ПОЛНОСТЬЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧНОЕ K ИНТЕРЛЕЙКИНУ 1-АЛЬФА Российский патент 2025 года по МПК A61K39/395 C07K16/24 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В данной заявке испрашивается приоритет согласно патентной заявке Канады под номером 3095675, поданной 7 октября 2020 г., полное содержание которой тем самым включено посредством ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ КАСАТЕЛЬНО ФЕДЕРАЛЬНО-СПОНСИРУЕМОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Нет данных.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение в целом относится к областям иммунологии и антител (Ab).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интерлейкин 1 альфа (IL 1α) представляет собой провоспалительный цитокин, который играет роль в ряде различных активностей, включая воспаление, иммунные ответы, метастазирование опухолей и гемопоэз. Представляющие собой иммуноглобулин G (IgG) аутоантитела к IL-1α встречаются в природе в общей популяции людей, и считается, что они оказывают полезное действие в ряде различных заболеваний, которые включают стерильное воспаление.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Раскрыта аминокислотная последовательность вариабельной области легкой и тяжелой цепей моноклонального Ab (mAb), которое связывается с IL-1α человека с высокой аффинностью. Соответственно, здесь описаны очищенные mAb человека, содержащие (1) антигенсвязывающую вариабельную область, которая проявляет очень высокую аффинность связывания с IL-1α человека, и (2) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 1 (или ее определяющие комплементарность участки (CDR)), и тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2 (или ее CDR).

Кроме того, здесь описан набор выделенных нуклеиновых кислот, включающий первую нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь mAb человека, которое специфически связывается с IL-1α, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь mAb человека, которое специфически связывается с IL-1α человека. Первая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 1 (или ее CDR), а вторая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2 (или ее CDR).

Согласно другому аспекту здесь описаны экспрессирующие векторы, которые включают как нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 1 (или ее CDR), так и нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2 (или ее CDR). Кроме того, здесь описан набор экспрессирующих векторов, включающий первый экспрессирующий вектор, кодирующий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO:1 (или ее CDR), и второй экспрессирующий вектор, кодирующий аминокислотную последовательность c SEQ ID NO: 2 (или ее CDR).

Кроме того, здесь описана выделенная клетка-хозяин (например, клетка млекопитающего, такая как клетка яичников китайского хомячка (CHO)), содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 1 (или ее CDR), и нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность c SEQ ID NO: 2 (или ее CDR).

Если не указано иное, все технические термины, использованные в данном описании, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится данное изобретение. Общепринятые определения биологических терминов можно найти в Riegel et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New-York, 1991; и Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994.

Использование в этом описании существительного в единственном числе означает одно или более чем одно конкретное существительное. Например, термин «антитело» означает «одно или более антител».

Под термином «антитело» или «Ab» понимают любой иммуноглобулин (например антитела человека, грызунов, хрящевых рыб или верблюдов) или его конъюгат, который специфически связывается с антигеном (например с IL-1α человека). Специалистам в данной области техники известны самые разнообразные Ab. Неограничивающие примеры Ab включают: моноклональные Ab (в том числе, например, полноразмерные Ab), поликлональные Ab, мультиспецифические Ab (например биспецифические Ab), одноцепочечные Ab (например однодоменные Ab, верблюжьи Ab и Ab хрящевых рыб), химерные (например гуманизированные) Ab и полностью человеческие Ab, в том числе те, которые могут быть обнаружены или индуцированы у людей (т.е. полностью человеческие Ab). Термин «антитело» также включает конъюгаты на основе Ab (например, Ab, конъюгированное со стабилизирующим белком, меткой или терапевтическим агентом (например с любым из терапевтических агентов, описанных здесь или известных в данной области техники)).

Под термином «антигенсвязывающий фрагмент» понимают любую часть полноразмерного Ab, которая содержит по меньшей мере один вариабельный домен [например вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина млекопитающего (например человека, мыши, крысы, кролика или козы), вариабельный антигенсвязывающий домен тяжелой цепи антител верблюдовых (VHH) или домен иммуноглобулинового нового антигенного рецептора (Ig-NAR) хрящевых рыб], способный специфически связываться с антигеном, Например, антигенсвязывающий фрагмент, описанный здесь, может включать по меньшей мере часть Fc области Ab, которой достаточно для опосредования антителозависимой клеточно опосредованной цитотоксичности (ADCC) и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC) у млекопитающего (например человека), и/или может быть конъюгирован с терапевтическим агентом (например с любым из терапевтических агентов, описанных здесь или известных в данной области техники). В качестве другого примера антигенсвязывающий фрагмент, описанный здесь, может включать по меньшей мере часть Fc-области Ab, которая не опосредует ADCC и/или CDC у млекопитающего (например человека). Неограничивающие примеры фрагментов Ab включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, диатела, линейные антитела и мультиспецифические Ab, образованные из фрагментов Ab. Дополнительные фрагменты Ab, содержащие по меньшей мере один VHH домен верблюдовых или по меньшей мере один Ig-NAR домен хрящевых рыб, включают минитела, микроантитела, субнаноантитела и наноантитела и любую из других форм Ab, описанных в публикации заявки на патент США №2010/0092470.

Под термином «человеческое антитело» понимают Ab, которое кодируется нуклеиновой кислотой (например, преобразованным локусом, кодирующим тяжелую или легкую цепь иммуноглобулина человека), присутствующей в геноме человека. В некоторых воплощениях человеческое Ab продуцируется в культуре клеток млекопитающего (например человека) (например, в линии клеток яичника китайского хомячка). В некоторых воплощениях человеческое Ab продуцируется в клетке, не являющейся клеткой человека (например, в линии клеток мышей или хомяков). В некоторых воплощениях человеческое Ab продуцируется в бактериальной или дрожжевой клетке.

Под термином «одноцепочечное антитело» понимают одиночный полипептид, содержащий по меньшей мере один вариабельный связывающий домен, который способен специфически связываться с антигеном. Неограничивающие примеры одноцепочечных Ab описаны здесь и известны в данной области техники (см., например, антитела, описанные в публикации заявки на патент США №2010/0092470).

В случае связывания с конкретным антигеном, Ab или его антигенсвязывающий фрагмент «специфически связывается» или «связывается специфически» с этим антигеном, например IL-1α человека (через эпитоп, который связывается с полноразмерным антителом, содержащим вариабельные области легкой и тяжелой цепей, описанные здесь), но при этом другие молекулы в образце распознает и связывает в меньшей степени (например, не распознает и не связывает). В некоторых воплощениях Ab или его антигенсвязывающий фрагмент избирательно связывается с эпитопом с аффинностью (с константой диссоциации (KD)), равной или ниже 1×10^-10 М (например ниже 1×10^-11 м или ниже 1×10^-12 М), в забуференном фосфатом физиологическом растворе (например, как определено с использованием поверхностного плазмонного резонанса). Способность Ab или антигенсвязывающего фрагмента специфически связываться с эпитопом белка можно определить, используя любой из способов, известных в данной области техники, или способов, изложенных в данном описании.

Под термином «определяющий комплементарность участок» или «CDR» понимают участок в Ig (тяжелой или легкой цепи Ig), который образует часть антигенсвязывающего сайта в Ab или его антигенсвязывающем фрагменте Как известно в данной области техники, тяжелая цепь Ig содержит три CDR: CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, и легкая цепь Ig содержит три CDR: CDR1, CDR2 и CDR3. В любом Ab или его антигенсвязывающем фрагменте три CDR тяжелой цепи Ig и три CDR легкой цепи Ig совместно образуют антигенсвязывающий сайт в Ab или в его антигенсвязывающем фрагменте. База данных по Rabat представляет собой одну из систем, используемых в данной области техники для нумерации аминокислотных остатков в последовательностях CDR, присутствующих в легкой цепи Ig или в тяжелой цепи Ig.

Несмотря на то, что при практическом применении или тестировании настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все заявки и публикации, упомянутые в данном описании, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае противоречия, описание настоящего изобретения, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, конкретные воплощения, обсуждаемые ниже, приведены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Далее будут описаны, только в качестве примера, воплощения настоящего изобретения со ссылкой на прилагаемые графические материалы.

На Фиг. 1 представлен график, демонстрирующий результаты анализа с использованием системы Octet Red 96 показавшие, что аффинность связывания (KD) XIA11 с IL-1α составляла 7,02×10^-11 М.

На Фиг. 2 представлен график, демонстрирующий результаты анализа с использованием системы Octet Red 96 показавшие, что аффинность связывания (KD) XIA11 с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) составляла 2,10×10^-7 М.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Здесь описаны композиции и способы, относящиеся к полностью (истинным) человеческим mAb, включающим антигенсвязывающую вариабельную область, которая демонстрирует очень высокую аффинность связывания с IL-1α. Описанные ниже предпочтительные воплощения иллюстрируют адаптацию этих композиций и способов. Тем не менее, исходя из описания этих воплощений и на основании приведенного ниже описания, могут быть выполнены и/или реализованы на практике другие аспекты изобретения.

Здесь описаны способы, включающие традиционные методы иммунологии и молекулярной биологии. Как правило, иммунологические методы (например, анализы для детекции и локализации комплексов антиген-Ab, иммунопреципитация, иммуноблоттинг и тому подобные) известны в данной области техники и описаны в методических научных трудах, таких как Current Protocols in Immunology, Coligan et al., ed., John Wiley & Sons, New York. Методы молекулярной биологии подробно описаны в таких научных трудах, как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; и Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., ed., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York. Относящиеся к Ab методы описаны в Handbook of Therapeutic Abs, Dubel, S., ed., Wiley-VCH, 2007. Методы культивирования клеток в общем известны в данной области техники и подробно описаны в методических научных трудах, таких как Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th edition, by R Ian Freshney, Wiley-Liss, Hoboken, N.J., 2000; и General Techniques of Cell Culture, by Maureen A Harrison and Ian F Rae, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 1994.

Методы очистки белков обсуждаются в Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology, Vol. 182, Deutscher M P, ed., Academic Press, San Diego, Calif., 1990.

Раскрыто полностью человеческое mAb, содержащее (1) антигенсвязывающую вариабельную область, которая демонстрирует очень высокую аффинность связывания с IL-1α человека, и (2) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 1 (или ее CDR), и тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO; 2 (или ее CDR). Вариабельные области легкой и тяжелой цепей (которые вместе образуют Fab), описанные здесь, могут быть присоединены к Fc области или ее части с использованием традиционных методов молекулярной биологии для слияния желаемой части Fc с Fab или антигенсвязывающим фрагментом. Таким образом можно создавать полноразмерные иммуноглобулины, такие как IgG1 (например IgG1a или IgG1b), IgG2 (например IgG2a или I_gG2b), IgG3 (например IgG3a или I_gG3b), IgG4 (например IgG4a или IgG4b), IgD, IgA (например IgA1 и IgA2), IgE или IgM (например, димерный, пентамерный и гексамерный) человека (и разные аллотипы перечисленных выше форм), содержащие вариабельные области легкой и тяжелой цепей, описанные здесь.

Для описанных здесь mAb можно провести процедуру созревания аффинности с целью повышения или иного изменения специфичности их связывания, используя известные методы, такие как перетасовка вариабельных доменов тяжелой цепи (VH) и вариабельных доменов легкой цепи (VL) (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783, 1992), случайный мутагенез гипервариабельных участков (HVR) и/или каркасных остатков (Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813, 1994; Schier et al., Gene 169:147-155, 1995; Yelton et al., J.Immunol. 155:1994-2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9, 1995; и Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896, 1992.

Варианты аминокислотной последовательности Ab могут быть получены посредством внесения соответствующих изменений в нуклеотидную последовательность, кодирующую Ab. Помимо этого можно осуществить модификации нуклеиновокислотных последовательностей, кодирующих mAb (например, без изменения аминокислотной последовательности mAb), для усиления продуцирования mAb в определенных системах экспрессии (например, путем устранения интронов и/или оптимизации кодонов для заданной системы экспрессии). Описанные здесь mAb также могут быть модифицированы путем конъюгирования с другим белком (например другим mAb) или небелковой молекулой Например, можно выполнить конъюгирование mAb с водорастворимым полимером, таким как полиэтиленгликоль, или углеродной нанотрубкой (см., Например, Kam et al., Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 102 11600-11605, 2005), См. заявку на патент США под номером 11/754899.

В константную область IgG этих подклассов можно ввести мутации, приводящие к изменению аминокислот. Мутации, приводящие к изменению аминокислот, которые могут быть введены, могут представлять собой, например, такие, которые усиливают связывание с рецепторами FcK (Fc-фрагмента, содержащего мутацию, приводящую к образованию выступа) (как описано, например, в Proc Nat. Acad, Sci, U.S.A., 103(11): 4005-4010, 2006; MAbs, 1 (6): 572-579, 2009; US 2010/0196362; US 2013/0108623; US 2014/0171623; US 2014/0093496; и US 2014/0093959) либо усиливают или ослабляют связывание с FcRn (как описано, например, в J. Biol. Chem., 276(9): 6591-6604, 2001; Int. Immunol., 18(12): 1 759-1 769, 2006; и J. Bid. Chem., 281 (33): 23514-23524, 2006).

Для образования биспецифического Ab необходимо осуществить связывание гетерологических Н-цепей двух типов Существуют: технология выступ-во-впадину (описанная, например, В J. Immunol. Methods, 248(1-2): 7-15, 2001; И J. Biol. Chem., 285(27): 20850-20859, 2010), технология электростатического отталкивания (описанная, например, в WO 06/106905), технология получения антител с доменами, сконструированными путем обмена между цепями (SEEDbody) (описанная, например, в Protein Eng. Des. Set., 23(4): 195-202, 2010), и такие технологии могут быть использованы для связывания гетерологических Н-цепей двух типов с использованием константного домена 3 тяжелой цепи (СН3). Любое из описанных здесь Ab может представлять собой антитело с модифицированными углеводными цепями или с неполным количеством углеводных цепей. Примеры Ab, имеющих модифицированные углеводные цепи, включают антитела, сконструированные посредством изменения гликозилирования (описанные, например, в WO 99/54342), Ab с дефукозилированными углеводными цепями (описанные, например, в WO 00/61739, WO 02/31140, WO 06/067847 и WO 06/067913) и Ab, имеющие углеводную цепь разветвлением в местах расположения остатков N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) (описанные, например, в WO 02/79255). Известные примеры методов получения антител IgG с неполным количеством углеводных цепей включают метод введения мутации, приводящей к замене аспарагина в положении 297 тяжелой цепи согласно нумерации, соответствующей индексу европейской системы (EU) (J. Clin. Pharmacol., 50(5): 494-506, 2010), и метод получения IgG с использованием Е. coli (J. Immunol. Methods, 263(1-2): 133-147, 2002; и J. Biol. Chem., 285(27): 20850-20859, 2010), Кроме того, гетерогенность, обусловленную делецией С концевого остатка лизина в IgG, и гетерогенность, обусловленную неправильным замыканием дисульфидных связей в шарнирной области IgG2, можно уменьшить путем введения аминокислотных делеций/замен (как описано, например, в WO 09/041613). Любое из Ab или любой из антигенсвязывающих фрагментов, описанных здесь, включает по меньшей мере одну аминокислоту (например, одну, две, три, четыре, пять или шесть аминокислот) (например, добавленную, встроенную или замененную аминокислоту, например, не в пределах CDR), которая не присутствует в соответствующем Ab человека. Любое из Ab или любой из антигенсвязывающих фрагментов, описанных здесь, также может содержать делецию по меньшей мере одной аминокислоты (например, по сравнению с соответствующим Ab человека), например, содержать делецию с N или С-конца легкой или тяжелой цепи либо делецию аминокислоты из константного домена (например Fc-домена).

Предпочтительно, чтобы обеспечить возможность введения субъекту специфичного к IL-1α человека mAb с высокими титрами и с минимальными неблагоприятными эффектами, композиции на основе mAb по изобретению содержат по меньшей мере 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9 или более процентов по массе только mAb (без учета любых эксципиентов). Композиции на основе mAb по изобретению могут включать mAb только одного типа (т.е. mAb, полученное из одного клона линии В-лимфоцитов). Помимо mAb к IL-1α человека композиции на основе Ab по изобретению также могут включать другие mAb, которые специфически связываются с антигенами, отличными от IL-1α человека.

С целью модификации или усиления своей функции mAb может быть конъюгировано с другой молекулой, такой как цитотоксин или детектируемая метка. Специфичное к IL-1α человека mAb может быть конъюгировано с одним или несколькими цитотоксинами для более эффективного уничтожения клеток, экспрессирующих IL-1α. Цитотоксины для использования в данном изобретении могут представлять собой любой цитотоксический агент (например, молекулу, которая может уничтожать клетку после приведения в контакт с данной клеткой), который может быть конъюгирован с mAb, специфичным к IL-1α человека. Примеры цитотоксинов включают, без ограничения, радионуклиды (например, ³⁵S, ¹⁴С, ³²Р, ¹²⁵1, ¹³¹1, ⁹⁰Y, ⁸⁹Zr, ²⁰¹Ti, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re, ⁵⁷Cu, ²¹³Bi и ²¹¹At), конъюгированные радионуклиды и химиотерапевтические агенты. Дополнительные примеры цитотоксинов включают, без ограничения, антиметаболиты (например 5-фторурацил (5-FU), метотрексат (МТХ), флударабин и т.д.), агенты, оказывающие воздействие на микротрубочки (например винкристин, винбластин, колхицин, таксаны (такие как паклитаксел и доцетаксел) и т.д.), алкилирующие агенты (например циклофосфамид, мелфалан, бисхлорэтилнитрозомочевину (BCNU) и т.д.), агенты на основе платины (например цисплатин (также называемый цис-дихлордиаминплатина(II) (cDDP)), карбоплатин, оксалиплатин, JM-216, CI-973 и т.д.), антрациклины (например доксорубицин, даунорубицин и т.д.), антибиотические агенты (например митомицин С), ингибиторы топоизомеразы (например этопозид, тенопозид и камптотецины) или другие цитотоксические агенты, такие как рицин, дифтерийный токсин (DT), экзотоксин А из Pseudomonas (РЕ), РЕ40, абрин, сапорин, противовирусный белок лаконоса, бромид этидия, глюкокортикоид, токсин сибирской язвы и другие См., например, патент США №5932188.

Специфичное к IL-1α человека mAb также может быть конъюгировано с детектируемой меткой Полезные в настоящем изобретении детектируемые метки включают биотин или стрептавидин, магнитные гранулы, флуоресцентные красители (например изотиоцианат флуоресцеина, техасский красный, родамин, зеленый флуоресцентный белок и тому подобное), радиоактивные метки (например ³Н, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴С, ³²Р, ¹¹¹L, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga или ⁷²As), рентгеноконтрастные вещества, такие как металлы для радиоизотопной визуализации, парамагнитные агенты для магнитно-резонансной визуализации, ферменты (например пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и другие, обычно используемые в иммуноферментном твердофазном анализе (ELISA)) и колориметрические метки, такие как гранулы из коллоидного золота, или цветного стекла, или пластика (например из полистирола, полипропилена, латекса и т.д.). Средства детектирования таких меток хорошо известны специалистам в данной области техники. Так, например, детектирование радиоактивных меток можно осуществлять, используя фотопленку или сцинтилляционные счетчики. Также можно использовать флуоресцентные маркеры, детектирование которых можно осуществлять, используя фотодетектор для обнаружения испускаемого излучения. Обнаружение ферментативных меток обычно осуществляют, добавляя субстрат к ферменту и детектируя продукт реакции, образуемый в результате действия фермента на субстрат, а обнаружение колориметрических меток осуществляют простой визуализацией окрашенной метки.

Настоящее изобретение также охватывает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие m Ab, специфичное к IL-1α человека. Хотя одна молекула нуклеиновой кислоты может кодировать как тяжелую, так и легкую цепи специфичного к IL-1α человека mAb, также можно использовать набор из двух разных молекул нуклеиновых кислот, одна из которых кодирует тяжелую цепь, а другая кодирует легкую цепь. Также можно использовать любую другую подходящую нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотные последовательности mAb, описанного здесь.

Для получения mAb молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие тяжелые и легкие цепи, могут быть встроены в экспрессирующий вектор в ориентации, при которой такие молекулы нуклеиновых кислот функционально связаны с контролирующими экспрессию последовательностями, такими как контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности. Примеры экспрессирующих векторов включают векторы, происходящие из плазмид, и векторы, происходящие из вирусов, таких как аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и ретровирусы. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь, могут быть встроены в один вектор или разные векторы. Векторы по изобретению также могут включать регуляторные последовательности, такие как промоторы и/или энхансеры (см. патент США №5168062, патент США №4510245 и патент США №4968615), селектируемые маркеры или последовательности, кодирующие аффинные метки (для облегчения очистки) или детектируемую метку.

Для продуцирования mAb векторы по изобретению можно ввести в подходящую клетку-хозяин, например прокариотическую клетку, такую как бактерия, или, предпочтительно, эукариотическую клетку, такую как клетка хозяин млекопитающих, растений или дрожжей. Примеры методов введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки-хозяева включают использование вирусных векторов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида(ов) в липосомы, декстран-опосредуемую трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, полибрен опосредуемую трансфекцию, слияние протопластов, опосредуемую агробактериями трансформацию, биолистическую трансформацию и прямую микроинъекцию ДНК в ядро. В настоящее время предпочтительными для экспрессии mAb с использованием векторов являются линии клеток млекопитающих. Примеры клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО) (например линию клеток DG44 СНО (ОНО, дефектных по дигидрофолатредуктазе (dhfr)), или линию клеток CHO-К1 (СНО, субклон К1)), клетки HeLa, клетки почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК), клетки почки африканской зеленой мартышки (COS), клетки гепатоклеточной карциномы человека (например клетки Hep G2), клетки NS0, клетки SP2, клетки почки эмбриона человека, линии 293Т (НЕК-293Т), клетки FreeStyle™ 293 и клетки NIH-3T3. mAb также может быть экспрессировано в трансгенных животных или растениях. См., например, патенты США №№5827690, 5756687, 57501 72, 5741957, 6046037 и 5959177.

Ab и антигенсвязывающие фрагменты, описанные здесь, могут быть введены в состав фармацевтических композиций, которые содержат Ab и антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель (например не встречающийся в природе фармацевтически приемлемый носитель). Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей включают стерилизованную воду, физиологический раствор, стабилизаторы, эксципиенты, антиоксиданты (например аскорбиновую кислоту), буферы (например, на основе фосфата, цитрата, гистидина и других органических кислот), антисептики, поверхностно активные вещества (например полиэтиленгликоль (ПЭГ) и твин), хелатирующие агенты (например этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) или этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA)) и связующие вещества. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых носителей также включают низкомолекулярные полипептиды, белки (например сывороточный альбумин и желатин), аминокислоты (например глицин, глутамин, аспарагин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, метионин, аргинин и лизин), сахара и углеводы (например полисахариды и моносахариды) и сахарные спирты (например маннит и сорбит). При приготовлении водного раствора для инъекций можно использовать физиологический раствор и изотонические растворы, содержащие глюкозу и другие адъюванты, такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннит и хлорид натрия, и при необходимости в комбинации с соответствующими солюбилизаторами, такими как спирт (например этанол), полиспирты (например пропиленгликоль и ПЭГ) и неионные поверхностно-активные вещества (например полисорбат 80, полисорбат 20, полоксамер 188 и НСО50). Путем добавления в композицию гиалуронидазы можно ввести подкожно больший объем жидкости (см., например, Expert. Opin. Drug Deliv., 4(4); 427-440, 2007).

Например, Ab и антигенсвязывающие фрагменты, предложенные здесь, могут быть инкапсулированы в микрокапсулы (например, изготовленные из гидроксиметилцеллюлозы, желатина и поли(метилметакрилата)) или инкорпорированы в качестве компонентов в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) (см., например, "Remington's Pharmaceutical Science, 16th edition", Oslo Ed. (1980)) Способы приготовления фармацевтических композиций в виде фармацевтических агентов с регулируемым высвобождением также хорошо известны, и такие способы могут быть применены к Ab и антигенсвязывающим фрагментам по настоящему изобретению (см., например, Langer et al., J. Biomed, Mater. Res., 15: 267-277, 1981; Langer, Chemtech., 12: 98-105, 1982; патент США №3773919; публикацию заявки на европейский патент №ЕР 58481; Sidman et al., Biopoiymers, 22: 547-556, 1983; и ЕР 133988).

Фармацевтические композиции, предложенные здесь, могут быть приготовлены для внутривенного, внутриартериального, интрадермального, подкожного, внутримышечного, внутрибрюшинного или перорального введения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Обнаружение последовательностей вариабельной области тяжелой и легкой цепей Ab к IL-1α человека

Плазму и мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли от здорового донора человека. Наличие антител к IL-1α в плазме крови подтверждали с помощью основанного на применении гранул проточного цитометрического анализа, используя стрептавидиновые магнитные гранулы, конъюгированные с биотинилированным рекомбинантным IL-1α человека. РВМС выделяли из крови донора, используя среду Histopaque™ 1077 и пробирки Accuspin™, и часть РВМС клеток отбирали. Из РВМС, а также В-клеток экстрагировали РНК, используя традиционные методы, и на основании РНК получали кДНК. С использованием этой кДНК проводили ПЦР, применяя методику и праймеры, описанные в патенте США под номером 9453217. Используемый обратный праймер выбирали с целью осуществления избирательной амплификации IgG4 и IgG1, поскольку в результате изотипирования реактивности в плазме было установлено, что она в большинстве случаев относится к подклассу IgG4, с некоторым сигналом от подкласса IgG1 Готовили библиотеки легких цепей как каппа, так и лямбда типов. Создавали фаговые библиотеки из участков, перекрывающих IgG4 каппа, и проводили три раунда пэннинга без какой либо амплификации фагов между раундами. Установлено, что разнообразие входной библиотеки составляло 0,65⋅10¹². После раунда 2 на чашке насчитывали половину клонов и эту оставшуюся часть подвергали дополнительному раунду пэннинга. После трех раундов пэннинга оставалось 38 клонов. Основанный на ELISA скрининг проводили с супернатантами фаговых суспензий на планшетах для ELISA, покрытых рекомбинантным IL-1α человека, с использованием антитела к пептидной метке FLAG для детекции связанных фагов и идентифицировали положительные клоны. Отбирали один из них, обозначенный как XIA11, и проводили секвенирование его ДНК. Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей человеческого моноклонального антитела, обозначенного как XIA11, приведены ниже вместе с CDR (определенными с использованием базы данных по иммуногенетике (IMGT)/DomainGapAlign] Ehrenmann, F., Lefranc, M.^_P. Cold Spring Harp, Protoc, 2011(6); 737-749 (2011), DOI; 10.1101/pdb.prot5636. PMID:21632775.), которые выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

>Х1А11_Легкая цепь

>Х1А11_Тяжелая цепь

Таким образом, легкая цепь XIA11 содержит CDR1, имеющий аминокислотную последовательность QSVLYSSNNKNY (SEQ ID NO: 3), CDR2, имеющий аминокислотную последовательность WAS (SEQ ID NO: 4), и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность QQYYSSPPT (SEQ ID NO: 5), Аналогичным образом, тяжелая цепь XIA11 содержит CDR1, имеющий аминокислотную последовательность GGRFTNYA (SEQ ID NO: 6), CDR2, имеющий аминокислотную последовательность IIPIFDET (SEQ ID NO: 7), и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность ATGSNSYYGLY (SEQ ID NO: 8).

Пример 2. Определение характеристик XIA11

Результаты анализа с использованием системы Octet Red 96 показали, что аффинность связывания (KD) XIA11 с IL-1α составила 7,02×10^-11 М (см. Фиг. 1). Результаты анализа с использованием системы Octet Red 96 показали, что аффинность связывания (KD) XIA11 с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) составила 2,10×10^-7 М (см. Фиг. 2).

Анализ эффективности с использованием эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) показал, что значение концентрации, вызывающей 50%-ное ингибирование (IC₅₀) в случае XIA11 составило 3,4 нг/мл. Кратко, 0,2×10⁶ клеток HUVEC (Coming™ 354151)/мл высевали в 96-луночный планшет с лунками с плоским дном. Молекулы XIA11 разбавляли до концентраций в диапазоне от 610 пг/мл до 100 мкг/мл. Разбавленный раствор XIA11 добавляли к клеткам HUVEC в 96-луночном планшете в конечных диапазонах концентраций от 61 пг/мл до 10 мкг/мл. В каждую лунку 96-луночного планшета вносили IL-1α человека (hIL-1α) в концентрации 0,5 нг/мл и используемый в анализе планшет инкубировали при 37°С/5% СО₂ в течение 18 ч. Клетки HUVEC окрашивали антителом к молекуле межклеточной адгезии 1 (ICAM-1) (eBioscience 12-0549, клон НА58) и определяли уровень экспрессии ICAM-1, используя проточную цитометрию. Анализ данных проводили, используя программное обеспечение FlowJo, и рассчитывали IC₅₀, используя приложение KaleidaGraph.

Другие воплощения

Следует понимать, что хотя данное изобретение изложено в рамках его подробного описания, приведенное выше описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема данного изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема приведенной ниже формулы изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> XBIOTECH INC.

<120> ПОЛНОСТЬЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧНОЕ К ИНТЕРЛЕЙКИНУ 1-АЛЬФА

<130> PAT 109598W-90

<150> CA 3,095,675

<151> 2020-10-07

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Arg Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Ala Ile Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Thr Asp His Ala Gln Asp Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Leu Thr Ile Thr Val Asp Glu Ser Met Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Ser Asn Ser Tyr Tyr Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Trp Ala Ser

1

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Pro Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gly Gly Arg Phe Thr Asn Tyr Ala

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Thr

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Ala Thr Gly Ser Asn Ser Tyr Tyr Gly Leu Tyr

1 5 10

<---

Изобретение относится к области иммунологии. Предложена фармацевтическая композиция, содержащая очищенное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с интерлейкином 1-альфа (IL-1α) и содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки (CDR) с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую CDR с SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8. Изобретение обеспечивает лечение заболеваний (воспаление, иммунные ответы, метастазирование опухолей и гемопоэз), активируя интерлейкин 1-альфа, посредством специфического связывания с высокой аффиностью очищенного человеческого моноклонального антитела с данным цитокином. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

1. Фармацевтическая композиция, содержащая очищенное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с интерлейкином 1-альфа (IL-1α) и содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки (CDR) с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую CDR с SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, где вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 1, и вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2.