Применение производных N-гидрокси-N-фенилбутандиамида в качестве ингибиторов металлопротеиназ в качестве соединений для противоопухолевой терапии и в качестве соединений с антиметастатической активностью Российский патент 2025 года по МПК A61K31/167 A61P35/00 C07C259/06 

Изобретение относится к области медицины, в частности к противоопухолевой терапии с применением комплекса таргетных лекарственных препаратов, включающих в себя ингибиторы металлоэнзимов. Матриксные металлопротеиназы (ММП) представляют собой семейство цинк-зависимых эндопептидаз, которые разрушают различные белки внеклеточного матрикса. ММП играют роль в пролиферации, миграции, дифференцировке, ангиогенезе, заживлении и восстановлении тканей. ММП могут участвовать в апоптотической клеточной гибели, а также в воспалительном и иммунном ответе [DOI 10.1016/j.jaut.2009.09.011]. Из всего семейства ММП в качестве мишеней для терапии рака наибольший интерес представляют ММП-2 и ММП-9, для которых показана повышенная экспрессия и активность в целом ряде опухолей человека [DOI 10.3892/ol.2017.6924]. Повышение активности ММП значительно влияет на функционирование внеклеточного матрикса и ремоделирование тканей, а также может приводить к метаболическим и иммунным заболеваниям, злокачественным новообразованиям и сердечно-сосудистым нарушениям, таким как гипертония, атеросклероз и аневризма [DOI 10.1016/bs.pmbts.2017.04.003]. Изменения в экспрессии и активности ММП были предложены в качестве потенциальных биомаркеров для диагностики и прогноза определенных патологических расстройств. Ингибиторы ММП могут быть использованы для снижения негативных эффектов ММП и рассматриваются как потенциальные терапевтические препараты при лечении остеоартрита, злокачественных новообразований и сердечно-сосудистых заболеваний. Были разработаны синтетические ингибиторы ММП, которые включают как ингибиторы широкого спектра действия, так и относительно специфические. Первым соединением, включенным в клинические испытания, был батимастат (ВВ-94, British Biotech), который демонстрировал высокую активность на различных ММП, но в клинических испытаниях фазы I и II вызывал ряд побочных эффектов (тошноту, утомляемость, субфебрилитет, боль в месте инъекции). Маримастат (ВВ-2516, British Biotech) также является ингибитором ММР широкого спектра действия. Фаза I и II испытаний продемонстрировала, что маримастат хорошо переносился, а побочные эффекты включали утомляемость и кумулятивный воспалительный полиартрит, обратимый после прекращения лечения. Приномастат (AG3340, Agouron Pharmaceuticals) является пикомолярным ингибитором ММП. Приномастат был разработан как более специфичный, чем предыдущие ингибиторы, и был направлен на селективное ингибирование ММП-2, -9, -13 и МТ1-ММП. В клинических испытаниях были выявлены побочные эффекты, аналогичные предыдущим ингибиторам ММП, такие как зависящая от времени и дозы скелетно-мышечная тугоподвижность и боль. Несмотря на преимущества в доклинических моделях на животных, клинические испытания III фазы на людях не привели к повышению выживаемости. Таномастат (BAY 12-9566, Bayer Corporation) представляет собой непептидный бифенильный ингибитор с Zn21-связывающей карбонильной группой. Таномастат является производным бутановой кислоты, что может объяснять его высокую селективность. Химические свойства таномостата могут быть причиной побочных эффектов, отличных от других ингибиторов ММП, включая бессимптомное повышение активности печеночных ферментов и тромбоцитопению. У некоторых пациентов, принимавших таномастат, заболевание ухудшалось [10.1124/pharmrev. 121.000349]. Получение и исследование новых ингибиторов ММП представляет важное направление для разработки новых подходов к терапии социально-значимых заболеваний и персооналифицированной медицине. Известные из уровня техники ингибиторы металлопротеиназ отличаются сложностью и многостадийностью синтеза и, как следствие, дороговизной. В то же время из уровня техники известен простой и технологичный метод синтеза производных N-гидроксибутанамидов [RU 2769320 С1] из легкодоступных N-замещенных сукцинимидов, который позволяет получать недорогие соединения, удовлетворяющие фармакофорной модели ингибиторов металлопротеиназ. В связи с этим задачей изобретения является поиск производных N-гидроксибутанамидов общей структуры 1 (фиг. 1), которые могут быть применимы в качестве ингибиторов металлопротеиназ.

Поставленная задача решается путем синтеза галоген и метокси производных N¹-гидрокси-N⁴-фенилбутандиамида по реакции N-замещенных сукцуинимидов с гидроксиламином [RU 2769320 С1].

Кроме того, поставленная задача решается путем исследования биологической активности полученных производных N¹-гидрокси-N⁴-фенилбутандиамида, в частности определения их ингибирующей активности на ферментативных моделях in vitro, определения цитотоксической активности на моделях неопухолевых и опухолевых клеток in vitro, определения острой токсичности на моделях in vivo, определения антиметастатической активности на моделях in vivo.

Сущность предлагаемого изобретения характеризуется примерами, приведенными ниже.

Пример 1

Синтез 1a (MMPI4) N¹-гидрокси-N⁴-(4-йодофенил)бутандиамида проводился по методике [RU 2769320 С1]. Найдено, %: С 34.01 Н 3.40; N 8.44; О 14.49. C₁₀H₁₁IN₂O₄. Рассчитано, %: С 35.95; Н 3.32; I 37.98; N 8.38; О 14.37. Масс спектр, m/z (Irel, %): 335 (1), 334 [М]⁺ (7.9), 302 (12.0), 246 (3.9), 245 (7.7), 220 (6.0), 219 (100), 218 (23.7), 203 (4.3), 191 (5.3), 176 (1.4), 175 (8.1), 174 (1.2), 161 (1.7), 150 (2.5), 146 (3.2), 128 (2.8), 127 (24.3), 119 (9.5), 118 (6.0), 116 (15.6), 105 (1.6), 104 (4.3), 93 (7.8), 92 (26.1), 91 (33.0), 90 (17.9), 88 (6.5), 87 (1.9), 76 (16.9), 75 (7.2), 74 (7.2), 70 (9.4), 65 (24.5), 64 (29.9), 63 (40.1), 62 (12.8), 60 (16.2), 56 (23.9), 55 (58.0), 52 (9.6), 50 (15.1), 44 (18.7), 43 (12.4), 42 (33.9), 39 (15.3), 38 (12.6), 33 (22.4), 32 (32.3), 30 (10.3), 29 (44.2), 28 (100), 27 (67.5), 26 (22.5), 18 (3.9), 17 (4.7), 16 (5.6), 15 (4.2). ИК спектр, ν, cm^-1: 3252, 2717, 1654, 1618, 1584, 1527, 1482, 1431, 1419, 1386, 1349, 1302, 1287, 1240, 1189, 1165, 1087, 1059, 1043, 1005, 968, 856, 846, 814, 781, 746, 706, 662, 601, 549, 501, 467, 399, 377. ¹Н ЯМР (DMSO-d₆), ppm (J, Hz): 2.28 (2H, t, J=7.2, -CH₂-), 2.55 (2H, t, J=7.2, -CH₂-), 7.42 (2H, d, J=8.7, Ar-H), 7.61 (2H, d, J=8.7, Ar-H), 8.69 (1H, s, N-OH), 10.04 (1H, s, C(O)NH), 10.41 (1H, s, C(O)NH). ¹³C ЯМР спектр (DMSO-d₆), δ, ppm: 27.15; 31.37; 86.11; 120.99; 137.18; 138.99; 168.17; 170.30.

Пример 2

Синтез 1b (MMPI6) N¹-гидрокси-N⁴-(4-метиксифенил)бутандиамида проводился по методике [RU 2769320 С1]. Найдено, %: С 55.51; Н 5.98; N 11.89; О 26.95. C₁₁H₁₄N₂O₄. Рассчитано, %: С 55.46; Н 5.92; N 11.76; О 26.86. ИК спектр, ν, cm^-1: 3260, 1656, 1604, 1539, 1512, 1423, 1409, 1354, 1248, 1086, 1029, 1007, 967, 827, 752, 683, 647, 541, 465, 448, 427, 401, 393, 376, 369. Масс спектр, m/z (Irel, %): 238 [М]+(23.8), 206 (18.2), 205 (4.9), 124 (9.9), 123 (100), 122 (42.8), 116 (6.2), 109 (5.1), 108 (67.3), 95 (14.0), 80 (16.8), 79 (7.2), 78 (6.4), 77 (5.5), 65 (9.4), 64 (7.9), 63 (10.0), 60 (9.4), 56 (30.4), 55 (37.8), 54 (7.3), 53 (19.3), 52 (25.0), 51 (9.1), 44 (25.4), 43 (9.9), 42 (21.6), 41 (13.3), 39 (40.0), 33 (11.1), 31 (8.7), 30 (10.2), 29 (36.2), 28 (32.5), 27 (49.5), 26 (16.7), 15 (44.7). ¹Н ЯМР спектр (DMSO-d₆), ppm (J, Hz): 2.27 (2H, t, J=7.3, -CH₂-), 2.50 - 2.55 (2H, m, -CH₂-), 3.70 (3H, s, -CH₃), 6.85 (2H, d, J=9.0, Ar-H), 7.49 (2H, d, J=8.9, Ar-H), 8.71 (1H, s, N-OH), 9.82 (1H, s, N-H), 10.49 (1H, s, N-H). ¹³C ЯМР спектр (DMSO-d₆), δ, ppm: 28.0; 29.0; 66.4; 115.2; 121.7; 130.0; 158.2; 167.1; 168.6; 170.7.

Пример 3

Синтез 1c (MMPI7) N¹-(4-фторофенил)-N⁴-гидроксибутандиамида проводился по методике [RU 2769320 С1]. Найдено, %: С 53.16; Н 4.99; N 12.52; О 21.31. C₁₀H₁₁FN₂O₃. Рассчитано, %: С 53.10; Н 4.90; F 8.40; N 12.38; О 21.22. ИК спектр, ν, cm^-1: 3272, 2988, 1658, 1613, 1539, 1510, 1423, 1407, 1342, 1307, 1217, 1084, 1008, 983, 965, 832, 782, 706, 647, 514, 454. Масс спектр, m/z (Irel, %): 226 [М]⁺(10.9), 195 (4.3), 194 (36.8), 193 (5.2), 138 (9.5), 116 (8.7), 112 (8.9), 111 (100), 110 (22.0), 109 (5.9), 95 (6.7), 84 (5.9), 83 (21.6), 82 (5.2), 57 (11.2), 56 (10.3), 55 (21.9), 44 (10.5), 42 (6.6), 29 (6.2), 28 (11.5), 27 (17.3), 26 (5.8). ¹Н ЯМР спектр (DMSO-d₆), δ, ppm (J, Hz): 2.28 (2H, t, J=7.2, -CH₂-), 2.55 (2H, t, J=7.2, -CH₂-), 5.80 - 8.10 (2H, broad peak, -OH, N-H), 7.12 (2H, t, J=8.8, Ar-H), 7.59 (2H, dd, J₁=8.7, J₂=5.1, Ar-H), 10.03 (1H, s, N-H). ¹³C ЯМР спектр (DMSO-d₆), δ, ppm (J, Hz): 27.9; 31.9; 115.6 (d, J=22.1); 121.1 (d, J=7.7); 136.2; 158.2 (d, J=239.5); 168.8; 170.6.

Пример 4

Синтез 1d (MMPI8) N¹-(4-бромфенил)-N⁴-гидроксибутандиамида проводился по методике [RU 2769320 С1]. Найдено, %: С 41.78; Н 4.01; N 9.52; О 16.89. C₁₀H₁₁BrN₂O₃. Рассчитано, %: С 41.83; Н 3.86; Br 27.83; N 9.76; О 16.72. ИК спектр, ν, cm^-1: 3257, 2685, 1654, 1588, 1532, 1486, 1418, 1394, 1350, 1299, 1241, 1189, 1073, 1007, 969, 708, 665, 611, 548, 504, 470, 453, 392, 378. ¹Н ЯМР спектр (DMSO-d₆), δ, ppm (J, Hz): 2.28 (2H, t, J=7.2, -CH₂-), 2.56 (2H, t, J=7.2, -CH₂-), 7.43 (2H, d, J=8.8, Ar-H), 7.58 (2H, d, J=8.8, Ar-H), 8.5 - 10.0 (broad peak, -OH), 10.26 (1H, s, N-H), 10.51 (1H, s, N-H). ¹³C ЯМР спектр (DMSO-d₆), δ, ppm: 27.4; 31.6; 114.5; 120.9; 131.5; 138.8; 168.5; 170.6.

Пример 5

Синтез 1e (MMPI9) N¹-гидрокси-N⁴-фенилбутандиамида проводился по методике [RU 2769320 С1]. Найдено, %: С 57.57; Н 5.92; N 13.36; О 23.29. C₁₀H₁₂N₂O₃. Рассчитано, %: С 57.68; Н 5.81; N13.45; О 23.05. ИК спектр, ν, cm^-1: 3270, 2927, 2728, 1662, 1599, 1571, 1535, 1498, 1421, 1352, 1313, 1265, 1242, 1191, 1165, 1083, 1047, 1007, 966, 903, 844, 782, 747, 693, 656, 588, 541, 505, 465, 445, 422, 387, 372. Масс спектр, m/z (Irel, %): 194 (7.6), 193 (61.5), 120 (7.5), 119 (6.6), 101 (18.5), 94 (18.5), 93 (98.5), 92 (38.5), 91 (15.4), 77 (23.7), 73 (21.5), 66 (21.5), 65 (53.8), 55 (38.5), 51 (16.9), 45 (100.0), 39 (40.0), 27 (73.1). ¹Н ЯМР спектр (DMSO-d₆), ppm (J, Hz): 2.28 (2Н, t, J=7.2, -CH₂-), 2.52 - 2.60 (2H, m, -СН₂-), 7.01 (1H, t, J=7.4, H Ar), 7.27 (2H, t, J=7.9, Ar-H), 7.58 (2H, d, J=7.8, Ar-H), 8.74 (1H, s, N-OH), 9.95 (1H, s, N-H), 10.43 (1H, s, N-H). ¹³C ЯМР спектр (DMSO-d₆), δ, ppm: 27.4; 31.5; 118.9; 122.9; 128.7; 139.3; 168.4; 170.2.

Пример 6

Использовали биохимический метод определения активности ММП, основанный на способности ферментов взаимодействовать со специфичными флуоресцентно-меченными субстратами, разработанный производителем Enzo (США). Эксперименты проводились согласно инструкции производителя (Instruction Manual, ММР Inhibitor Profiling Kit, Fluorometric RED, BML-AK308). Скорость ферментативной реакции детектировали в течение 10 мин с интервалом 1 мин. Интенсивность флуоресценции определяли на многофункциональном микропланшетном ридере «Spark 10М» (Tecan, Швейцария) при длинах волн: поглощение 545 нм, испускание 576 нм. Индекс ингибирования (концентрация, ингибирующая активность фермента на 50%, IC₅₀) определяли на основе дозозависимых кривых с использованием анализа медианного эффекта по методу Chou Т.С. и Talalay Р. (1984). Производные N-гидроксибутандиамида проявили ярко выраженную ингибирующую активность по отношению к обоим ферментам (фиг. 2 и 3). Соединения 1b и 1d показали выдающие ингибирующие свойства. Значения IC₅₀ 1b составило 22,10 нМ и 56,14 нМ соответственно для ММП-2 и ММП-9. Близкий результат получен для 1d - 19,32 нМ и 32,77 нМ соответственно для ММП-2 и ММП-9. Таким образом, показано, что соединения 1b и 1d являются наномолярными ингибиторами матриксных металлопротеиназ 2 и 9.

Пример 7

Оценку цитотоксического действия проводили с использованием метода МТТ-окрашивания клеток, широко применяемого в токсикологических исследованиях in vitro в связи с технологичностью и хорошей воспроизводимостью. В качестве тест-объектов были использованы клеточные линии опухолевых клеток А-172 (глиобластома человека), HeLa (аденокарцинома шейки матки человека), HepG2 (гепатоклеточная карцинома человека) и неопухолевых клеток FetMSC (мезенхимальные стволовые клетки). Через 72 ч после внесения исследуемых веществ проводили окрашивание клеток с помощью красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ), который в жизнеспособных клетках восстанавливается до нерастворимого в воде формазана фиолетового цвета. Интенсивность МТТ-окрашивания определяли фотометрически на многофункциональном микропланшетном ридере «Spark 10М» (Tecan, Швейцария) при длине волны 570 нм, фоновое поглощение света определяли при длине волны 620 нм. Жизнеспособность клеток определяли в процентах от МТТ-окрашивания контрольных (необработанных) клеток. Индекс цитотоксичности (IC₅₀) определялся на основе дозозависимых кривых с использованием анализа медианного эффекта по методу Chou Т.С. и Talalay Р. (1984). Индекс селективности (SI) определялся по соотношению значений IC₅₀ для опухолевых и нормальных клеток FetMSC.

В целом исследованные соединения 1а-1е могут считаться малотоксичными для клеток в соответствии с классификацией, приведенной в [DOI 10.1159/000207196], так как их значения IC₅₀ выше 100 мкМ. Исключение составило 1с, показавшее значительную цитотоксичность для клеток HeLa, HepG2 и FetMSC (IC₅₀ составила 50-100 мкМ). Наибольший цитотоксический эффект был получен для клеток карцином человека, а наименьший - для клеток глиобластомы. Расчет индексов селективности, которые показывают, насколько соединения более токсичны для опухолевых клеток по сравнению с неопухолевыми, позволил выявить соединение 1b, которое в несколько раз более активно на опухолевых клетках, чем на клетках костного мозга. Для соединения 1b значения индекса селективности составили 0,3-0,6.

Пример 8

В качестве тестируемых (заявляемых) производных N¹-гидрокси-N⁴-фенилбутандиамида были взяты соединения 1a, 1b, 1d, показавшие самую низкую цитотоксичность для неопухолевых клеток in vitro. Острая токсичность соединений 1a, 1b, 1d была изучена на самках интактных мышей-гибридов первого поколения BDF₁ (C57B1/6J х DBA/2). Токсичность исследовали при дозах от 200 до 1000 мг/кг. Дозы субстанций, превышающие 1000 мг/кг, животным ввести было невозможно вследствие недостаточной растворимости соединений в биологически совместимых растворителях. Контрольным животным вводили изотонический (0,9%) раствор хлористого натрия (отрицательный контроль), используя тот же путь и режим введения, что и животным в опытных группах. У животных регистрировали клинические признаки интоксикации, сроки гибели животных, изменение массы тела, потребление корма и воды. Ежедневно проводили осмотр всех животных в клетках содержания с целью выявления смертности или признаков отклонения в состоянии здоровья. По завершении опыта все животные были умерщвлены путем дислокации шейных позвонков, затем было проведено патологоанатомическое вскрытие.

Внутрибрюшинное введение 1a, 1b, 1d мышам BDF₁ в дозах от 200 до 1000 мг/кг не приводило к гибели животных от токсичности на протяжении всего времени наблюдения. После введения исследуемых субстанций в указанных дозах, у мышей в течение 0,5-1 часа наблюдали незначительное снижение двигательной активности. При дальнейшем наблюдении за мышами клинические признаки интоксикации отсутствовали в течение всего срока наблюдения за животными (14 суток), мыши были активны. Не было отмечено достоверного снижения массы тела животных. При вскрытии лабораторных животных и макроскопическом исследовании внутренних органов и тканей, не было выявлено существенных патоанатомических изменений в печени, почках, селезенке, легких, сердце по сравнению с мышами контрольной группы. Относительная масса внутренних органов животных опытных и контрольной групп также не имела существенных различий.

В связи с тем, что при введении максимально возможной дозы в 1000 мг/кг выявить достоверных признаков интоксикации и гибели животных не удалось, можно предположить, что исследуемые соединения можно отнести к 3 классу умеренно токсичных (ЛД₅₀>40 - 1250 мг/кг), либо 4 классу малотоксичных соединений (ЛД₅₀>1250 мг/кг).

Пример 9

Исследования противоопухолевой и антиметастатической активности тестируемых (заявляемых) производных N¹-гидрокси-N⁴-фенилбутандиамида продемонстрирована на соединении 1а на модели экспериментальной перевиваемой опухоли мышей меланома В16, способной к образованию спонтанных метастазов в легких. Экспериментальную меланому В16 перевивали подкожно мышам-гибридам первого поколения BDF₁ (C57B1/6J×DBA/2). Инокулум составлял 5×10⁶ опухолевых клеток. Исследовали действие 1а при многократном внутрибрюшинном введении в дозе 300 мг/кг. Критерием оценки служили торможение роста опухоли (ТРО%), а также индекс ингибирования метастазов в легких (ИИМ%). Как видно из результатов (табл. 4, фиг. 4), 4-кратное внутрибрюшинное введение 1а по 300 мг/кг со 2-х по 9-е сутки после трансплантации опухоли приводило к торможению роста опухоли меланомы В16. Торможение роста опухоли было наиболее выражено на 13-е сутки после начала лечения и составляло 61,4%. Как видно из табл. 5, 1а также вызывало снижение количества животных с метастазами в группе до 50%, и индекс ингибирования метастазирования составлял 88,6%.

Представленные выше примеры показывают, что соединения общей формулы 1 (получаемые по реакции раскрытия N-замещенных сукцинимидов) обладают противоопухолевой активностью. Исследование ингибирующей активности на ферментативной модели показало, что соединения 1b и 1d являются эффективными ингибиторами матриксных металлопротеиназ ММП-2 и ММП-9, играющих важную роль в прогрессировании опухолей. На модели неопухолевых и опухолевых клеток человека показано, что соединение 1b является малотоксичным и обладает селективностью цитотоксического действия по отношению к опухолевым клеткам. Результаты эксперимента на мышах позволяют предположить, что исследуемые соединения можно отнести к 3 классу умеренно токсичных (ЛД₅₀>40 - 1250 мг/кг) либо 4 классу малотоксичных соединений (ЛД₅₀>1250 мг/кг). Исследование на мышах с меланомой В16 показало, что соединение 1а проявляет противоопухолевую и антиметастатическую активности. Противоопухолевое действие 1а выражается в увеличении торможении роста опухоли до 61,4%. Антиметастатическое действие 1а проявляется в увеличении количества животных без метастазов до 50% и торможении метастазирования до 88,6%. Полученные данные показывают высокий потенциал исследуемого соединения для создания на его основе препаратов антиметастатического и противоопухолевого действия.

Изобретение относится к области органической химии, в частности к применению производных N¹-гидрокси-N⁴-фенилбутандиамида формулы 1 в качестве ингибиторов металлопротеиназ. В формуле 1 R выбран из Н, F, Cl, Br, I и О-СН₃. Технический результат – ингибирующее действие соединений формулы 1 в отношении металлопротеиназ. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 9 пр.

1. Применение производных N¹-гидрокси-N⁴-фенилбутандиамида общей формулы 1 в качестве ингибиторов металлопротеиназ:

где R=Н; F; Cl; Br; I; О-СН₃.

2. Применение производных N¹-гидрокси-N⁴-фенилбутандиамида по п. 1 в качестве соединений для противоопухолевой терапии.

3. Применение производных N¹-гидрокси-N⁴-фенилбутандиамида по п. 1 в качестве соединений с антиметастатической активностью.