Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs6443265 (T>C) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и может быть использовано для генотипирования человека по аллелям rs6443265-T и rs6443265-C гена OGG1, кодирующего фермент репарации окислительных повреждений ДНК 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазу [Horpaopan S, Spier I, Zink AM, Altmüller J, Holzapfel S, Laner A, Vogt S, Uhlhaas S, Heilmann S, Stienen D, Pasternack SM, Keppler K, Adam R, Kayser K, Moebus S, Draaken M, Degenhardt F, Engels H, Hofmann A, Nöthen MM, Steinke V, Perez-Bouza A, Herms S, Holinski-Feder E, Fröhlich H, Thiele H, Hoffmann P, Aretz S. Genome-wide CNV analysis in 221 unrelated patients and targeted high-throughput sequencing reveal novel causative candidate genes for colorectal adenomatous polyposis. Int J Cancer. 2015 Mar 15;136(6):E578-89. doi: 10.1002/ijc.29215]. Согласно данным ресурса GTEx Portal, депонирующего результаты полного транскриптомного анализа, однонуклеотидный вариант rs6443265 (T>C), расположенный в интроне гена OGG1, оказывает статистически значимое регуляторное влияние на экспрессию генов OGG1, TADA3, JAGN1 [https://gtexportal.org/home/snp/rs6443265], связанных с развитием врожденной нейтропении [Thomas S, Guenther G, Rowe JH, Platt CD, Shimamura A, Levy O, Ganapathi L. Severe congenital neutropenia due to jagunal homolog 1 (JAGN1) mutation: a case report and literature review. Front Pediatr. 2023 Jul 17;11:1223191. doi: 10.3389/fped.2023.1223191] и различных типов рака [Inokuchi S, Itoh S, Yoshizumi T, Yugawa K, Yoshiya S, Toshima T, Takeishi K, Iguchi T, Sanefuji K, Harada N, Sugimachi K, Ikegami T, Kohashi K, Taguchi K, Yonemasu H, Fukuzawa K, Oda Y, Mori M. Mitochondrial expression of the DNA repair enzyme OGG1 improves the prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreatology. 2020 Sep;20(6):1175-1182. doi: 10.1016/j.pan.2020.07.011; Elahi A, Zheng Z, Park J, Eyring K, McCaffrey T, Lazarus P. The human OGG1 DNA repair enzyme and its association with orolaryngeal cancer risk. Carcinogenesis. 2002 Jul;23(7):1229-34. doi: 10.1093/carcin/23.7.1229].

Однако на сегодняшний день нет простого, быстрого и недорогого метода генотипирования человека по полиморфному локусу rs6443265 (T>C).

Методом, позволяющим осуществить определение нуклеотидной последовательности в локусе rs6443265 является секвенирование по Сэнгеру - метод, применяемый для детекции любых изменений нуклеотидной последовательности, разработанный Ф. Сэнгером в 1977 году и широко использующийся для изучения нуклеотидной последовательности ДНК человека [Sanger F. "Determination of nucleotide sequences in DNA". Biosci Rep. - 2004. - V. 24(4-5). - P.237-253]. Недостатками данного метода являются его трудоемкость, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, значительно более долгое получение результатов и повышенные риски контаминации лаборатории продуктами полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и реакций секвенирования.

Генотипирование rs6443265 гена OGG1 возможно методом секвенирования следующего поколения [Horpaopan S, Spier I, Zink AM, Altmüller J, Holzapfel S, Laner A, Vogt S, Uhlhaas S, Heilmann S, Stienen D, Pasternack SM, Keppler K, Adam R, Kayser K, Moebus S, Draaken M, Degenhardt F, Engels H, Hofmann A, Nöthen MM, Steinke V, Perez-Bouza A, Herms S, Holinski-Feder E, Fröhlich H, Thiele H, Hoffmann P, Aretz S. Genome-wide CNV analysis in 221 unrelated patients and targeted high-throughput sequencing reveal novel causative candidate genes for colorectal adenomatous polyposis. Int J Cancer. 2015 Mar 15;136(6):E578-89. doi: 10.1002/ijc.29215. Epub 2014 Sep 30. PMID: 25219767], для которого необходимы секвенатор Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM, ThermoFisher Scientific) и специальная панель целевых праймеров AmpliSeq, разработанных с использованием программного обеспечения AmpliSeq версии 4.0 (ThermoFisher Scientific). Качество библиотеки оценивалось с помощью электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), а библиотеки, прошедшие этот этап, подвергались эмульсионной ПЦР, выполняемой с помощью системы OneTouch2 (ThermoFisher Scientific). Библиотеки загружали на Ion 318chipv2, а затем секвенировали на Ion PGM (ThermoFisher Scientific). Анализ данных, включая сопоставление с референсным геномом и определение вариантов, проводился с использованием программного обеспечения Torrent Suite v.5.0 (ThermoFisher Scientific). Недостатком метода является его высокая трудоемкость, длительность анализа и необходимость приобретения дорогостоящего секвенатора.

Генотипирование ДНК-полиморфизмов, включая rs293795 гена OGG1, возможно осуществить методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537]. Недостатком метода является длительность анализа - не менее 8 часов, необходимость приобретения дорогостоящего геномного масс-спектрометра и набора чипов и реагентов.

Прототипом является метод анализа ДНК путем проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени в присутствии меченых флуорофорами, аллель-специфичных (TaqMan) зондов и праймеров по патенту на изобретение США №5538848 (Kenneth J. Livak, Susan J., A. Flood, Jeffrey Marmaro, Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe, 23.07.1996). Недостатком прототипа является то, что для использования описанного в прототипе метода на практике, с целью исследования различных полиморфизмов, требуется разработка TaqMan зондов и праймеров для каждого отдельного исследуемого полиморфизма.

Технический результат заключается в разработке простого, быстрого и экономически выгодного способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs6443265 (T>C) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Технический результат достигается тем, что cпособ генотипирования однонуклеотидного варианта rs6443265 (T>C) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени состоит в том, что используются: прямой праймер OGG1-F 5'-AGAGACTTGTTCGGGTTGCT-3', обратный праймер OGG1-R 5'-GGGAATCCATCACAGTGCCT-3', OGG1-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-FAM-ATGTCACCTATACCCTT-RTQ1-3′, OGG1-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-ROX-ATGTCACCTATACCCTC-BHQ-3′, при этом для гомозиготных по аллелю T образцов ДНК с генотипом rs6443265-T/T детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs6443265-C/C детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs6443265-T/C наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена OGG1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Изобретение поясняется двумя фигурами. На фигуре 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена OGG1 длиной 154 пары нуклеотидов, кодирующие аллели rs6443265-T и rs6443265-C гена OGG1. Жирным шрифтом и подчеркиванием отмечены последовательности праймеров, жирным шрифтом и курсивом - последовательности зондов.

На фигуре 2 представлен пример детекции генотипов по локусу rs6443265 гена OGG1 при генотипировании методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени: генотипы rs6443265-T/T показаны оранжевым цветом, генотипы rs6443265-T/C показаны зеленым цветом, генотипы rs6443265-C/C показаны синим цветом.

Способ осуществляют следующим образом.

Для генотипирования однонуклеотидного варианта rs6443265 (T>C) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени использовали два общих для аллельных вариантов праймера, фланкирующих участок гена OGG1 длиной 154 пары нуклеотидов: прямой праймер OGG1-F 5'-AGAGACTTGTTCGGGTTGCT-3', обратный праймер OGG1-R 5'-GGGAATCCATCACAGTGCCT-3', OGG1-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-FAM-ATGTCACCTATACCCTT-RTQ1-3′, OGG1-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-ROX-ATGTCACCTATACCCTC-BHQ-3′, подобранные на основе нуклеотидной последовательности гена OGG1 (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Sequence?db=core;r=3:9782467-9783467;v=rs6443265;vdb=variation;vf=183472263), включающей в положении chr3:9782967 (GRCh38.p14) однонуклеотидный вариант rs6443265 (T>C). Для подбора праймеров использовали программу Primer3web version 4.1.0 (https://primer3.ut.ee/). Праймеры и зонды были синтезированы компанией «Синтол» (г. Москва). Праймеры OGG1-F и OGG1-R инициируют амплификацию участка гена OGG1, включающего локус rs6443265, длиной 154 пары нуклеотидов. Реакцию амплификации проводили в 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=54°С. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и ROX. Идентификация аллелей rs6443265-T и rs6443265-C гена OGG1 проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей FAM и ROX, соответственно. Для определения генотипа человека используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и ROX. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1, которое представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (фиг. 2). Для гомозиготных по аллелю T образцов ДНК с генотипом rs6443265-T/T детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs6443265-C/C детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs6443265-T/C наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена OGG1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК человека из коллекции биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. По результатам генотипирования 42,1% людей являлись гомозиготами по аллелю T (генотип rs6443265-T/T), 10,5% людей - гомозиготами по аллелю C (rs6443265-C/C), 47,4% - гетерозиготами (генотип rs6443265-T/C). Валидацию способа проводили с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537] на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали, однако патентуемый способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs6443265 (T>C) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени позволяет значительно (до 1 часа) сократить время проведения анализа по сравнению с методом генотипирования на основе MALDI-TOF (8 часов).

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Образец ДНК DM99 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs6443265 (T>C) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=54°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs6443265-C, что соответствует генотипу rs6443265-C/C OGG1.

Пример 2. Образец ДНК DM105 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs6443265 (T>C) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=54°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM и ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце и аллеля rs6443265-T, и аллеля rs6443265-C, что соответствует гетерозиготному генотипу rs6443265-T/C OGG1.

Пример 3. Образец ДНК DM106 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs6443265 (T>C) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=54°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs6443265-T, что соответствует генотипу rs6443265-T/T OGG1.

Результаты генотипирования трех образцов ДНК DM99, DM105, DM106 по однонуклеотидному варианту rs6443265 (T>C) гена OGG1 с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience) полностью совпали с результатами генотипирования методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Таким образом, разработан простой, быстрый и экономически выгодный способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs6443265 (T>C) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, который позволяет до 1 часа сократить время проведения анализа и дает возможность провести генотипирование по указанному полиморфному варианту в лаборатории, укомплектованной стандартным оборудованием - амплификатором для проведения ПЦР.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="60_rs6443265

OGG1.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-06-15">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode></IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-06-15</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1917</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Курский

государственный медицинский университет» Министерства

здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Азарова Юлия

Эдуардовна</InventorName>

<InventorNameLatin>Azarova Yulia Eduardovna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

однонуклеотидного варианта rs6443265 (C&gt;T) гена OGG1 человека

методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального

времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agagacttgttcgggttgct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gggaatccatcacagtgcct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtcacctataccctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtcacctataccctc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и позволяет упростить способ генотипирования человека по аллелям rs6443265-T и rs6443265-C гена OGG1, сократить время проведения анализа. Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs6443265 (Т>C) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени состоит в том, что используются: прямой праймер OGG1-F 5'-AGAGACTTGTTCGGGTTGCT-3', обратный праймер OGG1-R 5'-GGGAATCCATCACAGTGCCT-3', OGG1-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-FAM-ATGTCACCTATACCCTT-RTQ1-3′, OGG1-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-ROX-ATGTCACCTATACCCTC-BHQ-3′. 2 ил., 3 пр.

Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs6443265 (T>C) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что используются:

прямой праймер OGG1-F 5'-AGAGACTTGTTCGGGTTGCT-3',

обратный праймер OGG1-R 5'-GGGAATCCATCACAGTGCCT-3',

OGG1-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5′-FAM-ATGTCACCTATACCCTT-RTQ1-3′,

OGG1-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5′-ROX-ATGTCACCTATACCCTC-BHQ-3′,

при этом для гомозиготных по аллелю T образцов ДНК с генотипом rs6443265-T/T детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs6443265-C/C детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs6443265-T/C наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена OGG1 в анализируемом образце ДНК и соответственно генотип человека.