в дальнейшем использована для аппроксимации программой CRYSOL экспериментальной I(q). Модель 8xApofSumo хорошо аппроксимирует экспериментальные данные (χ² = 1.066). Рисунок 4 (сверху) демонстрирует модель 8xApofSumo, предсказанную с помощью программы Alphafold, цветом показана метрика достоверности предсказанной модели от синего (большая достоверность предсказания), до красного (низкая достоверность предсказания). Рисунок 4 (снизу) демонстрирует модель 8xApofSumo, предсказанную с помощью программы CORAL (Petoukhov et al., 2012), с выделенными красным цветом отдельными субъединицами для наглядности. производилось с помощью программы CORAL. Наилучшее соответствие теоретических и экспериментальных данных (χ² = 1.09) достигается при использовании модели октамера, в которой субъединицы апоферритина образуют тетрамер димеров, соответствующий 4-фолдному каналу. Стартовая модель одной субъединицы ApofSumo была построена с использованием онлайн-программы Phyre 2.0 (Kelley et al., 2015) в соответствии со структурой апоферритина высокого разрешения. Положения протомеров апоферритина фиксировали в соответствии с моделью PDB 3BVE, а положения доменов SUMO и гибких частей (петель) моделей были оптимизированы программой CORAL для достижения наилучшего соответствия между теоретическими и экспериментальными данными (χ² = 1.09).

Заключение

Таким образом, разработан способ получения самособирающегося белкового комплекса на основе апоферритина в октамерном состоянии как потенциального носителя для других белков, а также подтверждено его стабильное олигомерное состояние (октамер) методом малоуглового рентгеновского рассеяния, совмещенного с моделированием с помощью программы AlphaFold.

Список литературы

Cascella, M., Rajnik, M., Cuomo, A., Dulebohn, S.C., & Di Napoli, R. (2022). Features, Evaluation, and Treatment of Coronavirus (COVID-19). StatPearls.

Franke, D., Petoukhov, M.V., Konarev, P.V., Panjkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H.D.T.T., Kikhney, A.G., Hajizadeh, N.R., Franklin, J.M., Jeffries, C.M., Svergun, D.I., & Semenov, N.N. (2017). ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography, 50, 1212–1225. https://doi.org/10.1107/S1600576717007786

He, L., Cheng, Y., Kong, L., Azadnia, P., Giang, E., Kim, J., Wood, M.R., Wilson, I.A., Law, M., & Zhu, J. (2015). Approaching rational epitope vaccine design for hepatitis C virus with meta-server and multivalent scaffolding. Scientific Reports, 5(1), 12501. https://doi.org/10.1038/srep12501

Kanekiyo, M., Bu, W., Joyce, M.G., Meng, G., Whittle, J.R.R., Baxa, U., Yamamoto, T., Narpala, S., Todd, J.P., Rao, S.S., McDermott, A.B., Koup, R.A., Rossmann, M.G., Mascola, J.R., Graham, B.S., Cohen, J.I., & Nabel, G.J. (2015). Rational Design of an Epstein-Barr Virus Vaccine Targeting the Receptor-Binding Site. Cell, 162(5), 1090–1100. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.07.043

Kanekiyo, M., Wei, C.-J., Yassine, H.M., McTamney, P.M., Boyington, J.C., Whittle, J.R.R., Rao, S.S., Kong, W.-P., Wang, L., & Nabel, G.J. (2013). Self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizing H1N1 antibodies. Nature, 499(7456), 102–106. https://doi.org/10.1038/nature12202

Kelley, L.A., Mezulis, S., Yates, C.M., Wass, M.N., & Sternberg, M.J.E. (2015). The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols 2015 10:6, 10(6), 845–858. https://doi.org/10.1038/nprot.2015.053

Liu, Z., Zhou, H., Wang, W., Tan, W., Fu, Y. X., & Zhu, M. (2014). A novel method for synthetic vaccine construction based on protein assembly. Scientific Reports 2014 4:1, 4(1), 1–8. https://doi.org/10.1038/srep07266

Lurie, N., Sharfstein, J.M., & Goodman, J.L. (2020). The Development of COVID-19 Vaccines: Safeguards Needed. JAMA, 324(5), 439–440. https://doi.org/10.1001/JAMA.2020.12461

Petoukhov, M.V, Franke, D., Shkumatov, A.V, Tria, G., Kikhney, A.G., Gajda, M., Gorba, C., Mertens, H.D.T., Konarev, P.V, & Svergun, D.I. (2012). New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr., 45(2), 342. https://doi.org/10.1107/S0021889812007662

Sliepen, K., Ozorowski, G., Burger, J.A., Van Montfort, T., Stunnenberg, M., LaBranche, C., Montefiori, D.C., Moore, J.P., Ward, A.B., & Sanders, R.W. (2015). Presenting native-like HIV-1 envelope trimers on ferritin nanoparticles improves their immunogenicity. Retrovirology, 12(1), 82. https://doi.org/10.1186/s12977-015-0210-4

Steinmetz, E.J., & Auldridge, M.E. (2017). Screening Fusion Tags for Improved Recombinant Protein Expression in E. coli with the Expresso® Solubility and Expression Screening System. Current Protocols in Protein Science, 90(1), 5.27.1-5.27.20. https://doi.org/10.1002/CPPS.39

Sudarev, V.V., Gette, M.S., Bazhenov, S.V., Tilinova, O.M., Zinovev, E.V., Manukhov, I.V., Kuklin, A.I., Ryzhykau, YuL., & Vlasov, A.V. (2024). Ferritin-based fusion protein shows octameric deadlock state of self-assembly. Biochemical and Biophysical Research Communications, 690, 149276. https://doi.org/10.1016/J.BBRC.2023.149276

Sun, W., He, L., Zhang, H., Tian, X., Bai, Z., Sun, L., Yang, L., Jia, X., Bi, Y., Luo, T., Cheng, G., Fan, W., Liu, W., & Li, J. (2021). The self-assembled nanoparticle-based trimeric RBD mRNA vaccine elicits robust and durable protective immunity against SARS-CoV-2 in mice. Signal Transduction and Targeted Therapy 2021 6:1, 6(1), 1–11. https://doi.org/10.1038/s41392-021-00750-w

Wang, W., Wang, L., Chen, H., Zang, J., Zhao, X., Zhao, G., & Wang, H. (2018). Selective Elimination of the Key Subunit Interfaces Facilitates Conversion of Native 24-mer Protein Nanocage into 8-mer Nanorings. Journal of the American Chemical Society, 140(43), 14078–14081. https://doi.org/10.1021/JACS.8B09760/SUPPL_FILE/JA8B09760_SI_003.PDB

Zakeri, B., Fierer, J. O., Celik, E., Chittock, E. C., Schwarz-Linek, U., Moy, V. T., & Howarth, M. (2012). Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109(12), E690–E697. https://doi.org/10.1073/PNAS.1115485109/SUPPL_FILE/APPENDIX.PDF

Zhang, B., Tang, G., He, J., Yan, X., & Fan, K. (2021). Ferritin nanocage: A promising and designable multi-module platform for constructing dynamic nanoassembly-based drug nanocarrier. Advanced Drug Delivery Reviews, 176, 113892. https://doi.org/10.1016/J.ADDR.2021.113892

Zhang, Y., & Skolnick, J. (2004). Scoring function for automated assessment of protein structure template quality. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 57(4), 702–710. https://doi.org/10.1002/PROT.20264

Изобретение относится к области химии и биотехнологии, а именно к способу получения рекомбинантного белкового комплекса на основе апоферритина в октамерном состоянии, в котором апоферритин выступает в качестве носителя для множественной презентации другого белка, согласно которому культивируют рекомбинантный штамм-продуцент E. coli, содержащий гибридную плазмиду, содержащую под контролем рамнозного промотора нуклеотидную последовательность слитых генов презентуемого белка и апоферритина, кодирующих мономер белкового комплекса, на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, бактотриптон, глицерин, калий-фосфатный буфер и MgSO₄, которые при приготовлении среды автоклавируются совместно, затем из полученных при культивировании клеток получают лизат, который центрифугируют, фильтруют, после чего добавляют имидазол с получением раствора, из которого выделяют белковый комплекс методом никель-аффинной хроматографии. Технический результат заключается в биосинтезе, выделении и очистке рекомбинантного белкового комплекса на основе апоферритина в октамерном состоянии, в котором апоферритин выступает в качестве носителя для множественной презентации другого белка. 4 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ получения рекомбинантного белкового комплекса на основе апоферритина в октамерном состоянии, в котором апоферритин выступает в качестве носителя для множественной презентации другого белка, согласно которому культивируют рекомбинантный штамм-продуцент E. coli, содержащий гибридную плазмиду, содержащую под контролем рамнозного промотора нуклеотидную последовательность трансляционно слитых генов презентуемого белка и апоферритина, кодирующих мономер белкового комплекса, на питательной среде, содержащей 1% масс./об. дрожжевого экстракта, 1% масс./об. бактотриптона, 0,5% масс./об. глицерина, 89 мМ калий-фосфатного буфера при pH 7,0, 0,05% масс./об. глюкозы, 0,2% масс./об. L-рамнозы, 4 мМ MgSO₄, причем при приготовлении среды дрожжевой экстракт, бактотриптон, глицерин, калий-фосфатный буфер и MgSO₄ автоклавируются совместно, затем полученные при культивировании клетки суспендируют в лизирующем буфере, получают клеточный лизат, который центрифугируют, фильтруют, после чего добавляют имидазол с получением раствора, из которого выделяют белковый комплекс методом никель-аффинной хроматографии с применением для элюирования буферного раствора, содержащего имидазол.