Способ получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His Российский патент 2024 года по МПК A61K39/10 C07K1/00 C07K14/23 C12N1/21 C12N15/70 C12P21/02 C12R1/19 

Описание патента на изобретение RU2825400C1

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к биофармакологии, к областям получения и производства иммунобиологических препаратов, медицинской микробиологии, созданию фармакологических и вакцинных композиций, биотехнологиям продукции рекомбинантных белков, и касается разработки нового способа получения рекомбинантного химерного белка OMP25d-OMP19-OMP10His, включающего три белка Brucellaabortus, перспективного для использования в составе вакцины против бруцеллезной инфекции.

Основной сферой применения предлагаемого способа получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His являются биомедицина, создание медицинских профилактических препаратов, лабораторные биологические и медицинские исследования, создание субъединичных вакцин и вакцинных штаммов для профилактики бруцеллеза.

Бруцеллез - это широко распространенное в мире зоонозное заболевание, поражающее как животных, так и человека. Специфическая профилактика является одной из мер по борьбе с распространением данной инфекции. В России, в отличие от большинства стран мира, проводится вакцинация людей против бруцеллеза с помощью штамма Brucellaabortus 19ВА, однако, она применяется только у определенной категории лиц в случае угрозы заражения B. melitensis. Ограниченное применение данной вакцины связано с риском возникновения побочных эффектов, обусловленных остаточными вирулентностью и реактогенностью живого вакцинного штамма. Поэтому совершенствование специфической профилактики бруцеллеза остается актуальной задачей (Коршенко В.А., Щипелева И.А., Кретенчук О.Ф., Марковская Е.И. Прошлое, настоящее, перспективы и проблемы совершенствования специфической профилактики бруцеллёза. Медицинский вестник Юга России. – 2021. – V.12(3). – PP.12-21. https://doi.org/10.21886/2219-8075-2021-12-3-12-21).

Субъединичные и ДНК-вакцины, основанные на иммуногенности иммунодоминантных бруцеллезных белков, могут обладать рядом преимуществ по сравнению с традиционными живыми вакцинами, такими как безопасность, отсутствие «балластных» белков и нуклеиновых кислот, повышающих реактогенность и аллергенность препарата, простота производства, транспортировки и использования, легкая масштабируемость, возможность комбинирования с белковыми вакцинами, направленными на защиту от других патогенов. Однако применение моновалентных субъединичных вакцин не может обеспечить достаточного уровня протективности. Одним из вариантов решения данной проблемы, наряду с применением адъювантов, является использование коктейля из антигенов, например, в виде слитых белков, состоящих из нескольких иммуногенных белков бруцелл.

На данный момент изучен вакцинный потенциал большого количества как единичных антигенов (OMP2b, OMP10, OMP16, OMP19, OMP28, OMP25, OMP31, L7/L12, P39, так и их комбинаций (rL7/L12-TOmp31, rOmp10-rOmp19-rOmp28, rOmp31+rTF, в том числе слитых белков бруцелл Omp10-Omp28-L7/L12 (Zhu L, Wang Q., Wang Y., Xu Y., Peng D., Huang H., Hu L., Wei K., Zhu R. / Comparison of Immune Effects Between Brucella Recombinant Omp10-Omp28-L7/L12 Proteins Expressed in Eukaryotic and Prokaryotic Systems. // Front Vet Sci. - 2020. - V.18; 7. - P.576. DOI: 10.3389/fvets.2020.00576), L7/L12-TOmp31-SOmp2b (Golshani M., Rafati S., Jahanian-Najafabadi A., Nejati-Moheimani M., Siadat S.D., et al. / In silico design, cloning and high-level expression of L7/L12-TOmp31 fusion protein of Brucella antigens. // Res Pharm Sci. – 2015. - V.10(5). PP.436-45), L7/L12-OMP22-OMP25-OMP31 (Li Z., Wang S., Wei S., Yang G., Zhang C., et al. Immunization with a combination of recombinant Brucella abortus proteins induces T helper immune response and confers protection against wild-type challenge in BALB/c mice. // Microb Biotechnol. - 2022. - V.15(6). - PP.1811-1823. DOI: 10.1111/1751-7915.14015), L7/L12-Omp25 (Gupta S., Mohan S., Somani V.K., Aggarwal S., Bhatnagar R. Simultaneous Immunization with Omp25 and L7/L12 Provides Protection against Brucellosis in Mice. Pathogens. - 2020. - V.24; 9(2). -P.152. DOI: 10.3390/pathogens9020152), Adk-SecB (Huy T.X.N., Bernardo Reyes A.W., Vu S.H., Arayan L.T., Hop H.T., et al. Immunogenicity and protective response induced by recombinant Brucella abortus proteins Adk, SecB and combination of these two recombinant proteins against a virulent strain B. abortus 544 infections in BALB/c mice. Microb Pathog. - 2020. - V.143. - P.104137. DOI: 10.1016/j.micpath.2020.104137), L7/L12-Omp25 (Paul S., Peddayelachagiri B.V., Nagaraj S., Konduru B., Batra H.V. / Protective and therapeutic efficacy study of divalent fusion protein rL7/L12-Omp25 against B. abortus 544 in presence of IFNγ. // Appl Microbiol Biotechnol. - 2018 - V.102(20). - PP 8895-8907. DOI: 10.1007/s00253-018-9314-9), L7/L12-SOmp2b (Golshani M., Ghasemian M., Gheibi N., Bouzari S./ In silico Design, and In vitro Expression of a Fusion Protein Encoding Brucella abortus L7/L12 and SOmp2b Antigens. // Adv Biomed Res. - 2018. - V.16; 7. - P21. DOI: 10.4103/abr.abr_10_17), которые показали хорошую иммунореактивность и протективность на мышах, однако, недостаточную для замены существующих методов специфической профилактики бруцеллеза.

Выбор антигенного состава, кодируемого предлагаемой генно-инженерной конструкцией, обусловлен тем, что белки наружной мембраны OMP25d, OMP19 и OMP10 Brucella spp. - протеины, экспонированные на поверхности микробной клетки, высоко консервативны, экспрессируются у представителей всех биоваров шести патогенных видов бруцелл и связаны с вирулентностью (Martín-Martín A.I., Caro-Hernández .P, Orduña A., Vizcaíno N., Fernández-Lago L. / Importance of the Omp25/Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B. ovis in murine macrophages and HeLa cells. // Microbes Infect. -2008. V.10(6). - PP.706-10. DOI: 10.1016/j.micinf.2008.02.013). Показано, что белки OMP10 и OMP19 стимулируют у мышей продукцию IgG антител, а также индуцируют провоспалительный иммунный ответ в клетках человеческой моноцитарной клеточной линии (Im Y.B, Park W.B., Jung M., Kim S., Yoo H.S. / Comparative Analysis of Immune Responses to Outer Membrane Antigens OMP10, OMP19, and OMP28 of Brucella abortus. // Jpn J Infect Dis. -2018. - V.24; 71(3). - PP.197-204. DOI: 10.7883/yoken.JJID.2017.019). Была изучена возможность использования OMP19 в качестве адъюванта в связи с его высокой иммуногенностью Risso G.S., Carabajal M.V., Bruno L.A., Ibañez A.E., Coria L.M., Pasquevich K.A., Lee S.J., McSorley S.J., Briones G., Cassataro J. / U-Omp19 from Brucella abortus Is a Useful Adjuvant for Vaccine Formulations against Salmonella Infection in Mice. // Front Immunol. - 2017 - V.17; 8. - PP171. DOI: 10.3389/fimmu.2017.00171). Кроме того, установлено, что in vitro белки OMP10 и OMP19 участвуют в регуляции созревания и презентации антигена мышиными дендритными клетками (Yang N., Tong Z., Wang Z., et al. / Brucella outer membrane proteins to control maturation and antigen presentation of mouse dendritic cells. // bioRxiv; - 2021. DOI: 10.1101/2021.03.05.434055). OMP25d относится к семейству высококонсервативных белков наружной мембраны OMP25/OMP31, которое включает семь гомологов (OMP25, OMP25b, OMP25c, OMP25d, OMP31, OMB31b и OMP22) играет важную роль в поддержании целостности клеточной оболочки бруцелл (Roop R.M. 2nd, Barton I.S., Hopersberger D., Martin D.W. / Uncovering the Hidden Credentials of Brucella Virulence. // Microbiol Mol Biol Rev. - 2021. - V.10; 85(1). - PPe00021-19. DOI: 10.1128/MMBR.00021-19). Было показано, что инактивация гена omp25d у B. ovis PA приводит к значительному снижению вирулентности патогенна у мышей, а также, что OMP25d непосредственно вовлечен в проникновение и выживание B. ovis PA внутри клеток хозяина (Caro-Hernández P., Fernández-Lago L., de Miguel M.J., Martín-Martín A.I., Cloeckaert A., Grilló M.J., Vizcaíno N. / Role of the Omp25/Omp31 family in outer membrane properties and virulence of Brucella ovis. // Infect Immun. 2007 - V.75(8). - PP4050-61. DOI: 10.1128/IAI.00486-07). В частности, в формирование репликативной фагосомы (бруцелласомы), необходимой для правильного внутриклеточного размножения. В недавнем исследовании было показано, что транскрипционный фактор ArsR6, который активируется в условиях теплового, оксидативного и осмотического стресса и регулирует поддержание бактериального внутриклеточного гомеостаза Cu/Ni в клетках хозяина, также модулирует экспрессию гена omp25d (Zhi F., Zhou D., Chen J., Fang J., Zheng W., Li J., Hao M., Shi Y., Jin Y., Wang A. / An ArsR Transcriptional Regulator Facilitates Brucella sp. Survival via Regulating Self and Outer Membrane Protein. // Int J Mol Sci. - 2021. - V.22(19). - P10860. DOI: 10.3390/ijms221910860).

На данный момент не найдено публикаций о клонировании данного бруцеллезного белка и оценки его вакцинного потенциала.

Известен способ получения рекомбинантных антигенов для создания бруцеллезной вакцины на основе системы экспрессии Escherichia coli и оценки их вакцинного потенциала (Akbari R., Sekhavati M.H., Bahrami A., Majidzadeh Heravi R., Yousefi S. / Production of Brucella lumazine Synthase Recombinant Protein to Design a Subunit Vaccine against Undulant Fever // Arch Razi Inst. - 2019. - V.74(1). - P.1-6. DOI: 10.22092/ari.2019.117997. Abdollahi A., Mansouri S., Amani J., Fasihi-Ramandi M., Ranjbar R., et al. / A Recombinant Chimera Protein as a Novel Brucella Subunit Vaccine: Protective Efficacy and Induced Immune Response in BALB/c Mice. // Jundishapur J Microbiol. - 2018. - V.11(1). - Р.e12776. https://doi.org/10.5812/jjm.12776. Yousefi S., Abbassi-Daloii T., Sekhavati M.H., Tahmoorespur M. / Evaluation of immune responses induced by polymeric OMP25-BLS Brucella antigen. // Microb Pathog. – 2018. – V.115. - P.50-56. DOI: 10.1016/j.micpath.2017.12.045.). Однако несмотря на многолетние исследования, до сих пор ни один из препаратов на основе рекомбинантных бруцеллезных белков не прошел клинические испытания.

Изобретение решает задачу создания способа получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His, который может быть использован в качестве компонента вакцин против бруцеллеза.

Поставленная задача решается путем разработки способа получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His, включающего создание генетической конструкции, размером 1524 н.п., включающей гены белков OMP25d, OMP19, OMP10 без сигнальных пептидов, последовательности линкеров, гистидинового тага, конструирование плазмиды pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, 6871 п.н., трансформацию клеток E. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, культивирование полученного штамма E. coli BL21(DE3)/ pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His при температуре 37 °С в течение 4 часов при температуре 37 °С, получение фракции телец включения бактерий-продуцентов, очистку белка OMP25d-OMP19-OMP10His металл-хелатной хроматографией из телец включения в денатурирующих условиях.

Техническим результатом изобретения является способ продукции и очистки из телец включения бактерий гомогенного рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His с чистотой 98%, содержанием бактериального эндотоксина не более 5 IU/мг и выходом 0,2 г с литра бактериальной культуры, применимый для получения больших количеств данного белка, пригодного для использования в биотехнологии и фармакологии при разработке и производстве вакцинных препаратов.

Технический результат изобретения достигается за счет получения генов бруцеллезных белков OMP25d, OMP19, OMP10 при помощи ПЦР с геномной ДНК штамма B. abortus 544 с использованием специфических праймеров, кодирующих сайты расщепления эндонуклеазами рестрикции NdeI, XhoI.

Технический результат изобретения достигается за счет получения последовательности ДНК, определяющей синтез белка OMP25d-OMP19-OMP10His за счет соединения генов трех белков и линкеров при помощи СОЭ-ПЦР с использованием специфических праймеров.

Также технический результат изобретения достигается за счет конструирования плазмиды pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, содержащей промоторную последовательность ДНК бактериофага T7, ген устойчивости к антибиотику, последовательность ДНК, кодирующую белок OMP25d-OMP19-OMP10His, и синтетическую последовательность шести гистидинов для очистки белка металл-хелатной хроматографией.

Также технический результат изобретения достигается за счет получения штамма BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His на основе штамма E.coli BL21(DE3), трансформированного плазмидой pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, экспрессирующей белок OMP25d-OMP19-OMP10His.

Также технический результат изобретения достигается за счет продукции рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His в бактериях E. coli штамма BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His в течение 4 часов при температуре 37 °C, что обеспечивает накопление рекомбинантного белка в цитоплазме бактерий преимущественно в тельцах включения.

Также технический результат изобретения достигается получением цитоплазматической фракции бактериальных белков за счет процедуры ультразвуковой дезинтеграции бактерий и обработки лизоцимом, что приводит к разрушению клеточной стенки и разделению цитоплазмы и сферопластов бактерий.

Также технический результат изобретения достигается благодаря схеме очистки белка OMP25d-OMP19-OMP10His с помощью металл-хелатной хроматографии на колонке c иммобилизованным бивалентным металлом в денатурирующих условиях, позволяющей получить гомогенный белок, характеризующийся 98% чистотой по данным электрофореза и денситометрии и содержанием бактериального эндотоксина не более 5 IU/мг белка.

Отличием предлагаемого способа является высокий выход растворимого рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His (0,2 г с литра бактериальной культуры), достигаемый за счет особенностей конструирования продуцента BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, сохранение белка в растворимой стабильной форме после диализа из раствора с денатурирующим агентом 6М мочевины в раствор с ФСБ, pH=7,4, а также после замораживания.

Существенным достоинством предлагаемого способа получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His является низкий уровень содержания бактериального эндотоксина в конечном препарате (5 IU/мг белка), допустимый для применения в инъекциях как по российским, так и по международным стандартам (XII издание Государственной фармакопеи Российской Федерации; Международная фармакопея ВОЗ, документ QAS/11.452 FINAL, июль 2012 г.). Таким образом, полученный по данному способу рекомбинантный белок OMP25d-OMP19-OMP10His пригоден для разработки и производства вакцин.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

фиг. 1. Схема организации рекомбинантной плазмиды pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, где: OMP – клонированный фрагмент, включающий гены белков OMP25d, OMP19, OMP10 и линкеров; 6хHis - участок полигистидинового тага; NdeI и XhoI - уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции, использованные при создании данной конструкции; T7 – промотор, присутствующий в рекомбинантной плазмиде; lacI – ген β-лактамазы, обеспечивающий трансформированным бактериальным клеткам устойчивость к ампициллину.

фиг. 2. Электрофоретический анализ ДНК, где маркер - ThermoScientific™ O'GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder, 1 - pET32b, 2 - ген белка OMP25d-OMP19-OMP10His, 3 - pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, 4 - ген omp25d, 4 - ген omp19, 5 - ген omp10.

фиг. 3. Трехмерная модель белка OMP25d-OMP19-OMP10His, где А, Б - представление модели белка в виде ленточной и сферической структур, соответственно, выделенных цветами радуги в направлении от N-конца аминокислотной последовательности (красный) к С-концу (фиолетовый).

фиг. 4. Электрофоретический анализ белка OMP25d-OMP19-OMP10His во время экспрессии, после очистки и диализа, где: Маркер ММ - маркер молекулярной массы белка PageRuler™ unstained Protein Ladder SM0661, Маркер 2 - маркер молекулярной массы белка окрашенный G2058-250UL, К - контроль штамм E. coli BL21(DE3), 0 ч - образец из осадка клеток до индукции, 4 ч - образец через 4 часа индукции 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (ИПТГ) при 37°С.

Изобретение осуществляют следующим образом:

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют подробные примеры его конкретного выполнения со ссылками на прилагаемые таблицы и фигуры.

Пример 1.

Создание нуклеотидных последовательностей гена белка OMP25d-OMP19-OMP10His

С помощью BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - базовый инструмент поиска местного выравнивания) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) проводят анализ нуклеотидных последовательностей геномов 20 штаммов бруцелл, находящихся в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», и выявляют идентичность нуклеотидных последовательностей генов белков OMP25d, OMP19, OMP10 во всех штаммах. С помощью программы SignalP-6.0. (https://services.healthtech.dtu.dk/) устанавливают нуклеотидные последовательности лидерных пептидов в обоих генах белков. На основании вышеуказанных данных составляют нуклеотидную последовательность гена слитого белка из генов белков без участков, кодирующих лидерные пептиды, и 2 линкерами между ними. Схема организации гена белка OMP25d-OMP19-OMP10His представлена в таблице 1.

Пример 2.

Коструирование плазмиды.

Плазмиду pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His конструируют в результате следующих манипуляций: амплификация генов белков ОМР25d (с участком, кодирующем линкер (696 н.п.)) OMP19 (471 н.п.), OMP10 (с участком, кодирующем линкер (381 н.п.)) без участков, кодирующих сигнальные последовательности, в ПЦР на матрице суммарной ДНК штамма B. abortus 544 с использованием праймеров Forward ОМР25d и Reverse ОМР25d (включает последовательность линкера), Forward OMP19 и Reverse ОМР19, а также Forward OMP10 (включает последовательность линкера) и Reverse ОМР10, где

Forward OMP25d

5`- ggaattccatatggcggatgccattgttgcg -3`

Reverse OMP25d

5`- gcctcggcgttgcctataagttcgaagctgctgcaaaagaagctgctgcaaa

agaagctgctgcaaaatgccaaagctcccggcttgg-3`

Forward OMP19

5`- ggaattccatatgtgccaaagctcccggcttggtaat -3`

Reverse OMP19

5`- cccgctcgaggcgcgacagcgtcacggc -3`

Forward OMP10

5`- gccgtgacgctgtcgcgcggctccgctggctccgctgctggttctggcgagttctgcgaaacaacaggcccgggc -3`

Reverse OMP10

5`- cccgctcgaggccggcgttgcggcgggt -3`.

Затем проводят амплификацию гена слитого белка (omp) (1524 н.п.) в реакции СОЭ-ПЦР, где в качестве матрицы используют эквимолярные количества ДНК генов белков OMP25d (696 н.п.), OMP19 (471 н.п.) и OMP10 (381 н.п.), рестрикцию ПЦР-фрагмента гена omp эндонуклеазами NdeI и XhoI, лигирование его с рестрицированной эндонуклеазами NdeI и XhoI векторной ДНК, под контроль T7lac-промотора в векторе pET32b(+), трансформацию клеток E. coli DH5α; селекцию на среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, наращивание и выделение плазмиды, контроль вставки целевой ДНК в плазмиде с помощью ПЦР. Схема организации плазмиды представлена на фиг. 1. Электрофоретический анализ генов и плазмид представлен на фиг. 2.

Пример 3.

Секвенирование генов, аминокислотный состав белков, конструирование трехмерной модели белка.

Для определения нуклеотидной последовательности гена слитого белка (omp), включающего гены белков OMP25d, OMP19 и OMP10, разделенных участком, кодирующем линкер, используют прямой метод секвенирования без предварительного клонирования геномных фрагментов ДНК. Определяют нуклеотидную последовательность гена omp. Секвенирование проводят на приборе ABI Applied Biosistems c использованием олигонуклеотидов, комплементарных последовательности нуклеотидов генов omp25d (Forward primer), omp10 (Reverse primer). На основании полученного результата определяют аминокислотную последовательность слитого белка OMP25d-OMP19-OMP10His с помощью компьютерной программы Translate (https://www.bioinformatics.org/sms2/translate.html). Аминокислотный состав белка представлен в таблице 2. Данные об аминокислотной последовательности слитого белка OMP25d-OMP19-OMP10His вносят в программу расчета трехмерной модели белка I-TASSER-MTD (https://zhanggroup.org/I-TASSER-MTD/). Уточнение структуры полученной модели слитого белка, а затем прогноз физико-химических и иммуногенных белка проводят с помощью методов обратной вакцинологии Bibi et al., 2021. Модель слитого белка представлена на фиг. 3.

Табл. 2. Аминокислотные последовательности белков

Белок Аминокислотная последовательность OMP25d MADAIVAQEPAPIAIAPSFSWAGAYFGGQVGYGWGRAKLENRTNGGTSEFKPNGFIGGLYTGYNFDTGNNFILGLDANVDYNNLKKSRDFITSGNPVQTTGETQLRWSGAVRARAGYAIDRFMPYIAGGVAFGGIKNSLRIGGEESSKSKTQTGWTVGAGIDYAATDNVLLRLEYRYTDYGKKNFGLNDLDTRGSFKTNDIRLGVAYKF Линкер1 EAAAKEAAAKEAAAK OMP19 CQSSRLGNLDNVSPPPPPAPVNAVPAGTVQKGNLDSPTQFPNAPSTDMSAQSGTQVASLPPASAPDLTPGAVAGVWNASLGGQSCKIATPQTKYGQGYRAGPLRCPGELANLASWAVNGKQLVLYDANGGTVASLYSSGQGRFDGQTTGGQAVTLSR Линкер2 GSAGSAAGSGEF OMP10 CETTGPGSGNAPIIAHTPAGIEGSWVDPNGIASSFNGGIFETRTTDTNEKLAEGNYLYLSPQLVEINMRSIVRGTTSKVNCALVSPTQLNCTSSAGSRFSLTRRNAGLE Гис-таг HHHHHH

Пример 4

Получение штамма-продуцента белка OMP25d-OMP19-OMP10His

Штамм-продуцент иммуногенного полипептида OMP25d-OMP19-OMP10His конструируют на основе протеазо-дефицитного штамма E. coli BL21(DE3) [F− ompThsdSB (rB− mB−) galdcm (DE3)], несущего ген Т7 RNA полимеразы под контролем lacUV5 промотора (Novagen, США). Штамм получают в результате следующих манипуляций:

амплификации генов OMP25d, ОМР19, ОМР10 методом ПЦР,

создание слитой конструкции с помощью метода СОЭ-ПЦР,

клонирования ПЦР-фрагмента в вектор pET32b(+),

трансформации клеток реципиентного штамма.

В качестве матрицы в ПЦР используют ДНК штамма B. abortus 544.

Клетки E. coli трансформируют рекомбинантной плазмидой pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His и отбирают клоны с фенотипом ApR на селективной среде с ампициллином (100 мкг/мл). Штамм получил название E. coli BL21(DE3) /pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His депонирован в ГКПМ-Оболенск с инв. № B-10100, свидетельства №444 от 5.09.2022.

Пример 5.

Выделение и очистка белка OMP25d-OMP19-OMP10His.

Культуру E. coli выращивают при температуре 37°C в жидкой или на агаризованной среде Luria-Bertani (LB) c 100 мкг/мл ампициллина. Для выделения белка OMP25d-OMP19-OMP10His клетки E. coli BL21(DE3)/pET32bsdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His выращивают при температуре 37 °C в жидкой среде LB с антибиотиком и 1 мМ ИПТГ в лабораторном ферментере New Brunsuik Scientific с рабочим объемом 2 л в течение 4 ч. Клеточную суспензию центрифугируют 2800 g 15 мин, клетки ресуспендируют в буфере нанесения (50 мМ Трис-НСl, рН=8,0, 500 мМ NaCl, 6M мочевина, 10 мМ имидазол), вносят ФМСФ до 1 мМ, обрабатывали ДНКазой I (10000 ед./мл), лизоцимом (20 мг/мл) и озвучивают на дезинтеграторе UDM-10 («Techpan», Польша) при 44 кГц, 1,8 кВт, 10 раз по 30 с, при температуре 0 °С. Лизат клеток центрифугируют 37000 g 15мин. Наличие белка в лизате культуры клеток подтверждали ДСН - электрофорезом в 12% ПААГ, а присутствие полигистидинового тага – в иммуноблоте. Супернатант после центрифугирования лизата клеток наносят на колонку с 5 мл иминодиуксусной сефарозы (Iminodiacetic acid Sepharose, Sigma-Aldridge, Германия), предварительно насыщенной ионами никеля и уравновешенной буфером нанесения. Колонку промывают 10 объемами буфера нанесения, 3 объемами буфера с 30 мМ имидазола (50 мМ Трис-НСl, рН=8,0, 500 мМ NaCl, 8 M мочевина, 30 мМ имидазол), затем элюируют белок элюирующим буфером (50 мМ Трис-НСl, рН=8,0, 250 мМ имидазол, 8 M мочевина, 500мМ NaCl). Белки диализуют против фосфатного буфера (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na2HPO4, 1,4 мМ KH2PO4, рН=7,4) с добавлением ФМСФ до 1мМ в течение 16 часов при комнатной температуре. Препарат белка хранят в аликвотах при температуре -70 °С. Электрофоретический анализ экспрессии белка OMP25d-OMP19-OMP10His представлен на фиг. 4.

Пример 6.

Валидация препарата рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His для применения при разработке вакцин.

Измерение концентрации белка в полученном препарате проводят по методу Брэдфорд с использованием набора QuickStart™ Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США). Выход рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10Hisсоставляет 0,2 г с литра бактериальной культуры. Чистоту полученного белкового препарата анализируют электрофорезом в 10% денатурирующем ПААГ. После прохождения электрофореза гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Typhoon FLA9500 (GE Healthcare, США). Чистота полученного препарата OMP25d-OMP19-OMP10His по данным денситометрии составляет 98%. Гомогенность препарата белка OMP25d-OMP19-OMP10His тестируют при помощи хроматографии высокого давления HPLC-SEC. HPLC-SEC проводят с использованием колонки Waters Bio Suite High Resolution. 100 мкг белка наносят на колонку в буфере, содержащем 100 мМ фосфата натрия, рН 6.5. Единственный пик на хроматограмме свидетельствует о гомогенности препарата белка OMP25d-OMP19-OMP10His и отсутствии контаминаций. Содержание эндотоксина в конечном препарате белка OMP25d-OMP19-OMP10His определяют при помощи ЛАЛ-теста (Charles River Endosafe, США), оно составляет менее 5 IU/мг.

Таким образом, проведены генетические манипуляции с генами бруцеллезных белков для создания слитого целевого белка OMP25d-OMP19-OMP10His, включающего аминокислотные последовательности трех белков, разделенные линкерами. Сконструирована генетическая конструкция, которая обеспечивает экспрессию белка OMP25d-OMP19-OMP10His в экспрессионной системе E. coli. Создан продуцент белка OMP25d-OMP19-OMP10His, пригодный для получения препаративных количеств антигена для использования в составе субъединичной бруцеллезной вакцины. С помощью методов обратной вакцинологии составлен прогноз высокой иммуногенности слитого белка при применении in vivo.

Проверка предложенного способа на соответствие его критерию "изобретательский уровень" показала, что ни в научной, ни в патентной литературе не выявлено совокупности признаков, указанной в отличительной части формулы изобретения.

Похожие патенты RU2825400C1

название год авторы номер документа
Способ получения рекомбинантного бруцеллезного белка rLptD 2023
  • Дятлова Варвара Ивановна
RU2815099C1
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА 2003
  • Ставицкий Сергей Бронеславович
  • Носков Анатолий Николаевич
  • Кравченко Татьяна Борисовна
RU2285538C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА Е. coli BL21 Star™(DE3) pET302/NT-His tcpA - ПРОДУЦЕНТА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Тср А ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА БИОВАРА ЭЛЬ ТОР 2018
  • Тучков Игорь Витальевич
  • Хопрова Елена Владимировна
RU2707129C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК L-HEP, ШТАММ ESCHERICHIA COLI ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА 2019
  • Мягких Игорь Валентинович
  • Степаненко Василий Николаевич
  • Макаров Дмитрий Александрович
  • Соколова Ирина Владимировна
  • Воробьева Татьяна Владимировна
  • Левандовская Кристина Георгиевна
  • Свешникова Елена Васильевна
  • Зинченко Алексей Алексеевич
  • Павленко Даниил Михайлович
  • Нокель Елена Адамовна
  • Мелихова Татьяна Дмитриевна
  • Долгих Дмитрий Александрович
  • Гаспарян Марине Эдуардовна
  • Мирошников Анатолий Иванович
  • Королев Иван Романович
  • Калинин Данил Сергеевич
  • Пучков Илья Александрович
  • Новожилов Николай Михайлович
  • Кирпичников Михаил Петрович
RU2716975C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI KRX pET32b/ASFV/p30-ПРОДУЦЕНТ ХИМЕРНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА p30 ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ 2017
  • Середа Алексей Дмитриевич
  • Иматдинов Ильназ Рамисович
  • Казакова Анна Сергеевна
  • Иматдинов Алмаз Рамисович
  • Дубровская Ольга Александровна
RU2647573C1
ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР PET32B(+)ASFV/P30E2 ДЛЯ СИНТЕЗА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ ФРАГМЕНТА P30 ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ, ТИОРЕДОКСИНА И ПОЛИГИСТИДИНОВЫХ УЧАСТКОВ 2015
  • Середа Алексей Дмитриевич
  • Иматдинов Ильназ Рамисович
  • Казакова Анна Сергеевна
  • Иматдинов Алмаз Рамисович
  • Дубровская Ольга Александровна
RU2603056C2
Штамм E. coli - продуцент изолированного домена 1 протективного антигена Bacillus anthracis в форме вирусоподобных частиц 2016
  • Шибаева Анна Валерьевна
  • Летаров Андрей Викторович
  • Куликов Евгений Евгеньевич
  • Голомидова Алла Константиновна
  • Позднякова Наталья Владимировна
  • Кузнецова Татьяна Владимировна
  • Смирнова Мария Сергеевна
  • Лебедева Анна Александровна
  • Бирюкова Юлия Константиновна
RU2633508C1
Температурочувствительный мутантный интеин для нерастворимой экспрессии предшественника целевого белка 2015
  • Козлов Дмитрий Георгиевич
  • Санникова Евгения Павловна
  • Чеперегин Сергей Эдуардович
RU2619217C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PNDCTR1, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД GST-NDCTR1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PNDCTR1 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА GST-NDCTR1 И ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД GST-NDCTR1, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ ХЕЛАТИРОВАТЬ ИОНЫ МЕДИ, СЕРЕБРА И ПЛАТИНЫ 2015
  • Пучкова Людмила Валентиновна
  • Санькова Татьяна Петровна
  • Орлов Юрий Александрович
RU2603092C1
ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛНОРАЗМЕРНЫЙ АНТАГОНИСТ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-36 ЧЕЛОВЕКА, ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛНОРАЗМЕРНЫЙ АНТАГОНИСТ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-36 ЧЕЛОВЕКА С С-КОНЦЕВЫМ ПОЛИГИСТИДИНОВЫМ ТАГОМ, ПЛАЗМИДНЫЙ ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР (ВАРИАНТЫ), ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 STAR[DE3] (РЕТ-IL36RAF), - ПРОДУЦЕНТ ПОЛНОРАЗМЕРНОГО РЕЦЕПТОРНОГО АНТАГОНИСТА ИНТЕРЛЕЙКИНА-36 И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 STAR[DE3] (PET-IL36RAF-HIS), - ПРОДУЦЕНТ ПОЛНОРАЗМЕРНОГО РЕЦЕПТОРНОГО АНТАГОНИСТА ИНТЕРЛЕЙКИНА-36 С С-КОНЦЕВЫМ ПОЛИГИСТИДИНОВЫМ ТАГОМ 2014
  • Кондратьева Екатерина Владимировна
  • Нимирицкий Петр Петрович
  • Петров Александр Владимирович
  • Симбирцев Андрей Семенович
RU2582569C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 825 400 C1

Реферат патента 2024 года Способ получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His

Изобретение относится к биотехнологии и фармакологии, а именно к способу получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His, пригодного для использования при разработке и производстве вакцин. Предложенный способ включает: конструирование гена белка OMP25d-OMP19-OMP10His, содержащего гены трех бруцеллезных белков, разделенных двумя линкерами; создание рекомбинантной плазмиды pET32b sdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, 6871 п.н., несущей последовательность, кодирующую химерный белок OMP25d-OMP19-OMP10His, 1524 п.н., слитую с синтетической последовательностью, кодирующей шесть гистидинов; трансформацию клеток E. coli BL21(DE3) указанной рекомбинантной плазмидой с получением штамма E. coli BL21(DE3) / pET32b sdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His; культивирование этого штамма в среде с антибиотиком под контролем ИПТГ при 37°С в течение 4 ч; получение фракции телец включения обработкой клеток ультразвуком с последующим центрифугированием; очистку металл-хелатной хроматографией в денатурирующих условиях. Изобретение обеспечивает продукцию гомогенного рекомбинантного белка с чистотой 98%, содержанием бактериального эндотоксина не более 5 IU/мг и выходом 0,2 г с литра бактериальной культуры. 4 ил., 2 табл., 6 пр.

Формула изобретения RU 2 825 400 C1

Способ получения рекомбинантного белка OMP25d-OMP19-OMP10His, включающий конструирование гена белка OMP25d-OMP19-OMP10His, содержащего гены трех бруцеллезных белков, разделенных двумя линкерами; создание рекомбинантной плазмиды pET32b sdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His, 6871 п.н., несущей последовательность, кодирующую химерный белок OMP25d-OMP19-OMP10His, 1524 п.н., слитую с синтетической последовательностью, кодирующей шесть гистидинов; трансформацию клеток E. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pET32b sdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His с получением штамма E. coli BL21(DE3) / pET32b sdWP_002965367.1-sdWP_002964998.1-sdWP_002966502.1-His; культивирование штамма, полученного на предыдущей стадии, в среде с антибиотиком под контролем изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) при температуре 37°С в течение 4 ч; получение фракции телец включения бактерий-продуцентов обработкой клеток ультразвуком с последующим центрифугированием; очистку белка OMP25d-OMP19-OMP10His металл-хелатной хроматографией в денатурирующих условиях.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2825400C1

Donghao Shi et al
Способ изготовления электрических сопротивлений посредством осаждения слоя проводника на поверхности изолятора 1921
  • Андреев Н.Н.
  • Ландсберг Г.С.
SU19A1
Транспортер для перевозки товарных вагонов по трамвайным путям 1919
  • Калашников Н.А.
SU102A1
Походная разборная печь для варки пищи и печения хлеба 1920
  • Богач Б.И.
SU11A1
Устройство для перевода путевых стрелок на электрических железных дорогах 1932
  • Ковалев А.И.
  • Ковалев Н.И.
SU33182A1
Soheil Yousefi et al
Cloning, expression and molecular analysis of Iranian Brucella melitensis Omp25 gene for designing a subunit vaccine / Research in Pharmaceutical

RU 2 825 400 C1

Авторы

Дятлова Варвара Ивановна

Даты

2024-08-26Публикация

2024-01-09Подача