АНТИТЕЛА К CD38 И КОМБИНАЦИИ С АНТИТЕЛАМИ К CD3 И CD28 Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 C07K16/00 A61K39/395 A61K45/00 C12N5/10 A61P35/00 A61P35/02 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета согласно предварительной заявке на патент США с регистрационным № 62/570655, поданной 10 октября 2017 г., предварительной заявке на патент США с регистрационным № 62/570660, поданной 11 октября 2017 г., предварительной заявке на патент США с регистрационным № 62/676221, поданной 24 мая 2018 г., и заявке на европейский патент № EP 18187186.4, поданной 3 августа 2018 г.; которые все включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ТЕКСТОВОМ ФАЙЛЕ ASCII

Содержание нижеследующего представленного текстового файла ASCII включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте: машиночитаемая форма (CRF) перечня последовательностей (название файла: 183952029941seqlist.TXT, дата составления: 8 октября 2018 г., размер: 158 килобайт).

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее раскрытие относится к связывающим белкам, которые связывают полипептиды CD38 (например, полипептиды CD38 человека и макака-крабоеда), в том числе моноспецифические, биспецифические или триспецифические связывающие белки по меньшей мере с одним антигенсвязывающим доменом, который связывает полипептид CD38, а также полинуклеотиды, клетки-хозяева, способы получения и способы применения, связанные с ними.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Биотерапевтические препараты на основе моноклональных антител стали важным направлением в разработке новых лекарственных средств. Технология моноклональных антител предлагает специфическое нацеливание на конкретную популяцию клеток и точную доставку в них сигналов и/или полезной нагрузки и обеспечивает длительный биологический эффект посредством функций, опосредованных Fc-фрагментом. Попытки, предпринятые в области конструирования антител, позволили разработать полиспецифические антитела, в которых объединены специфичности множества моноклональных антител, для различных путей применения в биологических целях, расширяя область разработки лекарственных средств на основе антител.

CD38 является перспективной мишенью для лекарственных средств, поскольку экспрессируется на клеточной поверхности множества лимфоидных опухолевых клеток (см. Stevenson, G.T. (2006) Mol. Med. 12:345-346). DARZALEX® (даратумумаб) представляет собой антитело к CD38, утвержденное для применения в лечении множественной миеломы. Однако остается потребность в терапевтических средствах, нацеливающихся на CD38, с другим механизмом действия и/или улучшенными свойствами, в том числе без ограничения высокая аффинность связывания с CD38, перекрестная реактивность между полипептидами CD38 человека и макака-крабоеда, связывание с клетками лимфомы (например, линии клеток крупноклеточной В-клеточной лимфомы и множественной миеломы) и способность индуцировать апоптоз и/или антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и опосредованную Т-клетками противоопухолевую активность.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении представлены связывающие белки, которые связывают полипептиды CD38 (например, полипептиды CD38 человека и макака-крабоеда), в том числе моноспецифические, биспецифические или триспецифические связывающие белки с по меньшей мере одним антигенсвязывающим сайтом, который связывает полипептид CD38. Преимущественно такие связывающие белки характеризуются способностью к рекрутингу Т-клеток в непосредственной близости от раковых клеток с последующей активацией Т-клеток и стимуляции активированных Т-клеток к уничтожению соседних раковых клеток с помощью механизма гранзим/перфорин, обеспечивая таким образом другой механизм действия для противоопухолевой активности антител к CD38, таких как DARZALEX® (даратумумаб). Более того, способность связывать полипептиды CD38 человека и макака-крабоеда обеспечивает простое тестирование связывающих белков в доклинических токсикологических исследованиях, например, для оценки их профилей безопасности с целью последующего клинического применения.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены моноспецифические связывающие белки, которые связываются с полипептидом CD38 человека. В некоторых вариантах осуществления связывающие белки перекрестно реагируют с полипептидами CD38 человека и макака-крабоеда. В некоторых вариантах осуществления связывающие белки связываются с полипептидами CD38 изоформы A и изоформы E человека. В некоторых вариантах осуществления связывающие белки обладают одной или более из следующих характеристик (в любой комбинации): связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1) в качестве очищенного белка по данным SPR; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1) в качестве очищенного белка с K_D 1,5 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа SPR; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1), экспрессируемым на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1), экспрессируемым на поверхности клетки, с кажущимся значением K_D 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 1 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30) в качестве очищенного белка, что измерено с помощью анализа SPR; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30) в качестве очищенного белка с K_D 3,5 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа SPR; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30), экспрессируемым на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30), экспрессируемым на поверхности клетки, со значением кажущейся K_D 7,5 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 изоформы Е человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105) в качестве очищенного белка, что измерено с помощью анализа ELISA; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 изоформы E человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105), экспрессируемым на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; индуцируют апоптоз или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) клетки, экспрессирующей CD38 на своей клеточной поверхности; и имеют одну или более мутаций (например, в Fc-участке), приводящих к ослаблению связывания с FcγRI и/или FcγRII по сравнению с тем же самым связывающим белком в отсутствие одной или более мутаций. Иллюстративные анализы см. в примерах 1, 3 и 4. В некоторых вариантах осуществления KD измеряют при 4°C или 25°C.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены триспецифические связывающие белки, которые связываются с полипептидом CD38 человека. В некоторых вариантах осуществления триспецифические связывающие белки связываются (например, одновременно) с полипептидом CD38 (например, экспрессируемым на поверхности клетки) и одним или более другими целевыми антигенами, экспрессируемыми на поверхности второй клетки, с обеспечением таким образом рекрутинга второй клетки в непосредственной близости от клетки, экспрессирующей полипептид CD38. В некоторых вариантах осуществления триспецифические связывающие белки связываются (например, одновременно) с полипептидом CD38 (например, экспрессируемым на поверхности клетки) и одним или двумя целевыми антигенами, экспрессируемыми на поверхности T-клетки, обеспечивая таким образом рекрутинг T-клетки в непосредственной близости от клетки, экспрессирующей полипептид CD38. В некоторых вариантах осуществления триспецифические связывающие белки активируют Т-клетку и/или обеспечивают CD28-опосредованный костимуляторный сигнал в отношении Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления триспецифические связывающие белки перекрестно реагируют с полипептидами CD38 человека и макака-крабоеда. В некоторых вариантах осуществления триспецифические связывающие белки связываются с полипептидами CD38 изоформы A и изоформы E человека. В некоторых вариантах осуществления триспецифические связывающие белки обладают одной или более из следующих характеристик (в любой комбинации): связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1) в качестве очищенного белка по данным SPR; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1) в качестве очищенного белка с K_D 1,5 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа SPR; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1), экспрессируемым на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1), экспрессируемым на поверхности клетки, с кажущимся значением K_D 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 1 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30) в качестве очищенного белка, что измерено с помощью анализа SPR; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30) в качестве очищенного белка с K_D 3,5 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа SPR; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30), экспрессируемым на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30), экспрессируемым на поверхности клетки, с кажущимся K_D 7,5 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 изоформы Е человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105) в качестве очищенного белка, что измерено с помощью анализа ELISA; связываются с внеклеточным доменом полипептида CD38 изоформы E человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105), экспрессируемым на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; индуцируют апоптоз или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) клетки, экспрессирующей CD38 на своей клеточной поверхности; и имеют одну или более мутаций (например, в Fc-участке), приводящих к ослаблению связывания с FcγRI и/или FcγRII по сравнению с тем же самым связывающим белком в отсутствие одной или более мутаций, приводящих к уменьшению связывания с FcγRI и/или FcγRII по сравнению с тем же самым связывающим белком в отсутствие одной или более мутаций; индуцируют пролиферацию Т-клеток (например, CD4+ и/или CD8+ Т-клеток); индуцируют экспрессию Т-клетками (например, CD4+ и/или CD8+ Т-клетками) Bcl-xL; индуцируют апоптоз клеток CD38+; связываются с CD38, экспрессируемым на поверхности клетки, и одним или более целевыми Т-клеточными антигенами, экспрессируемыми на поверхности Т-клетки; связываются с CD38, экспрессируемым на поверхности клетки, CD28, экспрессируемым на поверхности Т-клетки, и CD3, экспрессируемым на поверхности Т-клетки; стимулируют активацию Т-клеточного рецептора; индуцируют костимуляцию передачи сигналов T-клеточными рецепторами (например, CD28-опосредованно); и имеют одну или более мутаций (например, в Fс-участке), приводящих к снижению индуцирования высвобождения цитокинов (например, IFN-γ, IL-2 и/или TNF-α) посредством PBMC по сравнению с тем же связывающим белком в отсутствие одной или более мутаций; индуцируют высвобождение цитокинов (например, IFN-γ и/или IL-6) посредством PBMC в присутствии целевой клетки CD38+. Иллюстративные анализы см. в примерах 1, 3 и 4. В некоторых вариантах осуществления KD измеряют при 4°C или 25°C.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен связывающий белок, содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD38, где антигенсвязывающий сайт содержит: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий сайт содержит: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQG (SEQ ID NO:132), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий сайт содержит: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и/или (b) вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит в направлении от N-конца к C-концу последовательность FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4; где FR1 содержит последовательность QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:87) или QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS (SEQ ID NO:88); где FR2 содержит последовательность MHWVKEAPGQRLEWIGY (SEQ ID NO:90) или MHWVKEAPGQGLEWIGY (SEQ ID NO:91); где FR3 содержит последовательность NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO:93) или NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO:94); и где FR4 содержит последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:96). В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5, и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:7, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:17, и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:19, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:21, и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:22, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:23, и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:24, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий сайт содержит: (а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и (b) вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит в направлении от N-конца к C-концу последовательность FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4; где FR1 содержит последовательность QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:87) или QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS (SEQ ID NO:88); где FR2 содержит последовательность MHWVKEAPGQRLEWIGY (SEQ ID NO:90) или MHWVKEAPGQGLEWIGY (SEQ ID NO:91); где FR3 содержит последовательность NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO:93) или NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO:94); и где FR4 содержит последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:96). В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:15, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен связывающий белок, содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD38, где антигенсвязывающий сайт содержит: (a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43); и (b) вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:9, и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:11, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:12. В некоторых вариантах антигенсвязывающий сайт перекрестно реагирует с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека и внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD38 человека, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD38 человека, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, с равновесной константой диссоциации (K_D) 2,1 нМ или меньше. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD38 изоформы Е человека, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD38 макака-крабоеда, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30. В некоторых вариантах антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD38 макака-крабоеда, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30, с равновесной константой диссоциации (K_D) 1,3 нМ или меньше.

В некоторых вариантах осуществления любого из приведенных выше вариантов осуществления связывающий белок представляет собой химерное или гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок представляет собой антитело человека. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок представляет собой моноклональное антитело человека. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит одну или более полноразмерных тяжелых цепей антитела, содержащих Fc-участок. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок человека, содержащий одну или более мутаций, которые ослабляют или устраняют связывание Fc-рецептора и/или эффекторную функцию Fc-участка. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок IgG1 человека содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и P329A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок IgG1 человека содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 298, 299 и 300 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S298N, T299A и Y300S. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок IgG4 человека содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P и R409K. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок IgG4 человека содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A и L235A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок IgG4 человека содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-236 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок IgG4 человека содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-237 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где последовательность EFLGG замещена последовательностью PVAG. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит F(ab)-, F(ab')2-, Fab'-SH-, Fv- или scFv-фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок конъюгирован с цитотоксическим средством или меткой. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок представляет собой биспецифический связывающий белок, содержащий первый антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD38, и второй антигенсвязывающий сайт. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок представляет собой триспецифический связывающий белок, содержащий первый антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD38, второй антигенсвязывающий сайт и третий антигенсвязывающий сайт. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий сайт связывает внеклеточный домен полипептида CD38 человека, и при этом каждый из второго и третьего антигенсвязывающих сайтов связывает поверхностный белок Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий сайт связывает внеклеточный домен полипептида CD38 человека, и где (а) второй антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD28 человека, а третий антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD3 человека, или (b) второй антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD3 человека, а третий антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD28 человека.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен связывающий белок, содержащий три антигенсвязывающих сайта, каждый из которых связывает один или более целевых белков, где по меньшей мере один из трех антигенсвязывающих сайтов перекрестно реагирует с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека и внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок перекрестно реагирует с полипептидом CD38 человека, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:105. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок перекрестно реагирует с полипептидом CD38 макака-крабоеда, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит антигенсвязывающий сайт, который перекрестно реагирует с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека и внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда, и два антигенсвязывающих сайта, каждый из которых связывает поверхностный белок Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит антигенсвязывающий сайт, который перекрестно реагирует с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека и внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда, антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD28 человека, и антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD3 человека. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих сайта, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I];

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь, и

где (a) домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36);

(b) домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36); или

(c) домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих сайта, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I];

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь, и

где (а) домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQG (SEQ ID NO:132), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36);

(b) домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQG (SEQ ID NO:132), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36); или

(с) домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQG (SEQ ID NO:132), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36); домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36); домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен _L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40) и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); или домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36); или домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:6; домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:17, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18; домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:21, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18; домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:23, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18; или домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих сайта, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I];

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь, и

где (a) домен _H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46);

(b) домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46); или

(с) домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:9, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54; домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54; домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:51, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:52, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54; домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:51, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:52, домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54, домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:84, и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:85; домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:84, и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:85; домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:51, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:52, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:84, и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:85; или домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:51, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:52, домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:84, и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:85. В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54, домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14; или домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54, домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:9, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо составляет по меньшей мере одну аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления (a) каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо имеет длину, составляющую ноль аминокислот, или содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59); или (b) каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L₂ содержит последовательность TKGPS (SEQ ID NO: 57), L₃ содержит последовательность S, и L₄ содержит последовательность RT; L₁ содержит последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L₂ содержит последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), длина L₃ составляет 0 аминокислот, и длина L₄ составляет 0 аминокислот; L₁ содержит последовательность GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L₂ содержит последовательность GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), длина L₃ составляет 0 аминокислот, и длина L₄ составляет 0 аминокислот; или L₁ содержит последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), длина L₂ составляет 0 аминокислот, L₃ содержит последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), и длина L₄ составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир-C_H2-C_H3 IgG4 человека, и при этом каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A и L235A. В некоторых вариантах осуществления домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир-C_H2-C_H3 IgG4 человека, и при этом каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-236 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236 В некоторых вариантах осуществления домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир-C_H2-C_H3 IgG4 человека, и при этом каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P и R409K. В некоторых вариантах осуществления домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир-C_H2-C_H3 IgG1 человека, и при этом каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и P329A. В некоторых вариантах осуществления домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир-C_H2-C_H3 IgG1 человека, и при этом каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 298, 299 и 300 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S298N, T299A и Y300S. В некоторых вариантах осуществления домен шарнир-C_H2-C_H3 второй полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V; и где домен шарнир-C_H2-C_H3 третьей полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W. В некоторых вариантах осуществления домен шарнир-C_H2-C_H3 второй полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W; и где домен шарнир-C_H2-C_H3 третьей полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:62, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:65, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:67, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:68, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:70, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:71, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен связывающий белок, содержащий три антигенсвязывающих сайта, каждый из которых связывает один или более целевых белков, где связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих сайта, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I];

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь, и

где (a) домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир-C_H2-C_H3 IgG1 человека, и где каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 298, 299 и 300 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S298N, T299A и Y300S; или (b) домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир-C_H2-C_H3 IgG4 человека, и где каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-236 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236 В некоторых вариантах осуществления домены шарнир-C_H2-C_H3 IgG4 человека предусматривают аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-237 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где последовательность EFLGG замещена последовательностью PVAG. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара из V_H1 и V_L1, V_H2 и V_L2, а также V_H3 и V_L3 образует антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD38. В некоторых вариантах осуществления одна, две или три пары из V_H1 и V_L1, V_H2 и V_L2, а также V_H3 и V_L3 образуют антигенсвязывающий сайт, который связывает целевой антиген, выбранный из группы, состоящей из A2AR, APRIL, ATPDазы, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, хитиназы, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролазы 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rбета, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, лептина, LPFS2, MHC класса II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDазы-1, OX40, OX40L, PD-1H, тромбоцитарного рецептора, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk-киназы, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, и XCR1. В некоторых вариантах осуществления первая пара из V_H1 и V_L1, V_H2 и V_L2, а также из V_H3 и V_L3 образует антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD3 человека, вторая пара из V_H1 и V_L1, V_H2 и V_L2, а также V_H3 и V_L3 образует антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD28 человека, и третья пара из V_H1 и V_L1, V_H2 и V_L2, а также V_H3 и V_L3 образует антигенсвязывающий сайт, который связывает целевой антиген человека, выбранный из группы, состоящей из A2AR, APRIL, ATPDазы, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, хитиназы, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролазы 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rбета, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, лептина, LPFS2, MHC класса II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDазы-1, OX40, OX40L, PD-1H, тромбоцитарного рецептора, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk киназы, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, и XCR1.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен набор полинуклеотидов, содержащий: (a) первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:72, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:74, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:75; (b) первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:76, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:77, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:75; (c) первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:78, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:79, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:75; (d) первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:72, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:80, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:81; (e) первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:76, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:82, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:81; или (f) первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:78, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:83, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:81.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен полинуклеотид, содержащий связывающий белок по любому из указанных выше вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен вектор, содержащий полинуклеотид, который содержит связывающий белок по любому из указанных выше вариантов осуществления.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлена клетка-хозяин, содержащая набор полинуклеотидов, полинуклеотид или вектор по любому из указанных выше вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен способ получения связывающего белка, при этом способ предусматривает культивирование клетки-хозяина в соответствии с любым из указанных выше вариантов осуществления с получением таким образом связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает извлечения связывающего белка из клетки-хозяина.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлена фармацевтическая композиция, содержащая связывающий белок в соответствии с любым из указанных выше вариантов осуществления и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен способ предупреждения и/или лечения рака у пациента, предусматривающий введение пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного связывающего белка в соответствии с любым из указанных выше вариантов осуществления или фармацевтической композиции в соответствии с любым из указанных выше вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок представляет собой триспецифический связывающий белок, содержащий первый антигенсвязывающий сайт, который связывает CD3, второй антигенсвязывающий сайт, который связывает CD28, и третий антигенсвязывающий сайт, который связывает внеклеточный домен полипептида CD38 человека. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один связывающий белок вводят совместно с химиотерапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) или B-клеточную лимфому. В некоторых вариантах осуществления пациентом является человек. В некоторых вариантах осуществления пациент выбран для лечения ввиду того, что раковые клетки экспрессируют полипептид CD38 изоформы E человека (например, изложенный под SEQ ID NO:105) на своей клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления раковые клетки экспрессируют CD38 и CD28. В некоторых вариантах осуществления раковые клетки экспрессируют CD38 и не экспрессируют CD28.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен по меньшей мере один связывающий белок в соответствии с любым из указанных выше вариантов осуществления или фармацевтическая композиция в соответствии с любым из указанных выше вариантов осуществления для применения в предупреждении и/или лечении рака у пациента (например, у нуждающегося в этом пациента, например, у пациента с раком). В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен по меньшей мере один связывающий белок в соответствии с любым из указанных выше вариантов осуществления или фармацевтическая композиция в соответствии с любым из указанных выше вариантов осуществления для применения в изготовлении лекарственного препарата, предназначенного для предупреждения и/или лечения рака у пациента (например, у нуждающегося в этом пациента, например, у пациента с раком). В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из указанных выше вариантов осуществления связывающий белок представляет собой триспецифический связывающий белок, содержащий первый антигенсвязывающий сайт, который связывает CD3, второй антигенсвязывающий сайт, который связывает CD28, и третий антигенсвязывающий сайт, который связывает внеклеточный домен полипептида CD38 человека. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один связывающий белок подлежит введению совместно с химиотерапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) или B-клеточную лимфому. В некоторых вариантах осуществления пациентом является человек. В некоторых вариантах осуществления пациент выбран для лечения ввиду того, что раковые клетки экспрессируют полипептид CD38 изоформы E человека (например, изложенный под SEQ ID NO:105) на своей клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления раковые клетки экспрессируют CD38 и CD28. В некоторых вариантах осуществления раковые клетки экспрессируют CD38 и не экспрессируют CD28.

Следует понимать, что один, несколько или все признаки различных вариантов осуществления, описанных в данном документе, можно комбинировать с получением других вариантов осуществления настоящего изобретения. Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники. Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения дополнительно описаны с помощью нижеследующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Файл данного патента или данной заявки содержит как минимум один графический материал, выполненный в цвете. Копии данного патента или публикации патентной заявки с цветным (цветными) графическим (графическими) материалом (материалами) будут представлены патентным ведомством по запросу и при оплате необходимого взноса.

На фиг. 1А показано связывание mAb1-антител к CD38 (вверху) и изатуксимаба (внизу) с клетками лимфомы человека SU-DHL-8 или клетками множественной миеломы человека MOLP-8 согласно данным анализа проточной цитометрии.

На фиг. 1B показаны результаты анализов связывания согласно данным анализа проточной цитометрии, в которых исследовали связывание mAb1-антител к CD38 или изатуксимаба (связывание не наблюдается) с клетками, экспрессирующими CD38 макака-крабоеда на их поверхности.

На фиг. 2A-2I показаны результаты анализов, характеризующие связывание антител к CD38 с полипептидами CD38 человека и макака-крабоеда. На фиг. 2A показано связывание гуманизированного mAb2-антитела к CD38 с растворимым CD38 человека (вверху, «hCD38::метка His») или CD38 макака-крабоеда (вверху, «cynoCD38::метка His») согласно данным анализа ELISA, а также связывание mAb2 с поверхностью клеток, экспрессирующих CD83 человека (как указано внизу) или CD38 макака-крабоеда (как указано внизу), согласно данным анализа проточной цитометрии. На фиг. 2B показано связывание mAb2 с CD38 человека (вверху) или CD38 макака-крабоеда (внизу) по данным поверхностного плазмонного резонанса (SPR). На фиг. 2С показано связывание гуманизированного mAb3-антитела к CD38 с растворимым CD38 человека (вверху, «hCD38::метка His») или CD38 макака-крабоеда (вверху, «cynoCD38::метка His») согласно данным анализа ELISA, а также связывание mAb3 с поверхностью клеток, экспрессирующих CD83 человека (как указано внизу) или CD38 макака-крабоеда (как указано внизу) согласно данным анализа проточной цитометрии. На фиг. 2D показано связывание mAb3 с CD38 человека (вверху) или CD38 макака-крабоеда (внизу) согласно данным SPR. На фиг. 2E показано связывание гуманизированного mAb5-антитела к CD38 с растворимым CD38 человека (вверху, «hCD38::метка His») или CD38 макака-крабоеда (вверху, «cynoCD38::метка His») согласно данным анализа ELISA, а также связывание mAb5 с поверхностью клеток, экспрессирующих CD83 человека (как указано внизу) или CD38 макака-крабоеда (как указано внизу), согласно данным анализа проточной цитометрии. На фиг. 2F показано связывание mAb5 с CD38 человека (вверху) или CD38 макака-крабоеда (внизу) согласно данным SPR. На фиг. 2G показано связывание человеческого антитела к CD38 hhy1370 с растворимым CD38 человека (вверху, «hCD38::метка His») или CD38 макака-крабоеда (вверху, «cynoCD38::метка His») по данным анализа ELISA, а также связывание hhy1370 с поверхностью клеток, экспрессирующих CD83 человека (как указано внизу) или CD38 макака-крабоеда (как указано внизу), согласно данным анализа проточной цитометрии. На фиг. 2H показано связывание hhy1370 с CD38 человека (вверху) или CD38 макака-крабоеда (внизу) согласно данным SPR. На фиг. 2I обобщены данные по связыванию согласно данным анализов ELISA, SPR и FACS, а также процента идентичности каждого домена VH («H») или VL («L») антитела с последовательностью V-участка человека сверху вниз, что соответствует mAb2, mAb3, mAb 4, mAb 5 и mAb6 в последней строке (1195 HHKK-3 не описана по ее аминокислотной последовательности VL/VH в тексте ниже).

На фиг. 2J показана зависимое от концентрации индуцирование апоптоза клеток SU-DHL-8 посредством mAb7 и mAb1 после инкубации в течение 72 часов при 37°C.

На фиг. 2K показана активность антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) изатуксимаба и mAb1 в отношении клеток SU-DHL-8 в присутствии клеток NK92.

На фиг. 2L показана зависимая от концентрации активность антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) изатуксимаба (справа) и mAb1 (слева) в отношении клеток SU-DHL-8 в присутствии клеток NK92 через 4 часа при 37°C.

На фиг. 2M-2Q показаны результаты анализов индуцирования апоптоза с использованием указанных антител к CD38 в отношении опухолевых клеток SU-DHL-8. Апоптоз определяли количественно посредством парного измерения поглощения аннексина V и пропидия йодида с помощью проточной цитометрии. На фиг. 2M показан процент клеток с апоптозом, индуцированным каждым антителом. На фиг. 2N - 2Q показана дозозависимое индуцирование апоптоза в клетках лимфомы SU-DHL-8 антителами mAb2 к CD38 (фиг. 2N), mAb3 (фиг. 2O), mAb4 (фиг. 2P) и mAb5 (фиг. 2Q), а также IC50 для каждого антитела.

На фиг. 3A изображено схематическое представление триспецифического связывающего белка, содержащего четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих сайта, которые связывают три целевых белка: CD28, CD3 и CD38. Первая пара полипептидов обладает двойными вариабельными доменами, имеющими кроссоверную ориентацию (VH1-VH2 и VL2-VL1), с образованием двух антигенсвязывающих сайтов, которые распознают CD3 и CD28, а вторая пара полипептидов обладает одним вариабельным доменом (VH3 и VL3), образующим один антигенсвязывающий сайт, который распознает CD38. В триспецифическом связывающем белке, показанном на фиг. 3А, используется константный участок IgG4 с мутацией по типу «выступы-во-впадины», где выступ находится на второй паре полипептидов с одним вариабельным доменом.

На фиг. 3B изображено схематическое представление анализа на основе SPR для изучения способности каждого антигенсвязывающего домена триспецифических связывающих белков-антител к CD38/CD28/CD3 связывать свой родственный антиген.

На фиг. 3C показаны результаты анализов на основе SPR для изучения связывания CD38 с триспецифическими связывающими белками-антителами к CD38/CD28/CD3. Связывание CD38 человека с триспецифическими связывающими белками исследовали отдельно (вверху слева), после предварительного связывания с CD3 (вверху в центре), после предварительного связывания с CD28 (вверху справа), после предварительного связывания с CD3, затем CD28 (внизу слева) или после предварительного связывания с CD28, затем с CD3 (внизу справа).

На фиг. 4 показано последовательное связывание полипептидов CD3, CD28 и CD38 человека с триспецифическими связывающими белками-антителами к CD38/CD28/CD3 согласно данным анализа SPR.

На фиг. 5 показаны обобщенные данные аффинности связывания указанных триспецифических связывающих белков с их родственными антигенами (CD3, CD28 и CD38 человека), что измерено с помощью SPR.

На фиг. 6A приведено сравнение кажущейся аффинности антигенсвязывающего домена изатуксимаба в формате человеческого IgG1 (2^-й лист) или в формате триспецифического связывающего белка с антигенсвязывающими доменами изатуксимаба, антитела к CD28 и антитела к CD3 (формат в соответствии с фиг. 3А; 1^-й лист) для связывания полипептидов CD38 человека (вверху) или макака-крабоеда (внизу) согласно данным анализа проточной цитометрии.

На фиг. 6B - 6D представлено сравнение кажущихся показателей аффинности триспецифического связывающего белка CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid, CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid или моноспецифического антитела mAb2 к CD38 для связывания с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека или макака-крабоеда, согласно данным анализа проточной цитометрии. На фиг. 6B показано связывание триспецифического связывающего белка CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека (вверху) или макака-крабоеда (внизу). На фиг. 6C показано связывание триспецифического связывающего белка CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека (вверху) или макака-крабоеда (внизу). На фиг. 6D показано связывание моноспецифического антитела к CD38 mAb2 с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека (вверху) или макака-крабоеда (внизу).

На фиг. 6E показано сравнение кажущихся показателей аффинности триспецифического связывающего белка CD38_HHY1370xCD28_supxCD3_mid или моноспецифического антитела mAb6 к CD38 для связывания с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека (вверху) или макака-крабоеда (внизу), согласно данным анализа проточной цитометрии.

На фиг. 6F обобщены данные аффинности связывания указанных триспецифических связывающих белков к CD38x-CD28x-CD3 в отношении CD38 человека, что измерено с помощью SPR или проточной цитометрии (FACS).

На фиг. 6G показана кажущаяся аффинность триспецифического связывающего белка ΔCD38_VH1xCD28_supxCD3_mid, в котором отсутствует антигенсвязывающий домен антитела к CD38, для связывания с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека (вверху) или макака-крабоеда (внизу), согласно данным анализа проточной цитометрии.

На фиг. 7A и 7B показаны результаты анализа ELISA в отношении аффинности связывания различных триспецифических связывающих белков-антител к CD38 x CD28 x CD3 IgG4 или контрольных антител с полипептидами CD3, CD28 и CD38 человека и макака-крабоеда.

На фиг. 8A-8D показаны результаты опосредованного антителами специфического уничтожения клеток CD38⁺ посредством PBMC от трех различных доноров человека с использованием указанных триспецифических связывающих белков-антител к CD38 × CD28 × CD3 и контрольных антител. Представлены репрезентативные результаты с использованием линий клеток множественной миеломы RPMI8266 (фиг. 8A), NCI-H929 (фиг. 8B), KMS-26 (фиг. 8C) и клеточных линий KMS-11 (фиг. 8D), и значения EC50 представлены в таблице N. Значения EC50, полученные с использованием клеток NCI-H929, KMS-26 и KMS-11, представлены в таблицах O-Q.

На фиг. 8E и 8F показаны результаты опосредованного антителами специфического уничтожения клеток CD38⁺ посредством PBMC от двух различных доноров с использованием указанных триспецифических связывающих белков-антител к CD38 x CD28 x CD3 с вариантными Fc-участками и контрольных антител. Показаны репрезентативные результаты с использованием линий клеток KMS-11 CD38⁺ (фиг. 8D) и U266 (фиг. 8E), а значения EC50 представлены в таблицах Q2 и Q3.

На фиг. 9A, 9B и 10 показана активация (CD69⁺) человеческих Т-клеток, обработанных различными триспецифическими связывающими белками-антителами к CD38 x CD28 x CD3 или контрольными антителами в течение 24 часов. На фиг. 9A показана активация (CD69⁺) CD3⁺ T-клеток человека. На фиг. 9В показана активация (CD69⁺) CD3⁺ CD4⁺ T-клеток человека. На фиг. 10 показана активация (CD69⁺) CD3⁺ CD8⁺ T-клеток человека.

На фиг. 11A - 11B показаны результаты оценок in vitro высвобождения цитокинов PBMC человека, обработанных указанными триспецифическими связывающими белками-антителами к CD38 x CD28 x CD3 или контрольными антителами на основе способа «нанесение на планшет с высушиванием», как описано в Stebbings, R. et al. (2007) J. Immunol. 179:3325-3331. На фиг. 11A показаны результаты, полученные с использованием 5 мкг/мл указанных антител. На фиг. 11B показаны результаты, полученные с использованием 25 нг/мл указанных антител.

На фиг. 12А - 12Е показана активность in vivo триспецифического связывающего белка CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в клетках CD34+ пуповинной крови гуманизированной мышиной модели NSG с имплантированными клетками множественной миеломы RPMI-8226. На фиг. 12A показано изменение объема опухоли у мышей, которым вводили триспецифический связывающий белок-антитело к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных концентрациях, по сравнению с мышами, получавшими биспецифическое антитело к CD3/CD38. На фиг. 12В показан средний объем опухоли на 18 день у мышей, которым вводили триспецифический связывающий белок-антитело к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных концентрациях, по сравнению с мышами, получавшими биспецифическое антитело к CD3/CD38. На фиг. 12С показан средний конечный вес опухоли у мышей, которым вводили триспецифический связывающий белок-антитело к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных концентрациях, по сравнению с мышами, получавшими биспецифическое антитело к CD3/CD38. На фиг. 12D показана средняя кривая роста опухоли в ходе эксперимента у мышей, которым вводили триспецифический связывающий белок-антитело к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных концентрациях, по сравнению с мышами, получавшими биспецифическое антитело к CD3/CD38. На фиг. 12E показано среднее изменение веса тела в нескольких временных точках в ходе эксперимента у мышей, которым вводили триспецифический связывающий белок-антитело к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных концентрациях, по сравнению с мышами, получавшими биспецифическое антитело к CD3/CD38.

На фиг. 13A - 13F показана активность in vivo триспецифического связывающего белка CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в клетках PBMC гуманизированной мышиной модели NSG с имплантированными клетками множественной миеломы RPMI-8226. На фиг. 13A показано изменение объема опухоли у мышей, которым вводили триспецифический связывающий белок-антитело к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных концентрациях, по сравнению с мышами, получавшими биспецифическое антитело к CD3/CD38. На фиг. 13В показан объем опухоли на 4 день у мышей, которым вводили триспецифический связывающий белок-антитело к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных концентрациях, по сравнению с мышами, получавшими биспецифическое антитело к CD3/CD38. На фиг. 13С показан объем опухоли на 21 день у мышей, которым вводили триспецифический связывающий белок-антитело к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных концентрациях, по сравнению с мышами, получавшими биспецифическое антитело к CD3/CD38. На фиг. 13D показан средний объем опухоли на 21 день у мышей, которым вводили триспецифический связывающий белок-антитело к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных концентрациях, по сравнению с мышами, получавшими биспецифическое антитело к CD3/CD38. На фиг. 13Е показан средний конечный вес опухоли у мышей, которым вводили триспецифический связывающий белок-антитело к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных концентрациях, по сравнению с мышами, получавшими биспецифическое антитело к CD3/CD38. На фиг. 13F показан средний объем опухоли в нескольких временных точках в ходе эксперимента у мышей, которым вводили триспецифический связывающий белок-антитело к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных концентрациях, по сравнению с мышами, получавшими биспецифическое антитело к CD3/CD38.

На фиг. 14A - 14U показаны результаты исследования с повышением дозы (0,5, 2,5, 12,5 мкг/кг) с использованием у приматов, отличных от человека, триспецифических связывающих белков-антител к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid), CD38_(VHI) x CD28_(cvn) x CD3_(mid), CD38_(hhy1370) x CD28_(sup) x CD3_(mid) и CD38_(hhy1370) x CD28_(cvn) x CD3_(mid). На фиг. 14A показана Т-клеточная активация (CD69⁺) циркулирующих CD3⁺ Т-клеток после введения разных доз триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid). На фиг. 14В показана Т-клеточная активация (CD69⁺) циркулирующих CD3⁺ Т-клеток после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(VHI) x CD28_(cvn) x CD3_(mid) в разных дозах. На фиг. 14С показана Т-клеточная активация (CD69⁺) циркулирующих CD3⁺ Т-клеток после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(hhy1370) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в разных дозах. На фиг. 14D показана Т-клеточная активация (CD69⁺) циркулирующих CD3⁺ Т-клеток после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(hhy1370) x CD28_(cvn) x CD3_(mid) в разных дозах. На фиг. 14E показано изменение процентной доли циркулирующих CD4⁺ Т-клеток после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных дозах. На фиг. 14F показано изменение процентной доли циркулирующих CD8⁺ Т-клеток после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(VHI) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных дозах. На фиг. 14G показано изменение процентной доли циркулирующих CD4⁺ Т-клеток после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(VHI) x CD28_(cvn) x CD3_(mid) в указанных дозах. На фиг. 14H показано изменение процентной доли циркулирующих CD8⁺ Т-клеток после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(VHI) x CD28_(cvn) x CD3_(mid) в указанных дозах. На фиг. 14I показано изменение процентной доли циркулирующих CD4⁺ Т-клеток после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(hhy1370) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных дозах. На фиг. 14J показано изменение процентной доли циркулирующих CD8⁺ Т-клеток после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(hhy1370) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в указанных дозах. На фиг. 14K показано изменение процентной доли циркулирующих CD4⁺ Т-клеток после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(hhy1370) x CD28_(cvn) x CD3_(mid) в указанных дозах. На фиг. 14L показано изменение процентной доли циркулирующих CD8⁺ Т-клеток после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(hhy1370) x CD28_(cvn) x CD3_(mid) в указанных дозах. На фиг. 14M показаны изменения общего количества CD4⁺ Т-клеток через 6, 24 и 48 часов после введения 12,5 мкг/кг указанных триспецифических связывающих белков. На фиг. 14N показаны изменения общего количества NK-клеток через 6, 24 и 48 часов после введения 12,5 мкг/кг указанных триспецифических связывающих белков. На фиг. 14O показаны изменения общего количества CD8⁺ Т-клеток через 6, 24 и 48 часов после введения 12,5 мкг/кг указанных триспецифических связывающих белков. На фиг. 14P показаны изменения общего количества В-клеток через 6, 24 и 48 часов после введения 12,5 мкг/кг указанных триспецифических связывающих белков. На фиг. 14Q показаны изменения уровней цитокинов через 6 часов после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(VH1) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в трех возрастающих дозах (0,5, 2,5, 12,5 мкг/кг) (результаты при использовании различных экспериментальных животных, обозначенных как «117065» и «117066»). На фиг. 14R показаны изменения уровней цитокинов через 6 часов после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(VH1) x CD28_(cvn) x CD3_(mid) в трех возрастающих дозах (0,5, 2,5, 12,5 мкг/кг) (результаты при использовании различных экспериментальных животных, обозначенных как «117067» и «117068»). На фиг. 14S показаны изменения уровней цитокинов через 6 часов после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(hhy1370) x CD28_(sup) x CD3_(mid) в трех возрастающих дозах (0,5, 2,5, 12,5 мкг/кг) (результаты при использовании различных экспериментальных животных, обозначенных как «117069» и «117070»). На фиг. 14T показаны изменения уровней цитокинов через 6 часов после введения триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_(hhy1370) x CD28_(cvn) x CD3_(mid) в трех возрастающих дозах (0,5, 2,5, 12,5 мкг/кг) (результаты при использовании различных экспериментальных животных, обозначенных как «117071» и «117072»). На фиг. 14U показаны изменения уровней цитокинов через 24 часа после введения указанных триспецифических связывающих белков в трех возрастающих дозах (0,5, 2,5, 12,5 мкг/кг) (результаты показаны для всех экспериментальных животных).

На фиг. 14V и 4W показано, что триспецифические связывающие белки-антитела к CD38_(VHI) × CD28_(sup) × CD3_(mid) и CD38_(VHI) × CD28_(cvn) × CD3_(mid) in vivo индуцировали истощение Т-клеток в крови у приматов, отличных от человека, при более высоких дозах (6 часов после введения).

На фиг. 14X - 14Y показано, что триспецифические связывающие белки-антитела к CD38_(HHY1370) × CD28_(sup) × CD3_(mid) и CD38_(HHY1370) × CD28_(cvn) × CD3_(mid) in vivo индуцировали истощение Т-клеток в крови у приматов, отличных от человека, при более высоких дозах (6 часов после введения).

На фиг. 14Z - 14AA показано количество Т-клеток крови у приматов, отличных от человека, с течением времени после введения триспецифических связывающих белков-антител к CD38_(VHI) × CD28_(sup) × CD3_(mid) или CD38_(VHI) × CD28_(cvn) × CD3_(mid).

На фиг. 14AB - 14AC показано количество Т-клеток крови у приматов, отличных от человека, с течением времени после введения триспецифических связывающих белков-антител к CD38_(HHY1370) × CD28_(sup) × CD3_(mid) или CD38_(HHY1370) × CD28_(cvn) × CD3_(mid).

На фиг. 14AD - 14AE показано количество CD4+ Т-клеток, связанных с триспецифическим связывающим белком, после введения дозы 100 мкг/кг у приматов, отличных от человека.

На фиг. 14AF - 14AG показано количество CD8+ Т-клеток, связанных с триспецифическим связывающим белком, после введения дозы 100 мкг/кг у приматов, отличных от человека.

На фиг. 15A - 15C показано связывание или отсутствие связывания различных Fc-вариантов с Fc-рецепторами FcγR I (фиг. 15A), FcγR IIa (фиг. 15B) и FcγR IIIb/c (фиг. 15C) человека. Исследуемые варианты представляли собой IgG1 человека, IgG4 человека и IgG4 человека с мутациями FALA.

На фиг. 16 показано связывание IgG4 человека с мутациями FALA или в отсутствие мутаций с FcRn.

На фиг. 17 обобщены PK-параметры указанных триспецифических связывающих белков (CD38_VH1×CD28_sup×CD3_mid IgG4, CD38_VH1×CD28_sup×CD3_mid IgG4 FALA, CD38_VH1×CD28_sup×CD3_mid IgG1 LALA P329A и CD38_HHY1370×CD28_sup×CD3_mid IgG4 FALA) у мышей NSG.

На фиг. 18A - 18C показано опосредованное взаимодействием Fc/FcR (неспецифическое) высвобождение IFN-γ (фиг. 18A), IL-2 (фиг. 18B) или TNF-α (фиг. 18C) РВМС человека, инкубированными с триспецифическими связывающими белками, имеющими Fc-участки дикого типа или FALA-варианты.

На фиг. 18D показана in vitro активация PBMC человека посредством триспецифических связывающих белков-антител к CD38_VH1×CD28_sup×CD3_mid и CD38_HHY1370×CD28_sup×CD3_mid, а также их Fc-вариантов IgG1 и IgG4.

На фиг. 19A - 19B показано, что индуцирование Bcl-xL в CD4+ (фиг. 19A) или CD8+ (фиг. 19B) T-клетках посредством триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_VH1×CD28_sup×CD3_mid требует антигенсвязывающих доменов CD3 и CD28. Гистограмма=среднее значение и станд. отклон. от 3 доноров РВМС. *p=<0,009.

На фиг. 19C - 19D показано, что CD38_VH1xCD28xCD3 с Fc-вариантом IgG4 FALA активирует Bcl-xL в CD4+ (фиг. 19C) или CD8+ (фиг. 19D) T-клетках в большей степени, чем сравнительное биспецифическое антитело. Гистограмма=среднее значение и станд. отклон. от 3 доноров РВМС. *p=<0,045

На фиг. 19E показано, что активация Т-клеток триспецифическими связывающими белками-антителами к CD38x-CD28x-CD3 согласно данным анализа экспрессии IL-2 в репортерной линии T-клеток Jurkat зависит от антигенсвязывающего домена антитела к CD3.

На фиг. 19F показано высвобождение цитокинов TNF, IFNg, IL-2, IL-6 и IL-10 посредством триспецифических связывающих белков-антител к CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid по сравнению со связывающими мутантными белками-антителами к CD28, CD38 или CD28, CD38 и CD3, а также контролем.

На фиг. 19G показана пролиферация Т-клеток, активированных триспецифическим связывающим белком-антителом к CD38x-CD28x-CD3 с Fc-вариантом IgG4 FALA, сравнительным биспецифическим антителом к CD38x-CD3 или изотипическим контролем (триспецифическим связывающим белок с Fc-вариантом IgG4 FALA, характеризующимся мутантными связывающими доменами).

На фиг. 20 показана пролиферация Т-клеток, активированных триспецифическим связывающим белком-антителом к CD38x-CD28x-CD3 с Fc-вариантом IgG4 FALA, триспецифическим связывающими белками-антителами к CD38x-CD28x-CD3 с Fc-вариантом IgG4 FALA и мутацией в связывающем CD38, CD28 или CD3 домене или изотипическим контролем (триспецифическим связывающим белком с Fc-вариантом IgG4 FALA, имеющим три мутантных связывающих домена).

На фиг. 21 показана in vivo противоопухолевая активность триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 FALA, вводимого в указанных дозах, в модели диссеминированной опухоли NCI-H929-Luc у мышей NSG, гуманизированных с помощью PBMC человека.

На фиг. 22 показана in vivo противоопухолевая активность триспецифического связывающего белка-антитела к CD38_HHY1370xCD28_supxCD3_mid IgG4 FALA, вводимого в указанных дозах, в модели диссеминированной опухоли NCI-H929-Luc у мышей NSG, гуманизированных с помощью PBMC человека.

На фиг. 23A - 23B показана высокая противоопухолевая активность in vitro в отношении клеток NCI-929-Luc с помощью трехспецифических связывающих белков CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid и CD38_HHY1370xCD28_supxCD3_mid, а также сравнительного биспецифического антитела к CD38x-CD3 при использовании PBMC человека, используемых в исследовании in vivo. РВМС человека от двух гуманизированных донорских мышей NSG использовали через 24 часа инкубации с соотношением эффектор:РВМС 10:1.

На фиг. 23C показана in vivo превосходная противоопухолевая активность триспецифических связывающих белков CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid и CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mid по сравнению со сравнительным биспецифическим антителом к CD38x-CD3, вводимым в указанных дозах, в модели с диссеминированной опухолью NCI-H929-Luc у мышей NSG, гуманизированных с помощью PBMC человека. Связывающие белки вводили раз в неделю интраперитонеально (и/п) путем инъекции в дозе 30 мкг/кг.

На фиг. 24A показаны результаты анализа с репортерным геном люциферазы с использованием клеток GloResponse™ IL2-luc2P Jurkat (Promega) после стимуляции с использованием CD38_VH1/ CD28_supxCD3_mid и его мутантов с одним мутантным сайтом связывания KO и трижды мутантным KO при концентрации 10 нМ.

На фиг. 24B показана оптимизация антитела к CD3xCD28 CODV-Fab. Оптимальную конфигурацию α-CD3 и α-CD28 в альтернативных положениях биспецифического Fab CODV оценивали с помощью анализов высвобождения цитокинов с использованием человеческих PBMC in vitro. Дистальный CD28 и проксимальный CD3 идентифицировали как оптимальное расположение на основе секреции IFN-γ и IL-2 в супернатанте через 24 часа.

На фиг. 25 показано, что CD38_VH1/CD28_supxCD3_mid индуцирует активацию представителя Bcl-xL семейства Bcl-2 в первичных Т-клетках CD28-зависимым образом.

На фиг. 26 показано, что в триспецифическом Ab антитело к CD28 обеспечивает вторичную передачу сигналов, необходимую для поддержания первичной пролиферации Т-клеток in vitro.

На фиг. 27 показана конфигурация триспецифического антитела с цветовым обозначением родительского антитела (слева). Темные оттенки (фиолетовый или зеленый) обозначают пептиды тяжелой цепи; светлые оттенки обозначают пептиды легкой цепи. Также показана структурная модель триспецифического Ab CD38_VH1/CD28_supxCD3_mid, основанная на кристаллических структурах антител Fab CD38 VH1 и CD28_sup/CD3_mid CODV Fab (справа).

На фиг. 28A и 28B показано, что клетки множественной миеломы (ММ) с высокой (RPMI-8226; фиг. 28A) и низкой (KMS-11; фиг. 28B) поверхностной экспрессией CD38 подвергались эффективному лизису за счет PBMC человека (E:T=10:1), инкубированных с триспецифическим Ab в разных концентрациях. Вклад в киллерную активность каждого сайта связывания был продемонстрирован посредством мутаций КО сайта связывания, как указано.

На фиг. 29A-29C показано, что мутантное антитело к CD28_supKO в составе триспецифического Ab проявляло заметно сниженную противоопухолевую активность in vitro в отношении клеток CD38_high, CD38_mid и CD38_low MM. Представлены анализы с использованием клеток RPMI-8226 (фиг. 29A), U266 (фиг. 29B) или KMS-11 (фиг. 29C).

На фиг. 30 показано, что уменьшение опухолевой нагрузки в группах лечения триспецифическими антителами CD38_VH1/CD28_supxCD3_mid_FALA было дозозависимым и статистически различающимся в модели линии клеток диссеминированной множественной миеломы человека с использованием мышей NSG, восстановленной in vitro с помощью амплифицированных первичных Т-клеток человека.

На фиг. 31A и 31B показан витальный микроскопический анализ цитолиза миеломных клеток, обусловленного триспецифическим Ab CD38, in vitro в присутствии первичных Т-клеток человека. Цейтраферную съемку микроскопических изображений выполняли с использованием отрицательного контроля (триспецифический тройной KO; фиг. 31A) или триспецифеского Ab CD38/CD28xCD3 (фиг. 31B) с использованием PBMC человека, инкубированных с линией клеток миеломы RPMI-8226, меченых глубоким красным красителем CellTracker™. Представленные изображения были собраны после 24-часовой инкубации. Масштабная метка: 50 мкм

На фиг. 32 показаны альтернативные мутации в Fc-участке IgG4, полученном с целью анализа в анализах связывания с Fc-рецептором. Показаны SEQ ID NO:111-116 (сверху вниз соответственно).

На фиг. 33 показаны результаты анализов SPR для измерения аффинности Fc-вариантов IgG4 и указанных Fc-рецепторов человека.

На фиг. 34 показано, что триспецифический связывающий белок-антитело к CD38 с минимальным связыванием с FcR снижает неспецифическое высвобождение цитокинов в РВМС человека in vitro. Различные мутации, инактивирующие FcR (как указано), анализировали в отношении их провоспалительного действия в отношении изотипа IgG4 человека. РВМС человека инкубировали в среде (нестимулированной) или в присутствии клеток миеломы, RPMI-8226 (стимулированная), и столбики указывают уровни супернатанта IFN-γ, измеренные с помощью ELISA.

На фиг. 35 показано, что триспецифический связывающий белок к CD38 с минимальным связыванием FcR обеспечивает лизис клеток множественной миеломы человека с разными уровнями экспрессии CD38. Цитолиз клеток миеломы с IgG4 или указанными мутациями Fc оценивали in vitro с использованием PBMC человека с указанными опухолевыми мишенями.

На фиг. 36 показано сравнение цитолитической активности in vitro триспецифического антитела Ab к CD38/CD28/CD3 и антитела к CD38 даратумумаба, измеренное с использованием PBMC человека в качестве эффекторных клеток к клеточным линиям RPMI-8226, U266 и KMS-11 (E:T =10:1).

На фиг. 37A-37D показана характеристика размножения подгруппы Т-клеток in vitro в ответ на CD38/CD3xCD28. Оценку размножения подгруппы Т-клеток осуществляли путем покрытия лунок при помощи 350 нг/лунка триспецифического Ab к CD38 в отсутствие экзогенных цитокинов. Популяции Т-клеток измеряли в указанные моменты времени. Трижды мутантное триспецифическое ab использовали как отрицательный контроль. Проточную цитометрию использовали для определения центральных и эффекторных CD4 T-клеток памяти (фиг. 37A), T-хелперных клеток (фиг. 37B), центральных и эффекторных CD8 T-клеток памяти (фиг. 37C) и pp65 CMV-специфических клеток CD8 (фиг. 37D), как это описано в примере 12. Анализ CMV-специфичных эффекторных клеток pp65 проводили путем окрашивания пентамером PBMC от доноров HLA-A2 CMV+, обработанных триспецифическим CD38 или трижды отрицательным контролем.

На фиг. 38 показан вклад экспрессии CD28 на целевых клетках в отношении восприимчивости к цитолизу посредством CD38/CD3xCD28. CD28 нокаутировали в клетках KMS-11 с использованием генного нацеливания CRISPR/Cas 9 и использовали как цитолитические мишени in vitro. По сравнению с родительским KMS-11, экспрессия CD38 сохранялась, а CD28 удалялся, что продемонстрировано с помощью проточной цитометрии (верхняя панель, KMS-11 и KMS-11 (CD28KO). Цитолиз клеток CD28 KO исследовали с помощью WT или триспецифического CD28 null (нижняя панель; триспецифический и триспецифический (CD28KO)).

На фиг. 39 показана цитолитическая активность CD38/CD28xCD3 триспецифического мутантного по FALA Ab в отношении указанных CD38⁺CD28^- линий, в том числе линий клеток острого миелоцитарного лейкоза (AML (KG-1)), В-клеточной лимфомы (OCI-Ly19), острого Т-лимфоцитарного лейкоза (ALL (KOPN8)) и хронической лимфоцитарной лимфомы (CLL(Z-138)).

На фиг. 40 показано, что активация РВМС человека in vitro посредством суперагониста α-CD28 требует бивалентности антитела.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящем изобретении представлен связывающий белок, содержащий по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD38.

I. Общие определения

Используемые в соответствии с настоящим изобретением следующие термины, если не указано иное, следует понимать как имеющие следующие значения. Если контекстом не требуется иное, термины в единственном числе будут включать формы множественного числа, и термины во множественном числе будут включать форму единственного числа. Используемая в данном подробном описании и прилагаемой формуле изобретения форма единственного числа включают ссылку на форму множественного числа, если в содержании прямо не указано иное. Таким образом, например, ссылка на «молекулу» необязательно включает комбинацию двух или более таких молекул и им подобное.

Понятно, что аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в данном документе, включают аспекты и варианты осуществления «содержащие», «состоящие из» и/или «по сути состоящие из».

Используемый в данном документе термин "полинуклеотид" относится к полимерам в виде однонитевой или двунитевой нуклеиновой кислоты, имеющих длину по меньшей мере 10 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления нуклеотиды, составляющие полинуклеотид, могут представлять собой рибонуклеотиды, или дезоксирибонуклеотиды, или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Такие модификации включают модификации оснований, как, например, бромуридин, модификации рибозы, как, например, арабинозид и 2',3'-дидезоксирибоза, и модификации межнуклеотидных связей, как, например, фосфотиоат, фосфодитиоат, фосфоселеноат, фосфодиселеноат, фосфоанилотиоат, фосфоаниладат и фосфоамидат. Термин "полинуклеотид" конкретно подразумевает однонитевые и двунитевые формы ДНК.

"Выделенный полинуклеотид" представляет собой полинуклеотид, имеющий геномное, кДНК- или синтетическое происхождение или характеризующийся некоторой их комбинацией, который: (1) не ассоциирован со всем полинуклеотидом, в котором выделенный полинуклеотид встречается в природе, или его частью, (2) связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе в виде части более крупной последовательности.

"Выделенный полипептид" представляет собой такой полипептид, который: (1) не содержит по меньшей мере некоторых других полипептидов, с которыми он обычно встречается, (2) фактически не содержит других полипептидов из одного и того же источника, например, из одного и того же вида, (3) экспрессируется клеткой из другого вида, (4) был отделен по меньшей мере от приблизительно 50 процентов полинуклеотидов, липидов, углеводов или других веществ, с которыми он связан в природе, (5) не связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) с частями полипептида, с которыми "выделенный полипептид" связан в природе, (6) функционально связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (7) не встречается в природе. Такой выделенный полипептид может кодироваться геномной ДНК, кДНК, мРНК или другой РНК синтетического происхождения или любой их комбинацией. Предпочтительно выделенный полипептид по сути не содержит полипептидов или других контаминантов, которые встречаются в его природном окружении, которые бы вызывали затруднения при его применении (терапевтическом, диагностическом, профилактическом, исследовательском или ином).

Встречающиеся в природе антитела обычно представляют собой тетрамер. Каждый такой тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну полноразмерную "легкую" цепь (обычно имеющую молекулярную массу приблизительно 25 кДа) и одну полноразмерную "тяжелую" цепь (обычно имеющую молекулярную массу приблизительно 50-70 кДа). Используемые в данном документе термины "тяжелая цепь" и "легкая цепь" обозначают любой полипептид иммуноглобулина, содержащий последовательность вариабельного домена, достаточную для придания специфичности в отношении антигена-мишени. Аминоконцевая часть каждой легкой и тяжелой цепей обычно содержит вариабельный домен из приблизительно 100-110 аминокислот или больше, который обычно отвечает за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи обычно определяет константный домен, ответственный за эффекторную функцию. Таким образом, во встречающемся в природе антителе полноразмерный полипептид, представляющий собой тяжелую цепь иммуноглобулина, содержит вариабельный домен (V_H) и три константных домена (C_H1, C_H2 и C_H3), где домен V_H находится на аминоконце полипептида, а домен C_H3 находится на карбоксильном конце, и полноразмерный полипептид, представляющий собой легкую цепь иммуноглобулина, содержит вариабельный домен (V_L) и константный домен (C_L), где домен V_L находится на аминоконце полипептида, а домен C_L находится на карбоксильном конце.

Легкие цепи человека обычно классифицируют как легкие каппа- и лямбда-цепи, а тяжелые цепи человека обычно классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и они определяют изотип антитела IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. IgG имеет несколько подклассов, в том числе без ограничения IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, в том числе без ограничения IgM1 и IgM2. IgA аналогичным образом подразделяют на подклассы, в том числе без ограничения IgA1 и IgA2. В полноразмерных легких и тяжелых цепях вариабельные и константные домены обычно соединены с помощью "J"-участка из приблизительно 12 или больше аминокислот, при этом тяжелая цепь также содержит "D"-участок из приблизительно 10 или больше аминокислот. См., например, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., Raven Press, 2nd ed., 1989), которая включена посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь обычно образуют антигенсвязывающий сайт. Вариабельные домены встречающихся в природе антител обычно характеризуются одинаковой общей структурой относительно консервативных каркасных участков (FR), соединенных с помощью трех гипервариабельных участков, также называемых определяющими комплементарность участками или CDR. CDR из двух цепей каждой пары обычно выровнены с помощью каркасных участков, что может обеспечивать возможность связывания со специфическим эпитопом. От аминоконца к карбоксильному концу вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепей обычно содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.

Термин "совокупность CDR" обозначает группу из трех CDR, которые содержатся в одном вариабельном участке, способном связывать антиген. Точные границы этих CDR определяли по-разному в соответствии с различными системами. Система, описанная Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд. (1987) и (1991)), не только предусматривает однозначную систему нумерации остатков, применимую к любому вариабельному участку антитела, но также предусматривает точные границы остатков, определяющие три CDR. Эти CDR могут называться CDR в соответствии с Kabat. Chothia и коллеги (Chothia и Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83) обнаружили, что определенные субфрагменты в пределах CDR в соответствии с Kabat принимают почти идентичные конформации пептидного каркаса, несмотря на наличие большого различия на уровне аминокислотной последовательности. Эти субфрагменты были обозначены как L1, L2 и L3 или H1, H2 и H3, где "L" и "H" обозначают участки легкой цепи и тяжелой цепи соответственно. Эти участки могут называться CDR в соответствии с Chothia, границы которых совпадают с CDR в соответствии с Kabat. Другие границы, определяющие CDR, которые совпадают с CDR в соответствии с Kabat, были описаны Padlan, 1995, FASEB J. 9: 133-39; MacCallum, 1996, J. Mol. Biol. 262(5): 732-45; и Lefranc, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77. Еще одни определения границ CDR могут не строго соответствовать одной из систем, приведенных в данном документе, но тем не менее будут совпадать с CDR в соответствии с Kabat, несмотря на то, что они могут быть укорочены или удлинены с учетом прогностических или экспериментальных выводов о том, что конкретные остатки или группы остатков или даже все CDR не влияют в значительной степени на связывание антигена. В способах, используемых в данном документе, можно использовать CDR, определенные в соответствии с любой из этих систем, несмотря на то, что в определенных вариантах осуществления применяют CDR, определенные в соответствии с Kabat или Chothia. Идентификация прогнозируемых CDR с помощью аминокислотной последовательности хорошо известна в данной области техники, например, в Martin, A.C. "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains" в Antibody Engineering, Vol. 2. Kontermann R., Dübel S., eds. Springer-Verlag, Berlin, p. 33-51 (2010). Аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи можно также исследовать с целью идентификации последовательностей CDR с помощью других традиционных способов, например, путем сравнения с известными аминокислотными последовательностями других вариабельных участков тяжелой и легкой цепей с определением участков гипервариабельности в последовательности. Пронумерованные последовательности можно выравнивать вручную или путем использования программы выравнивания, такой как одна из пакета программ CLUSTAL, как описано в Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80. Молекулярные модели традиционно используют для того, чтобы правильно определить каркасные и CDR-участки и таким образом скорректировать основанные на последовательности выравнивания.

В некоторых вариантах осуществления определение CDR/FR в легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина следует давать на основании определения по IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org).

Используемый в данном документе термин "Fc" обозначает молекулу, будь то в мономерной или мультимерной форме, содержащую последовательность, не являющуюся частью антигенсвязывающего фрагмента, которая получена в результате расщепления антитела или получена другими способами, и при этом она может содержать шарнирный участок. Исходный иммуноглобулиновый источник нативного Fc предпочтительно происходит от человека и может представлять собой любой из иммуноглобулинов. Молекулы Fc составлены из мономерных полипептидов, которые могут быть связаны в димерные или мультимерные формы посредством ковалентной (т. е. дисульфидных связей) и нековалентной связи. Число межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Fc варьирует от 1 до 4 в зависимости от класса (например, IgG, IgA и IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2 и IgG4). Одним примером Fc является димер с дисульфидной связью, полученный в результате расщепления IgG папаином. Термин "нативный Fc", используемый в данном документе, является общим для мономерных, димерных и мультимерных форм.

F(ab)-фрагмент обычно содержит одну легкую цепь и домены V_H и C_H1 одной тяжелой цепи, где часть V_H-C_H1 тяжелой цепи F(ab)-фрагмента не может образовывать дисульфидную связь с другим полипептидом тяжелой цепи. Как используется в данном документе, F(ab)-фрагмент также может содержать одну легкую цепь, содержащую два вариабельных домена, разделенных аминокислотным линкером, и одну тяжелую цепь, содержащую два вариабельных домена, разделенных аминокислотным линкером, и домен C_H1.

F(ab')-фрагмент обычно содержит одну легкую цепь и часть одной тяжелой цепи, которая содержит большую часть константного участка (между доменами C_H1 и C_H2), вследствие чего межцепочечная дисульфидная связь может быть образована между двумя тяжелыми цепями с образованием молекулы F(ab')₂.

Используемый в данном документе термин «связывающий белок» относится к не встречающейся в природе (или рекомбинантной, или сконструированной) молекуле, которая специфически связывается с по меньшей мере одним целевым антигеном, например полипептидом CD38 по настоящему изобретению.

"Рекомбинантная" молекула представляет собой молекулу, которая была получена, экспрессирована, создана или выделена рекомбинантными способами.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлены связывающие белки, характеризующиеся биологической и иммунологической специфичностью в отношении одного-трех антигенов-мишеней. В другом варианте осуществления настоящего изобретения представлены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные цепи, которые образуют такие связывающие белки. В другом варианте осуществления настоящего изобретения представлены векторы экспрессии, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные цепи, которые образуют такие связывающие белки. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения представлены клетки-хозяева, которые экспрессируют такие связывающие белки (т. е. содержащие молекулы нуклеиновой кислоты или векторы, кодирующие полипептидные цепи, которые образуют такие связывающие белки).

Используемый в данном документе термин "способность к обмену" обозначает способность к взаимозамене вариабельных доменов в формате связывающего белка, при этом с сохранением укладки и наивысшей аффинности связывания. "Способность к полному обмену" относится к способности менять порядок доменов как V_H1, так и V_H2 и, следовательно, порядок доменов V_L1 и V_L2 в полипептидной цепи формулы I или полипептидной цепи формулы II (т. е. обращать порядок), при этом поддерживая полную функциональность связывающего белка, о чем свидетельствует сохранение аффинности связывания. Кроме того, следует отметить, что обозначения V_H и V_L относятся лишь к положению домена в конкретной белковой цепи в конечном формате. Например, V_H1 и V_H2 могут быть получены из доменов V_L1 и V_L2 исходных антител и введены в положения, соответствующие V_H1 и V_H2 связывающего белка. Аналогично V_L1 и V_L2 могут быть получены из доменов V_H1 и V_H2 исходных антител и помещены в положения, соответствующие V_H1 и V_H2 связывающего белка. Таким образом, обозначения V_H и V_L относятся к существующему в данный момент положению, а не к первоначальному положению в исходном антителе. Следовательно, домены V_H и V_L являются "способными к обмену".

Используемый в данном документе термин "антиген", или "антиген-мишень", или "целевой антиген" обозначает молекулу или часть молекулы, которая может связываться связывающим белком и дополнительно может использоваться у животного для получения антител, способных связываться с эпитопом этого антигена. Антиген-мишень может иметь один или более эпитопов. С учетом того, что каждый антиген-мишень распознается связывающим белком, связывающий белок способен конкурировать с интактным антителом, которое распознает антиген-мишень.

"CD38" означает полипептид 38 кластера дифференцировки и представляет собой гликопротеин, обнаруживаемый на поверхности многих иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывает внеклеточный домен одного или более полипептидов CD38. Иллюстративные последовательности внеклеточного домена полипептида CD38 включают без ограничения внеклеточный домен CD38 человека (например, представленный под SEQ ID NO:1) и внеклеточный домен CD38 макака-крабоеда (например, представленный под SEQ ID NO:30).

Термин "рекрутер T-клеток" обозначает связывающие белки, направленные на иммунную систему хозяина, более конкретно на цитотоксическую активность T-клеток, а также направленные на опухолевый белок-мишень.

Термин "моноспецифический связывающий белок" обозначает связывающий белок, который специфически связывается с одним антигеном-мишенью.

Термин "моновалентный связывающий белок" обозначает связывающий белок, который имеет один антигенсвязывающий сайт.

Термин "биспецифический связывающий белок" обозначает связывающий белок, который специфически связывается с двумя различными антигенами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления биспецифический связывающий белок связывается с двумя разными антигенами. В некоторых вариантах осуществления биспецифический связывающий белок связывается с двумя разными эпитопами на одном и том же антигене.

Термин "бивалентный связывающий белок" обозначает связывающий белок, который имеет два связывающих участка.

Термин "триспецифический связывающий белок" обозначает связывающий белок, который специфически связывается с тремя различными антигенами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления триспецифический связывающий белок связывается с тремя разными антигенами. В некоторых вариантах осуществления триспецифический связывающий белок связывается с одним, двумя или тремя разными эпитопами на одном и том же антигене.

Термин "тривалентный связывающий белок" обозначает связывающий белок, который имеет три связывающих участка. В конкретных вариантах осуществления тривалентный связывающий белок может связываться с одним антигеном-мишенью. В других вариантах осуществления тривалентный связывающий белок может связываться с двумя антигенами-мишенями. В других вариантах осуществления тривалентный связывающий белок может связываться с тремя антигенами-мишенями.

"Выделенный" связывающий белок представляет собой связывающий белок, который был идентифицирован и отделен и/или извлечен из компонента своего природного окружения. Компоненты-контаминанты из его природного окружения представляют собой вещества, которые бы вызывали затруднения при диагностических или терапевтических применениях связывающего белка, и могут включать ферменты, гормоны и другие растворенные вещества белковой или небелковой природы. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок будет очищенным: (1) до более чем 95% по весу антитела, как определяется способом Лоури, и наиболее предпочтительно до более чем 99% по весу, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с применением секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с применением кумасси голубого или предпочтительно серебряного красителя. Выделенные связывающие белки включают связывающий белок in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения связывающего белка не будет присутствовать.

Используемые в данном документе термины "в значительной степени чистый" или "в значительной степени очищенный" обозначают соединение или структуру, которая является преобладающей присутствующей структурой (т. е. в расчете на моль она более многочисленна, чем любая другая отдельная структура в композиции). В некоторых вариантах осуществления в значительной степени очищенная фракция представляет собой композицию, где структура составляет по меньшей мере приблизительно 50% (в расчете на моль) от всех присутствующих макромолекулярных структур. В других вариантах осуществления в значительной степени чистая композиция будет содержать более чем приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% от всех макромолекулярных структур, присутствующих в композиции. В еще одних вариантах осуществления структура является очищенной до необходимой гомогенности (загрязняющие структуры не могут быть выявлены в композиции с помощью традиционных способов выявления), где композиция состоит фактически из одной макромолекулярной структуры.

Термин "эпитоп" подразумевает любую детерминанту, предпочтительно полипептидную детерминанту, способную специфически связываться с иммуноглобулином или T-клеточным рецептором. В определенных вариантах осуществления эпитопные детерминанты включают химически активные поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в определенных вариантах осуществления могут иметь специфические характеристики трехмерной структуры и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп представляет собой участок антигена, которая связывается антителом или связывающим белком. В определенных вариантах осуществления считается, что связывающий белок специфически связывает антиген, если он предпочтительно распознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул. В некоторых вариантах осуществления считается, что связывающий белок специфически связывает антиген, если равновесная константа диссоциации составляет ≤ 10^-8 M, более предпочтительно если равновесная константа диссоциации составляет ≤ 10^-9 M и наиболее предпочтительно если константа диссоциации составляет ≤ 10^-10 M.

Константу диссоциации (K_D) связывающего белка можно определить, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса. В целом в анализе поверхностного плазмонного резонанса измеряют связывающие взаимодействия между лигандом (антигеном-мишенью на биосенсорной матрице) и аналитом (связывающим белком в растворе) в реальном времени с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с применением системы BIAcore (Pharmacia Biosensor; Пискатауэй, Нью-Джерси). Анализ поверхностного плазмонного резонанса можно также выполнять посредством иммобилизации аналита (связывающего белка на биосенсорной матрице) и представления лиганда (антигена-мишени). Используемый в данном документе термин "K_D" обозначает константу диссоциации взаимодействия между конкретным связывающим белком и антигеном-мишенью.

Используемый в данном документе термин «связывается с» в ссылке на связывающий белок обозначает способность связывающего белка или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с антигеном, содержащим эпитоп, с Kd, составляющей по меньшей мере приблизительно 1×10^-6 M, 1×10^-7 M, 1×10^-8 M, 1×10^-9 M, 1×10^-10 M, 1×10^-11 M, 1×10^-12 M или больше, и/или связываться с эпитопом с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза превышает его аффинность к неспецифическому антигену. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывается с двумя или более антигенами, например, полипептидом CD38 человека и макака-крабоеда.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен и/или связывающий белок по настоящему изобретению «перекрестно реагирует» с полипептидами CD38 человека и макака-крабоеда, например, внеклеточными доменами CD38, такими как SEQ ID NO:1 (изоформа A CD38 человека), SEQ ID NO:105 (изоформа E CD38 человека) и SEQ ID NO:30 (CD38 макака-крабоеда). Связывание связывающего белка с антигеном 1(Ag1) является «перекрестно реактивным» в отношении антигена 2 (Ag2), если значения EC50 находятся в аналогичном диапазоне для обоих антигенов. В настоящей заявке связывание связывающего белка с Ag1 является перекрестно-реактивным в отношении Ag2, если соотношение аффинности к Ag2 и аффинности к Ag1 равно 10 или меньше (например, 5, 2, 1 или 0,5), при этом аффинности измеряют с помощью одного и того же метода в случае обоих антигенов.

Связывание связывающего белка с Ag1 не является «в значительной степени перекрестно-реактивным» в отношении Ag2, если показатели аффинности к этим двум антигенам очень отличаются. Аффинность к Ag2 может не поддаваться измерению, если реакция связывания является слишком слабой. В настоящей заявке связывание связывающего белка с Ag1 не является в значительной степени перекрестно-реактивным в отношении Ag2, если реакция связывания связывающего белка с Ag2 составляет менее 5% от реакции связывания того же самого связывающего белка с Ag1 при тех же экспериментальных условиях и при той же концентрации антитела. На практике используемая концентрация связывающего белка может составлять EC50 или концентрацию, требуемую для достижения плато насыщения, наблюдаемого в случае Ag1.

Используемый в данном документе термин "линкер" обозначает один или более аминокислотных остатков, вставленных между доменами иммуноглобулина для обеспечения подвижности, достаточной для того, чтобы домены легкой и тяжелой цепей сворачивались в иммуноглобулины с кроссоверными двумя вариабельными участками. Линкер вставляют в переходный участок между вариабельными доменами или между вариабельным и константным доменами, соответственно, на уровне последовательности. Переходный участок между доменами можно идентифицировать, поскольку приблизительный размер доменов иммуноглобулина хорошо известен. Точное местоположение переходного участка между доменами можно определить путем определения положения пептидных отрезков, которые не образуют элементов со вторичной структурой, такой как бета-слои или альфа-спирали, что показано с помощью экспериментальных данных или что можно прогнозировать с помощью методик моделирования или прогнозирования вторичной структуры. Линкеры, описанные в данном документе, обозначены как L₁, который расположен на легкой цепи между C-концом домена V_L2 и N-концом домена V_L1; и L₂, который расположен на легкой цепи между C-концом домена V_L1 и N-концом домена C_L. Линкеры тяжелой цепи называют как L₃, который расположен между C-концом домена V_H1 и N-концом домена V_H2; и L₄, который расположен между C-концом домена V_H2 и N-концом домена C_H1.

Используемый в данном документе термин "вектор" относится к любой молекуле (например, нуклеиновой кислоте, плазмиде или вирусу), используемой для переноса закодированной информации в клетку-хозяина. Термин "вектор" подразумевает молекулу нуклеиновой кислоты, которая способна транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой ее связали. Одним типом вектора является "плазмида", которая обозначает кольцевую двунитевую молекулу ДНК, в которую могут быть вставлены дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, при этом в геном вируса могут быть вставлены дополнительные сегменты ДНК. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы для млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы для млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина, и за счет этого они реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном документе "рекомбинантными векторами экспрессии" (или просто "векторами экспрессии"). Как правило, векторы экспрессии, полезные в технологиях рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. Термины "плазмида" и "вектор" могут использоваться взаимозаменяемо в данном документе, поскольку плазмида является наиболее широко используемой формой вектора. Однако подразумевается, что в настоящее изобретение включены и другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы с дефектной репликацией), которые выполняют эквивалентные функции.

Используемая в данном документе фраза "рекомбинантная клетка-хозяин" (или "клетка-хозяин") обозначает клетку, в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии. Подразумевается, что рекомбинантная клетка-хозяин или клетка-хозяин обозначают не только конкретную рассматриваемую клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут возникать определенные модификации вследствие мутации либо влияний окружающей среды, такое потомство в действительности может не быть идентичным родительской клетке, однако такие клетки по-прежнему включены в объем используемого в данном документе термина "клетка-хозяин". Широкое разнообразие систем экспрессии в клетке-хозяине можно применять для экспрессии связывающих белков, в том числе системы экспрессии на основе бактерий, дрожжей, бакуловирусов и клеток млекопитающих (а также системы экспрессии на основе фагового дисплея). Примером подходящего бактериального вектора экспрессии является pUC19. Для рекомбинантной экспрессии связывающего белка клетку-хозяина трансформируют или трансфицируют одним или более рекомбинантными векторами экспрессии, несущими фрагменты ДНК, кодирующие полипептидные цепи связывающего белка, вследствие чего полипептидные цепи экспрессируются в клетке-хозяине и предпочтительно секретируются в среду, в которой клетки-хозяева культивируются, при этом из данной среды можно извлечь связывающий белок.

Используемый в данном документе термин "трансформация" обозначает изменение генетических характеристик клетки, и при этом клетка была трансформирована, если ее модифицировали с тем, чтобы она содержала новую ДНК. Например, клетка является трансформированной, если она генетически модифицирована по сравнению с ее нативным состоянием. После трансформации трансформирующая ДНК может подвергаться рекомбинации с ДНК клетки путем физической интеграции в хромосому клетки, или может временно сохраняться в виде эписомального элемента без репликации, или может реплицироваться независимо как плазмида. Считается, что клетка является стабильно трансформированной, если ДНК реплицируется при делении клетки. Используемый в данном документе термин "трансфекция" обозначает захват чужеродной или экзогенной ДНК клеткой, и при этом клетка была "трансфицирована", если экзогенную ДНК ввели внутрь от клеточной мембраны. Ряд методик трансфекции хорошо известен из уровня техники. Такие методики можно применять для введения одной или более экзогенных молекул ДНК в подходящие клетки-хозяева.

Используемый в данном документе термин "встречающийся в природе" и применяемый в отношении объекта обозначает тот факт, что объект может обнаруживаться в природе и не был подвергнут манипуляциям со стороны человека. Например, полинуклеотид или полипептид, присутствующий в организме (в том числе вирусах), который может быть выделен из природного источника и который не был преднамеренно модифицирован человеком, является встречающимся в природе. Аналогично используемый в данном документе термин "не встречающийся в природе" обозначает объект, который не обнаруживается в природе или который был структурно модифицирован или синтезирован человеком.

Как используется в данном документе, двадцать стандартных аминокислот и их аббревиатуры соответствуют общепринятой практике. Стереоизомеры (например, d-аминокислоты) двадцати стандартных аминокислот; не встречающиеся в природе аминокислоты и аналоги, такие как α-,α-двузамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нестандартные аминокислоты также могут быть подходящими компонентами полипептидных цепей связывающих белков. Примеры нестандартных аминокислот включают 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-N, N,N-триметиллизин, ε-N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-N-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В системе обозначений полипептидов, используемой в данном документе, левое направление представляет собой направление в сторону аминоконца, а правое направление представляет собой направление в сторону карбоксильного конца в соответствии со стандартной практикой и правилами.

Встречающиеся в природе остатки можно разделить на классы на основании общих свойств боковой цепи:

(1) гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;

(2) полярные гидрофобные: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;

(3) алифатические: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;

(4) алифатические гидрофобные: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;

(5) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(6) кислые: Asp, Glu;

(7) основные: His, Lys, Arg;

(8) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(9) ароматические: His, Trp, Tyr, Phe; и

(10) ароматические гидрофобные: Phe, Trp, Tyr.

Консервативные аминокислотные замены могут включать обмен представителя одного из этих классов на другого представителя того же класса. Неконсервативные замены могут включать обмен представителя одного из этих классов на представителя другого класса.

Специалист в данной области техники сможет определить подходящие варианты полипептидных цепей связывающих белков с помощью общеизвестных методик. Например, специалист в данной области техники может идентифицировать подходящие участки в полипептидной цепи, которые можно изменить без нарушения активности, путем нацеливания на участки, которые, как предполагается, не являются важными с точки зрения активности. Альтернативно специалист в данной области техники может идентифицировать остатки и части молекул, которые являются консервативными среди схожих полипептидов. Кроме того, даже участки, которые могут быть важными с точки зрения биологической активности или с точки зрения структуры, могут подвергаться консервативным аминокислотным заменам без нарушения биологической активности или без неблагоприятного воздействия на структуру полипептида.

Используемый в данном документе термин «пациент» включает людей и животных (например, млекопитающих, таких как собаки, свиньи, лошади, кошки, коровы и т. д.).

Используемые в данном документе термины "лечение" или "лечить" обозначают как терапевтическое лечение, так и профилактические или превентивные меры. К нуждающимся в лечении относят тех, у которых имеется нарушение, а также тех, которые предрасположены к нарушению, или тех, у которых нужно предупредить нарушение. В конкретных вариантах осуществления связывающие белки можно применять для лечения людей с раком или людей, подверженных раку, или для уменьшения тяжести рака у субъекта-человека. Связывающие белки также можно применять для предупреждения рака у пациента-человека. В конкретных вариантах осуществления рак представляет собой множественную миелому, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, лимфому, рак молочной железы, такой как рак молочной железы Her2+, рак предстательной железы, В-клеточную лимфому из клеток зародышевого центра или В-клеточный острый лимфобластный лейкоз.

Используемые в данном документе термины "фармацевтическая композиция" или "терапевтическая композиция" обозначают соединение или композицию, способные индуцировать необходимый терапевтический эффект при введении пациенту должным образом.

Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" или "физиологически приемлемый носитель" обозначает одно или более веществ состава, подходящие для осуществления или улучшения доставки связывающего белка.

Термины "эффективное количество" и "терапевтически эффективное количество" при использовании в отношении фармацевтической композиции, содержащей один или более связывающих белков, обозначают количество или дозу, достаточные для получения необходимого терапевтического результата. Более конкретно, терапевтически эффективное количество представляет собой количество связывающего белка, достаточное для ингибирования, на некоторый период времени, одного или более клинически определенных патологических процессов, ассоциированных с состоянием, подлежащим лечению. Эффективное количество может меняться в зависимости от конкретного связывающего белка, подлежащего применению, а также зависит от ряда факторов и состояний, связанных с пациентом, подлежащим лечению, и тяжестью нарушения. Например, если связывающий белок подлежит введению in vivo, то факторы, такие как возраст, масса тела и состояние здоровья пациента, а также кривые зависимости "доза-эффект" и данные о токсичности, полученные в доклиническом исследовании на животных, будут входить в число таковых учитываемых факторов. Определение эффективного количества или терапевтически эффективного количества указанной фармацевтической композиции находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество связывающего белка.

II. CD38-связывающие белки

Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к связывающим белкам, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD38 (например, полипептиды CD38 человека и макака-крабоеда). В некоторых вариантах осуществления связывающие белки являются моноспецифическими и/или моновалентными, биспецифическими и/или бивалентными, триспецифическими и/или тривалентными или полиспецифическими и/или поливалентными.

В данном документе описано множество характеристик иллюстративных моноспецифических, биспецифических или триспецифических связывающих белков. Например, в некоторых вариантах осуществления связывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент перекрестно реагирует с CD38 человека (например, полипептидом CD38 изоформы А и/или изоформы Е человека) и CD38 макака-крабоеда. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок индуцирует апоптоз CD38+ клетки. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок осуществляет рекрутинг Т-клетку к CD38+ клетке и необязательно активирует Т-клетку (например, посредством стимуляции TCR и/или костимуляции).

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQG (SEQ ID NO:132), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления связывающие белки содержат 1, 2, 3, 4, 5, или 6 CDR из последовательности домена VH и/или VL из антитела mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5, mAb6, mAb2xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A или mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, как показано в таблице G, H или I.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36).

В некоторых вариантах осуществления связывающие белки содержат антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления связывающие белки содержат антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В других вариантах осуществления связывающие белки содержат антигенсвязывающий сайт, содержащий: вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления связывающие белки содержат антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36).

В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит в направлении от N-конца к C-концу последовательность FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4; где FR1 содержит последовательность QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:87) или QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS (SEQ ID NO:88); где FR2 содержит последовательность MHWVKEAPGQRLEWIGY (SEQ ID NO:90) или MHWVKEAPGQGLEWIGY (SEQ ID NO:91); где FR3 содержит последовательность NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO:93) или NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO:94); и где FR4 содержит последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:96). В некоторых вариантах осуществления домен VL содержит в направлении от N-конца к C-концу последовательность FR1-CDR-L1-FR2-CDR-L2-FR3-CDR-L3-FR4; где FR1 содержит последовательность DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRAS (SEQ ID NO:97); где FR2 содержит последовательность MHWYQQKPGQPPRLLIY (SEQ ID NO:99); где FR3 содержит последовательность SRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:101); и где FR4 содержит последовательность FGGGTKLEIK (SEQ ID NO:103).

В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:5; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:17; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:21; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:23; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:13; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:14.

В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:5; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:17; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:21; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:23; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:13; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:14.

В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:17, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:21, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:23, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:7, и/или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:19, и/или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:22, и/или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:24, и/или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:15, и/или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:7, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:19, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:22, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:24, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:15, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления связывающие белки содержат антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43); или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления связывающие белки содержат антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43); и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46).

В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит в направлении от N-конца к C-концу последовательность FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4; где FR1 содержит последовательность QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS (SEQ ID NO:89); где FR2 содержит последовательность MHWVRQAPGKGLEWVAV (SEQ ID NO:92); где FR3 содержит последовательность YYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:95); и где FR4 содержит последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:96). В некоторых вариантах осуществления домен VL содержит в направлении от N-конца к C-концу последовательность FR1-CDR-L1-FR2-CDR-L2-FR3-CDR-L3-FR4; где FR1 содержит последовательность AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS (SEQ ID NO:98); где FR2 содержит последовательность GWYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:100); где FR3 содержит последовательность SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYC (SEQ ID NO:102); и где FR4 содержит последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:104).

В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:9; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:10.

В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:9; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:9, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:10.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:11, или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:12. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:11, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:12.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей CDR из последовательности антитела, показанной в таблице G. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей CDR, последовательность домена VH и/или последовательность домена VL из последовательности антитела, показанной в таблице H. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей CDR, последовательность домена VH и/или последовательность домена VL из последовательности антитела, показанной в таблице I. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит 1, 2, 3 или 4 полипептидные последовательности, показанные в таблице I.

Таблица G. Последовательности CDR связывающих белков-антител к CD38

Ab CDR_H1 CDR_H2 CDR_H3 CDR_L1 CDR_L2 CDR_L3 mAb1 GYTFTSFN
(SEQ ID NO:31) IYPGNGGT
(SEQ ID NO:32) ARTGGLRRAYFTY
(SEQ ID NO:33) ESVDSYGNGF
(SEQ ID NO:34) LAS
(SEQ ID NO:35) QQNKEDPWT
(SEQ ID NO:36) mAb2 GYTFTSYA
(SEQ ID NO:37) IYPGQGGT
(SEQ ID NO:38) ARTGGLRRAYFTY
(SEQ ID NO:33) QSVSSYGQGF
(SEQ ID NO:39) GAS
(SEQ ID NO:40) QQNKEDPWT
(SEQ ID NO:36) mAb3 GYTFTSFN
(SEQ ID NO:31) IYPGNGGT
(SEQ ID NO:32) ARTGGLRRAYFTY
(SEQ ID NO:33) ESVDSYGNGF
(SEQ ID NO:34) LAS
(SEQ ID NO:35) QQNKEDPWT
(SEQ ID NO:36) mAb4 GYTFTSFN
(SEQ ID NO:31) IYPGNGGT
(SEQ ID NO:32) ARTGGLRRAYFTY
(SEQ ID NO:33) ESVDSYGNGF
(SEQ ID NO:34) LAS
(SEQ ID NO:35) QQNKEDPWT
(SEQ ID NO:36) mAb5 GYTFTSFN
(SEQ ID NO:31) IYPGNGGT
(SEQ ID NO:32) ARTGGLRRAYFTY
(SEQ ID NO:33) ESVDSYGNGF
(SEQ ID NO:34) LAS
(SEQ ID NO:35) QQNKEDPWT
(SEQ ID NO:36) mAb6 GFTFSSYG
(SEQ ID NO:41) IWYDGSNK
(SEQ ID NO:42) ARMFRGAFDY
(SEQ ID NO:43) QGIRND
(SEQ ID NO:44) AAS
(SEQ ID NO:45) LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46)

Таблица H. Последовательности вариабельных доменов связывающих белков-антител к CD38 (mAb1-7) и других связывающих белков

Ab VH (белок) VL (белок) mAb1 QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:5) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:6 mAb2 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:13) DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASQSVSSYGQGFMHWYQQKPGQPPRLLIYGASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:14) mAb3 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17) DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18) mAb4 QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21) DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18) mAb5 QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23) DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18) mAb6 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:10) mAb7 Qvqlvqsgaevakpgtsvklsckasgytftdywmqwvkqrpgqglewigtiypgdgdtgyaqkfqgkatltadkssktvymhlsslasedsavyycargdyygsnsldywgqgtsvtvss (SEq ID NO:47) DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:48) Антитело к CD28_sup qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyyihwvrqapgqglewigsiypgnvntnyaqkfqgratltvdtsistaymelsrlrsddtavyyctrshygldwnfdvwgkgttvtvss (SEQ ID NO:49) diqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqniyvwlnwyqqkpgkapklliykasnlhtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpediatyycqqgqtypytfgqgtkleik (SEq ID NO:50) Антитело к CD28_cvn qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgfslsdygvhwvrqppgkglewlgviwagggtnynpslksrktiskdtsknqvslklssvtaadtavyycardkgysyyysmdywgqgttvtvss (SEQ ID NO:51) divltqspaslavspgqratitcrasesveyyvtslmqwyqqkpgqppkllifaasnvesgvparfsgsgsgtdftltinpveandvanyycqqsrkvpytfgqgtkleik (SEQ ID NO:52) Антитело к CD3_mid qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkqlewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvss (SEQ ID NO:53) divmtqtplslsvtpgqpasisckssqslvhnnantylswylqkpgqspqsliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycgqgtqypftfgsgtkveik (SEQ ID NO:54) Антитело к CD3_low qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkglewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvss (SEQ ID NO:84) divmtqtplslsvtpgqpasisckssqslvhnngntylswylqkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycgqgtqypftfgggtkveik (SEq ID NO:85)

Примечание: в аминокислотных последовательностях, приведенных выше, последовательности CDR выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.

Таблица I. Полноразмерные последовательности связывающих белков

mAb2xCD28supxCD3mid IgG4 FALA CD28supxCD3mid IgG4(впадина) FALA тяжелая цепь 1
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyyihwvrqapgqglewigsiypgnvntnyaqkfqgratltvdtsistaymelsrlrsddtavyyctrshygldwnfdvwgkgttvtvsssqvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkqlewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvssrtastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvctlppsqeemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg SEQ ID NO: 60 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Divmtqtplslsvtpgqpasisckssqslvhnnantylswylqkpgqspqsliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycgqgtqypftfgsgtkveikgqpkaapdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqniyvwlnwyqqkpgkapklliykasnlhtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpediatyycqqgqtypytfgqgtkleiktkgpsrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec SEQ ID NO: 61 mAb2 IgG4(выступ) FALA тяжелая цепь 2
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyamhwvkeapgqrlewigyiypgqggtnynqkfqgratltadtsastaymelsslrsedtavyfcartgglrrayftywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppcqeemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg SEQ ID NO: 62 mAb2 легкая цепь 2
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Divltqspatlslspgeratiscrasqsvssygqgfmhwyqqkpgqpprlliygassratgiparfsgsgsgtdftltisplepedfavyycqqnkedpwtfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec SEQ ID NO: 63 mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A CD28supxCD3mid IgG1(впадина) LALA P329A тяжелая цепь 1
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyyihwvrqapgqglewigsiypgnvntnyaqkfqgratltvdtsistaymelsrlrsddtavyyctrshygldwnfdvwgkgttvtvsssqvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkqlewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvssrtastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalaapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 64 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 61 mAb2 IgG1(выступ) LALA P329A тяжелая цепь 2
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyamhwvkeapgqrlewigyiypgqggtnynqkfqgratltadtsastaymelsslrsedtavyfcartgglrrayftywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalaapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 65 mAb2 легкая цепь 2
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 63 mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA CD28supxCD3mid IgG1(впадина) NNSA тяжелая цепь 1
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyyihwvrqapgqglewigsiypgnvntnyaqkfqgratltvdtsistaymelsrlrsddtavyyctrshygldwnfdvwgkgttvtvsssqvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkqlewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvssrtastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynnasrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 66 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 61 mAb2 IgG1(выступ) NNSA тяжелая цепь 2
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyamhwvkeapgqrlewigyiypgqggtnynqkfqgratltadtsastaymelsslrsedtavyfcartgglrrayftywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynnasrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 67 CD38VH1 легкая цепь 2
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 63 mAb6xCD28supxCD3mid IgG4 FALA CD28supxCD3mid IgG4(впадина) FALA тяжелая цепь 1
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 60 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 61 mAb6 IgG4(выступ) FALA тяжелая цепь 2
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadsvkgrftisgdnskntlylqmnslraedtavyycarmfrgafdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppcqeemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg SEQ ID NO: 68 mAb6 легкая 2
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) aiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirndlgwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisglqpedsatyyclqdyiyyptfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec SEQ ID NO: 69 mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A CD28supxCD3mid IgG1(впадина) LALA P329A тяжелая цепь 1
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 64 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 61 mAb6 IgG1(выступ) LALA P329A тяжелая цепь 2
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadsvkgrftisgdnskntlylqmnslraedtavyycarmfrgafdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalaapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 70 mAb6 легкая 2
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 69 mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA CD28supxCD3mid IgG1(впадина) NNSA тяжелая цепь 1
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 66 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 61 mAb6 IgG1(выступ) NNSA тяжелая цепь 2
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadsvkgrftisgdnskntlylqmnslraedtavyycarmfrgafdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynnasrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 71 mAb6 легкая 2
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO: 69 Моновалентное антитело mAb1 Тяжелая цепь mAb1 QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 7 Легкая цепь mAb1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLES
GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 8 Моновалентное антитело mAb2 Тяжелая цепь mAb2 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 15 Легкая цепь mAb2 DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASQSVSSYGQGFMHWYQQKPGQPPRLLIYGASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 16 Моновалентное антитело mAb3 Тяжелая цепь mAb3 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 19 Легкая цепь mAb3 DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 20 Моновалентное антитело mAb4 Тяжелая цепь mAb4 QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 22 Легкая цепь mAb4 DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 20 Моновалентное антитело mAb5 Тяжелая цепь mAb5 QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 24 Легкая цепь mAb5 DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 20 Моновалентное антитело mAb6 Тяжелая цепь mAb6 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 11 Легкая цепь mAb6 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 12 Моновалентное антитело mAb7 Тяжелая цепь mAb7 QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTGYAQKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 107 Легкая цепь mAb7 DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 106

Таблица J. Полноразмерные полинуклеотидные последовательности связывающих белков

mAb2xCD28supxCD3mid IgG4 FALA CD28supxCD3mid IgG4(впадина) FALA тяжелая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaggtcgtgaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctactacatccactgggtgcgccaggcccctggacagggactggaatggatcggcagcatctaccccggcaacgtgaacaccaactacgcccagaagttccagggcagagccaccctgaccgtggacaccagcatcagcaccgcctacatggaactgagccggctgagaagcgacgacaccgccgtgtactactgcacccggtcccactacggcctggattggaacttcgacgtgtggggcaagggcaccaccgtgacagtgtctagcagccaggtgcagctggtggaatctggcggcggagtggtgcagcctggcagaagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcaccaaggcctggatgcactgggtgcgccaggcccctggaaagcagctggaatgggtggcccagatcaaggacaagagcaacagctacgccacctactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgtcggggcgtgtactatgccctgagccccttcgattactggggccagggaaccctcgtgaccgtgtctagtcggaccgccagcacaaagggcccatcggtgttccctctggccccttgcagcagaagcaccagcgaatctacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgctctgacaagcggcgtgcacacctttccagccgtgctccagagcagcggcctgtactctctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagcagcctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccctgccctccttgcccagcccctgaagctgccggcggaccctccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagctccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgagcctcaagtgtgtaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgagctgtgccgtgaaaggcttctaccccagcgacattgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctggtgtccaagctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtctctgtccctgggc SEQ ID NO:72 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) gacatcgtgatgacccagacccccctgagcctgagcgtgacacctggacagcctgccagcatcagctgcaagagcagccagagcctggtgcacaacaacgccaacacctacctgagctggtatctgcagaagcccggccagagcccccagtccctgatctacaaggtgtccaacagattcagcggcgtgcccgacagattctccggcagcggctctggcaccgacttcaccctgaagatcagccgggtggaagccgaggacgtgggcgtgtactattgtggccagggcacccagtaccccttcacctttggcagcggcaccaaggtggaaatcaagggccagcccaaggccgcccccgacatccagatgacccagagccccagcagcctgtctgccagcgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcaggccagccagaacatctacgtgtggctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcaacctgcacaccggcgtgcccagcagattttctggcagcggctccggcaccgacttcaccctgacaatcagctccctgcagcccgaggacattgccacctactactgccagcagggccagacctacccctacacctttggccagggcaccaagctggaaatcaagaccaagggccccagccgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccacctagcgacgagcagctgaagtccggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaagtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggaaagcgtgaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgacactgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtctagccccgtgaccaagagcttcaaccggggcgagtgt SEQ ID NO:73 mAb2 IgG4(выступ) FALA тяжелая цепь 2
(например, последовательность, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaagtcgtgaaacctggcgcctccgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctacgccatgcactgggtcaaagaggcccctggccagagactggaatggatcggctacatctaccccggccagggcggcaccaactacaaccagaagttccagggcagagccaccctgaccgccgatacaagcgccagcaccgcctacatggaactgagcagcctgcggagcgaggataccgccgtgtacttctgtgccagaacaggcggcctgaggcgggcctactttacctattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtctagcgctagcacaaagggcccatcggtgttccctctggccccttgcagcagaagcaccagcgaatctacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgctctgacaagcggcgtgcacacctttccagccgtgctccagagcagcggcctgtactctctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagcagcctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccctgccctccttgcccagcccctgaagctgccggcggaccctccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagctccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgagcctcaagtgtataccctgcccccttgccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgtggtgtctcgtgaaaggcttctaccccagcgacattgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtctctgtccctgggc SEQ ID NO:74 mAb2 легкая цепь 2
(например, последовательность, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) gacatcgtgctgacacagagccctgccaccctgtctctgagccctggcgagagagccaccatcagctgtagagccagccagagcgtgtccagctacggccagggcttcatgcactggtatcagcagaagcccggccagccccccagactgctgatctatggcgccagcagcagagccacaggcatccccgccagattttctggctctggcagcggcaccgacttcaccctgacaatcagccccctggaacccgaggacttcgccgtgtactactgccagcagaacaaagaggacccctggaccttcggcggaggcaccaagctggaaatcaagcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccacctagcgacgagcagctgaagtccggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaatgccctgcagagcggcaacagccaggaaagcgtgaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgtccaaggccgattacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtctagccccgtgaccaagagcttcaaccggggcgagtgc SEQ ID NO:75 mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A CD28supxCD3mid IgG1(впадина) LALA P329A тяжелая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaggtcgtgaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctactacatccactgggtgcgccaggcccctggacagggactggaatggatcggcagcatctaccccggcaacgtgaacaccaactacgcccagaagttccagggcagagccaccctgaccgtggacaccagcatcagcaccgcctacatggaactgagccggctgagaagcgacgacaccgccgtgtactactgcacccggtcccactacggcctggattggaacttcgacgtgtggggcaagggcaccaccgtgacagtgtctagcagccaggtgcagctggtggaatctggcggcggagtggtgcagcctggcagaagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcaccaaggcctggatgcactgggtgcgccaggcccctggaaagcagctggaatgggtggcccagatcaaggacaagagcaacagctacgccacctactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgtcggggcgtgtactatgccctgagccccttcgattactggggccagggaaccctcgtgaccgtgtctagtcggaccgccagcacaaagggccccagcgtgttccctctggcccctagcagcaagagcacatctggcggaacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaattctggcgccctgaccagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcagtccagcggcctgtacagcctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccccgaagccgccggaggcccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagccaagagaggaacagtacaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctggccgcccccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgaaccccaggtgtgcacactgcccccaagcagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgagctgtgccgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctggtgtccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggc SEQ ID NO:76 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO:73 mAb2 IgG1(выступ) LALA P329A тяжелая цепь 2
(например, последовательность, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaagtcgtgaaacctggcgcctccgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctacgccatgcactgggtcaaagaggcccctggccagagactggaatggatcggctacatctaccccggccagggcggcaccaactacaaccagaagttccagggcagagccaccctgaccgccgatacaagcgccagcaccgcctacatggaactgagcagcctgcggagcgaggataccgccgtgtacttctgtgccagaacaggcggcctgaggcgggcctactttacctattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtctagcgctagcacaaagggccccagcgtgttccctctggcccctagcagcaagagcacatctggcggaacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaattctggcgccctgaccagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcagtccagcggcctgtacagcctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccccgaagccgccggaggcccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagccaagagaggaacagtacaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctggccgcccccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgaaccccaggtgtacacactgcccccatgcagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgtggtgtctggtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggc SEQ ID NO:77 mAb2 легкая цепь 2
(например, последовательность, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO:75 mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA CD28supxCD3mid IgG1(впадина) NNSA тяжелая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaggtcgtgaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctactacatccactgggtgcgccaggcccctggacagggactggaatggatcggcagcatctaccccggcaacgtgaacaccaactacgcccagaagttccagggcagagccaccctgaccgtggacaccagcatcagcaccgcctacatggaactgagccggctgagaagcgacgacaccgccgtgtactactgcacccggtcccactacggcctggattggaacttcgacgtgtggggcaagggcaccaccgtgacagtgtctagcagccaggtgcagctggtggaatctggcggcggagtggtgcagcctggcagaagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcaccaaggcctggatgcactgggtgcgccaggcccctggaaagcagctggaatgggtggcccagatcaaggacaagagcaacagctacgccacctactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgtcggggcgtgtactatgccctgagccccttcgattactggggccagggaaccctcgtgaccgtgtctagtcggaccgccagcacaaagggccccagcgtgttccctctggcccctagcagcaagagcacatctggcggaacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaattctggcgccctgaccagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcagtccagcggcctgtacagcctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccccgaactgctgggaggcccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagccaagagaggaacagtacaacaatgcctcccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcccccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgaaccccaggtgtgcacactgcccccaagcagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgagctgtgccgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctggtgtccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggc SEQ ID NO:78 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO:73 mAb2 IgG1(выступ) NNSA тяжелая цепь 2
(например, последовательность, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaagtcgtgaaacctggcgcctccgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctacgccatgcactgggtcaaagaggcccctggccagagactggaatggatcggctacatctaccccggccagggcggcaccaactacaaccagaagttccagggcagagccaccctgaccgccgatacaagcgccagcaccgcctacatggaactgagcagcctgcggagcgaggataccgccgtgtacttctgtgccagaacaggcggcctgaggcgggcctactttacctattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtctagcgctagcacaaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtatgttgacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacaatgcctcccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatgccgggatgagctgaccaagaatcaagtcagcctgtggtgcctggtaaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctactcaaaactcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt SEQ ID NO:79 mAb2 легкая цепь 2
(например, последовательность, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO:75 mAb6xCD28supxCD3mid IgG4 FALA CD28supxCD3mid IgG4(впадина) FALA тяжелая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) См. выше. SEQ ID NO:72 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO:73 mAb6 IgG4(выступ) FALA тяжелая цепь 2
(например, последовательность, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtggaaagcggcggaggcgtggtgcagcctggcaggtctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacggaatgcactgggtgcgccaggcccctggcaaaggactggaatgggtggccgtgatttggtacgacggcagcaacaagtactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagcggcgacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaatgttcagaggcgccttcgactactggggccagggcacactcgtgaccgtgtctagtgcgtcgaccaagggcccatcggtgttccctctggccccttgcagcagaagcaccagcgaatctacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgctctgacaagcggcgtgcacacctttccagccgtgctccagagcagcggcctgtactctctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagcagcctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccctgccctccttgcccagcccctgaagctgccggcggaccctccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagctccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgagcctcaagtgtataccctgcccccttgccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgtggtgtctcgtgaaaggcttctaccccagcgacattgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtctctgtccctgggc SEQ ID NO:80 mAb6 легкая 2
(например, последовательность, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) gccatccagatgacccagagccccagcagcctgtctgccagcgtgggcgacagagtgaccatcacctgtagagccagccagggcatccggaacgacctgggctggtatcagcagaagcctggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgctagctctctgcagtccggcgtgcccagcagattttctggcagcggctccggcaccgacttcaccctgacaatctctggcctgcagcccgaggacagcgccacctactactgtctgcaagactacatctactaccccaccttcggccagggcaccaaggtggaaatcaagcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccacctagcgacgagcagctgaagtccggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaagtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggaaagcgtgaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgacactgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtctagccccgtgaccaagagcttcaaccggggcgagtgt SEQ ID NO:81 mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A CD28supxCD3mid IgG1(впадина) LALA P329A тяжелая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO:76 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO:73 mAb6 IgG1(выступ) LALA P329A тяжелая цепь 2
(например, последовательность, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtggaaagcggcggaggcgtggtgcagcctggcaggtctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacggaatgcactgggtgcgccaggcccctggcaaaggactggaatgggtggccgtgatttggtacgacggcagcaacaagtactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagcggcgacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaatgttcagaggcgccttcgactactggggccagggcacactcgtgaccgtgtctagtgcgtcgaccaagggccccagcgtgttccctctggcccctagcagcaagagcacatctggcggaacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaattctggcgccctgaccagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcagtccagcggcctgtacagcctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccccgaagccgccggaggcccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagccaagagaggaacagtacaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctggccgcccccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgaaccccaggtgtacacactgcccccatgcagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgtggtgtctggtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggc SEQ ID NO:82 mAb6 легкая 2
(например, последовательность, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO:81 mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA CD28supxCD3mid IgG1(впадина) NNSA тяжелая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO:78 CD28supxCD3mid легкая цепь 1
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO:73 mAb6 IgG1(выступ) NNSA тяжелая цепь 2
(например, последовательность, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtggaaagcggcggaggcgtggtgcagcctggcaggtctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacggaatgcactgggtgcgccaggcccctggcaaaggactggaatgggtggccgtgatttggtacgacggcagcaacaagtactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagcggcgacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaatgttcagaggcgccttcgactactggggccagggcacactcgtgaccgtgtctagtgcgtcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtatgttgacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacaatgcctcccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatgccgggatgagctgaccaagaatcaagtcagcctgtggtgcctggtaaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctactcaaaactcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt SEQ ID NO:83 mAb6 легкая 2
(например, последовательность, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) смотри выше. SEQ ID NO:81

Полипептиды CD38

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит антигенсвязывающий сайт, который связывает внеклеточный домен полипептида CD38 человека и внеклеточный домен полипептида CD38 макака-крабоеда. Иллюстративные анализы для определения того, связывает ли антигенсвязывающий сайт антиген, описаны в данном документе и известны в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления связывание определяют с помощью анализа ELISA, например, как это описано ниже. В некоторых вариантах осуществления связывание определяют с помощью анализа SPR, например, как это описано ниже. В некоторых вариантах осуществления связывание определяют с помощью анализа проточной цитометрии с использованием клеток, экспрессирующих полипептид CD38, на их клеточной поверхности, например, как это описано ниже. См., например, примеры 1, 3 и 4.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывает очищенный полипептид или его фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1 и/или 30 (как, например, измерено с помощью ELISA или SPR). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывается с полипептидом или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1 и/или 30 при экспрессии на поверхности клетки (как, например, измерено с помощью проточной цитометрии).

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывается с полипептидом CD38 изоформы A (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывается с полипептидом CD38 изоформы E (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105 и не содержащим полную аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, состоящим из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:105 или состоящим по сути из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:105). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывается с полипептидом CD38 изоформы A (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1) и полипептидом CD38 изоформы E (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105, и не содержащим полную аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, состоящим из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:105 или состоящим по сути из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:105). Не вдаваясь в теорию, полагают, что связывание с полипептидом CD38 изоформы E может быть преимущественным, например, при нацеливании связывающего белка по настоящему изобретению на клетку (клетки), экспрессирующие полипептид CD38 изоформы E.

Полипептидная последовательность внеклеточного домена CD38 изоформы A человека

RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI (SEQ ID NO:1)

Полипептидная последовательность CD38 изоформы E человека

RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRHFWECGSP (SEQ ID NO:105)

В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен полипептида CD38 человека содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен полипептида CD38 макака-крабоеда содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30.

Полипептидная последовательность CD38 макака-крабоеда

RWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI (SEQ ID NO:30)

Полиспецифические (например, биспецифические, триспецифические или мультиспецифические) связывающие белки, которые связывают полипептиды CD38

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой биспецифический связывающий белок, содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывает один или более полипептидов CD38, и второй антигенсвязывающий сайт, который связывает другой целевой антиген. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой биспецифический связывающий белок, содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывает один или более полипептидов CD38, и второй антигенсвязывающий сайт, который связывает один или более полипептидов CD38.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой триспецифический связывающий белок, содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывает один или более полипептидов CD38, второй антигенсвязывающий сайт и третий антигенсвязывающий сайт. Например, в некоторых вариантах осуществления один из антигенсвязывающих сайтов связывает один или более полипептидов CD38 (например, внеклеточный домен полипептида CD38 человека и/или макака-крабоеда), и один или два антигенсвязывающих сайта связывают поверхностный белок Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления один из антигенсвязывающих сайтов связывает один или более полипептидов CD38 (например, внеклеточный домен полипептида CD38 человека и/или макака-крабоеда), один из антигенсвязывающих сайтов связывает полипептид CD3 человека, и один из антигенсвязывающих сайтов связывает полипептид CD28 человека. Полипептиды CD3 и CD28 человека известны в данной области техники. В данном документе представлены аминокислотные последовательности иллюстративных и неограничивающих вариабельных доменов антител, которые связывают полипептиды CD3 и CD28 человека.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены связывающие белки, содержащие три антигенсвязывающих сайта, каждый из которых связывает один или более целевых белков. В некоторых вариантах по меньшей мере один из трех антигенсвязывающих сайтов связывает внеклеточный домен полипептида CD38 человека и внеклеточный домен полипептида CD38 макака-крабоеда. В некоторых вариантах осуществления полипептид CD38 человека содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, и/или полипептид CD38 макака-крабоеда содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит антигенсвязывающий сайт, который связывает внеклеточный домен полипептида CD38 человека и внеклеточный домен полипептида CD38 макака-крабоеда, и два антигенсвязывающих сайта, каждый из которых связывает поверхностный белок T-клеток (например, полипептид CD28 человека и/или полипептид CD3 человека).

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывает один или более целевых опухолевых белков (например, один или более полипептидов CD38) и один или более целевых белков Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок способен связывать один опухолевый целевой белок (например, один или более полипептидов CD38) и два разных эпитопа на одном целевом белке Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок способен связывать один целевой опухолевый белок (например, один или более полипептидов CD38) и два разных целевых белка Т-клеток (например, CD28 и CD3). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок способен связывать один целевой белок Т-клеток и два разных эпитопа на одном целевом опухолевом белке (например, один или более полипептидов CD38). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок способен связывать один целевой белок Т-клеток и два разных целевых опухолевых белка (например, один или более полипептидов CD38 и другой целевой опухолевый белок). В некоторых вариантах осуществления первая и вторая полипептидные цепи связывающего белка образуют два антигенсвязывающих сайта, которые нацеливаются на два целевых белка Т-клеток, а третья и четвертая полипептидные цепи связывающего белка образуют антигенсвязывающий сайт, который связывает один или более полипептидов CD38. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая полипептидные цепи связывающего белка образуют два антигенсвязывающих сайта, которые нацеливаются на два целевых опухолевых белка (например, один или более полипептидов CD38 и другой целевой опухолевый белок), а третья и четвертая полипептидные цепи связывающего белка образуют антигенсвязывающий сайт, который связывает целевой белок Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления один или более белков-мишеней T-клеток представляют собой один или более из CD3 и CD28.

В некоторых вариантах осуществления связывающие белки специфически связываются с одним или более полипептидами CD38 и одним или более целевыми белками на Т-клетке, в том числе с T-клеточным рецепторным комплексом. Эти связывающие белки являющиеся рекрутерами T-клеток, способны временно рекрутировать T-клетки к клеткам-мишеням с одновременной активацией цитолитической активности T-клеток. Примеры белков-мишеней на T-клетках включают без ограничения среди прочего CD3 и CD28. Дополнительные примеры таких антигенов-мишеней или белков-мишеней приведены выше. В некоторых вариантах осуществления триспецифические связывающие белки можно получить путем объединения антигенсвязывающих доменов двух или более моноспецифических антител (исходных антител) в одно антитело.

Биспецифические форматы связывающих белков

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой биспецифический и/или бивалентный связывающий белок, содержащий четыре полипептидные цепи, которые образуют четыре антигенсвязывающих сайта, которые связывают один или более (например, два) разных целевых антигенов или целевых белков (например, имеющих структуру, описанную в международной публикации № WO2012/135345). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок является бивалентным и/или биспецифическим. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок является тетравалентным и/или тетраспецифическим. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок является тетравалентным и/или биспецифическим. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из антигенсвязывающих сайтов связывает полипептид CD38 (например, внеклеточный домен полипептидов CD38 человека и/или макака-крабоеда).

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит две полипептидные цепи, имеющие структуру, представленную формулой:

V_L1-L₁-V_L2-L₂-C_L [I],

и две полипептидные цепи имеют структуру, представленную формулой:

V_H2-L₃-V_H1-L₄-C_H1-Fc [II],

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

Fc включает шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2, C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

и где полипептиды формулы I и полипептиды формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь. В некоторых вариантах осуществления V_H1 и V_L1 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает полипептид CD38, а V_H2 и V_L2 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает другой целевой антиген. В некоторых вариантах осуществления V_H2 и V_L2 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает полипептид CD38, а V_H1 и V_L1 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает другой целевой антиген.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит две полипептидные цепи, которые образуют два антигенсвязывающих сайта, где первая полипептидная цепь содержит

V_L1-L₁-V_L2-L₂-CL-Fc,

и вторая полипептидная цепь содержит

V_H2-L₃-V_HI-L₄-C_H1-Fc,

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

Fc включает шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2, C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

где первый и второй полипептиды образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь. В некоторых вариантах осуществления V_H1 и V_L1 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает полипептид CD38, а V_H2 и V_L2 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает другой целевой антиген. В некоторых вариантах осуществления V_H2 и V_L2 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает полипептид CD38, а V_H1 и V_L1 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает другой целевой антиген.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит три полипептидные цепи, которые образуют два антигенсвязывающих сайта, где первая полипептидная цепь содержит

V_L1-L₁-V_L2-L₂-CL,

вторая полипептидная цепь содержит

V_H2-L₃-V_HI-L₄-C_H1-Fc,

третья полипептидная цепь содержит Fc-участок антитела,

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

Fc включает шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2, C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

где первый и второй полипептиды образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь. В некоторых вариантах осуществления V_H1 и V_L1 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает полипептид CD38, а V_H2 и V_L2 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает другой целевой антиген. В некоторых вариантах осуществления V_H2 и V_L2 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает полипептид CD38, а V_H1 и V_L1 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает другой целевой антиген.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую структуру, представленную формулой:

V_L1-L₁-V_L2-L₂-C_L [I],

и вторую полипептидную цепь, содержащую структуру, представленную формулой:

V_H2-L₃-V_H1-L₄-C_H1 [II],

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь. В некоторых вариантах осуществления V_H1 и V_L1 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает полипептид CD38, а V_H2 и V_L2 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает другой целевой антиген. В некоторых вариантах осуществления V_H2 и V_L2 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает полипептид CD38, а V_H1 и V_L1 образуют антигенсвязывающий домен, который связывает другой целевой антиген.

В любом варианте осуществления биспецифических связывающих белков, описанных выше, целевой антиген, отличный от CD38, может представлять собой любой из следующих типичных целевых антигенов: A2AR, APRIL, ATPDазу, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (также известный как VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (также известный как MCP-1), CCL3 (также известный как MIP-1a), CCL4 (также известный как MIP-1b), CCL5 (также известный как RANTES), CCL7 (также известный как MCP-3), CCL8 (также известный как mcp-2), CCL11 (также известный как эотаксин), CCL15 (также известный как MIP-1d), CCL17 (также известный как TARC), CCL19 (также известный как MIP-3b), CCL20 (также известный как MIP-3a), CCL21 (также известный как MIP-2), CCL24 (также известный как MPIF-2/эотаксин-2), CCL25 (также известный как TECK), CCL26 (также известный как эотаксин-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23 (также известный как FCER2, рецептор для IgE), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (также известный как B7-1), CD86 (также известный как B7-2), CD122, CD137 (также известный как 41BB), CD137L, CD152 (также известный как CTLA4), CD154 (также известный как CD40L), CD160, CD272, CD273 (также известный как PDL2), CD274 (также известный как PDL1), CD275 (также известный как B7H2), CD276 (также известный как B7H3), CD278 (также известный как ICOS), CD279 (также известный как PD-1), CDH1 (также известный как E-кадгерин), хитиназу, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (также известный как M-CSF), CSF-2 (также известный как GM-CSF), CSF-3 (также известный как GCSF), CX3CL1 (также известный как SCYD1), CXCL12 (также известный как SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролазу 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rбета, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (также известный как рецептор для IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (также известный как интегрин b4), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, лептин, LPFS2, молекулу MHC класса II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDазу-1, OX40, OX40L, PD-1H, тромбоцитарный рецептор, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (также известный как рецептор для IL33), STEAP2, Syk-киназу, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (также известный как корецептор для IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM и XCR1 (также известный как GPR5/CCXCR1). В некоторых вариантах осуществления один или более вышеуказанных целевых антигенов представляют собой целевые антигены человека.

В любом из биспецифических связывающих белков, описанных выше, может быть использован любой линкер или комбинация линкеров, описанных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо составляет по меньшей мере одну аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо имеет длину, составляющую ноль аминокислот, или содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). В некоторых вариантах осуществления каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L₂ содержит последовательность TKGPS (SEQ ID NO: 57), L₃ содержит последовательность S, и L₄ содержит последовательность RT. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L₂ содержит последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), длина L₃ составляет 0 аминокислот, и длина L₄ составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L₂ содержит последовательность GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), длина L₃ составляет 0 аминокислот, и длина L₄ составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), длина L₂ составляет 0 аминокислот, L₃ содержит последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), и длина L₄ составляет 0 аминокислот.

Триспецифические связывающие белки, которые связываются с полипептидами CD38

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой триспецифический и/или тривалентный связывающий белок, содержащий четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих сайта, которые связывают один или более (например, три) разных целевых антигенов или целевых белков. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из антигенсвязывающих сайтов связывает полипептид CD38 (например, внеклеточный домен полипептидов CD38 человека и/или макака-крабоеда). В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I];

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой триспецифический и/или тривалентный связывающий белок, содержащий четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих сайта, которые связывают один или более (например, три) разных целевых антигенов или целевых белков. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из антигенсвязывающих сайтов связывает полипептид CD38 (например, внеклеточный домен полипептидов CD38 человека и/или макака-крабоеда). В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I];

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

и где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь. В некоторых вариантах осуществления вторая и третья полипептидная цепи дополнительно содержат Fc-участок, связанный с C_H1, при этом Fc-участки содержат шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина.

В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь характеризуются кроссоверной ориентацией, при этом они образуют два разных антигенсвязывающих сайта. В некоторых вариантах осуществления VH1 и VL1 образуют связывающую пару и образуют первый антигенсвязывающий сайт. В некоторых вариантах осуществления VH2 и VL2 образуют связывающую пару и образуют второй антигенсвязывающий сайт. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD3 (например, CD3 человека), и второй антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD28 (например, CD28 человека). В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD3 (например, CD3 человека), и первый антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD28 (например, CD28 человека). В некоторых вариантах осуществления третий полипептид и четвертый полипептид образуют третий антигенсвязывающий сайт. В некоторых вариантах осуществления VH3 и VL3 образуют связывающую пару и образуют третий антигенсвязывающий сайт. В некоторых вариантах осуществления третий антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD38 (например, CD38 человека и необязательно макака-крабоеда). Иллюстративные форматы связывающих белков с кроссоверными ориентациями, предполагаемые для применения в данном документе, также описаны в заявке на патент США с регистрационным номером № 15/487243 и международной заявке № PCT/US2017/027488.

В некоторых вариантах осуществления в любом из биспецифических, триспецифических или полиспецифических связывающих белков, описанных в данном документе, антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD38 (например, CD38 человека и необязательно макака-крабоеда). В некоторых вариантах осуществления другой (например, не связывающийся с CD38) антигенсвязывающий сайт (сайты) любого из описанных в данном документе из биспецифических, триспецифических или полиспецифических связывающих белков связываются с CD28 или CD3. В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQG (SEQ ID NO:132), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQG (SEQ ID NO:132), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQG (SEQ ID NO:132), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36).

В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и/или домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и/или домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45) и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и/или домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46).

В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46).

В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и/или домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и/или домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и/или домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и/или домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и/или домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и/или домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36).

В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36).

В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и/или домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и/или домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36).

В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5, или домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:17, или домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:21, или домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:23, или домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, или домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14.

В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5, и/или домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:17, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:21, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:23, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14.

В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и/или домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46).

В некоторых вариантах осуществления домен V_H3содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:9, и/или домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:10.

В некоторых вариантах осуществления любого из триспецифических связывающих белков по настоящему изобретению один антигенсвязывающий домен связывает полипептид CD3 (например, CD3 человека), и один антигенсвязывающий домен связывает полипептид CD28 (например, CD28 человека). В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит три CDR из SEQ ID NO:49 или 51, как показано в таблице H, и домен V_L1 содержит три CDR из SEQ ID NO:50 или 52, как показано в таблице H. В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит три CDR из SEQ ID NO:49 или 51, как показано в таблице H, и домен V_L2 содержит три CDR из SEQ ID NO:50 или 52, как показано в таблице H. В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит три CDR из SEQ ID NO:53 или 84, как показано в таблице H, и домен V_L1 содержит три CDR из SEQ ID NO:54 или 85, как показано в таблице H. В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит три CDR из SEQ ID NO:53 или 84, как показано в таблице H, и домен V_L2 содержит три CDR из SEQ ID NO:54 или 85, как показано в таблице H.

В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54. В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54. В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:51, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:52, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54. В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:51, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:52, домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54.

В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54, домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14. В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54, домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:9, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:10.

В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:62, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:63. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:65, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:67, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:68, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:69. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:70, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:69. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:71, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:69.

В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:62, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:65, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:67, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:68, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:70, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:71, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69.

В любом из триспецифических связывающих белков, описанных выше, целевой антиген, отличный от CD38, может представлять собой любой из следующих типичных целевых антигенов: A2AR, APRIL, ATPDазы, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (также известного как VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (также известного как MCP-1), CCL3 (также известного как MIP-1a), CCL4 (также известного как MIP-1b), CCL5 (также известного как RANTES), CCL7 (также известного как MCP-3), CCL8 (также известного как MCP-2), CCL11 (также известного как эотаксин), CCL15 (также известного как MIP-1d), CCL17 (также известного как TARC), CCL19 (также известного как MIP-3b), CCL20 (также известного как MIP-3a), CCL21 (также известного как MIP-2), CCL24 (также известного как MPIF-2/эотаксин-2), CCL25 (также известного как TECK), CCL26 (также известного как эотаксин-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23 (также известного как FCER2, рецептор для IgE), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (также известного как B7-1), CD86 (также известного как B7-2), CD122, CD137 (также известного как 41BB), CD137L, CD152 (также известного как CTLA4), CD154 (также известного как CD40L), CD160, CD272, CD273 (также известного как PDL2), CD274 (также известного как PDL1), CD275 (также известного как B7H2), CD276 (также известного как B7H3), CD278 (также известного как ICOS), CD279 (также известного как PD-1), CDH1 (также известного как E-кадгерин), хитиназы, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (также известного как M-CSF), CSF-2 (также известного как GM-CSF), CSF-3 (также известного как GCSF), CX3CL1 (также известного как SCYD1), CXCL12 (также известного как SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролазы 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rбета, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (также известного как рецептор для IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (также известного как интегрин b4), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, лептина, LPFS2, молекулы MHC класса II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDазы-1, OX40, OX40L, PD-1H, тромбоцитарного рецептора, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (также известного как рецептор для IL33), STEAP2, Syk-киназы, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (также известного как корецептор для IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM и XCR1 (также известного как GPR5/CCXCR1). В некоторых вариантах осуществления один или более вышеуказанных целевых антигенов представляют собой целевые антигены человека.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой химерное, гуманизированное или человеческое антитело.

Связывающие белки согласно настоящему изобретению можно получить с использованием доменов или последовательностей, полученных или происходящих из любого антитела человека или антитела нечеловеческого происхождения, в том числе, например, из антител человека, мыши или гуманизированных антител.

Линкеры

В некоторых вариантах осуществления длина линкеров L₁, L₂, L₃ и L₄ варьирует от нуля аминокислот (длина=0) до приблизительно 100 аминокислот или менее 100, 50, 40, 30, 20 или 15 аминокислот или меньше. Длина линкеров также может составлять 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту. Все из L₁, L₂, L₃ и L₄ в одном связывающем белке могут иметь одну и ту же аминокислотную последовательность, или все из них могут иметь разные аминокислотные последовательности.

Примеры подходящих линкеров включают одиночный глициновый (Gly) остаток; диглициновый пептид (Gly-Gly); трипептид (Gly-Gly-Gly); пептид из четырех глициновых остатков; пептид из пяти глициновых остатков; пептид из шести глициновых остатков; пептид из семи глициновых остатков и пептид из восьми глициновых остатков. Можно использовать другие комбинации аминокислотных остатков, как, например, пептид GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), пептид GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), пептид TKGPS (SEQ ID NO: 57), пептид GQPKAAP (SEQ ID NO:58), а также пептид GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). Вышеперечисленные примеры не предназначены для какого-либо ограничения объема настоящего изобретения, и при этом было показано, что линкеры, содержащие выбранные случайным образом аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из валина, лейцина, изолейцина, серина, треонина, лизина, аргинина, гистидина, аспартата, глутамата, аспарагина, глутамина, глицина и пролина, подходят для связывающих белков. Дополнительное описание линкерных последовательностей см., например, в WO2012135345 и международной заявке № PCT/US2017/027488.

Состав и последовательность аминокислотных остатков в линкере может меняться в зависимости от типа элемента вторичной структуры, который необходимо достигнуть при помощи линкера. Например, глицин, серин и аланин являются наиболее подходящими для линкеров, характеризующихся максимальной гибкостью. Некоторые комбинации глицина, пролина, треонина и серина применимы, если необходим более жесткий и удлиненный линкер. При необходимости любой аминокислотный остаток может рассматриваться как линкер в комбинации с другими аминокислотными остатками для конструирования более длинных пептидных линкеров в зависимости от требуемых свойств.

В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо составляет по меньшей мере одну аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ в по меньшей два раза превышает длину L₃. В некоторых вариантах осуществления длина L₂ в по меньшей два раза превышает длину L₄. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ в по меньшей мере два раза превышает длину L₃, а длина L₂ в по меньшей мере два раза превышает длину L₄. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ составляет 3-12 аминокислотных остатков, длина L₂ составляет 3-14 аминокислотных остатков, длина L₃ составляет 1-8 аминокислотных остатков, и длина L₄ составляет 1-3 аминокислотных остатка. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ составляет 5-10 аминокислотных остатков, длина L₂ составляет 5-8 аминокислотных остатков, длина L₃ составляет 1-5 аминокислотных остатков, и длина L₄ составляет 1-2 аминокислотных остатка. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ составляет 7 аминокислотных остатков, длина L₂ составляет 5 аминокислотных остатков, длина L₃ составляет 1 аминокислотный остаток, и длина L₄ составляет 2 аминокислотных остатка. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ составляет 10 аминокислотных остатков, длина L₂ составляет 10 аминокислотных остатков, длина L₃ составляет 0 аминокислотных остатков, и длина L₄ составляет 0 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо составляет от 0 до 15 аминокислот (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, или 15 аминокислот), где по меньшей мере длина двух линкеров составляет 1-15 аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, или 15 аминокислот). В некоторых вариантах осуществления длина каждого из L₁, L₂, L₃ и L₄ составляет 0 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления L₁, L₂, L₃ и/или L₄ содержат последовательность, полученную из встречающейся в природе последовательности в участке соединения между вариабельным доменом антитела и константным доменом антитела (например, описанной в WO2012/135345). Например, в некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность, находящуюся в переходном участке между эндогенными доменами V_H и C_H1 или между эндогенными доменами V_L и C_L (например, каппа- или лямбда-цепей). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность, находящуюся в переходном участке между эндогенными доменами V_H и C_H1 человека или между эндогенными доменами V_L и C_L человека (например, каппа- или лямбда-цепей человека).

В некоторых вариантах осуществления каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо имеет длину, составляющую ноль аминокислот, или содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). В некоторых вариантах осуществления каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59).

В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L₂ содержит последовательность TKGPS (SEQ ID NO: 57), L₃ содержит последовательность S, и L₄ содержит последовательность RT. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L₂ содержит последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), длина L₃ составляет 0 аминокислот, и длина L₄ составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L₂ содержит последовательность GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), длина L₃ составляет 0 аминокислот, и длина L₄ составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), длина L₂ составляет 0 аминокислот, L₃ содержит последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), и длина L₄ составляет 0 аминокислот.

Fc-участки и константные домены

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит полноразмерную тяжелую цепь антитела или полипептидную цепь, содержащую Fc-участок. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок человека, например, Fc-участок IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок включает шарнирный участок, C_H1, C_H2, C_H3 и необязательно домены C_H4. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок содержит одну или более мутаций, описанных ниже.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит один или два варианта Fc. Термин "вариант Fc", используемый в данном документе, обозначает молекулу или последовательность, которая модифицирована по сравнению с нативным Fc, но все еще содержит участок связывания для рецептора реутилизации FcRn (неонатального Fc-рецептора). Приводимые в качестве примера варианты Fc и их взаимодействие с рецептором реутилизации известны в данной области техники. Таким образом, термин "вариант Fc" может предусматривать молекулу или последовательность, полученную в результате гуманизации нативного Fc нечеловеческого происхождения. Кроме того, нативный Fc содержит участки, которые можно удалить, поскольку они обеспечивают структурные признаки или биологическую активность, которые не требуются для антителоподобных связывающих белков согласно настоящему изобретению. Таким образом, термин "вариант Fc" предусматривает молекулу или последовательность, в которой отсутствует один или более участков или остатков нативного Fc или в которой были модифицированы один или более участков или остатков Fc, воздействующих на или вовлеченных в: (1) образование дисульфидной связи, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) гетерогенность N-концов при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с системой комплемента, (6) связывание с Fc-рецептором, отличным от рецептора реутилизации, или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).

В некоторых вариантах осуществления Fc-участок содержит одну или более мутаций, которые уменьшают или устраняют связывание Fc-рецептора и/или эффекторную функцию Fc-участка (например, антителозависимый клеточный фагоцитоз, опосредованный Fc-рецепторами (ADCP), комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и/или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC)).

В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG1 человека, содержащий одну или более аминокислотных замен в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и/или 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и/или P329A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG1 человека, содержащий аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 298, 299 и/или 300 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S298N, T299A и/или Y300S.

В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий одну или более мутаций, которые ослабляют или устраняют связывание FcγI и/или FcγII. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий одну или более мутаций, которые ослабляют или устраняют связывание FcγI и/или FcγII, но не влияют на связывание FcRn. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228 и/или 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S228P и/или R409K. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и/или 235 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой F234A и/или L235A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 234, 235 и/или 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S228P, F234A, L235A и/или R409K. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-236 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий аминокислотные мутации в положениях, соответствующих положениям 228, 233-236 и/или 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные мутации представляют собой S228P; E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236; и/или R409K.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит одну или более мутаций для улучшения очистки, например, путем модулирования аффинности к реагенту для очистки. Например, известно, что гетеродимерные связывающие белки можно избирательно очищать от их гомодимерных форм, если один из двух Fc-участков гетеродимерной формы содержит мутацию (мутации), ослабляющие или устраняющие связывание с белком A, поскольку гетеродимерная форма будет характеризоваться промежуточной аффинностью к средству для очистки на основе белка A по сравнению с любой гомодимерной формой и может быть избирательно элюирована с белка A, например, путем использования другого значения pH (см., например, Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep.5:17943). В некоторых вариантах осуществления мутация предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 435 и 436 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой H435R и Y436F. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; и где только один из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 435 и 436 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой H435R и Y436F. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или более мутаций для улучшения очистки. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

Для повышения выхода некоторых связывающих белков (например, биспецифических или триспецифических связывающих белков) домены C_H3 можно изменить с помощью технологии «выступ-во-впадине», которая описана подробно с несколькими примерами, например, в международной публикации № WO 96/027011, Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9: 617-21; и Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16: 677-81. В частности, взаимодействующие поверхности двух доменов C_H3 изменяют для повышения гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих эти два домена C_H3. Каждый из двух доменов C_H3 (из двух тяжелых цепей) может представлять собой "выступ", тогда как другой представляет собой "впадину". Введение дисульфидного мостика дополнительно стабилизирует гетеродимеры (Merchant et al., 1998; Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270: 26-35) и повышает выход. В определенных вариантах осуществления выступ находится на второй паре полипептидов с одним вариабельным доменом. В других вариантах осуществления выступ находится на первой паре полипептидов, характеризующихся перекрестной ориентацией. В еще одних вариантах осуществления домены C_H3 не содержат "выступ-во-впадине".

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению (например, триспецифический связывающий белок) содержит мутацию по типу «выступа» на второй полипептидной цепи и мутацию по типу «впадины» на третьей полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит мутацию по типу "выступа" на третьей полипептидной цепи и мутацию по типу "впадины" на второй полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления мутация по типу "выступа" предусматривает замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 354 и/или 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S354C, T366W, T366Y, S354C и T366W или S354C и T366Y. В некоторых вариантах осуществления мутация по типу "выступа" предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W. В некоторых вариантах осуществления мутация по типу "впадины" предусматривает замену(замены) в положениях, соответствующих положениям 407 и необязательно 349, 366 и/или 368 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой Y407V или Y407T и необязательно Y349C, T366S и/или L368A. В некоторых вариантах осуществления мутация по типу "впадины" предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V.

В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 366 и необязательно 354 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой T366W или T366Y и необязательно S354C; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 407 и необязательно 349, 366 и/или 368 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y407V или Y407T и необязательно Y349C, T366S и/или L368A.

В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 407 и необязательно 349, 366 и/или 368 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y407V или Y407T и необязательно Y349C, T366S и/или L368A; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 366 и необязательно 354 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой T366W или T366Y и необязательно S354C.

В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотная замена представляет собой T366W; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 366, 368 и/или 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой T366S, L368A и/или Y407V.

В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 366, 368 и/или 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой T366S, L368A и/или Y407V; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотная замена представляет собой T366W.

В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V. В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первая Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 354, 366 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, S354C, T366W и R409K; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 349, 366, 368, 407 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, Y349C, T366S, L368A, Y407V и R409K. В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первый Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 349, 366, 368, 407 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, Y349C, T366S, L368A, Y407V и R409K; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 354, 366 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, S354C, T366W и R409K.

В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первый Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235, 354 и 366 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A, L235A, S354C и T366W; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235, 349, 366, 368 и 407 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A и Y407V. В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первый Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235, 349, 366, 368 и 407 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A и Y407V; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235, 354 и 366 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A, L235A, S354C и T366W.

В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первый Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 234, 235, 354, 366 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, F234A, L235A, S354C, T366W и R409K; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 234, 235, 349, 366, 368, 407 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V и R409K. В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первый Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 234, 235, 349, 366, 368, 407 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V и R409K; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 234, 235, 354, 366 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, F234A, L235A, S354C, T366W и R409K.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит одну или более мутаций для улучшения времени полужизни в сыворотке крови (см., например, Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56). В некоторых вариантах осуществления мутация предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 428 и 434 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой M428L и N434S. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый и/или второй Fc-участки содержат аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 428 и 434 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой M428L и N434S. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или более мутаций для улучшения времени полужизни в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит одну или более мутаций для улучшения стабильности, например, шарнирного участка и/или поверхности контакта димера IgG4 (см., например, Spiess, C. et al. (2013) J. Biol. Chem. 288:26583-26593). В некоторых вариантах осуществления мутация предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 228 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P и R409K. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; где первый и второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека; и где каждый из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P и R409K. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или более мутаций для улучшения стабильности. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит одну или более мутаций для улучшения очистки, например, путем модулирования аффинности к реагенту для очистки. Например, известно, что гетеродимерные связывающие белки можно избирательно очищать от их гомодимерных форм, если один из двух Fc-участков гетеродимерной формы содержит мутацию (мутации), ослабляющие или устраняющие связывание с белком A, поскольку гетеродимерная форма будет характеризоваться промежуточной аффинностью к средству для очистки на основе белка A по сравнению с любой гомодимерной формой и может быть избирательно элюирована с белка A, например, путем использования другого значения pH (см., например, Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep.5:17943). В некоторых вариантах осуществления мутация предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 435 и 436 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой H435R и Y436F. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; и где только один из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 435 и 436 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой H435R и Y436F. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или более мутаций для улучшения очистки. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит одну или более мутаций для улучшения времени полужизни в сыворотке крови (см., например, Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56). В некоторых вариантах осуществления мутация предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 428 и 434 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой M428L и N434S. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый и/или второй Fc-участки содержат аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 428 и 434 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой M428L и N434S. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или более мутаций для улучшения времени полужизни в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит одну или более мутаций для снижения эффекторной функции, например, антителозависимого клеточного фагоцитоза, опосредованного Fc-рецепторами (ADCP), комплементзависимой цитотоксичности (CDC) и/или антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; где первый и второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека; и где каждый из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A и L235A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки второй и третьей полипептидных цепей представляют собой Fc-участки IgG1 человека, и при этом каждый из Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A и L235A. В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; где первый и второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека; и где каждый из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и P329A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки второй и третьей полипептидных цепей представляют собой Fc-участки IgG1 человека, и где каждый из Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и P329A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки второй и третьей полипептидных цепей представляют собой Fc-участки IgG4 человека, и каждый из Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A и L235A. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; и где каждый из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A и L235A.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или более мутаций для снижения эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека. Для дальнейшего описания Fc-мутаций в положении 329, см., например, Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604 и WO 1999051642.

В некоторых вариантах осуществления типы мутаций, описанные выше, можно комбинировать в любом порядке или комбинации. Например, связывающий белок по настоящему изобретению может содержать две или более мутаций по типу "выступа" и "впадины", одну или более мутаций для улучшения времени полужизни в сыворотке крови, одну или более мутаций для улучшения стабильности IgG4, одну или более мутаций для улучшения очистки и/или одну или более мутаций для снижения эффекторной функции, описанных выше.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит фрагмент антитела, в том числе без ограничения F(ab)-, F(ab')2-, Fab'-SH-, Fv- или scFv-фрагменты антитела.

Анализы

Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим белкам, которые связывают полипептиды CD38 человека и/или макака-крабоеда, индуцируют пролиферацию Т-клеток (например, CD4+ и/или CD8+ Т-клеток) и/или индуцируют апоптоз клеток CD38+. В данном документе представлены иллюстративные анализы для измерения таких параметров и идентификации указанных связывающих белков. Например, в некоторых вариантах осуществления аффинность связывания между связывающим белком или его антигенсвязывающим фрагментом и очищенным полипептидом CD38 измеряют с помощью SPR (например, как описано ниже), а аффинность связывания между связывающим белком или его антигенсвязывающим фрагментом и полипептидом CD38, экспрессированным на поверхности клетки, измеряют с помощью проточной цитометрии (например, как описано ниже).

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий сайт связывающего белка по настоящему изобретению связывает полипептид CD38 человека, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, с равновесной константой диссоциации (K_D), составляющей 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше, 1 нМ или меньше или 0,8 нМ или меньше, что измерено с помощью проточной цитометрии с применением клеток, которые экспрессируют полипептид CD38 человека, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, на их клеточной поверхности, например, как описано ниже. В некоторых вариантах антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD38 макака-крабоеда, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30, с равновесной константой диссоциации (K_D), составляющей 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше, 1 нМ или меньше или 0,75 нМ или меньше, что измерено с помощью проточной цитометрии с применением клеток, которые экспрессируют полипептид CD38 макака-крабоеда, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30, на их клеточной поверхности, например, как описано ниже. В некоторых вариантах антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD38 человека, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, с равновесной константой диссоциации (K_D), составляющей 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше, 1 нМ или меньше или 0,83 нМ или меньше, что измерено с помощью SPR с применением полипептида CD38 человека, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, например, как описано ниже. В некоторых вариантах антигенсвязывающий сайт связывает полипептид CD38 макака-крабоеда, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30, с равновесной константой диссоциации (K_D), составляющей 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 3,5 нМ или меньше, 1,5 нМ или меньше или 1,0 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа SPR с применением полипептида CD38 макака-крабоеда, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30, например, как описано ниже. Как показано в данном документе, в некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению может обладать одним или более иллюстративными связывающими свойствами, описанными в данном документе. В некоторых вариантах осуществления KD измеряют при 4°C или 25°C.

В некоторых вариантах осуществления моноспецифический связывающий белок по настоящему изобретению характеризуются одним или более из следующих признаков: связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1) в качестве очищенного белка по данным SPR или ELISA; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1) в качестве очищенного белка с K_D 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше или 1,5 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа SPR или ELISA; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1), экспрессируемым на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1), экспрессируемым на поверхности клетки, с кажущимся значением K_D 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше или 1 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30) в качестве очищенного белка, что измерено с помощью анализа SPR или ELISA; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30) в качестве очищенного белка с K_D 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше, 1 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа SPR или ELISA; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30), экспрессируемым на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30), экспрессируемым на поверхности клетки, с кажущимся значением K_D 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше, 1 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 изоформы Е человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105) в качестве очищенного белка, что измерено с помощью анализа SPR или ELISA; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 изоформы E человека (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105), экспрессируемым на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; индуцирует апоптоз или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) клетки, экспрессирующей CD38 на своей клеточной поверхности; и имеет одну или более мутаций (например, в Fc-участке), приводящих к ослаблению связывания с FcγRI и/или FcγRII по сравнению с тем же самым связывающим белком в отсутствие одной или более мутаций. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывает полипептид CD38 (например, человека или макака-крабоеда), экспрессируемый на поверхности клетки с ЕС50, составляющим 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше или 1 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывает полипептид CD38 (например, человека или макака-крабоеда) в качестве очищенного белка с ЕС50, составляющим 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше или 1 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа ELISA. В некоторых вариантах осуществления KD измеряют при 4°C или 25°C.

В некоторых вариантах осуществления триспецифический связывающий белок по настоящему изобретению характеризуется одним или более из следующих признаков: индуцирует пролиферацию Т-клеток (например, CD4+ и/или CD8+ Т-клеток); индуцирует экспрессию Т-клетками (например, CD4+ и/или CD8+ Т-клетками) Bcl-xL; индуцирует апоптоз клеток CD38+ (например, измеренный с помощью анализа окрашивания аннексином V и/или захвата пропидиум йодида); связывается с CD38, экспрессируемым на поверхности клетки, и одним или более целевыми Т-клеточными антигенами, экспрессируемыми на поверхности Т-клетки; связывается с CD38, экспрессируемым на поверхности клетки, CD28, экспрессируемым на поверхности Т-клетки, и CD3, экспрессируемым на поверхности Т-клетки; стимулирует активацию Т-клеточного рецептора (например, измеренную по экспрессии CD69); индуцирует костимуляцию передачи сигналов T-рецепторами (например, CD28-опосредованную); имеет одну или более мутаций (например, в Fc-участке), приводящих к снижению индуцирования высвобождения цитокинов (например, IFN-γ, IL-2 и/или TNF-α) PBMC по сравнению с тем же связывающим белком в отсутствие одной или более мутаций; индуцирует высвобождение цитокинов (например, IFN-γ и/или IL-6) PBMC в присутствии целевой клетки CD38+ (например, по данным иммуноанализа); связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1) в качестве очищенного белка, что измерено с помощью анализа SPR или ELISA; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1) в качестве очищенного белка с K_D 1,5 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа SPR или ELISA; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1), экспрессируемым на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 человека (например, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1), экспрессируемым на поверхности клетки, с кажущимся K_D 12 нМ или меньше по данным проточной цитометрии; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30) в качестве очищенного белка, что измерено с помощью анализа SPR или ELISA; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30) в качестве очищенного белка с K_D 3,5 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа SPR или ELISA; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30), экспрессируемого на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 макака-крабоеда (например, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30), экспрессируемым на поверхности клетки, с кажущимся K_D 7,5 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 изоформы E человека (например, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105) в качестве очищенного белка, что измерено с помощью анализа SPR или ELISA; связывается с внеклеточным доменом полипептида CD38 изоформы E человека (например, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105), экспрессируемым на поверхности клетки, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии; индуцирует апоптоз или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) клетки, экспрессирующей CD38 на своей клеточной поверхности; и имеет одну или более мутаций (например, в Fc-участке), приводящих к ослаблению связывания с FcγRI и/или FcγRII по сравнению с тем же самым связывающим белком в отсутствие одной или более мутаций. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывает полипептид CD38 (например, человека или макака-крабоеда), экспрессируемый на поверхности клетки с ЕС50, составляющим 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше или 1 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывает полипептид CD38 (например, человека или макака-крабоеда) в качестве очищенного белка с ЕС50, составляющим 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 12 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше или 1 нМ или меньше, что измерено с помощью анализа ELISA.

Нуклеиновые кислоты

Стандартные технологии рекомбинантной ДНК применяют для конструирования полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды, образующие связывающие белки, встраивания этих полинуклеотидов в рекомбинантные векторы экспрессии и введения таких векторов в клетки-хозяева. См., например, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed.). Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, которые обычно выполняют в данной области техники или как описано в данном документе. Если не предусмотрены конкретные определения, то терминология, используемая в контексте аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, а также лабораторные процедуры и их методики, описанные в данном документе, являются общеизвестными и широко используемыми в данной области техники. Аналогично традиционные методики можно использовать для вариантов химического синтеза, вариантов химического анализа, фармацевтического получения, составления, доставки и лечения пациентов.

Другие аспекты настоящего изобретения относятся к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из связывающих белков, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновой кислоты содержат последовательность, которая на меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательностям под SEQ ID NO:60-83 и/или показанным в таблице J.

Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к наборам полинуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления один или более полинуклеотидов представляют собой вектор (например, вектор экспрессии). Наборы могут найти применение помимо прочего в получении одного или более связывающих белков, описанных в данном документе, например, триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления набор содержит один, два, три или четыре полинуклеотида, показанные в таблице J (например, mAb2xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A или mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA). В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:72, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:74, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:75. В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:76, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:77, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:75. В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:78, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:79, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:75. В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:72, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:80, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:81. В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:76, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:82, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:81. В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:78, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:83, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:81.

В некоторых вариантах осуществления выделенная нуклеиновая кислота функционально связана с гетерологичным промотором для управления транскрипцией последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающий белок. Промотор может относиться к контролирующим последовательностям нуклеиновой кислоты, которые управляют транскрипцией нуклеиновой кислоты. Первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, где первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с последовательностью, кодирующей связывающий белок, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Примеры промоторов могут включать без ограничения промоторы, полученные из геномов вирусов (таких как вирус полиомы, вирус оспы кур, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита B, вирус обезьян 40 (SV40) и т. п.), гетерологичные промоторы эукариот (такие как промотор гена актина, промотор гена иммуноглобулина, промоторы генов белков теплового шока и т. п.), CAG-промотор (Niwa et al., Gene 108(2):193-9, 1991), промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK), индуцируемый тетрациклином промотор (Masui et al., Nucleic Acids Res. 33:e43, 2005), lac-систему, trp-систему, tac-систему, trc-систему, основные операторные и промоторные участки лямбда-фага, промотор гена 3-фосфоглицераткиназы, промоторы гена кислой фосфатазы дрожжей и промотор гена альфа-фактора спаривания дрожжей. Полинуклеотиды, кодирующие по белки согласно настоящему изобретению, могут находиться под контролем конститутивного промотора, индуцируемого промотора или любого другого подходящего промотора, описанного в данном документе, или другого подходящего промотора, который легко распознает специалист в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления выделенную нуклеиновую кислоту встраивают в вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии. Векторы экспрессии могут содержать одну или более регуляторных последовательностей, функционально связанных с полинуклеотидом, подлежащим экспрессии. Термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы, контролирующие экспрессию (например, сигналы полиаденилирования). Примеры подходящих энхансеров могут включать без ограничения энхансерные последовательности из генов млекопитающих (таких как гены глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина, инсулина и т. п.) и энхансерные последовательности из вируса эукариотических клеток (такие как энхансер SV40 на участке позднего начала репликации (100-270 п. о.), ранний промотор/энхансер цитомегаловируса, энхансер полиомы на участке позднего начала репликации, энхансеры аденовирусов и т. п.). Примеры подходящих векторов могут включать, например, плазмиды, космиды, эписомы, транспозоны и вирусные векторы (например, векторы на основе аденовируса, вируса осповакцины, вируса Синдбис, вируса кори, вируса герпеса, лентивируса, ретровируса, аденоассоциированного вируса и т. д.). Векторы экспрессии можно применять для трансфекции клеток-хозяев, таких как, например, клетки бактерий, клетки дрожжей, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Биологически функциональные векторы на основе ДНК вируса и плазмидной ДНК, способные экспрессироваться и реплицироваться в хозяине, известны в данной области техники и могут применяться для трансфекции любой клетки, представляющей интерес.

Другие аспекты настоящего изобретения относятся к векторной системе, содержащей один или более векторов, кодирующих первую, вторую, третью и четвертую полипептидные цепи любого из связывающих белков, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит первый вектор, кодирующий первую полипептидную цепь связывающего белка, второй вектор, кодирующий вторую полипептидную цепь связывающего белка, третий вектор, кодирующий третью полипептидную цепь связывающего белка, и четвертый вектор, кодирующий четвертую полипептидную цепь связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит первый вектор, кодирующий первую и вторую полипептидные цепи связывающего белка, и второй вектор, кодирующий третью и четвертую полипептидные цепи связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит первый вектор, кодирующий первую и третью полипептидные цепи связывающего белка, и второй вектор, кодирующий вторую и четвертую полипептидные цепи связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит первый вектор, кодирующий первую и четвертую полипептидные цепи связывающего белка, и второй вектор, кодирующий вторую и третью полипептидные цепи связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит первый вектор, кодирующий первую, вторую, третью и четвертую полипептидные цепи связывающего белка. Один или более векторов векторной системы могут представлять собой любые из векторов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления один или более векторов представляют собой векторы экспрессии.

Выделенные клетки-хозяева

Другие аспекты настоящего изобретения относятся к выделенной клетке-хозяину, содержащей один или более выделенных полинуклеотидов, наборов полинуклеотидов, векторов и/или векторных систем, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку бактерии (например, клетку E. coli). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку дрожжей (например, клетку S. cerevisiae). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого. Примеры клеток-хозяев насекомого могут включать, например, клетки Drosophila (например, клетки S2), клетки Trichoplusia ni (например, клетки High Five™) и клетки Spodoptera frugiperda (например, клетки Sf21 или Sf9). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. Примеры клеток-хозяев млекопитающего могут включать, например, клетки почки эмбриона человека (например, клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре), клетки Expi293™, клетки CHO, клетки почки новорожденного хомячка (например, BHK, ATCC CCL 10), клетки Сертоли мыши (например, клетки TM4), клетки почки обезьяны (например, CV1 ATCC CCL 70), клетки почки африканской зеленой мартышки (например, VERO-76, ATCC CRL-1587), клетки карциномы шейки матки человека (например, HELA, ATCC CCL 2), клетки почки собаки (например, MDCK, ATCC CCL 34), клетки печени крысы линии Buffalo (например, BRL 3A, ATCC CRL 1442), клетки легкого человека (например, W138, ATCC CCL 75), клетки печени человека (например, Hep G2, HB 8065), клетки опухоли молочной железы мыши (например, MMT 060562, ATCC CCL51), клетки TRI, клетки MRC 5, клетки FS4, линию клеток гепатомы человека (например, Hep G2) и клетки миеломы (например, клетки NS0 и Sp2/0).

Другие аспекты настоящего изобретения относятся к способу получения любого из связывающих белков, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает: a) культивирование клетки-хозяина (например, любой из клеток-хозяев, описанных в данном документе), содержащей выделенную нуклеиновую кислоту, вектор и/или векторную систему (например, любое из выделенных нуклеиновых кислот, векторов и/или векторных систем, описанных в данном документе), в условиях, при которых клетка-хозяин экспрессирует связывающий белок; и b) выделение связывающего белка из клетки-хозяина. Способы культивирования клеток-хозяев в условиях, обеспечивающих экспрессию белка, хорошо известны специалисту в данной области техники. Способы выделения белков из культивируемых клеток-хозяев хорошо известны специалисту в данной области техники, в том числе, например, с помощью аффинной хроматографии (например, двухстадийной аффинной хроматографии, включающей аффинную хроматографию на белке A с последующей эксклюзионной хроматографией).

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению очищают с помощью аффинной хроматографии на белке A, аффинной хроматографии легких цепей каппа (например, с использованием смолы KappaSelect в соответствии с инструкциями производителя; GE Healthcare) и необязательно аффинной хроматографии легких цепей лямбда (например, с использованием смолы LambdaFabSelect в соответствии с инструкциями производителя; GE Healthcare). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению очищают с помощью аффинной хроматографии с белком A, аффинной хроматографии легких лямбда-цепей (например, с использованием смолы LambdaFabSelect в соответствии с инструкциями производителя; GE Healthcare) и необязательно аффинной хроматографии легких каппа-цепей (например, с использованием смолы KappaSelect в соответствии с инструкциями производителя; GE Healthcare). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит два Fc-участка, каждый из которых содержит домен C_H3, и только один из доменов C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 435 и 436 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой H435R и Y436F. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению последовательно очищают с помощью аффинной хроматографии на белке A, затем аффинной хроматографии легких каппа-цепей (например, с использованием смолы KappaSelect в соответствии с инструкциями производителя; GE Healthcare), а затем необязательно аффинной хроматографии легких лямбда-цепей (например, с использованием смолы LambdaFabSelect в соответствии с инструкциями производителя; GE Healthcare). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению очищают с помощью аффинной хроматографии с белком A, затем аффинной хроматографии легких лямбда-цепей (например, с использованием смолы LambdaFabSelect в соответствии с инструкциями производителя; GE Healthcare), а затем необязательно аффинной хроматографии легких каппа-цепей (например, с использованием смолы KappaSelect в соответствии с инструкциями производителя; GE Healthcare). Например, в некоторых вариантах осуществления связывающий белок приводят в контакт с белком A, элюируют с белка A в условиях, подходящих для отделения связывающего белка от связывающих белков, содержащих 0 или 2 домена C_H3, содержащих аминокислотные замены H435R и Y436F, приводят в контакт с аффинной средой для легких каппа-цепей (например, используемой со смолой KappaSelect; GE Healthcare) и элюируют из аффинной среды для легких каппа-цепей в условиях, подходящих для отделения связывающего белка от связывающих белков, содержащих только домены C_L лямбда-цепей (например, в соответствии с инструкциями производителя). Условия, подходящие для элюирования с белка A, известны в данной области техники, в том числе без ограничения элюирование в ступенчатом градиенте pH 4,5-2,8. В некоторых вариантах осуществления используется белок A или вариант белка A, применимый для очистки белков. В некоторых вариантах осуществления белок A присоединен к подложке или смоле, например, в качестве части среды для хроматографии. В некоторых вариантах осуществления после элюирования из аффинной среды для легких каппа-цепей связывающий белок приводят в контакт с аффинной средой для легких лямбда-цепей (например, используемой со смолой LambdaFabSelect; GE Healthcare) и элюируют из аффинной среды для легких лямбда-цепей в условиях, подходящих для отделения связывающего белка от связывающих белков, содержащих только домены C_L каппа-цепей (например, в соответствии с инструкциями производителя). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению выявляют с помощью HIC-хроматографии. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит первую полипептидную цепь, которая содержит домен C_L лямбда-цепи; домен C_H3 второй полипептидной цепи, который содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W; домен C_H3 третьей полипептидной цепи, который содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368, 407, 435 и 436 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R и Y436F; и четвертую полипептидную цепь, которая содержит домен C_L каппа-цепи. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок продуцируется клеткой-хозяином. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок очищают от среды для культивирования клеток или экстракта клеток-хозяев. В некоторых вариантах осуществления связывающие белки секретируются клеткой-хозяином или продуцируются клеткой-хозяином и экстрагируются из нее (например, перед приведением в контакт с белком A). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок находится в среде для культивирования клеток или экстракте клеток-хозяев при приведении в контакт с белком A. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок очищают от других связывающих белков, полипептидов и/или других клеточных компонентов.

III. Триспецифические связывающие белки

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой триспецифический и/или тривалентный связывающий белок, содержащий четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих сайта, которые связывают один или более (например, три) разных целевых антигенов или целевых белков. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I];

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь характеризуются кроссоверной ориентацией, при этом они образуют два разных антигенсвязывающих сайта. Как описано выше, вторая и третья полипептидные цепи включают Fc-участок (например, содержащий домены шарнир-C_H2-C_H3). В некоторых вариантах осуществления один или оба Fc-участка представляют собой Fc-участки IgG4 человека, содержащие аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-236 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека, содержащие аминокислотные мутации в положениях, соответствующих положениям 228, 233-236 и/или 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные мутации представляют собой S228P; E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236; и/или R409K. В некоторых вариантах осуществления один или оба Fc-участка представляют собой Fc-участки IgG1 человека, содержащие одну или более аминокислотных замен в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и/или 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и/или P329A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека, содержащие аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 298, 299 и/или 300 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S298N, T299A и/или Y300S.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой триспецифический и/или тривалентный связывающий белок, содержащий четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих сайта, которые связывают один или более (например, три) разных целевых антигенов или целевых белков. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из антигенсвязывающих сайтов связывает полипептид CD38 (например, внеклеточный домен полипептидов CD38 человека и/или макака-крабоеда). В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I];

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры;

и где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь. В некоторых вариантах осуществления вторая и третья полипептидная цепи дополнительно содержат Fc-участок, связанный с C_H1, при этом Fc-участки содержат шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления один или оба Fc-участка представляют собой Fc-участки IgG4 человека, содержащие аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-236 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека, содержащие аминокислотные мутации в положениях, соответствующих положениям 228, 233-236 и/или 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные мутации представляют собой S228P; E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236; и/или R409K. В некоторых вариантах осуществления один или оба Fc-участка представляют собой Fc-участки IgG1 человека, содержащие одну или более аминокислотных замен в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и/или 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и/или P329A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека, содержащие аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 298, 299 и/или 300 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S298N, T299A и/или Y300S.

В некоторых вариантах осуществления VH1 и VL1 образуют связывающую пару и образуют первый антигенсвязывающий сайт. В некоторых вариантах осуществления VH2 и VL2 образуют связывающую пару и образуют второй антигенсвязывающий сайт. В некоторых вариантах осуществления VH3 и VL3 образуют связывающую пару и образуют третий антигенсвязывающий сайт. Связывающие белки также можно применять для активации клеток, нацеливания на опухоль, нейтрализации форм активности цитокинов, нейтрализации вирусной инфекции, комбинации нескольких событий передачи сигнала для лечения рака, артрита и/или воспалительных нарушений. Например, в некоторых вариантах осуществления связывающий белок специфически связывает один, два или три целевых антигена, выбранных из A2AR, APRIL, ATPDазы, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (также известного как VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (также известного как MCP-1), CCL3 (также известного как MIP-1a), CCL4 (также известного как MIP-1b), CCL5 (также известного как RANTES), CCL7 (также известного как MCP-3), CCL8 (также известного как MCP-2), CCL11 (также известного как эотаксин), CCL15 (также известного как MIP-1d), CCL17 (также известного как TARC), CCL19 (также известного как MIP-3b), CCL20 (также известного как MIP-3a), CCL21 (также известного как MIP-2), CCL24 (также известного как MPIF-2/эотаксин-2), CCL25 (также известного как TECK), CCL26 (также известного как эотаксин-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23 (также известного как FCER2, рецептор для IgE), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (также известного как B7-1), CD86 (также известного как B7-2), CD122, CD137 (также известного как 41BB), CD137L, CD152 (также известного как CTLA4), CD154 (также известного как CD40L), CD160, CD272, CD273 (также известного как PDL2), CD274 (также известного как PDL1), CD275 (также известного как B7H2), CD276 (также известного как B7H3), CD278 (также известного как ICOS), CD279 (также известного как PD-1), CDH1 (также известного как E-кадгерин), хитиназы, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (также известного как M-CSF), CSF-2 (также известного как GM-CSF), CSF-3 (также известного как GCSF), CX3CL1 (также известного как SCYD1), CXCL12 (также известного как SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролазы 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rбета, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (также известного как рецептор для IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (также известного как интегрин b4), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, лептина, LPFS2, молекулы MHC класса II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDазы-1, OX40, OX40L, PD-1H, тромбоцитарного рецептора, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (также известного как рецептор для IL33), STEAP2, Syk-киназы, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (также известного как корецептор для IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM и XCR1 (также известного как GPR5/CCXCR1). В некоторых вариантах осуществления один или более вышеуказанных целевых антигенов представляют собой целевые антигены человека.

В некоторых вариантах осуществления один из трех антигенсвязывающих сайтов связывает полипептид CD3 (например, полипептид CD3 человека), один из трех антигенсвязывающих сайтов связывает полипептид CD28 (например, полипептид CD28 человека) и один из трех антигенсвязывающих сайтов связывает третий полипептид. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий сайт, который специфически связывает целевой антиген, отличный от CD3 или CD28, связывает целевой антиген, выбранный из A2AR, APRIL, ATPDазы, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (также известного как VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (также известного как MCP-1), CCL3 (также известного как MIP-1a), CCL4 (также известного как MIP-1b), CCL5 (также известного как RANTES), CCL7 (также известного как MCP-3), CCL8 (также известного как MCP-2), CCL11 (также известного как эотаксин), CCL15 (также известного как MIP-1d), CCL17 (также известного как TARC), CCL19 (также известного как MIP-3b), CCL20 (также известного как MIP-3a), CCL21 (также известного как MIP-2), CCL24 (также известного как MPIF-2/эотаксин-2), CCL25 (также известного как TECK), CCL26 (также известного как эотаксин-3), CCR3, CCR4, CD19, CD20, CD23 (также известного как FCER2, рецептор для IgE), CD24, CD27, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (также известного как B7-1), CD86 (также известного как B7-2), CD122, CD137 (также известного как 41BB), CD137L, CD152 (также известного как CTLA4), CD154 (также известного как CD40L), CD160, CD272, CD273 (также известного как PDL2), CD274 (также известного как PDL1), CD275 (также известного как B7H2), CD276 (также известного как B7H3), CD278 (также известного как ICOS), CD279 (также известного как PD-1), CDH1 (также известного как E-кадгерин), хитиназы, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (также известного как M-CSF), CSF-2 (также известного как GM-CSF), CSF-3 (также известного как GCSF), CX3CL1 (также известного как SCYD1), CXCL12 (также известного как SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролазы 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rбета, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (также известного как рецептор для IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (также известного как интегрин b4), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, лептина, LPFS2, молекулы MHC класса II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDазы-1, OX40, OX40L, PD-1H, тромбоцитарного рецептора, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (также известного как рецептор для IL33), STEAP2, Syk-киназы, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (также известного как корецептор для IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM и XCR1 (также известного как GPR5/CCXCR1). В некоторых вариантах осуществления один или более вышеуказанных целевых антигенов представляют собой целевые антигены человека.

В любом из триспецифических связывающих белков, описанных выше, может быть использован любой линкер или комбинация линкеров, описанных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо составляет по меньшей мере одну аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо имеет длину, составляющую ноль аминокислот, или содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). В некоторых вариантах осуществления каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L₂ содержит последовательность TKGPS (SEQ ID NO: 57), L₃ содержит последовательность S, и L₄ содержит последовательность RT. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L₂ содержит последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), длина L₃ составляет 0 аминокислот, и длина L₄ составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L₂ содержит последовательность GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), длина L₃ составляет 0 аминокислот, и длина L₄ составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), длина L₂ составляет 0 аминокислот, L₃ содержит последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), и длина L₄ составляет 0 аминокислот.

IV. Варианты применения связывающих белков

Связывающие белки можно использовать в любом известном способе анализа, таком как анализы конкурентного связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации для выявления и количественного определения одного или более антигенов-мишеней. Связывающие белки будут связывать один или более антигенов-мишеней с аффинностью, которая соответствует используемому способу анализа.

Для диагностических применений в определенных вариантах осуществления связывающие белки можно метить выявляемым фрагментом. Выявляемый фрагмент может представлять собой любой фрагмент, который способен непосредственно либо опосредованно генерировать выявляемый сигнал. Например, выявляемый фрагмент может представлять собой радиоизотоп, такой как ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In или ⁶⁷Ga; флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как изотиоцианат флуоресцеина, родамин или люциферин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза или пероксидаза хрена.

Связывающие белки также применимы для визуализации in vivo. Связывающий белок, меченный выявляемым фрагментом, можно вводить животному, предпочтительно в кровоток, и анализировать присутствие и положение меченного антитела в организме хозяина. Связывающий белок можно метить любым фрагментом, который можно выявить в организме животного с помощью ядерного магнитного резонанса, рентгенологического исследования либо с помощью других способов выявления, известных в данной области техники.

Для клинических или исследовательских применений в некоторых вариантах осуществления связывающие белки могут быть конъюгированы с цитотоксическим средством. Для нацеливания цитотоксических полезных нагрузок на конкретные опухолевые клетки использовали разнообразные антитела, связанные с цитотоксическими средствами (то есть конъюгаты антитело-лекарственное средство). Цитотоксические средства и линкеры, которые обеспечивают конъюгацию средства с антителом, известны в данной области техники; см., например, Parslow, A.C. et al. (2016) Biomedicines 4:14 и Kalim, M. et al. (2017) Drug Des. Devel. Ther. 11:2265-2276.

Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему связывающий белок и другие реагенты, применимые для выявления уровней целевых антигенов в биологических образцах. Такие реагенты могут включать выявляемую метку, блокирующую сыворотку крови, образцы положительного и отрицательного контроля и реагенты для выявления. В некоторых вариантах осуществления набор содержит композицию, содержащую любой связывающий белок, полинуклеотид, вектор, векторную систему и/или клетку-хозяина, описанные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления набор содержит контейнер и этикетку или листовку-вкладыш на контейнере или вместе с ним. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, мешки с раствором для в/в инъекции и т. д. Контейнеры могут быть изготовлены из ряда материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в комбинации с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой мешок с раствором для внутривенной инъекции или флакон с пробкой, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций). В некоторых вариантах осуществления на этикетке или листовке-вкладыше указывается, что композиция применяется для предупреждения, диагностирования и/или лечения предпочтительного состояния. Альтернативно или дополнительно изделие или набор может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-буферный раствор солевой раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие вещества, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в том числе другие буферы, разбавители, наполнители, иглы и шприцы.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению вводят нуждающемуся в этом пациенту для лечения или предупреждения рака. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу предупреждения и/или лечения пролиферативного заболевания или нарушения (например, рака). В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает введение пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного из связывающих белков или связанных с ним фармацевтических композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного из связывающих белков или связанных с ним фармацевтических композиций, описанных в данном документе, для предупреждения и/или лечения пролиферативного заболевания или нарушения (например, рака) у нуждающегося в этом пациента. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному из связывающих белков или связанным с ним фармацевтическим композициям, описанным в данном документе, для применения в изготовлении лекарственного препарата, предназначенного для профилактики и/или лечения пролиферативного заболевания или нарушения (например, рака) у нуждающегося в этом пациента. В некоторых вариантах осуществления пациентом является человек. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит один антигенсвязывающий сайт, который связывает поверхностный белок Т-клеток, и другой антигенсвязывающий сайт, который связывает внеклеточный домен полипептида CD38 человека, как, например, описано в разделе II выше. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит антигенсвязывающий сайт, который связывает внеклеточный домен полипептида CD38 человека, антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD28 человека, и антигенсвязывающий сайт, который связывает полипептид CD3 человека.

В некоторых вариантах осуществления клетки рака экспрессируют полипептид CD38 изоформы A человека на своей клеточной поверхности (например, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления клетки рака экспрессируют полипептид CD38 изоформы E человека на своей клеточной поверхности (например, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105). В некоторых вариантах осуществления пациент выбран для лечения на основе того, что раковые клетки экспрессируют полипептид CD38 изоформы E человека на своей клеточной поверхности (например, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105). В некоторых вариантах осуществления раковые клетки экспрессируют CD38 и CD28. В некоторых вариантах осуществления раковые клетки экспрессируют CD38 и не экспрессируют CD28.

В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой множественную миелому, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, лимфому, рак молочной железы, как, например, рак молочной железы Her2+, рак предстательной железы, В-клеточную лимфому из клеток зародышевого центра или В-клеточный острый лимфобластный лейкоз. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой множественную миелому. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML), острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) или B-клеточную лимфому.

В определенных вариантах осуществления рак представляет собой множественную миелому. Антитела к CD38 тестировали в отношении применения в лечении множественной миеломы, например, даратумумаб и изатуксимаб. Однако несмотря на то, что множественная миелома считается излечимой, рецидив неизбежен практически у всех пациентов, что приводит к развитию резистентной к лечению болезни. В некоторых вариантах рак представляет собой рецидивирующую или рефрактерную множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления пациент был подвергнут лечению с использованием предшествующего курса лечения множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению вводят пациенту как лечение множественной миеломы 1^-й, 2^-й или 3^-йлинии. Не вдаваясь в теорию, полагают, что связывающий белок-антитело к CD38x-CD28x-CD3 по настоящему изобретению может быть применим в лечении множественной миеломы, например, посредством рекрутинга Т-клеток к опухолевым клеткам при участии антитела к CD38 (или антитела к CD38/CD28), активации вовлеченных Т-клеток при участии антител к CD3/CD28 и/или уничтожения опухолевых клеток с помощью механизмов на основе перфорина/гранзима. Сообщалось, что CD28 является новым маркером рака при множественной миеломе. См. Nair, J.R. et al. (2011) J. Immunol. 187:1243-1253.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один связывающий белок вводят (или необходимо вводить) в комбинации с одним или более противораковыми терапевтическими средствами (например, любым противораковым терапевтическим средством, известным в данной области техники, таким как химиотерапевтическое средство или терапия). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один связывающий белок вводят (или необходимо вводить) перед одним или более противораковыми терапевтическими средствами. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один связывающий белок вводят (или необходимо вводить) одновременно с одним или более противораковыми терапевтическими средствами. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один связывающий белок вводят (или необходимо вводить) после одного или более антиретровирусных терапевтических средств.

V. Терапевтические композиции на основе связывающих белков и их введение

Терапевтические или фармацевтические композиции, содержащие связывающие белки, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Такие терапевтические или фармацевтические композиции могут содержать терапевтически эффективное количество связывающего белка или конъюгата связывающий белок-лекарственное средство в смеси с фармацевтически или физиологически приемлемым средством для составления, выбранным в соответствии со способом введения.

Приемлемые вещества для составления предпочтительно являются нетоксичными для получающих их пациентов при используемых дозах и концентрациях.

Фармацевтическая композиция может содержать вещества для составления, предназначенные для модификации, поддержания или сохранения, например, pH, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, всасывания или проникновения композиции. Подходящие вещества для составления включают без ограничения аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), противомикробные средства, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия), буферы (такие как борат, бикарбонат, Tris-HCl, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты), объемообразующие вещества (такие как маннит или глицин), хелатирующие вещества (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA)), комплексообразующие вещества (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин), наполнители, моносахариды, дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины), белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины), красители, ароматизаторы и разбавители, эмульгаторы, гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон), низкомолекулярные полипептиды, солеобразующие противоионы (такие как ион натрия), консерванты (такие как хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или пероксид водорода), растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахароспирты (такие как маннит или сорбит), суспендирующие вещества, поверхностно-активные вещества или смачивающие вещества (такие как плюроники; PEG; сложные эфиры сорбита; полисорбаты, такие как полисорбат 20 или полисорбат 80; тритон; трометамин; лецитин; холестерин или тилоксапол), вещества, повышающие стабильность (такие как сахароза и сорбит), вещества, повышающие тоничность (такие как галогениды щелочных металлов - предпочтительно хлорид натрия или калия - или маннит, сорбит), среды для доставки, разбавители, вспомогательные вещества и/или фармацевтические адъюванты (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) и его последующие издания, которые включены в данный документ посредством ссылки для любой цели).

Оптимальную фармацевтическую композицию будет определять специалист в данной области техники в зависимости, например, от предполагаемого пути введения, формата доставки и требуемой дозы. На такие композиции могут оказывать влияние физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость выведения in vivo связывающего белка.

Основная среда или носитель в фармацевтической композиции могут быть водными либо неводными по своей природе. Например, подходящей средой или носителем для инъекции может быть вода, физиологический солевой раствор или искусственная спинномозговая жидкость, возможно, с добавкой других веществ, общепринятых для композиций для парентерального введения. Нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином, представляют собой дополнительные приводимые в качестве примера среды. Другие приводимые в качестве примера фармацевтические композиции содержат буфер Tris со значением pH, составляющим приблизительно 7,0-8,5, или ацетатный буфер со значением pH, составляющим приблизительно 4,0-5,5, который может дополнительно включать сорбит или подходящий заменитель. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиции на основе связывающего белка могут быть получены для хранения в форме лиофилизированной массы или водного раствора путем смешивания выбранной композиции с требуемой степенью чистоты с необязательными средствами для составления. Кроме того, связывающий белок может быть составлен в форме лиофилизата с применением подходящих вспомогательных веществ, таких как сахароза.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут предназначаться для парентеральной или подкожной доставки. Альтернативно композиции могут предназначаться для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например, перорально. Получение таких фармацевтически приемлемых композиций находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники.

Компоненты состава присутствуют в концентрациях, которые являются приемлемыми для места введения. Например, буферы используют для поддержания значения pH композиции на физиологическом уровне или при немного меньшем значении pH, обычно в диапазоне значений pH от приблизительно 5 до приблизительно 8.

Если предусмотрено парентеральное введение, то терапевтические композиции, предназначенные для применения, могут быть в форме не содержащего пирогенов приемлемого для парентерального введения водного раствора, содержащего требуемый связывающий белок в фармацевтически приемлемой среде. Особенно подходящей средой для парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная вода, с помощью которой связывающий белок составляют в виде стерильного изотонического раствора с подходящими консервантами. Еще один препарат может предусматривать состав на основе требуемой молекулы со средством, таким как инъецируемые микросферы, биоразлагаемые частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, которое обеспечивает контролируемое или замедленное высвобождение продукта, который затем может быть доставлен посредством депо-инъекции. Можно также использовать гиалуроновую кислоту, и она может оказывать эффект обеспечения длительного пребывания в кровотоке. Другие подходящие средства для введения требуемой молекулы включают имплантируемые устройства для доставки лекарственных средств.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть составлена для ингаляции. Например, связывающий белок может быть составлен в виде сухого порошка для ингаляции. Растворы для ингаляций на основе связывающего белка можно также составлять с пропеллентом для аэрозольной доставки. В еще одном варианте осуществления растворы можно распылять.

Также предусматривается, что определенные составы можно вводить перорально. В одном варианте осуществления настоящего изобретения связывающие белки, которые вводят таким способом, можно составлять с такими носителями, которые обычно используют при составлении твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы, или без них. Например, капсула может быть предназначена для высвобождения активной части состава в момент попадания в пищеварительный тракт, где биодоступность повышается до максимума, а распад до попадания в системный кровоток сводится к минимуму. Можно включать дополнительные вещества для облегчения всасывания связывающего белка. Также можно использовать разбавители, ароматизаторы, легкоплавкие воски, растительные масла, смазывающие вещества, суспендирующие средства, средства для улучшения распадаемости таблеток и связующие средства.

Другая фармацевтическая композиция может включать эффективное количество связывающих белков в смеси с нетоксичными вспомогательными веществами, которые являются подходящими для изготовления таблеток. Путем растворения таблеток в стерильной воде или другой подходящей среде можно получить растворы в форме со стандартной дозой. Подходящие вспомогательные вещества включают без ограничения инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция; или связующие вещества, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; или смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.

Дополнительные фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению будут очевидны специалистам в данной области техники, в том числе составы, включающие связывающие белки, в форме с замедленной или контролируемой доставкой. Методики составления ряда других средств с замедленной или контролируемой доставкой, таких как липосомные носители, биоразлагаемые микрочастицы или пористые гранулы и формы для депо-инъекций, также известны специалистам в данной области техники. Дополнительные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые полимерные матрицы в форме изделий определенной формы, например, пленок или микрокапсул. Матрицы с замедленным высвобождением могут включать сложные полиэфиры, гидрогели, полилактиды, сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), этиленвинилацетат или поли-D(-)-3-гидроксимасляную кислоту. Композиции с замедленным высвобождением также могут включать липосомы, которые можно получить любым из нескольких известных из уровня техники способов.

Фармацевтические композиции, подлежащие применению для введения in vivo, обычно должны быть стерильными. Этого можно достичь путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны. Если композиция является лиофилизированной, то стерилизация с помощью этого способа может быть проведена либо до, либо после лиофилизации и восстановления. Композиция для парентерального введения может храниться в лиофилизированной форме или в форме раствора. Кроме того, композиции для парентерального введения, как правило, помещают в контейнер, имеющий стерильное входное отверстие, например, мешок с раствором для внутривенной инъекции или флакон с пробкой, которую можно проколоть гиподермической иглой для инъекций.

После того как фармацевтическая композиция составлена, ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или в виде обезвоженного или лиофилизированного порошка. Такие составы можно хранить либо в готовой к применению форме, либо в форме (например, лиофилизированной), требующей восстановления перед введением.

Настоящее изобретение также охватывает наборы для получения единицы для однократного введения дозы. Каждый из наборов может содержать как первый контейнер с высушенным белком, так и второй контейнер с водным составом. В объем настоящего изобретения также включены наборы, содержащие одно- и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).

Эффективное количество фармацевтической композиции на основе связывающего белка, подлежащей терапевтическому применению, будет зависеть, например, от терапевтического случая и целей. Специалисту в данной области техники будет понятно, что подходящие уровни доз для лечения будут, таким образом, меняться отчасти в зависимости от доставляемой молекулы, показания, в соответствии с которым будут применять связывающий белок, пути введения и метрических характеристик (массы тела, поверхности тела или размера органа) и состояния (возраста и общего состояния здоровья) пациента. Соответственно врач может подобрать дозу и видоизменить путь введения для получения оптимального терапевтического эффекта.

Частота дозирования будет зависеть от фармакокинетических параметров связывающего белка в составе, подлежащем применению. Обычно врач будет вводить композицию до тех пор, пока доза не достигнет такого уровня, при котором достигается необходимый эффект. Следовательно, композицию можно вводить в виде однократной дозы, в виде двух или более доз (которые могут содержать одинаковое количество требуемой молекулы или могут не содержать его) в течение определенного периода времени или в виде непрерывной инфузии посредством имплантируемого устройства или катетера. Дополнительное уточнение подходящей дозировки выполняется стандартным способом рядовыми специалистами в данной области техники и находится в диапазоне задач, которые они обычно выполняют. Подходящие дозировки можно определять с помощью соответствующих данных о дозозависимом ответе.

Путь введения фармацевтической композиции соответствует известным способам, например, перорально; посредством инъекции с помощью внутривенного, интраперитонеального, интрацеребрального (интрапаренхиматозного), интрацеребровентрикулярного, внутримышечного, внутриглазного, внутриартериального, интрапортального или внутриочагового путей; с помощью систем с замедленным высвобождением или с помощью имплантируемых устройств. При необходимости композиции можно вводить в виде болюсной инъекции или непрерывно путем инфузии или с помощью имплантируемого устройства.

Композицию также можно вводить местно посредством имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, в который необходимая молекула была поглощена или инкапсулирована. Если применяют имплантируемое устройство, то устройство можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, и доставка требуемой молекулы может осуществляться посредством диффузии, болюсного введения с регулируемым во времени высвобождением или непрерывного введения.

ПРИМЕРЫ

Приведенные ниже примеры иллюстрируют конкретные варианты осуществления настоящего изобретения и различные варианты их применения. Они приведены только для пояснительных целей, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем настоящего изобретения.

Следующую терминологию можно использовать взаимозаменяемо в примерах и графических материалах, приведенных в данном документе, для обозначения конкретных антигенсвязывающих доменов или антител к CD38:

антитело CD38_C2-CD38-1: mAb1

антитело CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 или CD38_VH1: mAb2

антитело CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3: mAb3

антитело CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3: mAb4

антитело CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3: mAb5

антитело CD38_1370 или CD38_HHY1370: mAb6

антитело CD38_SB19 или изатуксимаб: mAb7.

Пример 1. Получение и определение характеристик моноклональных антител к CD38

В следующих примерах описано получение и определение характеристик моноклональных антител к CD38. Преимущественно антитела, представленные в данном документе, перекрестно реагируют с белками CD38 человека и обезьяны, за счет чего получают молекулы, которые можно использовать как для исследований безопасности, так и для клинических исследований. Такие антитела также способны уничтожать клетки CD38+ путем апоптоза и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).

В этом примере описана эффективная последовательность действий для получения CD38-специфических и перекрестно-реактивных моноклональных антител из отдельных мышиных B-клеток.

Материалы и способы

Получение моноклональных антител

Антитела к CD38 человека получали с использованием внеклеточного домена CD38 человека R45-I300 (SEQ ID NO:1). См. Q. Liu, I. Krilksunov, R. Graeff, C. Munshi, H.C. Lee, and Q. Hao 2005 Structure 13:: 1331-1339. Иммуноген вводили непосредственно вместе с адъювантом для стимуляции иммунного ответа либо нормальным мышам BalbC, либо трансгенным мышам Trianni™ (Trianni, Сан-Франциско, Калифорния), содержащим ДНК, кодирующую вариабельные участки тяжелой и легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека.

Использовали различные рекомбинантные белки CD38, полученные из изоформы A, с разными метками и точечными мутациями (SEQ ID NO:2, 3, 4 и 28), и меченую версию CD38 изоформы E (SEQ ID NO: 105), охватывающую внеклеточный домен CD38 R45-P203. Белки получали путем временной экспрессии в клетках млекопитающих. Кодирующие последовательности ДНК клонировали в плазмиды экспрессии млекопитающих под влиянием энхансера/промотора CMV и полиА-сигналов SV40. Клетки HEK293 (Invitrogen; #K9000-10) временно трансфицировали плазмидами экспрессии с использованием системы экспрессии FreeStyle™ MAX 293 в соответствии с инструкциями производителя.

Иммунизация мышей и отбор отдельных В-клеток

Антитела к CD38 также выделяли непосредственно из антиген-позитивных В-клеток без слияния с клетками миеломы. С использованием этого способа получили более антител к CD38, таких как mAb1 (см. SEQ ID NO: 5 и 6 для последовательностей VH и VL соответственно и SEQ ID NO: 7 и 8 для последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи соответственно). Вкратце каждой самке мышей BALB/c 6-8-недельного возраста (S082342; Charles River Labs, Бар Харбор, Мэн) проводили три цикла иммунизации в течение 41 дня с использованием классического способа, описанного A. Wennerberg et al. (1993 Am. J. Pathol. 143:1050-1054). Антиген вводили интраперитонеально с вентральной стороны мышам. Через три дня после последней инъекции мышей умерщвляли, а селезенки отбирали в асептических условиях и промывали свежей средой RPMI. Лимфоциты выделяли из селезенки, и суспензию отдельных клеток дважды промывали средой RPMI перед сортировкой с использованием стратегии четырехцветной сортировки, включающей панель флуоресцентных антител и двойных белков CD38 человека и обезьяны, а затем отделяли с помощью проточной цитометрической сортировки клеток для выделения перекрестно-реактивных IgG-CD38-специфичных В-клеток человека/обезьяны. Отдельные клетки подвергали непосредственной сортировке в пробирки для ПЦР для амплификации родственной пары генов VH и VL с помощью RT-PCR (T. Tiller, C. Busse и H. Wardemann 2009 J. Immunol. Methods 350:183-193). Полученную ДНК подвергали секвенированию.

Полученную ДНК клонировали в вектор экспрессии млекопитающего, кодирующий соответственно домены IgG1 человека или Ck человека, для временной экспрессии в клетках HEK293 с использованием системы экспрессии FreeStyle™ MAX 293 в соответствии с инструкциями производителя. Партии очищали с помощью аффинной хроматографии с белком А (MabSelect, GE Healthcare). Элюат подвергали диализу против PBS перед стерильной фильтрацией и хранили при 4°С.

Получение антител путем иммунизации трансгенных мышей иммуноглобулином человека и селекция с применением технологии гибридом

Иммунизацию, слияние и скрининг проводили с использованием клеток миеломы P3X63-Ag8.653 с внеклеточным доменом CD38 человека, как описано в Kilpatrick et al. 1997 Hybridoma 16: 381389. С использованием способа RIMMS, описанного Kilpatrick et al., каждой из 6-8-недельных самок трансгенных Trianni Mice™, содержащих ДНК, кодирующую вариабельные участки тяжелой и легкой каппа-цепей иммуноглобулина человека, проводили четыре цикла иммунизации в течение 14 дней с интервалами в 3-4 дня. Белок CD38, эмульгированный в адъюванте RIBI (Sigma #T2684), вводили подкожно в шесть участков, проксимальных к дренирующим лимфатическим узлам, вдоль спины мышей и в шесть расположенных рядом друг с другом участков вдоль живота. Через четыре дня после последней инъекции мышей умерщвляли. Билатеральные подколенные, поверхностные паховые, подмышечные и бронхиальные лимфатические узлы извлекали в асептических условиях и промывали свежей средой RPMI. Лимфоциты извлекали из лимфатических узлов, и одноклеточную суспензию дважды промывали средой RPMI перед слиянием с клетками миеломы P3X63-AG8.653 с использованием полиэтиленгликоля. После слияния клеточную смесь инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 16-24 часов. Полученный клеточный препарат переносили в селективную полутвердую среду и асептически высевали в чашки Петри диаметром 100 мм и инкубировали при 37°С. Через десять дней после начала отбора планшеты исследовали на предмет роста гибридомы, а видимые колонии собирали и помещали в 96-луночные планшеты, содержащие 200 мкл ростовой среды. 96-луночные планшеты хранили в инкубаторе при 37°С в течение 2-4 дней. С использованием данной методики и описанного выше иммуногена, получали несколько химерных антител CD38, например, mAb 6 (см. SEQ ID NO: 9 и 10 для последовательностей VH и VL соответственно и SEQ ID NO: 11 и 12 для последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи соответственно. Последовательности VH и VL получали c помощью RT-PCR, а mAb 6 получали путем временной экспрессии, как описано выше.

Аффинность связывания с растворимыми внеклеточными доменами CD38

Связывающие свойства антител к CD38 человека оценивали с использованием BIAcore 2000 (BIAcore Inc., Уппсала, Нью-Джерси). Вкратце биосенсорный чип CM5 BIAcore фиксировали в данном инструменте и активировали посредством 250 мкл 1:1 NHS/EDC при комнатной температуре. Мышиное антитело к Fc IgG1 человека (GE Healthcare #BR-1008-39) (13,5 мкг/мл в 0,05 М ацетатном буфере, рН 5) иммобилизовали на активированных чипах в проточных ячейках 1. Иммобилизацию проводили при скорости потока 5 мкл/мин. Затем чип блокировали путем введения 55 мкл этаноламин-HCl, pH 8,5, с последующим пятикратным промыванием при помощи 50 мМ NaOH, 1 М NaCl. Для измерения связывания антител к CD38 с белком CD38 человека или CD38 макака-крабоеда использовали антитела в концентрации 2 мкг/мл в рабочем буфере BIAcore (HBS-EP). Антигены (CD38 человека-метка his (ID2) или CD38 макака-крабоеда-метка his (ID3)) вводили при от 3 до 1000 нМ. После завершения фазы введения контролировали диссоциацию в рабочем буфере BIAcore при той же скорости потока в течение 360 с. Поверхность регенерировали между введениями, используя 30 мкл 50 мМ NaOH-1 М NaCl. Отдельные сенсограммы анализировали с применением программного обеспечения BIAsimulation.

Аффинность связывания с предшественниками В-клеток, экспрессирующими CD38 человека

Связывание антител к CD38 с CD38, экспрессируемыми на поверхности рекомбинантных мышиных клеток preB::300.19, определяли с помощью проточной цитометрии. Линия рекомбинантных клеток была описана в J. Deckket et al. 2014 Clin. Cancer Res 20:4574-4583. Мышиные preB::300.19 CD38-экспрессирующие клетки переносили в количестве 40000 клеток/лунка в 96-луночный планшет High Bind (MSD L15XB-3) и 100 мкл/лунка антител к CD38 добавляли в течение 45 минут при 4°C и промывали три раза при помощи PBS 1% BSA. 100 мкл/лунка козьего антитела к IgG человека, конъюгированного с Alexa488 (Jackson ImmunoResearch; # 109-545-098), добавляли в течение 45 мин при 4°С и трижды промывали при помощи PBS 1% BSA. Связывание антител оценивали после центрифугирования и ресуспендирования клеток путем добавления 200 мкл/лунка 1% BSA PBS и считывания с использованием системы для проточной цитометрии Guava® easyCyte™ 8HT. Кажущиеся значения KD и EC50 оценивали с использованием программ BIOST@T-BINDING и BIOST@T-SPEED соответственно.

Результаты

Связывание вновь выделенного mAb1 с человеческими клетками SU-DHL-8 или MOLP-8 сравнивали со связыванием изатуксимаба с применением проточной цитометрии (фиг. 1A). Оба антитела демонстрировали высокоаффинное связывание с обеими клеточными линиями. Однако только mAb1 было способно связываться с клетками, экспрессирующими CD38 макака-крабоеда на своей поверхности (фиг. 1B).

Связывание с растворимыми внеклеточными доменами полипептидов CD38 человека и макака-крабоеда исследовали со вновь выделенными антителами mAb1 и mAb6 с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Результаты SPR приведены в таблице А.

Таблица A. Аффинность связывания антител с растворимым внеклеточным доменом hCD38 и cCD38 согласно данным анализа SPR

hCD38-his (SEQ ID NO:2) cCD38-his (SEQ ID NO:4) Kd (с-1) KD (M) Kd (с-1) KD (M) mAb1 2,66E-04 3,36E-10 9,85E-05 3,90E-10 mAb6 2,03E-04 1,44E-09 1,90E-04 1,38E-09

Также использовали проточную цитометрию для исследования связывания антител mAb1 и mAb6 к CD38 с мышиными клетками pre-B, экспрессирующими полипептид CD38 человека или макака-крабоеда на своей клеточной поверхности. Результаты показаны в таблице B. Оба тестируемых антитела проявили высокую аффинность связывания с клетками preB::300.19, экспрессирующими huCD38 или cCD38.

Таблица B. Аффинность связывания антител к hCD38 или cCD38, экспрессируемых мышиными клетками preB::300.10, определенная с помощью проточной цитометрии

Значения кажущейся KD FACS (M) hCD38-экспрессирующие клетки cCD38-экспрессирующие клетки mAb1 2,80E-10 2,20E-10 mAb6 2,07E-09 1,14E-09

Эти результаты демонстрируют продуцирование антител, которые с высокой аффинностью связываются с полипептидами CD38 человека и макака-крабоеда. Такие антитела, в отличие от других антител к CD38, перекрестно реагируют с полипептидами CD38 человека и макака-крабоеда в растворимой внеклеточной форме или экспрессирующимися на поверхности клеток млекопитающих.

Пример 2. Конструирование in silico вариантов гуманизированных антител к CD38

В данном примере описана гуманизация антител, полученных в примере 1.

Последовательности вариабельных доменов mAb1 анализировали in-silico. Международную информационную систему ImMunoGeneTics для определения иммуноглобулинов (IMGT) использовали для идентификации участков, определяющих комплементарность (CDR).

Сперва параллельно осуществляли поиск с целью определения наиболее близкой комбинации белкой последовательности зародышевой линии мыши и зародышевой линии человека для каждой вариабельной цепи. Это было выполнено с использованием средства поиска основного локального выравнивания (BLAST) (Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) путем сравнения с базами данных белковых последовательностей зародышевой линии мыши и человека. Для каждой цепи антител были выявлены наиболее близкие белковые последовательности V и J мыши и человека. Пригодность данной белковой последовательности с высокой степенью идентичности измеряли по проценту идентичности V-участка. Результаты поиска легкой и тяжелой цепей mAb1 представлены в таблицах C и D соответственно.

Таблица C. Вариабельные легкие цепи mAb1 ближайших белковых последовательностей зародышевой линии человека и мыши (V и J).

Вид Аллель V Идентичность участка V (%) Аллель J [Homo sapiens] IGKV4-1*01 (imgt) 66,34% IGKJ1*01 (imgt) Лучшие функциональные зародышевые линии Функциональные Функциональные [Mus musculus] IGKV3-10*01 (imgt) 96,97% IGKJ1*01 (imgt) Лучшие функциональные зародышевые линии Функциональные Функциональные

Таблица D. Вариабельные тяжелые цепи mAb1 ближайших белковых последовательностей зародышевой линии человека и мыши (V и J).

Вид Аллель V Идентичность участка V (%) Аллель J [Homo sapiens] IGHV1-3*01 (imgt) 69,39% IGHJ4*01 (imgt) Лучшие функциональные зародышевые линии Функциональные Функциональные [Mus musculus] IGHV1-12*01 (imgt) 87,76% IGHJ3*01 (imgt) Лучшие функциональные зародышевые линии Функциональные Функциональные

Затем последовательности вариабельного домена mAb1 подвергали скринингу на присутствие в последовательности участков нестабильности, подверженных воздействию, например, дезамидированию, кислотному расщеплению, окислению или образованию изоаспартатных сайтов. Структуру mAb1 анализировали с помощью трехмерного моделирования с помощью гомологии, чтобы определить, как аминокислотные остатки взаимодействуют внутри или между молекулами. Данная стадия привела к идентификации группы аминокислотных остатков, которые являются структурно важными для таких функциональностей mAb1, как конформация CDR и связывание антигена. Данные аминокислотные остатки отбирали с тем, чтобы они присутствовали в вариабельных участках последовательностей гуманизированного mAb1.

CDR из родительского мышиного mAb1 были привиты на соответствующие каркасы. На основании вышеуказанных анализов человеческий IGKV3-20*02 в сочетании с IGKJ1*01 и человеческий IGHV1-3*01 в сочетании с IGHJ4*01 выбрали в качестве основы для гуманизации вариабельного участка легкой цепи mAb1 и вариабельного участка тяжелой цепи соответственно. Легкая цепь mAb1 демонстрирует 64,52% идентичность в V-участке с выбранной зародышевой линией IGKV3-20*02 человека. Тяжелая цепь mAb1 демонстрирует 69,39% идентичность в V-участке с выбранной зародышевой линией IGHV1-3*01 человека. В ходе процесса гуманизации родительские мышиные CDR mAb1 трансплантировали между выбранными каркасными участками зародышевой линии с целью рекомбинации стандартных последовательностей вариабельных участков антител. Внимание обратили на ранее идентифицированную группу аминокислотных остатков mAb1, которые являются структурно важными для его функциональности, как отмечено выше. При необходимости эти аминокислотные остатки заменяли во вновь созданных последовательностях их точным соответствующим остатком mAb1. Это соответствует стадии обратной мутации для включения соответствующих аминокислотных остатков родительской последовательности. Некоторые мутации в CDR были введены как для гуманизации, так и для предупреждения возникновения участков нестабильности в последовательности в родительских CDR. Вновь созданные последовательности вариабельных участков легких и тяжелых цепей использовали для создания трехмерных моделей гомологии вариабельного участка гуманизированных mAb1. Трехмерные модели строили с использованием Model Antibody Framework из набора BIOVIA Discovery Studio.

На основе подхода прививания CDR создали два варианта вариабельного участка легкой цепи (VL1 и VL3) и четыре варианта вариабельного участка тяжелой цепи (VH1, VH3, VH5 и VH6). Конкретная комбинация аминокислотных остатков, которые варьируют между вариабельными участками легкой и тяжелой цепей mAb1 и их гуманизированными вариантами, представлены в таблицах E и F соответственно.

Таблица E. Различия в последовательностях между вариабельными участками легкой цепи mAb1 и гуманизированными вариантами

Участки Ig (IMGT) VL родительского mAb1 гуманизированный VL1 гуманизированный VL3 FR1 S10 T T A12 S S V13 L L L15 P P Q17 E E CDR1 E27 Q E D30 S D N34 Q N FR2 K49 R R CDR2 L54 G L FR3 N57 S S L58 R R E59 A A S60 T T V62 I I R72 G G D80 S S V82 L L A84 P P D85 E E A87 F F T89 V V

Таблица F. Отличия в последовательностях вариабельных участков тяжелой цепи mAb1 и гуманизированных вариантов

Участки Ig (IMGT) VH родительского mAb1 Гуманизи
рованный VH1 Гуманизи
рованный VH3 Гуманизи
рованный VH5 Гуманизи
рованный VH6 FR1 Q5 V V V V L11 V V V V R13 K K K K S14 P P S P M20 V V V M CDR1 F32 Y F F F N33 A N N N FR2 T40 A A A A G44 R R G R CDR2 N55 Q N N N FR3 K65 Q Q Q Q K67 R R R R S76 A A A A Q82 E E E E I83 L L I I T87 R R R R S91 T T T T

Гуманизированный вариант VL1 с SEQ ID NO: 14 демонстрирует в общей сложности 22 мутации (18 в FR и 4 в CDR) по сравнению с родительским VL в последовательности mAb1 с SEQ ID NO: 6. Этот вариант получен из каркасных участков зародышевых линий IGKV3-20*02 человека в сочетании с IGKJ1*01 с 8 обратными мутациями, выполненными из-за риска негативного воздействия на структуру mAb, конформацию CDR и, следовательно, на связывание с его мишенью. Четыре положения в родительских CDR были мутированы с целью повышения уровня гуманизации или чтобы избежать возникновения участков нестабильности в последовательности.

Гуманизированный вариант VL3 с SEQ ID NO: 18 показывает в общей сложности 18 мутации (18 в FR) по сравнению с родительским VL в последовательности mAb1 с SEQ ID NO: 6. Этот вариант получен из каркасных участков зародышевых линий IGKV3-20*02 человека в сочетании с IGKJ1*01 с 8 обратными мутациями, выполненными из-за риска негативного воздействия на структуру mAb, конформацию CDR и, следовательно, на связывание с его мишенью.

Гуманизированный вариант VH1 с SEQ ID NO: 13 демонстрирует в общей сложности 17 мутаций (14 в FR и 3 в CDR) по сравнению с родительским VH в последовательности mAb1 с SEQ ID NO: 5. Этот вариант получен из каркасных участков зародышевых линий IGHV1-3*01 человека в сочетании с IGHJ4*01 с 11 обратными мутациями, выполненными из-за риска негативного воздействия на структуру mAb, конформацию CDR и, следовательно, на связывание с его мишенью. Три положения в родительских CDR были мутированы с целью повышения уровня гуманизации или чтобы избежать возникновения участков нестабильности в последовательности.

Гуманизированный вариант VH3 с SEQ ID NO: 17 демонстрирует в общей сложности 14 мутаций (14 в FR ) по сравнению с родительской последовательностью VH mAb1 с SEQ ID NO: 5. Этот вариант получен из каркасных участков зародышевых линий IGHV1-3*01 человека в сочетании с IGHJ4*01 с 11 обратными мутациями, выполненными из-за риска негативного воздействия на структуру mAb, конформацию CDR и, следовательно, на связывание с его мишенью.

Гуманизированный вариант VH5 с SEQ ID NO: 21 демонстрирует в общей сложности 11 мутаций (11 в FR ) по сравнению с родительским VH в последовательности mAb1 с SEQ ID NO: 5. Этот вариант получен из каркасных участков зародышевых линий IGHV1-3*01 человека в сочетании с IGHJ4*01 с 14 обратными мутациями, выполненными из-за риска негативного воздействия на структуру mAb, конформацию CDR и, следовательно, на связывание с его мишенью.

Гуманизированный вариант VH6 с SEQ ID NO: 23 демонстрирует в общей сложности 12 мутаций (12 в FR ) по сравнению с родительским VH в последовательности mAb1 с SEQ ID NO: 5. Этот вариант получен из каркасных участков зародышевых линий IGHV1-3*01 человека в сочетании с IGHJ4*01 с 13 обратными мутациями, выполненными из-за риска негативного воздействия на структуру mAb, конформацию CDR и, следовательно, на связывание с его мишенью.

Полученные гуманизированные последовательности вариабельных участков легкой и тяжелой цепей подвергали очистке для определения сходства последовательностей с базой данных Базы данных иммунных эпитопов (IEDB) ((PLos Biol (2005) 3 (3) e91) www.iedb.org), чтобы убедиться в том, что ни одна из последовательностей не содержала какой-либо известный В- или Т-клеточный эпитоп, изложенный в данной базе.

Полные аминокислотные последовательности вариабельного участка mAb1 и гуманизированные вариабельные домены легких и тяжелых цепей приведены в таблице G. Эти гуманизированные вариабельные домены легких и тяжелых цепей были объединены для создания нескольких гуманизированных вариантов родительских вариабельных доменов mAb1. Вариабельные домены mAb2 соответствуют ассоциации гуманизированного VH1 в комбинации с гуманизированным VL1. Вариабельные домены mAb3 соответствуют ассоциации гуманизированного VH3 в комбинации с гуманизированным VL3. Вариабельные домены mAb4 соответствуют ассоциации гуманизированного VH5 в комбинации с гуманизированным VL3. Вариабельные домены mAb5 соответствуют ассоциации гуманизированного VH6 в комбинации с гуманизированным VL3. Триспецифические связывающие белки, показанные в таблице G, более подробно описаны в примере 4.

Соответствующие кодирующие последовательности ДНК гуманизированных вариантов VH и VL, описанные выше, клонировали в вектор экспрессии млекопитающего, кодирующий соответственно домены IgG1 человека или Ck человека, для временной экспрессии и очистки, как это описано в примере 1. Аминокислотные последовательности полноразмерных гуманизированных вариантов антител к CD38, полученных из mAb1, приведены как mAb2 (тяжелая цепь: HC1, SEQ ID NO:15; легкая цепь: LC1, SEQ ID NO:16), mAb3 (тяжелая цепь: HC3, SEQ ID NO:19; легкая цепь: LC3, SEQ ID NO:20), mAb4 (тяжелая цепь: HC5, SEQ ID NO:22; легкая цепь: LC3, SEQ ID NO:20) и mAb5 (тяжелая цепь: HC6, SEQ ID NO:24; легкая цепь: LC3, SEQ ID NO:20).

Пример 3. Перекрестная реактивность и индуцирование апоптоза антител к CD38

Затем гуманизированные варианты антитела к CD38, полученные в примере 2, характеризовали в отношении связывания с полипептидами CD38 человека и макака-крабоеда и индуцирования апоптоза.

Материалы и способы

Анализ индуцирования апоптоза

Клетки инкубировали при 2×10⁵ клеток/мл в полной среде (RPMI-1640, 10% FBS, 2 мМ L-глутамина) с 1,5 мкг/мл (10 нМ) указанных антител в течение 20 часов при 37°C с 5% CO2. Клетки окрашивали аннексином V-FITC в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies). Образцы анализировали с помощью проточной цитометрии на проточном цитометре BD FACSAria™ с использованием программного обеспечения BD FACSDiva для контроля сбора и анализа данных (оба BD Biosciences).

Результаты

Исследовали связывающие свойства отобранных антител к CD38 человека, полученных так, как это описано выше (фиг. 2A-2H). Связывание антител с растворимым CD38 человека и CD38 макака-крабоеда исследовали с применением анализов ELISA и SPR. Данные анализа ELISA использовали для определения EC50 связывания антител с CD38 человека и макака-крабоеда для гуманизированных антител к CD38 mAb2 (фиг. 2A), mAb3 (фиг. 2C), mAb4, mAb5 (фиг. 2E) и человеческого антитела к CD38 mAb6 (фиг. 2I).

Связывание гуманизированных вариантов антител к CD38 или человеческого mAb к CD38 с CD38 также оценивали с использованием выше описанного анализа SPR. Данные анализа SPR использовали для определения K_D и k_off связывания антител с CD38 человека и макака-крабоеда для гуманизированных антител к CD38 mAb2 (фиг. 2B), mAb3 (фиг. 2D), mAb4, mAb5 (фиг. 2F) и человеческого антитела к CD38 mAb6 (фиг. 2H). Данные по связыванию, обобщенные в таблице K, показывают, что все mAb к CD38 связываются с CD38 с аналогичными характеристиками связывания.

Таблица K. Аффинность связывания mAb к CD38 с растворимым внеклеточным доменом CD38 человека и CD38 макака-крабоеда, определенная с помощью поверхностного плазмонного резонанса

hCD38-his (SEQ ID NO:2) cCD38-his (SEQ ID NO:4) Kd (с-1) KD (M) Kd (с-1) KD (M) mAb1 2,66E-04 3,36E-10 9,85E-05 3,90E-10 mAb2 3,90E-04 3,32E-10 7,84E-04 3,44E-09 mAb3 2,83E-04 4,83E-10 1,29E-04 7,10E-10 mAb4 5,29E-04 8,22E-10 2,01E-04 1,14E-09 mAb5 3,33E-04 3,12E-10 1,25E-04 5,63E-10 mAb6 2,03E-04 1,44E-09 1,90E-04 1,38E-09

Способность гуманизированных вариантов антител к CD38 связываться с клетками, экспрессирующими CD38, оценивали с использованием анализа связывания на основе FACS, описанного выше. Данные анализа FACS использовали для определения EC50 связывания антител с CD38 человека и макака-крабоеда для гуманизированных антител к CD38 mAb2 (фиг. 2A), mAb3 (фиг. 2C), mAb4, mAb5 (фиг. 2E) и человеческих антител к CD38 mAb6 (фиг. 2G). Данные анализа связывания, приведенные в таблице L, показывают, что все гуманизированные варианты антител к CD38 проявляли аналогичные аффинности связывания с CD38 на клеточной поверхности.

Таблица L. Аффинность связывания mAb к CD38 с CD38, экспрессирующимися мышиными клетками preB::300.19

Значения кажущейся KD FACS (M) hCD38-экспрессирующие клетки cCD38-экспрессирующие клетки mAb1 2,80E-10 2,20E-10 mAb2 3,30E-10 7,50E-10 mAb3 7,80E-10 1,31E-09 mAb4 5,50E-10 1,15E-09 mAb5 6,80E-10 1,07E-09 mAb6 2,07E-09 1,14E-09

Данные анализа связывания из трех анализов суммированы на фиг. 2I наряду с идентичностью последовательностей доменов VH и VL с V-участками человека.

Затем исследовали способность родительского антитела mAb1 и mAb7 индуцировать апоптоз. Оба антитела обеспечивали усиленное окрашивание аннексином V и поглощение пропидий йодида (PI). 40% клеток стали дважды положительными по окрашиванию аннексином V и PI после обработки mAb7, тогда как 60% клеток, обработанных mAb1, были дважды положительными. Оба антитела проявляли сходный зависимый от концентрации апоптотический эффект в клетках SU-DHL-8 (фиг. 2J). Аналогично оба антитела стимулировали активность ADCC в отношении клеток SU-DHL-8 в присутствии клеток NK92 (фиг. 2K), обеспечивая цитотоксичность до 60% и IC50 4-6 мкМ через 4 часа при 37°C (фиг. 2L).

Изоформу E CD38 идентифицировали in silico и подтверждали на уровне транскриптов из NK-клеток, PBMC и BMMC от пациентов с множественной миеломой и раковых клеточных линий (MOLP-8, CU1702 и CU2332). Изоформу E CD38 подтверждали с помощью скрининга базы данных последовательностей нуклеиновых кислот с использованием программы BLASTN 2.2.26 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.) в базе данных транскриптов Human RefSeq выпуска 20131216. Программу BLASTN использовали без маскировки участков низкой сложности в последовательности и с учетом по меньшей мере: 98,5% идентичности с нуклеотидной последовательностью CD38 изоформы А человека на участке длиной минимум 100 остатков нуклеиновой кислоты. Последовательности, выделенные в результате этого скрининга, повторно выравнивали с локусом гена CD38 для подтверждения их в качестве транскрипционных форм гена CD38 человека (та же геномная структура интрон-экзон). Нуклеиновая последовательность CD38 изоформы E была одной из последовательностей, подтвержденных транскрипционные формы гена CD38 человека.

Также исследовали способность антител к CD38 связываться с обеими изоформами A и E CD38 человека. Для оценки связывания с изоформой А и изоформой Е CD38 проводили иммуноферментный анализ (ELISA) с использованием белков изоформы А и изоформы Е (полученных так, как это описано в примере 1) в качестве захватывающего антигена. 96-луночные планшеты путем покрывали внесения каждой из изоформ антител в концентрации 0,5 мкг/лунка в PBS и 100 мкл/лунка. Планшет инкубировали при 37°С в течение 1 часа и пять раз промывали при помощи PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (PBS-T). Затем 100 мкл в разведении 1:25000 антитела к IgG человека, конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson Ref: 109-035-098) добавляли в каждую лунку. После инкубации при 37°С в течение 1 ч в темноте планшеты промывали при помощи PBS-T пять раз. Связывание антител визуально контролировали путем добавления буфера TMB-H2O2 и считывали при длине волны 450 нм. Значения EC50 оценивали с использованием программного обеспечения BIOST@T-SPEED.

Аффинность связывания различных антител с CD38 изоформы A (SEQ ID NO:1) и изоформы E (SEQ ID NO:105) определяли так, как это показано в таблице L2. В таблице М приведено сравнение связывающих свойств для различных антител к CD38.

Таблица L2. Аффинность связывания антител к CD38 с CD38 изоформ A и E на основе EC50 согласно данным анализа ELISA

Антитело CD38 изоформа A, EC50 (нM) CD38 изоформа E, EC50 (нM) mAb1 0,11 (CV 9%) 0,08 (CV 7%) mAb2 0,14 (CV 13%) 0,10 (CV 12%) mAb6 0,47 (CV 3,7%) 0,32 (CV 5%) mAb7 0,10 (CV 7,1%) Связывание отсутствует

Таблица M. Связывающие характеристики различных антител к CD38.

Антитело к CD38 H11 (Santa Cruz) Даратумумаб mAb7 mAb1 mAb6 Связывание с CD38 изоформы A человека + + + + + Связывание с CD38 изоформы Е человека + - - + + Связывание с CD38 макака-крабоеда + - - + +

И в заключение, mAb7 и mAb1 индуцируют сходный апоптоз в клетках множественной миеломы MOLP-8 человека, сходный зависимый от концентрации апоптотический эффект в отношении клеток SU-DHL-8 и сходную зависимую от концентрации активность ADCC в отношении клеток SU-DHL-8. Однако только mAb1 связывается с CD38 человека и макака-крабоеда с субнаномолярной аффинностью и связывает CD38 изоформ A и E.

Способность гуманизированных вариантов антител к CD38 индуцировать апоптоз также оценивали с помощью сортировки клеток, активированных флуоресценцией (FACS), как это описано выше. Несколько антител к CD38 с различными функциональными свойствами идентифицировали ранее, в то время как некоторые из них могут опосредовать уничтожение in vitro клеточных линий CD38+ посредством прямого воздействия на пролиферацию клеток или апоптоза. Результаты анализов индуцирования апоптоза показаны на фиг. 2М. Все антитела, полученные в примерах 1 и 2, были способны индуцировать апоптоз, кроме mAb6. Антитела к CD38, mAb2, mAb3, mAb4 и mAb5, приводили к дозозависимому индуцированию апоптоза в клетках лимфомы SU-DHL-8; IC50 для каждого антитела представлена на фиг. 2N - 2Q.

Пример 4. Получение триспецифических белков, связывающих CD38

Затем связывающие свойства антигенсвязывающих доменов выбранных антител к CD38, описанных в примерах 1-3, анализировали в триспецифическом формате, показанном на фиг. 3A.

С помощью SPR антигенсвязывающие домены к CD38 исследовали в триспецифическом формате (антитело к CD38x-CD28x-CD3) в отношении способности связывать CD38, когда другие антигенсвязывающие домены связаны с их родственными лигандами. Последовательный анализ связывания с лигандом показан на фиг. 3B. Для последовательного связывания трех антигенов с каждым триспецифическим Ab вводили насыщающую концентрацию (> 10 кДа) каждого антигена в течение 8 минут с последующей диссоциацией в течение 5 минут. Регенерацию поверхности проводили путем введения 10 мМ глицина-HCl pH 2,5 в течение 60 с при 30 мкл/мин. Данные аппроксимировали с моделью кинетического связывания 1:1 и анализировали с использованием Biacore S200 Evaluation Software v 1.0. Равновесную константу диссоциации (K_D) рассчитывали с использованием константы скорости ассоциации (k_on) и константы скорости диссоциации (k_off).

Как показано на фиг. 3C, данный анализ на основе SPR показал, что триспецифические связывающие белки способны связывать CD38 независимо от того, были ли антигенсвязывающие домены CD3 и/или CD28 также связаны с их родственным антигеном. Результаты иллюстративного последовательного анализа связывания показаны на фиг. 4. Кинетические параметры, измеренные с помощью SPR, представлены в таблице M2.

Таблица M2. Связывание триспецифических связывающих белков-антител CD38x-CD28x-CD3 с 1, 2 или 3 родственными антигенами.

Состояние связывающего белка перед связыванием CD38 k_a (M^-1с^-1) k_d (с^-1) K_D (M) Отсутствует предварительное связывание 9,02E+05 1,42E-03 1,57E-09 Предварительное связывание с CD3 8,35E+05 1,24E-03 1,48E-09 Предварительное связывание с CD28 7,39E+05 1,32E-03 1,79E-09 Предварительное связывание CD3, затем CD28 8,18E+05 1,23E-03 1,50E-09 Предварительное связывание CD28, затем CD3 8,37E+05 1,23E-03 1,47E-09

Данные результаты демонстрируют, что все три мишени могут одновременно связываться с триспецифическими связывающими белками. Предварительное связывание триспецифических связывающих белков с CD28, CD3 или обоими (в любом порядке) не изменяло кинетику связывания или афинность связывания с CD38.

Затем каждый антигенсвязывающий домен триспецифического связывающего белка CD38_SB19xCD28_supxCD3_mid оценивали с помощью SPR в отношении способности связывать родственный антиген с двумя другими антигенсвязывающими доменами и без них при насыщении. Таблицы М3 и М4 показывают результаты этих анализов.

Таблица M3. Связывание мишени в отсутствие других мишеней

Мишень k_a (M^-1с^-1) k_d (с^-1) K_D (M) CD38 8,04E+05 1,41E-03 1,75E-09 CD28 1,16E+05 3,14E-04 2,71E-09 CD3 2,90E+04 6,73E-04 2,32E-08

Таблица M4. Связывание мишени в присутствие других мишеней при насыщении

Мишень k_a (M^-1с^-1) k_d (с^-1) K_D (M) CD38 5,93E+05 1,44E-03 2,42E-09 CD28 1,05E+05 3,96E-04 3,77E-09 CD3 1,27E+05 2,36E-03 1,86E-08

Как показано в таблицах М3 и М4, наличие двух мишеней, насыщенных предварительным связыванием с антигеном, не влияло на кинетику или аффинность связывания третьей мишени для CD38 или CD28. В случае связывания CD3 предварительно связанный CD38 и/или CD28 приводил к более быстрой кинетике (приблизительно 4-кратное влияние на значения k_on и k_off).

Антигенсвязывающие домены антител к CD38 исследовали в триспецифическом формате с двумя антигенсвязывающими доменами антитела к CD28 (суперагонист, «sup» и традиционный агонист «cvn») и двумя антигенсвязывающими доменами антитела к CD3 («mid» и «low»). Последовательности вариабельных доменов для этих антигенсвязывающих доменов представлены следующим образом: антитело CD28_sup: SEQ ID NO:49 (VH) и SEQ ID NO:50 (VL); антитело CD28_cvn: SEQ ID NO:51 (VH) и SEQ ID NO:52 (VL); антитело CD3_mid: SEQ ID NO:53 (VH) и SEQ ID NO:54 (VL); антитело CD3_low: SEQ ID NO:84 (VH) и SEQ ID NO:85 (VL). Результаты анализов SPR, оценивающих связывание триспецифических связывающих белков, показаны на фиг. 5. Три связывающих домена антитела к CD38 характеризовались примерно одинаковой аффинностью связывания в формате триспецифического связывающего белка, как и в моноспецифическом формате. Оба CD3-связывающих домена характеризовались приблизительно одинаковой аффинностью связывания в моно-, би- и триспецифических форматах. Домены, связывающие CD28, должны несколько снижать (но все же наномолярно) аффинность связывания в би- или триспецифическом формате по сравнению с моноспецифическим форматом. Когда два других антигенсвязывающих домена были насыщенными, антитело CD38_SB19 и антитело CD28_sup-связывающие домены имели сходные аффинности связывания по сравнению с тем, когда два других антигенсвязывающих домена не были связаны с антигеном. Однако CD3_mid-связывающий домен показал более быструю кинетику, когда два других антигенсвязывающих домена были в насыщенном состоянии. Эти результаты демонстрируют, что CD38-, CD28- и CD3-связывающие домены являются совместимыми для применения в формате триспецифического связывающего белка.

Антигенсвязывающие домены к антитела к CD38, полученные в данном документе, также сравнивали с существующим антигенсвязывающим доменом к антитела к CD38 mAb7 (см. SEQ ID NO:47 для VH и SEQ ID NO:48 для последовательностей VL соответственно). Связывание триспецифических молекул с CD38, экспрессируемым на поверхности рекомбинантных мышиных клеток preB::300.19, определяли с помощью проточной цитометрии, и параллельно анализировали соответствующие моновалентные антитела к CD38. Линия рекомбинантных клеток была описана в J. Deckket et al., 2014 Clin. Cancer Res 20:4574-4583. Мышиные preB::300.19 CD38-экспрессирующие клетки переносили при 40000 клеток/лунка в 96-луночный планшет High Bind (MSD L15XB-3), а 100 мкл/лунка триспецифических молекул добавляли в течение 45 минут при 4°C и трижды промывали при помощи PBS 1% BSA. 100 мкл/лунка козьего антитела к IgG человека, конъюгированного с Alexa488 (Jackson ImmunoResearch; # 109-545-098), добавляли в течение 45 мин при 4°С и трижды промывали при помощи PBS 1% BSA. Связывание антител оценивали после центрифугирования и ресуспендирования клеток путем добавления 200 мкл/лунка 1% BSA PBS и считывания с использованием системы для проточной цитометрии Guava® easyCyte™ 8HT. Кажущиеся значения KD и EC50 оценивали с использованием программ BIOST@T-BINDING и BIOST@T-SPEED соответственно.

Проточную цитометрию использовали так, как это описано выше, для оценки связывания mAb7 или триспецифического связывающего белка с антигенсвязывающим доменом антитела mAb7 к CD38 с мышиными клетками pre-B, экспрессирующими полипептид CD38 человека или макака-крабоеда на своей клеточной поверхности. На фиг. 6A показано, что триспецифический связывающий белок CD38xCD28_supxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом антитела mAb7 к CD38 связывается с клетками, экспрессирующими CD38 человека (вверху слева), с кажущейся аффинностью, которая в 8 раз меньше, чем у моноспецифического антитела mAb7 (вверху справа). Ни моноспецифическое антитело mAb7 (справа внизу), ни триспецифический связывающий белок с антигенсвязывающим доменом антитела mAb7 к CD38 (внизу слева) не связываются с клетками, экспрессирующими CD38 макака-крабоеда.

Связывающий домен гуманизированного антитела к CD38 mAb2 также исследовали в триспецифических форматах в отношении связывания с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека или макака-крабоеда. На фиг. 6B - 6D показано, что в отличие от mAb7 триспецифические связывающие белки CD38xCD28_supxCD3_mid и CD38xCD28_cvnxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом антитела mAb2 к CD38, а также моноспецифическое антитело mAb2 были способны связывать полипептиды CD38 человека и макака-крабоеда. Триспецифический связывающий белок CD38xCD28_cvnxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом mAb2 к CD38 связывается с клетками, экспрессирующими CD38 человека, с кажущейся аффинностью, которая в 9 раз меньше, чем у родительского антитело mAb2 (сравнение верхней части фиг. 6C и верхней части фиг. 6D). Триспецифический связывающий белок CD38xCD28_cvnxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом mAb2 к CD38 связывается с клетками, экспрессирующими CD38 макака-крабоеда, с кажущейся аффинностью, которая в 7,5 раза меньше, чем у родительского антитела mAb2 (сравнение нижней части фиг. 6C и нижней части фиг. 6D). Триспецифический связывающий белок CD38xCD28_supxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом mAb2 к CD38 связывается с клетками, экспрессирующими CD38 человека, с кажущейся аффинностью, которая в 2,5 меньше, чем у триспецифического связывающего белка CD38xCD28_cvnxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом mAb2 к CD38 (сравнение верхней части фиг. 6C и верхней части фиг. 6В).

Связывающий домен гуманизированного антитела к CD38 mAb6 также сравнивали с моноспецифическим антителом mAb6 в отношении связывания с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека или макака-крабоеда. Хотя моноспецифическое антитело mAb6 связывается с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека (вверху справа) или макака-крабоеда (внизу справа) в нМ диапазоне (фиг. 6E), триспецифический связывающий белок CD38xCD28_supxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом mAb6 к CD38 связывается с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека (вверху слева) или макака-крабоеда (внизу слева), в отсутствие насыщения.

И в заключение, было выявлено, что аффинность связывания триспецифического связывающего белка CD38_SB19xCD28_supxCD3_mid c CD38 человека находится в одном и том же диапазоне независимо от того, исследуют ли связывание с рекомбинантным CD38 человека с помощью SPR или с CD38 человека, экспрессируемым на поверхности клетки, с помощью проточной цитометрии (фиг. 6F). Аналогичным образом аффинность триспецифических связывающих белков CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid/low (связывающий домен mAb2 к CD38) и CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid/low (связывающий домен mAb2 к CD38) в отношении связывания с CD38 человека также находилась в одном и том же диапазоне в обоих анализах. В случае CD38_HHY1370xCD28_supxCD3_mid (связывающий домен mAb6 к CD38) K_D для связывания CD38 человека, определенная с помощью SPR, составила 1 нМ, тогда как точную величину EC50 невозможно было оценить с помощью проточной цитометрии. Итоговое описание значений кажущейся KD (полученных с помощью анализа FACS) для триспецифических связывающих белков с различными связывающими доменами антител к CD38 представлено в таблице M5.

Таблица M5. Итоговое описание значений кажущейся KD, полученных с помощью анализа проточной цитометрии

Значения кажущейся KD FACS (M) hCD38-экспрессирующие клетки cCD38-экспрессирующие клетки Триспецифическое с mAb2 к CD38 4,4 нM 7,5 нM Триспецифическое с mAb6 к CD38 Насыщение отсутствует Насыщение отсутствует Триспецифическое с mAb7 к CD38 4 нМ Связывание отсутствует hCD38-экспрессирующие клетки cCD38-экспрессирующие клетки mAb2 0,5 нM 1 нM mAb6 11,2 нM 6,6 нM mAb7 0,5 нM Связывание отсутствует

Как и ожидалось, триспецифический связывающий белок ΔCD38xCD28_supxCD3_mid, не имеющий связывающего домена антитела к CD38, не связывался с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека или макака-крабоеда (фиг. 6G). Это указывает на то, что связывание, наблюдаемое в данном анализе, было специфичным для антигенсвязывающих доменов антитела к CD38.

Пример 5. Определение характеристик in vitro и in vivo триспецифических связывающих белков, содержащих домены из mAb2 к CD38 и mAb6 к CD38

В следующем примере описаны эксперименты, проведенные для определения характеристик стабильности, связывающих свойств и активность новых рекрутеров Т-клеток, которые содержат вариабельные домены, полученные из антител mAb2 и mAb6. Были получены дополнительные антитела к CD38 x CD28 x CD3, содержащие варианты плеч антител к CD38, CD3 и CD28 для триспецифических связывающих белков. Новые антитела к CD38/CD3/CD28 отличаются следующим: 1) связывающий CD38 домен (mAb2 или mAb6); 2) связывающий CD3 домен (CD3_high или CD3_low; см. SEQ ID NO: 84 и 85 для последовательностей VH и VL к CD3_low соответственно); 3) связывающий CD28 домен (CD28_sup или CD28_cvn). В пределах возможных комбинаций совокупность антител к CD38 x CD28 x CD3 была сконструирована, получена и впоследствии исследована в отношении различных функций.

Материалы и способы

Получение и очистка триспецифических связывающих белков

Триспецифические связывающие белки получали путем транзиентной трансфекции клеток Expi293 4 экспрессионными плазмидами с помощью набора для трансфекции ExpiFectamine™ 293 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце 25% (вес/вес) каждой плазмиды разбавляли в Opti-MEM, смешивали с предварительно разбавленным реагентом ExpiFectamine в течение 20-30 минут при комнатной температуре (к. т.) и добавляли к клеткам Expi293 (2,5×10⁶ клеток/мл). Оптимизацию трансфекции для определения наилучшего соотношения плазмид часто использовали с целью получения триспецифического связывающего белка с хорошим выходом и чистотой.

Через 4-5 дней после трансфекции надосадочную жидкость культуры трансфицированных клеток собирали и фильтровали через фильтрующий блок с размером пор 0,45 мкм (Nalgene). Триспецифический связывающий белок в надосадочной жидкости очищали с помощью 3-стадийной процедуры. На первой стадии применяли аффинную очистку с помощью белка A, и связанное Ab элюировали с помощью "буфера для элюирования IgG" (Thermo Fisher Scientific). На второй стадии продукт подвергали диализу против PBS (pH 7,4) в течение ночи с 2 заменами буфера PBS. Любой осадок очищали путем фильтрации через фильтрующий блок на 0,45 мкм (Nalgene) перед следующей стадией. На третьей стадии применяли очистку с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) (Hiload 16/600 Superdex 200 пг или Hiload 26/600 Superdex 200 пг, GE Healthcare) для удаления агрегатов и других структур в образце. Перед их объединением фракции анализировали с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с целью идентификации фракций, содержащих мономерный триспецифический связывающий белок. Очищенное антитело можно разделить на аликвоты и хранить при -80°C в течение длительного срока.

ELISA-анализы

Связывающие свойства очищенных антител анализировали с помощью способов ELISA или SPR. Для ELISA использовали соответствующие антигены для каждого связывающего сайта в триспецифическом связывающем белке для покрывания 96-луночного Immuno Plate (Nunc 439454, Thermo Fisher Scientific) в течение ночи при 4°C с использованием 2 мкг/мл каждого антигена в PBS (pH 7,4). Покрытый планшет блокировали с помощью 5% обезжиренного молока+2% BSA в PBS в течение одного часа при к. т. с последующим трехкратным промыванием в PBS+0,25% Tween 20 (Aqua Max 400, Molecular Devices). Антитела (триспецифические и контрольные Ab) получали в серийном разведении и добавляли в планшеты для ELISA (100 мкл/лунка в двух повторах), инкубировали при к. т. в течение часа с последующим 5-кратным промыванием с помощью PBS+0,25% Tween 20.

После промывания в каждую лунку добавляли вторичное антитело к Fab человека, конъюгированное с HRP (1:5000, № по кат. 109-035-097, Jackson ImmunoResearch Inc) и инкубировали при к. т. в течение 30 минут. После 5-кратного промывания с помощью PBS+0,25% Tween 20 в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата пероксидазы TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL, Гейтерсберг, Мэриленд, США). Реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 1 M H₂SO₄ и OD₄₅₀ измеряли с помощью SpectraMax M5 (Molecular Devices) и анализировали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro6.3 (Molecular Devices). Окончательные данные переносили в программное обеспечение GraphPad Prism (GraphPad Software, Калифорния, США) и откладывали на графике, как это показано. EC50 рассчитывали с помощью того же программного обеспечения.

Для определения связывания триспецифических антител к CD38xCD28xCD3 или изотипических контрольных антител (IgG4 человека) с CD3 человека (Cambridge Biologics LLC, номер по кат. 03-01-0051), CD28 (Cambridge Biologics LLC, номер по кат. 03-01-0303) и CD38 (Cambridge Biologics LLC, номер по кат. 03-01-0369) использовали анализ ELISA. Связанные антитела выявляли с помощью вторичного антитела к Fab, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP)(Jackson ImmunoResearch Inc., #109-035-097).

Анализ уничтожения клеток in vitro

Очищенные PBMC человека использовали для анализов уничтожения in vitro разных раковых клеток с помощью различных триспецифических связывающих белков. Вкратце анализ уничтожения проводили в 96-луночном планшете с V-образным дном лунок. 40 мл PBMC от каждого донора высевали на каждый планшет при 2×10⁶ клеток/мл и готовили 30 мл клеток-мишеней, меченных PKH26 (Sigma, № MINI26), при 2,5×10⁵ клеток/мл (4 мкл красителя для окрашивания до 1×10⁷ клеток). В каждую лунку вначале добавляли 20 мкл/лунка тестируемых белков в различных концентрациях или PMA с последующим добавлением 80 мкл/лунка меченых клеток-мишеней в каждую лунку (2×10^4 клеток/лунка). Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл PBMC с достижением в лунке E:T=10:1 (2×10⁵ клеток/лунка) и инкубировали в течение 24 часов в инкубаторе при 37°C и 5% CO₂. Клетки осаждали путем центрифугирования и собирали надосадочную жидкость для измерения высвобождения цитокинов либо сливали. Клетки окрашивали фиксируемым фиолетовым окрашивающим буфером для мертвых клеток Vivid LIVE/DEAD™ (Life Technology, № L34955) (окрашивающий буфер готовили путем добавления 60 мкл реагента Vivid в 60 мл PBS). Клетки ресуспендировали в 100 мкл окрашивающего буфера путем инкубирования в течение 15 мин при к.т. в темноте. После промывания клеток в 1 x PBS клетки ресуспендировали в 200 мкл PBS с 0,5% параформальдегидом, а данные о PKH26+ Vivid+ раковых клетках получали с помощью проточного цитометра Fortessa (Beckton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния) с последующим анализом с применением программного обеспечения FlowJo. Процентную долю уничтожения рассчитывали как «специфическое уничтожение-спонтанное уничтожение/общее количество клеток» и наносили на графике, как показано.

Анализ высвобождения цитокинов

Для измерения концентраций воспалительных цитокинов в анализах активации in vitro, анализах уничтожения in vitro, анализах активации in vivo у мышей NSG, гуманизированных с помощью CD34+ клеток пуповинной крови, и исследовании токсичности отбирали надосадочную жидкость культуры клеток, а образцы сыворотки крови разбавляли в соответствии с протоколом производителя с использованием высокочувствительного 13-плексного набора Milliplex для T-клеток человека (EMD Millipore). Затем их анализировали с помощью системы EMD Millipore MAGPIX® и программного обеспечения MILLIPLEX® Analyst 5.1.

Мышиные модели и исследования эффективности in vivo

Мышей NSG, которым трансплантировали CD34+ гемопоэтические стволовые клетки человека (hu-CD34), использовали в качестве мышиной модели in vivo. У этих мышей развиваются человеческие иммунные клетки смешанного типа, и они представляют собой валидированную платформу для иммуноонкологических исследований эффективности (см., например, Shultz, L.D. et al. (2014) Cold Spring Harb. Protoc. 2014:694-708). Hu-CD34⁺ мышей NSG получают путем инъекции CD34⁺ гемопоэтических стволовых клеток, что демонстрирует эффективную трансплантацию популяций иммунных клеток смешанного типа человека, в том числе T-клеток, B-клеток и некоторых других популяций (McDermott, S.P. et al. (2010) Blood 116:193-200). Гемопоэз смешанного типа происходит в течение периода 12 недель. Трансплантация является устойчивой в течение более одного года без реакции "трансплантат против хозяина".

Для исследования эффективности с использованием мышей NSG hu-CD34 мышей приобретали у The Jackson Laboratory (Мэн, США), а популяции клеток человека валидировали перед использованием. Как правило, для инокуляции опухоли для каждой мыши использовали 5×10⁶ опухолевых клеток, смешанных c Matrigel (BD Biosciences) (50% об./об.). После достижения опухолью размера в диапазоне 100-150 мм³ мышей отбирали и рандомизировали в каждую группу для исследования. Антитела вводили внутривенно в указанных дозах 3 раза в неделю. Массу тела регистрировали 1-3 раза в неделю. Размер опухоли измеряли путем измерений опухоли штангенциркулем 1-3 раза/неделя. Всех мышей умерщвляли при достижении опухолью размера 1500 мм³ или через 24 часа после введения последней дозы. Образцы терминальной крови (0,3 мл) собирали в пробирки для отделения сыворотки крови, перемешивали путем осторожного пятикратного переворачивания и помещали в штатив для пробирок. Терминальные опухоли также собирали и взвешивали перед помещением в фиксатор для иммуногистохимического анализа.

Мышей NSG, гуманизированных с помощью PBMC человека (hu-PBMC), использовали в качестве другой мышиной модели in vivo. Этих мышей получают путем инъекции очищенных PBMC человека от здоровых доноров, которые характеризуются наиболее короткими сроками приживления трансплантата при использовании зрелых мононуклеарных клеток периферической крови и позволяют проводить краткосрочные исследования, требующие усиленного функционирования эффекторных T-клеток и T-клеток памяти и NK-клеток, и они подходят для краткосрочного исследования эффективности (3-4 недели) ввиду реакции "трансплантат против хозяина".

Для исследования эффективности с использованием мышей NSG hu-PBMC мышей NSG в возрасте 8-10 недель (№ по кат.: 005557, NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) приобретали у The Jackson Laboratory (Мэн, США). Каждой мыши подкожно инокулировали 5×10⁶ опухолевых клеток, смешанных с Matrigel (BD Biosciences) (50% об./об.). После достижения опухолью размера в диапазоне 50-100 мм³ каждую мышь подвергали восстановлению с помощью 10×10⁶ PBMC человека от здоровых доноров интраперитонеально (и/п). Восстановление с помощью клеток человека подтверждали на следующий день. После достижения опухолью размера в диапазоне 100-150 мм³ мышей отбирали и рандомизировали в каждую группу для исследования. Антитела вводили внутривенно в указанных дозах 3 раза в неделю. Массу тела регистрировали 1-3 раза в неделю. Размер опухоли измеряли путем измерений опухоли штангенциркулем 1-3 раза/неделя. Всех мышей умерщвляли при достижении опухолью размера 1500 мм³ или через 24 часа после введения последней дозы. Образцы терминальной крови (0,3 мл) собирали в пробирки для отделения сыворотки крови, перемешивали путем осторожного пятикратного переворачивания и помещали в штатив для пробирок. Терминальные опухоли также собирали и взвешивали перед помещением в фиксатор для иммуногистохимического анализа.

Мышиной модели NSG с hu-PMBC с диссеминированной опухолью вводили 1-5×10⁶ клеток внутривенно в день 0. В день 3 за основу для рандомизации взяли результат люминесцентной визуализации на исходном уровне. В день 4 каждую мышь подвергали восстановлению с помощью 10×10⁶ PBMC человека от здоровых доноров интраперитонеально (и/п). Мышей обрабатывали один раз в неделю в дни 5, 12, 19 с использованием указанных доз. Для контроля объема опухоли у каждого животного использовали еженедельную люминесцентную визуализацию тела в дни 10, 17, 24. В конце исследования отбирали кровь, селезенку, кость и костный мозг для гистопатологического исследования.

Результаты

Способность антител связываться с каждым из трех целевых антигенов исследовали с помощью анализа ELISA. CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4, CD38_VH1xCD28_supxCD3_low IgG4, CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid IgG4, CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_low IgG4 показали сходную аффинность связывания с CD3 и CD38 человека и обезьяны, но варьирующую аффинность связывания с CD28 (человека и обезьяны имеют идентичный внеклеточный домен) с CD28_sup, демонстрирующим лучшую аффинность (фиг. 7А). CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid и CD38_HHY1370xCD28_supxCD3_mid IgG4 вариант FALA и IgG1 варианты LALA P329A и NNAS все показали сходное связывание с CD3, CD28 и CD38 человека (фиг. 7B).

Затем варианты триспецифического связывающего белка-антитела к CD38xCD3xCD28 исследовали в отношении их способности индуцировать активацию Т-клеток и опосредованное антителами уничтожение опухолевых клеток (фиг. 8A-8D). На фиг. 8A показана активность CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4, CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mid IgG4, CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid IgG4, CD38_hhy1370xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 в отношении in vitro уничтожения линии клеток множественной миеломы человека RPMI-8226 с использованием PBMC от различных доноров при E:T=10. EC50 активности киллинга рассчитывали и суммировали в таблице N. Оба триспецифических связывающих белка-антитела к CD38xCD3xCD28, содержащие CD28_sup, показали лучшую киллерную активность. Киллерную активность данных молекул in vitro также исследовали с использованием клеточных линий NCI-H929 (фиг. 8B), KMS-26 (фиг. 8C) и KMS-11 (фиг. 8D).

Триспецифические связывающие белки-антитела к CD38x-CD3x-CD28 с IgG1 вариантами LALA P329A и NNAS или IgG4 вариантом FALA, также проявляют киллерную активность in vitro в отношении клеток множественной миеломы KMS-11 (фиг. 8E) и U266 (фиг. 8F). Рассчитывали EC50 для каждого антитела против каждой клеточной линии и значения суммировали в таблице Q2 (KMS-11) и Q3 (U266).

На фиг. 9А, 9В и 10 показан профиль in vitro активации Т-клеток для CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 и CD38_VH1xCD28_supxCD3_low IgG4. Оба антитела показали сходные активности в активации по отношению к CD4 и CD8 Т-клеткам. Рассчитывали EC50 для каждого антитела против каждой клеточной линии и значения суммировали в таблице N (RPMI-8226), таблице O (NCI-H929), таблице P (KMS-26) и таблице Q (KMS-11).

Таблица N. Антитело-опосредованное специфическое уничтожение клеток CD38+ RPMI8266 посредством PBMC от разных доноров

Антитело EC50 (нг/мл) Донор #65 Донор #67 Донор #68 CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 5,30 1,95 3,3 CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mid IgG4 2,24 3,42 3,4 CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 8,31 29,52 46,8 CD38_hhy1370xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 4,62 8,98 16,5

Таблица O. Антитело-опосредованное специфическое уничтожение клеток CD38+ NCI-H929 посредством PBMC от разных доноров

EC50 (нг/мл) Донор #65 Донор #67 Донор #68 CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 0,51 0,48 0,9 CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mid IgG4 0,94 1,84 2,5 CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 3,70 9,47 10,4 CD38_hhy1370xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 2,31 6,39 7,2

Таблица P. Антитело-опосредованное специфическое уничтожение клеток CD38+ KMS-26 посредством PBMC от разных доноров

EC50 (нг/мл) Донор #65 Донор #67 Донор #68 CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 1,03 0,91 1,3 CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mid IgG4 3,95 5,06 5,3 CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 10,73 28,17 22,4 CD38_hhy1370xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 15,84 32,10 25,7

Таблица Q. Антитело-опосредованное специфическое уничтожение клеток CD38+ KMS-11 посредством PBMC от разных доноров

EC50 (нг/мл) Донор #65 Донор #67 Донор #68 CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 3,05 3,40 14,7 CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mid IgG4 4,17 7,74 25,1 CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 18,14 98,83 566,8 CD38_hhy1370xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 16,30 27,63 139,2

Таблица Q2. Антитело-опосредованное специфическое уничтожение клеток CD38+ KMS-11 посредством PBMC от разных доноров (IgG1/4 Fc-варианты)

EC50 (пМ)
(KMS11) CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 FALA CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid
IgG1 LALA P329A CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid
IgG1 NNAS CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mi
IgG4 FALA CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mi
IgG1 LALA P329A CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mi
IgG1 NNAS KP50901 3,879 4,375 4,411 7,731 9,311 17,71 KP50904 4,379 6,739 8,644 19,01 18,88 24,39

Таблица Q3. Антитело-опосредованное специфическое уничтожение клеток CD38+ U266 посредством PBMC от разных доноров (IgG1/4 Fc-варианты)

EC50 (пМ)
(U266) CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 FALA CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid
IgG1 LALA P329A CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid
IgG1 NNAS CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mi
IgG4 FALA CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mi
IgG1 LALA P329A CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mi
IgG1 NNAS KP50901 1,879 1,031 1,150 2,691 1,597 2,816 KP50904 0,8657 3,570 2,018 2,112 0,8375 3,527

Продуцирование цитокинов, индуцированное вариантами триспецифического связывающего белка, также исследовали (фиг. 11А и 11В) с использованием способа, описанного в Stebbings, R. et al. (2007) (J. Immunol. 179:3325-3331), путем покрытия планшета указанными антителами с последующей инкубацией с РВМС человека в течение 24 часов с использованием 2 концентраций исследуемых антител (5 мкг/мл и 25 нг/мл). 24-часовой культуральный супернатант собирали и использовали для измерения концентрации IL2, IL6, IL10, IL12 и TNF-α, IFN-γ в супернатантах так, как это описано выше. Все из CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4, CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mid IgG4, CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid IgG4, CD38_hhy1370xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 стимулировали продуцирование значительного количества IL2, TNF-α и IFN-γ при 5 мкг/мл, но не обеспечивали индуцирование измеримого уровня любого цитокина при 25 нг/мл, дозе, показывающей эффективность in vivo в 2 моделях гуманизированных мышей NSG.

Противоопухолевую активность исследовали в мышиных моделях in vivo для вариантов триспецифического связывающего белка (фиг. 12A-13F), как это описано выше. На фиг. 12A-12E показаны результаты исследования эффективности in vivo с использованием мышиной модели NSG (hu-CD34) с имплантированными CD34+ стволовыми клетками человека с клеточной линией MM RPMI-8226. Для обработки мышей с опухолями использовали CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 и сравнительные маркерные контрольные биспецифические антитела CD38xCD3 в указанных дозах 3QW (всего 6 доз). Вес тела и рост опухоли у каждой мыши измеряли и наносили на график (фиг. 12A-12E). Среднюю кривую роста опухоли (фиг. 12D), объем опухоли в день 18 (фиг. 12В) и конечный вес опухоли D19 (фиг. 12C) для каждой группы также наносили на график. Все группы, получавшие CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4, не только продемонстрировали статистическую эффективность по сравнению с контролем PBS, но также показали статистически лучшую эффективность при дозе 1 мкг/кг по сравнению с контрольным биспецифическим антителом CD38xCD3.

На фиг. 13A-13F показаны результаты исследования эффективности in vivo с использованием мышиной модели NSG, гуманизированной с помощью клеток PBMC, с имплантированными клетками линии RPMI-8226 MM человека. Для обработки мышей с опухолями использовали CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 и сравнительные контрольные биспецифические антитела CD38xCD3 в указанных дозах 3QW (всего 8 доз). Рост опухоли у каждой мыши измеряли и наносили на график (фиг. 13A). Среднюю кривую роста опухоли (фиг. 13F), объем опухоли в день 4 (день начала обработки; фиг. 13B), объем опухоли в день 21 (день последней обработки; фиг. 13C), средний объем опухоли в день 21 (фиг. 13D) и конечный вес опухоли в день 22 (фиг. 13E) для каждой группы также наносили на график. Все группы, обработанные CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4, не только продемонстрировали статистическую эффективность по сравнению с контролем PBS, но также показали статистически лучшую эффективность при многократных дозах по сравнению с контрольным биспецифическим антителом CD38xCD3, что указывает на превосходную противоопухолевую активность in vivo триспецифического антитела к CD38/CD3/CD28.

Сравнительное контрольное биспецифическое антитело CD38xCD3 содержало следующие последовательности:

SEQ ID NO 108: сравнительная тяжелая цепь 1 (связывает CD38),

evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsyswmnwvrqapgkglewvseinpqsstinyatsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarygnwfpywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsdtkvdkkvepkscdkthtcppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvkhedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeeynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltcdvsgfypsdiavewesdgqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrweqgdvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO 109: сравнительная тяжелая цепь 2 (связывает CD3),

evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfstyamnwvrqapgkglewvgrirskynnyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycvrhgnfgdsyvswfaywgqgtlvtvssgkpgsgkpgsgkpgsgkpgsqavvtqepsltvspggtvtltcgsstgavttsnyanwvqqkpgksprgliggtnkrapgvparfsgsllggkaaltisgaqpedeadyycalwysnhwvfgggtkltvlepkssdkthtcppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvkhedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreqmtknqvkltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO 110: сравнительная тяжелая цепь (связывает CD38).

divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqnvdtwvawyqqkpgqspkaliysasyrysgvpdrftgsgsgtdftltisslqpedfatyfcqqydsypltfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

Пример 6. Исследование с повышением дозы триспецифических связывающих белков, содержащих домены из mAb2 и mAb6 к CD38

Материалы и способы

Все исследования на NHP проводили в Covance (Принстон, Нью-Джерси, США) в соответствии с протоколом IACUC Covance. Во всех исследованиях использовали самцов макаков-крабоедов, ранее не получавших лекарственное средство и белок или ранее не получавших белок. Согласно плану исследования обезьян отбирали и распределяли d группам, соответствующим каждому триспецифическому связывающему белку. Антитело вводили посредством внутривенной инфузии в подкожную вену в течение 1 часа. Возрастающие дозы вводили в последовательные дни в случае с низкими дозами (< 10 мкг/кг), но с интервалом в 1-2 дня в случае с более высокими дозами (> 10 мкг/кг) в целях наблюдения. Образцы крови отбирали через 0 часов (только в день 1), 0,5 часа (в ходе инфузии), 1 и 6 часов после начала инфузии у всех животных после каждой дозы, как указано. Дополнительные незапланированные образцы крови отбирали на усмотрение руководителя исследования, патологоанатома и/или ветеринара-клинициста. Всех животных возвращали в колонию в день 60. PBMC и сыворотку крови получали из образцов крови с помощью стандартных способов и хранили для дальнейшего анализа.

Кровь от обработанных приматов, отличных от человека, окрашивали флуоресцентно конъюгированными антителами к маркерам Т-клеток и человеческому IgG, фрагменту Fcγ и анализировали на проточном цитометре.

Результаты

Исследование токсичности с повышением дозы проводили у приматов, отличных от человека, с использованием mAb2-содержащих CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4, mAb6-содержащих CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mid IgG4, mAb2-содержащих CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 и mAb6-содержащих CD38_hhy1370xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 триспецифических связывающих белков. Все три связывающих домена в 4 связывающих белках перекрестно реагируют с полипептидами CD38/CD3/CD28 макака-крабоеда. Исследование предназначалось для оценки профиля потенциальной токсичности молекулы. Образцы крови отбирали для процедур выделения сыворотки крови и PBMC. После каждого введения дозы исследовали популяции циркулирующих T-клеток (фиг. 14E-14H) наряду с активацией субпопуляций T-клеток (CD69+) (фиг. 14A - 14D). Процентная доля CD4 и CD8 Т-клеток в кровотоке снижалась с увеличением дозы. Значительная активация CD4 и CD8 Т-клеток была заметной, начиная с доз 2,5 мкг/кг, что указывало на высокую активирующую способность для молекул, содержащих mAb2- и mAb6. Значительное истощение циркулирующих Т-клеток наблюдали при использовании всех белков в дозе 12,5 мкг/кг (фиг. 14I-14L), что опять же коррелирует с эффективностью. Истощение циркулирующих Т-клеток было достаточно кратковременным, с возвращением до уровня, предшествующего обработке, через 24-48 часов (фиг. 14M-14P). Также измеряли уровни некоторых цитокинов в сыворотке крови. Значительное высвобождение IL-6 и IL-10 наблюдали при 12,5 мкг/кг с использованием всех молекул, что было достаточно кратковременным, с возвращением до уровня, предшествующего обработке, через 24 часа (фиг. 14U).

Оба CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 (фиг. 14V) и CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 (фиг. 14W) индуцировали истощение T-клеток в крови при более высоких дозах. Аналогичным образом CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mid IgG4 (фиг. 14X) и CD38_hhy1370xCD28_cvnxCD3_mid IgG4 (фиг. 14Y) также индуцировали истощение T-клеток в крови при более высоких дозах. Однако Т-клетки начинали вновь появляться в крови через 24 часа после обработки любым из четырех триспецифических связывающих белков.(фиг. 14Z-14AC). На фиг. 14AD и 14AE показано количество CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4, связанного с CD4+ T-клетками, после введения дозы 100 мкг/кг. На фиг. 14AF и 14AG показано количество CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4, связанного с CD8+ T-клетками, после введения дозы 100 мкг/кг. Эти данные явно демонстрируют, что триспецифическое Ab CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 может связываться с Т-клетками in vivo в течение продолжительного времени (48-72 часа).

Пример 7. Оптимизация фармакокинетики/фармакодинамики посредством Fc-вариантов

Материалы и способы

С-терминально меченый 6-His рекомбинантный Fcγ RI человека (R&D Systems, #1257-FC-050), С-терминально меченый 10-His рекомбинантный Fcγ RIIA человека (R&D Systems, #1330-CD-050/CF) и С-терминально меченый HPC4 рекомбинантный FcγRIII человека (V158 или F158) подвергали захвату на чип Biacore. Антитела при концентрации 200, 100 и 50 нМ инъецировали в течение 2 минут с последующей диссоциацией в течение 2 минут в буфере HBS-P+, 2 мМ CaCl2 pH 7,4 при скорости потока 30 мкл/мин с использованием Biacore 200. Кривая связывания показана для 200 нМ.

Использовали анализ ELISA с применением С-терминально меченого HPC4 рекомбинантного неонатального Fc-рецептора человека (FcRn) для измерения свойств связывания триспецифических связывающих белков с разными Fc-модификациями. Вкратце рекомбинантный неонатальный Fc-рецептор человека (FcRn) использовали для покрытия планшета ELISA (Nunc 80040LE)(2 мкг/мл в PBS) в течение ночи. Серийно разведенные триспецифические связывающие белки с разными Fc-модификациями добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа с последующим промыванием и инкубацией с HRP-меченым вторичным антителом к IgG человека.

Результаты

Варианты триспецифических связывающих белков, описанные выше, затем анализировали на связывание с разными Fc-рецепторами с целью оптимизации фармакокинетики (PK)/фармакодинамики (PD).

Fc-варианты человека характеризовали в отношении связывания с FcγR I (фиг. 15A), FcγR IIa (фиг. 15B) и FcγR IIIb/c (фиг. 15C), как это описано выше. Исследуемые варианты представляли собой IgG1 человека, IgG4 человека и IgG4 человека с мутациями FALA (F234A и L235A в соответствии с EU-индексом) с контрольным триспецифическим связывающим белком.

Как показано на фиг. 15A-15C, IgG1 и IgG4 дикого типа были способны связывать FcγR I и FcγR IIa, но не FcγR IIIb c, как сообщали ранее. Мутации FALA в IgG4 устраняли связывание FcγR I и FcγR IIa. Не вдаваясь в теорию, полагают, что устранение связывания FcγR I и FcγR IIa может улучшить PK/PD путем удаления нежелательной кластеризации посредством взаимодействий Fc/FcγR.

Затем исследовали вариант IgG4 FALA в отношении связывания FcRn. Данный вариант, а также IgG4 дикого типа связываются с FcRn (фиг. 16). Эти результаты демонстрируют, что мутации IgG4 FALA не влияют на взаимодействия между Fc IgG4 и FcRn, что подразумевает минимальное влияние на время полужизни связывающего белка.

PK-параметры CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4, CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 FALA, CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG1 LALA P329A, а также CD38_HHY1370xCD28_supxCD3_mid IgG4 FALA, определенные у мышей NSG, обобщены на фиг. 17. Fc-модификации IgG4 показали значительно улучшенные время полужизни и AUC у мышей NSG за счет устранения связывания с NSG-специфичным FcγRI, который в избытке присутствует на макрофагах.

Пример 8. Активация in vitro и противоопухолевая эффективность in vivo триспецифических связывающих белков к CD38

Материалы и способы

Высвобождение цитокинов из PBMC человека

РВМС человека инкубировали с 100 мкМ связывающих белков в течение 24 ч. Супернатанты собирали и измеряли уровень цитокинов с помощью Luminex с использованием планшетов Drop Array (в трех экземплярах). Для экспериментов с использованием целевых опухолевых клеток PMBC человека инкубировали с 100 мкМ антител и с целевыми клетками RPMI-8226 или без них при соотношении E:T 10:1 в течение 24 часов. Супернатанты собирали после инкубации PMBC с триспецифическими белками, анализировали в отношении цитокинов с помощью набора MILLIPLEX® MAP и анализировали в системе MAGPIX®.

Анализ Bcl-xL

Отрицательно сортированные Т-клетки из РВМС (магнитные) инкубировали с 100 нМ Ab, связанными с планшетами, в течение 1 дня. Затем Т-клетки промывали и окрашивали флуоресцентно конъюгированными антителами, специфичными для маркеров Т-клеток и Bcl-xL, и анализировали на проточном цитометре.

Пролиферация Т-клеток

Отрицательно сортированные Т-клетки из РВМС (сортировка клеток на основе магнитных гранул) инкубировали с планшетами, связанными с Ab (100 нМ), в течение 1-6 дней. Общее количество клеток подсчитывали с помощью проточной цитометрии с использованием гранул для подсчета в определенные дни после начала инкубации. Кратность изменений рассчитывали по количеству клеток в день 0 (500 клеток/мкл). Результаты представлены от 3 доноров РВМС.

Экспрессия IL-2

Клетки Jurkat IL2-luc2P GloResponse™ инкубировали с триспецифическими белками в течение 6 часов, затем использовали систему для анализа люциферазы Bio-Glo™ для выявления экспрессии репортерного гена люциферазы.

Активация PBMC in vitro

Определяли активацию (CD69⁺) клеток PBMC человека, обработанных триспецифическими антителами к CD38xCD28xCD3 или контрольным связывающим IgG4 белком.

Эффективность in vivo в модели диссеминированной опухоли

Мышиной модели NSG с hu-PMBC с диссеминированной опухолью вводили 1-5×10⁶ клеток внутривенно в день 0. В день 3 за основу для рандомизации взяли результат люминесцентной визуализации на исходном уровне. В день 4 каждую мышь подвергали восстановлению с помощью 10×10⁶ PBMC человека от здоровых доноров интраперитонеально (и/п). Мышей обрабатывали один раз в неделю в дни 5, 12, 19 с использованием указанных доз. Для контроля объема опухоли у каждого животного использовали еженедельную люминесцентную визуализацию тела в дни 10, 17, 24. В конце исследования отбирали кровь, селезенку, кость и костный мозг для гистопатологического исследования.

Результаты

mAb2-содержащие триспецифические связывающие белки-антитела к CD38x-CD28x-CD3 с вариантом FALA IgG4 Fc-участка вызывали заметно сниженные уровни неспецифического высвобождения IFN-γ в PBMC человека по сравнению с аналогичными связывающими белками с Fc-участками дикого типа (фиг. 18А). Аналогичные результаты наблюдали в отношении высвобождения IL-2 (фиг. 18B) и TNF-α (фиг. 18C). Важно отметить, что высвобождение цитокинов было значительно ниже для таких триспецифических связывающих белков с Fc-вариантом по сравнению со сравнительным биспецифическим антителом к CD38x-CD3. Эти результаты предполагают улучшение профиля безопасности триспецифических связывающих белков с Fc-вариантами ввиду снижения неспецифического высвобождения цитокинов.

Fс-варианты IgG1 и IgG4 как mAb2-содержащего CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid, так и mAb6-содержащего CD38_HH71370xCD28_supxCD3_mid также приводили к активации in vitro PBMC человека (фиг. 18D).

Иммунная костимуляция путем лигирования CD28 необходима для выживания и пролиферации Т-клеток; передача сигналов TCR сама по себе не приводит к пролиферации Т-клеток (Sharmee and Allison (2015) Science 348:56-61). Триспецифический связывающий белок CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid приводил к индуцированию Bcl-xL как в CD4+, так и в CD8+ T-клетках, тогда как удаление антигенсвязывающих доменов CD28 или CD3 устраняло этот эффект (фиг. 19A и 19B). Данные результаты демонстрируют, как и ожидалось, что связывающие плечи и CD3, и CD28 необходимы для индуцирования Bcl-xL в Т-клетках посредством триспецифических связывающих белков-антител к CD38, за счет чего обеспечивается доставка способствующего выживаемости сигнала в Т-клетки. Плечо антитела к CD28 триспецифического связывающего белка имеет решающее значение для активации способствующего выживаемости Bcl-xL в Т-клетках. По сравнению со сравнительным биспецифическим антителом к CD38x-CD3 триспецифический связывающий белок CD38_VH1xCD28xCD3 приводил к большей активации Bcl-xL в CD4+ и CD8+ T-клетках (фиг. 19C и 19D).

С целью определения первичного фактора активации Т-клеток посредством триспецифических связывающих белков CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid экспрессию IL-2 в репортерной линии T-клеток Jurkat, содержащих промотор IL-2 человека, управляющий репортерным геном люциферазы, использовали для измерения активации. Нокаутная мутация связывающего домена антитела к CD3 приводила к устранению активации Т-клеток, демонстрируя, что активация Т-клеток является специфическим эффектом лигирования CD3 (фиг. 19E). Данные результаты показывают, что домен антитела к CD3 является основным фактором активации Т-клеток триспецифическими связывающими белками, и что домен антитела к CD28 также вносит значительный вклад в сигнал активации Т-клеток. Первичный фактор высвобождения цитокинов также исследовали с использованием PBMC человека (фиг. 19F). При изучении высвобождения TNF, IFNg, IL-2, IL-6 и IL-10 было выявлено, что CD3 является основной детерминантой высвобождения цитокинов. Было установлено, что CD28 вносит наименьший вклад в данный процесс. Также было обнаружено, что триспецифические связывающие белки с доменом к CD38_VH1 индуцируют меньшее высвобождение цитокинов, чем препарат сравнения.

Также оценивали пролиферацию Т-клеток. Активация Т-клеток с использованием триспецифического связывающего белка-антитела к CD38x-CD28x-CD3 с Fc-варианом IgG4 FALA приводила к большей пролиферации, чем при использовании сравнительного препарата или изотипического контроля (фиг. 19G). Такая активация снижалась при мутации антигенсвязывающих доменов антитела к CD28 или антитела к CD3 (фиг. 20).

Затем использовали гуманизированную мышиную модель NSG для экспериментов с ростом солидных опухолей in vivo. Мышам 6-8 недельного возраста имплантировали клетки миеломы человека RPMI8226. На 9 неделе PBMC человека вводили путем и/п инъекции, hPBMC восстанавливали, а противоопухолевую терапию вводили на 10-13 неделе. 56 гуманизированным с помощью PBMC самкам мышей NSG имплантировали 5 миллионов клеток RPMI8226 в 50% матригеле, и мышей отбирали и рандомизировали для исследования в день 5 или 6 после имплантации. Данная модель служит моделью опухоли in vivo у мышей со зрелыми Т-клетками человека.

Триспецифические связывающие белки также анализировали в мышиной модели NSG диссеминированного роста опухоли с использованием клеток миеломы человека NCI-H929-Luc и анализом роста опухоли с помощью биолюминесценции. Триспецифический связывающий белок CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid с Fc-вариантом IgG4 FALA показал статистически значимую дозозависимую противоопухолевую эффективность в данной модели диссеминированной опухоли при 30 мкг/кг (фиг. 21). Триспецифический связывающий белок CD38_HHY1370xCD28_supxCD3_mid с Fc-вариантом IgG4 FALA также показал статистически значимую дозозависимую противоопухолевую эффективность в данной модели диссеминированной опухоли при 30 мкг/кг и 10 мкг/кг (фиг. 22).

Триспецифические связывающие белки, mAb2-содержащие CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 FALA и mAb6-содержащие CD38_hhy1370xCD28_supxCD3_mid IgG4 FALA, продемонстрировали высокую противоопухолевую активность in vitro в отношении NCI-H929-Luc-миеломных клеток при использовании человеческих PBMC от двух гуманизированных доноров мышей NSG (фиг. 23A и 23B). Триспецифический связывающий белок CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 FALA продемонстрировал более высокую противоопухолевую активность in vivo по сравнению со сравнительным биспецифическим антителом в модели диссеминированной опухоли (фиг. 23C). P-значения для сравнения с контролем-носителем (PBS) определяли следующим образом: CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid IgG4 FALA: p=0,0023; СD38_HHY1370xCD28_supxCD3_mid IgG4 FALA: p=0,0088; сравнительная биспецифическая конструкция CD38xCD3 Fab-scFv-Fc: p=0,6045.

В своей совокупности данные результаты демонстрируют улучшенное кандидатное антитело к CD38 с вариантным Fc-участком, который проявляет увеличенный период полужизни, уменьшенное высвобождение неспецифических цитокинов и высокую противоопухолевую эффективность in vivo.

Пример 9. Дополнительное определение характеристик триспецифических связывающих белков-антител к CD38

С целью стимуляции Т-клеток необходимо два сигнала для оптимальной эффекторной функции и устойчивой пролиферации. Активация, опосредованная комплексом T-рецептор (TCR)-CD3, индуцирует транскрипционную активацию, приводящую к секреции цитокинов. Вовлечение второго поверхностного белка мембраны, CD28, стимулирует альтернативный путь передачи сигнала и подавляет запрограммированную клеточную смерть (Esensten JH, Helou YA, et al. Immunity 44:973-88(2016); Hui E, Cheung J, et al. Science 355:1428-1433(2017)). В отсутствие второго сигнала стимуляция Т-клеток с помощью только CD3 обычно приводит к гибели клеток, индуцированной активацией (Chai JG, Lechler RI. Int Immunol. 9:935-44(1997)). Было выдвинуто предположение о том, что пролиферация Т-клеток может быть повышена за счет объединения специфичности в отношении этих двух разных мишеней.

На фиг. 24A показаны результаты анализа репортерного гена люциферазы с использованием клеток GloResponse™ IL2-luc2P Jurkat (Promega) после стимуляции с использованием CD38_VH1/CD28_supxCD3_mid и его мутантов с одним мутантным сайтом связывания KO и трижды мутантым KO при концентрации 10 нМ. Эти данные иллюстрируют вклад CD28 в стимуляцию Т-клеток (например, передачу сигналов NFAT).

Используя формат биспецифического Ab с кроссоверной конфигурацией с двойным вариабельным участком (CODV) (Steinmetz A, et al. MAbs 8: 867-878 (2016)), комбинации α-CD3ε (сигнал 1) и α-CD28 (сигнал 2) Fv оценивали с целью определить, может ли двойное взаимодействие данных молекул клеточной поверхности стимулировать и поддерживать активацию Т-клеток (фиг. 24B). Ab к CD3ε со средней аффинностью (K_D ~ 20 нМ) использовали, чтобы избежать стимуляцию рецепторов Т-клеток с высокой аффинностью, которая вызывает высокий уровень высвобождения цитокинов и повышает риск синдрома выброса цитокинов. Данный агонист CD3 исследовали в обоих положениях двойного плеча в комбинации с Ab-суперагонистом к CD28, которое, как было показано ранее, обеспечивает пролиферацию Т-клеток (Waibler Z, Sender LY, et al. PLoS One 3:e1708(2008)). Данные моновалентные биспецифические антитела инкубировали с РВМС человека in vitro, и стимуляцию Т-клеток измеряли по секреции интерферона-γ и IL-2. Хотя обе ориентации были активными, оптимальное высвобождение указанных цитокинов наблюдали с CD3 в проксимальном и CD28 в дистальном положении (фиг. 24B). Затем такое двойное плечо отбирали для спаривания с антителом к CD38 в триспецифическом формате Ab (Xu L, Pegu A, et al. Science 358:85-90 (2017)).

На фиг. 25 показано, что активация представителя семейства Bcl-2 Bcl-xL в первичных Т-клетках, индуцированных CD38_VH1/ CD28_supxCD3_mid, является CD28-зависимой. Эти данные иллюстрируют вклад CD28 в выживаемость Т-клеток.

На фиг. 26 показано, что в триспецифическом Ab антитело к CD28 обеспечивает вторичную передачу сигналов, необходимую для поддержания первичной пролиферации Т-клеток in vitro. Эти данные иллюстрируют вклад CD28 в пролиферацию Т-клеток.

В совокупности эти данные показывают, что домен к CD28_sup в триспецифическом антителе CD38_VH1/CD28_supxCD3_mid обеспечивает значительные функциональные возможности в активации T-клеток, выживаемости и пролиферации in vitro.

На фиг. 27 показана конфигурация триспецифического антитела с указанием родительского антитела. Также показана структурная модель триспецифического Ab CD38_VH1/CD28_supxCD3_mid на основе кристаллических структур CD38 VH1 Fab и CD28_sup/CD3_mid CODV Fab (справа).

На фиг. 28A и 28B показано, что клетки множественной миеломы (ММ) с высокой (RPMI-8226; фиг. 28A) и низкой (KMS-11; фиг. 28B) поверхностной экспрессией CD38 подвергались эффективному лизису за счет PBMC человека (E:T=10:1), инкубированных с триспецифическим Ab в разных концентрациях. Вклад в активность в отношении киллерной активности каждого участка связывания был продемонстрирован посредством мутаций КО участка связывания. Эти данные демонстрируют, что триспецифическое антитело к CD38 обеспечивало лизис клеток ММ человека путем распознавания как CD38, так и CD28. CD28, экспрессируемый на клетках множественной миеломы, обеспечивает дополнительную мишень для триспецифического антитела CD38_VH1/CD28_supxCD3_{mid_}FALA, значительно усиливая его киллерную активность.

На фиг. 29A-29C показано, что мутантное антитело к CD28_supKO в составе триспецифического Ab проявляло заметно сниженную противоопухолевую активность in vitro в отношении клеток CD38_high, CD38_mid и CD38_low MM. Представлены анализы с использованием клеток RPMI-8226 (фиг. 29A), U266 (фиг. 29B) или KMS-11 (фиг. 29C). Экспрессия CD28 на клетках MM повышала их чувствительность к цитолизу, опосредованному триспецифическим антителом к CD38.

На фиг. 30 показаны результаты исследования эффективности in vivo в модели линии клеток диссеминированной множественной миеломы человека с использованием мышей NSG, восстановленной in vitro с помощью размноженных первичных Т-клеток человека. Снижение опухолевой нагрузки в группах обработки триспецифическими антителами CD38_VH1/CD28_supxCD3_mid_FALA было дозозависимым и статистически отличающимся. Таким образом, триспецифическое антитело к CD38 обеспечивает защиту от роста клеток ММ диссеминированной опухоли человека in vivo.

Исследование с помощью микроскопии также продемонстрировало уничтожение раковых клеток первичными Т-клетками человека, опосредованное триспецифическими антителами in vitro. На фиг. 31A и 31B показаны изображения, полученные путем микроскопии, демонстрирующие лизис RPMI-8226 (клетки MM человека, меченые красителем CellTracker Deep Red), посредством PBMC человека, опосредованный триспецифическим антителом CD38_VH1/CD28_supxCD3_{mid_}FALA. На фиг. 31А показан контроль, в то время как на фиг. 31B показан лизис, опосредованный триспецифическим антителом CD38_VH1/CD28_supxCD3_{mid_}FALA. Соотношение E:T 10:1 использовали в течение 24-часовой инкубации. Воздействие контрольного трижды нулевого мутанта Ab индуцировало минимальные изменения жизнеспособности опухолевых клеток в течение 24 часов (фиг. 31A). И напротив, инкубация с активным триспецифическим Ab к CD38 индуцировала существенную кластеризацию Т-клеток вокруг опухолевых клеток, что приводит к практически их полному лизису (фиг. 31B). Эти данные демонстрируют, что триспецифическое антитело CD38/CD3xCD28 опосредует цитолиз клеток миеломы посредством Т-клеток.

Пример 10. Модификация связывающих сайтов Fc-рецепторов в Fc-участке IgG4 триспецифических связывающих белков-антител к CD38 снижает неспецифическое воспаление

Fc-участок антител связывается с клеточными рецепторами на моноцитах и NK-клетках, что индуцирует неспецифическое воспаление, которое может быть предрасполагающим фактором у подвергаемых лечению субъектов к синдрому выброса цитокинов. Роль Fc-рецепторов в стимулировании выброса цитокинов оценивали путем исследования мутантов, которые устраняли связывание FcγI, FcγIIa, b и FcγIII. Для этой цели использовали изотип IgG4, который не фиксирует комплемент.

Связывание в анализе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием системы BIAcore (Pharmacia Biosensor; Пискатауэй, Нью-Джерси) использовали для измерения аффинности указанных Fc-вариантов IgG4 к указанным человеческим Fc-рецепторам, иммобилизованным на чипе. Fc-варианты IgG4 использовали при 150 нМ. Связывание с FcRn человека осуществляли с использованием ELISA путем нанесения на планшет антигена человеческого FcRn.

Мутация («FALA») в Fс-участке, которая была ранее описана (Alegre ML, Peterson LJ, et al. Transplantation 57:1537-43(1994); см. также примеры 7-9), устраняла связывание со всеми Fc-рецепторами (фиг. 32 и 33). При исследовании в отношении неспецифического выброса цитокинов такая мутация обеспечивала устранение высвобождения IFN-γ в нестимулированных РВМС, обеспечивая вместе с тем максимальную стимуляцию в присутствии опухолевых мишеней, которые экспрессировали CD38 (фиг. 34, слева и справа, FALA). Такой Fc-мутант сохранял свою цитолитическую активность в отношении миеломных опухолевых мишеней, сравнимую с контрольным Fc дикого типа в клетках, экспрессирующих разные уровни CD38 (фиг. 35). Аналогично другой мутантный Fc-участок IgG4 («PVA», см. фиг. 32), который обеспечивал устранение связывания с Fc-рецепторами (фиг. 33), также устранял высвобождение IFN-γ в нестимулированных PBMC, обеспечивая одновременно максимальную стимуляцию в присутствии опухолевых мишеней, которые экспрессировали CD38 (фиг. 34, слева и справа, PVA), с сохранением цитолитической активности в отношении миеломных опухолевых мишеней, сравнимой с контрольным Fc дикого типа в клетках, экспрессирующих разные уровни CD38 (фиг. 35).

Пример 11. Вклад доменов антитела к CD38 и антитела к CD28 в цитолитическую активность триспецифических связывающих белков

Для каждого участка связывания или комбинации участков связывания получали триспецифические мутантные Ab и исследовали их на цитолитическую активность в отношении линий клеток множественной миеломы с высокой (RPMI-8226) или низкой (KMS-11) поверхностной экспрессией CD38 и CD28.

Как показано выше на фиг. 28A и 28B, мутация специфического связывания CD3 обеспечивала устранение цитолиза, тогда как нулевые мутации в доменах антител к CD38 и к CD28 показали заметно ослабленную киллерную активность, сохраняя при этом некоторую остаточную функцию, что указывает на то, что домены антител и к CD38, и к CD28 способствовали уничтожению опухолевых клеток.

По сравнению с даратумумабом (моноклональное антитело к α-CD38, одобренное для лечения множественной миеломы; см. McKeage K. Drugs. 76:275-81(2016)) триспецифическое Ab продемонстрировало высокую киллерную активность in vitro, которая на 3-4 log выше, в отношении различных линий клеток, экспрессирующих CD38, в том числе клеток множественной миеломы CD38_high и CD38_low (фиг. 36).

Пример 12. Ab CD38/CD3xCD28 стимулирует центральные клетки памяти CD4 и CD8, Th1 и антиген-специфические ответы

Чтобы определить, может ли триспецифическое Ab CD38/CD3xCD28 усиливать клеточную иммунную функцию, оценивали фенотип Т-клеток, размноженных in vitro.

Материалы и способы

Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из крови здоровых доноров, собранной компанией Research Blood Components, LLC (Бостон, Массачусетс). РВМС добавляли в покрытые антителами планшеты (350 нг/лунка) (5×10⁵ клеток/мл), как описано выше, и инкубировали при 37°С в течение 3 и 7 дней. Клетки собирали в определенные моменты времени и анализировали с помощью проточной цитометрии в отношении субпопуляций Т-клеток: наивных (CCR7+ CD45RO-), Tcm (CCR7+ CD45RO+), Tem (CCR7- CD45RO+), Treg (CD4+ Foxp3+ CD25hi). Клетки также обрабатывали монензином (GolgiStop) (BD Biosciences, Калифорния) в течение по меньшей мере 6 часов перед окрашиванием для проточной цитометрии для определения экспрессии внутриклеточных цитокинов: Th1 (CD4+ IFN-γ+), Th2 (CD4+ IL-4+) и Th17 (CD4+ IL-17+). CMV pp65-специфичные CD8+ T-клетки выявляли с использованием флуоресцентно-конъюгированного пентамера, с ограничением PBMC доноров по HLA (A*02:01/NLVPMVATV) (ProImmune, Оксфорд, Великобритания). PBMC получали от HemaCare (Ван-Найз, Калифорния) от доноров с известными CMV-позитивными популяциями и типами HLA. PMBC от доноров, отрицательных в отношении ограничивающего типа HLA, использовали в качестве отрицательного контроля. Окрашивание проводили в соответствии с протоколом производителя.

Результаты

РВМС человека инкубировали в течение 7 дней с триспецифическим Ab или трижды мутантным отрицательным контролем в отсутствие цитокинов. Анализ субпопуляций CD4 выявил наибольшую пролиферацию в пуле центральных клеток памяти с меньшим увеличением количества эффекторных клеток памяти (фиг. 37A). Анализ субпопуляций CD4 также выявил наибольшую пролиферацию клеток Th1 (> 6 раз) по сравнению с клетками Th2 или Th17 (фиг. 37B). В субпопуляции CD8 к 7 дню наблюдали увеличение в 150 раз субпопуляции CD8 центральных клеток памяти с меньшим увеличением количества эффекторных клеток памяти (фиг. 37C). Важно то, что ранее существовавшие антиген-специфические ответы CD8 на CMV, направленные на эпитоп pp65 у серопозитивных доноров HLA-A2 с использованием окрашивания тетрамером (Gratama JW, van Esser JW, et al. Blood 98:1358-1364(2001)), увеличились в >44 раза в присутствии триспецифического белка-антитела к CD38 по сравнению с отрицательным контролем (фиг. 37D).

В совокупности эти данные указывают на то, что триспецифическое Ab к CD38 стимулирует функцию Th1 и защитные ответы CD8 T-клеток памяти, которые могут усиливать противоопухолевый иммунитет in vivo.

Пример 13. CD28 на клетках множественной миеломы повышает распознавание Т-клетками и цитолиз

Материалы и способы

Проточная цитометрия

Уровни CD28 и CD38 на указанных линиях опухолевых клеток определяли с помощью проточной цитометрии с использованием набора QIFI (Dako, Denmark, номер по кат. K007811), как это описано выше (S4). Вкратце мышиное антитело к CD38 человека (клон AT13/5, мышиный IgG1, Santa Cruz Biotech, номер по кат. 59028) и к CD28 человека (клон CD28.2, мышиный IgG1, k, BioLegend, номер по кат. 3029123) использовали в качестве первичного антитела (в концентрации 10 мкг/мл) для выявления поверхностных CD38 и CD28 на клеточных линиях с использованием протокола производителя. Поверхностные концентрации рассчитывали с использованием калибровочных стандартов из набора QIFI и состава, предоставленного в наборе.

Получение CD28 KO линий клеток множественной миеломы человека с помощью CRISPR-опосредованного нокаута

Для клеточной линии KMS-11 нокаут CD28 осуществляли с использованием набора для CRISPR-нокаута CD28 человека (Origene). Набор содержит донорный вектор с функциональной кассетой GFP-пуромицин и два отдельных вектора Cas-9, каждый с разной предварительно сконструированной направляющей РНК (gRNA 1: TACCTGTTACTTGAATTGAA (SEQ ID NO:117) и gRNA 2: ATTTTTTGAGGTCTTCCAAT (SEQ ID NO:118), которые нацеливают на экзон 1 и интрон 1 CD28 соответственно). Клетки высевали в 6-луночный планшет при плотности 3,10⁵ клеток/лунка в среде RPMI 1640 GlutaMAX, дополненной 10% FBS, и через 24 часа одновременно трансфицировали всеми тремя векторами с использованием реагента для трансфекции Lipofectamine™ 3000 (ThermoFisher Scientific) в соответствии с инструкцией производителя. Пуромицин добавляли через 48 часов после трансфекции в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Эффективность трансфекции составляла 30% при использовании 6,25 мкл/лунка Lipofectamine™ 3000, 1,25 мкг каждого вектора Cas-9/gRNA и 2,5 мкг вектора-донора GFP-пуромицин. Нокаут CD28 в клеточной линии RPMI 8226 проводили с использованием набора CD28 sgRNA CRISPR All-in-One Lentivirus (Applied Biological Materials Inc.). Он состоит из набора из 3 лентивирусных векторов «все в одном», экспрессирующих ген Cas9, ген устойчивости к пуромицину и другую sgRNA (sgRNA 1: ATTGTCGTACGCTACAAGCA (SEQ ID NO:119), нацеливающуюся на экзон 2 и sgRNA 2 CD28: CAAAAGGGCTTAGAAGGTCC (SEQ ID NO:120), и sgRNA 3: CTATAGCTTGCTAGTAACAG (SEQ ID NO:121), нацеливающуюся на экзон 3 CD28). Клетки инфицировали с использованием протокола центрифужной инокуляции с 2,10⁵ клеток, смешанных с лентивирусными частицами (10 МЕ/клетка), 8 мкг/мл полибрена и 1:100 усилителем трансдукции ViralPlus (Applied Biological Materials Inc.). Смесь предварительно инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, затем центрифугировали в течение 30 минут при 32°С и 800×g и высевали в 12-луночный планшет. Пуромицин добавляли через 48 часов после инфицирования в конечной концентрации 0,25 мкг/мл. Обе клеточные линии пассажировали по меньшей мере 5 раз (или до тех пор, пока жизнеспособность клеток не станет стабильной) перед подтверждением нокдауна CD28 на уровне белка с помощью проточной цитометрии (антитело к CD28 PE Clone 28.2, BioLegend). CD28-отрицательные клетки затем сортировали на клеточном сортере Sony SH800S и культивировали в средах с добавлением 0,25 мкг/мл или 0,5 мкг/мл пуромицина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (ThermoFisher Scientific). Затем клетки клонировали путем предельного разведения и нокаута CD28, подтвержденного проточной цитометрией, а также ПЦР и секвенированием по Сэнгеру с использованием прямого и обратного праймеров, приведенных ниже.

Таблица R. Перечень прямых и обратных праймеров

Клеточная линия Ампликон Праймеры Размер ампликона Комментарии KMS-11 CD28_GFP_слева F: CACAACCTGTCCCCATCCTATGAA (SEQ ID NO:122)
R: cAAGCTGCCATCCAGATCGTTATCG (SEQ ID NO:123) 1475 п. о. Подтверждает вставку кассеты GFP-пуромицин (левая сторона) CD28_PURO_справа F: CCAAATTAAGGGCCAGCTCATTCC (SEQ ID NO:124)
R: ACCTGTACATCCTTGGGCAAATCC (SEQ ID NO:125) 1233 п. о. Подтверждает вставку кассеты GFP-пуромицин (правая сторона) CD28_экзон_1 F: GTCAGGATGCCTTGTGGTTTGAGT (SEQ ID NO:126)
R: CAGAGCTTCCAGAGCCAATCTAC (SEQ ID NO:127) Вариабельный; WT=720 Участок, окружающий соединение экзон1-интрон1 CD28, соответствующий сайту вставки кассеты GFP-пуромицин и/или вставке/делеции после расщепления CRISPR RPMI 8226 Экзон_2 F: CCATGTACTGCCTTCTGGGTGAAA
(SEQ ID NO:128)
R: CCACTGACCACAACCCAGTTTT
(SEQ ID NO:129) Вариабельный; WT=682 п.о. Участок, окружающий экзон 2 CD28, соответствующий сайтам расщепления CRISPR Экзон_3 F: AGGCCATTGGAAGTCACCGTTT
(SEQ ID NO:130)
R: GCCAACATTGTCCATTGGCTTCAG
(SEQ ID NO:131) Вариабельный; WT=816 п.о. Участок, окружающий экзон 3 CD28, соответствующий сайтам расщепления CRISPR

Результаты

CD28 был встроен в триспецифическое Ab для улучшения пролиферации и выживаемости Т-клеток; однако при оценке маркеров клеточной поверхности на клетках множественной миеломы, было выявлено, что большинство клеточных линий (>95%) экспрессирует гликопротеин CD28 (таблица S).

Таблица S. Экспрессия CD28 и CD38 на поверхности линии клеток

множественной миеломы человека.

Клеточная линия CD28 CD38 JJN3 1,040 50 KMS-11 (p17) 35,345 2,845 U266 170,525 13,825 L-363 9,145 17,500 MM.1S 56,560 44,535 MM.1R 66,220 49,160 KMS-12BM 0 62,845 RPMI 8226 83,915 136,255 NCI-H929 22,065 153,620 LP-1 7,420 372,835 U266-CD38++ 126,465 633,805 JJN3-CD38 0 714,805 MOLP-8 245 885,030 NCI-H929-CD38++ 22,935 981,310 RPMI 8226-CD38++ 86,320 1,419,120

Сообщали, что экспрессия CD28, хотя и отсутствует на нормальных плазматических клетках (Almeida J, et al. British J. of Haematol. 107:121-131(1999)), может быть выявлена на первичных миеломных плазматических клетках приблизительно у одной трети пациентов с недавно установленным диагнозом (Mateo G, et al. Clin. Cancer Res. 11:3661-3667(2005)). Кроме того, она повышается в частоте в ходе прогрессирования миеломы и коррелирует с плохим прогнозом и агрессивными признаками миеломы (Robillard N, Jego G, et al. Clin Cancer Res. 4:1521-6(1998); Nair JR, Carlson LM, et al. J Immunol. 187:1243-53(2011)).

Чтобы определить, может ли экспрессия CD28 на целевых клетках улучшить распознавание и лизис Т-клетками, сравнивали активность дикого типа и триспецифическое немутантное Ab к CD28 на трех независимых линиях миеломы с разной степенью экспрессии CD38 и CD28. Как отмечено выше в примере 9 и показано на фиг. 29A - 29C, цитолиз наблюдали во всех трех линиях независимо от уровня экспрессии CD28 триспецифическим Ab к CD38; однако в отношении всех клеточных линий цитолитическая активность триспецифического немутантного Ab к CD28 была снижена в 30-100 раз, при этом наиболее значительное снижение было в клеточной линии KMS-11, которая проявляла наименьшую экспрессию CD38 (сравните WT и ΔCD28, фиг. 29C и фиг. 29A или фиг. 29B).

Вклад CD28 в распознавание и лизис опухолевых клеток был дополнительно подтвержден с помощью CRISPR-опосредованного нокаута CD28 на миеломной целевой клетке. Экспрессию CD28 не выявили на клетках CD28KO KMS-11 по сравнению с родительской линией (фиг. 38, верхняя панель, справа и слева). Чувствительность клеток CD28KO KMS-11 к цитолизу Т-клетками одновременно снижалась в 10-100 раз (фиг. 38, нижняя панель, слева). В соответствии с данным эффектом не было выявлено отличий в цитолизе при участии триспецифического антитела к CD38 по сравнению с триспецифическим немутантным антителом к CD28 на целевых клетках CD38 KO (фиг. 38, нижняя панель, справа).

Пример 14. Цитолиз посредством триспецифического Ab к CD38 в отношении CD38⁺ клеточных линий гематологического рака

Предыдущие примеры демонстрируют триспецифические антитела к CD38/CD3/CD28, которые способствуют цитолизу клеток множественной миеломы. Исследовали способность данных антител стимулировать цитолиз других линий раковых клеток.

Как показано на фиг. 39, триспецифическое Ab к CD38/CD28xCD3, мутантное по FALA, характеризовалось цитолитической активностью в отношении указанных CD38⁺CD28^- линий, в том числе линий клеток острого миелоцитарного лейкоза (AML (KG-1)), В-клеточной лимфомы (OCI-Ly19), острого Т-лимфоцитарного лейкоза (ALL (KOPN8)) и хронической лимфоцитарной лимфомы (CLL(Z-138)). Это демонстрирует, что триспецифические антитела к CD38/CD3/CD28 обладают активностью в отношении других линий клеток CD38+ гематологического рака, в том числе тех, которые являются CD28-.

Пример 15. Активация РВМС человека in vitro посредством суперагониста α-CD28 требует бивалентности антитела

In vitro активацию PBMC человека с помощью TGN1412 (TGN), одного связывающего плеча TGN1412 (TGNslg) и одного связывающего плеча антитела к CD28_sup(CD28_supslg) проводили так, как это описано (Findlay L, Eastwood D, et al. J Immunol Methods 352:1-12 (2010)). 10⁵ PBMC человека высевали на полипропиленовые 96-луночные планшеты, покрытые указанными антителами с высушиванием (1 мкг/лунка), в течение 24 часов, как это описано ранее. Такие цитокины, как IFN-γ, TNF-α и IL-2, в супернатанте измеряли с помощью Luminex, как это описано в примере 8.

Включение одной специфичности суперагониста CD28 также уменьшало неспецифическое высвобождение цитокинов, наблюдаемое в случае mAb-суперагониста CD28 (фиг. 40), ранее связанного с его неблагоприятными эффектами как нативного IgG у людей (Suntharalingam G, Perry MR, et al. N Engl J Med 355:1018-1028(2006)). И напротив, костимуляция триспецифическим Ab повышала активность и выживаемость Т-клеток, которые осуществляют лизис и защищают от опухолей. Более интересно то, что триспецифические Ab к CD38 преимущественно увеличивают количество популяций клеток Th1 и Tcm in vitro с проявлением важной особенности, которая отличает их от моноклональных Ab, являющихся агонистами α-CD3 или суперагонистами α-CD28, используемых для размножения Treg с целью индуцирования толерантности (Penaranda C1, Tang Q, Bluestone JA. J Immunol. 187:2015-22.(2011); Tabares P, Berr S, et al. Eur J Immunol. 44:1225-36(2014)).

В совокупности данные, представленные в примерах 1-15, демонстрируют триспецифические антитела к CD38/CD3/CD28, которые стимулируют мощный противоопухолевый иммунитет за счет рекрутинга двух Т-клеточных сигнальных рецепторов и усиления распознавания целевых клеток. Связывание CD3 и CD28 запускает передачу сигналов Т-клеточными рецепторами, которые активируют Bcl-xl и ингибируют апоптоз Т-клеток, повышая эффекторную функцию Т-клеток и выживаемость. Третье плечо триспецифического Ab взаимодействует с CD38, который на высоком уровне экспрессируется на клетках множественной миеломы. Удивительно, но CD28 также экспрессируется на клетках большинства миелом; поэтому триспецифическое Ab обеспечивало улучшенное целенаправленное воздействие с одновременным улучшением активации Т-клеток и цитолиза. Оптимизированное триспецифическое антитело обеспечивало лизис клеток миеломы >в 1000 раз более эффективно, чем даратумумаб, терапевтическое mAb к CD38, и продемонстрировало высокую противоопухолевую активность in vivo на модели гуманизированных мышей.

Хотя настоящее изобретение включает различные варианты осуществления, следует понимать, что видоизменения и модификации будут очевидны специалистам в данной области техники. Таким образом, предполагается, что прилагаемая формула изобретения охватывает все такие эквивалентные вариации, которые попадают в пределы объема настоящего изобретения. Кроме того, названия разделов, используемые в данном документе, представлены лишь в целях систематизации, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие описываемый объект настоящего изобретения.

Каждый вариант осуществления, описанный в данном документе, можно объединять с любым другим вариантом осуществления или вариантами осуществления, если четко не указано противоположное. В частности, любой признак или вариант осуществления в качестве предпочтительного или преимущественного может быть объединен с другим признаком или признаками или вариантом осуществления или вариантами осуществления, указанными в качестве предпочтительных или преимущественных, если четко не указано противоположное.

Все источники литературы, цитируемые в настоящей заявке, явным образом включены посредством ссылки в данный документ.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SANOFI

<120> АНТИТЕЛА К CD38 И КОМБИНАЦИИ С АНТИТЕЛАМИ К CD3 И СD28

<130> 18395-20299.41

<140> Пока еще не назначен

<141> Одновременно с этим

<150> US 62/570,655

<151> 2017-10-10

<150> US 62/570,660

<151> 2017-10-11

<150> US 62/676,221

<151> 2018-05-24

<150> EP 18187186.4

<151> 2018-08-03

<160> 132

<170> FastSEQ для Windows версии 4.0

<210> 1

<211> 256

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Внеклеточный домен CD38 (изоформа A)

<400> 1

Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro

1. 5 10 15

Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu

20 25 30

Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro

50 55 60

Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu

65 70 75 80

Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg

85 90 95

Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp

100 105 110

Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe

130 135 140

Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val

145 150 155 160

His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser

165 170 175

Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln

180 185 190

Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp

195 200 205

Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys

210 215 220

Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe

225 230 235 240

Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile

245 250 255

<210> 2

<211> 265

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Внеклеточный домен CD38, содержащий метку his на C-конце

<400> 2

Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro

1. 5 10 15

Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu

20 25 30

Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro

50 55 60

Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu

65 70 75 80

Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg

85 90 95

Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp

100 105 110

Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe

130 135 140

Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val

145 150 155 160

His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser

165 170 175

Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln

180 185 190

Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp

195 200 205

Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys

210 215 220

Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe

225 230 235 240

Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile

245 250 255

Ser Ala Ser His His His His His His

260 265

<210> 3

<211> 485

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Внеклеточный домен CD38, слитый с Fc-доменом человека на C-конце

<400> 3

Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro

1. 5 10 15

Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu

20 25 30

Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro

50 55 60

Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu

65 70 75 80

Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg

85 90 95

Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp

100 105 110

Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe

130 135 140

Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val

145 150 155 160

His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser

165 170 175

Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln

180 185 190

Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp

195 200 205

Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys

210 215 220

Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe

225 230 235 240

Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile

245 250 255

Gly Ala Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

260 265 270

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

275 280 285

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

290 295 300

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

305 310 315 320

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

325 330 335

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

340 345 350

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

355 360 365

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

370 375 380

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

385 390 395 400

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

405 410 415

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

420 425 430

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

435 440 445

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

450 455 460

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

465 470 475 480

Ser Leu Ser Pro Gly

485

<210> 4

<211> 265

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<220>

<223> Внеклеточный домен CD38, содержащий метку his на C-конце

<400> 4

Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg Phe Pro

1. 5 10 15

Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His Pro Glu

20 25 30

Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro

50 55 60

Leu Val Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr Leu Leu

65 70 75 80

Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg

85 90 95

Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp

100 105 110

Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe

130 135 140

Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly Val Val

145 150 155 160

His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser

165 170 175

Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln

180 185 190

Ala Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp

195 200 205

Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys

210 215 220

Arg Asn Ile Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe

225 230 235 240

Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser Gly Ile

245 250 255

Ser Ala Ser His His His His His His

260 265

<210> 5

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность VH mAb1

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность VL mAb1

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1. 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность HC mAb1

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 8

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность LC mAb1

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1. 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 9

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность VH mAb6

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность VL mAb6

<400> 10

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность HC mAb6

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 12

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность LC mAb6

<400> 12

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 13

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность VН1 mAb2

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL1 amino sequence of the mAb2

<400> 14

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Gln Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC1 amino sequence of the mAb2

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 16

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC1 amino sequence of the mAb2

<400> 16

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Gln Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 17

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH3 amino sequence of the mAb3

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность VL3 mAb3, и mAb4, и mAb5

<400> 18

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC3 amino sequence of the mAb3

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 20

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность LC3 mAb3, и mAb4, и mAb5

<400> 20

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 21

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH5 amino sequence of the mAb4

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Ser Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC5 amino sequence of the mAb4

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Ser Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 23

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH6 amino sequence of the mAb5

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC6 amino sequence of the mAb5

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 25

<400> 25

000

<210> 26

<400> 26

000

<210> 27

<400> 27

000

<210> 28

<400> 28

000

<210> 29

<400> 29

000

<210> 30

<211> 256

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<220>

<223> Внеклеточный домен CD38

<400> 30

Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg Phe Pro

1. 5 10 15

Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His Pro Glu

20 25 30

Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro

50 55 60

Leu Val Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr Leu Leu

65 70 75 80

Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg

85 90 95

Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp

100 105 110

Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe

130 135 140

Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly Val Val

145 150 155 160

His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser

165 170 175

Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln

180 185 190

Ala Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp

195 200 205

Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys

210 215 220

Arg Asn Ile Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe

225 230 235 240

Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser Gly Ile

245 250 255

<210> 31

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR-H1 mAb1/mAb3/mAb4/mAb5

<400> 31

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Asn

1. 5

<210> 32

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR-H2 mAb1/mAb3/mAb4/mAb5

<400> 32

Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr

1. 5

<210> 33

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR-H3 mAb1/mAb2/mAb3/mAb4/mAb5

<400> 33

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr

1. 5 10

<210> 34

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR-L1 mAb1/mAb3/mAb4/mAb5

<400> 34

Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Gly Phe

1. 5 10

<210> 35

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR-L2 mAb1/mAb3/mAb4/mAb5

<400> 35

Leu Ala Ser

1

<210> 36

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR-L3 mAb1/mAb2/mAb3/mAb4/mAb5

<400> 36

Gln Gln Asn Lys Glu Asp Pro Trp Thr

1. 5

<210> 37

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb2 CDR-H1

<400> 37

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala

1. 5

<210> 38

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb2 CDR-H2

<400> 38

Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr

1. 5

<210> 39

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb2 CDR-L1

<400> 39

Gln Ser Val Ser Ser Tyr Gly Gln Gly Phe

1. 5 10

<210> 40

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb2 CDR-L2

<400> 40

Gly Ala Ser

1

<210> 41

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb6 CDR-H1

<400> 41

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1. 5

<210> 42

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb6 CDR-H2

<400> 42

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1. 5

<210> 43

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb6 CDR-H3

<400> 43

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr

1. 5 10

<210> 44

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb6 CDR-L1

<400> 44

Gln Gly Ile Arg Asn Asp

1. 5

<210> 45

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb6 CDR-L2

<400> 45

Ala Ala Ser

1

<210> 46

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb6 CDR-L3

<400> 46

Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro Thr

1. 5

<210> 47

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH mAb7

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1. 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 48

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL mAb7

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly

1. 5 10 15

Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 49

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH антитела CD28sup

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL антитела CD28sup

<400> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 51

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH антитела CD28cvn

<400> 51

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1. 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 52

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL антитела CD28cvn

<400> 52

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr

20 25 30

Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 53

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH антитела CD3mid

<400> 53

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 54

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL антитела CD3mid

<400> 54

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1. 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn

20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly

85 90 95

Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 55

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 55

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1. 5 10

<210> 56

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 56

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1. 5 10 15

<210> 57

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 57

Thr Lys Gly Pro Ser

1. 5

<210> 58

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 58

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro

1. 5

<210> 59

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 59

Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly

1. 5 10

<210> 60

<211> 570

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептидная последовательность CD28supxCD3mid IgG4(впадина) FALA тяжелая цепь 1

<400> 60

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser

165 170 175

Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

180 185 190

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr

210 215 220

Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

245 250 255

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

260 265 270

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

275 280 285

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

290 295 300

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

305 310 315 320

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

325 330 335

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

340 345 350

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

355 360 365

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

370 375 380

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

385 390 395 400

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

405 410 415

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

420 425 430

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

435 440 445

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

450 455 460

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

465 470 475 480

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe

485 490 495

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

500 505 510

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

515 520 525

Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

530 535 540

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

545 550 555 560

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

565 570

<210> 61

<211> 338

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептидная последовательность CD28supxCD3mid легкая цепь 1

<400> 61

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1. 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn

20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly

85 90 95

Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

115 120 125

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala

130 135 140

Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

145 150 155 160

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly

165 170 175

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

180 185 190

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

195 200 205

Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

210 215 220

Ile Lys Thr Lys Gly Pro Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

245 250 255

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

260 265 270

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

275 280 285

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

290 295 300

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

305 310 315 320

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

325 330 335

Glu Cys

<210> 62

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептидная последовательность CD38VH1 IgG4(выступ) FALA тяжелая цепь 2

<400> 62

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

<210> 63

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD38VH1 Light2 polypeptide sequence

<400> 63

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Gln Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 64

<211> 573

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептидная последовательность CD28supxCD3mid IgG1(впадина) LALA P329A тяжелая цепь 1

<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser

165 170 175

Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

180 185 190

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr

210 215 220

Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

245 250 255

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

260 265 270

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

275 280 285

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

290 295 300

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

305 310 315 320

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

325 330 335

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

340 345 350

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

355 360 365

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

370 375 380

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

385 390 395 400

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

405 410 415

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

420 425 430

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

435 440 445

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

450 455 460

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

465 470 475 480

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

485 490 495

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

500 505 510

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

515 520 525

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

530 535 540

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

545 550 555 560

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

565 570

<210> 65

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептидная последовательность CD38VH1 IgG1(выступ) LALA P329A тяжелая цепь 2

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 66

<211> 573

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептидная последовательность CD28supxCD3mid IgG1(впадина) NNSA тяжелая цепь 1

<400> 66

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser

165 170 175

Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

180 185 190

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr

210 215 220

Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

245 250 255

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

260 265 270

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

275 280 285

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

290 295 300

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

305 310 315 320

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

325 330 335

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

340 345 350

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

355 360 365

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

370 375 380

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

385 390 395 400

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

405 410 415

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val

420 425 430

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

435 440 445

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

450 455 460

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

465 470 475 480

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

485 490 495

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

500 505 510

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

515 520 525

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

530 535 540

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

545 550 555 560

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

565 570

<210> 67

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептидная последовательность CD38VH1 IgG1(выступ) NNSA тяжелая цепь 2

<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 68

<211> 443

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептидная последовательность CD38hhy1370 IgG4(выступ) FALA P329A тяжелая цепь 2

<400> 68

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 69

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD38hhy1370 Light2 polypeptide sequence

<400> 69

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 70

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептидная последовательность CD38hhy1370 IgG1(выступ) LALA P329A тяжелая цепь 2

<400> 70

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 71

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептидная последовательность CD38hhy1370 IgG1(выступ) NNSA тяжелая цепь 2

<400> 71

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 72

<211> 1710

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная последовательность CD28supxCD3mid IgG4(впадина) FALA тяжелая цепь 1

<400> 72

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120

cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180

gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240

atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300

tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360

agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420

ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480

gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540

acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600

accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660

ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720

tctagtcgga ccgccagcac aaagggccca tcggtgttcc ctctggcccc ttgcagcaga 780

agcaccagcg aatctacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840

gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg 900

ctccagagca gcggcctgta ctctctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagcagcctg 960

ggcaccaaga cctacacctg taacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020

cgggtggaat ctaagtacgg ccctccctgc cctccttgcc cagcccctga agctgccggc 1080

ggaccctccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1140

cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaggaag atcccgaggt gcagttcaat 1200

tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagttc 1260

aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 1320

aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccca gctccatcga gaaaaccatc 1380

agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caagtgtgta ccctgccccc tagccaggaa 1440

gagatgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgccgtga aaggcttcta ccccagcgac 1500

attgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1560

gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg gtgtccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1620

tggcaggaag gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1680

acccagaagt ccctgtctct gtccctgggc 1710

<210> 73

<211> 1014

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная последовательность CD28supxCD3mid легкая цепь 1

<400> 73

gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60

atcagctgca agagcagcca gagcctggtg cacaacaacg ccaacaccta cctgagctgg 120

tatctgcaga agcccggcca gagcccccag tccctgatct acaaggtgtc caacagattc 180

agcggcgtgc ccgacagatt ctccggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240

agccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactattgtg gccagggcac ccagtacccc 300

ttcacctttg gcagcggcac caaggtggaa atcaagggcc agcccaaggc cgcccccgac 360

atccagatga cccagagccc cagcagcctg tctgccagcg tgggcgacag agtgaccatc 420

acctgtcagg ccagccagaa catctacgtg tggctgaact ggtatcagca gaagcccggc 480

aaggccccca agctgctgat ctacaaggcc agcaacctgc acaccggcgt gcccagcaga 540

ttttctggca gcggctccgg caccgacttc accctgacaa tcagctccct gcagcccgag 600

gacattgcca cctactactg ccagcagggc cagacctacc cctacacctt tggccagggc 660

accaagctgg aaatcaagac caagggcccc agccgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 720

atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt gtgcctgctg 780

aacaacttct acccccgcga ggccaaagtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 840

ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 900

agcaccctga cactgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 960

acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgt 1014

<210> 74

<211> 1338

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная последовательность CD38VH1 IgG4(выступ) FALA тяжелая цепь 2

<400> 74

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120

cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180

aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300

ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360

gctagcacaa agggcccatc ggtgttccct ctggcccctt gcagcagaag caccagcgaa 420

tctacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct ccagagcagc 540

ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gcagcctggg caccaagacc 600

tacacctgta acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660

aagtacggcc ctccctgccc tccttgccca gcccctgaag ctgccggcgg accctccgtg 720

ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780

tgcgtggtgg tggatgtgtc ccaggaagat cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 840

ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa cagcacctac 900

cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960

tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc tccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020

ggccagcccc gcgagcctca agtgtatacc ctgccccctt gccaggaaga gatgaccaag 1080

aaccaggtgt ccctgtggtg tctcgtgaaa ggcttctacc ccagcgacat tgccgtggaa 1140

tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200

gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 1260

aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320

ctgtctctgt ccctgggc 1338

<210> 75

<211> 654

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD38VH1 Light2 polynucleotide sequence

<400> 75

gacatcgtgc tgacacagag ccctgccacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60

atcagctgta gagccagcca gagcgtgtcc agctacggcc agggcttcat gcactggtat 120

cagcagaagc ccggccagcc ccccagactg ctgatctatg gcgccagcag cagagccaca 180

ggcatccccg ccagattttc tggctctggc agcggcaccg acttcaccct gacaatcagc 240

cccctggaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agaacaaaga ggacccctgg 300

accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 360

atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt gtgcctgctg 420

aacaacttct acccccgcga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 480

ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540

agcaccctga ccctgtccaa ggccgattac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 600

acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654

<210> 76

<211> 1719

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная последовательность CD28supxCD3mid IgG1(впадина) LALA P329A тяжелая цепь 1

<400> 76

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120

cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180

gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240

atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300

tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360

agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420

ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480

gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540

acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600

accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660

ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720

tctagtcgga ccgccagcac aaagggcccc agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag 780

agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840

gtgaccgtgt cctggaattc tggcgccctg accagcggcg tgcacacctt tccagctgtg 900

ctgcagtcca gcggcctgta cagcctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagctctctg 960

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020

aaggtggaac ccaagagctg cgacaagacc cacacctgtc ccccttgtcc tgcccccgaa 1080

gccgccggag gcccttccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1140

agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1200

aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gccaagagag 1260

gaacagtaca acagcaccta ccgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1320

ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctggccgc ccccatcgag 1380

aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc cgcgaacccc aggtgtgcac actgccccca 1440

agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgagct gtgccgtgaa aggcttctac 1500

ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1560

accccccctg tgctggacag cgacggctca ttcttcctgg tgtccaagct gacagtggac 1620

aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1680

aaccactaca cccagaagtc cctgagcctg agccccggc 1719

<210> 77

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная последовательность CD38VH1 IgG1(выступ) LALA P329A тяжелая цепь 2

<400> 77

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120

cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180

aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300

ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360

gctagcacaa agggccccag cgtgttccct ctggccccta gcagcaagag cacatctggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaattctg gcgccctgac cagcggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcagtccagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccccgaagc cgccggaggc 720

ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc caagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctggccgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgaaccccag gtgtacacac tgcccccatg cagggacgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgtggtgt ctggtgaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtcccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 78

<211> 1719

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная последовательность CD28supxCD3mid IgG1(впадина) NNSA тяжелая цепь 1

<400> 78

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120

cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180

gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240

atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300

tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360

agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420

ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480

gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540

acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600

accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660

ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720

tctagtcgga ccgccagcac aaagggcccc agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag 780

agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840

gtgaccgtgt cctggaattc tggcgccctg accagcggcg tgcacacctt tccagctgtg 900

ctgcagtcca gcggcctgta cagcctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagctctctg 960

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020

aaggtggaac ccaagagctg cgacaagacc cacacctgtc ccccttgtcc tgcccccgaa 1080

ctgctgggag gcccttccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1140

agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1200

aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gccaagagag 1260

gaacagtaca acaatgcctc ccgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1320

ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgcctgc ccccatcgag 1380

aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc cgcgaacccc aggtgtgcac actgccccca 1440

agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgagct gtgccgtgaa aggcttctac 1500

ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1560

accccccctg tgctggacag cgacggctca ttcttcctgg tgtccaagct gacagtggac 1620

aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1680

aaccactaca cccagaagtc cctgagcctg agccccggc 1719

<210> 79

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная последовательность CD38VH1 IgG1(выступ) NNSA тяжелая цепь 2

<400> 79

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120

cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180

aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300

ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360

gctagcacaa agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tatgttgacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

aatgcctccc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1080

ctgaccaaga atcaagtcag cctgtggtgc ctggtaaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac tcaaaactca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1347

<210> 80

<211> 1329

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная последовательность CD38hhy1370 IgG4(выступ) FALA P329A тяжелая цепь 2

<400> 80

caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120

cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300

agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360

aagggcccat cggtgttccc tctggcccct tgcagcagaa gcaccagcga atctacagcc 420

gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaactct 480

ggcgctctga caagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tccagagcag cggcctgtac 540

tctctgagca gcgtcgtgac agtgcccagc agcagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 600

aacgtggacc acaagcccag caacaccaag gtggacaagc gggtggaatc taagtacggc 660

cctccctgcc ctccttgccc agcccctgaa gctgccggcg gaccctccgt gttcctgttc 720

cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg 780

gtggatgtgt cccaggaaga tcccgaggtg cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 840

gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag gaacagttca acagcaccta ccgggtggtg 900

tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg 960

tccaacaagg gcctgcccag ctccatcgag aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc 1020

cgcgagcctc aagtgtatac cctgccccct tgccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg 1080

tccctgtggt gtctcgtgaa aggcttctac cccagcgaca ttgccgtgga atgggagagc 1140

aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccctg tgctggacag cgacggctca 1200

ttcttcctgt actccaagct gaccgtggac aagagccggt ggcaggaagg caacgtgttc 1260

agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtctctg 1320

tccctgggc 1329

<210> 81

<211> 642

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD38hhy1370 Light2 polynucleotide sequence

<400> 81

gccatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca gggcatccgg aacgacctgg gctggtatca gcagaagcct 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gctagctctc tgcagtccgg cgtgcccagc 180

agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatctctgg cctgcagccc 240

gaggacagcg ccacctacta ctgtctgcaa gactacatct actaccccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttcccacct 360

agcgacgagc agctgaagtc cggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420

ccccgcgagg ccaaagtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480

gaaagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgaca 540

ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600

ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gt 642

<210> 82

<211> 1338

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная последовательность CD38hhy1370 IgG1(выступ) LALA P329A тяжелая цепь 2

<400> 82

caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120

cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300

agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360

aagggcccca gcgtgttccc tctggcccct agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420

gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaattct 480

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagctgtgc tgcagtccag cggcctgtac 540

agcctgagca gcgtcgtgac agtgcccagc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc 600

aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660

gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccccgaag ccgccggagg cccttccgtg 720

ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780

tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 840

ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag ccaagagagg aacagtacaa cagcacctac 900

cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960

tgcaaggtgt ccaacaaggc cctggccgcc cccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020

ggccagcccc gcgaacccca ggtgtacaca ctgcccccat gcagggacga gctgaccaag 1080

aaccaggtgt ccctgtggtg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 1140

tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200

gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc 1260

aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320

ctgagcctga gccccggc 1338

<210> 83

<211> 1338

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная последовательность CD38hhy1370 IgG1(выступ) NNSA тяжелая цепь 2

<400> 83

caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120

cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300

agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360

aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600

aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtatgttgac 840

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa caatgcctcc 900

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 1080

aatcaagtca gcctgtggtg cctggtaaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200

gacggctcct tcttcctcta ctcaaaactc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320

ctctccctgt ctccgggt 1338

<210> 84

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH антитела CD3low

<400> 84

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 85

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL антитела CD3low

<400> 85

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1. 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly

85 90 95

Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 86

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW1 VH mAb2/mAb3

<400> 86

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 87

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW1 VH mAb4

<400> 87

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Ser Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 88

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW1 VH mAb5

<400> 88

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 89

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW1 VH mAb6

<400> 89

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 90

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW2 VH mAb2/mAb3/mAb5

<400> 90

Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly

1. 5 10 15

Tyr

<210> 91

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW2 VH mAb4

<400> 91

Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1. 5 10 15

Tyr

<210> 92

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW2 VH mAb6

<400> 92

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1. 5 10 15

Val

<210> 93

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW3 VH mAb2/mAb3

<400> 93

Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr

1. 5 10 15

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Phe Cys

35

<210> 94

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW3 VH mAb4/mAb5

<400> 94

Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr

1. 5 10 15

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Phe Cys

35

<210> 95

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW3 VH mAb6

<400> 95

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn

1. 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 96

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW4 VH mAb2/mAb3/mAb4/mAb5/mAb6

<400> 96

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1. 5 10

<210> 97

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW1 VL mAb2/mAb3/mAb4/mAb5

<400> 97

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 98

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW1 VL mAb6

<400> 98

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 99

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW2 VL mAb2/mAb3/mAb4/mAb5

<400> 99

Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile

1. 5 10 15

Tyr

<210> 100

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW2 VL mAb6

<400> 100

Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1. 5 10 15

<210> 101

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW3 VL mAb2/mAb3/mAb4/mAb5

<400> 101

Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1. 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 102

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW3 VL mAb6

<400> 102

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1. 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 103

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW4 VL mAb2/mAb3/mAb4/mAb5

<400> 103

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1. 5 10

<210> 104

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FW4 VL mAb6

<400> 104

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1. 5 10

<210> 105

<211> 159

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность CD38 изоформы E

<400> 105

Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro

1. 5 10 15

Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu

20 25 30

Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro

50 55 60

Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu

65 70 75 80

Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg

85 90 95

Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp

100 105 110

Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe

130 135 140

Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg His Phe Trp Glu Cys Gly Ser Pro

145 150 155

<210> 106

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь mAb7

<400> 106

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly

1. 5 10 15

Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 107

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь mAb7

<400> 107

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1. 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 108

<211> 445

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сравнительная тяжелая цепь 1 (связывает CD38)

<400> 108

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Pro Gln Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Thr Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Asn Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asp Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Glu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Asp Val Ser

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asp Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Glu

405 410 415

Gln Gly Asp Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 109

<211> 485

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сравнительная тяжелая цепь 2 (связывает CD3)

<400> 109

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Pro

115 120 125

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly

130 135 140

Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly

145 150 155 160

Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr

165 170 175

Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg

180 185 190

Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg

195 200 205

Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly

210 215 220

Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser

225 230 235 240

Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Pro

245 250 255

Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

260 265 270

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

275 280 285

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

290 295 300

Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

305 310 315 320

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

325 330 335

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

340 345 350

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

355 360 365

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

370 375 380

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Gln Met Thr Lys Asn Gln

385 390 395 400

Val Lys Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

405 410 415

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

420 425 430

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

435 440 445

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

450 455 460

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

465 470 475 480

Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210> 110

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сравнительная легкая цепь (связывает CD38)

<400> 110

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Trp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 111

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 111

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

1. 5 10

<210> 112

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 112

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

1. 5 10

<210> 113

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 113

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

1. 5 10

<210> 114

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 114

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

1. 5 10

<210> 115

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 115

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Val Ala Gly Pro Ser

1. 5 10

<210> 116

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 116

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

1. 5 10

<210> 117

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 117

tacctgttac ttgaattgaa 20

<210> 118

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 118

attttttgag gtcttccaat 20

<210> 119

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 119

attgtcgtac gctacaagca 20

<210> 120

<211> 20

<212> ДНК