СПОСОБЫ КОМБИНИРОВАННОГО ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ СРЕДСТВА, БЛОКИРУЮЩИЕ CTLA-4 И PD-1 Российский патент 2025 года по МПК A61K39/395 C07K16/28 A61P35/00 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

(1) Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам комбинированного лечения злокачественных новообразований, включающим CTLA-4-блокирующее средство и PD-1-блокирующее средство. В частности, настоящее изобретение относится к способам комбинированного лечения, где CTLA-4-блокирующее средство является антителом против CTLA-4 со сниженной или отсутствующей измеримой эффекторной функцией или фрагментом антитела против CTLA-4, в котором отсутствует Fc-домен, и PD-1-блокирующее средство является антителом против PD-1, фрагментом антитела против PD-1, антителом против PD-L1 или фрагментом антитела против PD-L1.

(2) Описание связанной области

Иммунотерапия опухолей играет все более важную роль в лечении различных онкологических заболеваний. Клинический успех использования блокады антителами иммунных контрольных точек, включающих ингибиторные рецепторы, экспрессирующиеся на T-клетках, такие как антиген-4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA-4) и рецептор программируемой гибели-1 (PD-1), стимулировал заметное развитие иммунотерапии злокачественных новообразований. Монотерапевтическая блокада CTLA-4 или PD-1 моноклональными антителами (mAb) приводила к повышенным противоопухолевым ответам и благоприятным клиническим исходам в контролируемых рандомизированных клинических испытаниях.

Характерной особенностью блокады иммунных контрольных точек при лечении различных злокачественных новообразований является клинически валидированный благоприятный эффект способов комбинированного лечения, включающих антитела против PD-1 и против CTLA-4. С появлением все большего количества клинических данных становится очевидным, что способы комбинированного лечения с использованием средств против PD-1/CTLA-4 могут обеспечивать превосходную клиническую эффективность по сравнению с таргетингом любого пути контрольных точек в отдельности. Однако иммуноопосредованная токсичность (irAE), ассоциированная с антителами против CTLA-4, является значимой и в условиях монотерапии, и в способах комбинированного лечения с антителами против PD-1. Например, антитело против CTLA-4 ипилимумаб, продаваемое Bristol-Myers Squibb под торговым названием YERVOY и являющееся единственным антителом против CTLA-4, одобренным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США, имеет особое предупреждение в черной рамке из-за вероятности индуцированиф тяжелых и фатальных иммуноопосредованных нежелательных явлений, таких как воспаление кишечника, печени, кожи, эндокринных желез и/или глаз. Ипилимумаб также одобрен для способов комбинированного лечения с использованием антитела против PD-1 ниволумаба (продаваемого Bristol-Myers Squibb под торговым названием OPDIVO) для почечноклеточных карцином на поздних стадиях и некоторых типов колоректального рака, но из-за риска значительных irAE, ипилимумаб вводят в низкой или субтерапевтической дозе 1 мг/кг. Субтерапевтическая доза для комбинированного лечения составляет гораздо меньше чем 3 мг/кг монотерапевтической дозы для нерезектабельной или метастатической меланомы или 10 мг/кг монотерапевтической дозы для адъювантной меланомы (см. вкладыш в упаковку и ярлык к YERVOY (июль 2018 года)).

Оба одобренных FDA mAb против PD1, ниволумаб и пембролизумаб, являются гуманизированными антителами против PD1 IgG4 каппа, описанными в патенте США №8008449 и патенте США №8354509, соответственно. Общеизвестно, что Fc-домен изотипа IgG4 имеет низкую детектируемую эффекторную функцию.

Ипилимумаб является антителом человека против CTLA-4 IgG1 каппа, описанным в патенте США №6984720. Константный домен тяжелой цепи (HC) изотипа IgG1 имеет Fc-домен, как известно, имеющий высокую аффинность к Fc-рецепторам (FcR), что придает антителу значительную эффекторную функцию (например, индуцированную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) и/или комплементзависимую цитотоксичность (CDC)). Исследования показали, что эффекторная функция Fc необходима для эффективности антител против CTLA-4. Например, в Ingram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115: 3912-3917 (2018) на модели на мышах показано, что фрагмент антитела альпаки только из тяжелой цепи (VHH) против CTLA-4, в котором отсутствует Fc-домен тяжелой цепи и его сопутствующая эффекторная функция не имели противоопухолевой эффективности; однако, противоопухолевую эффективность молекулы можно восстановить посредством ее слияния с Fc-доменом тяжелой цепи IgG2 мыши, демонстрирующим эффекторную функцию; и в Selby et al., Cancer Immunol. Res. 1: 32-42 (2013) на модели на мышах показано, что антитела против CTLA-4, слитые или связанные с Fc-доменом, подвергнутым мутагенезу для устранения эффекторной функции, не демонстрировали какую-либо противоопухолевую активность. Также см. Simpson et al., J. Exp. Med.; 210: 1695-710 (2013) и международную патентную заявку № WO 2014089113.

Тремелизумаб является антителом IgG2 человека против CTLA-4 человека, описанным в патенте США №8491895. Изотип IgG2 человека выбран для минимизации потенциальной активности эффекторной функции и, таким образом, потенциального снижения irAE. Однако, как показано в Vargas et al., Cancer cells 33: 649-663 (2018), тремелизумаб сохраняет эффекторную функцию; и Bertrand et al., BMC Med. 13: 211-214 (2015) показали, что, хотя тремелизумаб можно вводить в дозе, превышающей дозу ипилимумаба, он все равно может индуцировать irAE, в частности, воспалительную иммуноопосредованную токсичность в кишечнике и коже. Также см. Ribas et al., The Oncologist 12: 873-993 (2007), Schneider-Merck et al., J. Immunol. 184: 512-520 (2010) и et al., PLoS One. 10: e0145633(2015), где показаны другие антитела IgG2 человека, индуцирующие ADCC и ADCP in vitro схожей величины с изоформой IgG1 человека.

Другие попытки снизить irAE ипилимумаба включают BMS-986249, протело, состоящее из ипилимумаба, связанного с запатентованным маскирующим пептидом, охватывающим активный антигенсвязывающий участок антитела через расщепляемый протеазой линкер. Маскирующий пептид может снижать irAE посредством минимизации способности ипилимумаба связываться с CTLA-4 в нормальных тканях (см. международные патентные заявки №№ WO 2009025846, WO 2010081173, WO 2018222949, WO 2018085555, Pai et al., J. Clin. Invest. 129: 349-363 (2019) и Korman et al., Abstract SY09-01, AACR Annual Meeting Vol. 77, issue 13 (2017)).

В свете исследований, в которых предполагают, что терапевтическая эффективность антител против CTLA-4, подобных ипилимумаб, может включать истощение регуляторных T-клеток (T_reg-клеток, предполагают, что антитела против CTLA-4, такие как ипилимумаб, имеющие повышенную активность ADCC, будут обеспечивать более эффективную противоопухолевую активность, чем существующие антитела. В патенте США №10196445 описано несколько вариантов ипилимумаба с повышенной активностью ADCC.

Стандарт лечения для некоторых способов противоопухолевой терапии включает введение антитела против PD-1 в комбинации с химиотерапией. Противоопухолевая активность антитела против CTLA-4 может дополнительно повышать эффективность этих способов терапии; однако, т.к. желудочно-кишечная токсичность является одним из наиболее распространенных побочных эффектов, наблюдаемых во время химиотерапии, добавление антитела против CTLA-4 к терапии, вместо этого, может усиливать желудочно-кишечную токсичность.

Очевидно, что антитела против CTLA-4, делающие возможным введение на более высоких, более оптимальных уровнях без ассоциированных irAE, в частности, воспалительной иммуноопосредованной токсичности в отношении кожи и кишечника, ассоциированной с существующими антителами против CTLA-4, вероятно, сделают возможной более эффективную терапию в комбинации с антагонистами PD-1 и, необязательно, химиотерапевтическими средствами.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, хотя некоторые CTLA-4-блокирующие средства, связывающиеся с CTLA-4, имеют сниженную или отсутствующую измеримую противоопухолевую активность при введении в виде монотерапии, они могут демонстрировать клинически значимую противоопухолевую активность при использовании в способах комбинированного лечения с PD-1-блокирующим средством. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что эти некоторые CTLA-4-блокирующие средства могут иметь противоопухолевую активность при комбинированном лечении с блокадой CTLA-4/PD-1 без индуцирования иммуноопосредованных нежелательных явлений (irAE), включая irAE в коже и кишечнике, ассоциированные с одобренными в настоящее время способами комбинированного лечения с блокадой CTLA-4/PD-1. Комбинации с блокадой CTLA-4/PD-1, представленные в настоящем описании, делают возможными способы терапии с повышенным терапевтическим индексом относительно существующих способов комбинированного лечения с блокадой CTLA-4/PD-1, включая способы комбинированного лечения, включающие химиотерапию, что может приводить к более эффективному лечению злокачественных новообразований с улучшенными исходами для пациентов.

Некоторые CTLA-4-блокирующие средства, используемые как часть комбинированного лечения с блокадой CTLA-4/PD-1 по настоящему изобретению, можно выбирать из группы, состоящей из (i) эффекторно-молчащего антитела против CTLA-4 и (ii) эффекторно-молчащего фрагмента антитела против CTLA-4, в котором отсутствует домен кристаллизуемого фрагмента (Fc), или которое имеет Fc-домен, содержащий делеции этих областей в Fc-домене, связывающимся с Fc рецепторами (FcR). Эффекторно-молчащее антитело или фрагмент антитела демонстрирует (i) отсутствие измеримого связывания с одним или более FcR, что можно измерять с помощью анализа Biacore, где константа ассоциации в микромолярном диапазоне указывает на отсутствие измеримого связывания, или (ii) измеримое связывание с одним или более FcR, что можно измерять с помощью анализа Biacore, сниженное по сравнению со связыванием, являющимся типичным для антитела того же изотипа. Эти некоторые CTLA-4-блокирующие средства являются эффекторно-молчащими CTLA-4-блокирующими средствами.

В конкретных вариантах осуществления эти эффекторно-молчащие антитела против CTLA-4 и эффекторно-молчащие фрагменты антител против CTLA-4 могут не демонстрировать измеримую противоопухолевую активность при противоопухолевой монотерапии, но будут демонстрировать измеримую противоопухолевую активность в комбинированной противоопухолевой терапии с использованием PD-1- или PD-L1-блокирующего средства, не демонстрируя irAE, как правило, ассоциированные со способами комбинированного лечения с блокадой CTLA-4/PD-1, в частности, воспалительную иммуноопосредованную токсичность в отношении кожи или кишечника.

Эффекторно-молчащие антитела против CTLA-4 или эффекторно-молчащие фрагменты антител против CTLA-4, представленные в настоящем описании, можно использовать в более высоких дозах и в течение более длительных периодов времени в комбинации с PD-1- или PD-L1-блокирующими средствами без irAE, как правило, ассоциированных со способами комбинированного лечения с блокадой CTLA-4/PD-1, в частности, воспалительной иммуноопосредованной токсичности в отношении кожи или кишечника. В настоящее время доза антитела против CTLA-4 ипилимумаба, одобренного для использования в способах комбинированного лечения с блокадой CTLA-4/PD-1, составляет 1 мг/кг по сравнению с дозой 3 мг/кг или 10 мг/кг, одобренной для использования в монотерапии (см. вкладыш в упаковку и ярлык для YERVOY (июль 2018 года)), или фиксированной дозой 100 мг или менее, предусмотренной для способов комбинированного лечения с блокадой CTLA-4/PD-1 в международной патентной заявке № WO 2018183408. Таким образом, в способах комбинированного лечения с блокадой CTLA-4/PD-1 по настоящему изобретению можно использовать эффекторно-молчащие антитела против CTLA-4 или эффекторно-молчащие фрагменты антител против CTLA-4 в дозах, таких же или более высоких, чем дозы, одобренные в настоящее время для антител против CTLA-4 в монотерапии. Эффекторно-молчащие антитела против CTLA-4 или фрагменты антител против CTLA-4, представленные в настоящем описании, также можно использовать в комбинации с антителами против PD-1 или против PD-L1 в дозах, схожих с используемыми в настоящее время или предусмотренными для способов комбинированного лечения с блокадой CTLA-4/PD-1, но в течение более длительного периода времени, чем для антител против CTLA-4, и без irAE, как правило, ассоциированных со способами комбинированного лечения с блокадой CTLA-4/PD-1, в частности, воспалительной иммуноопосредованной токсичности в отношении кожи или кишечника.

Таким образом, настоящее изобретение относится к комбинированному лечению для лечения злокачественного новообразования у индивидуума, нуждающегося в таком лечении, способу, включающему введение индивидууму со злокачественным новообразованием (i) терапевтической дозы PD-1- или PD-L1-блокирующего средства и (ii) терапевтической дозы эффекторно-молчащего CTLA-4-блокирующего средства для лечения злокачественного новообразования, где эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство демонстрирует противоопухолевую активность при комбинированном лечении, которую оно не демонстрирует при введении индивидууму в виде монотерапии без PD-1- или PD-L1-блокирующего средства. В дополнительных вариантах осуществления комбинированное лечение не индуцирует или имеет сниженный риск индуцирования иммуноопосредованных нежелательных явлений (irAE) в кишечнике или коже в течение курса комбинированного лечения, имеющих степень более 2, что определяют по Общим терминологическим критериям нежелательных явлений (CTCAE) версии 5.0, по сравнению со способами комбинированного лечения, включающими антитело против CTLA-4, демонстрирующее эффекторную функцию. В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство, используемое как часть комбинированного лечения, не индуцирует irAE в коже или кишечнике, превышающие степень 2, в течение по меньшей мере первых 10 недель комбинированного лечения. В конкретных вариантах осуществления комбинированное лечение не приводит к детектируемым irAE в течение по меньшей мере первых четырех недель комбинированного лечения или irAE степени более 1 в течение по меньшей мере первых четырех недель комбинированного лечения.

В одном из вариантов осуществления эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство, используемое как часть комбинированного лечения, представленного в настоящем описании, является эффекторно-молчащим антителом против CTLA-4 или эффекторно-молчащим фрагментом антитела против CTLA-4.

В другом варианте осуществления PD-1-блокирующее средство, используемое как часть комбинированного лечения, представленного в настоящем описании, является антителом против PD-1 или против PD-L1 или фрагментом антитела против PD-1 или против PD-L1. В конкретных вариантах осуществления антитело против PD-1 или против PD-L1 содержит домен HC, содержащий одну или более мутаций в Fc-домене, делающих антитело эффекторно-молчащим. PD-1-блокирующее средство также может являться фрагментом антитела против PD-1 или против PD-L1, в каждом из которых отсутствует Fc-домен или области Fc-домена, связывающиеся с одним или более FcR, что делает фрагмент антитела эффекторно-молчащим.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам комбинированного лечения злокачественных новообразований, включающим введение индивидууму, нуждающемуся в терапии злокачественных новообразований, (i) первого состава, содержащего PD-1-блокирующее средство, выбранное из группы, состоящей из антитела против PD-1, имеющего Fc-домен IgG4 или IgG2, эффекторно-молчащего антитела против PD-1 и эффекторно-молчащего фрагмента антитела против PD-1; и (ii) второго состава, содержащего эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство, выбранное из группы, состоящей из эффекторно-молчащего антитела против CTLA-4 и эффекторно-молчащего фрагмента антитела против CTLA-4.

Настоящее изобретение дополнительно относится к противоопухолевому комбинированному лечению, включающему введение индивидууму, нуждающемуся в терапии злокачественных новообразований, состава, включающего (i) PD-1-блокирующее средство, выбранное из группы, состоящей из антитела против PD-1, имеющего Fc-домен IgG4 или IgG2, эффекторно-молчащего антитела против PD-1 и эффекторно-молчащего фрагмента антитела против PD-1; и (ii) эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство, выбранное из группы, состоящей из эффекторно-молчащего антитела против CTLA-4 и эффекторно-молчащего фрагмента антитела против CTLA-4.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам комбинированного лечения злокачественных новообразований, включающим введение индивидууму, нуждающемуся в терапии злокачественных новообразований, (i) первого состава, содержащего PD-L1-блокирующее средство, выбранное из группы, состоящей из антитела против PD-L1, имеющего Fc-домен IgG4 или IgG2, эффекторно-молчащего антитела против PD-L1 и эффекторно-молчащего фрагмента антитела против PD-L1; и (ii) второго состава, содержащего эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство, выбранное из группы, состоящей из эффекторно-молчащего антитела против CTLA-4 и эффекторно-молчащего фрагмента антитела против CTLA-4.

Настоящее изобретение дополнительно относится к противоопухолевому комбинированному лечению, включающему введение индивидууму, нуждающемуся в терапии злокачественных новообразований, состава, содержащего (i) PD-L1-блокирующее средство, выбранное из группы, состоящей из антитела против PD-L1 имеющего Fc-домен IgG4 или IgG2, эффекторно-молчащего антитела против PD-L1 и эффекторно-молчащего фрагмента антитела против PD-L1; и (ii) эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство, выбранное из группы, состоящей из эффекторно-молчащего антитела против CTLA-4 и эффекторно-молчащего фрагмента антитела против CTLA-4.

В более конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения эффекторно-молчащие антитело против CTLA-4 содержит Fc-домен IgG1, содержащий (i) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (ii) мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N297A, L234A/L235A/D265A, L234A/L235A/P329G, L235E, D265A, E233A/L235A, S267E/L328F, S2339D/A330L/I332E, L235G/G236R, N297A/D356E/L358M, L234F/L235E/P331S/D365E/L358M и D265A/N297G, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (iii) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, и мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из L234A/L235A/D265A, L234A/L235A/P329G, L235E, D265A, E233A/L235A, S267E/L328F, S2339D/A330L/I332E, L235G/G236R, D356E/L358M, L234F/L235E/P331S/D365E/L358M и D265A, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот в (i), (ii) и (iii) определяют в соответствии с нумерацией Eu.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения эффекторно-молчащие антитело против CTLA-4 содержит Fc-домен IgG2, содержащий (i) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (ii) мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N297A/D265S, D265A, P329G/D265A/N297G или V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (iii) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, и мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N297A/D265S, D265A, P329G/D265A/N297G или V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот в (i), (ii) и (iii) определяют в соответствии с нумерацией Eu.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит Fc-домен IgG4, содержащий замену аминокислоты S228P и дополнительно содержащий (i) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (ii) мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N267A, P329G и D265A/N297A, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (iii) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, и мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N267A, P329G и D265A/N297A, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот в (i), (ii) и (iii) определяют в соответствии с нумерацией Eu.

В дополнительном варианте осуществления комбинированного лечения эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4, в котором отсутствует Fc-домен, представляет собой или содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), антигенсвязывающий фрагмент (Fab) или димер антигенсвязывающего фрагмента F(ab')₂.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 или эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит три определяющие комплементарность области (CDR) тяжелой цепи (HC) и три CDR легкой цепи (LC) антитела против CTLA-4, выбранного из группы, состоящей из ипилимумаба, тремелимумаба, REGN4659, AGEN1884w, 8D2/8D2 (RE), 8D2/8D2 (RE)-варианта 1, 8D2H1L1, 8D2H1L1-варианта 1, 8D2H2L2, 8D2H2L2-варианта 1, 8D3H3L3, 8D2H2L15, 8D2H2L15-варианта 1, 8D2H2L17 и 8D2H2L17-варианта 1.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 или эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит VH и VL ипилимумаба, VH и VL тремелимумаба, VH и VL REGN4659, VH и VL AGEN1884w, VH и VL 8D2/8D2 (RE), VH и VL 8D2/8D2 (RE)-варианта 1, VH и VL 8D2H1L1, VH и VL 8D2H1L1-варианта 1, VH и VL 8D2H2L2, VH и VL 8D2H2L2-варианта 1, VH и VL 8D3H3L3, VH и VL 8D2H2L15, VH и VL 8D2H2L15-варианта 1, VH и VL 8D2H2L17 или VH и VL 8D2H2L17-варианта 1.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 или эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит (i) VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, и VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8; (ii) VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15, и VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16; (iii) VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 95, и VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 96; или (iv) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 97, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 98.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA4 или эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит (i) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 73, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 74; (ii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 75, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 76; (iii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 77, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 78; (iv) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 79, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 80; (v) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 81, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 82; (vi) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 83, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 84; (vii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 85, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 86; (viii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 87, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 88; (ix) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 89, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 90; (x) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 91, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 92; или (xi) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 93, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 94.

В дополнительных вариантах осуществления комбинированного лечения эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство является эффекторно-молчащим антителом против CTLA-4, выбранным из эффекторно-молчащих антител против CTLA-4, приведенных в таблицах 4-18.

В дополнительном варианте осуществления комбинированного лечения эффекторно-молчащее CTLA-4-связывающее средство является эффекторно-молчащим фрагментом антитела против CTLA-4, содержащим один или более отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов (ISVD), где каждый ISVD содержит вариабельный домен (VHH) антитела Верблюжьих, содержащего только тяжелую цепь; при условии, что ни один из ISVD не содержит VHH, содержащий CDR1, содержащую аминокислотную последовательность FYGMG (SEQ ID NO: 69), CDR2, содержащую аминокислотную последовательность DIRTSAGRTTYADSVKG (SEQ ID NO: 70), и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность EMSGISGWDY (SEQ ID NO: 71) или EPSGISGWDY (SEQ ID NO: 72), эти ISVD описаны в международных патентных заявках №№ WO 2008071447, WO 2017087587 и WO 2017087588, или VHH, содержащий 1, 2 или 3 мутации в CDR3, как описано в WO 2008071447, за исключением ISVD, содержащих указанные CDR в вариантах осуществления, где это условие не исключает один или более ISVD, слитых или связанных с эффекторно-молчащим гетерологичным доменом HC или Fc-доменом, включая, например, любой из доменов HC или Fc-доменов эффекторно-молчащего антитела, представленных в настоящем описании.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения антитело против PD-1 или фрагмент антитела против PD-1 содержит три определяющие комплементарность области (CDR) тяжелой цепи и три CDR легкой цепи пембролизумаба, ниволумаба или цемиплимаба-rwlc. В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения антитело против PD-1 содержит (i) VH и VL пембролизумаба; (ii) VH и VL ниволумаба; или (iii) VH и VL цемиплимаба-rwlc.

В дополнительных вариантах осуществления антитело против PD-1 или фрагмент антитела против PD-1 содержит (i) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30; (ii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24; или (iii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 99, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 100. В дополнительном варианте осуществления антитело против PD1 содержит (i) HC, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27, и LC, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 28; (ii) HC, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, и LC, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26; или (iii) HC, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 101, и LC, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 102.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения антитело против PD-L1 или фрагмент антитела против PD-L1 содержит (i) домены VH и VL атезолизумаба; (ii) домены VH и VL авелумаба; или (iii) домены VH и VL дурвалумаба.

В дополнительных вариантах осуществления антитело против PD-L1 или фрагмент антитела против PD-L1 содержат (i) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 103, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 104; (ii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 105, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 106; или (iii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 107, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 108.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения антитело против PD-1 или против PD-L1 может содержать Fc-домен IgG1, IgG2 или IgG4, как представлено в настоящем описании, который может содержать C-концевой лизин или не содержать C-концевой лизин или C-концевой дипептид глицин-лизин.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения антитело против PD-1 или против PD-L1 содержит (i) Fc-домен IgG2 или IgG4; (ii) Fc-домен IgG1, IgG2 или IgG4, содержащий мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (iii) Fc-домен IgG1, содержащий замены аминокислот N297A, L234A/L235A/D265A, L234A/L235A/P329G, L235E, D265A, E233A/L235A, L235G/G236R, S267E/L328F, S2339D/A330L/I332E или D265A/N297G, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (iv) Fc-домен IgG2, содержащий замены аминокислот N297A/D265S, D265A, P329G/D265A/N297G или V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (v) Fc-домен IgG4, содержащий замену аминокислоты S228P и замену аминокислоты N267A, P329G или D265A/N297A, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот определяют в соответствии с нумерацией Eu.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство является антителом против PD-1, выбранным из антител против PD-1, приведенных в таблицах 19-27, или антителом против PD-L1, выбранным из антител против PD-L1, приведенных в таблицах 28-36.

В дополнительном варианте осуществления комбинированного лечения фрагмент антитела против PD-1 или фрагмент антитела против PD-L1, в каждом из которых отсутствует Fc-домен, является одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), антигенсвязывающим фрагментом (Fab) или димером антигенсвязывающего фрагмента F(ab')₂.

В дополнительном варианте осуществления комбинированного лечения антитело против PD-1 или фрагмент антитела против PD-L1 содержит один или более ISVD, где каждый ISVD содержит VHH антитела Верблюжьих, содержащего только тяжелую цепь.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения CTLA-4-блокирующее средство вводят в дозе, содержащей от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 3 мг/кг CTLA-4-блокирующего средства, или фиксированной дозе CTLA-4-блокирующего средства, независящей от массы тела индивидуума и превышающей приблизительно 100 мг.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения CTLA-4-блокирующее средство вводят в дозе, содержащей от 1 мг/кг до 3 мг/кг CTLA-4-блокирующего средства.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения CTLA-4-блокирующее средство вводят в дозе, содержащей от 3 мг/кг до 10 мг/кг CTLA-4-блокирующего средства.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения CTLA-4-блокирующее средство вводят в дозе, содержащей более приблизительно 10 мг/кг CTLA-4-блокирующего средства.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство вводят в дозе, содержащей приблизительно 2 или 3 мг/кг или более, или фиксированной дозе, независящей от массы тела индивидуума и составляющей приблизительно 200 мг или более.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство вводят в дозе, независящей от массы тела индивидуума, составляющей от 200 мг до 400 мг.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство вводят в дозе, независящей от массы тела индивидуума и составляющей 400 мг.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство вводят индивидууму первым и CTLA-4-блокирующее средство вводят индивидууму вторым или CTLA-4-блокирующее средство вводят индивидууму первым и PD-1-блокирующее средство вводят индивидууму вторым. В конкретном варианте осуществления PD-1-блокирующее средство и CTLA-4-блокирующее средство вводят одновременно.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения индивидууму вводят химиотерапевтическое средство до, одновременно или после комбинированного лечения. В конкретных вариантах осуществления химиотерапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из актиномицина, полностью транс-ретиноевой кислоты, алитретиноина, азацитидина, азатиоприна, бексаротена, блеомицина, бортезомиба, кармофура, карбоплатина, капецитабина, цисплатина, хлорамбуцила, циклофосфамида, цитарабина, дакарбазина, даунорубицина, доцетаксела, доксифлуридина, доксорубицина, эпирубицина, эпотилона, этопозида, фторурацила, гемцитабина, гидроксимочевины, идарубицина, иматиниба, иксабепилона, иринотекана, мехлоретамина, мелфалана, меркаптопурина, метотрексата, митоксантрона, нитрозомочевины, оксалиплатина, паклитаксела, пеметрекседа, ромидепсина, тегафура, темозоломида (перорального дакарбазина), тенипозида, тиогуанина, топотекана, утиделона, валрубицина, вемурафениба, винбластина, винкристина, виндезина, винорелбина и вориностата.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения злокачественное новообразование является меланомой, немелкоклеточным раком легких, раком головы и шеи, уротелиальным раком, раком молочной железы, желудочно-кишечным злокачественным новообразованием, множественной миеломой, печеночно-клеточным раком, неходжкинской лимфомой, раком почки, лимфомой Ходжкина, мезотелиомой, раком яичников, мелкоклеточным раком легких, раком пищевода, раком анального канала, раком желчных протоков, колоректальным раком, раком шейки матки, раком щитовидной железы или раком слюнных желез.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения злокачественное новообразование является раком поджелудочной железы, раком бронхов, раком предстательной железы, раком поджелудочной железы, раком желудка, раком яичников, раком мочевого пузыря, злокачественным новообразованием головного мозга или центральной нервной системы, злокачественным новообразованием периферической нервной системы, раком матки или эндометрия, раком полости рта или глотки, раком печени, раком почки, раком яичка, раком желчных протоков, раком тонкого кишечника или аппендикса, раком надпочечника, остеосаркомой, хондросаркомой или злокачественным новообразованием кроветворных тканей.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения индивидуум является человеком, CTLA-4-блокирующее средство связывается с CTLA-4 человека, PD-1-блокирующее средство связывается с PD-1 человека и PD-L1-блокирующее средство связывается с PD-L1 человека.

Антитела и композиции

Настоящее изобретение дополнительно относится к эффекторно-молчащему антителу против CTLA-4 или эффекторно-молчащему фрагменту антитела против CTLA-4, каждое из которых содержит VH и VL, где VH содержит три CDR тяжелой цепи, и VL содержит три CDR легкой цепи, совместно связывающиеся с CTLA-4. В конкретных вариантах осуществления CTLA-4 является CTLA-4 человека.

В более конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит Fc-домен IgG1, содержащий (i) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот при условии, что эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 не включает ипилимумаб, состоящий исключительно из замены N297A; (ii) мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N297A, L234A/L235A/D265A, L234A/L235A/P329G, L235E, D265A, E233A/L235A, S267E/L328F, S2339D/A330L/I332E, L235G/G236R, N297A/D356E/L358M, L234F/L235E/P331S/D365E/L358M и D265A/N297G, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (iii) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, и мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из L234A/L235A/D265A, L234A/L235A/P329G, L235E, D265A, E233A/L235A, S267E/L328F, S2339D/A330L/I332E, L235G/G236R, D356E/L358M, L234F/L235E/P331S/D365E/L358M и D265A, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот в (i), (ii) и (iii) определяют в соответствии с нумерацией Eu.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит Fc-домен IgG2, содержащий (i) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (ii) мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N297A/D265S, D265A, P329G/D265A/N297G или V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (iii) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, и мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N297A/D265S, D265A, P329G/D265A/N297G или V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот в (i), (ii) и (iii) определяют в соответствии с нумерацией Eu.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит Fc-домен IgG4, содержащий замену аминокислоты S228P и дополнительно содержащий (i) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (ii) мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N267A, P329G и D265A/N297A, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (iii) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, и мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N267A, P329G и D265A/N297A, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот в (i), (ii) и (iii) определяют в соответствии с нумерацией Eu.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 или эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит три определяющие комплементарность области (CDR) тяжелой цепи (HC) и три CDR легкой цепи (LC) антитела против CTLA-4, выбранного из группы, состоящей из ипилимумаба, тремелимумаба, REGN4659, AGEN1884w, 8D2/8D2 (RE), 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D3H3L3, 8D2H2L15 и 8D2H2L17.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 или эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит VH и VL ипилимумаба, VH и VL тремелимумаба, VH и VL REGN4659, VH и VL AGEN1884w, VH и VL 8D2/8D2 (RE), VH и VL 8D2H1L1, VH и VL 8D2H2L2, VH и VL 8D3H3L3, VH и VL 8D2H2L15 или VH и VL 8D2H2L17.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 или эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит VH и VL 8D2/8D2 (RE)-варианта 1, VH и VL 8D2H1L1-варианта 1, VH и VL 8D2H2L2-варианта 1, VH и VL 8D2H2L15-варианта 1 или VH и VL 8D2H2L17-варианта 1. Эти варианты содержат замену изолейцина метионином в положении 18 в аминокислотной последовательности VH.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 или эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит (i) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8; (ii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16; (iii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 95, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 96; или, (iv) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 97, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 98.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA4 или эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит (i) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 73, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 74; (ii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 75, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 76; (iii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 77, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 78; (iv) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 79, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 80; (v) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 81, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 82; (vi) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 83, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 84; (vii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 85, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 86; (viii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 87, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 88; (ix) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 89, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 90; (x) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 91, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 92; или (xi) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 93, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 94.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 выбран из группы, состоящей из F(ab), F(ab')₂, Fv и scFv.

В дополнительном варианте осуществления эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит один или более отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов (ISVD), где каждый ISVD содержит вариабельный домен (VHH) антитела Верблюжьих, содержащего только тяжелую цепь; при условии, что ни один из ISVD не содержит VHH, содержащий CDR1, содержащую аминокислотную последовательность FYGMG (SEQ ID NO: 69), CDR2, содержащую аминокислотную последовательность DIRTSAGRTTYADSVKG (SEQ ID NO: 70), и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность EMSGISGWDY (SEQ ID NO: 71) или EPSGISGWDY (SEQ ID NO: 72), как ISVD, описанные в международной патентной заявке № WO 2008071447, WO 2017087587 и WO 2017087588, или VHH, содержащий 1, 2 или 3 мутации в CDR3, как описано в WO 2008071447, за исключением ISVD, содержащих указанные CDR в вариантах осуществления, где это условие не исключает один или более ISVD, слитых или связанных с эффекторно-молчащим гетерологичным доменом HC или Fc-доменом, включающим, например, любой из доменов HC или Fc-доменов эффекторно-молчащего антитела, представленных в настоящем описании.

Настоящее изобретение дополнительно относится к каждому из эффекторно-молчащих антител против CTLA-4, описанных в таблицах 4-18, при условии, что эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 не включает ипилимумаб, состоящий исключительно из замены N297A.

Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 или эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4, как представлено в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно относится к антителу против PD-1, содержащему

(a) тяжелую цепь (HC), содержащую вариабельный домен HC (VH), и легкую цепь (LC), содержащую вариабельный домен LC (VL), где (i) VH содержит по меньшей мере три определяющие комплементарность области (CDR) HC пембролизумаба, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR пембролизумаба, (ii) VH содержит по меньшей мере три HC-CDR ниволумаба, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR ниволумаба, или (iii) VH содержит по меньшей мере три HC-CDR цемиплимаба-rwlc, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR цемиплимаба-rwlc, и

(b) Fc-домен IgG1, IgG2 или IgG4, содержащий (i) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (ii) Fc-домен IgG1, содержащий замены аминокислот N297A, L234A/L235A/D265A, L234A/L235A/P329G, L235E, D265A, E233A/L235A, N297A/D356E/L358M, L234F/L235E/P331S/D356E/L358M или D265A/N297G, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (iii) Fc-домен IgG2, содержащий замены аминокислот N297A/D265S, D265A, P329G/D265A/N297G или V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (iv) Fc-домен IgG4, содержащий замену аминокислоты S228P и замену аминокислоты N267A, P329G, D265A/N297A, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот определяют в соответствии с нумерацией Eu.

В дополнительных вариантах осуществления указанного выше антитела против PD-1 антитело против PD-1 содержит (i) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30, (ii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24, или (iii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 99, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 100.

В конкретных вариантах осуществления антитела против PD-1 Fc-домен IgG1, IgG2 или IgG4, как представлено в настоящем описании, может дополнительно содержать C-концевой лизин или не содержать C-концевой лизин или C-концевой дипептид глицин-лизин.

Настоящее изобретение дополнительно относится к фрагменту антитела против PD-1, содержащему тяжелую цепь (HC), содержащую вариабельный домен HC (VH), и легкую цепь (LC), содержащую вариабельный домен LC (VL), где (i) VH содержит по меньшей мере три определяющие комплементарность области HC (CDR) пембролизумаба, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR пембролизумаба, (ii) VH содержит по меньшей мере три HC-CDR ниволумаба, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR ниволумаба, или (iii) VH содержит по меньшей мере три HC-CDR цемиплимаба-rwlc, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR цемиплимаба-rwlc.

В дополнительных вариантах осуществления фрагмента антитела против PD-1 фрагмент антитела против PD-1 содержит (i) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30, (ii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24, или (iii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 99, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 100.

В конкретных вариантах осуществления указанных выше фрагментов антител против PD-1 фрагмент антитела против PD-1 выбран из группы, состоящей из F(ab), F(ab')₂, Fv и scFv.

Настоящее изобретение дополнительно относится к каждому из антител против PD-1, приведенных в таблицах 19-27.

Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей антитело против PD-1 или фрагмент антитела против PD-1, представленное в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно относится к антителу против PD-L1, содержащему (a) тяжелую цепь (HC), содержащую вариабельный домен HC (VH), и легкую цепь (LC), содержащую вариабельный домен LC (VL), где (i) VH содержит по меньшей мере три определяющие комплементарность области (CDR) HC дурвалумаба, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR дурвалумаба, (ii) VH содержит по меньшей мере три HC-CDR авелумаба, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR авелумаба, или (iii) VH содержит по меньшей мере три HC-CDR атезолизумаба, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR атезолизумаба, и

(b) Fc-домен IgG1, IgG2 или IgG4, содержащий (i) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (ii) Fc-домен IgG1 содержащий замены аминокислот N297A, L234A/L235A/D265A, L234A/L235A/P329G, L235E, D265A, E233A/L235A, N297A/D356E/L358M, L234F/L235E/P331S/D356E/L358M или D265A/N297G, или мутантный Fc-домен содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (iii) Fc-домен IgG2 содержащий замены аминокислот N297A/D265S, D265A, P329G/D265A/N297G или V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, или мутантный Fc-домен содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (iv) Fc-домен IgG4, содержащий замену аминокислоты S228P и замену аминокислоты N267A, P329G, D265A/N297A, или мутантный Fc-домен содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот определяют в соответствии с нумерацией Eu, при условии, что если VH и VL имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 107 и SEQ ID NO: 108, соответственно, то константный домен тяжелой цепи (HC) не принадлежит изотипу IgG1 с комбинацией замен N297A/D356E/L358M, или, если VH и VL имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 104, соответственно, то константный домен HC не принадлежит изотипу IgG1 с комбинацией замен L234F/L235E/P331S/D356E/L358M.

В дополнительных вариантах осуществления указанного выше антитела против PD-L1 антитело против PD-L1 содержит (i) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 103, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 104, (ii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 105, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 106, или (iii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 107, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 108.

В конкретных вариантах осуществления антитела против PD-L1 Fc-домен IgG1, IgG2 или IgG4, представленный в настоящем описании может дополнительно содержать C-концевой лизин или не содержать C-концевой лизин или C-концевой дипептид глицин-лизин.

Настоящее изобретение дополнительно относится к фрагменту антитела против PD-L1, содержащему тяжелую цепь (HC), содержащую вариабельный домен HC (VH), и легкую цепь (LC), содержащую вариабельный домен LC (VL), где (i) VH содержит по меньшей мере три определяющие комплементарность области (CDR) HC дурвалумаба, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR дурвалумаба, (ii) VH содержит по меньшей мере три HC-CDR авелумаба, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR авелумаба, или (iii) VH содержит по меньшей мере три HC-CDR атезолизумаба, и VL содержит по меньшей мере три LC-CDR атезолизумаба.

В дополнительных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-L1 содержит (i) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 103, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 104, (ii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 105, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 106, или (iii) VH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 107, и VL, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 108.

В конкретных вариантах осуществления указанных выше фрагментов антител против PD-L1 фрагмент антитела против PD-1 выбран из группы, состоящей из F(ab), F(ab')₂, Fv и scFv.

Настоящее изобретение дополнительно относится к каждому из антител против PD-L1, приведенных в таблицах 28-36, при условии, что, если VH и VL имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 107 и SEQ ID NO: 108, соответственно, то константный домен тяжелой цепи (HC) не принадлежит изотипу IgG1 с комбинацией замен N297A/D356E/L358M, или, если VH и VL имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 104, соответственно, то константный домен HC не принадлежит изотипу IgG1 с комбинацией замен L234F/L235E/P331S/D356E/L358M.

Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей антитело против PD-L1 или фрагмент антитела против PD-L1, представленный в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей (i) антитело против CTLA-4, представленное в настоящем описании, и антитело против PD-1, представленное в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель; или (ii) антитело против CTLA-4, представленное в настоящем описании, и антитело против PD-L1, представленное в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей (i) фрагмент антитела против CTLA-4, представленный в настоящем описании, и антитело против PD-1, представленное в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель, или (ii) фрагмент антитела против CTLA-4, представленный в настоящем описании, и антитело против PD-L1, представленное в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей (i) фрагмент антитела против CTLA-4, представленный в настоящем описании, и фрагмент антитела против PD-1, представленный в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель, или (ii) фрагмент антитела против CTLA-4, представленный в настоящем описании, и фрагмент антитела против PD-L1, представленный в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей (i) антитело против CTLA-4, представленное в настоящем описании, и фрагмент антитела против PD-1, представленный в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель или (ii) антитело против CTLA-4, представленное в настоящем описании, и фрагмент антитела против PD-L1, представленный в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно относится к любому из антител против CTLA-4, против PD-1 или против PD-L1 или композициям, представленным в настоящем описании, для лечения злокачественного новообразования у индивидуума или для получения лекарственного средства для лечения злокачественного новообразования у индивидуума.

Настоящее изобретение дополнительно относится к любому из фрагментов антител против CTLA-4, против PD-1 или против PD-L1 или композициям, представленным в настоящем описании, для лечения злокачественного новообразования у индивидуума или для получения лекарственного средства для лечения злокачественного новообразования у индивидуума.

В конкретных вариантах осуществления злокачественное новообразование является меланомой, немелкоклеточным раком легких, раком головы и шеи, уротелиальным раком, раком молочной железы, желудочно-кишечным злокачественным новообразованием, множественной миеломой, печеночно-клеточным раком, неходжкинской лимфомой, раком почки, лимфомой Ходжкина, мезотелиомой, раком яичников, мелкоклеточным раком легких, раком пищевода, раком анального канала, раком желчных протоков, колоректальным раком, раком шейки матки, раком щитовидной железы или раком слюнных желез.

В конкретных вариантах осуществления злокачественное новообразование является раком поджелудочной железы, раком бронхов, раком предстательной железы, раком поджелудочной железы, раком желудка, раком яичников, раком мочевого пузыря, злокачественным новообразованием головного мозга или центральной нервной системы, злокачественным новообразованием периферической нервной системы, раком матки или эндометрия, раком полости рта или глотки, раком печени, раком почки, раком яичка, раком желчных протоков, раком тонкого кишечника или аппендикса, раком надпочечника, остеосаркомой, хондросаркомой или злокачественным новообразованием кроветворных тканей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1A-1E: Опосредованный блокадой CTLA-4 колит является Fc-зависимым. Мышам Balb/c дважды в неделю вводили антитела, как указано, в течение 55 дней. Фиг. 1A: Определение профиля экспрессии воспалительных генов кишечника после введения Fc-компетентного антитела против CTLA-4 или эффекторно-молчащего антитела против CTLA-4 включает замену D265A (антитело против CTLA4 (D265S)). После семи недель введения дважды в неделю проксимальные отделы тонкого кишечника собирали для оценки воспалительных маркеров кишечника посредством количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Показана тепловая карта кратного изменения экспрессии воспалительных генов кишечника для двух антител по сравнению с введением изотипического контроля. Экспрессию анализировали во множестве панелей и данные порогового цикла нормализовали по убиквитину в каждой панели. Нормализованные данные для генов, проанализированных как часть множественных панелей, усредняли перед определением кратного изменения относительно изотипического контроля. Фиг. 1B: потеря массы за время эксперимента. Фиг. 1C: Кишечную проницаемость оценивали посредством измерения флуоресценции FITC-декстрана в сыворотке в день 49 и 50. Фиг. 1D: гистологические данные об относительном воспалении кишечника и тяжести колита исследовал и оценивал сертифицированный патолог. Фиг. 1E: типичные микрофотографии окрашенных гематоксилином и эозином гистологических срезов толстого кишечника со дня 55.

Фиг. 2A-2E: Характеризация ISVD против CTLA-4 (nAb). Фиг. 2A: сравнение эффекторно-молчащего ISVD CTLA4 (nAb против CTLA4) с эффекторно-компетентным антителом против CTLA4; фиг. 2B: активированные T-клетки селезенки культивировали в течение трех дней в присутствии nAb против CTLA4 или антитела против CTLA4, как указано. Пролиферацию (фиг. 2C), продукцию ИФНγ (фиг. 2D) и ИЛ-2 (фиг. 22E) измеряли и строили график в виде кратного изменения относительно изотипического контроля (IgG2a мыши). Данные являются типичными для двух-трех независимых экспериментов.

Фиг. 3A-3D: nAb против CTLA4 в комбинации с антителом против PD-1 имеет высокую противоопухолевую эффективность. Фиг. 3A: Несущим опухоль CT26 мышам вводили дозу указанного антитела (антитела против CTLA4, антитела против PD1, антитела против CTLA4 (D265A)) 20 мг/кг и/или nAb против CTLA4 в дозе 30 мг/кг каждые четыре дня всего в пяти дозах, когда опухоли достигали среднего размера 100 мм³ (диапазон 78-125 мм³). Данные приведены как средний объем опухоли в течение 32-дневного периода. Результаты типичны для двух независимых экспериментов (n=10 мышей на группу); фиг. 3B: соотношение CD8⁺ T-клеток/ Foxp3⁺ T_reg-клеток в опухоли в день один после введения, как указано. Результаты типичны для двух независимых экспериментов (n=7 мышей на группу); фиг. 3C и фиг. 3D: Профиль экспрессии генов всей опухоли в день восемь после введения. Результаты типичны для одного или двух независимых экспериментов (n=5 мышей на группу). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 (непарный t-критерий Стьюдента). Планка погрешности ± SEM. Фиг. 3E: показаны объемы опухолей отдельных животных для каждой группа лечения по сравнению с изотипическими контролями. Полные ответы (CR) до дня 39 приведены для групп ответивших на лечение. Данные типичны для двух независимых экспериментов, n=10 мышей на группу.

Фиг. 4A-4D: Опосредованный антителом против CTLA-4 колит является Fc-зависимым. Мышам Balb/c дважды в неделю вводили антитела (антитело против CTLA4, антитело против PD1, антитело против CTLA4 (D265A)) в отдельности или в комбинации с nAb против CTLA4, как указано, в течение 55 дней. Фиг. 4A: потеря массы за время эксперимента; фиг. 4B: гистологическая оценка энтерита в проксимальных отделах тощей кишки в день 55; фиг. 4C: микрофотографии окрашенного гематоксилином и эозином гистологического среза толстого кишечника; фиг. 4D: показана тепловая карта кратного изменения экспрессии воспалительных генов кишечника для указанных образцов по сравнению с изотипическим контролем. Экспрессию анализировали во множественных панелях и данные порогового цикла нормализовали по убиквитину в каждой панели. Нормализованные данные для генов, проанализированных как часть множественных панелей, усредняли перед определением кратного изменения относительно изотипического контроля.

Фиг. 5A-5C: Эффекторная функция Fc антитела против CTLA-4 запускает воспаление в коже, но не системное воспаление. Мышам Balb/c дважды в неделю вводили антитело против CTLA4 или антитело против CTLA4 (D265A), как указано, в течение 55 дней. Фиг. 5A: Микрофотографии окрашенного гематоксилином и эозином гистологического среза кожи уха. Фиг. 5B: Абсолютное количество ИЛ-17-продуцирующих T-клеток, Foxp3⁺ T_reg-клеток и нейтрофилов кожи уха измеряли посредством проточной цитометрии. Фиг. 5C: микрофотографии окрашенного гематоксилином и эозином гистологического среза почки (верхняя панель), печени (средняя панель) и легкого (нижняя панель). Результаты типичны для одного из двух независимых экспериментов (n=4-8 мышей на группу). Масштабные линейки соответствуют 100 мкм. Планка погрешности ± SEM.

Фиг. 6A-6D: Fc-достаточное антитело против CTLA-4 не истощает Foxp3⁺ T_reg-клетки толстого кишечника. Фиг. 6A: внутриклеточное окрашивание CTLA-4 у несущих опухоль CT26 мышей в указанных органах. Фиг. 6B: средняя интенсивность флуоресценции (MFI) CTLA-4 на Foxp3⁺ T_reg-клетках. **p<0,01, ***p<0,001 (парный t-критерий Стьюдента). Фиг. 6C и фиг. 6D: Типичный точечный график и статистика для инфильтрирующих собственную пластинку толстого кишечника и опухоль CT26 Foxp3⁺ T_reg-клеток через 24 часа после введения, как указано. Данные типичны для 2-4 независимых экспериментов (n=4-12 мышей на группу) **p<0,01, ***p<0,001 (непарный t-критерий Стьюдента). Планка погрешности ± SEM.

Фиг. 7A-7D: Опосредованный функцией Fc кишечник при нарушенной антителом против CTLA-4, опосредованной T_reg-клетками супрессии колита. CD45Rb^high наивные T-клетки селезенки переносили мышам-реципиентам CB17-SCID и вводили им антитело против CTLA4 или nAb против CTLA4, как указано. Фиг. 7A: потеря массы за время эксперимента. Фиг. 7B: микрофотографии окрашенного гематоксилином и эозином гистологического среза толстого кишечника, и Фиг. 7C: балльная оценка патологии в день 47(n=14-18 мышей на группу). Фиг. 7D: профиль экспрессии генов во всем толстом кишечнике в день 47 после переноса наивных T-клеток (n=6 мышей на группу). Данные типичны для 1 из 2 независимых экспериментов. Ns=не значимо ****p<0,0001 (непарный t-критерий Стьюдента). Планка погрешности ± SEM.

Фиг. 8A-8E: Вовлечение FcγR и блокада CTLA-4 активируют макрофаги толстого кишечника. Фиг. 8A и фиг. 8B: поверхностная экспрессия CD16/CD32 на макрофагах, выделенных из селезенки, собственной пластинки толстого кишечника и опухоли несущих CT26 мышей, оценивали посредством проточной цитометрии. Фиг. 8C: долю макрофагов (CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺) в селезенке, собственной пластинке толстого кишечника и опухоли несущих CT26 мышей оценивали посредством проточной цитометрии. Фиг. 8D: экспрессию мРНК ИЛ-1b, ФНОα, ИФНγ и Stat1 оценивали в толстом кишечнике мышей, которым вводили антитело против CTLA4, антитело против CTLA4 (D265A) или nAb против CTLA4 в день 0, 10 и 18 после введения. Данные типичны для двух независимых экспериментов (n=8-10 мышей на группу). ns=не значимо, **p<0,01, ***p<0,001 (парный t-критерий Стьюдента). Планка погрешности ± SEM. Фиг. 8E: долю ИЛ-17-продуцирующих CD4⁺ T-клеток (CD45⁺TCRb⁺CD4⁺CD8a^-ИЛ-17A⁺), абсолютное количество ИФНγ-продуцирующих CD8a⁺ T-клеток (CD45⁺TCRb⁺CD4^-CD8a⁺ИФНγ⁺) и нейтрофилов (CD45⁺CD11b⁺Ly6G^high) собственной пластинки толстого кишечника измеряли посредством проточной цитометрии. Результаты типичны для 1 из 2 независимых экспериментов (n=4-8 мышей на группу). **p<0,01 (непарный t-критерий Стьюдента). Масштабные линейки соответствуют 100 мкм. Планка погрешности ± SEM.

Фиг. 9A-9B: Противоопухолевая эффективность в исследовании на сингенной модели опухоли мочевого пузыря MB49 на мышах. Фиг. 9A: несущим опухоль MB49 мышам вводили дозу указанного антитела (30 мг/кг nAb против CTLA-4, 10 мг/кг антитела против CTLA4, 5 мг/кг антитела против PD1 или комбинацию nAb против CTLA4 и антитела против PD-1) каждые четыре дня всего в четырех дозах, когда опухоли достигали среднего размера 102 мм³ (диапазон 87-117 мм³). Данные приведены как средний объем опухоли за 21-дневный период. Результаты типичны для двух независимых экспериментов (n=10 мышей на группу). Фиг. 9B: показаны объемы опухолей отдельных животных для каждой группы лечения. Полные ответы (CR) до дня 21 приведены для групп ответивших на лечение. Данные соответствуют результатам эксперимента с использованием n=10 мышей на группу.

Фиг. 10A-10B: Противоопухолевая эффективность в исследовании на сингенной модели опухоли толстого кишечника MC38 на мышах. Фиг. 10A: несущим опухоль MC38 мышам вводили дозу указанного антитела (30 мг/кг nAb против CTLA-4, 10 мг/кг антитела против CTLA4, 5 мг/кг антитела против PD1 или комбинацию nAb против CTLA4 и антитела против PD-1) каждые четыре дня всего в четырех дозах, когда опухоли достигали среднего размера 220 мм³ (диапазон 179-261 мм³). Данные приведены как средний объем опухоли за 23-дневный период. Результаты типичны для двух независимых экспериментов (n=10 мышей на группу). Фиг. 10B: показаны объемы опухолей отдельных животных для каждой группы лечения. Полные ответы (CR) до дня 23 приведены для групп ответивших на лечение. Данные соответствуют результатам эксперимента с использованием n=10 мышей на группу.

Фиг. 11: Индуцирование воспаления кишечника эффекторными клетками. На изображении показано, что Fc-опосредованного индуцирования воспаления кишечника можно достигать с помощью эффекторных T-клеток независимо от истощения T_reg-клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определение

В рамках изобретения термин "нежелательное явление" или "AE" приведен в Общих терминологических критериях нежелательных явлений (CTCAE) версии 5.0, опубликованных 27 ноября 2017 года Министерством здравоохранения и социального обеспечения США как любой неблагоприятный и незапланированный признак (включая отклонения результатов лабораторных анализов), симптом или заболевание, по времени ассоциированные с использованием медицинского лечения или способом, у человека, которые можно считать или не считать связанными с медицинским лечением или способом. AE является термином, представляющим собой уникальное представление конкретного явления, используемое для медицинской документации и научных анализов. Медицинское лечение может иметь одно или более ассоциированных AE, и каждое AE может иметь тот же или иной уровень тяжести. Тяжести AE приписывают степень. CTCAE отражает степени от 1 до 5 с уникальными клиническими описаниями тяжести каждого AE на основе общих рекомендаций: степень 1, слабая, или бессимптомная или слабые симптомы, только клиническое или диагностическое наблюдение, или вмешательство не показано; степень 2, умеренная, или минимальная, показано локальное или неинвазивное вмешательство, или соответствующее возрасту ограничение по шкале оценки способности к самообслуживанию (ADL); степень 3, тяжелая или медицински значимая, но не непосредственно угрожающая жизни, или показана госпитализация или пролонгирование госпитализации, или потеря дееспособности, или ограничение способности к самообслуживанию (ADL); степень 4, угрожающие жизни последствия или показано неотложное вмешательство; и степень 5, смерть, связанная с AE.

В рамках изобретения термин "антитело" относится к гликопротеину, содержащему (a) по меньшей мере две тяжелые цепи (HC) и две легкие цепи (LC), соединенные между собой дисульфидными связями, или (b), в случае антител биологических видов Верблюжьих, по меньшей мере две тяжелые цепи (HC), соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая HC состоит из вариабельной области или домена тяжелой цепи (VH) и константной области или домена тяжелой цепи. В некоторых природных антителах IgG, IgD и IgA, константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. В целом, основной структурной единицей антитела является тетрамер, содержащий две пары HC/LC, за исключением антител биологических видов Верблюжьих, содержащих только две HC, в случае которых структурной единицей является гомодимер. Каждый тетрамер включает две идентичные пары полипептидных цепей, при этом каждая пара содержит одну цепь LC (приблизительно 25 кДа) и HC (приблизительно 50-70 кДа).

В некоторых природных антителах каждая легкая цепь состоит из вариабельной области или домена LC (VL) и константного домена LC. Константный домен LC состоит из одного домена CL. VH человека включает шесть членов семейства: VH1, VH2, VH3, VH4, VH5 и VH6; и VL человека включает 16 членов семейства: Vκ1, Vκ2, Vκ3, Vκ4, Vκ5, Vκ6, Vλ1, Vλ2, Vλ3, Vλ4, Vλ5, Vλ6, Vλ7, Vλ8, Vλ9 и Vλ10. Каждого из этих членов семейства можно дополнительно разделять на конкретные подтипы. Домены VH и VL можно дополнительно разделять на области гипервариабельности, обозначаемые как определяющие комплементарность области (CDR), перемежающиеся с областями, являющимися более консервативными, обозначаемыми как каркасные области (FR). Каждый из VH и VL состоит из трех областей CDR и четырех областей FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, содержащий CDR, взаимодействующий с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами организма-хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Приписывание аминокислот к каждому домену, как правило, соответствует определениям из Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5^th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252: 6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196: 901-917 или Chothia, et al., (1989) Nature 342: 878-883.

Как правило, нумерация аминокислот в константный домен тяжелой цепи начинается с числа 118, что соответствует схеме нумерации Eu. Схема нумерации Eu зависит от аминокислотной последовательности IgG1 человека (Eu), содержащей константный домен, начинающийся с положения аминокислоты 118 аминокислотной последовательности IgG1, описанной в Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 63: 78-85 (1969) и показанной для константных доменов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 в , et al., Ed. Ginetoux, Correspondence between the IMGT unique numbering for C-DOMAIN, the IMGT exon numbering, the Eu and Kabat numberings: Human IGHG, создано: 17/05/2001, версия: 08/06/2016, доступно по адресу www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#r).

В основном, хотя пара VH/VL антитела содержит шесть CDR, три CDR на VH и три CDR на VL, на этом уровне техники известно, что в большинстве случаев область CDR3 тяжелой цепи является первичной детерминантой специфичности антитела, и в этой области известны примеры получения конкретных антител на основе CDR3 тяжелой цепи в отдельности (например, Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296: 833-849 (2000); Klimka et al., British J. Cancer 83: 252-260 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915 (1998); Xu et al., Immunity 13: 37-45 (2000). См. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) (определение областей CDR антитела по последовательности); также см. Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) (определение областей CDR антитела по структуре).

Следующие общие правила, описанные на www.bioinf.org.uk: Prof. Andrew C.R. Martin's Group и воспроизведенные в таблице ниже можно использовать для идентификации CDR в последовательности антитела, содержащей эти аминокислоты, специфически взаимодействующие с аминокислотами, содержащими эпитоп в антигене, с которым связывается антитело. Существуют редкие примеры, когда эти, как правило, константные признаки не встречаются; однако, остатки Cys являются наиболее консервативным признаком.

Таблица 1 CDR1 легкой цепи Начало Приблизительно аминокислотный остаток 24 Остаток перед Как правило, Cys Остаток после Как правило, Trp. Как правило, Trp-Tyr-Gln, но также Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln или Trp-Tyr-Leu Длина 10-17 аминокислотных остатков CDR2 легкой цепи Начало Как правило, 16 аминокислотных остатков после конца CDR1 Остатки перед Как правило, Ile-Tyr, но также Val-Tyr, Ile-Lys или Ile-Phe Длина Как правило, семь аминокислотных остатков CDR3 легкой цепи Начало Как правило, 33 аминокислотных остатка после конца CDR2 Остаток перед Как правило, Cys Остаток после Как правило, Phe-Gly-Xaa-Gly (SEQ ID NO: 65) Длина 7-11 аминокислотных остатков CDR1 тяжелой цепи Начало Приблизительно аминокислотный остаток 26 (как правило, через четыре аминокислотных остатка после Cys) [определение по Chothia/AbM]; определение по Kabat начинается через пять аминокислотных остатков Остатки перед Как правило, Cys-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 66) Остатки после Как правило, Trp. Как правило, Trp-Val, но также Trp-Ile или Trp-Ala Длина 10-12 аминокислотных остатков [определение по AbM]; при определении по Chothia исключает последние четыре аминокислотных остатка CDR2 тяжелой цепи Начало Как правило, 15 аминокислотных остатков после конца определения CDR1 тяжелой цепи по Kabat/AbM Остатки перед Как правило, Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (SEQ ID NO: 67), но есть ряд вариантов Остатки после Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala Длина Определение по Kabat: 16-19 аминокислотных остатков; определение по AbM (и последнее определение по Chothia) заканчивается на семь аминокислотных остатков раньше Тяжелая цепь CDR3 Начало Как правило, 33 аминокислотных остатка после конца CDR2 тяжелой цепи (как правило, два аминокислотных остатка после Cys) Остатки перед Как правило, Cys-Xaa-Xaa (как правило, Cys-Ala-Arg) Остатки после Как правило, Trp-Gly-Xaa-Gly (SEQ ID NO: 68) Длина 3-25 аминокислотных остатка

В целом, основная структурная единица антитела содержит тетрамер. Каждый тетрамер включает две идентичные пары полипептидных цепей, где каждая пара содержит одну цепь LC (приблизительно 25 кДа) и одну цепь HC (приблизительно 50-70 кДа). Амино-концевая часть каждой цепи включает вариабельную область из приблизительно от 100 до 110 или более аминокислот, главным образом, отвечающих за распознавание антигена. Карбокси-концевая часть HC может определять константную область, главным образом, отвечающую за эффекторную функцию антитела. Как правило, LC человека классифицируют как LC каппа и лямбда. Кроме того, HC человека, как правило, классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и они определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. В LC и HC вариабельные и константные области соединены областью "J" из приблизительно 12 или более аминокислот, при этом HC также включает область "D" еще из приблизительно 10 аминокислот. В целом, см. Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2^nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)).

Тяжелая цепь антитела может содержать или не содержать концевой остаток лизина (K) или концевые остатки глицина и лизина (GK). Таким образом, в конкретных вариантах осуществления антитела по изобретению содержат аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в настоящем описании, в которой дополнительно отсутствует концевой лизин, и которая заканчивается остатком глицина, или дополнительные варианты осуществления, в которых также отсутствует концевой остаток глицина. Это является результатом того, что концевой лизин и иногда глицин и лизин вместе могут расщепляться во время экспрессии антитела или отщепляться при введении в организм человека без очевидного неблагоприятного воздействия на эффективность, стабильность или иммуногенность антитела. В некоторых случаях в молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь, могут быть намерено не включены кодоны, кодирующие концевой лизин, или кодоны для концевого лизина и глицина.

В рамках изобретения термин "фрагмент антитела" или "антигенсвязывающий фрагмент" относится к фрагментам полноразмерных антител, т.е. фрагментам антител, сохраняющим способность специфически связываться с антигеном, связываемым полноразмерным антителом, но меньшим, чем полноразмерное антитело, и в которых полностью отсутствует Fc-домен или отсутствуют части Fc-домена, обеспечивающие связывание антитела с FcγR. Неограничивающие примеры связывающих фрагментов антител включают Fab-, Fab'-, F(ab')₂- и Fv-фрагменты; диатела; молекулы scFv; нанотела и полиспецифические антитела, образующиеся из фрагментов антител.

В рамках изобретения "химерное антитело" является антителом, имеющим вариабельный домен из первого антитела и константный домен из второго антитела, где (i) первое и второе антитела получены из разных биологических видов (патент США №4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)) или (ii) первое и второе антитела принадлежат разным изотипам, например, вариабельный домен из антитела IgG1 и константные домены из антитела IgG4. В одном из аспектов вариабельные домены получены из не принадлежащего человеку антитела, такого как антитело мыши ("родительское антитело"), и последовательности константного домена получены из антитела человека. В дополнительном аспекте вариабельные домены являются гуманизированными вариабельными доменами из антитела мыши и константными доменами антитела человека.

В рамках изобретения термин "комбинированное лечение" относится к лечению человека или животного, включающему введение индивидууму первого терапевтического средства и второго терапевтического средства последовательно или одновременно. В основном, первое и второе терапевтические средства вводят индивидууму раздельно, а не в виде смеси; однако, могут быть варианты осуществления, в которых первое и второе терапевтические средства смешивают перед введением.

В рамках изобретения термин "консервативная замена" относится к заменам аминокислот другими аминокислотами, имеющими схожие характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформацию, жесткость остова и т.д.), таким образом, что часто можно вносить изменения без изменений биологической активности белка. Специалистам в этой области известно, что, в основном, единичные замены аминокислот во второстепенных областях полипептида, по существу, не изменяют биологическую активность (см., например, Watson et al. Molecular biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4^th Ed.) (1987)). Кроме того, замены структурно или функционально схожих аминокислоты, менее вероятно, нарушат биологическую активность. Примеры консервативных замен приведены в таблице 2.

Таблица 2 Исходный остаток Консервативная замена Исходный остаток Консервативная замена Ala (A) Gly; Ser Leu (L) Ile; Val Arg (R) Lys; His Lys (K) Arg; His Asn (N) Gln; His Met (M) Leu; Ile; Tyr Asp (D) Glu; Asn Phe (F) Tyr; Met; Leu Cys (C) Ser; Ala Pro (P) Ala Gln (Q) Asn Ser (S) Thr Glu (E) Asp; Gln Thr (T) Ser Gly (G) Ala Trp (W) Tyr; Phe His (H) Asn; Gln Tyr (Y) Trp; Phe Ile (I) Leu; Val Val (V) Ile; Leu

Термины "антиген-4 цитотоксических T-лимфоцитов", "CTLA-4", "CTLA4", "антиген CTLA-4" и "CD152" (см., например, Murata, Am. J. Pathol. 155: 453-460 (1999)) используют взаимозаменяемо, и они включают варианты, изоформы, видовые гомологи CTLA-4 человека и аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с CTLA-4 (см., например, Balzano, Int. J. Cancer Suppl. 7: 28-32 (1992)). Полную последовательность нуклеиновой кислоты CTLA-4 можно найти под регистрационным номером GenBank L15006.

В рамках изобретения термин "эффекторная функция" относится к видам биологической активности, приписываемым Fc-области антитела и варьирующимся в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; отрицательную регуляцию рецепторов поверхности клетки (например, B-клеточного рецептора); и активацию B-клеток. Антитела действуют посредством ряда механизмов, большинство из которых затрагивают другие части иммунной системы. Антитела могут просто блокировать взаимодействия молекул или могут активировать классический путь комплемента (известный как обусловленная комплементом цитотоксичность или CDC) посредством взаимодействия C1q в комплексе C1 с кластеризованными антителами. Немаловажно, что антитела также действуют как связующее звено между антитело-опосредованными и клеточно-опосредованными иммунными ответами посредством вовлечения Fc-рецепторов.

В рамках изобретения "эффекторно-молчащие" относится к антителу или фрагменту антитела, демонстрирующему (i) отсутствие измеримого связывания с одним или более Fc-рецепторами (FcR), что можно измерять с помощью анализа Biacore, где константа ассоциации в микромолярном диапазоне свидетельствует об отсутствии измеримого связывания, или (ii) измеримое связывание с одним или более FcR, что можно измерять с помощью анализа Biacore, сниженное по сравнению со связыванием, типичным для антитела того же изотипа. В конкретных вариантах осуществления антитело может содержать одну или более мутаций в константном домене HC и, в частности, Fc-домене таким образом, что мутантное антитело имеет сниженное или отсутствующее измеримое связывание с FcγRIIIa, FcγRIIa и FcγRI по сравнению с антителом дикого типа того же изотипа, что и мутантное антитело. В конкретных вариантах осуществления аффинность или константа ассоциации эффекторно-молчащего антитела с одним или более из FcγRIIIa, FcγRIIa и FcγRI снижена по меньшей мере в 1000 раз по сравнению с аффинностью изотипа дикого типа; снижена по меньшей мере в 100-1000 раз по сравнению с аффинностью изотипа дикого типа, снижена по меньшей мере в 50-100 раза по сравнению с аффинностью изотипа дикого типа; или по меньшей мере 10-50 раз по сравнению с аффинностью изотипа дикого типа. В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело не имеет детектируемого или измеримого связывания с одним или более из FcγRIIIa, FcγRIIa и FcγRI по сравнению со связыванием изотипа дикого типа. В основном, в эффекторно-молчащих антителах будет отсутствовать измеримая активность антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). В эффекторно-молчащем фрагменте антитела отсутствует Fc-домен или части Fc-домена, придающие связывание с FcR, и, в связи с этим, они не будут демонстрировать детектируемого или измеримого связывания с одним или более из FcγRIIIa, FcγRIIa или FcγRI. В случае эффекторно-молчащего антитела или фрагментов антител связывание измеряют относительно FcR человека.

В рамках изобретения "Fab-фрагмент" состоит из одной LC и VH и CH1 одной HC и исключает остальную часть константного домена HC. CH1 молекулы Fab не могут образовывать дисульфидную связь с другим Fab-фрагментом или HC-содержащей молекулой. "Fab-фрагмент" может являться продуктом расщепления антитела папаином.

В рамках изобретения "Fab'-фрагмент" содержит одну LC и фрагмент одной HC, содержащий домен VH и константный домен HC вплоть до области между доменами CH1 и CH2, и исключает остальную часть константного домена HC, таким образом, что может образовываться межцепочечная дисульфидная связь между двумя HC двух Fab'-фрагментов с образованием молекулы F(ab')₂.

В рамках изобретения "F(ab')₂-фрагмент" содержит две LC и два фрагмента HC, где каждый фрагмент HC содержит домен VH и константный домен HC вплоть до области между доменами CH1 и CH2 и исключает остальную часть константного домена HC, таким образом, что межцепочечная дисульфидная связь образуется между двумя HC. Таким образом, F(ab')₂-фрагмент состоит из двух Fab'-фрагментов, удерживаемых вместе дисульфидной связью между двумя тяжелыми цепями. F(ab')₂-фрагмент можно получать посредством расщепления антитела пепсином, расщепляющим антитело в участке между доменами CH1 и CH2.

В рамках изобретения "Fc-домен" или "Fc" является доменом или областью кристаллизуемого фрагмента, полученным из антитела и содержащим домены CH2 и CH3 антитела. В антителе два Fc-домена удерживаются вместе двумя или более дисульфидными связями и гидрофобными взаимодействиями доменов CH3. Fc-домен можно получать посредством расщепления антитела протеазой папаином.

В рамках изобретения "Fc-рецепторы" или "FcR" являются ключевыми иммунными регуляторными рецепторами, связывающими гуморальный иммунный ответ с клеточными эффекторными функциями. Идентифицированы рецепторы для всех классов иммуноглобулинов, включая FcγR (IgG), FcεRI (IgE), FcαRI (IgA), FcμR (IgM) и FcδR (IgD). Существует три класса рецепторов для IgG человека, обнаруживаемые в лейкоцитах: CD64 (FcγRI), CD32 (FcγRIIa, FcγRIIb и FcγRIIc) и CD16 (FcγRIIIa и FcγRIIIb). FcγRI классифицируют как высокоаффинный рецептор (KD наномолярного диапазона), в то время как FcγRII и FcγRIII имеют аффинность от низкой до промежуточной (KD микромолярного диапазона). При антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) FcR на поверхности эффекторных клеток (естественных киллеров, макрофагов, моноцитов и эозинофилов) связываются с Fc-областью IgG, которая сама связана с клеткой-мишенью. После связывания путь передачи сигнала активируется, что приводит к секреции различных веществ, таких как литические ферменты, перфорин, гранзимы и фактор некроза опухоли, опосредующие разрушение клетки-мишени. Уровень эффекторной функции ADCC отличается среди подтипов IgG человека. Хотя это зависит от аллотипа и конкретного FcR, в простых терминах ADCC эффекторная функция является высокой для IgG1 и IgG3 человека и низкой для IgG2 и IgG4.

В рамках изобретения "Fv-область" содержит одну VH и пару VL, где полипептид VH и полипептид VL удерживаются вместе дисульфидными связями.

В рамках изобретения "гуманизация" (также называемая реконструированием или пересадкой CDR) представляет собой хорошо известный способ снижения иммуногенности моноклональных антител (mAb) из экзогенных источников (как правило, грызуна) и улучшения эффекторных функций (ADCC, активации комплемента, связывания C1q). Сконструированное mAb конструируют с использованием способов молекулярной биологии, однако, простая пересадка определяющих комплементарность областей (CDR) грызуна на каркасы человека часто приводит к утрате аффинности связывания и/или специфичности исходного mAb. В случае гуманизации антитела дизайн гуманизированного антитела включает такие варианты, как консервативные аминокислотные замены в остатках CDR и обратная замена остатков из mAb грызуна в каркасные области человека (обратные мутации). Положения можно различать или идентифицировать посредством сравнения последовательностей для структурного анализа или посредством анализа модели гомологии трехмерной структуры вариабельных областей. В способе созревания аффинности в последнее время используют фаговые библиотеки для варьирования аминокислот в выбранных положениях. Аналогичным образом используют множество подходов для выбора наиболее подходящих каркасов человека, на которые пересаживают CDR грызуна. С ростом наборов данных известных параметров для структур антител растет сложность и детализация этих способов. Можно использовать консенсусные последовательности или последовательности зародышевой линии из одного антитела или фрагментов каркасных последовательностей в каждой вариабельной области легкой или тяжелой цепи из нескольких разных mAb человека. Другим подходом гуманизации является модификация только поверхностных остатков последовательности грызуна, при этом наиболее распространенные остатки обнаруживают в mAb человека, и его обозначают как "перекладку" или "венирование". Зачастую антитело человека или гуманизированное антитело является, по существу, неиммуногенным для людей.

В рамках изобретения термин "гуманизированное антитело" относится к формам антител или фрагментов антител, содержащим последовательности из антител человека и не принадлежащих человеку антител (например, мыши, крысы). В основном, гуманизированное антитело будет содержать все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых гипервариабельные петли соответствуют петлям не принадлежащего человеку иммуноглобулина, и все или, по существу, все из каркасных (FR) областей являются каркасными областями последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело, необязательно, может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина человека (например, Fc-домен).

В рамках изобретения термин "гиперпролиферативное заболевание" относится к состояниям, при которых рост клеток повышен относительно нормальных уровней. Например, гиперпролиферативные заболевания или нарушения включают злокачественные заболевания (например, рак пищевода, рак толстого кишечника, рак желчных протоков) и незлокачественные заболевания (например, атеросклероз, доброкачественную гиперплазию, доброкачественную гипертрофию предстательной железы).

В рамках изобретения термин "иммуноопосредованные нежелательные явления" или irAE" относится к AE, являющимся аутоиммунными проявлениями из-за дисбаланса иммунной системы, которые можно приписать использованию одного или более ингибиторов иммунных контрольных точек, таких как антитела против PD-1, против PD-L1 и против CTLA-4.

В рамках изобретения термин "иммунный ответ" относится к действию, например, лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых указанными выше клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), приводящему к селективному повреждению, нарушению или элиминации из организма человека инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, злокачественных клеток, или, в случае аутоиммунности или патологического воспаления, нормальных клеток или тканей человека.

В рамках изобретения термин "отдельный вариабельный домен иммуноглобулина" (также обозначаемый как "ISV" или "ISVD"), как правило, используют в отношении вариабельных доменов иммуноглобулина (которые могут являться доменами тяжелой цепи или легкой цепи, включая домены VH, VHH или VL), которые могут образовывать функциональный антигенсвязывающий участок без взаимодействия с другим вариабельным доменом (например, без взаимодействия VH/VL, необходимого между доменами VH и VL общепринятого 4-цепочечного моноклонального антитела). Примеры ISVD включают нанотела (включая VHH, гуманизированный VHH и/или камелизированные VH, такие как камелизированные VH человека), IgNAR, домены, (однодоменные) антитела (такие как dAb™), представляющие собой домены VH или полученные из домена VH, и (однодоменные) антитела (такие как dAb™), представляющие собой домены VL или полученные из домена VL. ISVD, основанные и/или полученные из вариабельных доменов тяжелой цепи (таких как домены VH или VHH), как правило, являются предпочтительными.

В рамках изобретения термин "моноклональное антитело" относится к популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. молекулы антител, составляющие популяцию, идентичны по своей аминокислотной последовательности, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. В отличие от этого, общепринятые (поликлональные) препараты антител, как правило, включают множество разных антител, имеющих разные аминокислотные последовательности в своих вариабельных доменах, которые зачастую специфичны для разных эпитопов. Определение "моноклональное" означает природу антитела как получаемого из, по существу, гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующее получения антитела любым конкретным способом. Например, моноклональные антитела, подлежащие использованию по изобретению, можно получать гибридомным способом, впервые описанным в Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), или способами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США №4816567). "Моноклональные антитела" также можно выделять из фаговых библиотек антител способами, описанными в Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), например. Также см. Presta J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731 (2005).

В рамках изобретения термины "нанотело" и "нанотела" являются зарегистрированными торговыми марками Ablynx N.V.

В рамках изобретения термин "не принадлежащие человеку аминокислотные последовательности" в отношении антител или иммуноглобулинов относится к аминокислотной последовательности, являющейся характерной аминокислотной последовательностью не являющегося человеком млекопитающего. Термин не включает аминокислотные последовательности антител или иммуноглобулинов, полученных из библиотеки полностью человеческих антител, где разнообразия библиотеки достигают in silico (см., например, патент США №8877688 или 8691730).

Термин "PD-1" относится к белку программируемой гибели 1 (PD-1), ингибиторному члену расширенного семейства T-клеточных регуляторов CD28/CTLA-4 (Okazaki et al., Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82 (2002); Bennett et al., J. Immunol. 170: 711-8 (2003)). Другие члены семейства CD28 включают CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. Ген PD-1 кодирует трансмембранный белок I типа массой 55 кДа (Agata et al., Intl. Immunol. 8: 765-72 (1996)). Идентифицировано два лиганда для PD-1, PD-L1 (B7-H1) и PD-L2 (B7-DC), которые, как показано, отрицательно регулируют активацию T-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192: 1027-34; Carter et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32: 634-43). PD-1 известен как иммуноингибиторный белок, отрицательно регулирующий сигналы TCR (Ishida, Y. et al., EMBO J. 11: 3887-3895 (1992); Blank, C. et al., Immunol. Immunother. 56(5): 739-745 (Epub 2006 Dec. 29)). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 может действовать как иммунная контрольная точка, приводя, например, к снижению инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, снижению опосредованной T-клеточным рецептором пролиферации и/или избеганию злокачественными клетками иммунологического надзора (Dong et al., J. Mol. Med. 81: 281-7 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother. 54: 307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res. 10: 5094-100 (2004)). Иммунную супрессию можно реверсировать посредством ингибирования локального взаимодействия PD-1 с PD-L1 или PD-L2; эффект является аддитивным, когда также блокируют взаимодействие PD-1 с PD-L2 (Iwai et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99: 12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol. 170: 1257-66 (2003)).

Термины "белок программируемой гибели 1", "белок программируемой гибели клеток 1", "белок PD-1", "PD-1", "PD1," "PDCD1", "hPD-1" и "hPD-1" используют взаимозаменяемо, и они включают варианты, изоформы, видовые гомологи PD-1 человека и аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с PD-1. Полную последовательность PD-1 можно найти под регистрационным номером GenBank U64863.

В рамках изобретения "scFv" или "одноцепочечный вариабельный фрагмент" является слитым белком, содержащим VH и VL, слитые или связанные коротким линкерным пептидом от десяти до приблизительно 25 аминокислот. Линкер, как правило, богат глицином, придающим гибкость, а также серином или треонином, обеспечивающими растворимость, и с помощью него можно соединять N-конец VH с C-концом VL или наоборот. Этот белок сохраняет специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на удаление константных областей и встраивание линкера.

В рамках изобретения термин "субтерапевтическая доза" означает дозу терапевтического соединения (например, антитела), более низкую, чем обычная или типичная доза терапевтического соединения при введении в отдельности для лечения гиперпролиферативного заболевания (например, злокачественного новообразования). Доза терапевтического соединения может варьироваться в зависимости от заболевания, подвергаемого лечению. Например, субтерапевтическая доза антитела против CTLA-4 является однократной дозой антитела менее приблизительно 3 мг/кг, т.е. известной монотерапевтической дозы антитела против CTLA-4 YERVOY для лечения нерезектабельной или метастатической меланомы или, однократной дозой YERVOY менее приблизительно 10 мг/кг, известной монотерапевтической дозы для адъювантной меланомы.

В рамках изобретения термины "лечить" или "лечение" означают внешнее или внутреннее введение терапевтического средства, такого как композиция, содержащая любые из антител или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, индивидууму или пациенту, имеющему один или более симптомов заболевания или, как предполагают, имеющему заболевание, в отношении которого средство имеет терапевтическую активность или профилактическую активность. Как правило, средство вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или более симптомов заболевания у подвергнутого лечению индивидуума или популяции, посредством индуцирования регрессирования или ингибирования прогрессирования таких симптомов на любую клинически измеримую степень. Количество терапевтического средства, эффективное для облегчения любого конкретного симптома заболевания, может варьироваться в зависимости от факторов, таких как состояние заболевания, возраст и масса тела пациента, и способность лекарственного средства вызывать желаемый ответ у индивидуума. Облегчается ли симптом заболевания, можно оценивать посредством любого клинического измерения, как правило, используемого лечащими врачами или другими медицинскими работниками для оценки тяжести или статуса прогрессирования этих симптомов. Термин дополнительно включает задержку развития симптомов, ассоциированных с нарушением, и/или снижение тяжести симптомов такого нарушения. Термины дополнительно включают улучшение существующих неконтролируемых или нежелательных симптомов, профилактику дополнительных симптомов и улучшение или профилактику основополагающих причин таких симптомов. Таким образом, термины означают, что обеспечен благоприятный результат для человека или животного с нарушением, заболеванием или симптомом или потенциалом развития такого нарушения, заболевания или симптома.

В рамках изобретения термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству конкретного вещества, достаточному для достижения желаемого эффекта у индивидуума, подвергнутого лечению. Например, оно может являться количеством CTLA-4-блокирующего средства, необходимым для ингибирования активации CTLA-4 и индуцирования противоопухолевого ответа, или количеством, необходимым для повышенной отвечаемости против PD-1 или PD-L1 при совместном введении с PD-1 или PD-L1-блокирующим средством, соответственно.

В рамках изобретения "терапевтический индекс", также известный как "терапевтическое окно", "окно безопасности" или "терапевтическое отношение" представляет собой сравнение количества терапевтического средства, вызывающего терапевтический эффект, с количеством терапевтического средства, вызывающим токсичность.

В рамках изобретения термин "лечение", как его используют в отношении человека или животного, относится к терапевтическому лечению, предусматривающему контакт антител или антигенсвязывающих фрагментов с человеком или животным, нуждающимся в лечении антителами или фрагментами антител.

В рамках изобретения термин "VHH" означает, что домен VH получен из антител из HC. Антитела из тяжелых цепей являются функциональными антителами, содержащими две HC и несодержащими LC. Антитела из тяжелых цепей существуют в Верблюжьих, членов биологического семейства Camelidae, из которых их можно получать.

Введение

Антагонисты PD-1, такие как коммерчески доступные антитела против PD-1 KEYTRUDA и OPDIVO, содержат остов IgG4 человека, имеющий сниженную функцию FcγR, т.к. доклинические исследования с использованием антител против PD-1 с функцией связывания FcγR показали плохую противоопухолевую эффективность из-за истощения CD8⁺ цитотоксических T-клеток (CTL), необходимых для иммунотерапии опухоли (см., например, международную патентную заявку № WO 2014/089113). В отличие от этого, в доклинических экспериментах, в которых сравнивали антитела IgG2a мыши против CTLA-4, имеющие высокую аффинность связывания FcγR, с мутантными антителами IgG1 мыши против CTLA-4, у которых отсутствует измеримая аффинность связывания FcγR, было показано, что в случае монотерапии с использованием антител против CTLA-4 необходима функция FcγR для осуществления сильных противоопухолевых ответов (см. например, Selby et al., Cancer Immunol Res. 1: 32-42 (2013)). Необходимость функции FcγR при монотерапии антагонистом CTLA-4 коррелировала с истощением регуляторных T-клеток (T_reg) в моделях опухолей на мышах из-за более высокой экспрессии CTLA-4 на TIL (Simpson et al.,J. Exp. Med. 210: 1695-710 (2013)) по сравнению с популяциями T_reg-клеток в селезенке или лимфоузлах.

Авторы настоящего изобретения предполагали, что необходимость функции FcγR для эффективности антитела против CTLA-4 можно преодолевать посредством комбинирования антитела против CTLA-4 с антителом против PD-1. Эта гипотеза подтверждается новыми данными, иллюстрирующими критическую роль CD28-опосредованной костимуляции в опосредованной антагонистом PD-1 активации истощенных CD8⁺ цитотоксических T-клеток. Антитела против CTLA-4 и против PD-1 осуществляют свою противоопухолевую активность с помощью разных механизмов. Важно, что комбинированные эффекты антител против CTLA-4 и против PD-1 являются не только аддитивными, т.к. комбинированная блокада, вызванная двумя антителами, приводит к активации большого количества генов, включая гены, ассоциированные с пролиферацией, и гены хемокинов, не активируемые любым из антител в отдельности (см., например, фиг. 3C и 4D). Эти данные позволяют предполагать, что механизм действия в случае блокады CTLA-4 при монотерапии отличается от механизма действия в случае комбинации с блокадой PD-1.

Новые данные свидетельствуют о важности CD28-опосредованной костимуляции в активации эффекторных T-клеток (T_eff) после блокады PD-1. Передача сигнала PD-1 приводит к дефосфорилированию CD28, а не TCR, как считали ранее, и передача сигнала CD28 необходима для повышенного противоопухолевого ответа, наблюдаемого после блокады PD-1. Таким образом, в то время как монотерапевтическая блокада CTLA-4, главным образом, может быть нацелена на события примирования T-клеток, можно ожидать, что комбинирование блокады CTLA-4 с блокадой PD-1 будет облегчать активацию истощенных T-клеток за пределами ожидаемого при блокаде PD-1 в отдельности. Авторы настоящего изобретения предполагали, что это механизм усиливается антагонистами CTLA-4, делающими возможной повышенную CD28-опосредованную активацию, независимо от функции Fc-рецепторов, и истощение T_reg-клеток, что может являться важным фактором для опосредованной irAE токсичности.

Потенциальной проблемой в случае антител против CTLA-4, связывающихся с FcR (Fc-функциональных антител), является то, что истощение T_reg-клеток или образование клеточных мостиков между миелоидными клетками и T-клетками может индуцировать нежелательное иммуноопосредованное воспаление. Авторы настоящего изобретения предполагали, что это функция Fc может вносить вклад в наблюдаемые irAE, ассоциированные с иммунотерапией злокачественных новообразований с блокадой CTLA-4. Одним из критических моментов, используемых для аргументации против потенциальной роли функции Fc в индуцировании irAE, является то, что лечение и ипилимумабом (на остове IgG1 человека), и тремелимумабом (на остове IgG2 человека) ассоциировано с воспалением кишечника. Хотя Fc-домен IgG2 человека имеет значимо более низкую аффинность к FcγR человека по сравнению с IgG1 человека, прямое сравнение антител с остовами IgG2 и IgG1 человека показало, что оба вызывали схожие уровни функции Fc с использованием биологических анализов ADCC и ADCP in vitro (например, Vargas et al., Cancer Cell. 33: 649-663 (2018)). Кроме того, истощение T_reg-клеток in vivo и противоопухолевая активность химерных антител против CTLA-4 мыши с остовом изотипа IgG1 человека или остовом изотипа IgG2 человека были эквивалентными у мышей с нокином FcγR человека (Vargas et al., там же).

Ключевым препятствием для оценки потенциальной роли функции Fc в индуцировании воспаления кишечника в сингенных моделях опухолей является отсутствие измеримого воспаления и колита при использовании суррогатных антител мыши против CTLA-4. Для преодоления этого препятствия авторы настоящего изобретения использовали панель на основе ПЦР, ранее разработанную Cayatte et al., Clin. Transl. Gastroenterol. 3: e10 (2012) для измерения положительной регуляции воспалительных генов кишечника, ассоциированных с воспалительным заболеванием кишечника (IBD), на модели IBD мыши. Как показано в примерах в настоящем описании, эта панель на основе ПЦР позволила авторам настоящего изобретения определять повышенную экспрессию генов биомаркеров, свидетельствующих о воспалении кишечника у мышей, которым вводили Fc-функциональное антитело против CTLA-4 мыши (антитело против CTLA4), даже в отсутствие явного колита или гистологических признаков повреждения ткани (см. фиг. 1A, 3C и 4D). Это наблюдение субклинической стимуляции путей экспрессии генов воспаления кишечника позволило авторам настоящего изобретения расширить схему лечения для определения того, будет ли лежащее в основе воспаление прогрессировать с развитием клинического колита. Эта модель irAE колита на мышах позволила авторам настоящего изобретения осуществить эмпирические эксперименты для оценки необходимости функции Fc для индуцирования воспаления кишечника в контексте или в отсутствие сопутствующих противоопухолевых ответов в сингенных моделях опухолей, используемых в иммуноонкологической доклинической разработке.

Результаты, описанные в примерах, четко свидетельствуют о том, что в условиях монотерапии ни эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4, ни эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 не имели измеримую противоопухолевая активность. Однако введение эффекторно-молчащего антитела или эффекторно-молчащего фрагмента антитела в комбинации с антителом против PD1 приводит к противоопухолевой активности, сравнимой с противоопухолевой активностью, вызываемой эффекторно-функциональным антителом против CTLA-4 в отдельности или в комбинации с антителом против PD-1 (см. фиг. 3A) и без irAE кишечника или кожи, наблюдаемых в случае эффекторно-функционального антитела против CTLA-4 в отдельности или в комбинации с антителом против PD-1 (фиг. 4B и 5A), или потери массы (фиг. 4A). В свете этих результатов и обнаружения авторами настоящего изобретения потенциального T_reg-независимого механизма, ассоциированного с Fc-опосредованной противоопухолевой активностью и воспалением кишечника, настоящее изобретение делает возможной комбинированную иммунотерапию злокачественных новообразований с блокадой CTLA-4/PD-1 с улучшенным терапевтическим индексом и более обширной пригодностью.

Способы комбинированного лечения

Настоящее изобретение относится к способам комбинированного лечения злокачественных новообразований, включающим введение индивидууму, нуждающемуся в терапии злокачественных новообразований, (i) PD-1-блокирующего средства, выбранного из группы, состоящей из антитела против PD-1, антитела против PD-L1, эффекторно-молчащего антитела против PD-1, эффекторно-молчащего антитела против PD-L1, эффекторно-молчащего фрагмента антитела против PD-1 и эффекторно-молчащего фрагмента антитела против PD-L1; и (ii) эффекторно-молчащего CTLA-4-блокирующего средства, выбранного из группы, состоящей из эффекторно-молчащего антитела против CTLA-4 и эффекторно-молчащего фрагмента антитела против CTLA-4.

Эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство можно вводить в рамках комбинированного лечения с PD-1-блокирующим средством в дозах, превышающих субтерапевтическую дозу 1 мг/кг ипилимумаба, одобренную FDA США для способов комбинированного лечения ипилимумабом/ниволумабом, предназначенным для почечноклеточной карциномы на поздней стадии, или метастатического колоректального рака с высокой микросателлитной нестабильностью или недостаточностью репарации ошибочно спаренных оснований, и с более низким риском индуцирования irAE кожи или кишечника степени более 1-2 в соответствии с критериями, приведенными в Общих терминологических критериях нежелательных явлений (CTCAE) версии 5.0, в течение комбинированного лечения или по меньшей мере части периода времени, когда индивидуума подвергают комбинированному лечению, по сравнению с риском, наблюдаемым в случае способов комбинированного лечения ипилимумабом/ниволумабом. В конкретных вариантах осуществления дозы не индуцируют irAE степени более 1 в течение комбинированного лечения или по меньшей мере части периода времени, когда индивидуума подвергают комбинированному лечению.

Таким образом, в конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство можно вводить индивидууму в дозе более 1 мг/кг. В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство можно вводить индивидууму в дозе по меньшей мере 3 мг/кг. В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство можно вводить индивидууму в дозе по меньшей мере 10 мг/кг. В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство можно вводить индивидууму в дозе по меньшей мере 15 мг/кг. В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство можно вводить индивидууму в дозе по меньшей мере 20 мг/кг. В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство можно вводить индивидууму в дозе от 3 мг/кг до 20 мг/кг. В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство можно вводить индивидууму в фиксированной дозе, независящей от массы тела индивидуума, например, дозе более 100 мг.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения эффекторно-молчащее CTLA-4-блокирующее средство является эффекторно-молчащим антителом против CTLA-4 или (b) эффекторно-молчащим фрагментом антитела против CTLA-4. Т.к. активность эффекторной функции нежелательна в случае антитела против CTLA-4, антитело против CTLA-4 имеет домен HC, сконструированный так, чтобы быть "эффекторно-молчащим", т.е. посредством модификации Fc-домена так, чтобы он имел сниженное или отсутствующее измеримое связывание FcR по сравнению с Fc-доменом антитела дикого типа того же изотипа, что и эффекторно-молчащее антитело (например, Fc-доменом немутантного IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), что определяют посредством анализа Biacore. В эффекторно-молчащем фрагменте антитела против CTLA-4 отсутствует Fc-домен или области Fc-домена, связывающиеся с одним или более FcR.

В конкретных вариантах осуществления комбинированному лечению по настоящему изобретению подвергают индивидуума до или после хирургического вмешательства для удаления опухоли, и ее можно использовать до, во время или после лучевой терапии.

В конкретных вариантах осуществления комбинированному лечению по настоящему изобретению подвергают индивидуума, которого ранее не лечили биотерапевтическим или химиотерапевтическим средством, т.е. индивидуум ранее не подвергался лечению. В других вариантах осуществления комбинированному лечению подвергают индивидуума, не достигшего устойчивого ответа после предшествующей терапии биотерапевтическим или химиотерапевтическим средством, т.е. индивидуум ранее подвергался лечению.

В конкретных вариантах осуществления комбинированное лечение по настоящему изобретению используют для лечения опухоли, являющейся достаточно крупной, чтобы ее обнаружить при пальпации или способами визуализации, хорошо известными в этой области, такими как МРТ, ультразвуковое исследование или КТ. В некоторых вариантах осуществления комбинированное лечение по изобретению используют для лечения опухоли на поздней стадии, имеющей размеры по меньшей мере приблизительно 200 мм³, 300 мм³, 400 мм³, 500 мм³, 750 мм³ или до 1000 мм³.

В конкретных вариантах осуществления комбинированному лечению по настоящему изобретению подвергают индивидуума, имеющему злокачественное новообразование, по результатам анализа положительное по экспрессии PD-L1. В некоторых вариантах осуществления экспрессию PD-L1 определяют с использованием диагностического антитела против PD-L1 человека или его антигенсвязывающего фрагмента в иммуногистохимическом (IHC) анализе с помощью фиксированного формалином, погруженного в парафин (FFPE) или замороженного тканевого среза образца опухоли, полученного из индивидуума. Лечащий врач индивидуума может назначать диагностический тест для определения экспрессии PD-L1 в образце опухолевой ткани, полученном из индивидуума перед началом комбинированного лечения по настоящему изобретению, но предполагают, что лечащий врач может назначать первый или последующие диагностические тесты в любое время после начала лечения, например, после завершения цикла лечения.

Комбинированное лечение может включать любой из примеров эффекторно-молчащих антител против CTLA-4 или эффекторно-молчащих фрагментов антител против CTLA-4, представленных в настоящем описании, в комбинации с любым из примеров антител против PD-1 или фрагментов антител против PD-1, представленных в настоящем описании, или любым из примеров антител против PD-L1 или фрагментов антител против PD-L1, представленных в настоящем описании.

(a) Эффекторно-молчащие антитела

Эффекторно-молчащие антитело по настоящему изобретению содержит константный домен HC или его Fc-домен, модифицированный таким образом, что антитело демонстрирует отсутствие измеримого связывания с одним или более FcR или сниженное связывание с одним или более FcR по сравнению с немодифицированным антителом того же изотипа IgG. В дополнительных вариантах осуществления эффекторно-молчащие антитела могут демонстрировать отсутствие измеримого связывания с каждым из FcγRIIIa, FcγRIIa и FcγRI или сниженное связывание с каждым из FcγRIIIa, FcγRIIa и FcγRI по сравнению с немодифицированным антителом того же изотипа IgG. В конкретных вариантах осуществления константный домен HC или Fc-домен является константным доменом HC или Fc-доменом человека.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело содержит Fc-домен изотипа IgG1 или IgG2, IgG3 или IgG4, модифицированный так, что в нем отсутствует N-гликозилирование остатка аспарагина (Asn) в положении 297 (система нумерации Eu) константного домена HC. Консенсусная последовательность для N-гликозилирования представляет собой Asn-Xaa-Ser/Thr (где Xaa в положении 298 является любой аминокислотой, за исключением Pro); во всех четырех изотипах консенсусная последовательность N-гликозилирования представляет собой Asn-Ser-Thr. Модификации можно достигать посредством замены кодона, кодирующего Asn в положении 297 в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей константный домен HC, кодоном, кодирующим другую аминокислоту, например Ala, Asp, Gln, Gly или Glu, например N297A, N297Q, N297G, N297E или N297D. Альтернативно, кодон для Ser в положении 298 можно заменять кодоном для Pro или кодон для Thr в положении 299 можно заменять любым кодоном, за исключением кодона для Ser. В дополнительном альтернативном варианте каждую из аминокислот, составляющую консенсусную последовательность N-гликозилирования, заменяют другой аминокислотой. Такие модифицированные молекулы IgG не имеют измеримой эффекторной функции. В конкретных вариантах осуществления эти мутантные молекулы HC могут дополнительно содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями. В дополнительных вариантах осуществления такие IgG, модифицированные так, что в них отсутствует N-гликозилирование в положении 297, могут дополнительно включать одну или более дополнительных мутаций, представленных в настоящем описании, для устранения измеримой эффекторной функции.

Пример константного домена HC IgG1, мутантного в положении 297, что приводит к устранению N-гликозилирования константного домена HC, приведен в SEQ ID NO: 44, пример константного домена HC IgG2, мутантного в положении 297, что приводит к устранению N-гликозилирования константного домена HC, приведен в SEQ ID NO: 50, и пример IgG4 константного домена HC, мутантного в положении 297, что приводит к устранению N-гликозилирования константного домена HC, приведен в SEQ ID NO: 56. В конкретных вариантах осуществления эти мутантные молекулы HC может дополнительно содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В конкретных вариантах осуществления Fc-домен константного домена HC IgG1 IgG2, IgG3 или IgG4, составляющего эффекторно-молчащее антитело, модифицирован так, чтобы включать одну или более замен аминокислот, выбранных из E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, D265S и P331S (где положения определяют в соответствии с нумерацией Eu), и где указанный константный домен HC является эффекторно-молчащим. В конкретных вариантах осуществления модифицированный IgG1 дополнительно содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В конкретных вариантах осуществления константный домен HC содержит замены L234A, L235A и D265S (где положения определяют в соответствии с нумерацией Eu). В конкретных вариантах осуществления константный домен HC содержит замену аминокислоты в положении Pro329 и по меньшей мере одну дополнительную замену аминокислоты, выбранную из E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, D265S и P331S (где положения определяют в соответствии с нумерацией Eu). Эти и другие замены описаны в WO 9428027; WO 2004099249; WO 20121300831, патентах США №№9708406; 8969526; 9296815; Sondermann et al. Nature 406, 267-273 (20 Jul. 2000)).

В указанных выше конкретных вариантах осуществления константный домен HC содержит замены L234A/L235A/D265A; L234A/L235A/P329G; L235E; D265A; D265A/N297G или V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, где положения определяют в соответствии с нумерацией Eu. В конкретных вариантах осуществления молекулы HC дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело имеет изотип IgG1, в котором Fc-домен константного домена HC модифицирован так, чтобы быть эффекторно-молчащим, посредством замены аминокислот от положения 233 до положения 236 IgG1 соответствующими аминокислотами HC IgG2 человека и замены аминокислот в положениях 327, 330 и 331 соответствующими аминокислотами HC IgG4 человека, где положения определяют в соответствии с нумерацией Eu (Armour et al., Eur. J. Immunol. 29(8): 2613-24 (1999); Shields et al., J. Biol. Chem. 276(9): 6591-604(2001)). В конкретных вариантах осуществления модифицированный IgG1 дополнительно содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело содержит домен VH, слитый или связанный с гибридным константным доменом HC иммуноглобулина человека, включающим шарнирную область, домен CH2 и домен CH3 в направлении от N-конца к C-концу, где шарнирная область содержит по меньшей мере частичную аминокислотную последовательность шарнирной области IgD человека или шарнирной области IgG1 человека; и домен CH2 является доменом CH2 IgG4 человека, часть которого в его N-концевой области заменяют 4-37 аминокислотными остатками N-концевой области CH2 IgG2 человека или доменом CH2 IgD человека. Такой гибридный константный домен HC человека описан в патенте США №7867491, включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело содержит константный домен HC IgG4, в котором серин в положении 228 по системе Eu заменяют пролином, см., например, SEQ ID NO: 52. Эта модификация предотвращает образование возможной межцепочечной дисульфидной связи между цистеинами в положениях Cys226 и Cys229 по системе EU и может мешать образованию правильной внутрицепочечной дисульфидной связи. См. Angal et al. Mol. Imunol. 30: 105 (1993); также см. (Schuurman et al., Mol. Immunol. 38: 1-8, (2001); SEQ ID NO: 14 и 41). В дополнительных вариантах осуществления константный домен IgG4 включает, в дополнение к замене S228P, замену аминокислоты P239G, D265A или D265A/N297G, где положения определяют в соответствии с нумерацией Eu. В указанных выше конкретных вариантах осуществления константный домен HC IgG4 является константным доменом HC человека. В конкретных вариантах осуществления молекулы HC дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

Примеры константных доменов HC IgG1 включают константные домены HC, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44. Примеры константных доменов HC IgG2 имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49. Примеры константных доменов HC IgG4 имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56.

Более конкретные примеры эффекторно-молчащих антител описаны ниже в комбинации с конкретными примерами эффекторно-молчащих антител против CTLA-4, антител против PD-1 и антител против PD-1.

(b) Примеры эффекторно-молчащих антител против CTLA-4

Примеры эффекторно-молчащих антител против CTLA-4, которые можно использовать в комбинированном лечении по настоящему изобретению и композициях, содержащих эти антитела, включают любое эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4, связывающееся с CTLA-4 и ингибирующее связывание CTLA-4 с B7. Конкретные эффекторно-молчащие антитела против CTLA-4 включают следующие эффекторно-молчащие антитела против CTLA-4 и композиции, содержащие любое из этих антител и фармацевтически приемлемый носитель.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит (i) VH, содержащий, три HC-CDR ипилимумаба, слитый или связанный с константным доменом HC, демонстрирующим отсутствие измеримого связывания с FcγRIIIA, FcγRIIA и FcγRI или сниженное связывание по сравнению с полипептидом, содержащим область константного домена IgG дикого типа, что определяют посредством анализа Biacore, и (ii) VL, содержащий три LC-CDR ипилимумаба, слитый или связанный с константным доменом каппа или лямбда LC. Три HC-CDR содержат SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно, и три LC-CDR содержат SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно.

В дополнительных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит (i) VH, содержащий три HC-CDR тремелимумаба, слитый или связанный с константным доменом HC, демонстрирующим отсутствие измеримого связывания с FcγRIIIA, FcγRIIA и FcγRI или сниженное связывание по сравнению с полипептидом, содержащим область константного домена IgG дикого типа, что определяют посредством анализа Biacore, и (ii) VL, содержащий три LC-CDR тремелимумаба, слитый или связанный с константным доменом каппа или лямбда LC. Три HC-CDR содержат SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, соответственно, и три LC-CDR содержат SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, соответственно.

В дополнительных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит любые из (i) доменов VH и VL ипилимумаба, (ii) доменов VH и VL тремелимумаба, (iii) доменов VH и VL REGN4659, (iv) доменов VH и VL AGEN1884w или (v) доменов VH и VL клона 2C8 антитела против CTLA-4, описанного в международной патентной заявке № WO 2017194265. Домен VH ипилимумаба содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8. Домен VH тремелимумаба содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16. Домен VH REGN4659 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 95, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 96. Домен VH AGEN1884w содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 97, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 98. В конкретных вариантах осуществления домены VH и VL дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В дополнительных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит домены VH и VL 8D2/8D2 (RE) (см. публикацию патентной заявки США №20170216433 и международную патентную заявку № WO 2018183408), 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D3H3L3, 8D2H2L15 или 8D2H2L17, где домен VH слит или связан с константным доменом HC, демонстрирующим отсутствие измеримого связывания с FcγRIIIA, FcγRIIA и FcγRI или сниженное связывание по сравнению с полипептидом, содержащим область константного домена IgG дикого типа, что определяют посредством анализа Biacore, и домен VL слит или связан с константным доменом каппа или лямбда LC.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит вариант 8D2/8D2 (RE), 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H2L15 или 8D2H2L17, где метионин в положении 18 в аминокислотной последовательности VH варианта заменяют изолейцином. Таким образом, эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 может содержать VH и VL 8D2/8D2 (RE)-варианта 1, VH и VL 8D2H1L1-варианта 1, VH и VL 8D2H2L2-варианта 1, VH и VL 8D2H2L15-варианта 1 или VH и VL 8D2H2L17-варианта 1.

В дополнительных вариантах осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA4 имеет (i) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 73, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 74; (ii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 75, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 76; (iii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 77, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 78; (iv) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 79, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 80; (v) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 81, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 82; (vi) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 83, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 84; (vii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 85, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 86; (viii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 87, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 88; (ix) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 89, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 90; (x) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 91, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 92; или (xi) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 93, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 94.В конкретных вариантах осуществления домены VH и VL дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В дополнительных вариантах осуществления эффекторно-молчащего антитела против CTLA-4 домен VH слит или связан с константным доменом HC IgG4 или константным доменом HC IgG1, IgG2 или IgG4, модифицированным так, чтобы включать одну или более мутаций, делающих полученное антитело против CTLA4 эффекторно-молчащим.

В одном из вариантов осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит Fc-домен IgG1, содержащий (i) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (ii) мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N297A, L234A/L235A/D265A, L234A/L235A/P329G, L235E, D265A, E233A/L235A, S267E/L328F, S2339D/A330L/I332E, L235G/G236R, N297A/D356E/L358M, L234F/L235E/P331S/D365E/L358M и D265A/N297G, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (iii) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, и мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из L234A/L235A/D265A, L234A/L235A/P329G, L235E, D265A, E233A/L235A, S267E/L328F, S2339D/A330L/I332E, L235G/G236R, D356E/L358M, L234F/L235E/P331S/D365E/L358M и D265A, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот в (i), (ii) и (iii) определяют в соответствии с нумерацией Eu.

В другом варианте осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит Fc-домен IgG2, содержащий (i) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (ii) мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N297A/D265S, D265A, P329G/D265A/N297G, или V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (iii) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования и мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N297A/D265S, D265A, P329G/D265A/N297G или V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот в (i), (ii) и (iii) определяют в соответствии с нумерацией Eu.

В дополнительном варианте осуществления эффекторно-молчащее антитело против CTLA-4 содержит Fc-домен IgG4, содержащий замену аминокислоты S228P и дополнительно содержащий (i) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; (ii) мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N267A, P329G и D265A/N297A, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот; или (iii) мутацию в участке N-гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr, начинающуюся в положении аминокислоты 297, устраняющую N-гликозилирование в указанном участке N-гликозилирования, и мутацию с заменой аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из N267A, P329G и D265A/N297A, или мутантный Fc-домен, дополнительно содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где положения аминокислот в (i), (ii) и (iii) определяют в соответствии с нумерацией Eu.

В таблицах 4-18 приведены конкретные примеры антител против CTLA-4, которые можно использовать в комбинации с антителом против PD-1 или против PD-L1 в терапии для лечения индивидуума, имеющего злокачественное новообразование. Настоящее изобретение также относится к антителам, приведенным в таблицах, за исключением ипилимумаба, состоящего исключительно из замены N297A, и композициям, где каждая композиция содержит антитело, приведенное в таблицах, и фармацевтически приемлемый носитель, за исключением композиции, содержащей ипилимумаб, состоящий исключительно из замены N297A. Все положения замен аминокислоты HC в таблицах 4-18 соответствуют системе нумерации Eu.

Таблица 4 Производные IgG1 ипилимумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 1-1 IgG1 (L234A/L235A/D265S) 38 7 8 57 или 117 1-2 IgG1 (L234A/L235A/P329G) 39 7 8 57 или 117 1-3 IgG1 (L235E) 40 7 8 57 или 117 1-4 IgG1 (D265A) 41 7 8 57 или 117 1-5 IgG1 (D265A/N297G) 42 7 8 57 или 117 1-6 IgG1 (E233A/L235A) 43 7 8 57 или 117 1-7 IgG1 (N297X) 44 7 8 57 или 117 1-8 IgG1 (N297A/D356E/L358M) 116 7 8 57 или 117 1-9 IgG1 (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) 117 7 8 57 или 117

Таблица 5 Производные IgG2 ипилимумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 2-1 IgG2 (D265S) 46 7 8 57 или 117 2-2 IgG2 (P329G) 47 7 8 57 или 117 2-3 IgG2 (D265A) 48 7 8 57 или 117 2-4 IgG2 (D265A/N297G) 49 7 8 57 или 117 2-5 IgG2 (N297X) 50 7 8 57 или 117 2-6 IgG2 (V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S) 51 7 8 57 или 117

Таблица 6 Производные IgG4 ипилимумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 3-1 IgG4 (S228P) 52 7 8 57 или 117 3-2 IgG4 (S228P/P329G) 53 7 8 57 или 117 3-3 IgG4 (S228P/D265A) 54 7 8 57 или 117 3-4 IgG4 (S228P/D265A/N297G) 55 7 8 57 или 117 3-5 IgG4 (S228P/N297X) 56 7 8 57 или 117

Таблица 7 Производные IgG1 тремелимумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 4-1 IgG1 (L234A/L235A/D265S) 38 15 16 57 или 117 4-2 IgG1 (L234A/L235A/P329G) 39 15 16 57 или 117 4-3 IgG1 (L235E) 40 15 16 57 или 117 4-4 IgG1 (D265A) 41 15 16 57 или 117 4-5 IgG1 (D265A/N297G) 42 15 16 57 или 117 4-6 IgG1 (E233A/L235A) 43 15 16 57 или 117 4-7 IgG1 (N297X) 44 15 16 57 или 117 4-8 IgG1 (N297A/D356E/L358M) 116 15 16 57 или 117 4-9 IgG1 (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) 117 15 16 57 или 117

Таблица 8 Производные IgG2 тремелимумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 5-1 IgG2 (D265S) 46 15 16 57 или 117 5-2 IgG2 (P329G) 47 15 16 57 или 117 5-3 IgG2 (D265A) 48 15 16 57 или 117 5-4 IgG2 (D265A/N297G) 49 15 16 57 или 117 5-5 IgG2 (N297X) 50 15 16 57 или 117 5-6 IgG2 (V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S) 51 15 16 57 или 117

Таблица 9 Производные IgG4 тремелимумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 6-1 IgG4 (S228P) 52 15 16 57 или 117 6-2 IgG4 (S228P/P329G) 53 15 16 57 или 117 6-3 IgG4 (S228P/D265A) 54 15 16 57 или 117 6-4 IgG4 (S228P/D265A/N297G) 55 15 16 57 или 117 6-5 IgG4 (S228P/N297X) 56 15 16 57 или 117

Таблица 10 Производные IgG1 REGN4659 SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 7-1 IgG1 (L234A/L235A/D265S) 38 95 96 57 или 117 7-2 IgG1 (L234A/L235A/P329G) 39 95 96 57 или 117 7-3 IgG1 (L235E) 40 95 96 57 или 117 7-4 IgG1 (D265A) 41 95 96 57 или 117 7-5 IgG1 (D265A/N297G) 42 95 96 57 или 117 7-6 IgG1 (E233A/L235A) 43 95 96 57 или 117 7-7 IgG1 (N297X) 44 95 96 57 или 117 7-8 IgG1 (N297A/D356E/L358M) 116 95 96 57 или 117 7-9 IgG1 (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) 117 95 96 57 или 117

Таблица 11 Производные IgG2 REGN4659 SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 8-1 IgG2 (D265S) 46 95 96 57 или 117 8-2 IgG2 (P329G) 47 95 96 57 или 117 8-3 IgG2 (D265A) 48 95 96 57 или 117 8-4 IgG2 (D265A/N297G) 49 95 96 57 или 117 8-5 IgG2 (N297X) 50 95 96 57 или 117 8-6 IgG2 (V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S) 51 95 96 57 или 117

Таблица 12 Производные IgG4 REGN4659 SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 9-1 IgG4 (S228P) 52 95 96 57 или 117 9-2 IgG4 (S228P/P329G) 53 95 96 57 или 117 9-3 IgG4 (S228P/D265A) 54 95 96 57 или 117 9-4 IgG4 (S228P/D265A/N297G) 55 95 96 57 или 117 9-5 IgG4 (S228P/N297X) 56 95 96 57 или 117

Таблица 13 Производные IgG1 AGEN1884w SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 10-1 IgG1 (L234A/L235A/D265S) 38 97 98 57 или 117 10-2 IgG1 (L234A/L235A/P329G) 39 97 98 57 или 117 10-3 IgG1 (L235E) 40 97 98 57 или 117 10-4 IgG1 (D265A) 41 97 98 57 или 117 10-5 IgG1 (D265A/N297G) 42 97 98 57 или 117 10-6 IgG1 (E233A/L235A) 43 97 98 57 или 117 10-7 IgG1 (N297X) 44 97 98 57 или 117 10-8 IgG1 (N297A/D356E/L358M) 116 97 98 57 или 117 10-9 IgG1 (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) 117 97 98 57 или 117

Таблица 14 Производные IgG2 AGEN1884w SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 11-1 IgG2 (D265S) 46 97 98 57 или 117 11-2 IgG2 (P329G) 47 97 98 57 или 117 11-3 IgG2 (D265A) 48 97 98 57 или 117 11-4 IgG2 (D265A/N297G) 49 97 98 57 или 117 11-5 IgG2 (N297X) 50 97 98 57 или 117 11-6 IgG2 (V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S) 51 97 98 57 или 117

Таблица 15 Производные IgG4 AGEN1884w SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 12-1 IgG4 (S228P) 52 97 98 57 или 117 12-2 IgG4 (S228P/P329G) 53 97 98 57 или 117 12-3 IgG4 (S228P/D265A) 54 97 98 57 или 117 12-4 IgG4 (S228P/D265A/N297G) 55 97 98 57 или 117 12-5 IgG4 (S228P/N297X) 56 97 98 57 или 117

Таблица 16 Производные IgG1 8D2/8D2 (RE), 8D2/8D2 (RE)-варианта 1, 8D2H1L1, 8D2H1L1-варианта 1, 8D2H2L2, 8D2H2L2-варианта 1, 8D3H3L3, 8D2H2L15, 8D2H2L15-варианта 1, 8D2H2L17 и 8D2H2L17-варианта 1 SEQ ID NO № Ab* Изотип и замены HC Константный домен HC Пара VH+VL Константный домен LC 13-1n IgG1 (L234A/L235A/D265S) 38 a=73+74,
b=75+76,
c=77+78,
d=79+80,
e=81+82,
f=83+84,
g=85+86,
h=87+88,
i=89+90,
j=91+92, или
k=93+94 57 или 117 13-2n IgG1 (L234A/L235A/P329G) 39 57 или 117 13-3n IgG1 (L235E) 40 57 или 117 13-4n IgG1 (D265A) 41 57 или 117 13-5n IgG1 (D265A/N297G) 42 57 или 117 13-6n IgG1 (E233A/L235A) 43 57 или 117 13-7n IgG1 (N297X) 44 57 или 117 13-8n IgG1 (N297A/D356E/L358M) 116 57 или 117 13-9n IgG1 (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) 117 57 или 117 *n=a, b, c, d, e, f, g, h, i, j или k.

Таблица 17 Производные IgG2 8D2/8D2 (RE), 8D2/8D2 (RE)-варианта 1, 8D2H1L1, 8D2H1L1-варианта 1, 8D2H2L2, 8D2H2L2-варианта 1, 8D3H3L3, 8D2H2L15, 8D2H2L15-варианта 1, 8D2H2L17 и 8D2H2L17-варианта 1 SEQ ID NO № Ab* Изотип и замены HC Константный домен HC Пара VH+VL Константный домен LC 14-1n IgG2 (D265S) 46 a=73+74,
b=75+76,
c=77+78,
d=79+80,
e=81+82,
f=83+84,
g=85+86,
h=87+88,
i=89+90,
j=91+92, или
k=93+94 57 или 117 14-2n IgG2 (P329G) 47 57 или 117 14-3n IgG2 (D265A) 48 57 или 117 14-4n IgG2 (D265A/N297G) 49 57 или 117 14-5n IgG2 (N297X) 50 57 или 117 14-6n IgG2 (V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S) 51 57 или 117 *n=a, b, c, d, e, f, g, h, i, j или k.

Таблица 18 Производные IgG4 8D2/8D2 (RE), 8D2/8D2 (RE)-варианта 1, 8D2H1L1, 8D2H1L1-варианта 1, 8D2H2L2, 8D2H2L2-варианта 1, 8D3H3L3, 8D2H2L15, 8D2H2L15-варианта 1, 8D2H2L17 и 8D2H2L17-варианта 1 SEQ ID NO № Ab* Изотип и замены HC Константный домен HC Пара VH+VL Константный домен LC 15-1n IgG4 (S228P) 52 a=73+74,
b=75+76,
c=77+78,
d=79+80,
e=81+82,
f=83+84,
g=85+86,
h=87+88,
i=89+90,
j=91+92, или
k=93+94 57 или 117 15-2n IgG4 (S228P/P329G) 53 57 или 117 15-3n IgG4 (S228P/D265A) 54 57 или 117 15-4n IgG4 (S228P/D265A/N297G) 55 57 или 117 15-5n IgG4 (S228P/N297X) 56 57 или 117 *n=a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, или k.

(c) Примеры эффекторно-молчащих фрагментов антител против CTLA-4

Примеры эффекторно-молчащих фрагментов антител против CTLA-4, которые можно использовать в комбинированном лечении по настоящему изобретению и содержащих их композициях включают любой фрагмент антитела, связывающийся с CTLA-4 и ингибирующий связывание CTLA-4 с B7. Конкретные примеры этих фрагментов антител против CTLA-4 включают следующие фрагменты антител против CTLA-4 и композиции, где каждая композиция содержит эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 и фармацевтически приемлемый носитель.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 является Fv, scFv, F(ab) или F(ab')₂, содержащим (i) VH, содержащий три HC-CDR ипилимумаба, и (ii) VL, содержащий три LC-CDR ипилимумаба. Три HC-CDR содержат SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно, и три LC-CDR содержат SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7, соответственно.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит (i) VH, содержащий три HC-CDR тремелимумаба, и (ii) VL, содержащий три LC-CDR тремелимумаба. Три HC-CDR содержат SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, соответственно, и три LC-CDR содержат SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, соответственно.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит любые из (i) доменов VH и VL ипилимумаба, (ii) доменов VH и VL тремелимумаба, (iii) доменов VH и VL REGN4659, (iv) доменов VH и VL AGEN1884w или (v) доменов VH и VL клона 2C8 антитела против CTLA-4, описанного в международной патентной заявке № WO 2017194265. Домен VH ипилимумаба содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8. Домен VH тремелимумаба содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16. Домен VH REGN4659 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 95, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 96. Домен VH AGEN1884w содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 97, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 98.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит VH и VL ипилимумаба, VH и VL тремелимумаба, VH и VL REGN4659, VH и VL AGEN1884w, VH и VL 8D2/8D2 (RE), VH и VL 8D2H1L1, VH и VL 8D2H2L2, VH и VL 8D3H3L3, VH и VL 8D2H2L15 или VH и VL 8D2H2L17.

В конкретных вариантах осуществления антитело против CTLA-4 или фрагмент антитела против CTLA-4 содержит VH и VL 8D2/8D2 (RE)-вариант 1, VH и VL 8D2H1L1-варианта 1, VH и VL 8D2H2L2-варианта 1, VH и VL 8D2H2L15-варианта 1, или VH и VL 8D2H2L17-варианта 1.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит любой (i) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 73, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 74; (ii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 75, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 76; (iii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 77, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 78; (iv) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 79, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 80; (v) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 81, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 82; (vi) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 83, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 84; (vii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 85, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 86; (viii) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 87, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 88; (ix) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 89, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 90; (x) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 91, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 92; или (xi) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 93, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 94.

В конкретных вариантах осуществления эффекторно-молчащий фрагмент антитела против CTLA-4 содержит один или более отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов (ISVD), где каждый ISVD содержит вариабельный домен (VHH) антитела Верблюжьих, содержащий только тяжелую цепь при условии, что ISVD не содержит CDR1, содержащую аминокислотную последовательность FYGMG (SEQ ID NO: 69, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность DIRTSAGRTTYADSVKG (SEQ ID NO: 70), и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность EMSGISGWDY (SEQ ID NO: 71) или EPSGISGWDY (SEQ ID NO: 72), как ISVD, описанные в международной патентной заявке № WO 2008071447, WO 2017087587 и WO 2017087588, и варианты ISVD, содержащие 1, 2 или 3 мутаций в CDR3, как описано в WO 2008071447, с таким исключением, что не исключаемыми в силу него являются ISVD, содержащие указанные CDR в вариантах осуществления, где один или более ISVD слиты или связаны с константным доменом или Fc-доменом эффекторно-молчащего антитела, например, любым из константных доменов или Fc-доменов эффекторно-молчащего антитела, представленных в настоящем описании.

(d) Примеры антител против PD-1

Примеры антител против PD-1, которые можно использовать в комбинированном лечении по настоящему изобретению, включают любое антитело, связывающееся с PD-1 и ингибирующее связывание PD-1 с PD-L1. В дополнительном варианте осуществления пример антитела против PD-1 выбран из группы, состоящей из ниволумаба, пембролизумаба и цемиплимаба-rwlc. Примеры антител включают следующие антитела против PD-1 и композиции, содержащие антитело против PD1 и его фармацевтически приемлемую соль.

Пембролизумаб, также известный как KEYTRUDA, ламбролизумаб, MK-3475 или SCH-900475, является гуманизированным антителом против PD-1, описанным в патенте США №8354509 и WO 2009/114335 и, например, в Hamid, et al., New England J. Med. 369 (2): 134-144 (2013). Тяжелые и легкие цепи пембролизумаба представлены аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 27 и 28, соответственно.

Ниволумаб, также известный как OPDIVO, MDX-1106-04, ONO-4538 или BMS-936558, является полностью человеческим антителом IgG4 против PD-1, описанным в WO 2006/121168 и патенте США №8008449. Тяжелые и легкие цепи ниволумаба представлены аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 25 и 26, соответственно.

Цемиплимаб-rwlc, также известный как цемиплимаб, LIBTAYO или REGN2810, является рекомбинантным моноклональным антителом IgG4 человека, описанным в WO 2015112800 и патенте США №9987500. Тяжелые и легкие цепи цемиплимаба-rwlc представлены аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 101 и 102, соответственно.

В конкретных вариантах осуществления антитело против PD-1 содержит (i) VH, содержащий три HC-CDR пембролизумаба, слитый или связанный с эффекторно-молчащим константным доменом HC, и (ii) VL, содержащий три LC-CDR пембролизумаба, слитый или связанный с константным доменом каппа или лямбда LC. Три HC-CDR содержат SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33, соответственно, и три LC-CDR содержат SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, соответственно.

В конкретных вариантах осуществления антитело против PD-1 содержит (i) VH, содержащий три HC-CDR ниволумаба, слитый или связанный с эффекторно-молчащим константным доменом HC, и (ii) VL, содержащий три LC-CDR ниволумаба, слитый или связанный с константным доменом каппа или лямбда LC. Три HC-CDR содержат SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, соответственно, и три LC-CDR содержат SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 2, соответственно.

В конкретных вариантах осуществления антитело против PD-1 содержит (i) VH, содержащий три HC-CDR цемиплимаба-rwlc, слитый или связанный с эффекторно-молчащим константным доменом HC, и (ii) VL, содержащий три LC-CDR ниволумаба, слитый или связанный с константным доменом каппа или лямбда LC.

В конкретных вариантах осуществления антитело против PD-1 содержит (i) домены VH и VL пембролизумаба, где домен VH слит или связан с эффекторно-молчащим константным доменом HC, и домен VL слит или связан с константным доменом каппа или лямбда LC; (ii) домены VH и VL ниволумаба, где домен VH слит или связан с эффекторно-молчащим константным доменом HC, и домен VL слит или связан с константным доменом каппа или лямбда LC; или (iii) домены VH и VL цемиплимаба-rwlc, где домен VH слит или связан с эффекторно-молчащим константным доменом HC, и домен VL слит или связан с константным доменом каппа или лямбда LC. Домен VH пембролизумаба содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30. Домен VH ниволумаб содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24. Домен VH цемиплимаба-rwlc содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 99, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 100. В конкретных вариантах осуществления домены VH и VL могут дополнительно содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В конкретных вариантах осуществления антитело против PD-1 домен VH может быть слитым или связанным с константным доменом HC IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в настоящее время не связанным с конкретным VH или связанным с константным доменом HC IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, модифицированным так, чтобы включать одну или более мутаций в Fc-домене делающих полученное антитело против PD-1 эффекторно-молчащим.

В определенных вариантах осуществления константный домен HC принадлежит изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, модифицированному так, что в нем отсутствует N-гликозилирование остатка аспарагина (Asn) в положении 297 константного домена HC посредством замены кодона для Asn в положении 297 в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей константный домен HC, кодоном для другой аминокислоты, например, Gln. В дополнительных вариантах осуществления такие IgG, модифицированные так, что в них отсутствует N-гликозилирование в положении 297, дополнительно включают одну или более дополнительных мутаций, представленных в настоящем описании, для устранения детектируемой эффекторной функции. В конкретных вариантах осуществления константный домен HC является константным доменом HC человека. В конкретных вариантах осуществления молекулы дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу против PD-1, содержащему константный домен HC IgG4, модифицированный так, чтобы содержать замену S228P, и включающему, в дополнение к замене S228P, замены аминокислот P239G, D265A или D265A/N297G, где положения определяют в соответствии с нумерацией Eu. В указанных выше конкретных вариантах осуществления константный домен HC IgG4 является константным доменом HC человека. В конкретных вариантах осуществления молекулы дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В другом варианте осуществления антитело против PD-1 может иметь изотип IgG1 человека, в котором Fc-домен константного домена HC модифицирован так, чтобы быть эффекторно-молчащим, посредством замены аминокислот от положения 233 до положения 236 IgG1 соответствующими аминокислотами HC IgG2 человека и замены аминокислот в положениях 327, 330 и 331 соответствующими аминокислотами HC IgG4 человека, где положения определяют в соответствии с нумерацией Eu. В конкретных вариантах осуществления молекулы HC дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В другом варианте осуществления Fc-домен константного домена HC IgG1 IgG2, IgG3 или IgG4 модифицирован так, чтобы включать одну или более замен аминокислот, выбранных из E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, D265S и P331S, и где указанный полипептид демонстрирует отсутствие измеримого связывания с FcγRIIIA, FcγRIIA и FcγRI или сниженное связывание по сравнению с полипептидом, содержащим область константного домена IgG дикого типа, что определяют посредством анализа Biacore. Эти и другие замены описаны в WO 9428027; WO 2004099249; WO 20121300831, патентах США №№9708406; 8969526; 9296815; Sondermann et al. Nature 406, 267-273 (20 Jul. 2000)). В конкретных вариантах осуществления молекулы HC дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В таблицах 19-27 приведены конкретные примеры антител против PD-1, которые можно использовать в комбинации с антителом против CTLA-4, как представлено в настоящем описании, в терапии для лечения индивидуума, имеющего злокачественное новообразование. Настоящее изобретение также относится к антителам, приведенным в таблицах, и композициям, где каждая композиция содержит антитело, приведенное в таблицах, и фармацевтически приемлемый носитель. Все положения замен аминокислоты HC в таблицах 19-27 соответствуют системе нумерации Eu.

Таблица 19 Производные IgG1 пембролизумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 16-1 IgG1 (L234A/L235A/D265S) 38 29 30 57 или 117 16-2 IgG1 (L234A/L235A/P329G) 39 29 30 57 или 117 16-3 IgG1 (L235E) 40 29 30 57 или 117 16-4 IgG1 (D265A) 41 29 30 57 или 117 16-5 IgG1 (D265A/N297G) 42 29 30 57 или 117 16-6 IgG1 (E233A/L235A) 43 29 30 57 или 117 16-7 IgG1 (N297X) 44 29 30 57 или 117 16-8 IgG1 (N297A/D356E/L358M) 116 29 30 57 или 117 16-9 IgG1 (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) 117 29 30 57 или 117

Таблица 20 Производные IgG2 пембролизумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 17-1 IgG2 (D265S) 46 29 30 57 или 117 17-2 IgG2 (P329G) 47 29 30 57 или 117 17-3 IgG2 (D265A) 48 29 30 57 или 117 17-4 IgG2 (D265A/N297G) 49 29 30 57 или 117 17-5 IgG2 (N297X) 50 29 30 57 или 117 17-6 IgG2 (V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S) 51 29 30 57 или 117

Таблица 21 Производные IgG4 пембролизумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 18-1 IgG4 (S228P) 52 29 30 57 или 117 18-2 IgG4 (S228P/P329G) 53 29 30 57 или 117 18-3 IgG4 (S228P/D265A) 54 29 30 57 или 117 18-4 IgG4 (S228P/D265A/N297G) 55 29 30 57 или 117 18-5 IgG4 (S228P/N297X) 56 29 30 57 или 117

Таблица 22 Производные IgG1 ниволумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 19-1 IgG1 (L234A/L235A/D265S) 38 23 24 57 или 117 19-2 IgG1 (L234A/L235A/P329G) 39 23 24 57 или 117 19-3 IgG1 (L235E) 40 23 24 57 или 117 19-4 IgG1 (D265A) 41 23 24 57 или 117 19-5 IgG1 (D265A/N297G) 42 23 24 57 или 117 19-6 IgG1 (E233A/L235A) 43 23 24 57 или 117 19-7 IgG1 (N297X) 44 23 24 57 или 117 19-8 IgG1 (N297A/D356E/L358M) 116 23 24 57 или 117 19-9 IgG1 (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) 117 23 24 57 или 117

Таблица 23 Производные IgG2 ниволумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 20-1 IgG2 (D265S) 46 23 24 57 или 117 20-2 IgG2 (P329G) 47 23 24 57 или 117 20-3 IgG2 (D265A) 48 23 24 57 или 117 20-4 IgG2 (D265A/N297G) 49 23 24 57 или 117 20-5 IgG2 (N297X) 50 23 24 57 или 117 20-6 IgG2 (V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S) 51 23 24 57 или 117

Таблица 24 Производные IgG4 ниволумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 21-1 IgG4 (S228P) 52 23 24 57 или 117 21-2 IgG4 (S228P/P329G) 53 23 24 57 или 117 21-3 IgG4 (S228P/D265A) 54 23 24 57 или 117 21-4 IgG4 (S228P/D265A/N297G) 55 23 24 57 или 117 21-5 IgG4 (S228P/N297X) 56 23 24 57 или 117

Таблица 25 Производные IgG1 цемиплимаба-rwlc SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 22-1 IgG1 (L234A/L235A/D265S) 38 99 100 57 или 117 22-2 IgG1 (L234A/L235A/P329G) 39 99 100 57 или 117 22-3 IgG1 (L235E) 40 99 100 57 или 117 22-4 IgG1 (D265A) 41 99 100 57 или 117 22-5 IgG1 (D265A/N297G) 42 99 100 57 или 117 22-6 IgG1 (E233A/L235A) 43 99 100 57 или 117 22-7 IgG1 (N297X) 44 99 100 57 или 117 22-8 IgG1 (N297A/D356E/L358M) 116 99 100 57 или 117 22-9 IgG1 (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) 117 99 100 57 или 117

Таблица 26 Производные IgG2 цемиплимаба-rwlc SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 23-1 IgG2 (D265S) 46 99 100 57 или 117 23-2 IgG2 (P329G) 47 99 100 57 или 117 23-3 IgG2 (D265A) 48 99 100 57 или 117 23-4 IgG2 (D265A/N297G) 49 99 100 57 или 117 23-5 IgG2 (N297X) 50 99 100 57 или 117 23-6 IgG2 (V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S) 51 99 100 57 или 117

Таблица 27 Производные IgG4 цемиплимаба-rwlc SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 24-1 IgG4 (S228P) 52 99 100 57 или 117 24-2 IgG4 (S228P/P329G) 53 99 100 57 или 117 24-3 IgG4 (S228P/D265A) 54 99 100 57 или 117 24-4 IgG4 (S228P/D265A/N297G) 55 99 100 57 или 117 24-5 IgG4 (S228P/N297X) 56 99 100 57 или 117

(e) Примеры фрагментов антител против PD-1

Примеры фрагментов антител против PD-1, которые можно использовать в комбинированном лечении по настоящему изобретению, включают любой фрагмент антитела против PD-1, связывающийся с PD-1 и ингибирующий связывание PD-1 с PD-L1, и дополнительно включают следующие фрагменты антител против PD-1, связывающиеся с PD-1, и композиции, содержащие следующие фрагменты антител против PD-1 и фармацевтически приемлемый носитель.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела является Fv или scFv, содержащим VH пембролизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29, и VL пембролизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-1 является F(ab), содержащим VH пембролизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29, и VH пембролизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-1 является F(ab')₂, содержащим VH пембролизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29, и VH пембролизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-1 является Fv или scFv, содержащим VH ниволумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23, и VH ниволумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-1 является F(ab), содержащим VH ниволумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23, и VH ниволумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-1 является F(ab')₂, содержащим VH ниволумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23, и VH ниволумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-1 содержит один или более отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов (ISVD), где каждый ISVD содержит вариабельный домен (VHH) антитела Верблюжьих, содержащего только тяжелую цепь при условии, что ISVD не содержит CDR1, содержащую аминокислотную последовательность THAMG (SEQ ID NO: 73), CDR2, содержащую аминокислотную последовательность VITWSGGITTYADSVKG (SEQ ID NO: 74) или VITVSGGITYYADSVKG (SEQ ID NO: 75), и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность DKHQSSWYDY (SEQ ID NO: 76) или DKHQSSFYDY (SEQ ID NO: 77), как ISVD, описанные в международной патентной заявке № WO 2008071447, WO 2017087587 и WO 2017087589, и варианты, содержащие 1, 2 или 3 мутаций в CDR3, как описано в WO 2008071447, с таким исключением, что не исключаемыми в силу него являются ISVD, содержащие указанные CDR в вариантах осуществления, где один или более ISVD слиты или связаны с константным доменом или Fc-доменом эффекторно-молчащего антитела, например, любым из константных доменов или Fc-доменов эффекторно-молчащего антитела, представленных в настоящем описании.

(f) Примеры антител против PD-L1

Примеры антител против PD-L1, которые можно использовать в комбинированном лечении по настоящему изобретению, включают любое антитело против PD-L1, ингибирующее связывание PD-1 с PD-L1, и дополнительно включают следующие антитела против PD-L1 и композиции, содержащие следующие антитела против PD-L1 и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретных вариантах осуществления антитело против PD-L1 выбрано из группы, состоящей из атезолизумаба, авелумаба и дурвалумаба.

В конкретных вариантах осуществления антитело против PD-L1 содержит (i) домены VH и VL атезолизумаба, где домен VH слит или связан с константным доменом HC или эффекторно-молчащим константным доменом HC, и домен VL слит или связан с константным доменом каппа или лямбда LC, (ii) домены VH и VL авелумаба, где домен VH слит или связан с константным доменом HC или эффекторно-молчащим константным доменом HC, и домен VL слит или связан с константным доменом каппа или лямбда LC, или (iii) домены VH и VL дурвалумаба, где домен VH слит или связан с константным доменом HC или эффекторно-молчащим константным доменом HC, и домен VL слит или связан с константным доменом каппа или лямбда LC. Домен VH дурвалумаба содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 103, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 104. Домен VH авелумаба содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 105, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 106. Домен VH атезолизумаба содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 107, и домен VL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 108. В конкретных вариантах осуществления домены VH и VL дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В конкретных вариантах осуществления домен VH антитела против PD-L1 может быть слитым или связанным с константным доменом HC IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в настоящее время не связанным с конкретным VH или связанным с константным доменом HC IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, модифицированным так, чтобы включать одну или более мутаций в Fc-домене делающих полученное антитело против PD-L1 эффекторно-молчащим.

В определенных вариантах осуществления константный домен HC принадлежит изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, модифицированному так, что в нем отсутствует N-гликозилирование остатка аспарагина (Asn) в положении 297 константного домена HC, посредством замены кодона для Asn в положении 297 в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей константный домен HC, кодоном для другой аминокислоты, например, Gln. Альтернативно, кодон для Ser можно заменять кодоном для Pro или кодон для Thr можно заменять любым кодоном, за исключением кодона для Ser, например, N297A, N297G или N297D. Альтернативно, все три кодона модифицированы. В дополнительных вариантах осуществления такие IgG, модифицированные так, что в них отсутствует N-гликозилирование в положении 297, дополнительно включают одну или более дополнительных мутаций, представленных в настоящем описании, для устранения детектируемой эффекторной функции. В конкретных вариантах осуществления константный домен HC является константным доменом HC человека. В конкретных вариантах осуществления молекулы дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу против PD-L1, содержащему константный домен HC IgG4, модифицированный так, чтобы содержать замену S228P, и включающему, в дополнение к замене S228P, замены аминокислот P239G, D265A или D265A/N297G, где положения определяют в соответствии с нумерацией Eu. В указанных выше конкретных вариантах осуществления константный домен HC IgG4 является константным доменом HC человека. В конкретных вариантах осуществления молекулы дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В другом варианте осуществления антитело против PD-L1 может иметь изотип IgG1 человека, в котором Fc-домен константного домена HC модифицирован так, чтобы быть эффекторно-молчащим, посредством замены аминокислот от положения 233 до положения 236 IgG1 соответствующими аминокислотами HC IgG2 человека и замены аминокислот в положениях 327, 330 и 331 соответствующими аминокислотами HC IgG4 человека, где положения определяют в соответствии с нумерацией Eu. В конкретных вариантах осуществления молекулы HC дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В другом варианте осуществления Fc-домен константного домена HC IgG1 IgG2, IgG3 или IgG4 модифицирован так, чтобы включать одну или более замен аминокислот, выбранных из E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, D265S и P331S, и где указанный полипептид демонстрирует отсутствие измеримого связывания с FcγRIIIA, FcγRIIA и FcγRI или сниженное связывание по сравнению с полипептидом, содержащим область константного домена IgG дикого типа, что определяют посредством анализа Biacore. Эти и другие замены описаны в WO 9428027; WO 2004099249; WO 20121300831, патенты США №№9708406; 8969526; 9296815; Sondermann et al. Nature 406, 267-273 (20 Jul. 2000)). В конкретных вариантах осуществления молекулы HC дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных замен, инсерций и/или делеций аминокислот, где указанные замены могут являться консервативными мутациями или неконсервативными мутациями.

В таблицах 28-36 приведены примеры антител против PD-L1, которые можно использовать в комбинации с антителом против CTLA-4, как представлено в настоящем описании, в терапии для лечения индивидуума, имеющего злокачественное новообразование. Настоящее изобретение также относится к антителам, приведенным в таблицах, за исключением антител 25-9 и 31-8, и композиции, где каждая композиция содержит антитело, приведенное в таблице, за исключением антител 25-9 и 31-8, и фармацевтически приемлемый носитель. Все положения замен аминокислоты HC в таблицах 28-36 соответствуют системе нумерации Eu.

Таблица 28 Производные IgG1 дурвалумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 25-1 IgG1 (L234A/L235A/D265S) 38 103 104 57 или 117 25-2 IgG1 (L234A/L235A/P329G) 39 103 104 57 или 117 25-3 IgG1 (L235E) 40 103 104 57 или 117 25-4 IgG1 (D265A) 41 103 104 57 или 117 25-5 IgG1 (D265A/N297G) 42 103 104 57 или 117 25-6 IgG1 (E233A/L235A) 43 103 104 57 или 117 25-7 IgG1 (N297X) 44 103 104 57 или 117 22-8 IgG1 (N297A/D356E/L358M) 116 103 104 57 или 117 25-9 IgG1 (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) 117 103 104 57 или 117

Таблица 29 Производные IgG2 дурвалумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 26-1 IgG2 (D265S) 46 103 104 57 или 117 26-2 IgG2 (P329G) 47 103 104 57 или 117 26-3 IgG2 (D265A) 48 103 104 57 или 117 26-4 IgG2 (D265A/N297G) 49 103 104 57 или 117 26-5 IgG2 (N297X) 50 103 104 57 или 117 26-6 IgG2 (V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S) 51 103 104 57 или 117

Таблица 30 Производные IgG4 дурвалумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 27-1 IgG4 (S228P) 52 103 104 57 или 117 27-2 IgG4 (S228P/P329G) 53 103 104 57 или 117 27-3 IgG4 (S228P/D265A) 54 103 104 57 или 117 27-4 IgG4 (S228P/D265A/N297G) 55 103 104 57 или 117 27-5 IgG4 (S228P/N297X) 56 103 104 57 или 117

Таблица 31 Производные IgG1 авелумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 28-1 IgG1 (L234A/L235A/D265S) 38 105 106 57 или 117 28-2 IgG1 (L234A/L235A/P329G) 39 105 106 57 или 117 28-3 IgG1 (L235E) 40 105 106 57 или 117 28-4 IgG1 (D265A) 41 105 106 57 или 117 28-5 IgG1 (D265A/N297G) 42 105 106 57 или 117 28-6 IgG1 (E233A/L235A) 43 105 106 57 или 117 28-7 IgG1 (N297X) 44 105 106 57 или 117 28-8 IgG1 (N297A/D356E/L358M) 116 105 106 57 или 117 28-9 IgG1 (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) 117 105 106 57 или 117

Таблица 32 Производные IgG2 авелумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 29-1 IgG2 (D265S) 46 105 106 57 или 117 29-2 IgG2 (P329G) 47 105 106 57 или 117 29-3 IgG2 (D265A) 48 105 106 57 или 117 29-4 IgG2 (D265A/N297G) 49 105 106 57 или 117 29-5 IgG2 (N297X) 50 105 106 57 или 117 29-6 IgG2 (V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S) 51 105 106 57 или 117

Таблица 33 Производные IgG4 авелумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 30-1 IgG4 (S228P) 52 105 106 57 или 117 30-2 IgG4 (S228P/P329G) 53 105 106 57 или 117 30-3 IgG4 (S228P/D265A) 54 105 106 57 или 117 30-4 IgG4 (S228P/D265A/N297G) 55 105 106 57 или 117 30-5 IgG4 (S228P/N297X) 56 105 106 57 или 117

Таблица 34 Производные IgG1 атезолизумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 31-1 IgG1 (L234A/L235A/D265S) 38 107 108 57 или 117 31-2 IgG1 (L234A/L235A/P329G) 39 107 108 57 или 117 31-3 IgG1 (L235E) 40 107 108 57 или 117 31-4 IgG1 (D265A) 41 107 108 57 или 117 31-5 IgG1 (D265A/N297G) 42 107 108 57 или 117 31-6 IgG1 (E233A/L235A) 43 107 108 57 или 117 31-7 IgG1 (N297X) 44 107 108 57 или 117 31-8 IgG1 (N297A/D356E/L358M) 116 107 108 57 или 117 31-9 IgG1 (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) 117 107 108 57 или 117

Таблица 35 Производные IgG2 атезолизумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 32-1 IgG2 (D265S) 46 107 108 57 или 117 32-2 IgG2 (P329G) 47 107 108 57 или 117 32-3 IgG2 (D265A) 48 107 108 57 или 117 32-4 IgG2 (D265A/N297G) 49 107 108 57 или 117 32-5 IgG2 (N297X) 50 107 108 57 или 117 32-6 IgG2 (V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S) 51 107 108 57 или 117

Таблица 36 Производные IgG4 атезолизумаба SEQ ID NO № Ab Изотип и замены HC Константный домен HC VH VL Константный домен LC 33-1 IgG4 (S228P) 52 107 108 57 или 117 33-2 IgG4 (S228P/P329G) 53 107 108 57 или 117 33-3 IgG4 (S228P/D265A) 54 107 108 57 или 117 33-4 IgG4 (S228P/D265A/N297G) 55 107 108 57 или 117 33-5 IgG4 (S228P/N297X) 56 107 108 57 или 117

(g) Примеры фрагментов антител против PD-L1

Примеры фрагментов антител против PD-L1, которые можно использовать в комбинированном лечении по настоящему изобретению, относятся к любому фрагменту антитела против PD-L1, связывающемуся с PD-L1 и ингибирующему связывание PD-L1 с PD-1, и дополнительно включают следующие фрагменты антител против PD-L1 и композиции, где каждая композиция содержит следующий фрагмент антитела против PD-L1 и фармацевтически приемлемый носитель.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-L1 является Fv или scFv, содержащим VH дурвалумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 103, и VL дурвалумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 104.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-L1 является F(ab), содержащим VH дурвалумаба имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 103, и VH дурвалумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 104.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-L1 является F(ab')₂, содержащим VH дурвалумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 103, и VH дурвалумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 104.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-L1 является Fv или scFv, содержащим VH авелумаб, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 105, и VH авелумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 106.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-L1 является F(ab), содержащим VH авелумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 105, и VH авелумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 106.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-L1 является F(ab')₂, содержащим VH авелумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 105, и VH авелумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 106.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-L1 является Fv или scFv, содержащим VH атезолизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 107, и VH атезолизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 108.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-L1 является F(ab), содержащим VH атезолизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 107, и VH атезолизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 108.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-L1 является F(ab')₂, содержащим VH атезолизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 107, и VH атезолизумаба, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 108.

В конкретных вариантах осуществления фрагмент антитела против PD-L1 содержит один или более отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов (ISVD), где каждый ISVD содержит вариабельный домен (VHH) антитела Верблюжьих, содержащего только тяжелую цепь при условии, что ISVD не содержит ISVD против PD-L1, описанный в международной патентной заявке № WO 2008071447 и содержащий SEQ ID NO: 394-399 в ней или описанный в WO 2009030285, оба из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки, с таким исключением, что не исключаемыми условием являются ISVD, где один или более ISVD слиты или связаны с константным доменом или Fc-доменом эффекторно-молчащего антитела, например, любым из константных доменов или Fc-доменов эффекторно-молчащего антитела, представленных в настоящем описании.

(h) Примеры схем комбинированного лечения

Настоящее изобретение относится к противоопухолевым терапевтическим средствам, в которых комбинируют иммуностимулирующие эффекты PD-1-блокирующего средства с противоопухолевыми эффектами CTLA-4-блокирующего средства, но без дерматологических или кишечных irAE, как правило, наблюдаемых в случае CTLA-4-блокирующих средств, вводимых в комбинации с PD-1-блокирующими средствами. Признаком настоящего изобретения является то, что у CTLA-4-блокирующего средства отсутствует измеримое связывание с одним или более FcR, что определяют посредством анализа Biacore, или есть сниженное связывание с одним или более FcR по сравнению с антителом дикого типа того же изотипа, что измеряют посредством анализа Biacore. Таким образом, CTLA-4-блокирующие средства демонстрируют отсутствие измеримой эффекторной функции или сниженную эффекторную функцию, что позволяет использовать эффекторно-молчащие CTLA-4-блокирующие средства в способах комбинированного лечения с PD-1-блокирующими средствами в дозах и в течение периодов времени, недоступных в случае CTLA-4-блокирующих средств, демонстрирующих эффекторную функцию. Этот признак отличает CTLA-4-блокирующие средства по настоящему изобретению от доступных в настоящее время CTLA-4-блокирующих средств.

В типичной схеме введения по настоящему изобретению CTLA-4-блокирующее средство и PD-1-блокирующее средство можно вводить индивидууму одновременно в отдельных дозах и в разных форматах. В основном, CTLA-4-блокирующее средство по настоящему изобретению можно вводить в рамках комбинированного лечения с PD-1-блокирующим средством по меньшей мере в одинаковой дозе, с одинаковой частотой и длительностью лечениями, одобренными в настоящее время FDA США для комбинированного лечения ипилимумабом/ниволумабом по конкретным показаниям. Однако комбинированное лечение не ограничено конкретными показаниями, одобренными FDA США, но может включать любое показание, при котором можно получить пользу от комбинированного лечения по настоящему изобретению. Одобренной в настоящее время дозой является 1 мг/кг ипилимумаба после введения ниволумаба в дозе 3 мг/кг. Затем эту комбинацию доз можно повторять каждые три недели всего в четырех дозах, затем продолжая вводить дозы ниволумаба каждые две недели по мере необходимости. Однако в дополнительных вариантах осуществления CTLA-4-блокирующее средство по настоящему изобретению можно вводить в рамках комбинированного лечения в дозе, составляющей более 1 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг. В дополнительном варианте осуществления доза может составлять по меньшей мере 10 мг/кг, и в дополнительных вариантах осуществления доза может составлять приблизительно от 1 мг/кг до 10 мг/кг. В конкретных вариантах осуществления CTLA-4-блокирующее средство по настоящему изобретению можно вводить с той же частотой и длительностью лечения, что и в одобренном комбинированном лечении ипилимумабом/ниволумабом. В конкретных вариантах осуществления CTLA-4-блокирующие средства по настоящему изобретению можно вводить с той же частотой и длительностью лечения, что и для ниволумаба в одобренном комбинированном лечении ипилимумабом/ниволумабом.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения CTLA-4-блокирующее средство вводят в дозе, не основанной на массе тела индивидуума. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления CTLA-4-связывающее средство можно вводить в дозе приблизительно от 10 мг до 300 мг. В дополнительном варианте осуществления доза выбрана из группы, состоящей из 10 мг, 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг и 300 мг.

В комбинированном лечении по настоящему изобретению PD-1-блокирующее средство можно вводить в той же дозе, с частотой и длительностью лечения, одобренными для PD-1-блокирующего средства в монотерапии для конкретных показаний. Доза CTLA-4-блокирующего средства может являться такой, как указано выше, и CTLA-4-блокирующее средство можно вводить с той же частотой и длительностью лечения, что и указанные выше, или с той же частотой и длительностью лечения, что и для конкретного PD-1-блокирующего средства, используемого в комбинации с CTLA-4-блокирующим средством.

Конкретная доза находящихся в настоящее время на рынке PD-1-блокирующих средств варьируется среди PD-1-блокирующих средств, таким образом, в конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения по настоящему изобретению, доза, частота введения и/или длительность лечения могут являться по меньшей мере такими же, что и одобренные FDA США в случае конкретного PD-1-блокирующего средства для конкретных показаний. Например, пембролизумаб одобрен в дозе 200 мг каждые три недели по мере необходимости (детям (от двух до 18 лет) в дозе 2 мг/кг до 200 мг каждые три недели по мере необходимости); ниволумаб одобрен в дозе 3 мг/кг каждые 2 недели; цемиплимаб-rwlc одобрен в дозе 350 мг каждые три недели по мере необходимости; атезолизумаб одобрен в дозе 1200 мг каждые три недели по мере необходимости; авелумаб одобрен в дозе 10 мг/кг или 800 мг каждые две недели по мере необходимости; и дурвалумаб одобрен в дозе 10 мг/кг каждые две недели по мере необходимости.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство является антителом против PD-1 или фрагментом антитела против PD-1, которое можно вводить в дозе от приблизительно 150 мг до приблизительно 250 мг, от приблизительно 175 мг до приблизительно 250 мг, от приблизительно 200 мг до приблизительно 250 мг, от приблизительно 150 мг до приблизительно 240 мг, от приблизительно 175 мг до приблизительно 240 мг или от приблизительно 200 мг до приблизительно 240 мг. В некоторых вариантах осуществления доза антитела против PD-1 или его антигенсвязывающего фрагмента составляет 150 мг, 175 мг, 200 мг, 225 мг, 240 мг или 250 мг. В дополнительных вариантах осуществления антитело против PD-1 или фрагмент антитела против PD-1 можно вводить с частотой каждые три недели по мере необходимости. В другом варианте осуществления комбинированного лечения по настоящему изобретению антитело против PD-1 или фрагмент антитела против PD-1 можно вводить в дозе более 250 мг, например, дозе приблизительно 400 мг с частотой каждые шесть недель по мере необходимости.

В конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство является антителом против PD-1 или фрагментом антитела против PD-1, которое можно вводить в дозе от приблизительно 10 мг/кг до приблизительно 1200 мг. В дополнительных вариантах осуществления антитело против PD-1 или фрагмент антитела против PD-1 можно вводить с частотой каждые две-три недели по мере необходимости.

Хотя PD-1-блокирующее средство можно вводить по меньшей мере в дозах, с частотой и длительностью лечения, одобренными для находящихся в настоящее время на рынке PD-1-блокирующих средств в монотерапии, точные дозы, частоты и длительность лечения для любой конкретной комбинации по настоящему изобретению могут отличаться от одобренных для монотерапии PD-1-блокирующими средствами. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления комбинированного лечения по настоящему изобретению, доза, частота и длительность лечения любым конкретным PD-1-блокирующим средством в комбинированном лечении будут определять с помощью клинических испытаний, проведенных в отношении комбинированного лечения.

В конкретном варианте осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство является ниволумабом или эффекторно-молчащим вариантом ниволумаба, который вводят индивидууму внутривенно в дозе 3 мг/кг в течение от 30 до 60 минут каждые две-три недели по мере необходимости, и где каждую дозу CTLA-4-блокирующего средства вводят внутривенно после введения PD-1-блокирующего средства с той же длительностью лечения, что и PD-1-блокирующее средство или длительностью, меньшей или большей, чем длительность в случае PD-1-блокирующего средства. В конкретном варианте осуществления ниволумаб или эффекторно-молчащий вариант ниволумаба вводят внутривенно индивидууму в начальной дозе 3 мг/кг в течение 30 минут с последующим внутривенным введением CTLA-4-блокирующего средства в течение 30 минут в тот же день, каждые три недели всего в четырех дозах, затем ниволумаб вводят внутривенно в фиксированной дозе 240 мг каждые две недели в течение 30 минут или 480 мг каждые четыре недели в течение 30 минут.

В конкретных вариантах осуществления PD-1-блокирующее средство является пембролизумабом или эффекторно-молчащим вариантом пембролизумаба, который вводят взрослому индивидууму внутривенно в дозе 200 мг в течение 30 минут каждые три недели по мере необходимости или ребенку внутривенно в дозе 2 мг/кг максимально до приблизительно 200 мг в течение 30 минут каждые три недели, где после каждого введения вводят дозу CTLA-4-блокирующего средства, где каждую дозу CTLA-4-блокирующего средства вводят внутривенно после введения PD-1-блокирующего средства с той же длительностью лечения, что и PD-1-блокирующее средство, или длительностью, меньшей или большей, чем длительность в случае PD-1-блокирующего средства.

В конкретных вариантах осуществления PD-1-блокирующее средство является пембролизумабом или эффекторно-молчащим вариантом пембролизумаба, который вводят взрослому индивидууму внутривенно в дозе 400 мг в течение 30 минут каждые шесть недель по мере необходимости, где после каждого введения вводят дозу CTLA-4-блокирующего средства, где каждую дозу CTLA-4-блокирующего средства вводят внутривенно после введения PD-1-блокирующего средства с той же длительностью лечения, что и PD-1-блокирующее средство, или длительностью, меньшей или большей, чем длительность в случае PD-1-блокирующего средства.

В конкретном варианте осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство является цемиплимабом-rwlc или эффекторно-молчащим вариантом цемиплимаба-rwlc, который вводят индивидууму внутривенно в дозе 350 мг в течение 30 минут каждые три недели по мере необходимости, где каждую дозу CTLA-4-блокирующего средства вводят внутривенно после введения PD-1-блокирующего средства с той же длительностью лечения, что и PD-1-блокирующее средство, или длительностью, меньшей или большей, чем длительность в случае PD-1-блокирующего средства. В конкретном варианте осуществления цемиплимаб-rwlc или эффекторно-молчащий вариант цемиплимаба-rwlc вводят внутривенно индивидууму в начальной дозе 350 мг в течение 30 минут с последующим введением CTLA-4-блокирующего средства в течение 30 минут в тот же день каждые три недели по мере необходимости.

В конкретном варианте осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство является атезолизумабом или эффекторно-молчащим вариантом атезолизумаба, который вводят индивидууму внутривенно в дозе 1200 мг в течение 60 минут каждые три недели по мере необходимости, где каждую дозу CTLA-4-блокирующего средства вводят внутривенно после введения PD-1-блокирующего средства с той же длительностью лечения, что и PD-1-блокирующее средство, или длительностью, меньшей или большей, чем длительность в случае PD-1-блокирующего средства. В конкретном варианте осуществления атезолизумаб или эффекторно-молчащий вариант атезолизумаба вводят внутривенно индивидууму в начальной дозе 1200 мг в течение 60 минут с последующим введением CTLA-4-блокирующего средства в течение 30 минут в тот же день каждые три недели по мере необходимости.

В конкретном варианте осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство является авелумабом или эффекторно-молчащим вариантом авелумаба, который вводят индивидууму внутривенно в дозе 10 мг/кг или 800 мг в течение 60 минут каждые две недели по мере необходимости, и где каждую дозу CTLA-4-блокирующего средства вводят внутривенно после введения PD-1-блокирующего средства с той же длительностью лечения, что и PD-1-блокирующее средство, или длительностью, меньшей или большей, чем длительность в случае PD-1-блокирующего средства. В конкретном варианте осуществления авелумаб или эффекторно-молчащий вариант авелумаба вводят внутривенно индивидууму в начальной дозе 10 мг/кг или 800 мг в течение 60 минут с последующим введением CTLA-4-блокирующего средства в течение 30 минут в тот же день каждые две недели по мере необходимости.

В конкретном варианте осуществления комбинированного лечения PD-1-блокирующее средство является дурвалумабом или эффекторно-молчащим вариантом дурвалумаба, который вводят индивидууму внутривенно в дозе 10 мг/кг в течение 60 минут каждые две недели по мере необходимости, и где каждую дозу CTLA-4-блокирующего средства вводят внутривенно после введения PD-1-блокирующего средства с той же длительностью лечения, что и PD-1-блокирующее средство, или длительностью, меньшей или большей, чем длительность в случае PD-1-блокирующего средства. В конкретном варианте осуществления дурвалумаб или эффекторно-молчащий вариант дурвалумаба вводят внутривенно индивидууму в начальной дозе 10 мг/кг в течение 60 минут с последующим введением CTLA-4-блокирующего средства в течение 30 минут в тот же день каждые две недели по мере необходимости.

Хотя одобренные в настоящее время CTLA-4-блокирующие средства и PD-1-блокирующие средства предоставляют в составах с концентрацией, делающей возможным внутривенное введение индивидууму в течение от 30 до 60 минут, в способах комбинированного лечения по настоящему изобретению предусмотрены варианты осуществления, в которых каждое из CTLA-4-блокирующего средства и/или PD-1-блокирующего средства предоставляют в составах в концентрации, позволяющей вводить каждый из них раздельно индивидууму в одной инъекции. Возможность введения по меньшей мере одного из двух блокирующих средств в одной инъекции будет значительно снижать время введения индивидууму обоих блокирующих средств.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинированному лечению, в котором CTL-4-блокирующее средство и PD-1-блокирующее средство вводят совместно одновременно. Совместное введение можно осуществлять, предоставляя CTLA-4- и PD-1-блокирующие средства в отдельных составах и одновременно вводя каждый состав индивидууму посредством отдельных IV введений, или смешивания смеси перед введением IV индивидууму, или отдельной инъекции каждого состава индивидууму. Совместное введение также можно осуществлять посредством предоставления CTLA-4- и PD-1-блокирующих средств в одном составе, который затем вводят индивидууму посредством IV введения или одной инъекции.

(i) Комбинированное лечение

Комбинированное лечение по настоящему изобретению можно использовать для лечения любого пролиферативного заболевания, в частности, лечения злокачественного новообразования. В конкретных вариантах осуществления комбинированное лечение по настоящему изобретению можно использовать для лечения меланомы, немелкоклеточного рака легких, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака молочной железы, желудочно-кишечного злокачественного новообразования, множественной миеломы, печеночно-клеточного рака, неходжкинской лимфомы, рака почки, лимфомы Ходжкина, мезотелиомы, рака яичников, мелкоклеточного рака легких, рака пищевода, рака анального канала, рака желчных протоков, колоректального рака, рака шейки матки, рака щитовидной железы или рака слюнных желез.

В другом варианте осуществления комбинированное лечение по настоящему изобретению можно использовать для лечения рака поджелудочной железы, рака бронхов, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичников, рака мочевого пузыря, злокачественного новообразования головного мозга или центральной нервной системы, злокачественного новообразования периферической нервной системы, рака матки или эндометрия, рака полости рта или глотки, рака печени, рака почки, рака яичка, рака желчных протоков, рака тонкого кишечника или аппендикса, рака надпочечника, остеосаркомы, хондросаркомы или злокачественного новообразования кроветворных тканей.

Находящиеся в настоящее время на рынке PD-1-блокирующие средства одобрены FDA США для лечения по меньшей мере одного или более злокачественных новообразований, выбранных из меланомы (метастатической или нерезектабельной), первичной медиастинальной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (PMBCL), уротелиальной карциномы, MSIHC, рака желудка, рака шейки матки, печеночноклеточной карциномы (HCC), карциномы из клеток Меркеля (MCC), почечноклеточной карциномы (включая поздние стадии) и плоскоклеточной карциномы кожи. Таким образом, комбинированное лечение по настоящему изобретению можно использовать для лечения по меньшей мере одного или более злокачественных новообразований, выбранных из меланомы (метастатической или нерезектабельной), первичной медиастинальной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (PMBCL), уротелиальной карциномы, MSIHC, рака желудка, рака шейки матки, печеночноклеточной карциномы (HCC), карциномы из клеток Меркеля (MCC), почечноклеточной карциномы (включая поздние стадии) и плоскоклеточной карциномы кожи.

(j) Комбинированное лечение в комбинации с химиотерапией

Комбинированное лечение по настоящему изобретению можно вводить индивидууму, имеющему злокачественное новообразование, в комбинации с химиотерапией. Индивидуума можно подвергать химиотерапии одновременно с комбинированным лечением по настоящему изобретению. Индивидуума можно подвергать комбинированному лечению по настоящему изобретению после завершения химиотерапии. Индивидуума можно подвергать химиотерапии после завершения комбинированного лечения. Комбинированное лечение по настоящему изобретению также можно вводить индивидууму, имеющему рецидивирующее или метастатическое злокачественное новообразование с прогрессированием заболевания или рецидивирующее злокачественное новообразование, которого подвергают химиотерапии или завершившего химиотерапии.

Химиотерапия может включать химиотерапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из

(i) алкилирующих средств, включающих, в качестве неограничивающих примеров, бифункциональные алкиляторы, циклофосфамид, мехлоретамин, хлорамбуцил и мелфалан;

(ii) монофункциональных алкиляторов, включающих, в качестве неограничивающих примеров, дакарбазин, нитрозомочевину и темозоломид (пероральный дакарбазин);

(iii) антрациклинов, включающих, в качестве неограничивающих примеров, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон и валрубицин;

(iv) разрушителей цитоскелета (таксаны), включающих, в качестве неограничивающих примеров, паклитаксел, доцетаксел, абраксан и таксотер;

(v) эпотилонов, включающих, в качестве неограничивающих примеров, иксабепилон и утиделон;

(vi) ингибиторы гистоновых деацетилаз, включающих, в качестве неограничивающих примеров, вориностат и ромидепсин;

(vii) ингибиторов топоизомеразы I, включающих, в качестве неограничивающих примеров, иринотекан и топотекан;

(viii) ингибиторов топоизомеразы II, включающих, в качестве неограничивающих примеров, этопозид, тенипозид и тафлупозид;

(ix) ингибиторов киназ, включающих, в качестве неограничивающих примеров, бортезомиб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, вемурафениб и висмодегиб;

(x) аналогов нуклеотидов и их предшественников, включающих, в качестве неограничивающих примеров, азацитидин, азатиоприн, фторпиримидины (например, такие как капецитабин, кармофур, доксифлуридин, фторурацил, и тегафур), цитарабин, гемцитабин, гидроксимочевину, меркаптопурин, метотрексат и тиогуанин;

(xi) пептидных антибиотиков, включающих, в качестве неограничивающих примеров, блеомицин и актиномицин; средства на основе платины, включая, в качестве неограничивающих примеров, карбоплатин, цисплатин и оксалиплатин;

(xii) ретиноидов, включающих, в качестве неограничивающих примеров, третиноин, алитретиноин и бексаротен; и

(xiii) алкалоидов барвинка и их производных, включающих, в качестве неограничивающих примеров, винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин.

Выбор дозы химиотерапевтического средства для химиотерапии зависит от нескольких факторов, включая скорость оборота вещества в сыворотке или ткани, уровень симптомов, иммуногенность вещества и доступность целевых клеток, ткани или органа в организме индивидуума, подвергаемого лечению. Доза дополнительного терапевтического средства должна представлять собой количество, обеспечивающее приемлемый уровень побочных эффектов. Таким образом, доза и частота введения каждого дополнительного терапевтического средства будут зависеть частично от конкретного терапевтического средства, тяжести злокачественного новообразования, подвергаемого лечению, и характеристик пациента. Доступны руководства по выбору подходящих доз антител, цитокинов и низкомолекулярных соединений. См., например, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348: 601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341: 1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344: 783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342: 613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348: 24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343: 1594-1602; Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57^th Ed); Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57^th edition (november 2002). Определение подходящей схемы введения может проводить клиницист, например, с использованием параметров или факторов, которые, как известно или как предполагают в этой области, влияют на лечение или, как предполагают, влияют на лечение, и будут зависеть, например, от анамнеза пациента (например, предшествующей терапии), типа и стадии злокачественного новообразования, подлежащего лечению, и биомаркеров ответа на одно или более терапевтических средств в комбинированном лечении.

Например, пембролизумаб одобрен в настоящее время FDA США для комбинированного лечения (i) немелкоклеточного рака легких (NSCLC), включающего пембролизумаб с пеметрекседом и химиотерапии соединениями платины или карбоплатином и паклитакселом или наб-паклитакселом; и (ii) плоскоклеточного рака головы и шеи (HNSCC), включающего пембролизумаб и химиотерапию соединениями платины, и атезолизумаб одобрен в настоящее время для комбинированного лечения NSCLC, включающего бевацизумаб (антитело против VEGF-A, продаваемое под торговым названием AVASTIN), паклитаксел и карбоплатин.

Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены варианты осуществления комбинированного лечения по настоящему изобретению, дополнительно включающие стадию химиотерапии, включающей химиотерапию соединениями платины, пеметрексед и химиотерапию соединениями платины или карбоплатин и паклитаксел или наб-паклитаксел. В конкретных вариантах осуществления комбинированное лечение со стадией химиотерапии можно использовать для лечения, по меньшей мере, NSCLC и HNSCC.

Комбинированное лечение, дополнительно в комбинации со стадией химиотерапии, можно использовать для лечения любого пролиферативного заболевания, в частности, лечения злокачественного новообразования. В конкретных вариантах осуществления комбинированное лечение по настоящему изобретению можно использовать для лечения меланомы, немелкоклеточного рака легких, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака молочной железы, желудочно-кишечного злокачественного новообразования, множественной миеломы, печеночно-клеточного рака, неходжкинской лимфомы, рака почки, лимфомы Ходжкина, мезотелиомы, рака яичников, мелкоклеточного рака легких, рака пищевода, рака анального канала, рака желчных протоков, колоректального рака, рака шейки матки, рака щитовидной железы или рака слюнных желез.

В другом варианте осуществления комбинированное лечение, дополнительно в комбинации со стадией химиотерапии, можно использовать для лечения рака поджелудочной железы, рака бронхов, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичников, рака мочевого пузыря, злокачественного новообразования головного мозга или центральной нервной системы, злокачественного новообразования периферической нервной системы, рака матки или эндометрия, рака полости рта или глотки, рака печени, рака почки, рака яичка, рака желчных протоков, рака тонкого кишечника или аппендикса, рака надпочечника, остеосаркомы, хондросаркомы или злокачественного новообразования кроветворных тканей.

В конкретных вариантах осуществления комбинированное лечение со стадией химиотерапии можно использовать для лечения одного или более злокачественных новообразований, выбранных из меланомы (метастатической или нерезектабельной), первичной медиастинальной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (PMBCL), уротелиальной карциномы, MSIHC, рака желудка, рака шейки матки, печеночноклеточной карциномы (HCC), карциномы из клеток Меркеля (MCC), почечноклеточной карциномы (включая поздние стадии) и плоскоклеточной карциномы кожи.

Следующие примеры приведены для лучшего понимания настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

Функция Fc необходима для индуцирования irAE с воспалением кишечника

irAE с воспалением кишечника наблюдают у пациентов со злокачественными новообразованиями во время иммунотерапии с использованием монотерапии антителом против CTLA-4 или его комбинации с антителом против PD-1. Доклинические исследования мышей с дефицитом CTLA-4 в моделях конститутивного и условного нокаута показали развитие выраженного иммуноопосредованного воспалительного заболевания во множестве органов. Однако не показано, что лечение в сингенных моделях опухолей с использованием суррогатных антител против CTLA-4 индуцирует явные irAE, являющиеся прогностическими для токсичности, наблюдаемой у пациентов со злокачественными новообразованиями. Аналогично, гистопатологическую оценку воспаления кишечника осуществляли в сингенной или ксенотрансплантационной модели CT26 (мыши, инокулированные линией клеток карциномы толстого кишечника CT26). Мышам, несущим опухоли CT26, вводили Fc-компетентное mAb против CTLA-4 мыши 9D9-mIgG2a (антитело против CTLA4) (q4×4), что приводило к минимальному гранулоцитарному инфильтрату (степень 1 из 5), наблюдаемому в тканях собственной пластинки кишечника. Не наблюдали гранулоцитарных инфильтратов в когортах, которым вводили Fc-мутантное mAb против mCTLA-4 9D9-mIgG1-D265A (антитело против CTLA-4 (D265A)), ISVD против mCTLA-4 с меньшим Fc F894 (nAb против CTLA-4) или изотипические контроли. Однако не наблюдали сопутствующего изъязвления или другого повреждения ткани.

У Fc-мутантного антитела против CTLA-4 (D265A) отсутствует измеримая аффинность к рецепторам Fcγ (Nimmerjahn et al., Immunity, 23: 41-51 (2005)) и, таким образом, отсутствует Fc-эффекторная функция. У мышей противоопухолевая эффективность монотерапии mAb против CTLA4 мыши зависит от способности антитела опосредовать истощение внутриопухолевых регуляторных T-клеток с помощью эффекторной функции Fc (Selby et al., в цитируемом источнике). В связи с этим, не ожидали, что nAb против CTLA-4 и антитело против CTLA-4 (D265A) будут иметь благоприятный противоопухолевый эффект при монотерапии.

Минимальные результаты гистопатологического анализа побудили авторов настоящего изобретения оценить профили экспрессии генов в качестве потенциально более чувствительных средств для детекции маркеров активации воспалительных клеток в кишечнике. Авторы настоящего изобретения использовали панель экспрессии генов, которую они ранее разработали для протеомного анализа и определения профиля экспрессии генов, ассоциированных с воспаление кишечника, в образцах кала и биоптатах при воспалительном заболевании кишечника (IBD) в доклинических моделях и у пациентов (Cayatte, C, et. al., Clinical and Translational Gastroenterology, 3: e10 (2012)).

Профили экспрессии генов измеряли в образцах ткани тонкого кишечника и толстого кишечника в различные моменты времени после начала лечения антителом против CTLA-4 и сравнивали с антителом против CTLA-4 (D265A) для специфической оценки роли функции Fc в индуцировании воспаления кишечника. Как показано на фиг. 1A, экспрессия многочисленных воспалительных генов кишечника подвергалась положительной регуляции в образцах проксимальных отделов тонкого кишечника мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, но не мышей, которым вводили антитело против CTLA-4 (D265A). Результаты свидетельствовали о том, что манифестации воспалительных путей кишечника можно определять по экспрессии генов в тканях тонкого кишечника и толстого кишечника в субклинических условиях.

Положительная регуляция генов, ассоциированных с воспалением кишечника, позволила оценить эффект длительного введения в отношении прогрессирования до клинического энтероколита, наблюдаемого у пациентов, которым вводят ипилимумаб, после лечения в течение 6-7 недель или более (Samaan et al., Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 15: 222-234 (2018)). Для оценки относительных эффектов блокады CTLA-4 и функции Fc в отношении воспаления кишечника и прогрессирования до энтероколита мышам BALB/c дважды в неделю вводили антитело против CTLA-4, антитело против CTLA-4 (D265A). Двум группам мышей вводили Fc-компетентное антитело против CTLA-4, одной группе мышей с опухолями CT26 и одной группе наивных мышей BALB/c без опухолей, для оценки потенциального влияния роста опухоли и индуцирования опухолевого иммунитета на индуцирование воспаления кишечника. Массу тела и баллы состояния организма оценивали дважды в неделю на всем протяжении длительного лечения для мониторинга прогрессирования до энтероколита.

Масса тела продолжала повышаться до дня 50 у мышей, которым вводили изотипические антитела и антитело против CTLA-4 (D265A). В отличие от этого, у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, наблюдали снижение средней массы тела через приблизительно 35-40 дней (фиг. 1B). Кишечная проницаемость повышалась в обеих группах, которым вводили антитело против CTLA-4, но не у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4 (D265A), что оценивали на мышах, которым через желудочный зонд вводили FITC-декстран в день 49 и 50 (фиг. 1C). Гистологические признаки воспаления в проксимальных отделах тонкого кишечника и толстом кишечнике, оцениваемые патологом (L.A), свидетельствовали о прогрессировании до умеренного и тяжелого энтероколита в группах, которым вводили антитело против CTLA-4 (фиг. 1D и Фиг. 1E), при этом наблюдали обширную инфильтрацию иммунными клетками, утолщение слизистой оболочки и утрату бокаловидных клеток клетки. В отличие от этого, не наблюдали энтероколит у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4 (D265A), что является доказательством того, что функция Fc необходима для индуцируемого блокадой CTLA-4 энтероколита. Примечательно, что рост опухоли и противоопухолевые ответы не были необходимыми для индуцируемого антителом против CTLA-4 воспаления кишечника.

Ранее было показано, что антитела против CTLA-4 с сильной функцией FcγR необходимы для сильных противоопухолевых ответов при монотерапии в экспериментах, в которых сравнивали химерные антитела IgG2a мыши с высокой аффинностью к FcγR с мутантными химерами IgG1 без детектируемого связывания FcγR (Selby et al., Cancer Immunol. Res. 1: 32-42 (2013)). Очевидно, специфическое истощение T_reg-клеток в опухоли играет ключевую роль при монотерапии антителами против CTLA-4 на остове IgG2a мыши (mIgG2a) (Simpson et al., J. Exp. Med. 210: 1695-710 (2013). Недавние статьи, в которых показана важность CD28 для эффективности против PD-1 (см. ссылки), позволили авторам настоящего изобретения предположить, что повышение функции CD28 посредством блокирования более сильного взаимодействия CTLA-4 с лигандами CD80 и CD86 с использованием антагониста CTLA-4 может обеспечивать высокую комбинированную противоопухолевую эффективность без необходимости истощения T_reg-TIL. ISVD, специфические для CTLA-4 мыши (mCTLA-4), способные ингибировать связывание с CD80 и CD86, разрабатывали с использованием однодоменного фрагмента антитела VHH, полученного их антител Верблюжьих, состоящих только из тяжелых цепей. У этих небольших белков массой 15 кДа отсутствуют Fc-области, и, таким образом, они не связываются с FcγR. Для сравнения с полностью Fc-функциональным антителом авторы настоящего изобретения использовали антитело против CTLA-4, как показано ранее, имеющее сильную противоопухолевую эффективность при монотерапии (см. ссылки). Для рассмотрения потенциальных эффектов связывания разных эпитопов CTLA-4 авторы настоящего изобретения использовали антитело против CTLA-4 (D265A), у которого отсутствует детектируемая аффинность к FcγR, для изучения необходимости сильной функции FcγR для противоопухолевой эффективности и переносимости.

nAb против CTLA-4 состояло из двух доменов VHH против CTLA-4, связанных с 35GS-линкером и доменом VHH против альбумина человека в качестве субъединицы для увеличения времени полужизни (HLE) (см. SEQ ID NO: 61). VHH против CTLA-4 имел 96% ингибирования для CD80 и CD86 по сравнению с антителом против CTLA-4, которое использовали в качестве референсного антагониста (100%) (фиг. 2A и фиг. 2B). nAb против CTLA-4 дополнительно сравнивали с антителом против CTLA-4 и эффекторно-молчащим антителом против CTLA-4 (D265A) в биологическом анализе in vitro на основе MLR на способность повышать ответы с пролиферацией (фиг. 2C), продукцией ИФНγ (фиг. 2D) и ИЛ-2 (фиг. 2E).

Функция Fc в случае блокады CTLA-4 не является необходимой для комбинированной иммунотерапии PD-1

Относительную противоопухолевую эффективность, индуцируемую посредством монотерапии тремя антагонистами CTLA-4 и комбинированного лечения с использованием антитела против PD-1 мыши mDX400 (антитела против PD-1) оценивали посредством измерения изменения объема опухоли с течением времени в сингенной модели карциномы толстого кишечника CT26 (фиг. 3A-3E), лишь умеренно отвечающей на монотерапию против PD-1. Не наблюдали противоопухолевой активности в когортах монотерапии, которым вводили nAb против CTLA-4 или антитело против CTLA-4 (D265A) и которые сравнивали с изотипическими контролями (группа 1 на фиг. 3A). Высокую противоопухолевую активность монотерапии наблюдали у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, что соответствует предшествующим данным, свидетельствовавшим о необходимости функции Fc в антителах против CTLA-4 для противоопухолевой эффективности монотерапии в сингенных моделях опухолей на мышах (Simpson et al., J. Exp. Med. 210: 1695-710 (2013)) (группа 2 на фиг. 3A), и лечение антителом против PD-1 в отдельности обеспечивало низкое и умеренное ингибирование роста опухоли по сравнению с антителом против CTLA-4. Однако, комбинированное лечение с использованием nAb против CTLA-4 или антителом против CTLA-4 (D265A) с антителом против PD-1 обеспечивало сильный противоопухолевый благоприятный эффект, сравнимый с наблюдаемым в случае антитела против CTLA-4 в отдельности или антитела против CTLA-4 в комбинации с антителом против PD-1 (группа 2 на фиг. 3A). nAb против CTLA-4 и антитело против CTLA-4 (D265A) связывают отдельные эпитопы на CTLA-4, таким образом, эффект не является специфическим для эпитопа. Дополнительные доказательства устойчивого комбинированного благоприятного эффекта, независящего от функции Fc, были очевидны, т.к. схожие противоопухолевые ответы наблюдали при комбинированном лечении антителом против PD-1 в случае nAb против CTLA-4, антитела против CTLA-4 (D265A) и антитела против CTLA-4. На фиг. 3D показаны отдельные результаты для каждой из 10 мышей, обобщенные на фиг. 3A. Экспансию CD8⁺ T-клеток и повышенные соотношения CD8⁺ T-клеток/T_reg-клеток наблюдали у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, и мышей, которым вводили комбинацию антитела против CTLA-4 (D265S), и мышей, которым вводили антитело против PD-1, по сравнению с мышами, которым вводили антитело против CTLA-4 (D265S) в отдельности (фиг. 3B). Эти результаты свидетельствуют о том, что антагонисты CTLA-4, у которых отсутствует функция Fc, в комбинации с антагонистом PD-1 обеспечивали противоопухолевую эффективность, превосходящую эффективность, достигаемую с использованием монотерапии антагонистом PD-1, и обеспечивали противоопухолевую эффективность в комбинации, схожую по эффекту с противоопухолевой эффективностью антител против CTLA-4 с функцией Fc при монотерапии.

Авторы настоящего изобретения исследовали регуляцию генов иммунного ответа, ассоциированных с эффективной иммунотерапией злокачественных новообразований, в опухолях на девятый день после начала лечения для выявления потенциальных комплементарных механизмов, ассоциированных с высокой комбинированной активностью. ПЦР-профилирование экспрессии опухолей у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, показало сильную положительную регуляцию многочисленных генов, ассоциированных с эффективной иммунотерапией (фиг. 3C), включая ИФНγ, ИФН-чувствительные гены, хемокины, провоспалительные цитокины и MHC. Наблюдали лишь умеренную положительную регуляцию в опухолях у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4 (D265A), что свидетельствует о том, что сильная положительная регуляция, наблюдаемая в опухолях мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, по меньшей мере частично зависела от функции Fc. Также наблюдали умеренные ответы в опухолях у мышей, которым вводили nAb против CTLA-4 и антитело против PD-1. В отличие от этого, наблюдали устойчивую положительную регуляцию генов иммунного ответа в опухолях в когортах комбинированного лечения, которым вводили nAb против CTLA-4 или антитело против CTLA-4 (D265A) с антителом против PD-1. На фиг. 3D показано, что ни nAb против CTLA-4, ни антитело против CTLA-4 (D265A) не имели противоопухолевой активности в отсутствие блокады PD-1. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что комплементарные механизмы абсолютной блокады CTLA-4 и блокады PD-1 могут обеспечивать сильный комбинированный положительный эффект, независящий от Fc.

Блокада CTLA-4 без функции Fc в комбинации с антителом против PD-1 обеспечивает достижение лучшего терапевтического индекса

Характерной особенностью блокады иммунных контрольных точек является клинически валидированный комбинированный благоприятный эффект антитела против PD-1 и антитела против CTLA-4, приводящий к лучшей клинической эффективности по сравнению с направленным воздействием на пути контрольных точек по отдельности. Однако иммуноопосредованная токсичность (irAE), ассоциированная с комбинированным лечением с блокадой CTLA-4 с антителом против PD-1, ассоциирована с повышенным индуцированием воспаления кишечника у пациентов (Ribas & WO lchok, Science 359: 1350-1355 (2018)). Кроме того, для антитела против CTLA-4 (D265A) и nAb против CTLA-4 с меньшим Fc необходима комбинация с антителом против PD-1, чтобы индуцировать сильный противоопухолевый иммунитет. Для рассмотрения потенциальных эффектов сильного противоопухолевого иммунитета в отношении индуцирования воспаления кишечника авторы настоящего изобретения исследовали профили экспрессии при воспалении кишечника у мышей, подвергаемых комбинированному лечению с использованием антитела против PD-1 с антителом против CTLA-4, антителом против CTLA-4 (D265A) или nAb против CTLA-4, после пяти введений, в день 18 после начала лечения (фиг. 4D).

Для оценки относительных эффектов блокады CTLA-4 и функции Fc в отношении воспаления кишечника наивным мышам BALB/c дважды в неделю вводили антитело против CTLA-4, антитело против CTLA-4 (D265A), nAb против CTLA4 с меньшим Fc, антитело против PD-1 или комбинации антитела против PD-1 с различными антагонистами mCTLA4. Массу тела и баллы состояния организма оценивали дважды в неделю на всем протяжении исследования. Масса тела мышей во всех группах повышалась до приблизительно дня 20 (фиг. 4A). Масса тела продолжала расти до дня 50 у мышей, которым вводили изотипическое антитело, антитело против CTLA-4 (D265A), nAb против CTLA4 или антитело против PD-1 или их комбинации. У мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, наблюдали снижение средней массы тела после приблизительно дня 30 приблизительно до уровней до лечения ко дню 50. Введение антитела против CTLA-4 в комбинации с антителом против PD-1 приводило к более быстрому снижению средней массы тела ниже уровней до лечения со дня 20 до дня 50. Примечательно, что у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, баллы состояния организма у 2 из 8 мышей снижались до 2 (неудовлетворительно), начиная со дня 42 и начиная со дня 28 у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4 в комбинации с антителом против PD-1. В этих когортах у животных наблюдали лоснящуюся, неряшливую шерсть и опухший живот.

Анализ воспаления был запланирован через семь недель введения, когда у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, наблюдали потерю массы тела за период времени, усиливающуюся при введении в комбинации с антителом против PD-1 (группа B на фиг. 4A). В отличие от этого, ни одно из эффекторно-молчащих CTLA-4-блокирующих средств или антитела против PD-1 не демонстрировало какую-либо значимую потерю массы по сравнению с изотипическими контролями в течение периода времени (группа A на фиг. 4B).

Всех мышей из групп комбинированного лечения и четырех мышей из групп изотипического контроля и введения антитела против PD-1 умерщвляли в день 50 для сбора тканей. Четырех оставшихся мышей из групп изотипического контроля и введения антитела против PD-1 и всех мышей из групп монотерапии умерщвляли в день 54 для сбора тканей. Во время некропсии проксимальные отделы тонкого кишечника и толстый кишечник удаляли для RT-qPCR для определения экспрессии воспалительных генов и оценки воспаления посредством гистопатологического анализа.

Тепловая карта экспрессии генов в проксимальных отделах тонкого кишечника из каждой группы лечения относительно изотипического контроля приведена на фиг. 4D. Введения антитела против CTLA-4 было достаточно для индуцирования положительной регуляции воспалительных генов в тощей кишки (фиг. 4D) и толстом кишечнике (фиг. 4E). Комбинация антитела против CTLA-4 с антителом против PD-1 индуцировала даже более сильную положительную регуляцию воспалительных генов, чем монотерапия антителом против CTLA-4. В отличие от этого, введение nAb против CTLA-4 индуцировало небольшую экспрессию воспалительных генов в кишечнике или не индуцировало ее, а также индуцировало лишь умеренную положительную регуляцию при комбинировании с антителом против PD-1. Аналогично, введение антитела против CTLA-4 (D265A) в отдельности или в комбинации с антителом против PD-1 приводило к минимальному и низкому индуцированию воспалительных генов. Проницаемость кишечника, оцениваемая в сыворотке после введения FITC-декстрана с помощью желудочного зонда, значимо повышалась у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, и мышей, которых подвергали комбинированному лечению антителом против CTLA-4 и антителом против PD-1.

Тяжесть воспаления в проксимальных отделах тонкого кишечника подвергали балльной оценке посредством гистологического анализа энтерита в проксимальных отделах тощей кишки в день 50. По результатам гистопатологической оценки введение антитела против CTLA-4 приводило к воспалению от слабого до тяжелого у большинства мышей. В когортах, которым вводили комбинацию антитела против CTLA-4 и антитела против PD-1, длительное лечение индуцировало воспаление от умеренного до очень тяжелого у всех мышей (фиг. 4B). У мышей с очень тяжелым энтеритом наблюдали еюнит, диффузные нейтрофильные очаги с умеренным количеством тучных клеток и дегенерацией нейронов мейсснерова сплетения. В отличие от этого, введение nAb против CTLA-4 или антитела против CTLA-4 (D265A) не индуцировало воспаление при гистопатологической оценке. Введение nAb против CTLA-4 в комбинации с антителом против PD-1 приводило к отсутствию воспаления или минимальному или слабому воспалению у нескольких мышей. Введение антитела против CTLA-4 (D265A) в комбинации с антителом против PD-1 приводило к слабому воспалению только у одной из восьми мышей. На типичных микрофотографиях показан относительный уровень воспаления в каждой группе лечения (фиг. 4C).

Как показано на фиг. 5A-5C, эффекторная функция Fc антитела против CTLA-4 запускает воспаление кожи (фиг. 5A), но не системное воспаление, т.к. не наблюдали детектируемого воспаления в почках, печени или легких (фиг. 5C). Абсолютное количество ИЛ-17-продуцирующих T-клеток, Foxp3⁺ T_reg-клеток и нейтрофилов кожи уха измеряли посредством проточной цитометрии. Как показано на фиг. 5B, повышенные уровни ИЛ-17-продуцирующих T-клеток, Foxp3⁺ T_reg-клеток и нейтрофилов наблюдали в коже уха мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, но не антитело против CTLA-4 (D265A). В совокупности, эти данные подтверждают ключевую роль эффекторной функции Fc в индуцировании воспаления кишечника антителами против CTLA-4 мыши, имеющими эффекторную функцию. Эффекторная функция Fc вносила вклад в индуцируемое антителом против CTLA-4 мыши воспаление кишечника в модели энтероколита на мышах BALB/c, в то время как воспаление кишечника является слабым или отсутствует у мышей, которым вводили nAb против CTLA-4, или мышей, которым вводили антитело против CTLA-4 (D265A).

В совокупности, два признака были ассоциированы с индуцированием воспаления кишечника в модели опухоли CT26 под действием антитела против CTLA-4. Во-первых, необходима специфичность к CTLA-4, т.к. Fc-функциональные изотипические контроли не вызывали экспрессию генов, ассоциированных с воспаление. Однако блокирования связывания CTLA-4 с лигандами CD80/CD86 было недостаточно для индуцирования положительной регуляции воспалительных генов в кишечнике у мышей, которым вводили nAb против CTLA-4 и антитело против CTLA-4 (D265A). Таким образом, высокая активность функции Fc, имеющаяся у изоформы IgG2a в антителе против CTLA-4, необходима для индуцирования воспаления кишечника.

Активация воспаления кишечника инициирована активацией T_eff-клеток независимо от истощения T_reg-клеток

Механизм действия (MOA) опосредованного антителами против CTLA-4 противоопухолевого иммунитета теоретически опосредован фармакодинамическими (PD) эффектами в отношении популяций регуляторных T-клеток (T_reg), а также эффекторных T-клеток (T_eff) (CTL, T_H1-клеток и т.д.). Истощение T_reg-клеток в микроокружении опухоли (TIL) является характерным MOA антител против CTLA-4 в сингенных моделях опухолей на мышах (Simpson et al., в цитируемом источнике). Кроме того, совместное вовлечение Fc-FcγR под действием mAb против CTLA-4 модулирует передачу сигнала T-клеточного рецептора (TCR) и CD28, что приводит к повышенной активации T-клеток, независимо от истощения T_reg-клеток (Waight et al., Cancer cell, 33: 1033-1047 (2018)).

Для характеризации дифференциальных эффектов антитела против CTLA-4 и nAb против CTLA-4 в отношении T_reg-клеток и эффекторных T-клеток осуществляли проточную цитометрию популяций T-клеток из опухоли (TIL), собственной пластинки толстого кишечника, крови и селезенки через 20 часов после подкожного введения. Авторы настоящего изобретения могли измерять уровни экспрессии CTLA-4 в T_reg-клетках мышей, которым вводили антитело против CTLA-4 или антитело против CTLA-4 (D265A), используя клон UC10-4B9 mAb против CTLA-4 (ThermoFisher), т.к. оно не приводит к перекрестному блокированию, что позволяет окрашивать связанный с лекарственным средством CTLA-4. Как и описано в литературе (Selby et al. в цитируемом источнике, Simpson et al. в цитируемом источнике), авторы настоящего изобретения наблюдали дифференциальную экспрессию CTLA-4 в T_reg-клетках в селезенке (CTLA-4^lo) и микроокружении опухоли (T_reg^hi) у мышей, несущих опухоль CT26. T_reg-клетки в PBMC экспрессировали бимодальные уровни CTLA-4^lo-mid. Примечательно, что T_reg-клетки из собственной пластинки толстого кишечника экспрессировали бимодальные уровни CTLA-4^mid-hi. CTLA-4^hi T_reg-клетки в толстом кишечнике экспрессировали уровни, схожие с популяциями T_reg-TIL. Дифференциальные уровни экспрессии CTLA-4 на различных популяциях T-клеток влияют на активность ADCC-опосредованного истощения из-за зависящих от плотности рецепторов механизмов уничтожения. Хотя популяции T_reg-клеток в норме экспрессируют более высокие уровни CTLA-4, T_reg-клетки в окружении опухоли экспрессируют гораздо более высокие уровни (в 3,3 раза более высокие, MFI=8100 в T_reg-TIL в случае изотипических контролей), чем обнаруживаемые в селезенке (MFI=2400). T_reg-клетки собственной пластинки толстого кишечника, экспрессирующие более высокие уровни CTLA-4 (MFI CTLA-4^hi=10000), напоминали T_reg-TIL по относительным уровням экспрессии при использовании проточной цитометрии (фиг. 6A). Как показано на фиг. 6B-6D, значительное истощение T_reg-клеток было ограничено TIL из микроокружения опухоли мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, имевших наибольшую плотность экспрессии CTLA-4. Введение Fc-мутантного антитела против CTLA-4 (D265A), у которого отсутствует функция Fc, не приводило к истощению T_reg-клеток.

Основываясь только на предположении, что клетки, экспрессирующие более высокие уровни CTLA-4, были предрасположены к истощению под действием антитела против CTLA-4, авторы настоящего изобретения прогнозировали, что CTLA-4^hi T_reg-клетки в собственной пластинке будут истощены, аналогично популяциям T_reg-TIL. Неожиданно, только T_reg-клетки TIL, выделенные из опухолей мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, по-видимому, были истощены. Полученные из собственной пластинки T_reg-клетки толстого кишечника мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, не выглядели истощенными. Не наблюдали детектируемого истощения полученных из собственной пластинки T_reg-клеток толстого кишечника мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, что позволяет предполагать, что индуцирование воспаления кишечника не инициировалось утратой T_reg-клеток в слизистой оболочке кишечника.

Авторы настоящего изобретения исследовали возможные фенотипические изменения в T_reg-клетках, выполняющих супрессорную функцию, которые могут вносить вклад в индуцируемое антителом против CTLA-4 воспаление кишечника. T_reg-клетки собственная пластинка (LP) толстого кишечника FoxP3 GLD-репортерных мышей с имплантированной опухолью MC38 подвергали сортировке для ПЦР-профилирования экспрессии генов, ассоциированных с функцией T_reg-клеток (фиг. 7A). Однако не наблюдали значимых различий экспрессии генов в T_reg-клетках LP мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, и мышей, которым вводили антитело против CTLA-4 (D265A). Потенциальный эффект функции Fc в отношении T_reg-клеток дополнительно исследовали с использованием модели колита с переносом CD45RB^hi T-клеток. Пассивный перенос T_reg-клеток с CD45RB^hi T-клетками защищал мышей от развития колита (фиг. 7B-7C). Лечение мышей, которым вводили T_reg-клетки совместно с CD45RB^hi T-клетками, антителом против CTLA-4 приводило к утрате защиты T_reg-клетками и развитию колита. В отличие от этого, утрату защиты не наблюдали у мышей, которым вводили nAb против CTLA-4 (фиг. 7B-7C). Профиль экспрессии генов в сортированных посредством проточной цитометрии Foxp3⁺ T_reg-клетках толстого кишечника мышей через 24 часа после введения свидетельствовал о значимой положительной регуляции экспрессии генов у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, что схоже с наблюдаемым в случае CD45RB^high, по сравнению с экспрессией генов, наблюдаемой в случае клеток, полученных из мышей, которым вводили nAb против CTLA-4 или изотипические контроли. В совокупности, эти результаты позволяют предполагать, что Fc-опосредованное истощение T_reg-клеток не является необходимым для индуцирования воспаления кишечника под действием антитела против CTLA-4, но регуляторную функцию T_reg-клеток в ответ на воспаление кишечника можно модулировать.

Ограниченная экспрессия CTLA-4 и CD28 на T-клетках и CD80, CD86 и FcγR на антигенпрезентирующих клетках может играть ключевую роль в опосредованной Fc-функциональным nAb против CTLA-4 активации T-клеток, независящей от истощения T_reg-клеток (Waight et. al., Cancer cell, 33: 1033-1047, 2018). Fc-усиленная активация в опухолях является предпочтительной, но может вносить вклад в незапланированные irAE в тканях кишечника. Авторы настоящего изобретения исследовали потенциальный вклад функции Fc в активацию эффекторных иммунных клеток в тканях кишечника. Проточный цитометрический анализ экспрессии CD16/32 на макрофагах из опухоли и толстого кишечника показал значимо более высокий уровень FcR на антигенпрезентирующих клетках по сравнению с макрофагами селезенки (фиг. 8A и 8B). Кроме того, доля CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺ макрофагов в опухоли и собственной пластинке толстого кишечника была значимо выше, чем в селезенке (фиг. 8C). Функция Fc была необходима для активации цитокиновых ответов ИЛ-1β, ФНОα и ИФНγ в тканях кишечника, что было очевидным уже через 10 дней после начала лечения, задолго до появления явных признаков воспаления кишечника, что позволяет предполагать ее ключевую роль в индуцировании irAE (фиг. 8C).

При цитокиновых ответах в CD4⁺ T-клетках, выделенных из собственной пластинки толстого кишечника мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, после одного месяца лечения наблюдали более высокую долю ИЛ-17-, ФНОα- и ИФНγ-продуцирующих клеток, ассоциированных с Fc-опосредованным воспалением кишечника (фиг. 8E). Кроме того, Fc-зависимое повышение нейтрофилов также наблюдали у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4 (фиг. 8E). В совокупности, результаты свидетельствуют о том, что ассоциированное с блокадой CTLA-4 воспаление кишечника индуцировалось Fc-опосредованной активацией эффекторных клеток, усиленной повышением под действием FcγR-антитела образования клеточных мостиков между APC и T-клетками, приводящим к стимуляции воспалительных цитокиновых ответов, как показано на фиг. 11. Fc-опосредованное индуцирование воспаления кишечника может быть вызвано эффекторными T-клетками независимо от истощения T_reg-клеток.

Обсуждение

В нескольких недавних статьях подтверждена ключевая роль функции Fc в монотерапии с блокадой CTLA-4 в сингенных моделях иммунотерапии опухолей на мышах (международная патентная заявка № WO 2014/089113; Selby et al., Cancer Immunol. Res. 32-42 (2013); Vargas et al., Cancer cell, 33: 649-663 (2018)). В Ingram et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115: 3912-3917, (2018) описано, что для обеспечения ISVD против CTLA-4 противоопухолевой эффективностью необходимо слияние Fc-домена с ISVD. Фактически, авторы настоящего изобретения наблюдали схожее отсутствие эффективности при таргетинге опухолей с помощью nAb против CTLA-4 или антитела против CTLA-4 (D265A) в виде монотерапии. Показано, что специфическое истощение инфильтрирующих опухоль T_reg-клеток, экспрессирующих более высокие уровни CTLA-4 на своей поверхности, вносит вклад в противоопухолевую эффективность в моделях опухолей (Simpson et al., J. Exp. Med., 210: 1695-1710 (2013); Selby et al., Cancer Immunol. Res1: 32-42 (2013).

Индуцирование энтероколита антителом против CTLA-4 не было ассоциировано с детектируемым истощением T_reg-клеток-резидентов в собственной пластинке. Авторы настоящего изобретения исследовали потенциал блокады CTLA-4 в противоопухолевом лечении посредством демонстрации высокой противоопухолевой активности при комбинировании с антителами против PD-1 без индуцирования сильного воспаления кишечника. Функция Fc не требовалась для достижения комбинированного благоприятного эффекта в случае блокад CTLA-4 и PD-1. Комбинированное лечение, включающее nAb против CTLA-4 или антитело против CTLA-4 (D265A) с антителом против PD-1, индуцировало схожую активацию ИФНγ-ассоциированных генов иммунного ответа в опухолях, с индуцируемой антителом против CTLA-4, имеющим выраженную функцию Fc. В отличие от этого, сильное воспаление кишечника, прогрессирующее до энтероколита, главным образом, наблюдали у мышей, которым вводили антитело против CTLA-4, и оно повышалось при комбинировании с антителом против PD-1 mDX400. Эти результаты свидетельствуют о том, что простой блокады CTLA-4, облегчающей активацию CD28, достаточно для повышения противоопухолевых ответов истощенных T-клеток при комбинировании с блокадой PD-1.

В статье Kamphorst et al. in Science 355: 1423-1427 (2017) показано, что для спасения истощенных CD8⁺ T-клеток при блокаде PD-1 необходима костимуляция CD28 при активации TCR. Кроме того, в сопутствующей статье Hui et.al. in Science 355: 1428-1433 (2017) показано, что корецептор CD28 является более предпочтительным, чем TCR, в качестве мишени дефосфорилирования PD-1-рекрутированной фосфатазой Shp2, и что CD28 преимущественно дефосфорилирован. Результаты, полученные авторами настоящего изобретения, свидетельствуют о том, что комплементарной активации корецептора TCR CD28, опосредованной простым блокированием CTLA-4 антителами против CTLA-4 без функции Fc, и блокады PD-1-опосредованного дефосфорилирования CD28 может быть достаточно для достижения комбинированного благоприятного эффекта при иммунотерапии злокачественных новообразований. Преимущество простой комбинированной блокады без Fc-опосредованной повышенной активации посредством образования мостиков Fc-FcγR может заключаться в том, что она делает возможным больший терапевтический индекс, что делает возможными большие диапазоны доз и большее время лечения. Это преимущество также может способствовать созданию дополнительных комбинаций с химиотерапевтическими стандартами лечения из-за более низкого риска irAE с воспалением кишечника.

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

Мыши

Мышей C57BL/6J дикого типа получали в Jackson Laboratories. Мышей Balb/c и CB17-SCID дикого типа получали в Taconic. Мышей B6.Foxp3GDL (GFP-DTR-люцифераза) получали и держали в специальных непатогенных условиях в микроизоляторах с фильтруемым воздухом в виварии Merck Research Laboratories (MRL) в Palo Alto, California. Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных MRL в соответствии с руководствами Международной ассоциации оценки и аккредитации лабораторных исследований на животных.

Инокуляция опухолевого материала и лечение

Для экспериментов на сингенных опухолях использовали модели опухолей CT26, MC38 и MB49. 8 Мышам Balb/c или C57BL/6J возрастом 8-12 недель подкожно (s.c.) в бок инъецировали 3×10⁵ клеток CT26. Диаметр опухоли измеряли с помощью электронного калипера и вычисляли объем опухоли с помощью уравнения длина × ширина × ширина × 1/2. Лечение начинали, когда опухоли достигали приблизительно 100 мм³. Мышам дважды в неделю подкожно (s.c.) вводили антитело против CTLA-4, антитело против CTLA-4 (D265A), антитело мыши против IgG1-D265A изотипического контроля, антитело мыши против IgG2a изотипического контроля, антитела против PD-1 в дозе 10 мг/кг. Мышам дважды в неделю вводили s.c. nAb против CTLA-4 или контрольный ISVD в дозе 30 мг/кг.

Антитело против CTLA-4 содержит HC, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 58, и LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59.

Антитело против CTLA-4 (D265A) содержит HC, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 60, и LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60.

Антитело против PD-1 содержит HC, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 63, и LC, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

nAb против CTLA-4 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 61.

ISVD против PD-1 F037 (nAb против PD-1) содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 62.

Индуцирование колита и воспаления кожи

Наивным мышам Balb/c возрастом 8-12 недель дважды в неделю s.c. в течение восьми недель вводили антитело против CTLA-4, антитело против CTLA-4 (D265A), антитело мыши против IgG1-D265A изотипический контроль, антитело мыши против IgG2a изотипического контроля в дозе 20 мг/кг. Мышам дважды в неделю s.c. вводили nAb против CTLA-4 или контрольный ISVD в дозе 30 мг/кг. В день 55 собирали плазму для анализов ELISA и Luminex. Органы собирали и обрабатывали следующим образом: 1) фиксировали 10% нейтральным забуференным формалином и окрашивали погруженные в парафин тканевые срезы гематоксилином и эозином для оценки патологии тканей; 2) быстро замораживали в жидком азоте для дальнейшего выделения РНК; или 3) помещали в HBSS для выделения клеток.

Вызываемый T-клетками колит

Клетки селезенки мышей Balb/c обрабатывали и очищали по CD4 посредством разделения с помощью магнитных частиц (Stem Cell Technologies). TCRb⁺CD4⁺CD25^-CD45RB^high T-клетки (CD45RB^high T-клетки) и TCRb⁺CD4⁺CD25⁺CD45RB^low (T_reg-клетки) сортировали с помощью FACS Aria (BD). 3×10⁵ CD45RB^high T-клеток и 1×10⁵ T_reg-клеток инъецировали внутривенно. Мышам i.p. дважды в неделю вводили 350 мкг антитела против CTLA-4 или изотипического контроля или 600 мкг nAb против CTLA-4 или контрольного ISVD. Мышей подвергали мониторингу и взвешивали в течение семи недель после инъекции.

Кишечная проницаемость

Мышам с помощью желудочного зонда вводили FITC-декстран (4 кДа, Sigma-Aldrich) за четыре часа до измерения флуоресценции FITC в сыворотке.

Выделение собственной пластинки толстого кишечника, кожи и опухолевых клеток

Клетки собственной пластинки толстого кишечника выделяли, сначала удаляя эпителиальные клетки посредством инкубации фрагментов ткани кишечника размером 0,5 см в забуференном растворе Хенкса, содержащем 5 мМ ЭДТА и 10 мМ HEPES, в течение 20 минут при 37°C, а затем повторяя эту инкубацию еще раз. Оставшуюся ткань нарезали на небольшие фрагменты, а затем расщепляли с помощью 1-кратной среды HBSS, содержащей 0,250 мг/мл либеразы (Roche), 30 ед./мл ДНКазы I (Sigma-Aldrich) и диспазы (Corning), в тех же условиях. Полученную суспензию клеток наслаивали на градиент 40%/80% PERCOLL и центрифугировали в течение 10 минут при 600×g; клетки LP выделяли с поверхности раздела.

Кожу уха измельчали и расщепляли 1-кратной средой HBSS, содержащей 0,250 мг/мл либеразы (Roche), 30 ед./мл ДНКазы I (Sigma-Aldrich) и диспазы (Corning) в течение 90 минут при 37°C. Суспензию клеток фильтровали и дважды промывали 1-кратным буфером HBSS. Опухоли измельчали и расщепляли 1-кратной средой HBSS, содержащей 0,250 мг/мл либеразы (Roche), 30 ед./мл ДНКазы I (Sigma-Aldrich) и диспазы (Corning) в течение 30 минут при 37°C. Суспензию клеток фильтровали и дважды промывали 1-кратным буфером HBSS.

Гистологические препараты толстого кишечника, кожи уха, печени, легких, почек фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение ночи, переносили в 70% этанол, обрабатывали общепринятым образом, заключали в парафин, получали срезы толщиной 4-5 мкм, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Патолог оценивал образцы толстого кишечника в слепом режиме по тяжести заболевания в соответствии с тремя критериями: воспаление: при наличии, оно отличается инфильтрацией большим количеством (60-70%) мононуклеарных клеток (макрофагов и лимфоцитов) и 30-40% нейтрофилов и палочкоядерных гранулоцитов. Балльная оценка воспаления включает тяжесть инфильтрации, утрату желез, эрозию, дилатацию просвета желез, наличие абсцессов крипт и дегенерацию эпителиальных клеток. Воспаление оценивали по шкале 0-4, 0=отрицательно; 1=минимальное, 2=слабое; 3=умеренное; 4=тяжелое. Апоптоз: распространение апоптотических телец оценивали по шкале 0-3, 0=отрицательно; 1=низкое, 2=умеренное; 3=высокое. Регенерация: Оцениваемые регенеративные изменения включают балльную оценку распространения митотических фигур в верхней трети слизистой оболочки, ядерную плотность (скученность ядер) в отдельных железистых структурах, регулярность поверхностного эпителия. Апоптоз оценивали по шкале 0-3, 0=отрицательно; 1=низкий, 2=умеренный; 3=высокий.

Проточная цитометрия и антитела

Клетки ресуспендировали в PBS и окрашивали на льду в течение 30 минут в темноте с помощью красителя Fixable Viability Stain (BD Bioscience). Затем клетки ресуспендировали в буфере для окрашивания (FBS, BD Bioscience) и окрашивали на льду в течение 30 минут с использованием различных комбинаций напрямую конъюгированных с флуорохромом антител. В случае внутриклеточных антигенов поверхностно окрашенные клетки пермеабилизовали, фиксировали с помощью набора буферов для окрашивания Foxp3 (eBiosciences) в течение 30 минут на льду, а затем окрашивали с помощью специфических антител. Антитела мыши: CD45 (30-F11), CD8a (53-6,7), CTLA-4 (UC10-4B9), CD11c (HL3), CD11b (M1/70), TCRβ (H57-597), TCRγδ (GL3), CD4 (RM4-5 или GK1,5), CD25 (PC61), CD45RB (16A), Ly6G (1A8), F4/80 (T45-2342), CD16/32 (2,4G2), ИФНγ (XMG1.2), ИЛ-17A (TC11-18H10), ФНОα (MP6-XT22), Foxp3 (FJK-16s). Все антитела приобретали в BD Biosciences, Biolegend или eBioscience. Для всех образцов данные получали с помощью проточного цитометра LSR II (BD). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FLOWJO (Tree Star).

Если продукцию цитокинов измеряли посредством проточной цитометрии, клетки стимулировали 500 нг/мл иономицина, 50 нг/мл PMA (Sigma-Aldrich). Через час добавляли брефелдин A (BD Bioscience) еще на два часа перед окрашиванием.

Анализ аллогенной смешанной лейкоцитарной реакции (MLR) мыши

2×10⁵ T-клеток селезенки мыши C57B6/J (возрастом 8-12 недель, самки) выделяли с использованием набора для выделения T-клеток EASYSEPMouse (STEMCELL) и сокультивировали с 1×10⁵ облученных (2000 рад) спленоцитов мыши Balb/c в присутствии указанной концентрации антитела против CTLA-4, антитела против CTLA-4 (D265A), nAb против CTLA-4 или изотипических контролей. В день три супернатант собирали и измеряли продукцию ИЛ-2 и ИФН-гамма посредством ELISA по инструкциям производителя (Meso Scale Discovery). Затем в клетки вводили [³H]-тимидин (1 мкКи на лунку) в течение шести часов или 16-18 часов. Клетки собирали на фильтры из стекловолокна с использованием харвестера. Фильтры подсчитывали с помощью счетчика MicroBeta (PerkinElmer Microbeta 2450) по инструкциям производителя.

Выделение тотальной РНК из тканей и клеток и последующий анализ экспрессии генов с использованием платформы Fluidigm BIOMARK.

Для анализа посредством ПЦР в реальном времени тотальную РНК выделяли любым из двух способов. Органы гомогенизировали в RNA STAT-60 (Tel-Test Inc., FriendsWO od, TX) с помощью гомогенизатора Polytron, а затем осуществляли выделение РНК с помощью MagMAX-96 для набора Microarrays (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) по инструкциям производителя. В случае образцов клеток РНК выделяли с использованием набора для выделения РНК ARCTURUS PICOPURE по инструкциям производителя (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA).

Обработанную ДНКазой тотальную РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора QUANTITECT Reverse Transcription (Qiagen, Valencia, CA) по инструкциям производителя. Праймеры приобретали в ThermoFisher Scientific (Foster City, CA). Гено-специфическую предварительную амплификацию осуществляли с помощью по меньшей мере 2 нг кДНК по инструкциям производителя к Fluidigm BIOMARK (Fluidigm, Foster City). Затем осуществляли количественную ПЦР в реальном времени с помощью Fluidigm BIOMARK с использованием двух немеченых праймеров по 900 нМ каждого, 250 нМ меченого FAM зонда (ThermoFisher Scientific, Foster City, CA) и универсального мастер-микса для ПЦР TAQMAN, содержащего UNG. Образцы и праймеры использовали в формате 48×48 или 96×96 по инструкциям производителя (Fluidigm, Foster City). Уровни убиквитина измеряли в отдельной реакции и использовали их для нормализации данных способом ΔCt (с использованием среднего значения порогового цикла для убиквитина и интересующего гена для каждого образца, для получения нормализованных значений использовали уравнение 1,8^(Ct убиквитина минус Ct интересующего гена) × 10⁴). Референсные последовательности праймеров доступны по запросу.

Статистический анализ

Для вычисления статистической значимости в остальной части настоящего исследования использовали двухсторонний парный и непарный t-критерий Стьюдента. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. Статистический анализ осуществляли с использованием программного обеспечения GraphPad PRISM 7.

ПРИМЕР 2

Противоопухолевую эффективность nAb против CTLA-4 оценивали в сингенной модели опухоли MB49 на мышах. Клетки MB49 представляют собой линию клеток уротелиальной карциномы, полученную из взрослой мыши C57BL/6 посредством подвергания первичных эксплантатов клеток эпителия мочевого пузыря воздействию 7,12-диметилбенз[a]антрацена (DMBA) в течение 24 часов с последующим длительным культивированием. Сингенную модель рака мочевого пузыря на мышах широко используют в течение более чем 35 лет.

Клетки рака мочевого пузыря мыши MB49 имплантировали подкожно (s.c.) 80 мышам и приписывали животных к пяти группам лечения по 10 мышей в каждой. Когда медиана начального объема опухоли достигала 103 мм³, мышам делали инъекцию s.c. один раз каждые четыре дня всего в четырех дозах. Неродственный контрольный ISVD (30 мг/кг, лот №01AQL) и 5 мг/кг mAb mIgG1 изотипического контроля (лот №64AIS) вводили в качестве контроля лечения. Лечение включало 30 мг/кг nAb против CTLA-4, 10 мг/кг Fc-компетентного антитела против CTLA-4 (D265A), 5 мг/кг антитела против PD-1 или комбинаций нацеленных на CTLA4 средств и антитела против PD-1. Рост опухоли подвергали мониторингу в течение 21 дня после начала лечения.

На фиг. 9A показаны объемы опухолей отдельных животных в каждой группе лечения. Полные ответы (CR) до дня 21 представлены для групп отвечающих на лечение. На фиг. 9B показан средний объем опухоли и стандартная ошибка среднего для каждой группы лечения (начальное количество n=10/группу). Объемы опухолей у животных, которых исключали из исследования из-за больших объемов опухолей, переносили в среднее значение до проведения последнего измерения в этой группе лечения. На фиг. 9A-9B показано, что, как и в модели опухоли толстого кишечника CT26 (см. фиг. 3A), модели опухоли мочевого пузыря MB49 и моделях опухоли толстого кишечника MC38, комбинированное лечение с использованием nAb против CTLA-4 с меньшим Fc с антителом против PD-1 обеспечивало сильный противоопухолевый благоприятный эффект, независящий от функции Fc.

ПРИМЕР 3

Противоопухолевую эффективность nAb против CTLA-4 оценивали в сингенной модели опухоли MC38 на мышах. Клетки рака толстого кишечника мышь MC38 имплантировали SC 80 мышам и приписывали животных к пяти группам лечения по 10 мышей в каждом. Когда медиана начального объема опухоли достигала 246 мм³, мышам делали инъекцию SC один раз каждые четыре дня всего в четырех дозах. Неродственный контрольный ISVD (30 мг/кг) и 5 мг/кг mAb mIgG1 изотипического контроля вводили в качестве контроля лечения. Лечение включало 30 мг/кг nAb против CTLA-4, 10 мг/кг Fc-компетентного антитела против CTLA-4 (D265A), 5 мг/кг антитела против PD-1 или комбинаций нацеленных на CTLA4 средств и антитела против PD-1. Рост опухоли подвергали мониторингу в течение 23 дней после начала лечения.

На фиг. 10A показаны объемы опухолей отдельных животных для каждой группы лечения. Полные ответы (CR) до дня 23 представлены для групп отвечающих на лечение. На фиг. 10B показан средний объем опухоли и стандартная ошибка среднего для каждой группы лечения (начальное количество n=10/группу). Объемы опухолей у животных, которых исключали из исследования из-за больших объемов опухолей, переносили в среднее значение до проведения последнего измерения в этой группе лечения. На фиг. 10A-10B показано, что, как и в модели опухоли толстого кишечника CT26 (см. фиг. 3A), модели опухоли мочевого пузыря MB49 и моделях опухоли толстого кишечника MC38, комбинированное лечение с использованием nAb против CTLA-4 с меньшим Fc с антителом против PD-1 обеспечивало сильный противоопухолевый благоприятный эффект, независящий от функции Fc.

Последовательности

Таблица последовательностей
(все положения аминокислот идентифицированы с использованием нумерации Eu) SEQ ID NO: Описание Последовательность 1 LC-CDR1 ипилимумаба RASQSVGSSYLA 2 LC-CDR2 ипилимумаба GAFSRAT 3 LC-CDR3 ипилимумаба QQYGSSPWT 4 HC-CDR1 ипилимумаба SYTMH 5 HC-CDR2 ипилимумаба FISYDGNNKYYADSVKG 6 HC-CDR3 ипилимумаба TGWLGPFDY 7 VH ипилимумаба QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS 8 VL ипилимумаба EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK 9 LC-CDR1 тремелимумаба RASQSVGSSYLA 10 LC-CDR2 тремелимумаба GAFSRAT 11 LC-CDR3 тремелимумаба QQYGSSPWT 12 HC-CDR1 тремелимумаба SYGMH 13 HC-CDR2 тремелимумаба ISYDGNNKYYADSVKG 14 HC-CDR3 тремелимумаба YGSSP 15 VH тремелимумаба GVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLLQMNSLRAETAVYYCARDPRGATLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS 16 VL тремелимумаба PSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIK 17 HC-CDR1 ниволумаба NSGMH 18 HC-CDR2 ниволумаба VIWYDGSKRY YADSVKG 19 HC-CDR3 ниволумаба NDDY 20 LC-CDR1 ниволумаба RASQSVSSYLA 21 LC-CDR2 ниволумаба DASNRAT 22 LC-CDR3 ниволумаба QQSSNWPRT 23 VH ниволумаба QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS 24 VL ниволумаба EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK 25 HC ниволумаба(IgG4 S228P) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 26 LC ниволумаба EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 27 HC пембролизумаба (IgG4 S228P) QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 28 LC пембролизумаба EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 29 VH пембролизумаба QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS 30 VL пембролизумаба EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK 31 HC-CDR1 пембролизумаба GYTFTNYYMY 32 HC-CDR2 пембролизумаба NPSNGGTNFNEKFKN 33 HC-CDR3 пембролизумаба RDYRFDMGFDY 34 LC-CDR1 пембролизумаба RASKGVSTSGYSYLH 35 LC-CDR2 пембролизумаба LASYLES 36 LC-CDR3 пембролизумаба CQHSRDLPLT 37 Константный домен HC IgG1 человека ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 38 Константный домен HC IgG1 человека (L234A L235A D265S) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 39 Константный домен HC IgG1 человека (L234A L235A P329G) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 40 Константный домен HC IgG1 человека (L235E) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 41 Константный домен HC IgG1 человека (D265A) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 42 Константный домен HC IgG1 человека (D265A N297G) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 43 Константный домен HC IgG1 человека (E233A/L235A) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPALAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 44 Константный домен HC IgG1 человека (N297X, где X является любой аминокислотой, иной, чем N) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYXSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 45 Константный домен HC IgG2 человека ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 46 Константный домен HC IgG2 человека (D265S) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 47 Константный домен HC IgG2 человека (P329G) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 48 Константный домен HC IgG2 человека (D265A) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 49 Константный домен HC IgG2 человека (D265A N297G) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFGSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 50 Константный домен HC IgG2 человека (N297X, где X является любой аминокислотой, иной, чем N) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFXSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 51 Константный домен HC IgG2 человека (V234A G237A P238S H268A V309L A330S P331S X378S/A)(см. IgGsigma SEQ ID NO: 78 в WO 2017079112) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIXVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 52 Константный домен HC IgG4 человека (S228P) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 53 Константный домен HC IgG4 человека (S228P P329G) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 54 Константный домен HC IgG4 человека (S228P D265A) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 55 Константный домен HC IgG4 человека (S228P D265A N297G) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 56 Константный домен HC IgG4 человека (S228P N297X, где X является любой аминокислотой, иной, чем N) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFXSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 57 Константный домен LC каппа человека RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 58 HC IgG2 мыши против CTLA-4 (модифицированное x [CTLA-4_M] mAb мыши (9D9 Balb/c (Igh-1a) гаплотип- основной аллель) IgG2a/каппа-тяжелая цепь)) EAKLQESGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARYYGSWFAYWGQGTLITVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 59 LC каппа антитела мыши против CTLA-4 (12AIL_9D9_LC) DIVMTQTTLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 60 HC антитела мыши против CTLA-4 (D265A) (мышь x [CTLA-4_M] mAb (9D9 мутация D265A) IgG1/каппа-тяжелая цепь) EAKLQESGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARYYGSWFAYWGQGTLITVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK 61 ISVD мыши против CTLA-4 (54BBI_Llama x [CTLA4_M] [ALB_H] VHH (F023700894) (PI)) EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTPSINYMGWYRQAPGKQREFVATIRSGGATNYADSVKGRFTISRDNTKNTVYLQMNSLKPEDTAVYDCYTGGGGYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTPSINYMGWYRQAPGKQREFVATIRSGGATNYADSVKGRFTISRDNTKNTVYLQMNSLKPEDTAVYDCYTGGGGYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS 62 ISVD мыши против PD-1
PF023700037 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTHTMGWFRQGPGKEREFVATINRLDYTYYANSVRGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCAADSERRLGVIPGLYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSRLAMGWFRQAPGKEREFVASISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASREYSGSYYYGLTLYEYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS 63 HC клона DX400 антитела мыши против PD-1 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNSGLAWVRQAPEKGLEWVATITYNGTSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTATYYCARWVPGSGNFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK 64 LC клона DX400 антитела мыши против PD-1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVTISRYTLMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLASGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEDDAATYYCQQSRESPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 65 Остатки после LC-CDR3
X является любой аминокислотой FGXG 66 Остатки перед HC-CDR1 X является любой аминокислотой CXXX 67 Остатки перед HC-CDR2 LEWIG 68 Остатки после HC-CDR3
X является любой аминокислотой WGXG 69 CDR-1 ISVD против CTLA-4 FYGMG 70 CDR-2 ISVD против CTLA-4 DIRTSAGRTTYADSVKG 71 CDR-3 ISVD против CTLA-4 EMSGISGWDY 72 CDR-3 варианта ISVD против CTLA-4 EPSGISGWDY 73 VH 8D2/8D2 (RE) EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDNWMNWVRQSPEKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRGEDMGIYYCTAQFAYWGQGTLVTVSA 74 VL 8D2/8D2 (RE) DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGTSENIYGGLNWYQRKQGKSPQLLIFGATNLADGMSSRFSGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYYCQNVLRSPFTFGSGTKLEI 75 VH 8D2/8D2 RE
ВАРИАНТ 1 M18I EVKLDETGGGLVQPGRPIKLSCVASGFTFSDNWMNWVRQSPEKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRGEDMGIYYCTAQFAYWGQGTLVTVSA 76 VL 8D2/8D2 RE
ВАРИАНТ 1 M18I DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGTSENIYGGLNWYQRKQGKSPQLLIFGATNLADGMSSRFSGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYYCQNVLRSPFTFGSGTKLEI 77 VH 8D2H1L1 EVQLVESGGGLVQPGGSMRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAPGKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS 78 VL 8D2H1L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKQGKSPKLLIYGATNLASGMSSRFSGSGSGTDYTLKISSLHPDDVATYYCQNVLRSPFTFGSGTKLEIK 79 VH 8D2H1L1
ВАРИАНТ 1 M18I EVQLVESGGGLVQPGGSIRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAPGKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS 80 VL 8D2H1L1
ВАРИАНТ 1 M18I DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKQGKSPKLLIYGATNLASGMSSRFSGSGSGTDYTLKISSLHPDDVATYYCQNVLRSPFTFGSGTKLEIK 81 VH 8D2H2L2 EVQLVESGGGLVQPGGSMRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAPGKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS 82 VL 8D2H2L2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYGATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNVLRSPFTFGSGTKLEIK 83 VH 8D2H2L2
ВАРИАНТ 1 M18I EVQLVESGGGLVQPGGSIRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAPGKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS 84 VL 8D2H2L2
ВАРИАНТ 1 M18I DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYGATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNVLRSPFTFGSGTKLEIK 85 VH 8D3H3L3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAPGKGLEWVAQIRNKPYNYETEYAASVKGRFTISRDDSKNSAYLQMNSLKTEDTAVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS 86 VL 8D3H3L3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYGGLNWYQQKPGKAPKLLIYGATSLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQNVLRSPFTFGSGTKLEIK 87 VH 8D2H2L15 EVQLVESGGGLVQPGGSMRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAPGKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS 88 VL 8D2H2L15 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYGATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNVLSRHPGFGSGTKLEIK 89 VH 8D2H2L15
ВАРИАНТ 1 M18I EVQLVESGGGLVQPGGSIRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAPGKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS 90 VL 8D2H2L15
ВАРИАНТ 1 M18I DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYGATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNVLSRHPGFGSGTKLEIK 91 VH 8D2H2L17 EVQLVESGGGLVQPGGSMRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAPGKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS 92 VL 8D2H2L17 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYGATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNVLSSRPGFGSGTKLEIK 93 VH 8D2H2L17
ВАРИАНТ 1 M18I EVQLVESGGGLVQPGGSIRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAPGKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS 94 VL 8D2H2L17
ВАРИАНТ 1 M18I DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYGATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNVLSSRPGFGSGTKLEIK 95 VH REGN4659
W02019023482 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYEMSWVRQAPGKGLEWVSSIRTSGTTKYYADSMKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGGTFLHYWGQGTLVTVSS 96 VL REGN4659 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIASYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQTGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPMYTFGQGTKLEIK 97 VH AGEN1884w EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGLMGPFDIWGQGTMVTVSS 98 VL AGEN1884w EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLGWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTITRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK 99 VH цемиплимаба-rwlc EVQLLESGGVLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMTWVRQAPGKGLEWVSGISGGGRDTYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKGEDTAVYYCVKWGNIYFDYWGQGTLVTVSS 100 VL цемиплимаба-rwlc DIQMTQSPSSLSASVGDSITITCRASLSINTFLNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLHGGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRTLQPEDFATYYCQQSSNTPFTFGPGTVVDFR 101 HC цемиплимаба-rwlc (S228P) EVQLLESGGVLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMTWVRQAPGKGLEWVSGISGGGRDTYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKGEDTAVYYCVKWGNIYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 102 LC цемиплимаба-rwlc DIQMTQSPSSLSASVGDSITITCRASLSINTFLNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLHGGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRTLQPEDFATYYCQQSSNTPFTFGPGTVVDFRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 103 VH дурвалумаба EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS 104 VL дурвалумаба EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK 105 VH авелумаба QAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS 106 VL авелумаба QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL 107 VH атезолизумаба EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS 108 VL атезолизумаба DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK 109 HC дурвалумаба (IgG1 L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 110 LC дурвалумаба EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 111 HC авелумаба (IgG1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 112 LC авелумаба QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 113 HC атезолизумаба (IgG1 N297A/D235E/L358M) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 114 LC атезолизумаба DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 115 Константный домен HC IgG1 человека (N297A/D356E/L358M) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 116 Константный домен HC IgG1 человека (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 117 Константный домен лямбда LC человека GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Замененные аминокислоты показаны полужирным шрифтом.
Константные домены HC и LC указаны курсивом.

Ссылки

Azuma et al., B70 antigen is a second ligand for CTLA-4 and CD28. Nature. 1993 Nov 4; 366(6450): 76-9.

Collins et al., The interaction properties of costimulatory molecules revisited. Immunity. 2002 Aug; 17(2): 201-10.

Hui et al., T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 2017 Mar 31; 355(6332): 1428-1433.

Ingram et al., Anti-CTLA-4 therapy requires an Fc domain for efficacy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Apr 10; 115(15): 3912-3917.

Kamphorst et al., Rescue of exhausted CD8 T cells by PD-1-targeted therapies is CD28-dependent. Science. 2017 Mar 31; 355(6332): 1423-1427.

et al., Reformatting Rituximab into Human IgG2 and IgG4 Isotypes Dramatically Improves Apoptosis Induction In Vitro. PLoS One. 2015 Dec 29; 10(12): e0145633.

Lanier et al., CD80 (B7) and CD86 (B70) provide similar costimulatory signals for T cell proliferation, cytokine production, and generation of CTL. J Immunol. 1995 Jan 1; 154(1): 97-105.

Leach et al., Enhancement of antitumor immunity by CTLA-4 blockade. Science. 1996 Mar 22; 271(5256): 1734-6.

Pai et al., Tumor-conditional anti-CTLA4 uncouples antitumor efficacy from immunotherapy-relatedtoxicity. J Clin Invest. 2019 Jan 2; 129(1): 349-363.

Ribas & WO lchok, Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 2018 Mar 23; 359(6382): 1350-1355.

Schneider-Merck et al., Human IgG2 antibodies against epidermal growth factor receptor effectively trigger antibody-dependent cellular cytotoxicity but, in contrast to IgG1, only by cells of myeloid lineage. J Immunol. 2010 Jan 1; 184(1): 512-20.

Selby et al., Anti-CTLA-4 antibodies of IgG2a isotype enhance antitumor activity through reduction of intratumoral regulatory T cells. Cancer Immunol Res. 2013 Jul; 1(1): 32-42.

Sharma et al., Anti-CTLA-4 Immunotherapy Does Not Deplete FOXP3+ Regulatory T Cells (Tregs) in Human Cancers. Clin Cancer Res. 2018 Jul 27.

Simpson et al., Fc-dependent depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells co-defines the efficacy of anti-CTLA-4 therapy against melanoma. J Exp Med. 2013 Aug 26; 210(9): 1695-710.

& Foltz, Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Lab Anim Sci. 1999 Jun; 49(3): 319-23.

Vargas et al., Fc Effector Function Contributes to the Activity of Human Anti-CTLA-4 Antibodies. Cancer Cell. 2018 Apr 9; 33(4): 649-663.e4.

Waight et al., Selective FcγR Co-engagement on APCs Modulates the Activity of Therapeutic Antibodies Targeting T Cell Antigens. Cancer Cell. 2018 Jun 11; 33(6): 1033-1047.e5.

Хотя настоящее изобретение представлено в настоящем описании со ссылкой на иллюстрированные варианты осуществления, следует понимать, что изобретение ими не ограничено. Специалистам в этой области с учетом идей, изложенных в настоящем описании, будут понятны дополнительные модификации и варианты осуществления в объеме настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение ограничено только формулой изобретения, прилагаемой к настоящему описанию.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Merck Sharp & Dohme Corp

LaFace, Drake

Punnonen, Juha

Bowman, Edward

Bauche, David

Chackerian, Alissa

Grein, Jeffery

Mauze, Smita

Sawant, Anandi

Annamalai, Laksmanan

<120> СПОСОБЫ КОМБИНИРОВАННОГО ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ,

ВКЛЮЧАЮЩИЕ СРЕДСТВА, БЛОКИРУЮЩИЕ CTLA-4 И PD-1

<130> 24702

<150> 62/817,749

<151> 2019-03-13

<160> 117

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR1 ипилимумаба

<400> 1

Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR2 ипилимумаба

<400> 2

Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR3 ипилимумаба

<400> 3

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR1 ипилимумаба

<400> 4

Ser Tyr Thr Met His

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR2 ипилимумаба

<400> 5

Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR3 ипилимумаба

<400> 6

Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 7

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH ипилимумаба

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL ипилимумаба

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR1 тремелимумаба

<400> 9

Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR2 тремелимумаба

<400> 10

Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR3 тремелимумаба

<400> 11

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 12

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR1 тремелимумаба

<400> 12

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 13

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR2 тремелимумаба

<400> 13

Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 14

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR3 тремелимумаба

<400> 14

Tyr Gly Ser Ser Pro

1 5

<210> 15

<211> 114

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH тремелимумаба

<400> 15

Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

1 5 10 15

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro

20 25 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn

35 40 45

Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

50 55 60

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Thr

65 70 75 80

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr

85 90 95

Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 16

<211> 100

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL тремелимумаба

<400> 16

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

1 5 10 15

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys

20 25 30

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

50 55 60

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys

85 90 95

Val Glu Ile Lys

100

<210> 17

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR1 ниволумаба

<400> 17

Asn Ser Gly Met His

1 5

<210> 18

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR2 ниволумаба

<400> 18

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 19

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR3 ниволумаба

<400> 19

Asn Asp Asp Tyr

1

<210> 20

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR1 ниволумаба

<400> 20

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 21

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR2 ниволумаба

<400> 21

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR3 ниволумаба

<400> 22

Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr

1 5

<210> 23

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH ниволумаба

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 24

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL ниволумаба

<400> 24

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 25

<211> 440

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC ниволумаба (IgG4 S228P)

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 26

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC ниволумаба

<400> 26

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 27

<211> 447

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC пембролизумаба (IgG4 S228P)

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 28

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC пембролизумаба

<400> 28

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 29

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH пембролизумаба

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL пембролизумаба

<400> 30

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 31

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR1 пембролизумаба

<400> 31

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr

1 5 10

<210> 32

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR2 пембролизумаба

<400> 32

Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn

1 5 10 15

<210> 33

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC-CDR3 пембролизумаба

<400> 33

Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR1 пембролизумаба

<400> 34

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 35

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR2 пембролизумаба

<400> 35

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 36

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC-CDR3 пембролизумаба

<400> 36

Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 37

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG1 человека

<400> 37

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 38

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG1 человека (L234A L235A D265S)

<400> 38

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Ser Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 39

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG1 человека (L234A L235A P329G)

<400> 39

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Ser Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 40

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG1 человека (L235E)

<400> 40

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 41

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG1 человека (D265A)

<400> 41

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 42

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG1 человека (D265A N297G)

<400> 42

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 43

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG1 человека (E233A/L235A)

<400> 43

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 44

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG1 человека (N297X, где X является любой аминокислотой, иной, чем N)

<220>

<221> прочий_признак

<222> (180)..(180)

<223> Xaa может являться любой природной аминокислотой

<400> 44

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 45

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG2 человека

<400> 45

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 46

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG2 человека (D265S)

<400> 46

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ser

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 47

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG2 человека (P329G)

<400> 47

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 48

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG2 человека (D265A)

<400> 48

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 49

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG2 человека (D265A N297G)

<400> 49

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gly

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 50

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG2 человека (N297X, где X является любой аминокислотой, иной, чем N)

<220>

<221> прочий_признак

<222> (176)..(176)

<223> Xaa может являться любой природной аминокислотой

<400> 50

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 51

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG2 человека (V234A G237A P238S H268A V309L A330S P331S X378S/A)

<220>

<221> прочий_признак

<222> (257)..(257)

<223> Xaa может являться любой природной аминокислотой

<400> 51

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Ala Ala Ala Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Xaa Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 52

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG4 человека (S228P)

<400> 52

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 53

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG4 человека (S228P P329G)

<400> 53

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Gly Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 54

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG4 человека (S228P D265A)

<400> 54

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Ala Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 55

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG4 человека (S228P D265A N297G)

<400> 55

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Ala Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 56

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG4 человека (S228P N297X, где X является любой аминокислотой, иной, чем N)

<220>

<221> прочий_признак

<222> (177)..(177)

<223> Xaa может являться любой природной аминокислотой

<400> 56

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 57

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен LC каппа человека

<400> 57

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 58

<211> 447

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC IgG2 мыши против CTLA-4 (модифицированное x [CTLA-4_M] mAb мыши (9D9 Balb/c (Igh-1a) гаплотип - основной аллель) IgG2a/каппа—тяжелая цепь))

<400> 58

Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Ile Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp

180 185 190

Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser

245 250 255

Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp

260 265 270

Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln

275 280 285

Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser

290 295 300

Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro

340 345 350

Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met

355 360 365

Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn

370 375 380

Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn

405 410 415

Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu

420 425 430

His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 59

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC каппа антитела мыши против CTLA-4 (12AIL_9D9_LC)

<400> 59

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

145 150 155 160

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

180 185 190

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

195 200 205

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 60

<211> 441

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC антитела мыши против CTLA-4 (D265A) (мышь x [CTLA-4_M] mAb (9D9 мутация D265A) IgG1/каппа—тяжелая цепь)

<400> 60

Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Ile Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp

180 185 190

Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys

210 215 220

Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

225 230 235 240

Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val

245 250 255

Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe

260 265 270

Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu

275 280 285

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His

290 295 300

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala

305 310 315 320

Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg

325 330 335

Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met

340 345 350

Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro

355 360 365

Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn

370 375 380

Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr

405 410 415

Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu

420 425 430

Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 61

<211> 415

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ISVD мыши против CTLA-4 (54BBI_Llama x [CTLA4_M] [ALB_H] VHH (F023700894) (PI))

<400> 61

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Pro Ser Ile Asn

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Thr Ile Arg Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Tyr

85 90 95

Thr Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

165 170 175

Ser Thr Pro Ser Ile Asn Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly

180 185 190

Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Arg Ser Gly Gly Ala Thr Asn

195 200 205

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr

210 215 220

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

225 230 235 240

Ala Val Tyr Asp Cys Tyr Thr Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Tyr Trp Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

290 295 300

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu

305 310 315 320

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp

325 330 335

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser

340 345 350

Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

355 360 365

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

370 375 380

Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly

385 390 395 400

Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

405 410 415

<210> 62

<211> 436

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ISVD мыши против PD-1 PF023700037

<400> 62

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr His

20 25 30

Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Arg Leu Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Arg

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Ser Glu Arg Arg Leu Gly Val Ile Pro Gly Leu Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

145 150 155 160

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

165 170 175

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Leu Ala Met

180 185 190

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ser

195 200 205

Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

210 215 220

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

225 230 235 240

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

245 250 255

Ser Arg Glu Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly Leu Thr Leu Tyr Glu

260 265 270

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

305 310 315 320

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

325 330 335

Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser

340 345 350

Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

355 360 365

Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser

370 375 380

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu

385 390 395 400

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

405 410 415

Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val

420 425 430

Thr Val Ser Ser

435

<210> 63

<211> 443

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC клона DX400 антитела мыши против PD-1

<400> 63

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Leu Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Tyr Asn Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Val Pro Gly Ser Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys

210 215 220

Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser

260 265 270

Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile

290 295 300

Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn

305 310 315 320

Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

325 330 335

Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu

340 345 350

Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe

355 360 365

Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala

370 375 380

Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr

385 390 395 400

Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly

405 410 415

Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His

420 425 430

Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 64

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC клона DX400 антитела мыши против PD-1

<400> 64

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ile Ser

20 25 30

Arg Tyr Thr Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 65

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Остатки после LC-CDR3

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = любая аминокислота

<400> 65

Phe Gly Xaa Gly

1

<210> 66

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Остатки перед HC-CDR1

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(4)

<223> Xaa = любая аминокислота

<400> 66

Cys Xaa Xaa Xaa

1

<210> 67

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Остатки перед HC-CDR2

<400> 67

Leu Glu Trp Ile Gly

1 5

<210> 68

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Остатки после HC-CDR3

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = любая аминокислота

<400> 68

Trp Gly Xaa Gly

1

<210> 69

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR-1 ISVD против CTLA-4

<400> 69

Phe Tyr Gly Met Gly

1 5

<210> 70

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR-2 ISVD против CTLA-4

<400> 70

Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 71

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR-3 ISVD против CTLA-4

<400> 71

Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr

1 5 10

<210> 72

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR-3 варианта ISVD против CTLA-4

<400> 72

Glu Pro Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr

1 5 10

<210> 73

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 8D2/8D2 (RE)

<400> 73

Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Gly Glu Asp Met Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 74

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 8D2/8D2 (RE)

<400> 74

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro

65 70 75 80

Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105

<210> 75

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 8D2/8D2 RE ВАРИАНТ 1 M18I

<400> 75

Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Pro Ile Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Gly Glu Asp Met Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 76

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 8D2/8D2 RE ВАРИАНТ 1 M18I

<400> 76

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro

65 70 75 80

Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105

<210> 77

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 8D2H1L1

<400> 77

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 78

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 8D2H1L1

<400> 78

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro

65 70 75 80

Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 79

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 8D2H1L1 ВАРИАНТ 1 M18I

<400> 79

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ile Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 80

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 8D2H1L1 ВАРИАНТ 1 M18I

<400> 80

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro

65 70 75 80

Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 81

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 8D2H2L2

<400> 81

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 82

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 8D2H2L2

<400> 82

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 83

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 8D2H2L2 ВАРИАНТ 1 M18I

<400> 83

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ile Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 84

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 8D2H2L2 ВАРИАНТ 1 M18I

<400> 84

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 85

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 8D3H3L3

<400> 85

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 86

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 8D3H3L3

<400> 86

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 87

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 8D2H2L15

<400> 87

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 88

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 8D2H2L15

<400> 88

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Arg His Pro

85 90 95

Gly Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 89

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 8D2H2L15 ВАРИАНТ 1 M18I

<400> 89

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ile Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 90

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 8D2H2L15 ВАРИАНТ 1 M18I

<400> 90

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Arg His Pro

85 90 95

Gly Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 91

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 8D2H2L17

<400> 91

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 92

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 8D2H2L17

<400> 92

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Ser Arg Pro

85 90 95

Gly Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 93

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 8D2H2L17 ВАРИАНТ 1 M18I

<400> 93

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ile Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 94

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 8D2H2L17 ВАРИАНТ 1 M18I

<400> 94

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Ser Arg Pro

85 90 95

Gly Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 95

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH REGN4659 W02019023482

<400> 95

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Arg Thr Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Gly Thr Phe Leu His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 96

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL REGN4659

<400> 96

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ala Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Lys Ser Phe Pro Met

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 97

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH AGEN1884w

<400> 97

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 98

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL AGEN1884w

<400> 98

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 99

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH цемиплимаба-rwlc

<400> 99

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Trp Gly Asn Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 100

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL цемиплимаба-rwlc

<400> 100

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Ser Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Asn Thr Phe

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Thr Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Val Val Asp Phe Arg

100 105

<210> 101

<211> 444

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC цемиплимаба-rwlc (S228P)

<400> 101

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Trp Gly Asn Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 102

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC цемиплимаба-rwlc

<400> 102

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Ser Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Asn Thr Phe

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Thr Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Val Val Asp Phe Arg Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 103

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH дурвалумаба

<400> 103

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 104

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL дурвалумаба

<400> 104

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 105

<211> 80

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH авелумаба

<400> 105

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Tyr Pro Ser

1 5 10 15

Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

20 25 30

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

35 40 45

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val

50 55 60

Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

65 70 75 80

<210> 106

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL авелумаба

<400> 106

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 107

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH атезолизумаба

<400> 107

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 108

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL атезолизумаба

<400> 108

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 109

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC дурвалумаба (IgG1 L234F/L235E/P331S/D356E/L358M)

<400> 109

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 110

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC дурвалумаба

<400> 110

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 111

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC авелумаба (IgG1)

<400> 111

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 112

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC авелумаба

<400> 112

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 113

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC атезолизумаба (IgG1 N297A/D235E/L358M)

<400> 113

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 114

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC атезолизумаба

<400> 114

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 115

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG1 человека (N297A/D356E/L358M)

<400> 115

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 116

<211> 317

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен HC IgG1 человека (L234F/L235E/P331S/D356E/L358M)

<400> 116

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

225 230 235 240

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

245 250 255

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

260 265 270

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

275 280 285

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

290 295 300

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

305 310 315

<210> 117

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный домен лямбда LC человека

<400> 117

Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<---

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к способу лечения злокачественного новообразования у индивидуума, нуждающегося в таком лечении, с использованием комбинации антитела против PD-1 и антитела против CTLA-4, которая не вызывает от умеренной до тяжелой воспалительной иммуноопосредованной токсичности в отношении кожи или кишечника, где указанный способ включает введение комбинации антитела против PD-1, содержащего тяжелую цепь (HC), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27, и легкую цепь (LC), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, и антитела против CTLA-4, содержащего (i) HC, имеющую вариабельный домен HC (VH), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, и константный домен HC, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, и (ii) LC, имеющую вариабельный домен LC (VL), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и константный домен LC, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57. Технический результат заключается в противоопухолевой активности антитела против CTLA-4 при совместном введении с антителом против PD-1 без иммуноопосредованной токсичности в отношении кожи и кишечника. 5 з.п. ф-лы, 11 ил., 36 табл., 3 пр.

1. Способ лечения злокачественного новообразования у индивидуума, нуждающегося в таком лечении, с использованием комбинации антитела против PD-1 и антитела против CTLA-4, которая не вызывает от умеренной до тяжелой воспалительной иммуноопосредованной токсичности в отношении кожи или кишечника, где указанный способ включает введение комбинации антитела против PD-1, содержащего тяжелую цепь (HC), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27, и легкую цепь (LC), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, и антитела против CTLA-4, содержащего (i) HC, имеющую вариабельный домен HC (VH), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, и константный домен HC, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, и (ii) LC, имеющую вариабельный домен LC (VL), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и константный домен LC, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57.

2. Способ по п.1, где антитело против CTLA-4 вводят в дозе, содержащей более 1 мг/кг, или фиксированной дозе, не зависящей от массы тела индивидуума, составляющей 100 мг или более.

3. Способ по п.1, где антитело против PD-1 вводят в дозе, содержащей (i) 2 или 3 мг/кг, или фиксированную дозу, не зависящую от массы тела индивидуума, составляющую 200 мг, (ii) более 3 мг/кг или фиксированную дозу, не зависящую от массы тела индивидуума, составляющую более 200 мг, или (iii) фиксированную дозу, не зависящую от массы тела индивидуума, составляющую от приблизительно 200 мг до приблизительно 400 мг.

4. Способ по п.1, где антитело против PD-1 вводят индивидууму первым и антитело против CTLA-4 вводят индивидууму вторым; антитело против CTLA-4 вводят индивидууму первым и антитело против PD-1 вводят индивидууму вторым; или антитело против PD-1 и антитело против CTLA-4 вводят индивидууму одновременно.

5. Способ по п.1, где злокачественное новообразование является меланомой, немелкоклеточным раком легких, раком головы и шеи, уротелиальным раком, раком молочной железы, желудочно-кишечным злокачественным новообразованием, множественной миеломой, печеночно-клеточным раком, неходжкинской лимфомой, раком почки, лимфомой Ходжкина, мезотелиомой, раком яичников, мелкоклеточным раком легких, раком пищевода, раком анального канала, раком желчных протоков, колоректальным раком, раком шейки матки, раком щитовидной железы или раком слюнных желез.

6. Способ по п.1, где злокачественное новообразование является раком поджелудочной железы, раком бронхов, раком предстательной железы, раком поджелудочной железы, раком желудка, раком яичников, раком мочевого пузыря, злокачественным новообразованием головного мозга или центральной нервной системы, злокачественным новообразованием периферической нервной системы, раком матки или эндометрия, раком полости рта или глотки, раком печени, раком почки, раком яичка, раком желчных протоков, раком тонкого кишечника или аппендикса, раком надпочечника, остеосаркомой, хондросаркомой или злокачественным новообразованием кроветворных тканей.