Спиросоединения в качестве ингибиторов ERK и их применение Российский патент 2023 года по МПК C07D513/20 A61K31/4015 A61K31/429 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение касается спиросоединений в качестве ингибиторов ERK и их применения при изготовлении лекарственных средств для лечения заболеваний, связанных с ERK. В частности, настоящее изобретение касается соединений, представленных формулой (III), либо их фармацевтически приемлемых солей.

Уровень техники

Путь Ras/Raf/MEK/ERK - классический путь сигнального каскада митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK), который участвует в передаче сигналов различных факторов роста, цитокинов, митогенов и рецепторов гормонов после активации и является одним из самых важных путей передачи сигналов для контроля роста, дифференцировки и выживания клеток.

Исследования показали, что аномальная активация пути Ras/Raf/MEK/ERK, вызванная мутацией или амплификацией, является детерминантой различных раковых заболеваний. В опухолях у человека частота мутаций RAS составляет около 22%, частота мутаций BRAF - около 7%, а частота мутаций MEK - около 1%. Поэтому белки ключевых узлов на этом пути стали важными мишенями для лечения рака (Cancer Discov. 2019, 9, 329-341). В настоящее время ряд ингибиторов BRAF и ингибиторов MEK1/2, а также их комбинированные схемы одобрены FDA США для лечения меланомы, немелкоклеточного рака легких с мутацией BRAFV600E и других раковых заболеваний. Однако применение ингибиторов BRAF и MEK для этих вышестоящих узлов может быстро вызвать проблемы лекарственной устойчивости вследствие мутации или реактивации пути, что сильно ограничивает их клиническое применение.

Регулируемые внеклеточными сигналами протеинкиназы (ERK) (особенно киназы ERK1 и ERK2) являются главными участниками и нижележащими ключевыми узлами пути Ras/Raf/MEK/ERK, и чрезмерная активация их встречается при многих раковых заболеваниях человека. У ERK, как терминальной сигнальной киназы этого пути, еще не обнаружено мутаций, вызывающих лекарственную устойчивость. Поэтому препараты, нацеленные на ERK-киназы, должны преодолеть проблему лекарственной устойчивости, вызванной применением ингибиторов вышележащих мишеней, и станут более перспективной стратегией терапии. Но пока что исследования ингибиторов ERK все еще находятся в клинической фазе, и ни один ингибитор ERK еще не был одобрен для продажи в качестве лекарственного средства.

Итак, существует настоятельная потребность в разработке безопасных и эффективных препаратов - ингибиторов ERK для удовлетворения потребности в лечении рака.

Сущность изобретения

Настоящим изобретением предусмотрены соединения по формуле (III) либо их фармацевтически приемлемые соли:

где: n равно 0 или 1;

m равно 1 или 2;

кольцо A означает или ;

T₁, T₂ и T₃ каждый независимо означает N или CH;

E₁ означает O, S или NH;

R₁ означает H или C_1-3-алкил, причем C_1-3-алкил необязательно замещен 1, 2 или 3 R_a;

R₂ и R₃ каждый независимо означает H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH₂ или C_1-3-алкил, причем C_1-3-алкил необязательно замещен 1, 2 или 3 R_b;

R₄ означает H;

R₅, R_6, R₇, R₈ и R₉ каждый независимо означает H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH₂ или C_1-3-алкил, причем C_1-3-алкил необязательно замещен 1, 2 или 3 R_c;

R_a, R_b и R_c каждый независимо означает F, Cl, Br, I, OH, CN или NH₂.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенный R₁ означает H или CH₃, причем CH₃ необязательно замещен 1, 2 или 3 R_a, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенный R₁ означает CH₃, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенные R₂ и R₃ каждый независимо означает H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH₂ или CH₃, причем CH₃ необязательно замещен 1, 2 или 3 R_b, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенные R₂ и R₃ каждый независимо означает H или CH₃, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенные R₂ и R₃ каждый независимо означает H, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенные R₅, R_6, R₇, R₈ и R₉ каждый независимо означает H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH₂, CH₃ или -CH₂-CH₃, причем CH₃ или -CH₂-CH₃ необязательно замещен 1, 2 или 3 R_c, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенные R₅, R_6, R₇, R₈ и R₉ каждый независимо означает H, F, Cl, Br, I, OH, CN или NH₂, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенная структурная группировка означает , или , а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенная структурная группировка означает или , а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенное кольцо A означает или , а другие переменные уже определены в настоящем описании.

Настоящим изобретением предусмотрены соединения по формуле (I) либо их фармацевтически приемлемые соли:

где: n равно 0 или 1;

T₁, T₂ и T₃ каждый независимо означает N или CH;

R₁ означает H или C_1-3-алкил, причем C_1-3-алкил необязательно замещен 1, 2 или 3 R_a;

R₂ и R₃ каждый независимо означает H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH₂ или C_1-3-алкил, причем C_1-3-алкил необязательно замещен 1, 2 или 3 R_b;

R₄ означает H;

R₅, R_6, R₇, R₈ и R₉ каждый независимо означает H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH₂ или C_1-3-алкил, причем C_1-3-алкил необязательно замещен 1, 2 или 3 R_c;

R_a, R_b и R_c каждый независимо означает F, Cl, Br, I, OH, CN или NH₂.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенный R₁ означает H или CH₃, причем CH₃ необязательно замещен 1, 2 или 3 R_a, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенный R₁ означает CH₃, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенные R₂ и R₃ каждый независимо означает H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH₂ или CH₃, причем CH₃ необязательно замещен 1, 2 или 3 R_b, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенные R₂ и R₃ каждый независимо означает H, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенные R₅, R₆, R₇, R₈ и R₉ каждый независимо означает H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH₂, CH₃ или -CH₂-CH₃, причем CH₃ или -CH₂-CH₃ необязательно замещен 1, 2 или 3 R_c, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеприведенные R₅, R₆, R₇, R₈ и R₉ каждый независимо означает H, F, Cl, Br, I, OH, CN или NH₂, а другие переменные уже определены в настоящем описании.

Настоящее изобретение также включает и некоторые воплощения, которые получаются при комбинировании каких-либо из вышеприведенных переменных.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения предусмотрены вышеприведенные соединения либо их фармацевтически приемлемые соли, которые выбраны из числа:

и ,

где m, n, E₁, T₁, T₂, T₃, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ и R₉ уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения предусмотрены вышеприведенные соединения либо их фармацевтически приемлемые соли, которые выбраны из числа:

, и ,

где R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, E₁, T₁, T₂ и T₃ уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения предусмотрены вышеприведенные соединения либо их фармацевтически приемлемые соли, которые выбраны из следующего:

,

где T₁, T₂, T₃, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ и R₉ уже определены в настоящем описании.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения предусмотрены вышеприведенные соединения либо их фармацевтически приемлемые соли, которые выбраны из следующего:

,

где R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ и R₉ уже определены в настоящем описании.

Настоящим изобретением также предусмотрены соединения, представленные следующими формулами, либо их фармацевтически приемлемые соли:

, , , , , и .

В некоторых воплощениях настоящего изобретения предусмотрены вышеприведенные соединения либо их фармацевтически приемлемые соли, которые выбраны из числа:

и .

Настоящим изобретением также предусмотрено применение вышеприведенных соединений либо их его изомеров или фармацевтически приемлемых солей при изготовлении лекарственных средств для лечения заболеваний, связанных с ERK.

Технический эффект

Соединения по настоящему изобретению проявляют превосходную активность ингибирования киназы ERK2 и пролиферации клеток HT29. К тому же соединения по настоящему изобретению проявляют превосходную пероральную экспозицию и биодоступность. Более того, соединения по настоящему изобретению могут значительно ингибировать рост опухолей. При введении не наблюдается существенного снижения веса тела животных, и переносимость хорошая.

Определения и термины

Если не указано иначе, следующие термины и выражения в настоящем изобретении должны иметь следующие значения. Конкретные термины или выражения не должны считаться неопределенными или неясными в отсутствие конкретного определения, а должны пониматься в общепринятом смысле. При этом торговые названия служат для обозначения соответствующих товаров либо их активных ингредиентов.

Термин “фармацевтически приемлемый” применяется здесь в отношении таких соединений, материалов, композиций и/или дозовых форм, которые подходят для применения в контакте с тканями человека и животных в рамках здравого медицинского суждения, без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергических реакций или других проблем или осложнений, соизмеримо с разумным соотношением польза/риск.

Термин “фармацевтически приемлемая соль” означает такие соли приведенных здесь соединений, которые получают при реакции соединений, содержащих определенные заместители, приведенные здесь, с относительно нетоксичными кислотами или основаниями. Когда приведенные здесь соединения содержат сравнительно кислые функциональные группы, можно получить соли с основаниями при обработке этих соединений достаточным количеством основания в чистом растворе или в подходящем инертном растворителе. Фармацевтически приемлемые соли с основаниями включают соли натрия, калия, кальция, аммония, органических аминов или магния либо аналогичные соли. Когда приведенные здесь соединения содержат сравнительно щелочные функциональные группы, можно получить соли с кислотами при обработке этих соединений достаточным количеством кислоты в чистом растворе или в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых солей с кислотами включают соли неорганических кислот, причем неорганические кислоты включают, к примеру, соляную кислоту, бромистоводородную кислоту, азотную кислоту, угольную кислоту, бикарбонаты, фосфорную кислоту, монозамещенные фосфаты, двузамещенные фосфаты, серную кислоту, бисульфаты, йодистоводородную кислоту, фосфиновую кислоту и т.п.; и соли органических кислот, причем органические кислоты включают, к примеру, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, изомасляную кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, бензойную кислоту, янтарную кислоту, пробковую кислоту, фумаровую кислоту, молочную кислоту, миндальную кислоту, фталевую кислоту, бензолсульфоновую кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту, лимонную кислоту, винную кислоту, метансульфоновую кислоту и т.п.; а также соли аминокислот (типа аргинина и др.) и соли органических кислот типа глюкуроновой кислоты и т.п. Некоторые из приведенных здесь соединений содержат как щелочные, так и кислотные функциональные группы и могут быть преобразованы в любые соли с основаниями или кислотами.

Фармацевтически приемлемые соли, приведенные здесь, могут быть получены из исходных соединений, содержащих кислотные или щелочные группировки, стандартными химическими методами. Как правило, такие соли можно получить при реакции соединения в виде свободной кислоты или основания со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или органическом растворителе либо их смеси.

Приведенные здесь соединения могут присутствовать в виде определенных геометрических или стереоизомеров. Настоящим изобретением предусмотрены все такие соединения, включая цис- и транс-изомеры, (-)- и (+)-энантиомеры, (R)- и (S)-энантиомеры, диастереоизомеры, (D)-изомеры, (L)-изомеры, рацемические смеси и другие смеси, например, смеси, обогащенные энантиомерами или диастереоизомерами, которые все входят в рамки настоящего изобретения. Заместители типа алкилов могут содержать дополнительные асимметрические атомы углерода. Все эти изомеры и их смеси входят в рамки настоящего изобретения.

Если не указано иначе, термины “энантиомер” или “оптический изомер” означают такие стереоизомеры, которые находятся в зеркальном соотношении друг с другом.

Если не указано иначе, термины “цис-транс-изомер” или “геометрический изомер” возникают вследствие отсутствия свободного вращения у двойной связи или одинарной связи между кольцевыми атомами углерода.

Если не указано иначе, термин “диастереомер” означает такой стереоизомер, у которого в молекуле содержатся два или больше хиральных центров, которые не находятся в зеркальном соотношении между молекулами.

Если не указано иначе, “(+)” означает декстроизомер, “(-)” означает левоизомер, а “(±)” означает рацемат.

Если не указано иначе, клиновидная сплошная связь () и клиновидная пунктирная связь () обозначают абсолютную конфигурацию стереоцентра; прямая сп лошная связь () и прямая пунктирная связь () обозначают относительную конфигурацию стереоцентра; волнистая линия () означает клиновидную сплошную связь () или клиновидную пунктирную связь (); или же волнистая линия () означает прямую сплошную связь () либо прямую пунктирную связь ().

Если не указано иначе, когда у соединения присутствует структура двойной связи типа двойной связи углерод-углерод, двойной связи углерод-азот или двойной связи азот-азот и каждый атом у двойной связи соединяется с двумя различными заместителями (в двойной связи, содержащей атом азота, одна пара неподеленных пар электронов на атоме азота рассматривается как один из заместителей, с которыми он соединяется), то соединение представляет собой (Z)-изомер, (E)-изомер либо смесь из двух изомеров соединения, если в соединении атомы у двойной связи соединяются со своими заместителями волнистой линией (). Например, если соединение имеет следующую формулу (А), то это значит, что соединение присутствует в виде отдельного изомера по формуле (А-1) или по формуле (А-2) либо в виде смеси двух изомеров по формуле (А-1) и формуле (А-2); а если соединение имеет следующую формулу (B), то это значит, что соединение присутствует в виде отдельного изомера по формуле (B-1) или по формуле (B-2) либо в виде смеси двух изомеров по формуле (B-1) и формуле (B-2). Если же соединение имеет следующую формулу (C), то это означает, что соединение присутствует в виде отдельного изомера по формуле (C-1) или по формуле (C-2) либо в виде смеси двух изомеров по формуле (C-1) и формуле (C-2):

Если не указано иначе, термины “таутомер” или “таутомерная форма’ означают то, что различные функциональные группы находятся в динамическом равновесии при комнатной температуре и могут быстро превращаться друг в друга. Если возможны таутомеры (как-то в растворе), то может достигаться химическое равновесие таутомеров. Например, протонные таутомеры (также известные как прототропные таутомеры) включают взаимные превращения при переносе протонов типа кето-енольной изомеризации и имин-енаминовой изомеризации. Таутомеры по валентности включают взаимные превращения при рекомбинации некоторых образующих связи электронов. Конкретным примером кето-енольной таутомеризации являются взаимные превращения между двумя таутомерами: пентан-2,4-дионом и 4-гидроксипент-3-ен-2-оном.

Если не указано иначе, термин “обогащенный одним изомером”, “обогащенный изомером”, “обогащенный одним энантиомером” или “обогащенный энантиомером” означает то, что содержание одного изомера или энантиомера составляет менее 100%, причем содержание изомера или энантиомера составляет 60% и более или 70% и более или 80% и более или 90% и более или 95% и более или 96% и более или 97% и более или 98% и более или 99% и более или 99,5% и более или 99,6% и более или 99,7% и более или 99,8% и более или 99,9% и более.

Если не указано иначе, термин “изомерный избыток” или “энантиомерный избыток” означает разность между относительным содержанием двух изомеров или двух энантиомеров в процентах. Например, если один изомер или энантиомер присутствует в количестве 90%, а другой изомер или энантиомер присутствует в количестве 10%, то изомерный избыток или энантиомерный избыток (значение ee) составляет 80%.

Оптически активные (R)- и (S)-изомеры или D- и L-изомеры можно получить с помощью хирального синтеза или хиральных реагентов или другими стандартными методами. Если нужно получить один из энантиомеров определенного соединения, приведенного здесь, то требуемый чистый энантиомер можно получить путем асимметрического синтеза или производного действия хирального вспомогательного вещества с последующим разделением полученной диастереомерной смеси и отщеплением вспомогательной группы. С другой стороны, если молекула содержит основную функциональную группу (типа аминогруппы) или кислотную функциональную группу (типа карбоксильной), то проводится реакция соединения с соответствующей оптически активной кислотой или основанием с образованием соли диастереомерного изомера, которая затем подвергается разделению диастереомеров принятым в данной области методом с получением чистого энантиомера. Кроме того, энантиомеры и диастереоизомеры обычно выделяют методами хроматографии с использованием хиральной неподвижной фазы, необязательно в сочетании с методом химической дериватизации (например, получением карбамата из амина).

Приведенные здесь соединения могут содержать неестественные доли атомных изотопов у одного или нескольких атомов, входящих в состав соединения. Например, соединение может быть помечено радиоизотопом типа трития (³H), йода-125 (¹²⁵I) или C-14 (¹⁴C). В другом случае водород может быть заменен на тяжелый водород для получения дейтерированного препарата. Связь между дейтерием и углеродом прочнее, чем между простым водородом и углеродом. По сравнению с недейтерированными препаратами дейтерированные препараты обладают такими преимуществами, как снижение токсических побочных эффектов, повышение стабильности препаратов, повышение эффективности и продление биологического периода полураспада препаратов. Все изменения изотопного состава приведенных здесь соединений, независимо от радиоактивности, входят в рамки настоящего изобретения.

Термин “необязательный” или “необязательно” означает, что последующее событие или условие может произойти, но не обязательно, причем этот термин включает случаи, когда событие или условие происходит, и случаи, когда событие или условие не происходит.

Термин “замещенный” означает то, что один или несколько атомов водорода у определенного атома замещены заместителем, включая варианты дейтерия и водорода, если только валентность данного атома остается нормальной, а замещенное соединение стабильно. Если заместителем является оксо (т.е. =O), то это значит, что замещены два атома водорода. Положения в ароматическом кольце не могут быть замещены оксогруппой. Термин “необязательно замещенный” означает то, что атом может быть замещен заместителем или нет, если не указано иначе, а вид и количество заместителей могут быть произвольными, если только они химически достижимы.

Когда какая-либо переменная (типа R) встречается в строении или структуре соединения более одного раза, то определение переменной в каждом случае является независимым. Так, например, если какая-то группа замещена 0-2 R, то она может быть необязательно замещена максимум двумя R, причем определение R в каждом случае будет независимым. Кроме того, комбинации заместителей и/или их вариантов допустимы лишь в том случае, если эти комбинации дают стабильные соединения.

Когда количество соединительных групп равно 0 типа -(CRR)₀-, то это значит, что соединительная группа представляет собой простую связь.

Когда одна из переменных представляет собой простую связь, то это значит, что две группы, связанные простой связью, соединяются напрямую. Например, когда L в A-L-Z означает простую связь, то структура A-L-Z фактически представляет собой A-Z.

Когда заместитель является вакантным, то это значит, что заместитель не существует. Например, когда X является вакантным в A-X, то структура A-X фактически представляет собой A. Когда у пронумерованного заместителя не указано, через какой атом он связан с замещаемой группой, такой заместитель может быть связан через любой из своих атомов. Например, пиридильная группа в качестве заместителя может быть связана с замещаемой группой через любой из атомов углерода в кольце пиридина.

Когда у пронумерованной соединительной группы не указано направление связи, то ее направление связи является произвольным. Например, когда соединительная группа L в представлена -M-W-, то -M-W- может соединяться с кольцом A и кольцом B в том же направлении, что и при чтении слева направо, составляя , или же может соединяться с кольцом A и кольцом B в обратном направлении, чем при чтении слева направо, составляя . Комбинации соединительных групп, заместителей и/или их вариантов допускаются только в том случае, если такие комбинации могут дать стабильные соединения.

Если не указано иначе, когда группа содержит один или несколько соединяемых участков, то какой-либо один или несколько участков этой группы могут соединяться с другими группами через химические связи. Химическая связь между этим участком и другими группами может быть представлена в виде прямой сплошной связи (), прямой пунктирной связи () или волнистой линии (). К примеру, прямая сплошная связь в -OCH₃ означает, что эта группа соединяется с другими группами через атом кислорода в группе; прямая пунктирная связь в означает, что эта группа соединяется с другими группами через два конца атома азота в группе; а волнистая линия в означает, что эта группа соединяется с другими группами через 1-й и 2-й атомы углерода фенильной группы.

Если не указано иначе, термин “C_1-3-алкил” применяется для обозначения линейной или разветвленной насыщенной углеводородной группы, состоящей из 1-3 атомов углерода. C_1-3-алкильные группы включают C_1-2- и C_2-3-алкильные группы и т.п. Они могут быть одновалентными (напр., метил), двухвалентными (напр., метилен) или поливалентными (напр., метенил). Примеры C_1-3-алкильных групп включают, без ограничения, метил (Me), этил (Et), пропил (включая н-пропил и изопропил) и т.п.

Если не указано иначе, термин “C_1-3-алкокси” обозначает алкильные группы, содержащие 1-3 атома углерода и соединенные с остальной частью молекулы через атом кислорода. C_1-3-алкоксигруппы включают C_1-2-, C_2-3-, C₃- и C₂-алкоксигруппы и т.п. Примеры C_1-3-алкоксигрупп включают, без ограничения, метокси, этокси, пропокси (в том числе н-пропокси и изопропокси) и др.

Если не указано иначе, термин “гало” или “галоген” сам по себе или в составе другого заместителя означает атом фтора, хлора, брома или йода.

Если не указано иначе, C_n-n+m или C_n-C_n+m включает все конкретные случаи от n до n+m атомов углерода, например, C_1-12 включает C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀, C₁₁ и C₁₂, а также включает любые диапазоны от n до n+m, например, C_1-12 включает C_1-3, C_1-6, C_1-9, C_3-6, C_3-9, C_3-12, C_6-9, C_6-12 и C_9-12 и т.д; точно так же число членов от n до n+m означает, что количество атомов в кольце составляет от n до n+m, например, 3-12-членное кольцо включает 3-членное кольцо, 4-членное кольцо, 5-членное кольцо, 6-членное кольцо, 7-членное кольцо, 8-членное кольцо, 9-членное кольцо, 10-членное кольцо, 11-членное кольцо и 12-членное кольцо, а также включает любые диапазоны от n до n+m, к примеру, 3-12-членное кольцо включает и 3-6-членное кольцо, 3-9-членное кольцо, 5-6-членное кольцо, 5-7-членное кольцо, 6-7-членное кольцо, 6-8-членное кольцо и 6-10-членное кольцо и т.д.

Термин “уходящая группа” означает такую функциональную группу или атом, которая может быть заменена другой функциональной группой или атомом при реакции замещения (типа реакции нуклеофильного замещения). Например, репрезентативные уходящие группы включают трифлат; хлор, бром и йод; сульфонатные группы типа мезилата, тозилата, п-бромбензолсульфоната, п-толуолсульфоната и т.п.; ацилокси типа ацетокси, трифторацетокси и др.

Термин “защитная группа” включает, без ограничения, “аминозащитные группы”, “гидроксизащитные группы” или “тиозащитные группы”. Термин “аминозащитные группы” означает защитные группы, пригодные для блокирования побочных реакций у азота аминогруппы. Репрезентативные аминозащитные группы включают, без ограничения: формил; ацилы типа алканоилов (напр., ацетил, трихлорацетил или трифторацетил); алкоксикарбонилы типа трет-бутоксикарбонила (Boc); арилметоксикарбонилы типа бензилоксикарбонила (Cbz) и 9-фторенилметоксикарбонила (Fmoc); арилметилы типа бензила (Bn), тритила (Tr), 1,1-бис-(4'-метоксифенил)метила; силилы типа триметилсилила (TMS) и трет-бутилдиметилсилила (TBS) и др. Термин “гидроксизащитные группы” означает защитные группы, пригодные для блокирования побочных реакций у гидроксила. Репрезентативные гидроксизащитные группы включают, без ограничения: алкилы типа метила, этила и трет-бутила; ацилы типа алканоилов (напр., ацетил); арилметилы типа бензила (Bn), п-метоксибензила (PMB), 9-фторенилметила (Fm) и дифенилметила (бензгидрила, DPM); силилы типа триметилсилила (TMS) и трет-бутилдиметилсилила (TBS) и др.

Приведенные здесь соединения могут быть получены различными методами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области, включая следующие пронумерованные воплощения, воплощения, полученные по следующим перечисленным воплощениям в сочетании с другими методами химического синтеза, и эквивалентные замены, хорошо известные специалистам в данной области. Альтернативные воплощения включают, без ограничения, приведенные здесь воплощения.

Структура приведенных здесь соединений может быть проверена стандартными методами, хорошо известными специалистам в данной области. Если в настоящем изобретении приводится абсолютная конфигурация соединения, то абсолютная конфигурация может быть проверена стандартными методами типа рентгеновской дифракции на монокристалле (SXRD). При рентгеновской дифракции на монокристалле (SXRD) данные по интенсивности дифракции на выращенном монокристалле получают на коммерческом дифрактометре Bruker D8 с источником излучения типа CuKα в режиме сканирования ϕ/ω; после получения соответствующих данных проводится дальнейший анализ кристаллической структуры прямым методом (Shelxs97) для проверки абсолютной конфигурации.

Растворители, используемые в настоящем изобретении, являются коммерчески доступными. В настоящем описании применяется следующее сокращение: aq означает водный.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Кривая роста опухолей HCT116 рака толстой кишки человека на модели у животных после введения растворителя и WX007, соответственно.

Фиг. 2. Степень изменения веса (%) на модели у животных с раком толстой кишки HCT116 человека при введении.

Раскрытие сущности изобретения

Далее настоящее изобретение описано подробно на примерах. Однако это не означает, что данные примеры имеют какие-либо неблагоприятные ограничения для настоящего изобретения. Настоящее изобретение подробно описано здесь, и воплощения также изложены здесь. Специалистам в данной области должно быть ясно, что в приведенные здесь воплощения могут вноситься различные изменения и модификации, не выходящие за рамки изложенной здесь сущности и объема изобретения.

Контрольный пример 1. Фрагмент A-1

Стадия 1. Синтез соединения A-1-2

В сухую одногорлую колбу вносили раствор ацетата натрия (4,64 г, 56,60 ммоль, 5 экв.), моноперсульфата калия (13,92 г, 22,64 ммоль, 2 экв.) и воду (47 мл). Смесь охлаждали до 0°C. По каплям добавляли раствор A-1-1 (4,7 г, 11,32 ммоль, 1 экв.), растворитель тетрагидрофуран (47 мл) и метанол (47 мл) и перемешивали смесь при 0°C в течение 1 часа. Затем смесь перемешивали на масляной бане при 29°C в течение 15 часов. По завершении реакции реакционный раствор выливали в воду (200 мл) и экстрагировали водную фазу этилацетатом (3×50 мл). Органические фазы объединяли, а объединенную органическую фазу последовательно промывали насыщенным раствором NaCl (200 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат собирали и упаривали при пониженном давлении, получая остаток. Остаток очищали методом колоночной флэш-хроматографии, получая A-1-2. ¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ ppm 8,67 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,64 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 3,37 (s, 3H), 1,63-1,53 (m, 6H), 1,39-1,30 (m, 6H), 1,26-1,12 (m, 6H), 0,90 (t, J = 7,3 Hz, 9H).

Стадия 2. Синтез соединения A-1

В реакционную колбу вносили A-1-2 (3,9 г, 8,72 ммоль, 1 экв.), A-1-3 (1,02 г, 10,46 ммоль, 1,2 экв.) и тетрагидрофуран (117 мл). Заменяли атмосферу на газообразный азот, а затем по каплям добавляли гексаметилдисилазид лития (1 М, 18,31 мл, 2,1 экв.) при -35°C. Раствор этой смеси инкубировали при -35°C в течение 10 минут. По завершении реакции реакционный раствор гасили насыщенным водным раствором хлористого аммония (100 мл) и экстрагировали этилацетатом (2×100 мл) и дихлорметаном (100 мл). Органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали досуха на роторном испарителе, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом колоночной хроматографии, получая A-1. ¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ ppm 8.17 (d, J=4.85 Hz, 1H), 7.46 (d, J=1.76 Hz, 1H), 6.91 (d, J=4.63 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.32 (d, J=1.98 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 1.52-1.61 (m, 6H), 1.28-1.40 (m, 6H), 1.03-1.20 (m, 6H), 0.89 (t, J=7.28 Hz, 9H).

Пример 1

Схема синтеза:

Стадия 1. Синтез WX001-3

В реакционную колбу вносили WX001-1 (5 г, 24,03 ммоль, 1 экв.) и тетрагидрофуран (200 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, охлаждали смесь до -78°C и медленно по каплям добавляли диизопропиламид лития (2 М, 28,84 мл, 2,4 экв.) и тетраметилэтилендиамин (4,19 г, 36,05 ммоль, 5,44 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при -78°C в течение 0,5 часа, а затем добавляли WX001-2 (3,10 г, 36,05 ммоль, 1,5 экв.). Смесь инкубировали при -78°C в течение 2 часов. По завершении реакции реакционный раствор гасили насыщенным водным раствором хлорида аммония (250 мл), доводили до pH 2-3 с помощью 2 М соляной кислоты и экстрагировали этилацетатом (3×100 мл). Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl (100 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса при 45°C, получая WX001-3.

Стадия 2. Синтез WX001-4

В реакционную колбу вносили WX001-3 (1 г, 3,40 ммоль, 1 экв.) и ацетонитрил (10 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, а затем охлаждали смесь до 0°C. Медленно по каплям добавляли эфират трифторида бора (579,06 мг, 4,08 ммоль, 503,53 мкл, 1,2 экв.). Раствор этой смеси инкубировали при 20°C в течение 2 часов, затем нагревали до 50°C и инкубировали еще 16 часов, а затем нагревали до 60°C и инкубировали еще 8 часов. По завершении реакции реакционный раствор разбавляли водой (20 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×20 мл). Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали досуха при пониженном давлении с помощью водяного насоса при 45°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом колоночной хроматографии, получая WX001-4. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 4.18 (d, J=8.6 Hz, 1H), 4.06-4.13 (m, 2H), 3.76 (d, J=8.6 Hz, 1H), 2.76-2.87 (m, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.16 (dt, J=12.9, 7.5 Hz, 1H).

Стадия 3. Синтез WX001-5

В реакционную колбу вносили WX001-4 (250 мг, 788,25 мкмоль, 1 экв.), соляную кислоту (2 М, 1,97 мл, 5 экв.) и этанол (2 мл). Раствор этой смеси инкубировали при 70°C в течение 16 часов. По завершении реакции реакционный раствор разбавляли водой (2 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×5 мл). Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl (2 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали досуха при пониженном давлении с помощью водяного насоса при 45°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, получая WX001-5. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.23 (br s, 1H), 3.97-4.14 (m, 2H), 3.84-3.95 (m, 1H), 3.76 (br d, J=8.7 Hz, 1H), 2.17-2.33 (m, 1H).

Стадия 4. Синтез WX001-7

В реакционную колбу вносили WX001-5 (150 мг, 545,21 мкмоль, 1 экв.) и N,N-диметилформамид (2 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, а затем охлаждали смесь до 0°C. Добавляли гидрид натрия (26,17 мг, 654,25 мкмоль, чистота 60%, 1,2 экв.). Смесь перемешивали в течение 0,5 часа, а затем добавляли WX001-6 (134,44 мг, 654,25 мкмоль, 85,63 мкл, 1,2 экв.). Смесь медленно нагревали до 20°C и инкубировали в течение 0,5 часа. По завершении реакции реакционный раствор разбавляли водой (20 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×10 мл). Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl (2 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали досуха при пониженном давлении с помощью водяного насоса при 45°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, получая WX001-7. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 7.30-7.39 (m, 3H), 7.23-7.29 (m, 1H), 4.62-4.79 (m, 2H), 4.02-4.11 (m, 1H), 3.95 (q, J=8.4 Hz, 1H), 3.72-3.82 (m, 2H), 2.30-2.38 (m, 2H).

Стадия 5. Синтез WX001-8

В реакционную колбу вносили WX001-7 (100 мг, 250,19 мкмоль, 1 экв.), A-1 (127,76 мг, 275,21 мкмоль, 1,1 экв.) и толуол (2 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, а затем добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (57,82 мг, 50,04 мкмоль, 0,2 экв.). Раствор этой смеси инкубировали при 125°C в течение 14 часов. По завершении реакции реакционный раствор непосредственно упаривали досуха на роторном испарителе, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, получая WX001-8.

Стадия 6. Синтез WX001A или WX001B

Проводили хиральное разделение WX001-8 методом сверхкритической жидкостной хроматографии (условия разделения: хроматографическая колонка Daicel Chiralcel OJ (250×30 мм внутренний диаметр, 10 мкм); подвижная фаза: A - CO₂, B - этанол (с 0,1% NH₃ в H₂O), B% = 50%; скорость подачи: 70 мл/мин), получая WX001A
или WX001B. Время удерживания WX001A составляло 1,782 мин, а время удерживания WX001B составляло 1,969 мин.

Пример 2

Схема синтеза:

Стадия 1. Синтез WX002-2

В реакционную колбу вносили WX001-1 (5 г, 24,03 ммоль, 1 экв.) и тетрагидрофуран (250 мл) в атмосфере азота и медленно добавляли диизопропиламид лития (2 М, 28,84 мл, 2,4 экв.) и тетраметилэтилендиамин (4,19 г, 36,05 ммоль, 5,44 мл, 1,5 экв.) при -78°C. Смесь инкубировали при -78°C в течение 0,5 часа, а затем добавляли раствор WX002-1 (4,81 г, 48,07 ммоль, 4,42 мл, 2 экв.) в тетрагидрофуране (10 мл). Смесь инкубировали при -78°C в течение 2 часов. По завершении реакции реакционный раствор медленно выливали в 100 мл насыщенного водного раствора хлористого аммония при 0°C, доводили до pH 3-4 с помощью соляной кислоты (2 М) и экстрагировали этилацетатом (3×200 мл). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором NaCl (3×200 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса при 45°C, получая WX002-2.

Стадия 2. Синтез WX002-3

В реакционную колбу вносили WX002-2 (1 г, 3,25 ммоль, 1 экв.) и ацетонитрил (20 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, а затем добавляли эфират трифторида бора (552,70 мг, 3,89 ммоль, 480,61 мкл, 1,2 экв.). Раствор этой смеси инкубировали при 60°C в течение 16 часов. По завершении реакции в реакционный раствор добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия (20 мл) и экстрагировали смесь этилацетатом (3×30 мл). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором NaCl (3×30 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса при 45°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт растирали с этилацетатом (10 мл), получая WX002-3.

Стадия 3. Синтез WX002-4

В сухую реакционную колбу вносили WX002-3 (260 мг, 785,06 мкмоль, 1 экв.), соляную кислоту (2 М, 4 мл, 10,19 экв.) и этанол (6 мл). Смесь инкубировали при 50°C в течение 16 часов, а затем нагревали до 70°C и инкубировали в течение 4 часов. По завершении реакции реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (3×50 мл). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором NaCl (3×50 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса при 45°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт растирали с этилацетатом (10 мл), получая WX002-4. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.32 (s, 1H), 3.73-3.79 (m, 2H), 3.56-3.63 (m, 2H), 2.27-2.34 (m, 1H), 1.86-1.91 (m, 2H), 1.80-1.82 (m, 1H).

Стадия 4. Синтез WX002-5

В сухую реакционную колбу вносили WX002-4 (50 мг, 172,92 мкмоль, 1 экв.) и N,N-диметилформамид (2 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, а затем добавляли гидрид натрия (10,37 мг, 259,38 мкмоль, чистота 60%, 1,5 экв.) при 0°C. Смесь инкубировали при 0°C в течение 0,5 часа, а затем добавляли WX001-6 (35,53 мг, 172,92 мкмоль, 22,63 мкл, 1 экв.). Реакционный раствор медленно нагревали до 25°C и инкубировали еще 1,5 часа. По завершении реакции в реакционный раствор добавляли 30 мл воды и экстрагировали смесь этилацетатом (3×50 мл). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором NaCl (3×50 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса при 45°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, получая WX002-5. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 7.42 (s, 1H), 7.29-7.38 (m, 3H), 4.77 (s, 2H), 4.03 (br dd, J = 12.3, 4.1 Hz, 2H), 3.45 (br t, J = 12.0 Hz, 2H), 2.17-2.25 (m, 4.8 Hz, 2H), 1.38 (br d, J = 13.0 Hz, 2H).

Стадия 5. Синтез WX002

В реакционную колбу вносили WX002-5 (50 мг, 120,86 мкмоль, 1 экв.), A-1 (65,66 мг, 120,86 мкмоль, 1 экв.) и толуол (1 мл) и заменяли атмосферу газообразным азотом. Смесь нагревали до 125°C, а затем медленно добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (27,93 мг, 24,17 мкмоль, 0,2 экв.). Смесь инкубировали при 125°C в течение 48 часов. По завершении реакции реакционный раствор упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса при 45°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматографическая колонка: Waters Xbridge BEH C18, 100×30 мм×10 мкм; подвижная фаза: [вода с 10 мМ бикарбонатом аммония-ацетонитрил]; ацетонитрил: 28%-58%, 8 мин), получая WX002.

Пример 3

Схема синтеза:

Стадия 1. Синтез WX003-1

В сухую реакционную колбу вносили WX002-5 (100 мг, 241,71 мкмоль, 1 экв.), A-1-2 (108,10 мг, 241,71 мкмоль, 1 экв.) и толуол (2 мл) и заменяли атмосферу газообразным азотом. Добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (55,86мг, 48,34 мкмоль, 0,2 экв.) при 125°C и инкубировали смесь с перемешиванием в течение 48 часов. По завершении реакции реакционный раствор упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса при 45°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, получая WX003-1. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.29 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 8.48 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.31-7.39 (m, 3H), 4.83 (s, 2H), 4.07 (m, J = 12.3, 4.4 Hz, 2H), 3.64 (m, J = 12.0 Hz, 2H), 3.54 (s, 3H), 2.24-2.31 (m, 2H), 1.43 (m, J = 12.9 Hz, 2H).

Стадия 2. Синтез WX003

В сухую реакционную колбу вносили WX003-1 (50 мг, 101,84 мкмоль, 1 экв.), тетрагидропиран-4-амин (10,30 мг, 101,84 мкмоль, 1 экв.) и диметилсульфоксид (1 мл). Смесь инкубировали с перемешиванием при 100°C в течение 16 часов. По завершении реакции реакционный раствор очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматографическая колонка: Waters Xbridge BEH C18, 100×30 мм×10 мкм; подвижная фаза: [вода с 10 мМ бикарбонатом аммония-ацетонитрил]; ацетонитрил: 32%-62%, 8 мин), получая WX003.

Пример 4

Схема синтеза:

Стадия 1. Синтез WX004-1

В реакционную колбу вносили WX001-1 (10 г, 48,07 ммоль, 1 экв.) и тетрагидрофуран (200 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, а затем медленно по каплям добавляли раствор боран-тетрагидрофуранового комплекса (1 М, 144,21 мл, 3 экв.) в атмосфере азота. Смесь инкубировали при 25°C в течение 5 часов. По завершении реакции в реакционный раствор медленно по каплям добавляли метанол (100 мл) в атмосфере азота. Смесь перемешивали при 25°C в течение 16 часов, а затем упаривали досуха на роторном испарителе при 40°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом колоночной хроматографии, получая WX004-1. ¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ (ppm) 7.47 (s, 1H), 4.52 (d, J = 1.0 Hz, 2H).

Стадия 2. Синтез WX004-3

В реакционную колбу вносили WX004-1 (7,86 г, 40,51 ммоль, 1 экв.) и тетрагидрофуран (78,6 мл) и заменяли атмосферу газообразным азотом. Смесь охлаждали до -78°С. Медленно добавляли диизопропиламид лития (2 М, 48,61 мл, 2,4 экв.), а затем добавляли тетраметилэтилендиамин (7,06 г, 60,76 ммоль, 9,17 мл, 1,5 экв.). Смесь инкубировали при -78°C в течение 0,5 часа, а затем добавляли смесь WX004-2 (10,65 г, 60,76 ммоль, 1,5 экв.) и тетрагидрофурана (10 мл). Смесь инкубировали при -78°C в течение 1 часа. По завершении реакции реакционный раствор гасили насыщенным водным раствором хлорида аммония (100 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×50 мл). Органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали досуха на роторном испарителе при 45°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом колоночной хроматографии, получая WX004-3. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 6.39 (s, 1H), 5.42 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.84-5.03 (m, 4H), 4.38 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.12 (s, 9H).

Стадия 3. Синтез WX004-4

В реакционную колбу вносили тетрагидрофуран (56 мл), WX004-3 (5,6 г, 11,07 ммоль, чистота 73%, 1 экв.) и трибутилфосфин (4,48 г, 22,14 ммоль, 5 ,46 мл, 2 экв.). По завершении растворения заменяли атмосферу газообразным азотом. Смесь охлаждали до 0°C и медленно добавляли диизопропилазодикарбоксилат (4,48 г, 22,14 ммоль, 4,30 мл, 2 экв.). Смесь медленно нагревали до 20°C и инкубировали в течение 2 часов. По завершении реакции в реакционный раствор добавляли воду (60 мл) и экстрагировали смесь этилацетатом (3×30 мл). Органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали досуха на роторном испарителе при 45°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом колоночной хроматографии, получая WX004-4. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 5.30 (d, J=7.6 Hz, 1H), 4.75-4.87 (m, 3H), 4.61 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 4.22 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 1.27 (s, 9H).

Стадия 4. Синтез WX004-5

В реакционную колбу вносили WX004-4 (500 мг, 1,42 ммоль, 1 экв.), тетрагидрофуран (8,3 мл), воду (1,6 мл) и йод (72,25 мг, 284, 67 мкмоль, 57,34 мкл, 0,2 экв.). Заменяли атмосферу газообразным азотом и инкубировали смесь при 30°C в течение 16 часов. По завершении реакции получали реакционный раствор, содержащий WX004-5, который непосредственно использовали в следующей реакции.

Стадия 5. Синтез WX004-6

В полученный на стадии 4 реакционный раствор, содержащий WX004-5, последовательно добавляли тетрагидрофуран (8,3 мл), воду (1,6 мл), ди-трет-бутилдикарбонат (465,00 мг, 2,13 ммоль, 489,47 мкл, 1,5 экв.) и карбонат натрия (301,10 мг, 2,84 ммоль, 2 экв.) и инкубировали смесь при 25°C в течение 4 часов. По завершении реакции реакционный раствор гасили водой (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×5 мл). Органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали досуха на роторном испарителе при 45°C, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом колоночной хроматографии, получая WX004-6. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 5.46 (br d, J = 5.8 Hz, 1H), 5.32 (br d, J = 6.3 Hz, 1H), 4.64 (br d, J = 6.3 Hz, 1H), 4.55 (br d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.49 (br d, J = 9.5 Hz, 2H), 1.47-1.57 (m, 9H).

Стадия 6. Синтез WX004-7

В сухую реакционную колбу вносили WX004-6 (150 мг, 431,99 мкмоль, 1 экв.), триоксид хрома (86,39 мг, 863,99 мкмоль, 32,00 мкл, 2 экв.) и уксусную кислоту (3 мл) и инкубировали смесь при 25°C в течение 12 часов. По завершении реакции реакционный раствор разбавляли водой (3 мл) и трижды экстрагировали дихлорметаном (по 5 мл). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором NaCl (5 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом колоночной хроматографии, получая WX004-7.

Стадия 7. Синтез WX004-8

В сухую реакционную колбу вносили WX004-7 (70 мг, 193,79 мкмоль, 1 экв.), дихлорметан (1 мл) и трифторуксусную кислоту (287,47 мг, 2,52 ммоль, 186,67 мкл, 13,01 экв.) и инкубировали смесь при 25°C в течение 1 часа. По завершении реакции реакционный раствор непосредственно упаривали, получая неочищенный продукт, который очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, получая WX004-8. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.59 (br, s, 1H), 4.89 (s, 4H).

Стадия 8. Синтез WX004-10

В сухую реакционную колбу вносили WX004-8 (45 мг, 172,35 мкмоль, 1 экв.), N,N-диметилформамид (2 мл), карбонат цезия (84,23 мг, 258,53 мкмоль, 5 экв.) и WX004-9 (39,09 мг, 206,82 мкмоль, 25,39 мкл, 1,2 экв.). Заменяли атмосферу газообразным азотом и инкубировали смесь при 25°C в течение 12 часов. По завершении реакции реакционный раствор разбавляли водой (2 мл) и трижды экстрагировали дихлорметаном (по 2 мл). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором NaCl (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса, получая неочищенный продукт, который очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, получая WX004-10.

Стадия 9. Синтез WX004

В сухую реакционную колбу вносили WX004-10 (45 мг, 121,88 мкмоль, 1 экв.), A-1 (62,24 мг, 134,07 мкмоль, 1,1 экв.) и толуол (1 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, а затем добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (28,17 мг, 24,38 мкмоль, 0,2 экв.). Смесь нагревали до 125°C и инкубировали в течение 16 часов. По завершении реакции реакционный раствор непосредственно упаривали, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, а затем очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматографическая колонка: Waters Xbridge BEH C18, 100×30 мм×10 мкм; подвижная фаза: [H₂O с 10 мМ бикарбонатом аммония-ацетонитрил]; ацетонитрил: 25%-45%, 8 мин), получая WX004.

Пример 5

Схема синтеза:

Стадия 1. Синтез WX005-1

В сухую реакционную колбу вносили WX004-8 (300 мг, 1,15 ммоль, 1 экв.), N,N-диметилформамид (6 мл), карбонат цезия (561,55 мг, 1,72 ммоль, 5 экв.) и WX001-6 (283,32 мг, 1,38 ммоль, 180,46 мкл, 1,2 экв.). Заменяли атмосферу газообразным азотом и инкубировали смесь при 25°C в течение 16 часов. По завершении реакции реакционный раствор разбавляли водой (10 мл) и трижды экстрагировали этилацетатом (по 20 мл). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором NaCl (5×20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом колоночной хроматографии, получая WX005-1. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 7.42 (s, 1H), 7.32-7.40 (m, 2H), 7.26-7.32 (m, 1H), 4.98 (s, 2H), 4.79-4.89 (m, 4H).

Стадия 2. Синтез WX005

В сухую реакционную колбу вносили WX005-1 (30 мг, 77,79 мкмоль, 1 экв.), A-1 (39,72 мг, 85,57 мкмоль, 1,1 экв.) и толуол (1 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, а затем добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (17,98 мг, 15,56 мкмоль, 0,2 экв.). Смесь нагревали до 125°C и инкубировали в течение 16 часов. Еще добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (8,99 мг, 7,78 мкмоль, 0,1 экв.) и инкубировали смесь при 125°C в течение 3 часов. По завершении реакции реакционный раствор непосредственно упаривали, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, а затем очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматографическая колонка: Waters Xbridge BEH C18, 100×30 мм×10 мкм; подвижная фаза: [вода с 10 мМ бикарбонатом аммония-ацетонитрил]; ацетонитрил: 25%-55%, 8 мин), получая WX005.

Пример 6

Схема синтеза:

Стадия 1. Синтез WX006-2

В сухую реакционную колбу вносили WX004-10 (105 мг, 284,39 мкмоль, 1 экв.), тетрагидрофуран (1 мл) и хлорид цинка (0,7 М, 406,27 мкл, 1 экв.). Заменяли атмосферу газообразным азотом и добавляли н-бутиллитий (2,5 М, 170,64 мкл, 1,5 экв.) при -30°C. Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 часа, а затем охлаждали до -30°C. Добавляли раствор B-1 (75,68 мг, 284,39 мкмоль, 1 экв.) и тетракис(трифенилфосфин)палладия (16,43 мг, 14,22 мкмоль, 0,05 экв.) в тетрагидрофуране (0,5 мл), нагревали смесь до 60°C и инкубировали в течение 16 часов. По завершении реакции в реакционный раствор добавляли 2 мл насыщенного водного раствора хлорида аммония и экстрагировали смесь этилацетатом (3×5 мл). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором NaCl (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали, растирая с 2 мл метил-трет-бутилового эфира, получая WX006-2. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 8.77 (s, 1H), 7.37-7.42 (m, 1H), 7.20 (br d, J = 8.6 Hz, 3H), 5.04 (s, 2H), 4.94 (d, J =7.5 Hz, 2H), 4.86 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.64 (s, 3H), 2.62 (s, 3H).

Стадия 2. Синтез WX006-3

В сухую реакционную колбу вносили WX006-2 (20 мг, 46,67 мкмоль, 1 экв.) и дихлорметан (1 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, а затем добавляли м-хлорпероксибензойную кислоту (30,20 мг, 140,02 мкмоль, чистота 80%, 3 экв.) при 0°C. Смесь медленно нагревали до 25°C и инкубировали в течение 3 часов. По завершении реакции в реакционный раствор добавляли насыщенный раствор тиосульфата натрия (10 мл) до тех пор, пока крахмальная индикаторная бумажка с KI не посинеет. Смесь разбавляли дихлорметаном (10 мл). Проводили разделение слоев. Затем собирали органическую фазу, которую промывали 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 10 мл насыщенного раствора NaCl, соответственно, сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали досуха на роторном испарителе, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, получая WX006-3. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.20 (s, 1H), 7.37-7.45 (m, 1H), 7.21 (br d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.09-7.15 (m, 1H), 5.05(s, 2H), 4.93-4.96 (m, 2H), 4.89-4.91 (m, 2H), 3.51 (s, 3H), 2.82 (s, 3H).

Стадия 3. Синтез WX006

В сухую реакционную колбу вносили WX006-3 (28 мг, 60,80 мкмоль, 1 экв.), A-1-3 (11,81 мг, 121,61 мкмоль, 2 экв.), дихлорметан (1 мл) и тетрагидрофуран (1 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом и добавляли гексаметилдисилазид лития (1 М, 127,69 мкл, 2,1 экв.) при -30°C. Смесь инкубировали при 25°C в течение 1 часа. По завершении реакции в реакционный раствор добавляли 1 мл воды. Органический растворитель в реакционном растворе упаривали на роторном испарителе, а твердые вещества выпадали в осадок. Смесь фильтровали и собирали твердые частицы, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматографическая колонка: Waters Xbridge BEH C18 100×25 мм×5 мкм; подвижная фаза: [H₂O с 10 мМ бикарбонатом аммония-ацетонитрил]; ацетонитрил: 25%-60%, 10 мин), получая WX006.

Пример 7

Схема синтеза:

Стадия 1. Синтез WX007-1

В сухую реакционную колбу вносили WX005-1 (100 мг, 259,29 мкмоль, 1 экв.), хлорид цинка (0,7 М, 370,42 мкл, 1 экв.) и тетрагидрофуран (1,5 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, а затем охлаждали смесь до -30°C. Добавляли н-бутиллитий (2,5 М, 155,58 мкл, 1,5 экв.) и инкубировали смесь при 20°C в течение 1 часа. Затем охлаждали смесь до -30°C. Медленно по каплям добавляли раствор тетракис(трифенилфосфин)палладия (14,98 мг, 12,96 мкмоль, 0,05 экв) и B-1 (69,00 мг, 259,29 мкмоль, 1 экв) в тетрагидрофуране (0,5 мл) и инкубировали смесь при 60°C в течение 15 часов. По завершении реакции реакционный раствор гасили 5 мл насыщенного раствора хлорида аммония и трижды экстрагировали этилацетатом (по 10 мл). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором NaCl (10 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали при пониженном давлении с помощью водяного насоса, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, получая WX007-1. ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 8.78 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.30-7.42 (m, 3H), 5.03 (s, 2H), 4.91-4.96 (m, 2H), 4.83-4.89 (m, 2H), 2.59-2.71 (m, 6H).

Стадия 2. Синтез WX007-2

В сухую реакционную колбу вносили WX007-1 (40 мг, 89,90 мкмоль, 1 экв.) и дихлорметан (1 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом, а затем добавляли м-хлорпероксибензойную кислоту (58,18 мг, 269,69 мкмоль, чистота 80%, 3 экв.) при 0°C. Смесь медленно нагревали до 25°C и инкубировали в течение 3 часов. По завершении реакции в реакционный раствор добавляли насыщенный раствор тиосульфата натрия (10 мл) до тех пор, пока крахмальная индикаторная бумажка с KI не посинеет. Раствор этой смеси разбавляли дихлорметаном (10 мл). Проводили разделение слоев. Затем собирали органическую фазу, которую промывали 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 10 мл насыщенного раствора NaCl, соответственно, сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали досуха на роторном испарителе, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали методом тонкослойной хроматографии на покрытой силикагелем пластинке, получая WX007-2.

Стадия 3. Синтез WX007

В сухую реакционную колбу вносили WX007-2 (35 мг, 73,38 мкмоль, 1 экв.), A-1-3 (14,97 мг, 154,10 мкмоль, 2,1 экв.), дихлорметан ( 0,5 мл) и тетрагидрофуран (0,5 мл). Заменяли атмосферу газообразным азотом. Смесь охлаждали до 0°C и по каплям добавляли гексаметилдисилазид лития (1 М, 146,76 мкл, 2 экв.). Смесь инкубировали при 0°C в течение 0,5 часа и еще 1 час при 25°С. По завершении реакции реакционный раствор гасили 10 мл воды и экстрагировали 20 мл дихлорметана. Проводили разделение слоев. Собирали органическую фазу, а водную фазу экстрагировали дихлорметаном (3×20 мл). Органические фазы объединяли, а затем последовательно промывали насыщенным раствором NaCl (3×20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и упаривали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматографическая колонка: Phenomenex Gemini-NX C18, 75×30 мм×3 мкм; подвижная фаза: [H₂O с 10 мМ бикарбонатом аммония-ацетонитрил]; ацетонитрил: 35%-55%, 8 мин), получая WX007.

В табл. 1 представлены данные спектров ¹H-ЯМР и масс-спектров из каждого примера.

Таблица 1 Пример Соединение ЯМР MS m/z 1 WX001A ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.81 (br s, 1H), 8.70 (d, J=4.9 Hz, 1H), 7.55 (d, J=5.0 Hz, 1H), 7.25-7.45 (m, 5H), 6.32 (s, 1H), 4.67-4.83 (m, 2H), 3.99-4.13 (m, 2H), 3.82-3.88 (m, 1H), 3.76-3.81 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.35-2.45 (m, 2H). 494,2
[M+H]⁺ WX001B ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.80 (br s, 1H), 8.69 (d, J=4.9 Hz, 1H), 7.55 (d, J=4.9 Hz, 1H), 7.25-7.46 (m, 5H), 6.32 (d, J=1.6 Hz, 1H), 4.67-4.84 (m, 2H), 3.98-4.14 (m, 2H), 3.83-3.88 (m, 1H), 3.76-3.81 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.33-2.45 (m, 2H). 494,1
[M+H]⁺ 2 WX002 ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.81 (s, 1H), 8.71 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.42 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.30-7.40 (m, 3H), 6.34 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 4.81 (s, 2H), 4.07 (br dd, J = 12.1, 4.0 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.57 (br t, J = 12.0 Hz, 2H), 2.23-2.31 (m,, 4.5 Hz, 2H), 1.40 (br d, J = 12.7 Hz, 2H). 508,3
[M+H]⁺ 3 WX003 ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 8.54 (br d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.51-7.69 (m, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.30-7.39 (m, 3H), 7.28 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.80 (s, 2H), 4.06 (br dd, J = 12.9, 3.9 Hz, 3H), 3.90 (br d, J = 11.0 Hz, 2H), 3.53-3.64 (m, 2H), 3.37-3.51 (m, 2H), 2.22-2.29 (m, 4.6 Hz, 2H), 1.82-1.94 (m, 2H), 1.51-1.63 (m, 2H), 1.40 (br d, J = 12.7 Hz, 2H). 512,3
[M+H]⁺ 4 WX004 ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.84 (br s, 1H), 8.70 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 7.36-7.44 (m, 2H),7.15-7.21 (m, 2H), 7.06-7.15 (m, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.03 (s, 2H), 4.89-4.95 (m, 2H), 4.83-4.88 (m, 2H), 3.74 (s, 3H). 464,0
[M+H]⁺ 5 WX005 ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.84 (br s, 1H), 8.71 (d, J=4.9 Hz, 1H), 7.55 (d, J=5.0 Hz, 1H), 7.29-7.46 (m, 5H), 6.35 (d, J=1.5 Hz, 1H), 5.02 (s, 2H), 4.89-4.94 (m, 2H), 4.84-4.89 (m, 2H), 3.74 (s, 3H). 480,1
[M+1]⁺ 6 WX006 ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.68 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.37-7.43 (m, 2H), 7.16-7.21 (m, 2H), 7.08-7.15 (m, 1H), 6.36 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.03 (s, 2H), 4.94 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 4.83 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.58 (s, 3H). 478,1
[M+1]⁺ 7 WX007 ¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ (ppm) 9.66 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.28-7.46 (m, 5H), 6.36 (s, 1H), 5.02 (s, 2H), 4.94 (d, J=7.3 Hz, 2H), 4.83 (d, J=7.3 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.59 (s, 3H). 494,1
[M+1]⁺

Тест-пример 1. Анализ активности киназы in vitro

1. Цель исследования

Измеряли способность соединений ингибировать активность киназы ERK2.

2. Буфер для анализа

20 мМ Hepes (рН 7,5), 10 мМ MgCl₂, 1 мМ этиленбис(оксиэтиленнитрило)тетрауксусная кислота (EGTA), 0,02% Brij35, 0,02 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,1 мМ Na₃VO₄, 2 мМ дитиотреитол (DTT), 1% DMSO.

3. Обработка соединений

Исследуемые соединения растворяли в 100% DMSO, получая маточные растворы в определенной концентрации. Делали серийные разведения соединений в растворе DMSO с помощью смарт-пипетки Integra Viaflo Assist.

4. Методика исследования

1) Готовили субстрат MBP в свежеприготовленном буфере для реакции.

2) В данный раствор MBP добавляли киназу ERK2 и осторожно перемешивали.

3) В систему для киназной реакции вносили соединения, растворенные в 100% DMSO, по ультразвуковой технологии (Echo550; диапазон: нанолитры), и инкубировали смеси при комнатной температуре в течение 20 минут.

4) В реакционную систему добавляли ³³P-АТФ (удельная концентрация: 10 мкКи/мкл) и сразу же запускали реакцию.

5) Инкубировали смеси при комнатной температуре в течение 2 часов.

6) Определяли уровень радиоактивности методом связывания на фильтре.

7) Рассчитывали активность киназы ERK2 как отношение остающейся в исследуемом образце активности киназы к активности киназы в контрольной группе (DMSO). Строили кривые с помощью Prism (программное обеспечение GraphPad) и рассчитывали значения IC₅₀.

Результаты исследования представлены в табл. 2.

Таблица 2. Результаты анализа активности киназы in vitro Соединение ERK2 IC₅₀ (нM) WX001A 0,31 WX001B 0,32 WX002 0,40 WX003 0,29 WX004 1,10 WX005 0,36 WX006 0,94 WX007 0,48

Вывод. Соединения по настоящему изобретению проявляют превосходную активность ингибирования киназы ERK2.

Тест-пример 2. Анализ ингибирования пролиферации клеток in vitro

1. Цель исследования

Измеряли способность соединений ингибировать пролиферацию раковых клеток НТ29.

2. Обработка соединений

Исследуемые соединения растворяли в 100% DMSO, получая 10 мМ маточные растворы.

3. Методика и стадии исследования

1) Включали УФ-освещение в кабинете биологической безопасности и начинали отсчет 30 минут.

2) На водяной бане подогревали среду RPMI 1640 и трипсин при 37°C.

3) По завершении УФ-облучения открывали кабинет биологической безопасности. Подогретую среду, трипсин и фосфатно-солевой буфер (PBS) и т.д. протирали спиртом и помещали в кабинет биологической безопасности.

4) Извлекали клетки НТ29 из инкубатора и удаляли старую среду в кабинете биологической безопасности. Добавляли 10 мл PBS. Смесь осторожно встряхивали, а затем удаляли PBS.

5) Добавляли 1,5 мл подогретого 0,25% трипсина. Встряхивали горизонтально сосуд для культивирования с тем, чтобы трипсин равномерно покрывал клетки на дне, и помещали в инкубатор на 2 минуты.

6) Останавливали расщепление клеток добавлением полной среды, пипеткой доводили суспензию клеток до гомогенности и проводили подсчет клеток.

7) По результатам подсчета клеток доводили плотность клеточной суспензии до 1500 клеток на лунку и высеивали суспензию клеток по 50 мкл на лунку.

8) Делали серийные разведения маточных растворов соединений в растворе DMSO и вносили соединения на планшет с помощью Tecan.

9) Уравновешивали планшет с клетками и добавленными соединениями и CellTiterGlo при комнатной температуре, а затем в каждую лунку добавляли 25 мкл CellTiterGlo. Планшет с клетками встряхивали 1-2 минуты, а затем оставляли на 10 минут. Затем определяли значения сигналов. Данные анализировали с помощью XL-Fit и рассчитывали IC₅₀ для каждого соединения.

4. Результаты исследования представлены в табл. 3.

Таблица 3. Результаты анализа активности на клетках in vitro Соединение HT29 IC₅₀ (нM) WX001A 21 WX001B 26 WX002 73 WX003 69 WX004 125 WX005 49 WX006 14 WX007 11

Вывод. Соединения по настоящему изобретению проявляют превосходную активность ингибирования пролиферации клеток HT29.

Тест-пример 3. Исследование DMPK in vivo

Исследование DMPK in vivo на мышах.

1. Цель исследования

Определение концентрации соединений в крови и оценка фармакокинетического поведения после однократного введения, используя самок мышей BALB/c в качестве подопытных животных.

2. Процедура исследования

Отбирали 8 здоровых взрослых самок мышей BALB/c, причем 4 мыши были в группе внутривенного введения и 4 мыши - в группе перорального введения. Носителем в группе внутривенного введения был 5% DMSO + 95% (20% HP-β-CD). Исследуемые соединения смешивали с соответствующим количеством носителя для внутривенной инъекции, обрабатывали на вибромешалке и ультразвуком, получая прозрачный раствор в 0,5 мг/мл. Прозрачный раствор фильтровали через микропористую мембрану и готовили к использованию. Носителем в группе перорального введения был 5% DMSO + 95% (20% HP-β-CD). Исследуемые соединения смешивали с носителем, обрабатывали на вибромешалке и ультразвуком, получая раствор в 0,3 мг/мл. Мышам вводили по 1 мг/кг внутривенно или 3 мг/кг перорально, а затем в течение определенного времени собирали цельную кровь. Выделяли плазму. Концентрацию препаратов анализировали методом LC-MS/MS, а фармакокинетические параметры рассчитывали с помощью программы Phoenix WinNonlin (Pharsight, США).

Примечания. DMSO: диметилсульфоксид; HP-β-CD: гидроксипропил-β-циклодекстрин.

3. Результаты исследования представлены в табл. 4.

Таблица 4. Результаты анализа ФК соединений Соединение C_max (нМ) F% Пероральный DNAUC (нM·ч/mpk) Vd_ss (л/кг) Cl (мл/мин/кг) T_½ (ч) WX006 1400 70% 1356 1,7 17,2 1,4 WX007 595 46% 1086 1,7 14,4 1,3

Примечания. C_max - максимальная концентрация; F% - пероральная биодоступность; DNAUC = AUC_PO/доза, где AUC_PO - AUC при пероральном введении, а доза - доза препарата; Vd_ss - объем распределения; Cl - скорость клиренса; а T_½ - период полувыведения.

Вывод. Соединения по настоящему изобретению проявляют превосходную пероральную экспозицию и биодоступность.

Тест-пример 4. Анализ эффективности in vivo на модели подкожных ксенотрансплантатов клеток HCT-116 рака толстой кишки человека у мышей BALB/c nude

1. Цель исследования

Оценка противоопухолевого действия WX007 на модели подкожных ксенотрансплантатов клеток HCT-116 рака толстой кишки человека у мышей nude.

2. Животные для исследования

Вид: мышь; линия: мыши BALB/c nude; возраст: 6-8 недель; пол: самки; вес: 17-23 грамм; поставщик: Отдел содержания лабораторных животных, Шанхайский институт биомедицинских и фармацевтических технологий; сертификат на животных № 20180006020214.

3. Процедура исследования

1) Клетки и их культивирование. Клетки HCT-116 рака толстой кишки человека культивировали в монослое in vitro. Условия культивирования: среда McCoy's 5a плюс 10% фетальной телячьей сыворотки и инкубатор на 37°C с 5% CO₂. Обычно для пересева проводилась обработка клеток трипсином с ЭДТА три раза в неделю. Когда конфлюэнтность клеток достигала 80%-90% и их количество соответствовало потребности, клетки собирали, подсчитывали и высеивали.

2) Инокуляция опухолевой ткани и разбивка на группы. Инокулировали подкожно по 0,2 мл (5×10⁶) клеток HCT-116 в правую подмышечную ямку каждой мыши. Когда средний объем опухолей достигал 149 мм³, животных случайным образом разбивали на 2 группы и начинали введение. Схема распределения по группам и введения при исследовании представлена в табл. 5.

Таблица 5. Схема группирования животных и введения при исследовании Группа Количество животных Препарат Дозировка (мг/кг) Цикл введения Способ и частота введения 1 6 контроль на растворитель (носитель) - 18 дней перорально (PO), один раз в день (QD) 2 6 WX007 15 18 дней перорально (PO), один раз в день (QD)

3) Ежедневное наблюдение подопытных животных. Разработка данной методики исследования и ее модификаций проводилась с одобрения Институтского комитета по содержанию и использованию животных (IACUC). Использование и благосостояние исследуемых животных контролировалось в соответствии с правилами Ассоциации по оценке и аккредитации лабораторий по содержанию животных (AAALAC). Животных ежедневно обследовали на предмет здоровья и смертности. Плановые обследования включали отслеживание роста опухолей и влияния приема препаратов на повседневное поведение животных типа поведенческой активности, приема пищи и воды (только визуальный осмотр), изменения веса (измеряли вес два раза в неделю), внешних признаков или других аномалий. Отмечали гибель животных и побочные эффекты в каждой группе, исходя из количества животных в каждой группе.

4) Рецептуры исследуемых соединений. Группа носителя: кукурузное масло. Группа исследуемого соединения: делали навеску исследуемого соединения в рецептурном флаконе. Добавляли соответствующий объем кукурузного масла, а затем обрабатывали смесь на вибромешалке до получения прозрачного раствора. Соединения готовили раз в неделю.

5) Измерение опухолей и показателей при исследовании. a) Измеряли диаметр опухолей два раза в неделю с помощью штангенциркуля. Рассчитывали объем опухолей по формуле: TV=1/2×a×b², где a и b -длинный и короткий диаметр опухоли, соответственно. b) Определяли эффективность ингибирования опухолей соединениями по TGI (%). TGI (%) отражает степень ингибирования роста опухоли. TGI (%) рассчитывали следующим образом: TGI (%) = {[1 - (средний объем опухолей под конец введения в опытной группе - средний объем опухолей в начале введения в той же опытной группе)]/(средний объем опухолей под конец обработки в контрольной группе растворителя - средний объем опухолей в начале обработки в контрольной группе растворителя)}×100%.

4. Результаты исследования

1) Как видно из табл. 6 и фиг. 1, на модели подкожных ксенотрансплантатов клеток HCT-116 рака толстой кишки человека у мышей nude, при пероральном введении до 18-го дня, WX007 в дозе 15 мг/кг оказывал значительное ингибирующее действие на рост опухолей со значением TGI = 62%.

2) В качестве показателя для косвенного определения токсичности препарата использовали вес тела исследуемых животных. Как видно из фиг. 2, при введении до 18-го дня, у всех животных в контрольной группе растворителя и в группе WX007 при 15 мг/кг не было существенного снижения веса тела и не отмечалось болезненности или смертности.

Таблица 6. Результаты по эффективности in vivo на модели HCT116 у мышей Группа Препарат TGI 2 WX007 (15 мг/кг, PO, QD) 62%

Заключение. Соединения по настоящему изобретению могут значительно ингибировать рост опухолей. При введении не наблюдается существенного снижения веса тела животных, и переносимость хорошая.

Изобретение относится к спиросоединению общей формулы (III) и его фармацевтически приемлемым солям, обладающим ингибирующей активностью по отношению к киназе ERK. В указанной формуле n равно 0 или 1; m равно 1 или 2; кольцо А означает T₁ означает N, Т₂ и Т₃ каждый означает СН; E₁ означает О; R₁ выбирают из Н или C_1-3-алкила; R₂ и R₃ каждый независимо выбирают из Н и C_1-3-алкила; R₄ означает Н; R₅, R₇, R₈ и R₉ каждый независимо выбирают из Н и C_1-3-алкила; R₆ выбирают из F, Cl, Br, I. Изобретение также относится к применению соединения общей формулы (III) при приготовлении лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с ERK, лекарственному средству, обладающему ингибирующей активностью в отношении киназ ERK. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 11 пр.

1. Соединение формулы (III) или его фармацевтически приемлемая соль:

,

где: n равно 0 или 1;

m равно 1 или 2;

кольцо А означает

T₁ означает N,

Т₂ и Т₃ каждый означает СН;

E₁ означает О;

R₁ выбирают из Н или C_1-3-алкила;

R₂ и R₃ каждый независимо выбирают из Н и C_1-3-алкила;

R₄ означает Н;

R₅, R₇, R₈ и R₉ каждый независимо выбирают из Н и C_1-3-алкила;

R₆ выбирают из F, Cl, Br, I.

2. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где R₁ выбирают из Н и СН₃.

3. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 2, где R₁ означает СН₃.

4. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где R₂ и R₃ каждый независимо выбирают из Н и СН₃.

5. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где R₂ означает Н.

6. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где R₅, R₇, R₈ и R₉ каждый независимо выбирают из Н, СН₃ и -СН₂-СН₃.

7. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 6, где R₅, R₇, R₈ и R₉ каждый означает Н.

8. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где R₆ выбирают из F и Cl.

9. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где структурная группировка означает или

10. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где кольцо А означает

11. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-9, где соединение выбрано из:

где m, n, E₁, T₁, Т₂ и Т₃ уже определены в п. 1; R₁ определен в любом из пп. 1-3;

R₂ определен в пп. 1, 4 или 5;

R₃ определен в п. 1 или 4;

R₄ определен п. 1;

R₅, R₇, R₈ и R₉ определены в пп. 1, 6 или 7;

R₆ определен в п. 1 или 8.

12. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 11, где соединение выбрано из:

или

где R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, E₁, T₁, T₂ и Т₃ уже определены в п. 11.

13. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 11, где соединение выбрано из:

где R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, E₁, T₁, Т₂ и Т₃ уже определены в п. 11.

14. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 13, где соединение выбрано из:

где R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ и R₉ уже определены в п. 11.

15. Соединение, представленное следующей формулой, или его фармацевтически приемлемая соль:

16. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 15, где соединение выбрано из:

17. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-16 при изготовлении лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с ERK.

18. Лекарственное средство, обладающее ингибирующей активностью в отношении киназ ERK, содержащее соединение или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп. 1-16.