Способ гуманной эвтаназии лабораторных животных в эксперименте Российский патент 2025 года по МПК A61K31/541 A61K31/5513 A61K47/18 A61K47/20 A61P43/00 

Изобретение относится к ветеринарии, медицине и фармации, а также экспериментальной фармакологии с токсикологией, и касается проведения гуманной эвтаназии лабораторных животных в эксперименте. Использование изобретения позволяет обеспечить гуманный вывод из экспериментов лабораторных животных благодаря комплексному действию на основании гипнотического, диссоциативного, седативного, болеутоляющего и миорелаксирующего эффектов ксилазина, тилетамина, золазепама и бисдиметилсульфата бисдиметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты, а также снижению общего времени наступления глубокого наркоза и, как следствие, биологической смерти.

Согласно Правилам надлежащей лабораторной практики и положениям Хельсинской декларации исследования с использованием лабораторных животных представляют собой неотъемлемую часть биомедицинских исследований, результатом которых являются данные о фундаментальных процессах в живых организмах и свойствах новых фармацевтических субстанций (Guide for the care and use of laboratory animals. 8^th ed. – Washington : The National Academies Press, 2011.). Несмотря на стремление научного сообщества к переводу исследований в условиях in vivo на in vitro, в настоящее время остается значительным число используемых лабораторных животных: в 2019 году количество использующихся в экспериментах лабораторных животных в мире оценивалось в 192,1 млн. голов в год (European Commission. Summary Report on the statistics on the use of animals for scientific purposes in the Member States of the European Union and Norway in 2018. – Brussels; European Commission, 2021). При этом, в соответствие с правилами гуманного обращения с животными, в случаях, когда они испытывают стресс, страдания и серьезные сдвиги в гомеостазе, в обязательном порядке проводится процедура эвтаназии (AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. – Schaumburg, IL: AVMA, 2020). При этом общепринятыми требованиями к эвтаназии являются: отсутствие боли, страха и стресса, быстрая потеря сознания с последующей смертью, надежность и необратимость (Shearer J.K., Griffin D., Cotton S.E. Humane Euthanasia and Carcass Disposal. Vet. Clin. North. Am. Food. Anim. Pract. – 2018. – Vol. 34(2). – P. 355-374.). Совершенствование сочетаний и дозировок препаратов для эвтаназии с различными механизмами действия позволят снизить боль и стресс у лабораторных животных при их умерщвлении.

Внутримышечный путь введения является наиболее удобным при индукции эвтаназии животных в экспериментальных исследованиях. На сегодняшний день в Российской Федерации арсенал подобных препаратов, которые не подлежат особому учету и могут быть свободно применены для эвтаназии лабораторных животных, сильно ограничен.

Известен способ эвтаназии лабораторных грызунов при помощи внутримышечного введения препаратов ксилазина («Рометар», «Ксила», «Ксиланит») и фармацевтической композиции тилетамина с золазепамом (препараты «Золетил», «Телазол», «Везотил»). Данный способ позволяет снизить боль и стресс в процессе умерщвления животного, а также оказывает незначительное влияние на клинико-биохимические показатели сыворотки крови. Недостатком данного способа является необходимость введения ксилазина в качестве премедикации и тилетамина с золазепамом в виде двух отдельных инъекций, что создает дополнительный стресс животным и усложняет процедуру. Еще одним недостатком данного способа эвтаназии является относительно медленное действие препаратов: хирургическая стадия наркоза наступает спустя 6 минут после введения препаратов (Comparative Study of the Aftereffect of CO₂ Inhalation or Tiletamine-Zolazepam-Xylazine Anesthesia on Laboratory Outbred Rats and Mice / O.N. Khokhlova, N.A. Borozdina, E.S. Sadovnikova et al. // Biomedicines. – 2022. – Vol. 10(2). – Art. ID 512.). С учетом того, что инъекционные анестетики рекомендованы к применению для эвтаназии в дозах троекратно превышающих дозы для проведения общей анестезии (тилетамин/золазепам 20-40 мг/кг в/м + ксилазин 5-10 мг/кг в/м), для проведения эвтаназии при внутримышечном введении данную комбинацию целесообразно использовать в следующих дозах: тилетамин с золазепамом – 60-120 мг/кг, ксилазин – 15-30 мг/кг (Руководство по работе с лабораторными животными для сотрудников ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России, занятых проведением доклинических испытаний. – Москва: ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова, 2015. – 42 с.).

Известен способ эвтаназии животных при помощи бисдиметилсульфата бисдиметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты – ББЭЯК (препарат «Адилин-супер»). Данный препарат представляет собой курареподобный деполяризующий миорелаксант, использующийся для бескровной эвтаназии животных с целью предотвращения особо опасных инфекционных заболеваний (Методические рекомендации по применению препарата «Адилин-супер» для бескровного умерщвления животных / Р. М. Асланов, К. Х. Папуниди, Э. И. Семенов. – Казань, 2018. – 24 с.). Существенным недостатком данного способа эвтаназии является то, бисдиметилсульфат бисдиметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты парализует мышцы, в том числе и дыхательные, не угнетая при этом функцию ЦНС. Таким образом, у животных наблюдается обездвиживание с последующей острой дыхательной недостаточностью и стресс на фоне сохранеия сознания (Харкевич Д.А. Фармакология: Учебник. М.: ГЭОТАРМедиа, 2017. – 760 с.; Гуманна ли эвтаназия с применением препарата «Адилин-супер» и других миорелаксантов в монорежиме? / И.М. Донник и др. // Ветеринария. – 2019. – №. 12. – С. 3-7.). Согласно ряду документов и методических пособий, использование для эвтаназии миорелаксантов без предварительной анестезии является негуманным (ГОСТ 33215 – 2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур. – М.: Стандартинформ, 2016. – 13 с.; Couto M., Cates C. Laboratory Guidelines for Animal Care. Methods Mol. Biol. – 2019. – Vol. 1920. – P. 407-430.).

Остальные инъекционные средства, которые используются в мировой практике для эвтаназии животных (кетамин, барбитураты, эмбутрамид, комбинации на их основе и прочие), не доступны для отечественных ученых, поскольку или относятся к спискам особого учета или не представлены на фармацевтическом рынке.

Задачей является разработка способа гуманной эвтаназии лабораторных животных в эксперименте, обеспечивающего однократное введение раствора композиции препаратов, сочетающих болеутоляющее, анксиолитическое, седативное и миорелаксирующее действие и обеспечивающих быстрое наступление бессознательного состояния с последующим наступлением смерти.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является снижение времени от этапа введения раствора до наступление бессознательного состояния с последующим наступлением смерти.

Технический результат достигается тем, что осуществляют индукцию общей анестезии при помощи комбинации ксилазина и тилетамина с золазепамом, вводимых внутримышечно, причем используют водный раствор ксилазина, тилетамина, золазепама и бисдиметилсульфата бисдиметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты в равных частях и дозе 40 мг/кг по сумме действующих веществ, вводимый внутримышечно.

При таком подходе процедура эвтаназии осуществляется гуманным образом при предварительном отключении сознания животных, без мучений, стресса и боли, является надежной и необратимой (со стопроцентным показателем летальности) и легко воспроизводится путем однократной внутримышечной инъекции. При этом расход комбинированного препарата тилетамина с золазепамом, который является наиболее дорогим компонентом летальной смеси, минимален.

Способ осуществляют следующим образом.

В мерной колбе на 25 мл смешивают лиофилизированный порошок, содержащий по 250 мг тилетамина и золазепама, с 12,5 мл раствора ксилазина с концентрацией 20 мг/мл, далее в нее добавляют 250 мг субстанции бисдиметилсульфата бисдиметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты и доводят до метки водой для инъекций. Смесь тщательно перемешивают до полного растворения. В результате получают 25 мл раствора, содержащего по 250 мг ксилазина, тилетамина, золазепама и бисдиметилсульфата бисдиметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты. Полученный раствор вводят животным в дозе 1,0 мл/кг (40 мг/кг) однократно внутримышечно. Факт наступления хирургической стадии наркоза определяют по отсутствию педального, мигательного и хвостового рефлексов. Наступление смерти констатируется на основании формирования изоэлектрической формы электроэнцефалограммы (ЭЭГ), что свидетельствует о гибели мозга, прекращения дыхания и сердечной деятельности.

Предложенный способ эвтаназии иллюстрируется следующими примерами, но не ограничивается ими.

Рассмотрим пример применения способа.

Предложенный способ эвтаназии был апробирован на 2-х группах крыс линии Wistar массой 350-500 г по 15 особей в каждой. В первой группе эвтаназию животных осуществляли предложенным методом, путем внутримышечной инъекции комбинации ксилазина, тилетамина, золазепама и бисдиметилсульфата бисдиметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты в равных частях в дозе 40 мг/кг. Во второй группе животные получали внутримышечно комбинацию ксилазина, тилетамина и золазепама в равных частях и дозе 90 мг/кг, которая в 3 раза превышает дозу, рекомендованную для общей анестезии. В ходе исследования оценивали летальность животных, время до угнетения сознания, остановки дыхания и остановки сердца. Нежелательные явления при осуществлении эвтаназии (вокализация, дисфория, агональное дыхание, уринации, дефекации, мышечная активность, осложнения вследствие инъекции) оценивали полуколичественным методом по 1 балу за каждый выявленный вид явлений (от 0 до 7 балов). Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Характеристика процедуры эвтаназии, индуцированной предложенным способом

Исследуемый показатель 1-я группа
(n=15)* 2-я группа
(n=12)* Время от момента индукции эвтаназии до угнетения сознания, с 124±7 88±6* остановки дыхания, с 158±8 444±28* остановки сердца, с 322±17 535±33* Полуколичественная оценка нежелательных реакций, баллы 3,0 (2,0÷3,5) 5,0 (4,0÷6,0)* Летальность, % 100 80*

Примечания
* - количество животных, погибших в результате эвтаназии;

**- отличия достоверны относительно животных 1-й группы (р<0,05).

Полученные результаты свидетельствуют, что предложенный способ эвтаназии имеет очевидные преимущества в сравнении с рекомендованным. Так, несмотря на большее время угнетения сознания (в среднем 88 с против 124 с), он характеризовался в 1,7 раза более высокой скоростью наступления смерти животных и прекращения деятельности сердечно-сосудистой системы (р<0,05). Вследствие наличия в составе миорелаксанта дыхание останавливалась еще быстрее – в среднем за 158 с против 444 с (р<0,05). При этом состояние полного угнетения сознания, которое характеризовалась отсутствием педального, мигательного и хвостового рефлексов, наблюдалось раньше признаков угнетения дыхания. Вследствие этого предложенный метод эвтаназии характеризовался меньшей степенью нежелательных явлений, о чем говорит достоверно более низкий показатель бальной оценки (3,0 балла против 5,0). Уровень летальности при осуществлении эвтаназии данным способом составил 100%, что было достоверно выше, чем при использовании простой комбинации ксилазина, тилетамина и золалепама.

Таким образом, предложенный способ эвтаназии лабораторных животных является быстрым, надежным, эффективным, сопровождается минимальными нежелательными явлениями и соответствует критериям гуманности. Технико-экономическая эффективность данного способа заключается в том, что он позволяет обеспечить гуманную эвтаназию лабораторных животных в эксперименте благодаря однократному внутримышечному введению раствора смеси ксилазина, тилетамина, золазепама и бисдиметилсульфата бисдиметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты, оказывающих седативное, гипнотическое, болеутоляющее, анксиолитическое и миорелаксирующее действие, а также снижение времени от этапа введения раствора до наступление бессознательного состояния с последующим наступлением смерти.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной фармакологии и токсикологии. У лабораторных животных производят индукцию общей анестезии при помощи комбинации из водного раствора ксилазина, тилетамина, золазепама, и бисдиметилсульфата бисдиметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты, смешанных в равных частях. Комбинацию препаратов вводят в дозе 40 мг/кг по сумме действующих веществ внутримышечно. Способ позволяет осуществить гуманную эвтаназию лабораторных животных в эксперименте, благодаря однократному введению раствора композиции препаратов, сочетающих болеутоляющее, анксиолитическое, седативное и миорелаксирующее действие, что в свою очередь дает возможность снизить время от этапа введения раствора до наступления бессознательного состояния с последующим наступлением смерти. 1 табл., 1 пр.

Способ проведения гуманной эвтаназии лабораторных животных в эксперименте, включающий индукцию общей анестезии при помощи комбинации ксилазина и тилетамина с золазепамом, вводимых внутримышечно, отличающийся тем, что используют водный раствор ксилазина, тилетамина, золазепама и бисдиметилсульфата бисдиметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты в равных частях и дозе 40 мг/кг по сумме действующих веществ, вводимый внутримышечно.