ВАКЦИНА ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1998 года по МПК A61K39/10 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к препаратам, применяемым для специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота.

Эффективность борьбы с бруцеллезом крупного рогатого скота во многом определяется средствами специфической профилактики данной болезни.

В настоящее время для специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота применяют в основном живую противобруцеллезную вакцину из штамма B. abortus 82, содержащую антиген (живые микробные клетки) и сахарозо-желатиновый стабилизатор.

К недостаткам вакцины из штамма B.abortus 82 относятся нестабильность, обусловленная нестабильностью свойств вакцинного штамма, абортогенность, исключающая возможность иммунизации стельных животных, и низкая иммуногенность [1].

Для приготовления вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота был предложен штамм B.abortus 75/79A, отличающийся от штамма 82 меньшей агглютиногенностью и отсутствием абортогенности [2]. Однако при дальнейшем изучении свойств данного штамма было установлено, что по ряду причин, в частности недостаточно высокой иммуногенности для крупного рогатого скота [1], сложности культивирования и относительно невысокой стабильности культуральных свойств, он не может быть рекомендован для изготовления противобруцеллезной вакцины.

Целью изобретения является получение слабоагглютиногенной, неабортогенной, высокоиммуногенной живой вакцины из штамма бруцелл, обладающего стабильными свойствами.

Цель достигается тем, что вакцина в качестве антигена содержит бактериальную массу штамма B.abortus 75/79AB при следующем содержании компонентов, мас./об.%:
Бактериальная масса из штамма B.abortus - 10-40 г (125•10¹¹ - 500•10¹¹ микр.клеток)
Сахароза - 6,0 - 9,0 г
Желатин пищевой - 0,9 - 0,135 г
Дистиллированная вода - Остальное до 100 см³
Штамм B.abortus 75/79 AB, используемый для изготовления вакцины, получен из культуры штамма B.abortus 75/79A посредством пятикратного пассажа через организм крупного рогатого скота с последующей целенаправленной селекцией по культуральным, морфологическим, антигенным и иммуногенным свойствам.

Штамм B.abortus 75/79 AB депонирован в ВГНКИ за номером 75/79 AB-ДЕП.

Штамм характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки. Короткие грамотрицательные палочки с закругленными концами, расположенные поодиночке или парами, без спор и капсул. Размер 1,2 - 1,3 мкм, ширина 0,5 - 0,6 мкм.

Культурные свойства. Культура штамма хорошо растет на плотных и жидких питательных средах: мясо-пептонном печеночном глюкозоглицериновом агаре (МППГГА), МППГГА с добавлением перевара Хоттингера, МППГТБ в аэробных условиях (не требует для культивирования повышенного процентного содержания CO₂).

На МППГГА (4-5 сутки инкубирования при 37-38^oC) растет в виде круглых, выпуклых, шероховатых, с нечетко контурированным краем, прозрачных с голубовато-зеленоватым оттенком колоний диаметром 2,5 - 3,0 мм. При окрашивании раствором кристаллического фиолетового 1/2000 (по Уайт-Вилсону) 100% колоний окрашивается как RS-форма: по фиолетовому фону желтая исчерченность в виде 8-10 трещин слоя краски, расположенных в центре колонии. Культура дает положительную пробу с акрифлавином и положительную реакцию термоагглютинации.

Культура штамма растет на МППГГА, содержащем фуксин, тионин в концентрации 1:50000, натриевую соль бензилпенициллина в концентрации 5 ЕД/см³, эритритол - 1 мг/см³, и не растет на среде, содержащей 5 мкг/см³ стрептомицина сульфат. Продуцирует H₂S(8-10 мм). Лизируется фагом Тб.

Агглютинабельные свойства. Культура штамма агглютинируется S- и R-антибруцеллезными сыворотками, А-моноспецифической сывороткой в титре 1:10 и не агглютинируется М-моноспецифической сывороткой.

Антигенные свойства. При введении культуры штамма крупному рогатому скоту (50-200 млрд.клеток) у животных вырабатываются специфические S- и R-бруцеллезные антитела, выявляемые S и R-бруцеллезными антигенами в серологических реакциях, принятых для диагностики бруцеллеза (РА, РСК, РДСК).

Безвредность. Штамм 75/79 АВ безвреден для лабораторных животных и крупного рогатого скота. При введении мышам 250 млн и морским свинкам 2 млрд микробных клеток не вызывает патологоанатомических изменений, характерных для бруцеллезной инфекции. При подкожном введении крупному рогатому скоту до 200 млрд микробных клеток не вызывает аборты и бруцеллезную инфекцию.

Бруцеллы штамма 75/79 АВ не мигрируют от вакцинированных животных к интактным.

Пример 1. Штамм B.abortus 75/79 АВ культивируют на плотной питательной среде или в ферментере на жидкой питательной среде. К 10-40 г бактериальной массы добавляют 90-60 см³ (до 100 см³) сахарозо-желатинового стабилизатора, содержащего 10.0% сахарозы в дистиллированной воде и 1,5% желатина, устанавливают концентрацию бакмассы, равную 125•10¹¹ - 500•10¹¹ микробных клеток. Готовую вакцину расфасовывают в ампулы (или флаконы) и консервируют, лиофильно высушивая.

Готовая вакцина представляет собой сухую пористую массу светло-коричневого или светло-желтого цвета, укупоренную в ампулу под вакуумом или во флаконы под азотом, хорошо растворяющуюся в физиологическом растворе.

Полученная вакцина имеет следующий компонентный состав (табл.1).

Пример 2. Полученную вакцину серий 1-3 испытывают на антигенную активность в сравнении с экспериментальной вакциной штамма B.abortus 75/79 АВ (прототип) и коммерческой вакциной из штамма B.abortus 82 (аналог). Противобруцеллезные вакцины вводят телкам в возрасте 4-5 месяцев под кожу в область задней трети шеи. Вакцину из штамма B.abortus 75/79 AB в дозах 50, 100 и 200 млрд микробных клеток, из штамма 82 и 75/79 A в дозе 100 млрд микробных клеток в объеме 5 см³. Каждым препаратом прививают 10-12 животных. Спустя 30,60,90,180,270 и 350 дней после иммунизации у животных берут кровь и исследуют серологическими методами (РБП, РА, РСК с S-бруцеллезными антигенами).

Результаты испытаний антигенных свойств вакцин приведены в табл.2.

Из табл. 2 видно, что вакцина из штамма 75/79 AB имеет преимущества перед экспериментальной из штамма 75/79A и вакциной из штамма 82. Спустя три месяца после иммунизации живой вакциной из штамма 75/79 AB можно проводить исследования на бруцеллез в принятых диагностических реакциях и выявлять заразившихся бруцеллезом животных. Телки, иммунизированные вакциной штамма 75/79 A (прототип) и вакциной из штамма 82 (аналог), дольше содержали в крови антитела, улавливаемые S-бруцеллезными антигенами, что затрудняет дифференциацию иммунных животных от заразившихся и оздоровление поголовья.

Пример 3. Вакцину из штамма 75/79 AB серий 1-3 испытывали на иммуногенную активность в сравнении с вакцинами из штаммов 75/79 A и 82.

Телок в возрасте 4-6 мес иммунизируют испытуемой вакциной в дозах 50, 100, 200 млрд микробных клеток. Вакцинами из штамма 75/79 A и из штамма 82 в дозе 100 млрд микробных клеток. Вакцины вводят в объеме 5 см³ под кожу в область задней трети шеи. Каждым препаратом иммунизируют 7-10 телок. Через 10 мес после вакцинации животных заражают стандартной культурой контрольного вирулентного штамма Б. абортус 54М/ВГНКИ в дозе 15 млн микробных клеток. Культуру вирулентного штамма наносят на конъюнктиву обоих глаз по 7,5 млн микробных клеток в объеме 0.1 см³. Спустя 42-45 дней после заражения животных убивают и проводят бактериологическое исследование лимфатических узлов и внутренних органов (30-35 объектов). Критерием оценки заражения животных служит наличие бруцелл вирулентного штамма в лимфатических узлах и внутренних органах вакцинированных животных. Результаты испытания приведены в табл.3.

Из табл. 3 видно, что предложенная вакцина, содержащая антиген из штамма Б. абортус 75/79 AB, обеспечивает защиту 90-100% иммунизированных животных и по этому показателю значительно превосходит вакцинный штамм Б.абортус 75/79 A и вакцину из штамма 82.

Пример 4. Испытания абортогенности (безвредности для стельных животных) проводят на 195 коровах и 64 нетелях со стельностью от 2-х до 6 мес. Испытуемую вакцину из штамма Б абортус 75/79 AB вводят в дозе 100 млрд микробных клеток в объеме 5 см³ под кожу в область задней трети шеи. За вакцинированными животными наблюдают в течение 7 мес. В результате испытания установлено, что у всех животных отелы прошли нормально. Испытуемая вакцина не вызывает аборты у стельных коров и может быть использована для иммунизации коров независимо от срока стельности.

Использование предложенной вакцины в ветеринарной практике позволит повысить эффективность специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота и расширить ассортимент высокоэффективных биопрепаратов против данного заболевания.

Литература:
1. Апробация вакцины из штамма 75/79A Br.abortus на крупном рогатом скоте. Никифоров И.П. и др./Ветеринария, 1995, N 8, c.20-22.

2. Авторское свидетельство SU 1701743 Al.Штамм бактерий Brucella abortus, используемый для приготовления вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота.

Вакцина предназначена для специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота. В качестве антигена вакцина содержит бактериальную массу нового вакцинного штамма Brucella abortus 75/79АВ - ДЕП ВГНКИ. В состав вакцины входит также желатиновый стабилизатор. Использование новой вакцины в ветеринарной практике расширяет ассортимент средств специфической профилактики бруцеллеза и позволяет в 1,5-2 раза повысить эффективность противобруцеллезных мероприятий. 3 табл.

Вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота, содержащая антиген бруцелл и водный сахарозо-желатиновый стабилизатор, отличающаяся тем, что она в качестве антигена содержит бактериальную массу штамма Brucella abortus 75/79 AB - ДЕП ВГНКИ при следующем содержании компонентов:
Сахороза, г - 6,0 - 9,0
Желатин пищевой, г - 0,9 - 1,35
Бактериальная масса штамма Brucella abortus 75/79 AB - ДЕП ВГНКИ г (микр.клетки) - 10 - 40 (125•10¹¹ - 500•10¹¹ м.к.)
Вода дистиллированная, см³ - До 1005