2-[6-МЕТИЛ-3-(ТИЕН-2-ИЛ)-5-ФЕНИЛ-5,6-ДИГИДРО-4Н-[1,2,4,5]ТЕТРАЗИН-1-ИЛ]-БЕНЗОТИАЗОЛ С ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ КОКСАКИ В3 Российский патент 2025 года по МПК C07D417/14 A61K31/428 A61P31/14 

Область техники

Изобретение относится к органической химии и направлено на создание препаратов для лечения энтеровирусных инфекций (ЭВИ) на основе органических соединений.

Уровень техники

Вирусы группы Коксаки - группа высококонтагиозных энтеровирусов, попадающих в организм человека через слизистую ротовой полости и далее по достижении кишечника активно размножающихся в нем. В тяжелой форме болезнь может поражать нервную систему, включая головной мозг, а также нарушать работу сердца, влиять на изменения в мышечной ткани этого органа и негативно сказываться на печени.

Ввиду отсутствия зарегистрированных этиотопных препаратов для терапии ЭВИ поиск противовирусных препаратов нового поколения с улучшенными характеристиками актуален.

Большая часть вирусных инфекций сопровождаются генерацией активных форм кислорода. Поэтому использование антиоксидантов для профилактики и лечения вирусных заболеваний активно изучается [В.В. Зарубаев, А.В. Слита, Н.А. Калинина, А.В. Гаршинина, А.А. Штро, Л.А. Карпинская. Протективная активность интерферона в комбинации с различными антиоксидантами в отношении экспериментальной летальной гриппозной инфекции // РМЖ, 2012, №28, 1416-1420], [R. Sgarbanti, D. Amatore, I. Celestino, M.E. Marcocci, A. Fraternale, M.R. Ciriolo, M. Magnani, R. Saladino, E. Garaci, A.T. Palamara L. Nencioni. Intracellular Redox State as Target for Anti-Influenza Therapy: Are Antioxidants Always Effective? // Curr. Top. Med. Chem. 2014, Vol. 14, №22, p. 2529-2541].

Комбинацией противовирусных (противогриппозных) и антиоксидантных свойств обладают, например, производные аминофенолов 1 [О. Shadyro, G. Ksendzova, G. Polozov, V. Sorokin, E. Boreko, O. Savinova, B. Dubovik, N. Bizunok. Synthesis and study of antiviral and anti-radical properties of aminophenol derivatives // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2008, Vol. 18, p. 2420-2423], 6-нитро-1,2,4-триазолоазины с полифенольными фрагментами 2 [E.N. Ulomskiy, A.V. Ivanova, E.B. Gorbunov, I.L. Esaulkova, A.V. Slita, E.O. Sinegubova, E.K. Voinkov, R.A. Drokin, I.I. Butorin, E.R. Gazizullina, E.L. Gerasimova, V.V. Zarubaev, V.L. Rusinov. Synthesis and biological evaluation of 6-nitro-l,2,4-triazoloazines containing polyphenol fragments possessing antioxidant and antiviral activity // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2020, Vol. 30, p. 127216], производные 2,6-диметил-N-((пиридин-4-ил)метил)имидазо[1,2-В]пиридазин-8-амина 3 [Вестман Я. Производные 2,6-диметил-((пиридин-4-ил)метил)имидазо[1,2-В]пиридазин-8-амина и 2,5-диметил-М-((пиридин-4-ил)метил)имидазо[1,5-А]пиримидин-7-амина для лечения вирусных инфекций, патент РФ №2798107 от 20.08.2019] и аминометансульфоновые кислоты 4 [R.E. Khoma, V.O. Gelmboldt, А.А. Ennan, T.L. Gridina, A.S. Fedchuk, V.P. Lozitsky, I.M. Rakipov, A.S. Vladyka. Synthesis and antioxidant and anti-influenza activity of aminomethanesulfonic acids // Pharm. Chem. J., 2019, Vol. 53, №5, p. 436].

Однако зарегистрированных препаратов, реализующих противовирусный потенциал в отношении вирусов рода Enterovirus посредством антиоксидантных свойств, в настоящий момент нет. Известно несколько групп малых молекул, активных в отношении энтеровирусов разных групп in vitro и in vivo: вещества, связывающиеся с вирусным капсидом (плеконарил и его производные, пиродавир, вапендавир, покапавир), ингибиторы вирусных протеаз (рупинтривир и его производные), ингибиторы полимеразного комплекса вирусов (рибавирин, 5-нитро-цитидин,флуоксетин, дибукаин). Однако среди тех групп соединений, которые успешно прошли доклинические исследования, ни для одного из препаратов не был показан хороший профиль эффективности и безопасности в выполненных клинических исследованиях. Кроме того, к соединениям, сходным по структуре и механизму действия, вирусы быстро вырабатывают перекрестную резистентность, что существенно ограничивает их применение.

Наиболее близкими к заявляемому соединению являются 2-[5-(арил)-6-R-3-фенил-5,6-дигидро-4N-[1,2,4,5]тетразин-1-ил]-бензотиазолы 5 [Федорченко Т.Г., Волобуева А.С., Тунгусов В.Н., Зарубаев В.В., Липунова Г.Н., Чупахин О.Н. 2-[5-(4-Метоксифенил)-3-фенил-5,6-дигидро-4N-[1,2,4,5]тетразин-1-ил]-бензотиазолы с противовирусной активностью в отношении вируса Коксаки В3. Патент РФ №2783659 от 24.01.2022], однако имеется постоянная потребность поиска соединений, обладающих более высокой активностью при низкой токсичности.

Раскрытие изобретения

Цель настоящего изобретения заключается в создании нового производного 2-(5,6-дигидро-4N-[1,2,4,5]тетразин-1-ил)бензотиазола, способного ингибировать репродукцию энтеровирусов.

Заявленное соединение 7 синтезировали алкилированием 5-(бензотиазол-2-ил)-1-арил-3-тиенилформазана 6, с последующей циклизацией продуктов алкилирования по описанной ранее методике [Т.Г. Федорченко, Г.Н. Липунова, А.В. Щепочкин, М.С. Валова, А.Н. Цмокалюк, П.А. Слепухин, О.Н. Чупахин. Синтез, спектральные, электрохимические и антиоксидантные свойства 2-[5-(арил)-6-R-3-фенил-5,6-дигидро-4Н-[1,2,4,5]тетразин-1-ил]-бензотиазолов // ЖОрХ, 2020, Т. 56, №1, 52-64]:

К суспензии 5-(бензотиазол-2-ил)-1-арил-3-тиенилформазана 6 (0.309 г, 0.8 ммоль) в 20 мл этанола добавляют 30% водный раствор гидроксида натрия (0.12 мл, 0.9 ммоль). К полученному темно-фиолетовому раствору добавляют этилйодид (8.0 ммоль), смесь кипятят 15 минут. Растворитель отгоняют под вакуумом. К реакционной массе добавляют 30 мл гептана, кипятят в течение часа. Гептан отгоняют под вакуумом. Продукт 7 выделяют из реакционной массы колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/хлороформ 2:1).

Температура плавления определена с помощью аппарата Stuart SMP3. Контроль за ходом реакций и чистотой полученных продуктов осуществлен методом ТСХ на пластинах Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ. Колоночная хроматография проведена с использованием силикагеля Kieselgel 60 (размер частиц 0.040-0.063 мм, 230-400 меш). Спектры ЯМР получали на спектрометре Bruker Avance III-500 МГц. ИК-спектры поглощения записывали с помощью приставки DRA на спектрофотометре Spectrum One (Perkin Elmer). Масс-спектры записаны на приборе Bruker Daltonics maXis impact HD, метод ионизации ESI. Элементный анализ проведен с помощью автоматического элементного анализатора CHNS РЕ 2400, серия II (Perkin Elmer Instruments).

Примеры реализации изобретения

Структурная идентификация продукта

Пример 1. 2-(6-Метил-3-(тиен-2-ил)-5-фенил-5,6-дигидро-4N-[1,2,4,5]тетразин-1-ил)-бензтиазол (7)

Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.: 1.54 д (3Н, Me, J 5.6 Гц); 6.39 кв (1Н, СН, J 5.6 Гц); 6.96 т (1Н_аром, J 7.2 Гц); 7.05 т (1Н_аром, J 7.2 Гц); 7.19-7.33 м (6Н_аром); 7.50 д (1Н_аром, J 8.0 Гц); 7.67-7.70 м (1Н_аром); 7.71-7.77 м (2Н_аром); 9.71 с (1Н, NH). Спектр ЯМР ¹³С, 16.30, 67.11, 117.76, 118.93, 121.30, 122.73, 123.93, 125.72, 126.59, 127.75, 128.76, 129.23, 130.68, 134.35, 140.80, 149.99, 152.20, 165.49. ИК спектр, v, см^-1: 3193, 1597, 1538, 1519, 1443, 1274, 1173, 1040, 750, 698. Масс-спектр: найдено, m/z: 392.0995 [М+Н]⁺. Вычислено [М+Н]⁺для C₂₂H₁₈N₅S₂, m/z.392.1004. Рассчитано для C₂₂H₁₇N₅S₂, %: С, 67.52; Н, 4.35; N, 17.91. Найдено, %: С, 67.49; Н, 4.33; N, 17.89.

Пример 2. Оценка цитотоксичности соединений

Токсичность соединения была изучена в отношении клеток Vero. Клетки сеяли в 96-луночные планшеты и культивировали при 37°С в среде MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере 5% СО₂ (в газопроточном инкубаторе Panasonic 170-AIC) до состояния монослоя. Из исследуемых соединений готовили маточный раствор концентрации 10 мг/мл в диметилсульфоксиде, после чего готовили серию трехкратных разведений препаратов в среде MEM от 1000 до 1 мкг/мл. Растворенный препарат вносили в лунки планшетов и инкубировали 1 сутки при 37°С. По истечении этого срока клетки промывали 2 раза по 5 минут фосфатно-солевым буфером и количество живых клеток оценивали при помощи микротетразолиевого теста (МТТ). С этой целью в лунки планшетов добавляли по 100 мкл раствора (5 мг/мл) 3-(4,5-диметилтиазолил-2) 2,5-дифенилтетразолия бромида (ICN Biochemicals Inc., Aurora, Ohio) на физиологическом растворе. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 2 часов. Супернатант удаляли, а осадок растворяли в 100 мкл на лунку ДМСО, после чего оптическую плотность в лунках планшетов измеряли на планшетном ридере Thermo Multiskan FC при длине волны 535 нм. По результатам теста для каждого продукта определяли 50% цитотоксическую дозу (СС₅₀), т.е. концентрацию препарата, вызывающую гибель 50% клеток в культуре с использованием программного обеспечения GraphPadPrism6.

Значение СС₅₀ для соединения 7 составило 250 мкг/мл, что свидетельствует о низкой токсичности полученного соединения, поскольку их следует отнести к 3-му из пяти существующих классу опасности (50% токсическая доза от 300 до 2000 мг/кг, или мкг/мл) [Классификация Европейской экономической комиссии ЕЭК ООН, https://unece.org/D AM/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev07/Russian/03r_Part3.pdf].

Пример 3. Оценка противовирусного действия

Противовирусную активность соединения изучали в культуре клеток Vero в отношении вируса Коксаки В3 (штамм Nancy). Клетки Vero рассевали на 96-луночные планшеты, как описано в Примере 2. После формирования монослоя в лунки добавляли изучаемое соединение в соответствующих концентрациях (от 100 мкг/мл до 1 мкг/мл), инкубировали 1 час и заражали клетки вирусом Коксаки В3 при множественности заражения 0,01 TCID₅₀ на клетку. Планшеты инкубировали 1 час, несвязавшийся вирус отмывали физиологическим раствором, добавляли свежие растворы соединений в тех же концентрациях и инкубировали планшеты при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 24 часов. После этого инфекционную активность вирусного потомства в каждой лунке планшета определяли при помощи титрования на клетках Vero методом предельных разведений (титрование по конечной точке). Для этого из вируссодержащей жидкости готовили серию десятикратных разведений, заражали ими клетки Vero, предварительно посеянные в 96-луночные планшеты и инкубировали 72 часа при 37°С в атмосфере 5% СО₂. По прошествии этого срока визуально отмечали наличие вирусспецифического цитопатогенного действия (ЦПД) в лунках планшетов. За титр вируса принимали максимальное разведение вируса, приводящее к появлению ЦПД в половине инфицированных лунок. Титр выражали в 50% цитотоксических дозах (TCID₅₀/0,2 мл). На основании полученных данных с использованием программного обеспечения GraphPadPrism6 для соединения 7 рассчитывали значение 50% ингибирующей концентрации (IC₅₀) - концентрации, снижающей титр вируса вдвое по сравнению с контролем, а также индекс селективности - отношение СС₅₀ к IC₅₀, показывающий, насколько избирательно соединение подавляет репродукцию вируса по сравнению с клеточным метаболизмом.

Полученные в результате экспериментов значения IC₅₀ для соединения 7 составили 1.1±0.3 мкг/мл. Таким образом, величина индекса селективности составила 227. Этот показатель намного превосходит пороговое значение SI = 10, на основании которого делается заключение о перспективности того или иного соединения как потенциального противовирусного средства [Smee D., J Virol Methods; 2017: 51-56], что убедительно доказывает высокие вирусингибирующие характеристики изученного соединения.

Результаты исследований представлены в таблице.

Заявляемое соединение (7) проявляют высокую активность в отношении коллекционного штамма вируса Коксаки В3 (Nancy).

Таким образом, заявляемый 2-[6метил-3-(тиен-2-ил)-5-фенил-5,6-дигидро-4Н-[1,2,4,5]тетразин-1-ил]-бензотиазол (7) обладает выраженной противовирусной активностью в отношении вируса Коксаки В3, а также низкой цитотоксичностью.

Изобретение относится к 2-[6-метил-3-(тиен-2-ил)-5-фенил-5,6-дигидро-4H-[1,2,4,5]тетразин-1-ил]-бензотиазолу формулы I, обладающему противовирусной активностью в отношении вируса Коксаки В3. Указанное соединение может найти применение для лечения энтеровирусных инфекций, вызванных вирусом Коксаки В3. 1 табл., 3 пр.

2-[6-Метил-3-(тиен-2-ил)-5-фенил-5,6-дигидро-4H-[1,2,4,5]тетразин-1-ил]-бензотиазол формулы I, обладающий противовирусной активностью в отношении вируса Коксаки В3

.