ОПУХОЛЕВЫЕ БИОМАРКЕРЫ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/574 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к средству противораковой иммунотерапии, нацеленному против регуляторных Т-клеток, экспрессирующих поверхностный Т-клеточный рецептор ICOS (индуцируемый Т-клеточный костимулятор), включающему антитела к ICOS и другие терапевтические средства, которые подавляют активность ICOS+ регуляторных Т-клеток (TReg) или уничтожают их. Настоящее изобретение относится к биомаркерам, которые указывают на восприимчивость опухоли к такому средству иммунотерапии и которые обеспечивают ранний индикатор ответа пациента на средство иммунотерапии.

Предпосылки изобретения

Иммунотерапия, при которой собственную иммунную систему пациента модулируют для борьбы с заболеванием, стала передовым способом лечения многих типов рака. Сигналы, которые подавляют активацию Т-клеток, подвергают понижающей модуляции с использованием нацеленных лекарственных средств ("блокада иммунных контрольных точек"), позволяя Т-клеткам обеспечивать эффективный противоопухолевый ответ [N1]. У пациентов, которые демонстрируют ответ на иммунотерапию, результаты противоопухолевой активности могут быть сильно выраженными и обеспечивать спасение жизней, что поддерживает интерес к данной области. Иммунотерапия с помощью ингибиторов иммунных контрольных точек, таких как моноклональные антитела, которые нацеливаются на белок 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1), лиганд-1 белка запрограммированной гибели клеток (PD-L1) и ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами антиген 4 (CTLA-4), стала важным способом лечения множества видов рака. В настоящее время проводятся сотни клинических испытаний ингибиторов иммунных контрольных точек для тестирования новых лекарственных средств и новых комбинаций лекарственных средств.

В дополнение к коингибирующим рецепторам иммунных контрольных точек, таким как PD-1 и CTLA-4, костимулирующие рецепторы влияют на функциональный статус Т-клеток и имеют критическое значение для иммунологического надзора в отношении развития рака. При связывании лигандов с костимулирующими рецепторами активируется нисходящий каскад сигналов, управляющих функцией, выживанием и/или пролиферацией Т-клеток. ICOS представляет собой костимулирующий рецептор, обнаруживаемый исключительно на Т-клетках, и он был идентифицирован как мишень для иммунотерапии для активации противоопухолевого Т-клеточного ответа у пациента. См., например, WO 2019/122884 и приведенные в ней ссылки.

В случае опухолей, а также при других заболеваниях и состояниях, в развитии которых участвует иммунный компонент, существует баланс между эффекторными Т-клетками (TEff, такими как CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты, CTL), которые вызывают антиген-специфический Т-клеточный иммунный ответ, и регуляторными Т-клетками (TReg), которые подавляют этот иммунный ответ путем понижающей регуляции TEff. Повышенные уровни TReg в опухолях связаны с неблагоприятным прогнозом для по меньшей мере некоторых видов рака, включая гепатоцеллюлярную карциному (НСС) [N2, N3]. Tu et al. (2016) сообщали, что TReg, особенно ICOS+FOXP3+TReg, способствуют иммуносупрессии при опухолях, относящихся к НСС, и связаны со сниженной выживаемостью пациентов [3]. ICOS является важным костимулирующим рецептором на TEff, но также способствует росту опухоли ввиду высокого уровня его экспрессии на TReg. Исследования in vitro показали, что ICOS-экспрессирующие (ICOS+) TReg обладают более сильным иммуносупрессивным действием, чем ICOS-отрицательные TReg [N4, N5]. Иммунотерапия с помощью антител к ICOS направлена на модулирование баланса TEff/TReg в пользу числа и активности TEff. Антитела, которые инициируют истощение количества (например, посредством Fc-опосредованной эффекторной функции, такой как антителозависимая клеточная цитотоксичность, ADCC) ICOS-положительных TReg, будут ослаблять степень подавления TEff и улучшать соотношение TEff/TReg и, таким образом, будут оказывать суммарный эффект стимуляции TEff-опосредуемого противоопухолевого ответа. Антитело к ICOS также может проявлять агонистическую активность на уровне рецептора ICOS с непосредственным стимулированием осуществляемого TEff продуцирования цитокинов. Обеспечение комбинации этих двух усиливающих эффектов в отношении TEff возможно с помощью антитела к ICOS ввиду того, что ICOS представлен на TReg при значительно более высоких уровнях, чем на TEff; например, человеческие антитела подкласса IgG1 к ICOS могут усиливать противоопухолевый иммунитет путем стимуляции ICOS^Low Teff и истощения количества ICOS^High TReg [N6; N7]. Таким образом, антитела к ICOS представляют собой потенциально ценный класс терапевтических средств для иммунотерапии в отношении опухолей, при которой мобилизуется TEff-опосредуемый иммунный ответ.Был описан ряд антител к ICOS, и показано, что они влияют на популяции/активность Т-клеток [N8; W0 2016/120789; WO 2016/154177; WO 2018/029474; WO 2018/187613; WO 2019/122884]. Несколько антител к ICOS проходят клинические испытания с участием пациентов, страдающих от рака: JTX-2011 [25], GSK-3359609 [N9], MEDI-570, BMS-986226 [WO 2018/187613; NCT03251924] и KY1044 [7].

Хотя прогресс иммуноонкологии на сегодняшний день является впечатляющим, иммунотерапевтические способы лечения все еще оказываются неэффективными для количества пациентов, которое превышает количество жизней пациентов, спасение которых они обеспечивают. Значения частоты ответов, составляющие 30% или ниже, являются нормой для иммунотерапии, осуществляемой в отношении ряда типов опухолей. Частота ответов для антитела к PD-1, представляющего собой ниволумаб, при меланоме составляет около 30%. В исследовании фазы I/II при распространенной НСС частота ответа для него составила 15-20% [N10]. Пембролизумаб, являющийся другим антителом к PD-1, обеспечивал достижение схожей частоты ответов, что и ниволумаб, в исследовании фазы II у пациентов с НСС, которые ранее получали лечение сорафенибом [N11]. Ниволумаб и пембролизумаб получили одобрение на ускоренную регистрацию от Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) для лечения НСС в 2017 и 2018 годах соответственно. Однако последующие испытания фазы III при распространенной НСС, в которых тестировали ниволумаб и пембролизумаб в условиях терапии 1-й и 2-й линий соответственно, не продемонстрировали достижения положительных результатов [N12, N13]. В фазе II клинического испытания антитела к PD-L1 атезолизумаба при уротелиальной карциноме частота ответов составила около 26% у пациентов с PD-L1+ опухолями, 15% в целом (у пациентов независимо от экспрессии PD-L1 в опухолях) и 10% у пациентов с PD-L1-отрицательными опухолями. Последний пример иллюстрирует значение биомаркера для подбора средства иммунотерапии для группы пациентов, страдающих от рака, у которых имеется больше шансов (хотя и всего 26%) получить пользу в результате ее применения. Calderaro et al. также сообщали о взаимосвязи между экспрессией PD-L1 при НСС и клиническими и патологическими характеристиками [N14].

Средства комбинированной терапии исследовали как способ повышения эффективности ингибиторов иммунных контрольных точек при НСС и других видах рака. Недавно сообщалось о частоте объективного ответа, составляющей около 30%, в когорте из испытания с использованием комбинации ниволумаба и антитела к CTLA-4 ипилимумаба [N15], после чего FDA США предоставило одобрение на ускоренную регистрацию комбинации ниволумаб/ипилимумаб для пациентов с НСС, которые ранее получали лечение сорафенибом. В другом недавнем испытании тестировали комбинацию антитела к PD-L1 атезолизумаба и антитела к VEGF бевацизумаба по сравнению с сорафенибом в качестве средства терапии первой линии для пациентов с распространенной НСС, и в этом испытании сообщалось о положительных результатах при использовании комбинации атезолизумаба и бевацизумаба с повышением ORR до около 30% [N16].

В целом неясно, почему одни пациенты демонстрируют наличие ответа на иммунотерапию, тогда как другие его наличия не демонстрируют.Сильно выраженные различия в отношении ответа наблюдаются у предположительно схожих пациентов, когда один пациент демонстрирует полный ответ, в то время как другие почти или совсем не получают клинической пользы от того же средства лечения. Это может быть связано с различиями в отношении микроокружения опухоли (ТМЕ) на исходном уровне, но детали еще не изучены. Несмотря на то, что были идентифицированы некоторые прогностические биомаркеры (например, экспрессия PD-L1 на опухолевых и иммунных клетках, выявленная в упомянутом выше исследовании атезолизумаба), неизменным остается то, что большая часть пациентов, получающих лечение с помощью средства иммунотерапии, не получает какой-либо пользы от лечения. Любой прогресс в отношении подбора для пациентов средств терапии, которые с наибольшей вероятностью окажутся эффективными, принесет долгожданное улучшение клинической эффективности и ограничит количество пациентов, подвергающихся бесполезным медицинским вмешательствам.

Традиционная диагностика типов и подтипов рака основана на анатомических и тканевых системах классификации, например, рак легкого, рак поджелудочной железы и так далее. Однако, учитывая низкие значения частоты ответа на иммунотерапию в пределах и между такими категориями опухолей, эти определения лишь частично способствуют идентифицированию групп пациентов, которым конкретное лечение принесет пользу. Таким образом, клиницисты и регулирующие органы теперь признают ценность "ткань-независимого" подхода, при котором лечение основано на биомаркерах, характеризующих опухоль и/или пациента, которые не связаны с типом ткани или клетки, из которых происходит развитие опухоли (но могут коррелировать с ним). Например, FDA США одобрило антитело к PD-1 пембролизумаб для лечения пациентов с солидными опухолями, являющимися неоперабельными или метастатическими, характеризующимися высокой микросателлитной нестабильностью или дефицитом репарации ошибок спаривания нуклеотидов. Возможна также комбинация системы классификации опухолей по типу ткани с ткань-независимой системой классификаций опухолей.

Мутационный статус опухолей влияет на их микроокружение. Популяции опухолевых клеток могут эволюционировать с образованием фенотипов, которые защищают их от обнаружения иммунной системой и влияют на местные ткани, поддерживая рост опухоли, тем самым создавая проопухолевую среду. Такие опухоли могут быть в низкой степени инфильтрированы иммунными клетками и обозначаются как иммунологически "холодные". В других ситуациях высокая частота мутаций в опухолевых клетках (например, в результате дефектов репарации ошибочно спаренных нуклеотидов ДНК) создает обилие неоэпитопов, что приводит к высокой инфильтрации цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) и развитию иммунологически "горячей" опухоли. Природа и степень связи между генотипом и фенотипом опухоли, а также их совместное изменение с течением времени являются предметом широко масштабных и стремительных открытий. Есть надежда, что определение различий между демонстрирующими ответ и не демонстрирующими ответ опухолями в конечном итоге приведет к идентификации многих подклассов пациентов, для которых конкретный курс иммунотерапии будет стабильно обеспечивать излечение. Поскольку, как сообщается, у большинства пациентов с метастатическими опухолями имеется множество различных геномных изменений, для обеспечивающих успех средств лечения могут потребоваться индивидуализированные комбинации нескольких терапевтических средств для достижения точного соответствия между средством лечения и профилем характеристик рака [N17].

Были разработаны различные диагностические системы, основанные на определении характеристик ТМЕ, включая иммунный инфильтрат и местную воспалительную реакцию [N18; N19; N20; 21]. Ретроспективный анализ популяций пациентов, получавших лечение блокаторами иммунных контрольных точек, такими как антитело к CTLA-4 и антитело к PD-1, указал на наличие различий между опухолями в иммунологическом контексте, связанных с их способностью демонстрировать ответ на лечение [N21]. Сообщалось, что "мутационная нагрузка опухоли" и "профиль экспрессии связанных с воспалением генов Т-клеток" ассоциированы с положительным исходом лечения антителом к PD-1 пембролизумаб [N22]. Сообщалось, что вычислительная модель "TIDE" (иммунная дисфункция и эксклюзия в отношении опухоли), которая моделирует уклонение опухолей от CTL на основе генных сигнатур (из профилей RNA-Seq или NanoString до лечения), коррелирующих с инфильтрацией CTL и выживаемостью пациентов, обеспечивает прогнозирование исхода для пациентов с меланомой, получавших лечение средством первой линии, представляющим собой антитело к PD-1 или антитело к CTLA-4, более точно, чем другие биомаркеры, такие как экспрессия PD-L1 и мутационная нагрузка [N23]. Сообщалось, что в механизм действия антитела к CTLA-4 ипилимумаба вовлечены FcγRIIIA-экспрессирующие неклассические моноциты, которые были обнаружены с более высокими исходными уровнями частоты встречаемости среди периферических клеток у демонстрирующих ответ на лечение пациентов по сравнению с не демонстрирующими ответ на лечение пациентами [N24].

Исследования показывают, что антитела к ICOS могут иметь особую терапевтическую ценность в отношении опухолей, положительных в отношении экспрессии ICOS и/или FOXP3 (маркер TReg) [6; WO 2018/029474; WO 2019/122884]. На основании данных из испытания ICONIC NCT02904226 с использованием антитела к ICOS JTX2011 сообщалось, что показатели контроля заболевания и уменьшения опухоли были выше у пациентов с высоким уровнем экспрессии ICOS в опухоли [N25]. Тем не менее, экспрессия ICOS и/или FOXP3 обеспечивает лишь общий показатель того, будет ли терапия антителами к ICOS действенной для данного пациента.

В WO 2014/009535 описан способ определения того, будет ли пациент, страдающий от солидного рака, демонстрировать ответ на лечение (химиотерапию, радиационную терапию или иммунотерапию), включающий анализ образца опухолевой ткани, полученного от пациента, на уровни экспрессии совокупности генов, выбранных из CCR2, CD3D, CD3E, CD3G, CD8A, CXCL10, CXCL11, GZMA, GZMB, GZMK, GZMM, IL15, IRF1, PRF1, STAT1, CD69, ICOS, CXCR3, STAT4, CCL2 и ТВХ21. Сообщалось также, что уровни экспрессии генов в этой совокупности связаны с прогнозом в отношении течения рака.

В WO 2014/023706 описан способ определения наличия у пациента, страдающего от рака, сильного или слабого адаптивного иммунного ответа и сильного или слабого иммуносупрессивного ответа, включающий анализ образца опухолевой ткани, полученного от пациента, на уровни экспрессии определенной совокупности генов.

В WO 15/103037 описаны способы анализа образцов пораженных раком тканей на соматические мутации для идентифицирования пациентов, которые являлись кандидатами на лечение с помощью модулятора иммунной контрольной точки.

В WO 16/10954 6 описан выбор пациентов для лечения с помощью средства иммунотерапии, основанный на "генной сигнатуре иммунных клеток" в биологическом образце, полученном от пациента, при этом сигнатура для иммунных клеток предусматривает уровень экспрессии одного или нескольких генов из определенной совокупности генов.

В WO 2017/070423 описан способ анализа образцов, полученных от пациентов, на уровни мРНК из определенной совокупности генов для идентифицирования пациентов, подходящих для лечения с помощью антитела к ICOS.

В WO 2018/225062 и WO 2018/225063 описан способ прогнозирования ответа у пациента, страдающего от рака, на лечение с помощью по меньшей мере ингибитора иммунной контрольной точки, предусматривающий анализ биомаркеров, зависимых от организма хозяина, таких как цитокины, хемокины, факторы роста, ферменты или растворимые формы рецепторов.

В WO 2020/245155 описан способ определения схемы лечения с помощью химиотерапевтического средства для пациента, пораженного раком, при этом способ предусматривает количественное определение CD8 и CD3 в образце опухолевой ткани, взятом у пациента. Описаны способы количественного определения плотности CD8+ и CD3+ клеток в опухоли и в инвазивном крае опухоли.

Наряду с идентификацией подходящих биомаркеров, которые позволяют назначать соответствующие средства лечения и комбинации средств лечения для отдельных пациентов, применимой является идентифицирование прогностических биомаркеров для пациентов, находящихся на ранней стадии лечения. Схемы иммунотерапевтического лечения характеризуются большой продолжительностью, при этом они длятся по меньшей мере месяцы, а часто и годы. Это отличается от химиотерапевтического лечения, при котором уничтожение клеток/уменьшение размера опухоли происходит почти незамедлительно. Ответ на иммунотерапию можно рассматривать как трехстадийный процесс: клеточный ответ по мере того, как лекарственное средство активирует клетки иммунной системы; противоопухолевый ответ по мере того, как иммунные клетки атакуют опухоль; и терапевтический ответ по мере того, как противоопухолевый эффект обеспечивает снижение опухолевой нагрузки и улучшение исхода для пациента. При наличии возможности идентифицирования ранних маркеров, которые коррелируют с возможным терапевтическим ответом, такие как биомаркеры, которые могут быть обнаружены у пациентов в течение первых нескольких недель лечения и которые указывают на долгосрочный прогноз, это обеспечит уверенность в целесообразности продолжения лечения пациентов, демонстрирующих положительный статус по отношению к биомаркеру, тогда как пациенты, у которых биомаркер отсутствует, могут быть переведены на альтернативные виды терапии.

Feng et al. [N26] сообщали, что прогностическую информацию для пациентов с плоскоклеточным раком ротовой полости можно получить, исходя из частоты встречаемости Т-клеток в срезах опухолевой ткани. Высокое количество CD8+ Т-клеток в инвазивном крае положительно коррелировало с общей выживаемостью, в то время как количество FOXP3+ клеток, находящихся в пределах 30 мкм от CD8+ Т-клеток, отрицательно коррелировало с общей выживаемостью. Авторы объединили эти и другие измерения в "кумулятивный индекс подавления", коррелирующий с общей выживаемостью.

В WO 2019/222188 указано, что повышенные уровни ICOS и Т-bet связаны с ответом, развивающимся у пациента на антитело к ICOS.

Недавно Kagamu et al. [N27] сообщали, что статус CD4+ Т-клеток в периферической крови пациентов можно использовать для идентифицирования пациентов с немелкоклеточным раком легкого, у которых наблюдается раннее прогрессирование заболевания после лечения с помощью ниволумаба (антитело к PD-1), что позволяет классифицировать пациентов как не способных демонстрировать ответ на лечение или способных демонстрировать ответ на лечение. Обнаружено, что у пациентов, способных демонстрировать ответ на лечение, имелись значительно (р<0,0001) более высокие процентные значения уровней эффекторных CD62L^low CD4+ Т-клеток до блокады PD-1. И наоборот, процентное значение уровня CD25+FOXP3+CD4+ Т-клеток было значительно (р=0,034) более высоким у пациентов, не способных демонстрировать ответ на лечение. Анализ экспрессии генов показал, что CCL19, CLEC-2A, IFNA, IL7, TGFBR3, CXCR3 и HDAC9 предпочтительно экспрессировались в CD62L^low CD4+ Т-клетках, полученных от пациентов, способных демонстрировать ответ на лечение. Примечательно, что у пациентов, способных демонстрировать долгосрочный ответ, у которых выживаемость без прогрессирования заболевания составляла более 500 дней, было показано наличие значительно более высоких значений числа CD62L^low CD4+ Т-клеток до терапии посредством блокады PD-1. Снижение значений процентного содержания CD62L^low CD4+ Т-клеток после терапии приводило к приобретенной резистентности, при этом у выживающих в течение длительного времени пациентов сохранялись высокие значения процентного содержания CD62L^low CD4+ Т-клеток.

Сущность изобретения

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что характеристики клеточного состава, иммунной обстановки и специфического пространственного расположения клеток в микроокружении опухоли (ТМЕ) могут обеспечивать получение информации относительно существующей для пациента вероятности клинического прогрессирования и относительно того, может ли он получить пользу от лечения с помощью средства иммунотерапии. Авторами настоящего изобретения были идентифицированы биомаркеры в ТМЕ, которые коррелируют с продолжительностью выживаемости пациента и вероятностью ответа на иммунотерапию, включая лечение с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg. Эти биомаркеры способствуют прогнозированию течения заболевания у пациентов, страдающих от рака, позволяют составлять профили для пациентов, чтобы идентифицировать для них вероятность получения пользы от средства иммунотерапии, и при мониторинге как до, так и после лечения обеспечивают ценное раннее указание на то, развивается ли у пациента ответ на терапию.

Эти биомаркеры включают следующие характеристики ТМЕ, которые могут быть идентифицированы в опухоли пациента, например, посредством анализа резецированной опухоли или биопсийного образца:

(i) плотность ICOS+: плотность расположения или концентрация клеток, экспрессирующих белок ICOS, т.е. ICOS-положительных (ICOS+) клеток,

(ii) доля ICOS+ TReg: доля FOXP3+ клеток, которую составляют ICOS+ клетки, представляющая долю TReg, которую составляют ICOS-положительные клетки,

(iii) межклеточная пространственная близость: межклеточная пространственная близость ICOS+FOXP3+ клеток и ICOS+FOXP3- клеток, представляющая собой среднюю величину (среднее значение) расстояния между каждой одноположительной по ICOS (т.е. ICOS-положительной FOXP3-отрицательной) клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой, представляющая пространственную близость между ICOS-положительной TReg и другими ICOS-положительными клетками (включая ICOS+ TEff), и

(iv) коэффициент зонального влияния: отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенной области ("радиус влияния") относительно любой одноположительной по ICOS клетки, к общему числу одноположительных по ICOS клеток, где радиус влияния представляет собой расстояние (например, 30 мкм), на котором может происходить межклеточное и/или зависимое от цитокинов взаимодействие между дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой и одноположительной по ICOS клеткой.

Каждый из этих биомаркеров положительно коррелирует с ожиданием того, что иммунотерапия антителом к ICOS и/или антителом к TReg принесет для пациента пользу. В целом, чем выше значение биомаркера (больше плотность, доля, пространственная близость или зональное влияние), тем хуже прогноз для пациента при отсутствии лечения, но больше вероятность того, что пациент продемонстрирует ответ на средство вмешательства, представленное антителом к ICOS и/или антителом к TReg. Таким образом, измерение биомаркеров, как описано в данном документе, способствует соответствующему выбору пациентов для лечения, позволяя избирательно вводить средства иммунотерапии тем пациентам, у которых они с наибольшей вероятностью вызовут развитие благоприятного противоопухолевого ответа.

Подробная информация относительно этих биомаркеров обобщена в прилагаемой таблице В и описана ниже. Биомаркеры (ii), (iii) и (iv) являются индикаторами иммуносупрессивного ТМЕ.

FOXP3 является известным маркером TReg, и клетки, которые экспрессируют как ICOS, так и FOXP3, идентифицируют как подгруппу TReg с высокой иммуносупрессорной активностью. Хотя авторами настоящего изобретения описывается в данном документе применение FOXP3 в качестве идентифицирующего маркера для TReg, следует понимать, что могут с легкостью применяться альтернативные маркеры для избирательной идентификации TReg. Как раскрыто авторами настоящего изобретения в данном документе, все из большей плотности ICOS+ клеток, большей доли TReg, являющихся ICOS+ клетками, и более тесной пространственной близости между ICOS+ TReg и другими ICOS+(FOXP3-) Т-клетками ассоциировано с худшим прогнозом для пациента, что проявляется, например, как уменьшенная продолжительность выживаемости или уменьшенная продолжительность безрецидивной выживаемости (RFS), выживаемости без прогрессирования (PFS) или времени до прогрессирования (ТТР) по сравнению с другими пациентами с тем же типом опухоли. Однако с другой стороны, такие пациенты представляют собой подгруппу, в которой особенно высока вероятность ответа на иммунотерапию антителом к ICOS и/или антителом к TReg.

Лечение терапевтическим средством на основе антитела к TReg, таким как Fc-эффектор-положительное антитело к ICOS, как например антитело KY1044, описанное в данном документе, снижает число TReg, улучшает соотношение между TEff/TReg в ТМЕ и, таким образом, может усиливать иммунный ответ пациента, направленный против опухоли, что приводит к уменьшению роста опухоли и предпочтительно к уменьшению размера и, в конечном итоге, к ликвидации опухоли или опухолей у пациента. Другие антитела к ICOS, не относящиеся к истощающим количество TReg, аналогичным образом будут обеспечивать улучшение противоопухолевого иммунного ответа за счет усиления продуцирования цитокинов TEff и таким образом повышения активности TEff.

Авторами настоящего изобретения описывается в данном документе то, как определенные биомаркеры можно измерить и количественно определить в отдельных образцах опухолевой ткани и в группах пациентов, предоставляя пороговые значения, которые эффективно классифицируют пациентов на группы способных демонстрировать ответ на лечение и не способных демонстрировать ответ на лечение. Учитывая сложную природу биологии опухолей и разнообразие пациентов, прогнозы, сделанные с использованием этих биомаркеров, не могут быть точными на 100%, но они все равно будут служить полезным ориентиром, основанным на показателях вероятности. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает увеличение вероятности надлежащего подбора терапии для пациента, которая принесет пользу для этого пациента. Таким образом, пациентов, страдающих от рака, можно подвергать скринингу с использованием биомаркеров в соответствии с настоящим изобретением, чтобы обеспечить получение индикатора относительной вероятности ответа на терапию, при этом данная информация является ценной как для клиницистов, так и для пациентов при принятии решения о необходимости начала курса иммунотерапии в соответствии с настоящим изобретением и/или при определении того, какой курс иммунотерапии (например, какое средство монотерапии или какую комбинацию средств) выбрать для использования.

Варианты осуществления настоящего изобретения раскрыты со ссылкой на гепатоцеллюлярный рак (НСС), как проиллюстрировано посредством следующих количественных измерений, выполненных на основе характеристик ТМЕ, для исследуемой когорты пациентов:

- высокая плотность ICOS+ клеток, измеренная как более 120 клеток на мм²;

- высокая плотность ICOS+ клеток, составляющая более 100 клеток на мм², где известно, что НСС ассоциирована с инфекцией, вызванной вирусом гепатита В (HBV), ИЛИ представляет собой НСС 2 или более поздней стадии в соответствии с критериями Американского объединенного комитета по раку (AJCC) [N28];

- высокая доля FOXP3+ клеток, которую составляют ICOS+ клетки, измеренная как ICOS+ статус у более чем половины количества FOXP3-+ клеток;

- непосредственная пространственная близость между ICOS+FOXP3- (одноположительными по ICOS) клетками и ближайшими к ним соседними дважды положительными ICOS+FOXP3+ клетками, измеренная как среднее межклеточное расстояние, составляющее менее 105 мкм;

- высокое отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах радиуса влияния одноположительных по ICOS клеток, составляющего 30 мкм, ко всем одноположительным по ICOS клеткам.

Пациенты с НСС, отвечающие одному или нескольким (предпочтительно всем) из этих критериев, могут быть выбраны для лечения посредством иммунотерапии антителом к ICOS и/или антителом к TReg, как описано в данном документе.

Референтные значения, как правило, будут определяться в отношении пациентов с конкретными клиническими характеристиками (такими как подтип рака), и их лучше всего использовать для прогнозирования у сопоставимых пациентов. Вышеприведенные примеры являются иллюстративными вариантами осуществления для групп пациентов с НСС, проиллюстрированных в данном документе в качестве примера, и другие подходящие пороговые значения могут быть определены в отношении других типов опухолей и/или популяций пациентов. Таким образом, хотя референтные значения, приведенные в качестве примера в данном документе, могут необязательно применяться для прогнозирования у пациентов с другими видами рака, не относящимися к НСС, их применение в таких более широких контекстах должно быть сначала подтверждено, если это возможно, путем оценки данных, полученных от пациентов с целевым типом рака или молекулярным подтипом (гистологически независимым). Авторами настоящего изобретения описываются способы определения подходящих референтных значений и формулы для дифференциации пациентов в соответствии с ожидаемым прогнозом в отношении течения рака и вероятной пользой от иммунотерапии антителом к ICOS и/или антителом к TReg. Определение и применение референтных значений для НСС проиллюстрировано в примерах, и эквивалентные способы могут использоваться для определения и применения референтных значений в отношении других видов рака.

Настоящее изобретение относится к применению биомаркеров в медицинских контекстах, в том числе в следующих аспектах:

в прогнозировании течения рака у пациентов, например, для расчета выживаемости, которая может включать длительность выживаемости, безрецидивной выживаемости (RFS), выживаемости без прогрессирования (PFS) и/или времени до прогрессирования (ТТР);

при подборе для пациентов соответствующих способов лечения, например, при выборе пациентов для лечения посредством иммунотерапии антителом к ICOS и/или антителом к TReg и назначении иммунотерапии антителом к ICOS и/или антителом к TReg для пациентов, идентифицированных как характеризующиеся более высокой вероятностью получения пользы;

при мониторинге клеточного ответа на иммунотерапию антителом к ICOS и/или антителом к TReg в качестве раннего показателя того, развивается ли у пациента ответ на лечение;

в медицинских исследованиях, где данные относительно биомаркеров, полученные в отношении пациентов, сопоставляют с историей их болезни и/или ответом на терапию, чтобы предоставить или уточнить модели, которые могут улучшить клиническую оценку и лечение будущих пациентов.

Для прогнозирования развития раковой солидной опухоли у пациента можно использовать один или несколько биомаркеров, включая один или несколько из следующих биомаркеров, определяемых в ткани из центральной части опухоли, полученной от пациента:

(i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

(ii) среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной ICOS+FOXP3+ клеткой,

(iii) доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

(iv) плотность ICOS-положительных клеток.

Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ прогнозирования развития раковой солидной опухоли у пациента, включающий

предоставление образца ткани из центральной части опухоли, полученного от пациента,

определение одного или нескольких из следующих биомаркеров в указанном образце:

(i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

(ii) среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной ICOS+FOXP3+клеткой,

(iii) доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

(iv) плотность ICOS-положительных клеток, и предоставление прогноза для пациента на основе указанных одного или нескольких биомаркеров, где на более короткий период выживаемости указывает

более высокое отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

более короткое среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной ICOS+FOXP3+клеткой,

более высокая доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и/или

более высокая плотность ICOS-положительных клеток.

Можно определить отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток и сравнить его с референтным значением. Число, превышающее референтное значение, указывает на прогноз более короткого периода выживаемости, а число, являющееся более низким, чем референтное значение, указывает на прогноз более длительной выживаемости. В случае НСС, например, авторами настоящего изобретения было определено референтное значение для классификации пациентов, равное 0,1, для радиуса влияния, составляющего 30 мкм (30 микрометров). Таким образом, в случае, если было определено, что отношение дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток составляет более 0,1, то это указывает на более короткий период выживаемости.

Аналогичным образом можно определять среднее расстояние между каждой ICOS+FOXP3- (одноположительной по ICOS) клеткой и ближайшей к ней ICOS+FOXP3+ (дважды положительной по ICOS FOXP3) клеткой и сравнивать его с референтным значением. Расстояние, меньшее, чем референтное значение, указывает на прогноз более короткой продолжительности выживаемости, тогда как расстояние, превышающее референтное значение, указывает на прогноз более продолжительной выживаемости. Например, если опухоль представляет собой НСС, можно использовать референтное значение, составляющее 105 мкм. Таким образом, среднее расстояние между каждой одноположительной по ICOS клеткой и ближайшей к ней дважды положительной ICOS+FOXP3+ клеткой, составляющее менее чем 105 мкм, указывает на более короткий период выживаемости при НСС, тогда как среднее расстояние между каждой одноположительной по ICOS клеткой и ближайшей к ней дважды положительной ICOS+FOXP3+ клеткой, составляющее более чем 105 мкм, указывает на более длительную выживаемость при НСС.

Долю FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, можно определять и сравнивать с референтным значением. Доля, превышающая референтное значение, указывает на прогноз более короткого периода выживаемости, тогда как доля, являющаяся более низкой, чем референтное значение, указывает на прогноз более длительной выживаемости. Например, если опухоль представляет собой НСС, можно использовать референтное значение, составляющее 0,5. Таким образом, если более половины FOXP3-положительных клеток являются ICOS-положительными, это указывает на более короткий период выживаемости, тогда как если менее половины FOXP3-положительных клеток являются ICOS-положительными, это указывает на более длительную выживаемость.

Плотность ICOS-положительных клеток можно определять и сравнивать с референтным значением. Плотность, превышающая референтное значение, указывает на прогноз более короткого периода выживаемости, тогда как плотность, являющаяся более низкой, чем референтное значение, указывает на прогноз более длительной выживаемости. Например, если опухоль представляет собой НСС, можно использовать референтное значение, составляющее 120 ICOS-положительных клеток на мм². Таким образом, плотность ICOS+ клеток, которая превышает 120 на мм², указывает на более короткий период выживаемости, тогда как плотность, являющаяся более низкой, чем 120 на мм², указывает на более длительную выживаемость. Если опухоль представляет собой НСС, ассоциированную с инфекцией, вызванной вирусом гепатита В, или представляет собой НСС 2 или более поздней стадии, можно использовать референтное значение, составляющее 100 ICOS-положительных клеток на мм². Таким образом, в прогнозировании, осуществляемом для пациента, у которого продемонстрировано наличие этих подтипов НСС, можно применять это более низкое референтное значение, тогда как в прогнозировании, осуществляемом для пациента, у которого продемонстрировано наличие другого типа НСС или наличие НСС, которая не была идентифицирована как ассоциированная с HBV или как относящаяся к НСС 2 или более поздней стадии, можно применять более высокое референтное значение, составляющее 120 клеток на мм². В последнем случае предусматриваются пациенты с диагнозом НСС 1 стадии.

Как будет проиллюстрировано в прилагаемых примерах, референтные значения получены в результате статистического моделирования, и, хотя референтное значение может отражать "наилучшее приближение" для данных в модели, исходя из которых оно было получено, оно может служить лишь примерным ориентиром для классификации пациентов и определения прогноза и поэтому не должно рассматриваться как абсолютно определяющее. Следует понимать, что приведенные в данном документе точные значения, такие как "отношение для дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах радиуса 30 мкм, составляющее 0,1", "среднее расстояние между каждой ICOS+FOXP3- клеткой и ближайшей к ней ICOS+FOXP3+ клеткой, составляющее 105 мкм", "50% FOXP3-положительных клеток, которые составляют ICOS-положительные клетки", "120 ICOS+ клеток на мм²" или "100 ICOS+ клеток на мм²" представляют собой только иллюстративные варианты осуществления, и что настоящее изобретение можно осуществлять на практике с использованием вариантов этих точных значений, сохраняя при этом прогностическую ценность. Например, если бы кто-либо определил радиус влияния как составляющий 25 мкм, а пороговое количество дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток как составляющее 0,2, все равно можно ожидать наличия возможности выполнения применимой оценки в отношении того, является ли пациент тем, для которого можно ожидать относительно долговременную выживаемость, а также будет ли такой пациент с большей или меньшей вероятностью получать пользу от лечения с помощью терапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg.

Выживаемость можно определять и измерять различными способами. В самом простом случае выживаемость можно определить как продолжительность для общей выживаемости (OS), т.е. период времени до смерти пациента. Другие клинические конечные точки, связанные с выживаемостью, включают измерение показателей статуса заболевания пациента в течение измеренного времени выживаемости, как например включающей безрецидивную выживаемость (RFS), выживаемость без прогрессирования (PFS) и время до прогрессирования (ТТР). Вкратце, RFS представляет собой продолжительность периода времени, прошедшего до рецидива или повторного развития подвергнутого лечению рака, PFS представляет собой продолжительность периода времени, прошедшего до ухудшения течения рака (его прогрессирования), а ТТР является аналогичным PFS, но не учитывает пациентов, которые умирают от причин, не связанных с имеющимся у них их раком. Биомаркеры по настоящему изобретению позволяют прогнозировать способность пациента переносить заболевание и, таким образом, ожидается, что они коррелируют с продолжительностью для каждого из OS, RFS, PFS и ТТР. В этом контексте предполагаемая продолжительность выживаемости представляет собой выживаемость в отсутствие лечения с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, т.е. прогноз делается независимо от того, каким образом пациент будет получать иммунотерапию антителом к ICOS и/или антителом к TReg, как описано в других местах данного документа, или будет ли пациент получать ее.

Предоставление прогноза, таким образом, может предусматривать прогнозирование того, сможет ли пациент рассчитывать на более длительную выживаемость по сравнению с другими сопоставимыми пациентами. Предоставление прогноза может предусматривать прогнозирование времени выживаемости, как например прогнозирование продолжительности OS, RFS, PFS и ТТР, например, в виде расчетного количества месяцев или лет. Предполагаемую продолжительность выживаемости пациента (например, OS) необязательно оценивают как количество месяцев с даты взятия образца ткани. Продолжительность выживаемости можно оценивать как диапазон, например менее х месяцев или более х месяцев, в зависимости от того, находится(-ятся) ли значение(-я) биомаркера(-ов) выше или ниже соответствующего(-их) референтного(-ых) значения(-й). Например, в описанной в данном документе популяции пациентов с НСС медианное значение OS составило 100,3 месяца. Для другого пациента, у которого продемонстрировано наличие НСС, следует определить показания биомаркеров для зонального влияния, межклеточной пространственная близости, доли ICOS+ TReg и/или плотности ICOS+ клеток и сравнить их с референтными значениями, определенными для этой популяции, чтобы обеспечить прогноз выживаемости, которая составляет больше или меньше 100,3 мес.

Таким образом, пациент, который идентифицирован как характеризующийся относительно неблагоприятным прогнозом, определенным посредством одного или нескольких таких биомаркеров, может характеризоваться более высокой вероятностью ответа на иммунотерапию в соответствии с настоящим изобретением, чем пациенты, для которых прогноз более оптимистичен. Другими словами, хотя у пациента предполагается относительно короткая продолжительность выживаемости, более вероятно, что выживаемость данного пациента можно продлить путем лечения с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg.

Таким образом, второй аспект настоящего изобретения относится к идентифицированию пациентов, которые с большей вероятностью, чем другие, продемонстрируют ответ на лечение с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg. Этот аспект настоящего изобретения обеспечивает идентификацию подгруппы пациентов (например, подгруппы пациентов с НСС), где подгруппа определяется наличием или значением биомаркера или комбинации биомаркеров, и где предполагается, что пациенты в указанной подгруппе будут более восприимчивы к иммунотерапии антителом к ICOS и/или антителом к TReg, чем пациенты вне подгруппы (т.е. по сравнению с пациентами, у которых не проявляется(-ются) определенный(-е) биомаркер(-ы)).

В этом втором аспекте в настоящем изобретении представлен способ определения вероятности того, что раковая солидная опухоль у пациента продемонстрирует ответ на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, предусматривающий

предоставление образца ткани из центральной части опухоли, полученного от пациента, и

определение одного или нескольких из следующих биомаркеров в указанном образце:

(i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

(ii) среднее расстояние между каждой ICOS+FOXP3- клеткой и ближайшей к ней ICOS+FOXP3+ клеткой,

(iii) доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

(iv) плотность ICOS-положительных клеток, где

на более высокую вероятность того, что пациент продемонстрирует ответ на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, указывает

более высокое отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

более короткое среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней положительной ICOS+FOXP3+ клеткой,

более высокая доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и/или

более высокая плотность ICOS-положительных клеток.

Таким образом, один или несколько из вышеперечисленных биомаркеров используют для определения вероятности того, что раковая опухоль у пациента продемонстрирует ответ на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg. Можно определить, характеризуется ли пациент повышенной или пониженной вероятностью ответа на лечение по сравнению с другими пациентами, и/или вероятность ответа можно оценить численно.

Необязательно, способ предусматривает сравнение значений одного или нескольких биомаркеров с соответствующими референтными значениями таким же образом, как описано для первого аспекта настоящего изобретения и как проиллюстрировано в других местах данного документа. Референтные значения рассчитывают для референтной популяции пациентов, например, значения биомаркеров, определенные для пациента с НСС, можно сравнивать с референтными значениями для популяции пациентов с НСС. Таким образом определяют повышенную или пониженную вероятность ответа на лечение по отношению к ожидаемому ответу на лечение в референтной популяции.

Способы могут дополнительно предусматривать идентифицирование пациента как характеризующегося повышенной вероятностью ответа на иммунотерапию и, таким образом, осуществление выбора иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg для лечения указанного пациента. Таким образом, один или несколько из вышеперечисленных биомаркеров можно использовать для идентифицирования пациента как характеризующегося более высокой вероятностью получения пользы от иммунотерапии антителом к ICOS и/или антителом к TReg, и необязательно для соответствующего выбора пациента для лечения с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg. Например, пациент с НСС, у которого наблюдается повышенное количество ICOS+ клеток в ТМЕ, превышающее определенное референтное значение, может быть идентифицирован как подходящий для лечения с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg. Затем необязательно пациенту назначают и/или вводят иммунотерапевтическое средство основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg.

Если показания биомаркеров указывают на то, что пациент с меньшей вероятностью продемонстрирует ответ на иммунотерапию (не отвечающий на лечение), этому пациенту может быть рекомендовано другое лечение. В качестве альтернативы такие показания биомаркеров могут указывать на то, что пациента следует лечить с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg в комбинации с одним или несколькими другими средствами лечения, при этом в случае такой комбинации с большей вероятностью будет достигнут ответ.Например, некоторые средства лечения могут влиять на биомаркеры, описанные в данном документе, и могут приводить к изменению биомаркеров в направлении, которое указывает на усиление роли иммунотерапии. Средство иммунотерапии можно вводить в комбинации с этим дополнительным средством лечения, при этом несколько средств лечения вводят либо совместно (одновременно), либо последовательно в любом порядке. Фигура 1.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к лечению пациентов, страдающих от рака, посредством иммунотерапии антителом к ICOS и/или антителом к TReg, где пациентов идентифицируют посредством биомаркеров, описанных в данном документе, а также к иммунотерапевтическим средствам на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg для применение в лечении пациентов, идентифицированных посредством биомаркеров, описанных в данном документе. Фармацевтические композиции, содержащие иммунотерапевтические средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, могут быть предоставлены для применения у таких пациентов. Кроме того, иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg может быть использовано для изготовления лекарственного препарата для лечения раковой солидной опухоли у такого пациента. Лечение может предусматривать продление выживаемости пациента.

Способ согласно этому третьему аспекту настоящего изобретения предусматривает лечение раковой солидной опухоли у пациента, где способ предусматривает

идентифицирование пациента как характеризующегося повышенной вероятностью ответа на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, при этом указанный пациент является или был идентифицирован как таковой, как описано во втором аспекте настоящего изобретения. Таким образом, например, пациента можно идентифицировать по одному или нескольким из следующих показаний биомаркеров опухоли:

отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток, при этом указанное отношение превышает референтное значение,

среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней ICOS-положительной FOXP3-положительной клеткой, при этом указанное расстояние является меньшим, чем референтное значение,

доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, при этом указанная доля превышает референтное значение, и

плотность ICOS-положительных клеток, при этом указанная плотность превышает референтное значение, и при этом

осуществляют введение пациенту иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg.

Таким образом, иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg применяют для лечения раковой солидной опухоли у пациента, где в отношении опухоли было определено, что она предусматривает один или несколько определенных биомаркеров. Соответственно, перед лечением с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg один или несколько биомаркеров в образце ткани из центральной части опухоли, ранее полученном от пациента, могут быть определены для обеспечения индикатора пригодности терапии при сравнении с референтным значением для биомаркера, как описано в данном документе. Для НСС в качестве примера может быть определено, что опухоль предусматривает один или несколько из следующих биомаркеров:

отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток, при этом указанное отношение превышает 0,1,

среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней ICOS-положительной FOXP3-положительной клеткой, при этом указанное расстояние составляет менее 105 мкм,

доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, при этом указанная доля превышает половину от их количества, и

плотность ICOS-положительных клеток, при этом указанная плотность превышает 120 клеток на мм².

Для НСС, ассоциированной с HBV, или для НСС 2 или более поздней стадии может быть определено, что опухоль предусматривает один или несколько из следующих биомаркеров:

отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток, при этом указанное отношение превышает 0,1,

среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой, при этом указанное расстояние составляет менее 105 мкм,

доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, при этом указанная доля превышает половину от их количества, и

плотность ICOS-положительных клеток, при этом указанная плотность превышает 100 клеток на мм².

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к измерению ответа у пациента, страдающего от рака, на иммунотерапию антителом к ICOS и/или антителом к TReg путем обнаружения изменения одного или нескольких биомаркеров, описанных в данном документе. Такие изменения могут представлять собой сигнатуру ответа и могут быть обнаружены значительно раньше, чем внешние видимые клинические признаки, обеспечивая полезное указание на то, обеспечивает ли лечение достижение биологических эффектов, которые будут подавлять прогрессирование заболевания.

Способ мониторинга ответа у пациента на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, введение которого было осуществлено для лечения раковой солидной опухоли, может предусматривать

предоставление образца для тестирования ткани из центральной части опухоли, полученного от пациента после введения иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg,

определение одного или нескольких из следующих биомаркеров в указанном образце:

(i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

(ii) среднее расстояние между каждой ICOS+FOXP3- клеткой и ближайшей к ней ICOS+FOXP3+ клеткой,

(iii) доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

(iv) плотность ICOS-положительных клеток,

сравнение значений указанных одного или нескольких биомаркеров в указанном образце для тестирования со значениями тех же одного или нескольких биомаркеров в ранее взятом образце ткани из центральной части опухоли, полученном от пациента, и

определение того, произошло ли изменение значений указанных одного или нескольких биомаркеров.

Образец для тестирования получают после введения иммунотерапевтического средства, обеспечивая прохождение некоторого периода времени, необходимого для того, чтобы иммунотерапевтическое средство оказало эффект. Например, образец для тестирования может быть взят по меньшей мере через 3 дня после указанного введения иммунотерапевтического средства. Взятие образца для тестирования предпочтительно осуществляют в течение 2, 4, 6 или 8 недель после указанного введения.

Более ранний образец получают от пациента в более ранний момент времени в ходе лечения пациента, до момента времени, соответствующего получению образца для тестирования, и предпочтительно до указанного введения иммунотерапевтического средства. Более ранний образец может быть получен до осуществления (необязательно незадолго до, например, вплоть до 14 дней до осуществления), во время осуществления (например, в тот же день) или вскоре после осуществления (например, на следующий день после осуществления) указанного введения иммунотерапевтического средства. Более ранний образец может являться исходным образцом, полученным перед или в начале курса лечения иммунотерапевтическим средством (например, вплоть до 14 дней до осуществления), во время осуществления (например, в тот же день) или вскоре после осуществления (например, на следующий день после осуществления) исходного введения иммунотерапевтического средства.

Образец для тестирования обычно получают по меньшей мере через 2 недели после получения более раннего образца, с которым его сравнивают.

Таким образом можно проводить оценку того, развивается ли у пациента ответ на иммунотерапевтическое средство, где на ответ указывает одно или несколько из следующих изменений относительно более раннего образца:

снижение отношения числа дважды положительных по ICOS и F0XP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

увеличение среднего расстояния между каждой ICOS+FOXP3-клеткой и ближайшей к ней ICOS+FOXP3+ клеткой,

снижение доли FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

снижение плотности ICOS-положительных клеток.

Фактически, более ранний образец используют для получения референтных значений для одного или нескольких биомаркеров, с которыми затем сравнивают значения одного или нескольких биомаркеров из образца для тестирования.

Способ может включать наблюдение за изменением одного или нескольких указанных биомаркеров в образце для тестирования по сравнению с более ранним образцом, где указанное изменение является показателем того, что у пациента развивается ответ на иммунотерапию.

Способы согласно этому четвертому аспекту настоящего изобретения можно применять для непрерывной оценки или мониторинга пациентов, подвергаемых иммунотерапии антителом к ICOS и/или антителом к TReg, и, таким образом, необязательно периодически повторять их осуществление в течение курса терапии, в ходе чего показания для одного или нескольких биомаркеров сравнивают с предыдущими показаниями, тем самым отображая изменение одного или нескольких биомаркеров с течением времени. В дополнение к исходному образцу, который предпочтительно получают перед первым введением пациенту иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, можно осуществлять необязательное взятие образцов для измерения биомаркеров после каждого введения иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg или только после определенных введений (например, после первого введения и снова с примерными интервалами, составляющими месяц, два месяца или три месяца, где забор образцов ткани необязательно приурочен к визитам пациента в клинику для лечения). Таким образом, показания для образца для тестирования можно сравнивать с показаниями для нескольких более ранних образцов, чтобы осуществлять мониторинг изменений в отношении биомаркеров в течение продолжительного периода времени. Таким образом, способы могут предусматривать обнаружение изменений одного или нескольких биомаркеров в образце для тестирования по сравнению с более ранним образцом, при этом указанные изменения необязательно обнаруживают в серии из нескольких образцов (сравнивая образец для тестирования с несколькими более ранними образцами, например, образцами, полученными на протяжении продолжительного периода времени, составляющего некоторое количество недель или месяцев), и обнаружение сигнатуры ответа (предпочтительно сигнатуры устойчивого ответа, наблюдаемой в образце для тестирования по сравнению с несколькими более ранними образцами), где сигнатура ответа указывает на то, что у пациента развивается ответ на лечение.

Показания для биомаркеров можно использовать для обоснования клинических решений относительно дальнейшего лечения пациента. При обнаружении положительных сигналов (одного или нескольких биомаркеров, указывающих на то, что у пациента развивается ответ на лечение) иммунотерапию антителом к ICOS и/или антителом к TReg можно продолжить. В противном случае или если это перестанет иметь место в ходе длительного лечения, иммунотерапию можно прекращать и пациента необязательно можно переводить на альтернативное лечение. В качестве альтернативы может быть показано дополнение иммунотерапии одним или несколькими дополнительными видами лечения. Необязательно при выборе такого альтернативного лечения руководствуются биомаркерами, определенными в образцах. Конечно, любые такие решения касательно лечения будут также учитывать любые другие симптомы или признаки заболевания или клинического ответа у пациента, но показания биомаркеров представляют ценную и раннюю информацию относительно фармакодинамики лечения и, таким образом, обеспечивают важный сигнал для пересмотра и обновления прогноза для пациента, а также для руководства при принятии решения врачом.

В целом ожидается, что изменения нескольких биомаркеров будут характеризоваться тенденцией развития в одном и том же направлении друг относительно друга, например, все изменения указывают на ответ на лечение, а не один биомаркер четко указывает на ответ на изменение, а другой биомаркер указывает на противоположное. Более высокую точность и большую прогностическую ценность можно получить путем интегрирования выходных данных относительно нескольких показаний для биомаркеров в соответствии с формулой, где выходные данные, полученные посредством формулы, сравнивают между образцами и/или с референтными значениями, как описано в других местах в данном документе.

Может наблюдаться сигнатура ответа, где показания для одного или нескольких биомаркеров или результаты согласно формуле, рассчитанные на их основе, указывают на наличие ответа на лечение, при этом сигнатуру ответа идентифицируют посредством

измерения снижения отношения числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

измерения увеличения среднего расстояния между каждой одноположительной по ICOS клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

измерения снижения доли FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и/или

измерения снижения плотности ICOS-положительных клеток.

Изменение можно идентифицировать путем сравнения показаний для биомаркеров до и после терапии.

При наблюдении наличия сигнатуры ответа в образце для тестирования пациенту может быть назначено продолжение лечения с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg.

Степень изменения биомаркеров можно использовать для обоснования дозирования и/или составления графика терапии. Лечение можно повторно корректировать для доведения до максимума положительного изменения биомаркеров, т.е. изменения, указывающего на ответ на лечение, при этом количество и/или время введения терапевтического средства корректируют на основе самых последних данных относительно биомаркеров.

Если не имеется положительного изменения биомаркеров, т.е. биомаркеры не указывают на то, что у пациента развивается ответ на лечение, особенно если положительное изменение не наблюдается при длительном мониторинге с повторным взятием образцов, то противораковое иммунотерапевтическое лечение антителом к ICOS и/или антителом к TReg может быть прекращено для указанного пациента или для него может быть изменена схема лечения, например, с монотерапевтического лечения на комбинированное лечение.

Сигнатура ответа может указывать на то, что иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg предрасполагает пациента к ответу на другое средство лечения, такое как блокаторы иммунных контрольных точек. Это позволяет применять индивидуализированный подход к средствам комбинированной терапии, при котором дополнительное терапевтическое средство назначают избирательно для лечения пациента, у которого обнаружена сигнатура ответа. Изменения одного или нескольких биомаркеров могут указывать, например, на то, что опухоль характеризуется повышенной восприимчивостью к другому виду лечения (помимо существующей иммунотерапии антителом к ICOS и/или антителом к TReg), как например введению дополнительного терапевтического средства, и можно осуществлять мониторинг биомаркеров для определения надлежащих временных рамок введения для такого другого средства лечения. Примеры такого другого вида лечения включают введение другого иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, блокатора иммунных контрольных точек, химиотерапевтического средства, средства таргетной терапии (такого как антиангиогенные средства и ингибиторы тирозинкиназы) или лучевую терапию (или комбинации нескольких таких других видов лечения). Можно использовать средства, которые индуцируют гибель клеток иммунной системы. Любое такое другое средство лечения может вводиться пациенту в комбинации с предыдущим иммунотерапевтическим средством на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg (т.е. предыдущее лечение не прекращают) или может заменять его (т.е. предыдущее лечение прекращают, при этом пациента переводят на другое лечение).

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к определению параметров для использования биомаркеров в новых подгруппах пациентов, включая коррелирование одного или нескольких биомаркеров с прогнозом для пациента или развитием у него ответа на лечение, а также идентифицирование количественных значений биомаркера, которые позволяют дифференцировать пациентов с учетом прогноза в отношении развития опухоли или ответа на лечение. Определенные таким образом референтные значения можно использовать в других аспектах настоящего изобретения, таких как прогнозирование течения заболевания и выбор пациентов для лечения.

В этом пятом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ идентифицирования референтного значения для классификации пациентов с раковыми солидными опухолями в соответствии с ожидаемым для них прогнозом или ожидаемым для них ответом на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, предусматривающий

предоставление образцов ткани из центральной части опухоли, полученных от каждого пациента из популяции пациентов (статистически значимое количество, например, по меньшей мере 20, по меньшей мере 100), характеризующейся одним типом опухоли (солидные раковые опухоли одного и того же гистологического и/или молекулярного типа (необязательно гистологически независимые), для которых известен исход заболевания или известен ответ на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg,

определение одного или нескольких из следующих биомаркеров в каждом из указанных образцов:

(i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

(ii) среднее расстояние между каждой одноположительной по ICOS клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

(iii) доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

(iv) плотность ICOS-положительных клеток,

сопоставление данных для каждого из указанных одного или нескольких биомаркеров с данными относительно исхода заболевания или ответа на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg у каждого пациента, и

группирование данных для каждого из указанных одного или нескольких биомаркеров с определением порогового числового значения, которое определяет две группы статистически значимых данных относительно исхода заболевания или ответа на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg,

где указанное пороговое значение представляет собой референтное значение для классификации пациентов с идентичным типом раковых солидных опухолей в соответствии с ожидаемым для них прогнозом или ожидаемым для них ответом на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg.

Каждый из описанных в данном документе биомаркеров можно использовать отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими биомаркерами. Этиология и прогрессирование рака являются многофакторными, и большую прогностическую ценность можно получить с использованием комбинаций биомаркеров. Способы статистического моделирования, такие как логистическая регрессия, можно использовать для определения того, какие биомаркеры и комбинации биомаркеров обеспечивают наилучшую прогностическую ценность. Референтные значения для нескольких биомаркеров можно комбинировать с получением формулы, посредством которой пациентов можно классифицировать в соответствии с их прогнозом и/или вероятностью ответа на лечение. Такую формулу можно применять для определения вероятности того, сможет ли пациент получить пользу от терапии антителом к ICOS и/или антителом к TReg, и, таким образом, для идентифицирования пациентов для лечения с помощью терапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, где пациент, для которого наблюдается соответствие референтному значению или превышение референтного значения, рассчитанное в соответствии с формулой, получает лечение с помощью терапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg.

Далее варианты осуществления настоящего изобретения будут описаны более подробно со ссылкой на прилагаемые графические материалы. Специалистам в данной области техники будет понятно или они будут способны определить с применением только лишь рутинных экспериментов наличие многих эквивалентов конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных в данном документе. Предполагается, что такие эквиваленты входят в объем охраны, определяемый прилагаемой формулой изобретения.

Краткое описание графических материалов

На фигуре 1 представлена блок-схема способов, в которых используют биомаркеры при отборе пациентов для лечения посредством противораковой иммунотерапии антителом к ICOS в соответствии с настоящим изобретением, на которой показаны варианты осуществления процедуры сбора данных для оценки иммунной обстановки при раке и прогнозирования соответствия критериям и необходимости проведения лечения антителом к ICOS у пациентов с подтвержденным диагнозом НСС. Пациентам, для которых показатель для биомаркера является положительными (группа "да"), вводят антитело к ICOS KY1044 необязательно в комбинации с другим видом лечения. Пациентам, для которых показатель для биомаркера является отрицательными (группа "нет"), либо не назначают терапию антителом к ICOS, либо назначают терапию антителом к ICOS в комбинации с одним или несколькими другими видами лечения (например, введением других средств, которые будут оказывать эффект влияния на биомаркер, а также в отношении пересечения порога "да/нет").

На фигуре 2 представлена гистограмма, показывающая значительное увеличение плотности дважды положительных по ICOS и FOXP3 TReg в ТМЕ по сравнению с нормальной прилегающей тканью (перитуморальной).

На фигуре 3 представлена гистограмма, на которой показано значительное увеличение отношения дважды положительных по ICOS и FOXP3 TReg к общему количеству клеток TReg (все FOXP3+) в ТМЕ по сравнению с нормальной прилегающей тканью (перитуморальной).

На фигуре 4 показаны кривые Каплана-Мейера применительно к общей выживаемости с течением времени, разделенные в соответствии с плотностью ICOS-положительных клеток в ТМЕ биоптатов опухолевой ткани, пораженной НСС (n=142 пациента). 142 образца пораженной НСС ткани, полученных в когорте Taiwan NTU, стратифицировали в соответствии с наивысшим квартилем (пунктирная линия) плотности клеток с ICOS на мм² по сравнению с 3 нижними квартилями (сплошная линия), что соответствует пороговой плотности, составляющей 120 клеток на мм². Логарифмический ранговый критерий (Мантела-Кокса), р<0,05.

На фигуре 5 показаны кривые Каплана-Мейера применительно к общей выживаемости с течением времени, разделенные в соответствии с отношением ICOS+FOXP3+ к общему количеству FOXP3+ клеток в ТМЕ биоптатов опухолевой ткани, пораженной НСС (n=142 пациента). Пороговое отношение, равное 0,5, использовали для разделения популяций, характеризующихся высоким (пунктирная линия) и низким (сплошная линия) отношениями. Логарифмический ранговый критерий (Мантела-Кокса), р=0,0451.

На фигуре 6 показаны кривые Каплана-Мейера применительно к общей выживаемости с течением времени, разделенные в соответствии с в соответствии с плотностью ICOS-положительных клеток в ТМЕ биоптатов опухолевой ткани, пораженной НСС, индуцированной HBV (n=87 пациентов). 87 образцов пораженной НСС ткани, полученных в когорте Taiwan NTU, стратифицировали в соответствии с наивысшим квартилем (пунктирная линия) плотности клеток с ICOS на мм² по сравнению с 3 нижними квартилями (сплошная линия), что соответствует пороговому значению, составляющему 100 клеток на мм². Логарифмический ранговый критерий (Мантела-Кокса), р<0,05.

На фигуре 7 показаны кривые Каплана-Мейера применительно к общей выживаемости с течением времени, разделенные в соответствии с плотностью ICOS-положительных клеток в ТМЕ образцов опухолевой ткани, пораженной НСС 2 стадии по классификации AJCC (n=41 пациент). 41 образец опухолевой ткани, пораженной НСС 2 стадии по классификации AJCC, которые были получены в когорте Taiwan NTU, стратифицировали в соответствии с наивысшим квартилем (пунктирная линия) плотности клеток с ICOS на мм² по сравнению с 3 нижними квартилями (сплошная линия), что соответствует пороговому значению, составляющему 100 клеток на мм². Логарифмический ранговый критерий (Мантела-Кокса), р<0,01.

На фигуре 8 показаны кривые Каплана-Мейера применительно к безрецидивной выживаемости (% RFS), разделенные в соответствии с общей плотностью ICOS-положительных клеток в ТМЕ биоптатов опухолевой ткани, пораженной НСС 2 стадии по классификации AJCC (n=41 пациент). 41 образец опухолевой ткани, пораженной НСС 2 стадии по классификации AJCC, которые были получены в когорте Taiwan NTU, стратифицировали в соответствии с наивысшим квартилем (пунктирная линия) плотности клеток с ICOS на мм² по сравнению с 3 нижними квартилями (сплошная линия), что соответствует пороговому значению, составляющему 100 клеток на мм². Логарифмический ранговый критерий (Мантела-Кокса), р<0,05.

На фигуре 9 показаны кривые Каплана-Мейера применительно к общей выживаемости с течением времени, разделенные в соответствии со средним расстоянием от одноположительных по ICOS клеток до ближайшей к ним дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетке в ТМЕ. 142 образца пораженной НСС ткани, которые были получены в когорте Taiwan NTU, стратифицировали в соответствии с медианой среднего расстояния: малое расстояние (<105 мкм для сплошной линии) и большое расстояние (≥105 мкм, пунктирная линия). Логарифмический ранговый критерий (Мантела-Кокса), р<0,05.

На фигуре 10 показаны кривые Каплана-Мейера применительно к общей выживаемости с течением времени, разделенные в соответствии с отношением числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток в ТМЕ пораженной НСС ткани. 142 образца пораженной НСС ткани, которые были получены в когорте Taiwan NTU, стратифицировали в соответствии со значением среднего показателя, большего или меньшего чем 0,1 для дважды положительных клеток, находящихся в пределах 30 мкм от одноположительных по ICOS клеток. Низкая частота встречаемости (<0,1 для сплошной линии) по сравнению с высокой частотой встречаемости (≥0,1 пунктирной линии). р<0,05, логарифмический ранговый критерий (Мантела-Кокса).

На фигуре 11 показано снижение отношения дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток к общему числу FOXP3-положительных клеток (представляющее долю ICOS+ TReg среди всех TReg) у пациентов-людей до и после введения моноклонального антитела к ICOS KY1044. А) Когорта 1 (фиксированная доза 0,8 мг, Q3W), предусматривающая пациентов с лейомиосаркомой; В) когорта 2 (фиксированная доза 2,4 мг, Q3W), предусматривающая пациентов с карциномой неизвестной первичной локализации (окружности), почечно-клеточной карциномой (треугольники) и раком поджелудочной железы (квадраты); С) когорта 3 (фиксированная доза 8 мг, Q3W), предусматривающая пациентов с метастатическим раком предстательной железы; D) когорта 4 (фиксированная доза 24 мг, Q3W), предусматривающая пациентов с раком поджелудочной железы (окружности) и пищевода (треугольники), и Е) когорта 5 (фиксированная доза 80 мг, Q3W), предусматривающая пациентов с аденокарциномой толстой кишки (окружности), поджелудочной железы (треугольники) и мезотелиомой (квадраты).

На фигуре 12 под (А) представлено изображение среза ткани, на котором проведена граница, определяющая центральную часть опухоли, определяющая область приблизительно 2 см х 1 см, которая включает более половины среза ткани. Не относящиеся к опухоли признаки отмечены для исключения из области центральной части опухоли. Только опухолевая ткань, которая находится в пределах отмеченных границ, включается в оценку в качестве ТМЕ.

Под (В) представлено увеличенное изображение области, показанной под (А). Отображено IHC-окрашивание, включая гематоксилиновый краситель, который окрашивает все ядра клеток, и более темные области, окрашенные двумя разными хромогенами для ICOS и FOXP3 соответственно.

Под (С) представлено изображение, идентичное таковому под (В), на котором дополнительно показаны рамки в виде квадратов, представляющие дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки (идентифицированные посредством двойного окрашивания), и окружности, представляющие одноположительные по ICOS клетки (идентифицированные только посредством ICOS-специфического окрашивания, FOXP3-отрицательные). Линии, соединяющие "ближайших соседей", соединяют каждую одноположительную по ICOS клетку с ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой. Не все дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки соединены, потому что некоторые дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки в ткани не являются ближайшими дважды положительными по ICOS и FOXP3 клетками по отношению к какой-либо одноположительной по ICOS клетке.

Под (D) представлено увеличенное изображение области, показанной под (С). Расстояния измеряются между каждой одноположительной по ICOS клеткой и дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой в ТМЕ. Кратчайшее расстояние от каждой одноположительной по ICOS клетки до дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетки (т.е. расстояние до ближайшей дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетки) указано соединительной линией. Показаны индивидуальные измерения расстояния от субпопуляции одноположительных по ICOS клеток до их ближайшей дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетки, значения которых составляют 50,7, 36,6, 45,4 и 39,5 мкм соответственно, при этом такие измерения будут записываться для каждой одноположительной по ICOS клетки. Эти расстояния измеряют с использованием пакета программного обеспечения Halo®.

На фигуре 13 (А) представлен график, построенный с помощью Halo®, для области из центральной части опухоли, определяемой границами, показанными на фигуре 12 (А), с отмеченными одноположительными по ICOS клетками (черные) и дважды положительными по ICOS и FOXP3 клетками (серые), без отображения подлежащей ткани.

Под (В) представлено увеличенное изображение области, показанной под (А).

Под (С) представлено увеличенное изображение области, показанной под (В), а также представлен график, построенный с помощью Halo®, для области, показанной на фигуре 12 (С). Линии, соединяющие ближайших соседей, показаны от каждой одноположительной по ICOS клетки (окружность) к ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетке (квадрат).

На фигуре 14 (А) представлено увеличенное изображение области среза ткани, изображенного на фигуре 12(А), при этом данная область перекрывается с областью, показанной на фигуре 12(B).

Под (В) представлено изображение, идентичное (А), на котором дополнительно показаны окружности, представляющие одноположительные по ICOS клетки (идентифицированные только посредством ICOS-специфического окрашивания, FOXP3-отрицательные), и квадратные рамки, представляющие дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки (идентифицированные посредством двойного окрашивания), которые находятся в пределах 30 мкм от любой одноположительной по ICOS клетки. Линии соединяют каждую одноположительную по ICOS клетку с дважды положительными по ICOS и FOXP3 клетками в пределах 30 мкм. Дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки, которые не находятся в пределах 30 мкм от любой одноположительной по ICOS клетки, не маркируют. Одноположительные по ICOS клетки, которые не находятся в пределах 30 мкм от любой дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетки, не маркируют.

Под (С) представлено увеличенное изображение области, показанной под (В). Показаны примеры измерений расстояния между одноположительными по ICOS клетками и дважды положительными по ICOS и FOXP3 клетками в пределах 30 мкм. Эти расстояния составляют 7,4 мкм, 7,6 мкм и 15,6 мкм соответственно. Эти расстояния будут измеряться от каждой одноположительной по ICOS клетки до каждой дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетки в пределах 30 мкм от нее по всей площади ТМЕ. Эти расстояния измеряют с использованием пакета программного обеспечения Halo®.

Под (D) представлен график, построенный с помощью Halo®, для слегка увеличенного изображения области, соответствующей (В), без отображения подлежащей ткани и со всеми обнаруженными одноположительными по ICOS клетками (окружности) и дважды положительными по ICOS и FOXP3 клетками (квадраты). Линии соединяют каждую одноположительную по ICOS клетку с дважды положительными по ICOS и FOXP3 клетками в пределах 30 мкм.

На фигуре 15 под (А) представлено изображение среза ткани, на котором проведена граница, определяющая центральную часть опухоли, определяющая область приблизительно 2 см х 2 см, которая включает большую часть среза ткани. Не относящиеся к опухоли признаки отмечены для исключения из области центральной части опухоли. Только опухолевая ткань, которая находится в пределах отмеченных границ, включается в оценку в качестве ТМЕ.

Под (В) представлен график, построенный с помощью Halo®, для области из центральной части опухоли, определенной границами, показанными под (А), с отмеченными дважды положительными по ICOS и FOXP3 клетками (серые окружности) и одноположительными по FOXP3 клетками (черные треугольники), без отображения подлежащей ткани.

Под (С) представлено увеличенное изображение области, показанной под (В).

Под (D) и (Е) представлено отсканированное изображение и график, построенный с помощью Halo®, соответственно для области в пределах (С). Элемент ткани, исключенный из области ТМЕ, обведен. Под (D) отображено IHC-окрашивание, включая гематоксилиновый краситель, который окрашивает все ядра клеток, и более темные области, окрашенные двумя разными хромогенами для ICOS и FOXP3 соответственно. Под (Е) дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки отмечены серыми кругами и FOXP3 одинарные положительные клетки отмечены черными треугольниками, а отображение подлежащей ткани не показано. Подробное описание

Предоставление образцов опухолевой ткани

Для оценки клеточного состава, иммунной обстановки и специфического пространственного расположения в пределах ТМЕ предоставляют образец опухолевой ткани in vitro. Образец можно получать из резецированной опухоли после излечивающей хирургической операции (хирургической операции по иссечению опухоли) или из биопсийного образца, полученного из опухоли, остающейся in vivo. Резецированная ткань является более предпочтительной ввиду простоты анализа ввиду большего объема ткани, который обычно доступен, но в равной степени можно использовать биопсийный материал (например, полученный при толстоигольной пункционной биопсии). Альтернативным вариантом является тонкоигольная пункционная биопсия, хотя образец должен содержать достаточное количество ткани из центральной части опухоли, чтобы анализ был репрезентативным, поэтому предпочтительными являются способы более масштабного отбора образцов (например, открытая биопсия). В качестве альтернативы, если системы визуализации in vivo позволяют оценивать биомаркеры непосредственно in situ в пределах ТМЕ, стадия отбора образца путем хирургического вмешательства может быть опущена. В целом, однако, способы по настоящему изобретению обычно осуществляют в отношении образцов in vitro.

В дополнение к раковым клеткам, составляющим основную массу центральной части опухоли, ТМЕ содержит ряд различных иммунных клеток, таких как Т-лимфоциты различных подтипов, моноциты, нейтрофилы, дендритные клетки и макрофаги.

Оценку экспрессии белка в клинических биоптатах часто проводят на микроскопических препаратах со срезами тканей, подвергнутых фиксированию формалином и заливке парафином (FFPE), для оценки характеристик опухоли и экспрессии индикаторных прогностических маркеров. Их можно использовать, чтобы обеспечить помощь при индивидуальном подборе корректного лечения для данного пациента или ретроспективном установлении различий между пациентами, способными демонстрировать ответ, и пациентами, не способными демонстрировать ответ, по отношению к данной терапии, что осуществляют путем идентифицирования новых биомаркеров.

После получения образца ткани (например, из резецированной ткани или биопсийных образцов) его обычно обрабатывают для сохранения его целостности и его подготовки к тестированию. Ткань можно фиксировать в 10% формалине с последующей заливкой парафином, при этом стандартные параметры формы блока предусматривают 0,5 х 1 х 1 см. Альтернативой этому способу является процедура заморозки в свежем виде, при которой ткани можно погружать в среду для получения срезов при оптимальной температуре (ОСТ) и мгновенно замораживать в сухом льде перед переносом в жидкий азот для длительного хранения. Способ FFPE предлагает преимущества длительного хранения при комнатной температуре, в то время как заморозка в свежем виде является более быстрым способом для обеспечения хранения тканей и сохраняет антигены в нативном формате, но требует доступа к сухому льду для подготовки и транспортировки и к жидкому азоту для длительного хранения.

Для исследования может быть предоставлен двухмерный срез образца ткани. Получают как минимум один срез в расчете на пациента или на опухоль. Необязательно можно получать несколько срезов из одного и того же образца ткани или из нескольких образцов, например, из разных областей одной опухоли или из нескольких опухолей. Для образцов, подвергнутых FFPE, блоки загружают в микротом для нарезания срезов толщиной от 4 до 5 микрон и закрепляют на предметном стекле, подходящем для окрашивания, обычно имеющем стандартный размер 25 мм х 75 мм. Свежезамороженные блоки нарезают и закрепляют аналогичным образом с помощью криостата, который по сути является микротомом в морозильной камере, что позволяет срезам оставаться замороженными в ходе процедуры. Затем срезы тканей предоставляют для тестирования, чтобы определить показания для биомаркеров, например, посредством иммуногистохимического (IHC) исследования и анализа цифровых изображений.

Область центральной части опухоли в срезе ткани можно определить для оценки. Резецированная ткань часто будет содержать не относящиеся к опухоли ткани в дополнение к опухолевой ткани. Это может иметь место и для биопсированной ткани, хотя биопсийный образец может просто состоять из ткани из центральной части опухоли. Размеры опухоли обычно определяет патолог, который может определить край опухоли в образце ткани. Область внутри опухоли (>500 мкм внутрь от края) называется центральной частью опухоли, и микроокружение опухоли относится к этой области. ТМЕ можно контрастировать с перитуморальной стромой, которая определяется как ткань, находящаяся в пределах >500 мкм снаружи от края опухоли, и обычно предусматривает нормальную нераковую ткань, которая может принадлежать к тому же типу ткани или органу, из которого образуется опухоль, или не принадлежать к нему. Границу, представляющую край опухоли, можно провести либо непосредственно на микроскопическом препарате для IHC (например, вручную на стекле), либо предпочтительно электронными средствами в виде визуального наложения на цифровое изображение среза ткани. Край опухоли, как правило, имеет произвольную форму, и в двух измерениях на срезе ткани он может быть представлен в виде одной петли или, например, когда на срезе появляется несколько участков опухолевой/не относящейся к опухоли ткани, он может предусматривать несколько петель. При аннотировании среза ткани могут также быть определены границы вокруг одной или нескольких областей, которые подлежат исключению из ТМЕ, как например артефакты или складки ткани. Фигура 12.

Обнаружение ICOS

Последовательности ICOS человека, мыши и яванского макака доступны в NCBI под NCBI ID: NP_036224.1 для человека, под NCBI ID: NP_059508.2 для мыши и GenBank ID: ЕНН55098.1 для яванского макака. Поскольку пациенты, рассматриваемые в настоящем изобретении, предпочтительно являются пациентами-людьми, ссылки в данном документе на ICOS относятся к ICOS человека или предусматривают его, если контекст не требует иного.

ICOS является маркером активированных Т-клеток. ICOS-положительные клетки можно идентифицировать путем обнаружения рецептора ICOS на клеточной поверхности. ICOS-связывающее средство, такое как антитело, например, клон D1K2T антитела к ICOS, приводят в контакт со срезом ткани в условиях, обеспечивающих связывание между средством и ICOS, если он присутствует. Средство либо поддается обнаружению само по себе (например, несет поддающуюся обнаружению метку), либо поддается обнаружению опосредованно путем специфичного связывания меченого вторичного средства со средством на основе антитела к ICOS (например, вторичное антитело, которое несет поддающуюся обнаружению метку). Например, при использовании IHC-анализа антитело к ICOS (например, D1K2T, которое представляет собой IgG кролика) связывается с ICOS-положительными клетками и обнаруживается с помощью вторичного антитела (например, антитела к Fc IgG кролика), несущего поддающуюся обнаружению метку. Избыток несвязанного средства удаляют при промывке, а затем обнаруживают поддающуюся обнаружению метку для локализации ICOS в ткани, тем самым идентифицируя присутствие и местоположение ICOS-положительных клеток.

ICOS-положительная (ICOS+) клетка представляет собой клетку, которая экспрессирует ICOS в форме, поддающейся обнаружению с применением таких способов, как описанные в данном документе. ICOS-положительные клетки могут экспрессировать другие маркеры в дополнение к ICOS, такие как FOXP3. ICOS-положительная клетка может быть отрицательной в отношении FOXP3, в случае чего ее также можно обозначать как одноположительная по ICOS клетка (в частности, когда ICOS является единственным антигеном, обнаруженным среди множества антигенов, на которые проводилось окрашивание) или ICOS+FOXP3- (ICOS-положительная FOXP3-отрицательная) клетка. ICOS-положительная клетка может быть положительной в отношении FOXP3, в случае чего ее также можно обозначать как дважды положительная по ICOS и FOXP3 клетка или IC0S+FOXP3+ клетка. И наоборот, ICOS-отрицательная (ICOS-) клетка представляет собой клетку, на которой ICOS не поддается обнаружению с применением таких способов, как описанные в данном документе (например, клетка демонстрирует отсутствие уровня метки ICOS, значительно превышающего фоновый уровень в IHC-анализе).

Обнаружение FOXP3

FOXP3 является маркером TReg. FOXP3-положительные клетки можно идентифицировать путем обнаружения FOXP3 внутри клеток. FOXP3 представляет собой внутриклеточную молекулу, поэтому образцы тканей следует обрабатывать для высвобождения антигена, например, путем инкубации с детергентом. FOXP3-связывающее средство, такое как антитело, например, клон 236А/Е7 антитела к FOXP3, приводят в контакт со срезом ткани в условиях, обеспечивающих связывание между средством и FOXP3, если он присутствует. Средство либо поддается обнаружению само по себе (например, несет поддающуюся обнаружению метку), либо поддается обнаружению опосредованно путем специфичного связывания меченого вторичного средства со средством на основе антитела к FOXP3 (например, вторичное антитело, которое несет поддающуюся обнаружению метку). Например, при использовании IHC-анализа антитело к FOXP3 (например, клон 236А/Е7) связывается с ICOS-положительными клетками и обнаруживается с помощью вторичного антитела, несущего поддающуюся обнаружению метку. Избыток несвязанного средства удаляют при промывке, а затем обнаруживают поддающуюся обнаружению метку для локализации FOXP3 в ткани, тем самым идентифицируя присутствие и местоположение FOXP3-положительных клеток.

FOXP3-положительная (FOXP3+) клетка представляет собой клетку, которая экспрессирует FOXP3 в форме, поддающейся обнаружению с применением таких способов, как описанные в данном документе. FOXP3-положительные клетки могут экспрессировать другие маркеры в дополнение к FOXP3, такие как ICOS. FOXP3-положительная клетка может быть отрицательной в отношении ICOS, в случае чего ее также можно обозначать как одноположительная по FOXP3 клетка (в частности, когда FOXP3 является единственным антигеном, обнаруженным среди множества антигенов, на которые проводилось окрашивание) или ICOS- FOXP3+ (ICOS-отрицательная FOXP3-положительная) клетка. FOXP3-положительная клетка может быть положительной в отношении ICOS, в случае чего ее также можно обозначать как дважды положительная по ICOS и FOXP3 клетка или ICOS+FOXP3+ клетка. И наоборот, FOXP3-отрицательная (FOXP3-) клетка представляет собой клетку, на которой FOXP3 не поддается обнаружению с применением таких способов, как описанные в данном документе (например, клетка демонстрирует отсутствие уровня метки FOXP3, значительно превышающего фоновый уровень в IHC-анализе).

Иммуногистохимический анализ

Срезы тканей можно окрашивать для визуализации антигенов с применением IHC-анализа. Вкратце, IHC-анализ предусматривает инкубирование среза ткани с антиген-специфическим средством (например, антителом), чтобы обеспечить связывание агента с его когнатным антигеном, отмывание избытка несвязанного средства и обнаружение присутствия связанного средства, тем самым визуализируя присутствие и локализацию антигена в ткани. IHC-анализ можно проводить непосредственно с использованием непосредственно связанных репортерных антител или опосредованно посредством связывания антигена первичным антителом с последующим связыванием или конъюгацией со вторичными антителами. В то время как первый вариант может быть более эффективным по времени, последний вариант может обеспечить более гибкий подход с преимуществом усиления сигнала. IHC-анализ можно проводить в мультиплексном режиме в отношении одного и того же среза ткани с использованием нескольких различных антиген-специфических средств с целью обнаружения и локализации нескольких разных антигенов, используя разные

сигналы/репортеры/метки для разных антигенов, например, флуоресцентный или ферментный мультиплексный IHC [N29; N30; N31; N32; N33].

IHC-анализ обычно используется по отношению к срезам подвергнутых FFPE и свежезамороженных тканей. Чтобы начать процедуру IHC-анализа микроскопических препаратов со срезами тканей, подвергнутых FFPE, сначала удаляют парафин с поверхности ткани посредством серии процедур инкубации в ксилоле, этаноле и воде. Ввиду покрытия эпитопов антигена фиксатором, для микроскопических препаратов со срезами тканей, подвергнутых FFPE, обычно требуется прохождение процедуры, называемой демаскировкой антигена, представляющей собой процедуру, в ходе которой происходит разрушение метиленовых мостиков фиксатора с "обнажением" представляющего интерес антигена, что обеспечивает для антител возможность связывания. Этого можно достичь двумя основными способами: индуцированной высокой температурой демаскировкой эпитопа (HIER) и индуцированной протеазами демаскировкой эпитопа (PIER) [N34; N35]. В ходе HIER предметное стекло с помещенной на него тканью кипятят в течение нескольких минут перед промывкой, и обычно эту процедуру выполняют с использованием варочного автоклава, микроволновой печи или пароварки, в то время как PIER представляет собой процедуру инкубации с определенным ферментом, таким как трипсин или протеиназа К, в течение нескольких минут при 37°С перед промывкой. Следует обратить внимание, что точное время каждой процедуры необходимо оптимизировать в зависимости от используемой методики и антигена, который демаскируют, для обеспечения оптимального демаскирования и предотвращения повреждения ткани. Напротив, микроскопические препараты со срезами свежезамороженных тканей не требуют стадии демаскирования антигена, но потребуют короткой стадии фиксации при окрашивании внутриклеточных мишеней, таких как FOXP3. Обычно это выполняют с использованием спирта, который в отличие от параформальдегида не маскирует антигенные эпитопы.

Для окрашивания внутриклеточных мишеней, таких как FOXP3, микроскопические препараты со срезами тканей, подвергнутых FFPE, а также со срезами фиксированных свежезамороженных тканей инкубируют в детергенте, таком как 0,25% Triton-X 100 в PBS, в течение 15-30 минут при комнатной температуре перед промывкой. Затем ткани блокируют для предотвращения неспецифического связывания первичных антител путем инкубации с блокирующим буфером в течение 1 часа при комнатной температуре. Эндогенная щелочная фосфатаза (АР) в тканях также может оставаться в большом количестве в микроскопических препаратах, полученных из замороженной ткани, и требует блокирования левамизолом на этой стадии. После того как образцы ткани были подвергнуты блокированию, представляющий интерес антиген можно затем окрашивать первичными антиген-специфическими антителами (антителом к ICOS и антителом к FOXP3). Следует обратить внимание, что антиген-специфические антитела должны быть подтверждены для применения в IHC-окрашивании, поскольку они должны связываться с мишенью в соответствии с описанными выше способами. Первичные антитела должны быть специфичными для данного эпитопа на представляющей интерес мишени и не должны связываться с другими нерелевантными мишенями, чтобы избежать окрашивания фона или ложноположительного окрашивания. Наиболее убедительным доказательством специфичности антител является отсутствие связывания в тканях или клетках, являющихся нокаутными по рассматриваемому антигену. Избыток несвязанного антитела удаляют посредством промывки. Затем для хромогенного IHC-анализа микроскопические препараты следует подвергнуть блокированию в отношении пероксидазной активности путем инкубирования в перекиси водорода в метаноле. Затем, если первичное антитело не является непосредственно меченым, инкубируют вторичное антитело, конъюгированное с репортером, и после заключительных стадий промывки проводят обнаружение репортера.

Применение различных репортеров может обуславливать разные преимущества и недостатки. В хромогенном IHC-анализе используют фрагменты, связанные с ферментом, которые катализируют превращение субстратов в нерастворимые окрашенные осадки, что позволяет визуализировать данный антиген [2 9; 30]. Окрашивание является перманентным, характеризующимся малой вероятностью того, что оно со временем ухудшится, и его можно использовать параллельно с гистологическими красителями, такими как гематоксилин и эозин. Однако оценить можно только небольшое количество антигенов ввиду малого количества ферментов и ферментных субстратов, являющихся коммерчески доступными. В иммунофлуоресцентном (IF) IHC-анализе используются антиген-специфические антитела, связанные с флуоресцентными фрагментами, что позволяет параллельно использовать большее количество маркеров для окрашивания. К недостаткам этого способа относят ухудшение сигнала с течением времени и наложение спектров между флуорофорами при оценке нескольких антигенов [31; 33]. Для целей настоящего изобретения обе формы IHC-анализа более чем подходят для окрашивания ICOS и FOXP3. В качестве примера процедуры окрашивания с использованием хромогенного IHC-анализа, ткани следует окрашивать как в отношении ICOS, так и в отношении FOXP3 с использованием двух первичных антител животных разной видовой принадлежности, например IgG мыши и овцы, а затем двух вторичных антител, нацеливающихся на первичные антитела животных различной видовой принадлежности, представляющих собой антитела к мышиному иммуноглобулину и антитела к овечьему иммуноглобулину, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) или щелочной фосфатазой (АР). Затем экспрессию ICOS и FOXP3 можно выявить путем применения двух разных красителей, которые реагируют с HRP или АР, например, DAB и BCIP/NBT, окрашивая ткань в коричневый и синий/черный цвета соответственно.

Иммунофлуоресценция с серийным окрашиванием, такая как цитометрия на чипе, представляет собой процедуру, способную обеспечивать количественный анализ нескольких антигенов посредством окрашивания антиген-специфическими антителами, связанными с флуоресцентными фрагментами на подвергнутых FFPE или свежезамороженных тканях. Флуоресценцию можно оценивать с помощью визуализации с расширенным динамическим диапазоном в сочетании с программным обеспечением на основе искусственного интеллекта для получения результатов анализа типов клеток в срезе [N36]. Как пояснялось ранее, свежезамороженные срезы не требуют демаскирования антигена и, следовательно, обеспечивают более качественные результаты по сравнению с подвергнутой FFPE тканью при применении данного способа. Тем не менее, осуществление методики цитометрии на чипе все еще возможно на микроскопических препаратах со срезами тканей, подвергнутых FFPE, при добавлении стадии демаскирования антигена с целью получения аналогичных демаскированных антигенов, необходимых для этого анализа. После этого ткань, представленную как подвергнутыми FFPE, так и свежеполученными тканями, можно затем повторно фиксировать на цитометрических чипах посредством стандартной процедуры. Затем ткани можно окрашивать на наличие вплоть до пяти отдельных антигенов в ходе осуществления способа, аналогичного описанному выше для стандартного IHC-анализа, с использованием пяти непосредственно меченых первичных антител. Например, два первичных антитела, нацеленные на ICOS и FOXP3, непосредственно конъюгированные с двумя разными флуорофорами, например, АРС и GFP, будут обеспечивать возможность различать экспрессию антигенов ICOS и FOXP3 в тканях при анализе. Затем можно провести оценку пространственного расположения в ткани, предпочтительно осуществляемую с помощью программного обеспечения. Одно из основных отличий этой методики от стандартного IHC-анализа заключается в том, что процедура фиксации стабилизирует ткань, что позволяет хранить ее вплоть до 2 лет при комнатной температуре. Кроме того, это позволяет обесцвечивать ткань, чтобы погасить флуоресценцию антител без повреждения, что позволяет повторно окрашивать ткань в отношении дополнительных пяти антигенов. Посредством процедуры повторного окрашивания и отбеливания можно окрасить почти неограниченное количество белковых биомаркеров на одном и том же микроскопическом препарате с высоким разрешением и низкой фоновой флуоресценцией.

Визуализация на основе масс-цитометрии (MCI) является альтернативой способам стандартного ферментного или флуоресцентного IHC-анализа, описанным выше. Масс-цитометрия с визуализацией (IMC) и мультиплексная ионно-лучевая визуализация (MIBI) представляют собой две формы нового способа визуализации, преставляющего собой визуализацию на основе масс-цитометрии, которые могут обеспечивать чрезвычайно подробную информацию относительно экспрессии нескольких антигенов как в подвергнутых FFPE, так и в свежезамороженных образцах в пределах заданной области [N37; N38]. В IMC ткани окрашивают антиген-специфическими первичными антителами, меченными металлом, затем можно оценивать экспрессию каждого антигена путем последовательной абляции очень небольших областей ткани (например, 1 мкм²) концентрированным лазерным лучом и анализа долей конкретных ионов металлов путем определения их удельной массы с использованием времяпролетной цитометрии (CyTOF). В качестве альтернативы, при использовании MIBI процедура характеризуется высокой схожестью, за исключением того, что первичный ионный пучок, генерируемый дуоплазматроном с помощью кислородной плазмы, используют для растеризации ткани, последовательно подвергая абляции тонкий слой и высвобождая изотопы металлов в виде ионов [N39; N40; N41; N42; N43]. В обоих случаях количество антиген-специфических антител в каждом срезе можно оценивать путем количественного определения удельной массы меток, представленных металлом, с разрешением до 1 Да, после чего с использованием полученной информации реконструируют высокодетализированное цифровое изображение всей ткани. Например, следуя способу окрашивания, аналогичному описанному для стандартного IHC-анализа, и используя при необходимости демаскирование антигена, ткани окрашивают первичными антителами к ICOS и FOXP3, связанными с изотопами редкоземельных и тяжелых металлов, такими как ¹⁰²Pd и ²⁰⁹Bi (возможны многие другие изотопы тяжелых металлов) [N44]. Затем экспрессию ICOS и FOXP3 в ткани будут подвергать последовательному анализу с применением процедуры, описанной выше. Ввиду разрешения, обеспечиваемого этой методикой, ее можно использовать для оценки любых параметров ткани и биомаркеров, описанных в данном документе. Способность различать изотопы до 1 Да позволяет параллельно анализировать посредством MCI до 40 маркеров, избегая при этом проблем спектрального наложения. Таким образом, на одном и том же микроскопическом препарате можно одновременно оценивать несколько типов клеток. Кроме того, методика не ограничена затуханием сигнала или фоновой флуоресценцией.

Анализ цифровых изображений

Образцы тканей, предоставленные в виде срезов, можно рассматривать под микроскопом. Светлопольное освещение подходит для визуализации контрастных красителей для IHC-анализа. Образец ткани можно сканировать для получения цифрового изображения ткани (например, увеличенного светлопольного изображения). Увеличение изображения, например, 20-кратное или 40-кратное, облегчает анализ. Изображение можно аннотировать для определения области, относящейся к центральной части опухоли, как описано. В работе, описанной в данном документе, авторы настоящего изобретения сканировали микроскопические препараты IHC-окрашенных тканевых срезов толщиной 5 мкм при 20-кратном увеличении с использованием цифрового сканера Hamamatsu Nanozoomer в светлопольном режиме.

Чтобы получить показания для биомаркеров из определенной области центральной части опухоли, можно осуществлять подсчет клеток и измерять межклеточные расстояния. Предпочтительно подсчет клеток и измерение расстояния автоматизированы с использованием анализа цифровых изображений с помощью программного обеспечения. Авторами настоящего изобретения использовалась платформа HALO® (Indica Labs) для проведения анализа цифровых изображений. Вкратце, способ предусматривал 3-хромогенную цветовую деконволюцию для разделения IHC-хромогенов для ICOS и FOXP3 соответственно и контрастного окрашивания ядер. Клеточные объекты формировали путем применения взвешенных значений оптической плотности для отдельных хромогенов. Затем каждый положительный тип клеток идентифицируют с использованием определенных параметров размера, формы и окрашивания внутриклеточных компартментов. Окрашивание фона, которое не соответствует мечению клеток, идентифицировали и вычитали, вследствие чего на присутствие ICOS или FOXP3 указывал уровень окрашивания, превышающий фоновый уровень. Была осуществлена разработка и интеграция в алгоритм классификатора для автоматической сегментации представляющих интерес областей ткани для анализа. Дополненный алгоритм применяли ко всем изображениям срезов ткани в исследовании, проводимом автоматизированным и объективным образом, с получением подробных данных относительно каждой клетки.

Плотность клеток

Плотность для клетки определенного типа в ТМЕ представляет собой общее количество этих клеток, деленное на площадь ТМЕ, и обычно выражается как количество клеток на мм². Представляющий интерес тип клеток можно идентифицировать на срезе ткани (или его изображении) путем обнаружения маркеров, таких как ICOS и FOXP3, как подробно описано в других местах данного документа, что позволяет подсчитывать количество клеток. Как описано, подсчет можно автоматизировать с использованием программного обеспечения для подсчета всех объектов в заданном поле зрения, которые соответствуют определенным критериям, ввиду чего можно предоставлять для программного обеспечения инструкции, предусматривающие подсчет всех ICOS-положительных клеток в центральной части опухоли. Если обнаруживаются другие клеточные маркеры помимо ICOS, это количество клеток может предусматривать несколько отдельных популяций, например, одноположительные по ICOS клетки и дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки. Общее количество ICOS-положительных клеток представляет собой все клетки, на которых ICOS обнаруживается на уровне, превышающем фоновый уровень, таким образом, включая одноположительные по ICOS клетки, а также клетки, на которых ICOS присутствует в дополнение к другим обнаруживаемым маркерам, в том числе дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки. Площадь центральной части опухоли (ТМЕ) также можно определять с использованием автоматизированного программного обеспечения, обеспечивая указания для программного обеспечения путем проведения границы вокруг центральной части опухоли, как описано в данном документе. Количество ICOS-положительных клеток в ТМЕ делят на площадь указанного ТМЕ с получением значения плотности.

Повышенная плотность ICOS-положительных клеток в ТМЕ является биомаркером ответа на иммунотерапевтические средства на основе антител к ICOS, которые также могут обеспечивать истощение количества или подавление активности TReg, такие как антитело к ICOS KY1044. Примеры 2, 3, 4 и 8 иллюстрируют определение и применение этого биомаркера.

Доля (ICOS+FOXP3+) клеток/общее число FOXP3+ клеток Эту долю или отношение рассчитывают путем определения количества дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток в ТМЕ, определения количества FOXP3-положительных клеток в ТМЕ и деления первого значения на второе. Представляющий интерес тип клеток можно идентифицировать на срезе ткани (или его изображении) путем обнаружения маркеров (ICOS, FOXP3), как подробно описано в других местах данного документа, что позволяет подсчитывать количество клеток. Как описано, подсчет можно автоматизировать с использованием программного обеспечения для подсчета всех объектов в заданном поле зрения, которые соответствуют определенным критериям, ввиду чего можно предоставлять для программного обеспечения инструкции, предусматривающие подсчет всех FOXP3-положительных клеток в центральной части опухоли. Если обнаруживаются другие клеточные маркеры помимо FOXP3, это количество клеток может предусматривать несколько отдельных популяций, например, одноположительные по FOXP3 клетки и дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки. Общее количество FOXP3-положительных клеток представляет собой все клетки, на которых FOXP3 обнаруживается на уровне, превышающем фоновый уровень, таким образом, включая одноположительные по FOXP3 клетки, а также клетки, на которых FOXP3 присутствует в дополнение к другим обнаруживаемым маркерам, в том числе дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки. Площадь центральной части опухоли (ТМЕ) также можно определять с использованием автоматизированного программного обеспечения, обеспечивая указания для программного обеспечения путем проведения границы вокруг центральной части опухоли, как описано в данном документе. Количество дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток в ТМЕ делят на количество FOXP3-положительных клеток в ТМЕ с получением величины отношения.

Поскольку FOXP3 является маркером TReg, это отношение можно обозначать как доля ICOS+ TReg. Высокая доля TReg, которую составляют ICOS+ клетки, представляет собой биомаркер, указывающий на иммуносупрессивное ТМЕ. Наличие этого биомаркера указывает на то, что иммунотерапевтическое средство может принести пользу пациенту. В одном варианте осуществления для классификации пациентов используют пороговое значение, составляющее 50% (отношение, составляющее 0,5). Таким образом, например, пациента с НСС выбирают для лечения антителом к ICOS и/или антителом к TReg, если результаты тестирования образца опухолевой ткани, взятого у пациента, указывают на то, что более 50% FOXP3+(TReg) клеток в ТМЕ являются ICOS+ клетками. Примеры 1, 2, 8 и 9 иллюстрируют определение и применение этого биомаркера.

Межклеточная пространственная близость

После идентификации местоположений типов клеток, осуществляемой путем обнаружения маркеров, как описано, можно измерить расстояния между этими клетками. Измерения следует проводить от центра ядра к центру ядра, который обычно является серединой клетки в Т-клетках, которые в ТМЕ имеют компактную округлую форму.

Среднее расстояние между каждой одноположительной по ICOS клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой определяют путем измерения кратчайшего расстояния от одноположительной по ICOS клетки до дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетки, повторяя эту процедуру для каждой одноположительной по ICOS клетки, и деления суммы этих кратчайших расстояний на количество одноположительных по ICOS клеток. Как и в случае других описанных в данном документе биомаркеров, измерения проводят в области, относящейся к центральной части опухоли (ТМЕ), в образце ткани (например, на цифровом изображении среза ткани).

Пространственная близость между дважды положительными по ICOS и FOXP3 клетками и одноположительными по ICOS клетками представляет собой близость в высокой степени иммуносупрессивных клеток к TEff. Непосредственная пространственная близость (небольшое расстояние) является биомаркером, указывающим на иммуносупрессивное ТМЕ. Наличие этого биомаркера указывает на то, что иммунотерапевтическое средство может принести пользу пациенту. Примеры 5 и 8 иллюстрируют определение и применение этого биомаркера.

Зональное влияние

Авторами настоящего изобретения коэффициент зонального влияния определяется как отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток.

Значение отношения можно найти путем идентификации всех дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток в ТМЕ, идентификации всех одноположительных по ICOS (т.е. ICOS+FOXP3-) клеток в ТМЕ, затем выбора субпопуляции дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, которые находятся в пределах определенного радиуса относительно любой (одной или нескольких) одноположительной по ICOS клетки в ТМЕ, и деления числа, которым характеризуется эта субпопуляция, на число одноположительных по ICOS клеток.

Дважды положительную по ICOS и FOXP3 клетку учитывают при подсчете, если она находится в пределах определенного радиуса относительно любой одноположительной по ICOS клетки. Ее не учитывают при подсчете, если она не находится в пределах определенного радиуса относительно любой одноположительной по ICOS клетки. Дважды положительную по ICOS и FOXP3 клетку, которая находится в пределах определенного радиуса относительно нескольких одноположительных по ICOS клеток, учитывают при подсчете только один раз. Таким образом, эта субпопуляция подсчитанных клеток предусматривает все дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки, которые находятся в пределах определенного радиуса влияния какой-либо одноположительной по ICOS клетки в ТМЕ.

Подсчитанное число дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток затем делят на число одноположительных по ICOS клеток в ТМЕ. Подсчитанное количество одноположительных по ICOS клеток представляет собой общее подсчитанное количество, предусматривающее все одноположительные по ICOS клетки в ТМЕ, независимо от того, характеризуются ли эти клетки наличием дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетки в пределах предусматриваемого для них определенного радиуса.

Этот расчет обеспечивает получение коэффициента зонального влияния. Предпочтительным является радиус, составляющий 30 мкм. Размер лимфоцитарных клеток варьируется в пределах 7-15 мкм в диаметре. Ближайшая внеклеточная среда оказывает влияние на клетку, и в тех случаях, когда две клетки находятся в пределах примерно 30 мкм друг от друга, можно ожидать наличия взаимодействия посредством растворимых форм межклеточных медиаторов и потенциально посредством прямого межклеточного контакта. Иммуносупрессивные TReg, такие как дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки, могут подавлять FOXP3-отрицательные лимфоциты путем прямого взаимодействия или путем высвобождения иммуносупрессивных цитокинов, таких как IL10 и TGFβ. Таким образом, для идентификации клеток, находящихся в зоне влияния друг друга, авторами настоящего изобретения определен радиус, составляющий 30 мкм, вокруг представляющих интерес клеток, в данном случае ICOS+FOXP3- клеток. Настоящее изобретение не ограничено точным расстоянием этого радиуса, и могут быть обозначены более широкие (например, 50 мкм) или более узкие (например, 20 мкм) зоны, например, в пределах примерно 50% (15-45 мкм) или 20% (24-30 мкм) от предложенного значения, составляющего 30 мкм. Примеры 6 и 8 иллюстрируют определение и применение биомаркера зонального влияния.

Солидные раковые опухоли

Виды рака обычно классифицируют по типу ткани, в которой возникает рак (гистологический тип), или по первичному очагу, представляющему собой местоположение в организме, где впервые произошло развитие рака. Классификация рака является предметом международного стандарта ICD-O-3, разработанного Всемирной организацией здравоохранения [N45], включенного в данный документ посредством ссылки. Ось морфологии предусматривает пятизначные коды в диапазоне от М-8000/0 до М-9989/3. Первые четыре цифры обозначают конкретный гистологический термин. Пятая цифра после косой черты (/) представляет собой код, характеризующий поведение, который указывает, является ли опухоль злокачественной, доброкачественной, in situ или неопределенной (независимо от того, является ли она доброкачественной или злокачественной). Также предусмотрен отдельный однозначный код для гистологической градации (дифференциации).

При рассмотрении когорт пациентов и вычисленных на их основе референтных значений биомаркеров предпочтительно, чтобы референтное значение было вычислено для пациентов с опухолями одного и того же типа. Опухоли могут относиться к одной и той же физиологической категории (например, все относятся к видам карциномы, все относятся к видам саркомы, или все относятся к видам миеломы, необязательно включая опухоли смешанного типа, охватывающие более одной категории) и предпочтительно к одному и тому же типу ткани, необязательно к морфологическому типу, классифицируемому в соответствии с ICD-O-3 (например, НСС М-8170/3). Тип опухоли может представлять собой, например, рак печени, например, НСС (например, М-8170/3, М-8171/3, М-8172/3, М-8173/3, М-8174/3 или М-8175/3 по ICD-O-3), почечно-клеточный рак (необязательно почечно-клеточную карциному, например, светлоклеточную почечно-клеточную карциному), рак головы и шеи, меланому (необязательно злокачественную меланому), немелкоклеточный рак легкого (например, аденокарциному), рак мочевого пузыря, рак яичника, рак шейки матки, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак молочной железы или герминогенную карциному яичка, включая метастазы любой солидной опухоли, такой как перечисленные.

Было обнаружено, что пациенты с меньшей вероятностью отвечают на системную иммунотерапию антителом к PD-1, если имеющаяся у них опухоль метастазировала в печень. Пациентов с метастазами в печень часто исключают из клинических испытаний. Lee et al. [N46] предположили, что антиген-специфические TReg активируются в печени и что эти "тренированные печенью" TReg затем подавляют более обширный противоопухолевый иммунный ответ у пациента. Доклинические исследования показали, что у пациентов с метастазами в печень чувствительность опухоли к ингибиторам иммунных контрольных точек, таким как антитело к PD-1, можно улучшить за счет истощения количества TReg.

Это обоснование может распространяться на НСС, которая метастазирует в другие ткани организма, такие как кость и легкие. В данном случае первичная опухоль находится в печени и метастазы являются отдаленными, но может иметь место эффект, описанный Lee et al., а именно, опухолевые антиген-специфические TReg активируются в печени и распространяют иммуносупрессивный эффект, который снижает в других тканях чувствительность опухолей к лечению ингибитором иммунной контрольной точки.

Таким образом, в вариантах осуществления настоящего изобретения опухоль может быть представлена следующим:

- первичная опухоль печени (например, НСС);

- метастазы в печень, т.е. опухоль непеченочного происхождения, возникшая в другом органе и давшая метастазы в печень; или

- опухоль в очаге, отличном от печени, где у пациента также имеет место метастазирование опухоли в печень.

В вариантах осуществления настоящего изобретения пациентом является тот, у кого имеется опухоль в печени, которая необязательно представляет собой либо первичную опухоль печени (например, НСС), либо представлена метастазами в печень.

Настоящее изобретение может предусматривать идентификацию пациентов с такими опухолями как подходящих для лечения посредством иммунотерапии на основе антитела к TReg, где такое лечение также предусматривает введение ингибитора иммунной контрольной точки (например, антитела к PD-1 или антитела к PD-L1).

Гепатоцеллюлярная карцинома (НСС)

Первичный рак печени в настоящее время является четвертой по величине причиной смертности от рака во всем мире, и большинство случаев рака печени приходится на НСС. Канцерогенез НСС связывают с хроническим воспалением печени, преимущественно в результате инфицирования вирусом гепатита В (HBV) или вирусом гепатита С (HCV), или в результате цирроза печени.

Повышенный уровень альфа-фетопротеина (AFP) в крови является известным индикатором наличия либо первичного рака печени, либо герминогенной опухоли. Этот белок обычно вырабатывается плодом и не обнаруживается в крови здоровых взрослых мужчин и небеременных здоровых женщин. Было обнаружено, что уровень AFP отрицательно коррелирует с выживаемостью пациентов с НСС.

Текущее лечение, выбираемое в отношении НСС, обычно зависит от стадии заболевания. Система стадирования AJCC представляет собой систему классификации, разработанную Американским объединенным комитетом по раку для описания степени прогрессирования заболевания у пациентов, страдающих от рака [28]. Для пациентов с локализованной НСС ранней стадии способы лечения, направленного на излечение, включают резекцию, аблацию и трансплантацию печени, тогда как для пациентов с локализованной НСС промежуточной стадии виды транскатетерной терапии опухоли под визуальным контролем, как например трансартериальная химиоэмболизация, обеспечивают преимущества в отношении выживаемости. Тем не менее, у большинства пациентов с НСС происходит либо прогрессирование до местно-распространенных или метастатических заболеваний, либо они развиваются de novo, и для них показано применение системной терапии [N47].

Сорафениб, являющийся мультикиназным ингибитором, был первым средством системной терапии, одобренным для лечения НСС [N48, N49]. С 2016 года 4 других средства направленного действия, в том числе 3 мультикиназных ингибитора и одно моноклональное антитело к рецептору фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), продемонстрировали в клинических испытаниях III фазы обеспечение преимуществ в отношении выживаемости для пациентов с распространенной НСС [N50, N51, N52, N53]. Как следствие, регулирующие органы нескольких стран одобрили ленватиниб в качестве средства системной терапии первой линии при НСС, а также одобрили регорафениб, кабозантиниб и рамуцирумаб (исключительно для пациентов с уровнем α-фетопротеина >400 нг/мл) для лечения пациентов с НСС, которые ранее получали лечение сорафенибом. Антитело к PD-1 также использовалось в качестве средства лечения второй линии при распространенной НСС.

У пациентов в соответствии с настоящим изобретением может иметься НСС, ассоциированная с инфекцией, вызванной HBV и/или HCV, или не ассоциированная с инфекцией, вызванной HBV и/или HCV. НСС может характеризоваться любой стадией (определенной в соответствии с руководством по стадированию AJCC, 8-е издание), например, 1 стадией, 2 стадией или 3 стадией. Пациенты могут являться мужчинами или женщинами, взрослыми или детьми (<18 лет). Пациентам может быть проведена гепатэктомия по поводу опухоли или может быть назначено ее проведение. Пациенты могли ранее получать лечение по поводу НСС, например, лечение сорафенибом и/или любым другим средством, упомянутым выше. Пациенты могли получать или не получать предшествующее лечение по поводу рака, осуществляемое посредством иммунотерапии.

Прогноз

Общая выживаемость (OS) определяется как определяется как период времени, прошедший с даты постановки диагноза или начала лечения заболевания, такого как рак, до смерти. При использовании для описания популяции пациентов с диагностированным заболеванием (а не отдельных пациентов) OS обычно выражается в виде медианы, представляющей собой период времени, прошедший либо от даты постановки диагноза, либо от момента начала лечения, в течение которого половина пациентов в группе все еще живы. В когорте пациентов с НСС, описанной в данном документе, OS рассчитывали с даты гепатэктомии до даты смерти пациента или последнего дня в рамках его периода последующего наблюдения.

Безрецидивная выживаемость (RFS) при раке относится к периоду времени после окончания первичного лечения рака, в течение которого пациент выживает без каких-либо признаков или симптомов этого рака. Также ее называют выживаемостью без признаков заболевания (DFS), выживаемостью без рецидивов.

Выживаемость без прогрессирования (PFS) относится к периоду времени в ходе и после лечения, в течение которого пациент живет с заболеванием, выраженность которого при этом не усиливается.

Время до прогрессирования (ТТР) относится к периоду времени от даты постановки диагноза или начала лечения до того, как выраженность заболевания начнет усиливаться или произойдет его распространение на другие части тела.

Как правило, данные относительно тех же одного или нескольких количественных показателей выживаемости получают для всех пациентов в когорте (например, в популяции пациентов, в которой получены референтные значения), чтобы получить данные для прогнозирования выживаемости по тем же одному или нескольким количественным показателям.

Иммунотерапевтические средства

Иммунотерапевтическое средство (средство, используемое для иммунотерапии) согласно настоящему изобретению может являться средством на основе антитела к ICOS и/или оно может являться иммунотерапевтическим средством на основе антитела к TReg. Средство на основе антитела к ICOS представляет собой средство, которое связывает ICOS, предпочтительно внеклеточный домен ICOS. Иммунотерапевтическое средство на основе антитела к TReg представляет собой средство, которое истощает количество или подавляет активность TReg, предпочтительно избирательно, т.е. без истощения количества или подавления активности других Т-клеток, таких как TEff, или когда эффект в отношении таких других Т-клеток является менее выраженным, чем в отношении TReg. Средство, которое связывает ICOS, а также истощает количество или подавляет активность TReg, представляет собой

иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и антитела к TReg. Примеры включают антитело к ICOS KY1044 и другие антитела к ICOS с эффекторной функцией Fc (например, человеческое антитело изотипа IgG1 к ICOS).

Иммунотерапевтические средства на основе антитела к TReg включают антитела, другие биологические средства, малые молекулы и средства клеточной терапии. Иммунотерапевтическое средство на основе антитела к TReg может представлять собой антитело, которое связывает TReg и опосредует клеточные эффекторные функции (например, посредством эффектор-положительной Fc-области) для истощения количества или подавления активности TReg. Иммунотерапевтическое средство на основе антитела к TReg может связывать маркер TReg, который избирательно или дифференциально экспрессируется на TReg, например, на клеточной поверхности TReg. Примеры таких поверхностных маркеров включают ICOS, CD25, CCR8, CTLA-4 и глюкокортикоид-индуцируемый TNF-родственный белок (GITR). Отображаемые на МНС эпитопы также могут представлять собой такие маркеры и обеспечивать возможность нацеливания на TReg посредством внутриклеточных белков, таких как FOXP3, которые не содержат внеклеточной части. Расщепленные пептиды FOXP3 и других внутриклеточных маркеров презентируются молекулами МНС I класса на поверхности TReg, после чего они могут быть распознаны средством, которое специфически связывает эпитоп, представленный в полости на МНС. Dao et al. было описано антитело, имитирующее TCR, которое связывает эпитоп внутриклеточного FOXP3 [N54]. Как обобщено у Dao et al., другие иммунотерапевтические средства, направленные на TReg, которые были описаны, включают средства, нацеливающиеся на CD25 (например, антитело к CD25 даклизумаб), средства, направленные на рецептор IL-2 (например, слитые молекулы на основе токсина и IL-2, такие как денилейкин дифтитокс, который представляет собой слитый белок, содержащий IL-2 и дифтерийный токсин), антитела к GITR, которые обеспечивают истощение количества TReg, антитела к CTLA-4, которые подавляют функцию TReg, и средства, которые нарушают опухолевый хоуминг TReg, и/или модулируют пластичность Т-клеток. Было показано, что антитело к хемокиновому рецептору-4 (CCR4) избирательно истощает количество TReg, экспрессирующих более высокий уровень FOXP3, что приводит к усилению ответа CD8+ Т-клеток, специфичного по отношению к пептиду NY-ESO-1. CCR4 экспрессируется на активированных Т-клетках, Т-хелперах 2 типа, NK-клетках, макрофагах и дендритных клетках, что затрудняет обеспечение избирательных эффектов. Дефукозилированное гуманизированное mAb к CCR4, представляющее собой могамулизумаб, проходило клинические испытания применительно к различным видам рака. Хемокиновый рецептор-8 (CCR8) предпочтительным образом экспрессируется на TReg у пациентов, страдающих от рака молочной железы, и ассоциирован с плохим прогнозом. CCR8 также экспрессируется на тканерезидентных CD8+ Т-клетках памяти и NK-Т-клетках, и ввиду этого терапевтический потенциал нацеливания на эту молекулу еще предстоит изучить. Кроме того, также была предпринята попытка модулирования трансформирующего фактора роста (TGF)-бета, важнейшего цитокина для обеспечения функции TReg. Было показано, что циклофосфамид подавляет активность TReg.

Недавно в WO 2020053833 были описаны терапевтические средства, направленные против TReg, предусматривающие антитело к CD36 и/или ингибиторы PPAR-бета. В ней раскрыт способ снижения количества внутриопухолевых TReg (например, CD4+ клеток) у субъекта, включающий, например, введение ингибитора CD36. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение ингибитора PPAR-бета.

Антитела

Предпочтительными иммунотерапевтическими средствами являются антитела, которые могут представлять собой целые иммуноглобулины или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие домены иммуноглобулинов, являющиеся либо природными, либо частично или полностью полученными синтетически. Антитела могут представлять собой молекулы IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или их антигенспецифические фрагменты антител (включая без ограничения Fab, F(ab')2, Fv, дисульфид-связанный Fv, scFv, однодоменное антитело, мультиспецифическое антитело с закрытой конформацией, дисульфид-связанный scfv, диатело), независимо от того, получены ли они из организма представителя каких-либо видов, у которых естественным образом продуцируются антитела, или созданы с помощью технологии рекомбинантной ДНК; независимо от того, выделены ли они из сыворотки крови, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий. Антитела можно гуманизировать с использованием рутинной технологии.

Антитело содержит антигенсвязывающий участок антитела (паратоп), который связывается с эпитопом антигена-мишени и является комплементарным ему. Термин "эпитоп" относится к области антигена, которая связывается антителом. Эпитопы можно определять как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы в общем представляют собой подгруппу структурных эпитопов и содержат те остатки, которые непосредственно обуславливают свойство аффинности взаимодействия. Также эпитопы могут быть конформационными, то есть состоять из нелинейно расположенных аминокислот. В определенных вариантах осуществления эпитопы могут включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в определенных вариантах осуществления могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда.

Примеры фрагментов антител включают:

(i) Fab-фрагмент, представляет собой моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1;

(ii) F(ab')2-фрагмент, представляет собой бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области;

(iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и СН1;

(iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела,

(v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546; которая полностью включена в данный документ посредством ссылки), который состоит из домена VH или VL; и

(vi) выделенная определяющая комплементарность область (CDR), которая сохраняет специфическую антигенсвязывающую функциональность.

Дополнительными примерами антител являются антитела Н2, которые предусматривают димер тяжелой цепи (5'-VH-(необязательная шарнирная область)-СН2-СН3-3') и лишены легкой цепи.

Одноцепочечные антитела (например, scFv) являются широко используемым фрагментом. Мультиспецифические антитела могут быть образованы из фрагментов антител. В антителе по настоящему изобретению может использоваться любой такой формат, если это целесообразно.

Расщепление целых иммуноглобулинов с помощью фермента папаина приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, известных также как "Fab"-фрагменты, и "Fc"-фрагмента, не обладающего антигенсвязывающей активностью, но обладающего способностью к кристаллизации. "Fab" при использовании в данном документе относится к фрагменту антитела, который содержит один константный и один вариабельный домен каждой из тяжелой и легкой цепей. Термин "Fc-область" в данном документе используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc-области с нативной последовательностью и вариантные Fc-области. "Fc-фрагмент" относится к карбоксиконцевым частям обеих Н-цепей, удерживаемым вместе дисульфидными связями. Эффекторные функции антител определяются последовательностями в Fc-области, представляющей собой область, которая также распознается Fc-рецепторами (FcR), обнаруживаемыми на определенных типах клеток. Расщепление антител с помощью фермента пепсина приводит к образованию F(ab')2-фрагмента, в котором два плеча молекулы антитела остаются связанными и содержат два антигенсвязывающих участка. F(ab')2-фрагмент обладает способностью сшивать антиген.

mAb² содержит домены VH и VL из интактного антитела, слитые с модифицированной константной областью, которая была сконструирована для обеспечения образования антигенсвязывающего участка, известного как "Fcab". Технология, лежащая в основе формата Fcab/mAb², более подробно описана в W0 2008/003103, и описание формата mAb² включено в данный документ посредством ссылки. Дополнительные описания этого формата можно найти в WO 2006/072620, WO 2008/003116, WO 2009/000006 и WO 2 009/0132876.

"Fv" при использовании в данном документе относится к минимальному фрагменту антитела, который сохраняет как антиген-распознающие, так и антигенсвязывающие участки. Эта область состоит из димера вариабельных доменов одной тяжелой и одной легкой цепи, находящихся в тесной нековалентной или ковалентной ассоциации. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего участка на поверхности димера VH-VL. В совокупности шесть CDR придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных по отношению к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем весь связывающий участок.

В Fab антигенсвязывающий участок антитела может быть представлен одним или несколькими вариабельными доменами антитела. В одном примере связывающий участок антитела представлен одним вариабельным доменом, например, вариабельным доменом тяжелой цепи (домен VH) или вариабельным доменом легкой цепи (домен VL). В другом примере связывающий участок содержит пару VH/VL или две или нескольких таких пар. Таким образом, антигенсвязывающий участок антитела может содержать VH и VL.

Необязательно иммуноглобулиновые домены антитела могут быть слиты или конъюгированы с дополнительными полипептидными последовательностями и/или с метками, маркерами, токсинами или другими молекулами. Иммуноглобулиновые домены антитела могут быть слиты или конъюгированы с одной или несколькими различными антигенсвязывающими областями, обеспечивая молекулу, которая способна связывать второй антиген. Антитело по настоящему изобретению может являться мультиспецифическим антителом, например, биспецифическим антителом, содержащим (i) антигенсвязывающий участок антитела для ICOS и (ii) дополнительный антигенсвязывающий участок (необязательно антигенсвязывающий участок антитела, описанный в данном документе), который распознает другой антиген.

Вариабельные домены антител содержат аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей (CDR, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3) и каркасных областей (FR). Таким образом, в пределах каждого из доменов VH и VL находятся CDR и FR. Термин "гипервариабельная область", "область CDR" или "CDR" относится к областям вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными в отношении последовательности и/или образуют структурно определенные петли. Как правило, антигенсвязывающие участки антитела содержат шесть

гипервариабельных областей: три в VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три в VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3). Эти области тяжелой и легкой цепей антитела придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Домен VH содержит совокупность HCDR, а домен VL содержит совокупность LCDR. VH относится к вариабельному домену тяжелой цепи. VL относится к вариабельному домену легкой цепи. Каждый VH и VL обычно состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Антитело может содержать домен VH антитела, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 VH и каркасную область. В качестве альтернативы или дополнения оно может содержать домен VL антитела, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 VL и каркасную область. Примеры доменов VH и VL и CDR антител согласно настоящему изобретению перечислены в прилагаемом перечне последовательностей и таблицах, которые составляют часть настоящего изобретения. Как описано в данном документе, "совокупность CDR" предусматривает CDR1, CDR2 и CDR3. Таким образом, совокупность HCDR относится к HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а совокупность LCDR относится к LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Если не указано иное, "совокупность CDR" содержит HCDR и LCDR.

CDR могут быть определены в соответствии с системой нумерации согласно Kabat [N55], системой нумерации согласно Chothia [N56] или системой нумерации IMGT [N57, N58). IMGT используется по умолчанию, поэтому нумерация для CDR и вариабельных доменов в данном документе соответствует IMGT, если не указано иное.

Антитела и другие биологические средства в соответствии с настоящим изобретением могут быть представлены в выделенной или очищенной форме. Выделенное антитело или белок представляют собой таковые, которые были идентифицированы, выделены и/или извлечены из компонента среды их получения (например, природные или рекомбинантные). Например, антитело или белок по сути не содержат клеточного материала или других загрязняющих белков из клеточного или тканевого источника, из которого получено антитело, или по сути не содержат химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. Выражение "по сути не содержит клеточного материала" включает препараты антитела, в которых антитело отделено от клеточных компонентов клеток, из которых его выделяют или получают рекомбинантным путем. Таким образом, антитело, по сути не содержащее клеточного материала, включает препараты антитела, характеризующиеся содержанием гетерологичного белка (также называемого в данном документе "загрязняющим белком"), составляющим менее чем приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (от сухого веса). Если антитело получено рекомбинантным путем, то оно также предпочтительно по сути не содержит культуральную среду, т.е. культуральная среда представляет менее чем приблизительно 20%, 10% или 5% от объема белкового препарата. Когда антитело получают путем химического синтеза, оно предпочтительно по сути не содержит химических предшественников или других химических веществ, т.е. оно отделено от химических предшественников или других химических веществ, которые участвуют в синтезе белка. Соответственно, такие препараты антитела содержат менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% (от сухого веса) химических предшественников или соединений, отличных от представляющего интерес антитела. В предпочтительном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению являются выделенными или очищенными.

Антитело может содержать домен VH, который характеризуется по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичностью аминокислотной последовательности с доменом VH любого из антител, описанных в данном документе и/или показанных в прилагаемом перечне последовательностей, и/или оно содержит домен VL, который характеризуется по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичностью аминокислотной последовательности с доменом VL любого из этих антител. Алгоритмы, которые можно использовать для расчета % идентичности двух аминокислотных последовательностей, включают, например, BLAST, FASTA или алгоритм Смита-Уотермана, например, с использованием параметров по умолчанию. Конкретные варианты могут предусматривать одно или несколько изменений аминокислотной последовательности (добавление, делецию, замену и/или вставку аминокислотного остатка).

Изменения могут быть выполнены в одной или нескольких каркасных областях и/или в одной или нескольких CDR. Получение вариантов необязательно обеспечивают путем мутагенеза CDR. Изменения обычно не приводят к потере функции, поэтому антитело, содержащее измененную таким образом аминокислотную последовательность, может сохранять способность связывать антиген (например, ICOS). Оно может сохранять связывающую способность, которая в количественном отношении является такой же, что и у антитела, которое изменению не подвергалось, например, как измерено в анализе, описанном в данном документе. Антитело, содержащее измененную таким образом аминокислотную последовательность, может обладать улучшенной способностью к связыванию антигена.

Изменение может включать замену одного или нескольких аминокислотных остатков не встречающейся в природе или нестандартной аминокислотой, модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков с преобразованием в не встречающуюся в природе или нестандартную форму или вставку одной или нескольких не встречающихся в природе или нестандартных аминокислот в последовательность. Примеры значений числа и местоположений изменений в последовательностях по настоящему изобретению описаны в других местах данного документа. Встречающиеся в природе аминокислоты включают 2 0 "стандартных" L-аминокислот, обозначенных их стандартными однобуквенными кодами как G, А, V, L, I, М, Р, F, W, S, Т, N, Q, Y, С, K, R, Н, D, Е. Нестандартные аминокислоты включают любой другой остаток, который может быть включен в остов полипептида или получен в результате модификации существующего аминокислотного остатка. Нестандартные аминокислоты могут являться встречающимися в природе или не встречающимися в природе.

Термин "вариант", используемый в данном документе, относится к пептиду или нуклеиновой кислоте, которые отличаются от исходного полипептида или нуклеиновой кислоты одной или несколькими делециями, заменами или добавлениями аминокислот или нуклеиновых кислот, но при этом сохраняют одну или несколько специфических функций или биологических активностей исходной молекулы. Аминокислотные замены включают изменения, при которых аминокислоту заменяют другим встречающимся в природе аминокислотным остатком. Такие замены можно классифицировать как "консервативные", в случае чего аминокислотный остаток, содержащийся в полипептиде, заменяют другой встречающейся в природе аминокислотой сходного характера в отношении полярности, функциональности боковой цепи или размера. Такие консервативные замены хорошо известны в данной области техники. Замены, охватываемые настоящим изобретением, также могут являться "неконсервативными", при которых аминокислотный остаток, присутствующий в пептиде, заменяют аминокислотой, имеющей отличающиеся свойства, такой как встречающаяся в природе аминокислота из другой группы (например, заменяя заряженную или гидрофобную аминокислоту аланином), или в качестве альтернативы при которых встречающуюся в природе аминокислоту заменяют нетрадиционной аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены являются консервативными. Также охватываемое значение термина "вариант", в случае его использования в отношении полинуклеотида или полипептида, относится к полинуклеотиду или полипептиду, которые могут варьироваться в отношении первичной, вторичной или третичной структуры по сравнению с эталонным полинуклеотидом или полипептидом соответственно (например, по сравнению с полинуклеотидом или полипептидом дикого типа).

В некоторых аспектах можно применять "синтетические варианты", "рекомбинантные варианты" или "химически модифицированные" варианты полинуклеотидов или варианты полипептидов, выделенные или созданные с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. "Модифицированные варианты" могут включать консервативные или неконсервативные аминокислотные изменения, как описано ниже. Полинуклеотидные изменения могут приводить к аминокислотным заменам, добавлениям, делециям, слияниям и усечениям в полипептиде, кодируемом эталонной последовательностью. Некоторые аспекты применения включают варианты с вставкой, варианты с делецией или варианты с заменой, характеризующиеся заменами аминокислот, включая вставки и замены аминокислот и других молекул, которые обычно не встречаются в пептидной последовательности, являющейся основой варианта, например без ограничения вставку орнитина, который обычно не встречается в белках человека. Термин "консервативная замена" при описании полипептида относится к изменению аминокислотного состава полипептида, которое по сути не изменяет активность полипептида. Например, консервативная замена относится к замене аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток, обладающий сходными химическими свойствами (например, кислотный, основной, положительно или отрицательно заряженный, полярный или неполярный и т.д.). Консервативные аминокислотные замены включают замену лейцина изолейцином или валином, аспартата глутаматом или треонина серином. Таблицы консервативных замен, в которых приведены функционально сходные аминокислоты, хорошо известны из уровня техники. Например, каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами по отношению друг к другу: 1) аланин (А), серии (С), треонин (Т); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V) и 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W) [N59]. В некоторых вариантах осуществления отдельные замены, делеции или добавления, которые обеспечивают изменение, добавление или удаление одной аминокислоты или небольшого процента аминокислот, также могут считаться "консервативными заменами", если изменение не приводит к снижению активности пептида. Вставки или делеции обычно находятся в диапазоне приблизительно 1-5 аминокислот. Выбор консервативных аминокислот может быть сделан на основе местоположения аминокислоты, подлежащей замене, в пептиде, например, если аминокислота находится во внешней части пептида и подвергается воздействию растворителей или во внутренней части и не подвергается воздействию растворителей.

Можно выбрать аминокислоту, которая заменит существующую аминокислоту, исходя из местоположения существующей аминокислоты, включая воздействие на нее растворителей (т.е. если аминокислота подвергается воздействию растворителей или присутствует на внешней поверхности пептида или полипептида по сравнению с локализованными на внутренней стороне аминокислотами, не подвергающимися воздействию растворителей). Выбор таких консервативных аминокислотных замен хорошо известен в данной области техники [N60, N61, N62]. Соответственно, можно выбрать консервативные аминокислотные замены, подходящие для аминокислот на внешней стороне белка или пептида (т.е. аминокислот, подвергающихся воздействию растворителя), например без ограничения можно использовать следующие замены: замена Y на F, Т на S или K, Р на А, Е на D или Q, N на D или G, R на K, G на N или А, Т на S или K, D на N или Е, I на L или V, F на Y, S на Т или A, R на K, G на N или А, K на R, А на S, K или Р.

В альтернативных вариантах осуществления можно также выбирать консервативные аминокислотные замены, охватывающие таковые, подходящие для аминокислот во внутренней части белка или пептида, например, можно применять подходящие консервативные замены для аминокислот, находящихся во внутренней части белка или пептида (т.е. аминокислот, не подвергающихся воздействию растворителя), например без ограничения можно применять следующие консервативные замены, где Y заменяют на F, Т на А или S, I на L или V, W на Y, М на L, N на D, G на А, Т на А или S, D на N, I на L или V, F на Y или L, S на А или Т и А на S, G, Т или V. В некоторых вариантах осуществления неконсервативные аминокислотные замены также охватываются термином "варианты".

Антитела, раскрытые в данном документе, можно модифицировать для увеличения или уменьшения времени полужизни в сыворотке крови, например, путем конструирования последовательности одной или нескольких константных областей антитела и/или слияния с другими молекулами, например, пегилирования, или путем связывания с альбумином, например, путем включения связывающего альбумин однодоменного антитела (dAb). Были описаны различные варианты слияния, продлевающие время полужизни [N63].

Антитело по настоящему изобретению может являться человеческим антителом или химерным антителом, содержащим человеческие вариабельные области и константные области, не являющиеся человеческими (например, мышиные). Антитело по настоящему изобретению, например, содержит человеческие вариабельные области и необязательно также содержит человеческие константные области.

Таким образом, антитела необязательно содержат константные области или их части, например, константные области человеческого антитела или их части. Например, домен VL может быть присоединен на своем С-конце к константному домену легкой каппа- или лямбда-цепи антитела. Аналогично, домен VH антитела может быть присоединен на своем С-конце ко всей или к части (например, к домену СН1 или Fc-области) константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, полученной из антитела любого изотипа, например, IgG, IgA, IgE и IgM, а также любого из изотипических подклассов, таких как IgG1 или IgG4. Примеры константных доменов человеческих антител показаны в таблице С.

Константные области антител по настоящему изобретению в качестве альтернативы могут представлять собой константные области, не являющиеся человеческими. Например, когда антитела вырабатываются у трансгенных животных (примеры которых описаны в других местах данного документа), могут быть получены химерные антитела, содержащие человеческие вариабельные области и не являющиеся человеческими константные области (животного-хозяина). У некоторых трансгенных животных вырабатываются полностью человеческие антитела. Другие были подвергнуты конструированию с обеспечением выработки антител, содержащих химерные тяжелые цепи и полностью человеческие легкие цепи. Если антитела содержат одну или несколько константных областей, не являющихся человеческими, их можно заменять человеческими константными областями с получением антител, более подходящих для введения людям в виде терапевтических композиций, поскольку их иммуногенность при этом снижается.

Эффекторные функции Fc, представленные ADCC, ADCP и CDC

Как обсуждалось выше, антитела могут быть представлены в виде различных изотипов и с различными константными областями. Примеры последовательностей константной области тяжелой цепи человеческого антитела класса IgG показаны в таблице С.Fc-область антитела в первую очередь определяет его эффекторную функцию с точки зрения связывания Fc, активности антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), активности комплементзависимой цитотоксичности (CDC) и активности антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP). Эти "клеточные эффекторные функции", в отличие от функции эффекторных Т-клеток, предусматривают рекрутирование клеток, несущих Fc-рецепторы, в очаг клеток-мишеней, что приводит к уничтожению клетки, связанной антителом. В дополнение к ADCC и CDC механизм ADCP [N64] представляет собой средство истощения количества Т-клеток, связанных антителами, и, таким образом, нацеливания на TReg с высоким уровнем экспрессии ICOS для их устранения.

Клеточные эффекторные функции ADCC, ADCP и/или CDC также могут проявляться у антител, лишенных Fc-областей. Антитела могут содержать несколько различных антигенсвязывающих участков, один из которых направлен на ICOS, а другой направлен на молекулу-мишень, где взаимодействие с этой молекулой-мишенью индуцирует ADCC, ADCP и/или CDC, например, антитело, содержащее две scFv-области, соединенные линкером, где одна scFv может взаимодействовать с эффекторной клеткой.

Антитело по настоящему изобретению может представлять собой антитело, демонстрирующее ADCC, ADCP и/или CDC. В качестве альтернативы антитело по настоящему изобретению может не характеризоваться активностью, представленной ADCC, ADCP и/или CDC. В любом случае, антитело согласно настоящему изобретению может содержать Fc-область, которая связывается с одним или несколькими типами Fc-рецептора, или необязательно может не содержать ее. Применение различных форматов антител, а также наличие или отсутствие FcR-связывающих и клеточных эффекторных функций позволяет адаптировать антитело для применения в конкретных терапевтических целях, как обсуждается в других местах данного документа.

В подходящем формате антител для некоторых терапевтических областей применения используется константная область человеческого IgG1 дикого типа. Константная область может представлять собой константную область IgG1, способную демонстрировать эффекторную функцию, необязательно обладающую активностью, представленной ADCC, и/или CDC, и/или ADCP. Подходящей последовательностью константной области человеческого IgG1 дикого типа является IGHG1*01. Дополнительные примеры константных областей человеческого IgG1 показаны в данном документе.

Константная область может быть сконструирована с обеспечением усиленной ADCC, и/или CDC, и/или ADCP. Выраженность Fc-опосредуемых эффектов может быть усилена за счет конструирования Fc-домена посредством различных известных методик. Такие способы увеличивают аффинность к определенным Fc-рецепторам, таким образом создавая потенциальные разнообразные профили усиления активации. Этого можно достичь путем модификации одного или нескольких аминокислотных остатков [N65]. Было показано, что константные области IgG1 человека, содержащие специфические мутации или измененный статус гликозилирования по остатку Asn297 (например, N297Q, нумерация согласно EU-индексу), усиливают связывание с Fc-рецепторами. Иллюстративные мутации затрагивают один или несколько остатков, выбранных из 239, 332 и 330 для константных областей IgG1 человека (или эквивалентных положений в других изотипах IgG). Таким образом, антитело может содержать константную область IgG1 человека, имеющую одну или несколько мутаций, независимо выбранных из N297Q, S239D, I332E и A330L (нумерация согласно EU-индексу). Тройную мутацию (M252Y/S254T/T256E) можно использовать для усиления связывания с FcRn, а другие мутации, влияющие на связывание FcRn, обсуждаются в таблице 2 из [N66], любая из которых может быть использована в настоящем изобретении.

Повышенной аффинности в отношении Fc-рецепторов также можно достичь за счет изменения естественного профиля гликозилирования Fc-домена, например, при создании в недостаточной степени фукозилированных или дефукозилированных вариантов [N67]. Нефукозилированные антитела содержат триманнозильную коровую структуру, предусматривающую N-гликаны сложного типа в Fc без остатка фукозы. Эти сконструированные в отношении гликанов антитела, в которых отсутствует коровый остаток фукозы, которым характеризуются N-гликаны Fc, могут демонстрировать более сильную ADCC, чем фукозилированные эквиваленты, вследствие усиления FcγRIIIa-связывающей способности. Антитело по настоящему изобретению может быть фукозилированным, афукозилированным, дефукозилированным или в недостаточной степени фукозилированным.

Чтобы увеличить уровень ADCC, можно изменять остатки в шарнирной области с обеспечением увеличения связывания с Fc-гамма RIII [N68]. Таким образом, антитело может содержать константную область тяжелой цепи человеческого IgG, которая представляет собой вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG дикого типа, где вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG связывается с рецепторами Fcγ человека, выбранными из группы, состоящей из FcγRIIB и FcγRIIA, с более высокой аффинностью, чем связывается с рецепторами Fcγ человека константная область тяжелой цепи человеческого IgG дикого типа. Антитело может содержать константную область тяжелой цепи человеческого IgG, которая представляет собой вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG дикого типа, где вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG связывается с FcγRIIB человека с более высокой аффинностью, чем связывается с FcγRIIB человека константная область тяжелой цепи человеческого IgG дикого типа. Вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG может представлять собой вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG1, человеческого IgG2 или человеческого IgG4. В одном варианте осуществления вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG содержит одну или несколько аминокислотных мутаций, выбранных из G236D, P238D, S239D, S267E, L328F и L328E (система нумерации согласно EU-индексу). В другом варианте осуществления вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG содержит совокупность аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из S267E и L328F; P238D и L328E; P238D и одной или нескольких замен, выбранных из группы, состоящей из E233D, G237D, H268D, P271G и A330R; P238D, E233D, G237D, H268D, P271G и A330R; G236D и S267E; S239D и S267E; V262E, S267E и L328F; а также V264E, S267E и L328F (система нумерации согласно EU-индексу). Усиления CDC можно достигать за счет аминокислотных изменений, которые увеличивают аффинность к C1q, первому компоненту классического каскада активации комплемента [N69]. Другой подход заключается в создании химерного Fc-домена, созданного из сегментов IgG1 и IgG3 человека, в котором задействована более высокая аффинность IgG3 к C1q. [N70]. Антитела по настоящему изобретению могут содержать мутированные аминокислоты по остаткам 329, 331 и/или 322 для изменения связывания C1q и/или снижения или устранения активности CDC. В другом варианте осуществления антитела или фрагменты антител, раскрытые в данном документе, могут содержать Fc-области с модификациями по остаткам 231 и 239, в случае которых аминокислоты заменены для изменения способности антитела фиксировать комплемент. В одном варианте осуществления антитело или его фрагмент имеют константную область, содержащую одну или несколько мутаций, выбранных из E345K, E430G, R344D и D356R, в частности, двойную мутацию, предусматривающую R344D и D356R (система нумерации согласно EU-индексу).

В WO 2008/137915 описаны антитела к ICOS с модифицированными Fc-областями, обладающие усиленной эффекторной функцией. Сообщалось, что эти антитела опосредуют усиленную активность ADCC по сравнению с уровнем активности ADCC, опосредуемой исходным антителом, содержащим домены VH и VK и Fc-область дикого типа. В антителах по настоящему изобретению могут использоваться такие варианты Fc-областей, обладающие эффекторной функцией, как описано в вышеуказанном документе.

Активность ADCC антитела можно определять в ходе анализа, как описано в данном документе. Активность ADCC антитела к ICOS можно определять in vitro с использованием линии ICOS-положительных Т-клеток, как описано в данном документе. В более общем случае активность ADCC для антитела можно определить in vitro в ходе анализа ADCC с использованием клеток, демонстрирующих наличие представленного на клеточной поверхности антигена, который распознается антителом.

Для некоторых пациентов может быть предпочтительным применение антител без эффекторной функции Fc. Антитела могут быть предусмотрены без константной области или без Fc-области -примеры таких форматов антител описаны в других местах данного документа. В качестве альтернативы антитело может иметь константную область, которая является нуль-эффекторной. Антитело может содержать константную область тяжелой цепи, которая не связывает Fcγ-рецепторы, например, константная область может содержать мутацию Leu235Glu (т.е. где лейциновый остаток дикого типа мутирован на остаток глутаминовой кислоты). Другая необязательная мутация константной области тяжелой цепи представляет собой Ser228Pro, которая повышает стабильность. Константная область тяжелой цепи может представлять собой IgG4, содержащий как мутацию Leu235Glu, так и мутацию Ser228Pro. Эта константная область тяжелой цепи "IgG4-PE" является нуль-эффекторной.

Альтернативная нуль-эффекторная человеческая константная область представлена деактивированным IgG1. Константная область тяжелой цепи деактивированного IgG1 может содержать аланин в положении 235 и/или 237 (нумерация согласно EU-индексу), например, это может быть последовательность IgG1*01, содержащая мутации L235A и/или G237A ("LAGA").

Вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG может содержать одну или несколько аминокислотных мутаций, которые обеспечивают снижение аффинности IgG к FcγRIIIA человека, FcγRIIA человека или FcγRI человека. В одном варианте осуществления FcγRIIB экспрессируется на клетке, выбранной из группы, состоящей из макрофагов, моноцитов, В-клеток, дендритных клеток, эндотелиальных клеток и активированных Т-клеток. В одном варианте осуществления вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG содержит одну или несколько из следующих аминокислотных мутаций G236A, S239D, F243L, Т256А, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305I, A330L, I332E, Е333А, K334A, А339Т и P396L (система нумерации согласно EU-индексу). В одном варианте осуществления вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG содержит совокупность аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из S239D; Т256А; K290A; S298A; I332E; Е333А; K334A; А339Т; S239D и I332E; S239D, A330L и I332E; S298A, ЕЗЗЗА и K334A; G236A, S239D и I332E; а также F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L (система нумерации согласно EU-индексу). В одном варианте осуществления вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG содержит аминокислотные мутации S239D, A330L или I332E (система нумерации согласно EU-индексу). В одном варианте осуществления вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG содержит аминокислотные мутации S239D и I332E (система нумерации согласно EU-индексу). В одном варианте осуществления вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG представляет собой вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG1, содержащий аминокислотные мутации S239D и I332E (система нумерации согласно EU-индексу).

Антитело может иметь константную область тяжелой цепи, которая связывает один или несколько типов Fc-рецептора но не индуцирует клеточные эффекторные функции, т.е. не опосредует активность, представленную ADCC, CDC или ADCP. Такая константная область может быть неспособна связываться с конкретным(-и) Fc-рецептором(-ами), ответственным(-и) за инициирование активности, представленной ADCC, CDC или ADCP.

Антитела к ICOS

Средство на основе антитела к ICOS может представлять собой антитело к ICOS, которое связывается с внеклеточным доменом ICOS и, таким образом, нацеливается на Т-клетки, экспрессирующие ICOS.

Сообщалось, что антитела к ICOS обладают противоопухолевым действием в результате связывания ICOS+ Т-клеток. Антитело к ICOS может обеспечивать иммунотерапевтический эффект за счет различных механизмов. Например, антитела к ICOS могут оказывать агонистический эффект в отношении ICOS, тем самым усиливая функцию TEff-клеток, на что указывает их способность повышать экспрессию и секрецию IFNγ. Антитела к ICOS могут быть необязательно сконструированы для обеспечения истощения количества клеток, с которыми они связываются, что должно оказывать эффект предпочтительного подавления активности ICOS+ TReg, устраняя эффект подавления, оказываемый этими клетками в отношении ответа с участием эффекторных Т-клеток, и, таким образом, стимулируя ответ с участием эффекторных Т-клеток в целом. Антитело к ICOS KY1044 обладает идеальным функциональным профилем для применения в качестве иммунотерапевтического средства в настоящем изобретении, хотя в качестве альтернативы можно использовать другие средства на основе антитела к ICOS.

Антитело к ICOS может представлять собой любое из следующих антител, может содержать домены VH и VL любого из следующих антител или может содержать HCDR и/или LCDR любого из следующих антител:

(a) KY1044,

(b) антитела к ICOS, описанные в PCT/GB2 017/052352, WO 2018/029474 или US 9957323, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки (например, STIM001, STIM002, STIM002B, STIM003, STIM004, STIM005, STIM006, STIM007, STIM008 или STIM009),

(c) антитела к ICOS, описанные в PCT/GB2018/053701, WO 2019/122884, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки (например, STIM017, STIM020, STIM021, STIM022, STIM023, STIM039, STIM040, STIM041, STIM042, STIM043, STIM044, STIM050, STIM051, STIM052, STIM053, STIM054, STIM055, STIM056, STIM057, STIM058, STIM059, STIM060, STIM061, STIM062, STIM063, STIM064, STIM065 или SIIM066),

(d) биспецифические антитела mAb² к ICOS/PD-L1, описанные в PCT/GB2018/053698, WO 2019/122882,

(e) вопрателимаб,

(f) антитела к ICOS, описанные в WO 2016/154177 или US 2016/0304610 (например, 37A10S713, 7F12, 37А10, 35А9, 36Е10, 16G10, 37A10S714, 37A10S715, 37A10S716, 37A10S717, 37A10S718, 16G10S71, 16G10S72, 16G10S73, 16G10S83, 35A9S79, 35A9S710 или 35A9S89),

(g) антитела к ICOS, описанные в WO 2016/120789 или US 2016/0215059 (например, 422.2 H2L5),

(h) антитело С398.4 или гуманизированное производное этого антитела, как описано в WO 2018/187613 или US 2018/0289790, например, ICOS.33 IgG1f S267E, ICOS.4, ICOS34 G1f, ICOS35 G1f, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7a, 1D7b или 2644 (в отношении последовательностей см. таблицу 35 из WO 2018187613), например, антитело BMS-986226 в NCT03251924,

(i) антитело JMAb 136, "136", или любое другое антитело, описанное в WO 2010/056804,

(j) антитело 314-8, антитело, полученное из гибридомы CNCM I-4180, или любое другое антитело к ICOS, описанное в WO 2012/131004, WO 2014/033327 или US 2 015/0239978,

(k) антитело Icosl45-1, антитело, продуцируемое гибридомой CNCM I-4179, или любое другое антитело, описанное в WO 2012/131004, US 9376493 или US 2 016/02 64 666,

(l) антитело MIC-944 (из гибридомы DSMZ 2645), 9F3 (DSMZ 2646) или любое другое антитело к ICOS, описанное в WO 99/15553, US 7259247, US 7132099, US 7125551, US 7306800, US 7722872, WO 05/103086, US 8318905 или US 8916155,

(m) антитела к ICOS, описанные в WO 98/3821, US 7932358B2, US 2002/156242, US 7030225, US 7045615, US 7279560, US 7226909, US 7196175, US 7932358, US 8389690, WO 02/070010, US 7438905, US 7438905, WO 01/87981, US 6803039, US 7166283, US 7988965, WO 01/15732, US 7465445 или US 7998478 (например, JMAb-124, JMAb-126, JMAb-127, JMAb-128, JMAb-135, JMAb-136, JMAb-137, JMAb-138, JMAb-139, JMAb-140 или JMAb-141, например, JMAb136),

(n) антитела к ICOS, описанные в WO 2014/08911,

(о) антитела к ICOS, описанные в WO 2012/174338,

(р) антитела к ICOS, описанные в US 2016/0145344,

(q) антитела к ICOS, описанные в WO 2011/020024, US 2016/002336, US 2016/024211 или US 8840889,

(r) антитела к ICOS, описанные в US 8497244,

(s) антитела, представленные клоном ISA-3 (eBioscience), клоном SP98 (Novus Biologicals), клоном 1 G1, клоном 3G4 (Abnova Corporation), клона 669222 (R&D Systems), клоном TQ09 (Creative Diagnostics), клоном 2С7 (Deng et al. Hybridoma Hybridomics 2004), клоном ISA-3 (eBioscience) или клоном 17G9 (McAdam et al. J Immunol 2000).

KY1044 представляет собой человеческое моноклональное антитело подкласса G1-каппа к ICOS. Его разработка была осуществлена с целью придания ему двойного механизма действия, а именно истощения количества TReg и костимуляции (агонизм) TEff-клеток [7]. Последовательности антитела KY1044 показаны в таблице K данного документа.

Антитело к ICOS может представлять собой антитело, которое конкурирует за связывание с ICOS человека с антителом (например, IgG1 или scFv человека), содержащим CDR тяжелой и легкой цепи из KY1044. Антитело к ICOS может связывать ICOS с по меньшей мере такой же аффинностью, как и KY1044, или с аффинностью в пределах 50%, в пределах 25% или в пределах 10% от аффинности KY1044 (например, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса с использованием связанного с чипом антигена или связанного с чипом антитела класса IgG к ICOS).

Антитело к ICOS по настоящему изобретению может содержать одну или несколько CDR из KY1044 (например, все 6 CDR или совокупность HCDR и/или LCDR) или его вариантов, как описано в данном документе.

Антитело может содержать домен VH антитела, содержащий CDR, представляющие собой HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и домен VL антитела, содержащий CDR, представляющие собой LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где HCDR3 представляет собой HCDR3 из KY1044 или предусматривает эту HCDR3 с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными изменениями. HCDR2 может представлять собой HCDR2 из KY1044 или может предусматривать эту HCDR2 с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными изменениями. HCDR1 может представлять собой HCDR1 из KY1044 или может предусматривать эту HCDR1 с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными изменениями.

Антитело может содержать домен VL антитела, содержащий CDR, представляющие собой HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и домен VL антитела, содержащий CDR, представляющие собой LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где LCDR3 представляет собой LCDR3 из KY1044 или предусматривает эту LCDR3 с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными изменениями. LCDR2 может представлять собой LCDR2 из KY1044 или может предусматривать эту LCDR2 с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными изменениями. LCDR1 может представлять собой LCDR1 из KY1044 или может предусматривать эту LCDR1 с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными изменениями.

Антитело может содержать

домен VH антитела, содержащий HCDR, представляющие собой HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и

домен VL антитела, содержащий LCDR, представляющие собой LCDR1, LCDR2 и LCDR3,

где HCDR представляют собой HCDR из KY1044 или предусматривают HCDR из KY1044 с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными изменениями; и/или

где LCDR представляют собой LCDR антитела KY1044 или предусматривают LCDR из KY1044 с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными изменениями.

Антитело может содержать домен VH, содержащий совокупность HCDR, представляющих собой HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где

HCDR1 представляет собой HCDR1 из KY1044 под SEQ ID NO: 1,

HCDR2 представляет собой HCDR2 из KY1044 под SEQ ID NO: 2,

HCDR3 представляет собой HCDR3 из KY1044 под SEQ ID NO: 3,

или содержащий эту совокупность HCDR с 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотными изменениями.

Антитело может содержать домен VL, содержащий совокупность LCDR, представляющих собой LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где

LCDR1 представляет собой LCDR1 из KY1044 под SEQ ID NO: 8,

LCDR2 представляет собой LCDR2 из KY1044 под SEQ ID NO: 9,

LCDR3 представляет собой LCDR3 из KY1044 под SEQ ID NO: 10,

или содержащий эту совокупность LCDR с 1, 2, 3 или 4 аминокислотными изменениями.

Аминокислотные изменения (например, замены) могут иметь место в любом положении остатка в CDR.

Предпочтительно антитело содержит ICOS-связывающий участок, содержащий полную совокупность из 6 CDR из KY1044.

Антитело к ICOS согласно настоящему изобретению может содержать домен VH антитела, который представляет собой домен VH из KY1044 под SEQ ID NO 5 или который имеет аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 90% идентичную последовательности домена VH антитела KY1044. Идентичность аминокислотной последовательности может составлять по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%.

Антитело к ICOS согласно настоящему изобретению может содержать домен VL антитела, который представляет собой домен VL из KY104 4 под SEQ ID NO: 12 или который имеет аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 90% идентичную последовательности домена VL антитела KY1044. Идентичность аминокислотной последовательности может составлять по меньшей мере 95%.

Предпочтительно антитело содержит домены VH и VL из KY1044.

Как подробно описано в других местах данного документа, антитела могут содержать константные области, необязательно константные области человеческих тяжелой и/или легкой цепей. Иллюстративным изотипом является IgG, например, IgGl человека. Антитело к ICOS может содержать тяжелую цепь из KY1044 под SEQ ID NO: 7 и/или легкую цепь из KY1044 под SEQ ID NO: 14. KY1044 можно получать рекомбинантным путем в виде двух тяжелых цепей по 454 аминокислотных остатка каждая и двух легких цепей по 215 аминокислотных остатков каждая с меж- и внутрицепочечными дисульфидными связями, типичными для антител подкласса IgG1.

Иммунотерапия

Иммунотерапия предусматривает лечение с помощью иммунотерапевтического средства, которое может являться средством на основе антитела к ICOS и/или средством на основе антитела к TReg. Его можно вводить пациенту в виде фармацевтического состава, например, путем внутривенной или подкожной инъекции. В предпочтительных вариантах осуществления иммунотерапия антителом к ICOS и/или антителом к TReg предусматривает введение пациенту антитела к ICOS, такого как KY1044.

Пациенты также могут параллельно, предварительно или впоследствии получать лечение в соответствии со стандартом лечения для имеющегося у них рака, необязательно включая хирургическое вмешательство. Сорафениб, являющийся мультикиназным ингибитором, был первым средством системной терапии, одобренным для лечения НСС. С 2016 года 4 других средства направленного действия, в том числе 3 мультикиназных ингибитора и одно моноклональное антитело к рецептору фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), продемонстрировали в клинических испытаниях III фазы обеспечение преимуществ в отношении выживаемости для пациентов с распространенной НСС [N71, N72, N73, N74]. Регулирующие органы нескольких стран одобрили ленватиниб в качестве средства системной терапии первой линии при НСС, а также одобрили регорафениб, кабозантиниб и рамуцирумаб (исключительно для пациентов с уровнем сх-фетопротеина >400 нг/мл) для лечения пациентов с НСС, которые ранее получали лечение сорафенибом. Антитело к PD-1 также использовалось в качестве средства лечения второй линии при распространенной НСС.

Способы лечения, которые можно комбинировать с иммунотерапией на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg или заменять ею, включают таковые, которые индуцируют гибель клеток иммунной системы, которая характеризуется высвобождением АТР и HMGB1 из клетки и экспонированием кальретикулина на плазматической мембране [N75, N76]. К способам лечения, вызывающим гибель клеток иммунной системы, относятся лучевая терапия (например, облучение клеток ионизирующей с использованием коротковолнового УФ-излучения или γ-излучения), химиотерапевтические средства (например, оксалиплатин, антрациклины, такие как доксорубицин, идарубицин или митоксантрон, агонисты BK-каналов, такие как флоретин или пимаровая кислота, бортезомиб, сердечные гликозиды, циклофосфамид, ингибиторы GADD34/PP1 с митомицином, PDT с гиперицином, полиинозиновая-полицитидиловая кислота, 5-фторурацил, гемцитабин, гефитниб, эрлотиниб или тапсигаргин с цисплатином) и антитела к опухолеассоциированным антигенам. Опухолеассоциированный антиген может представлять собой любой антиген, который сверхэкспрессируется опухолевыми клетками по сравнению с не относящимися к опухоли клетками той же ткани, например, HER2, CD20, EGFR. Подходящие антитела включают герцептин (антитело к HER2), ритуксимаб (антитело к CD20) или цетуксимаб (антитело к EGFR).

Другие способы лечения, которые можно комбинировать с иммунотерапией на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, и способы введения терапевтических средств и/или средств комбинированной терапии на основе антитела к ICOS описаны в WO 2018/029474, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Способы по настоящему изобретению, включая способы определения биомаркеров и способы, в рамках которых осуществляют мониторинг образцов, полученных от пациентов, в отношении наличия сигнатуры ответа, предусматривающей изменения значений для одного или нескольких биомаркеров, можно применять для обоснования назначения этих или других видов лечения.

Пациент, подвергаемый хирургической операции по удалению или уменьшению размеров опухоли, может получать средство иммунотерапии до и/или после хирургической операции. Средство иммунотерапии, предоставляемое после хирургической операции, может терапевтически воздействовать на оставшуюся опухолевую ткань и/или другие оставшиеся первичные опухоли или метастазы.

Статистические способы и моделирование

Кривые Каплана-Мейера и логарифмические ранговые критерии являются примерами однофакторного анализа. Они описывают выживаемость исключительно в соответствии с выбранным исследуемым фактором. Альтернативным способом является регрессионный анализ пропорциональных рисков Кокса (СОХ-РН), который работает как для количественных переменных-предикторов, так и для категориальных переменных. Кроме того, регрессионная модель Кокса расширяет способы анализа выживаемости, позволяя одновременно оценивать влияние нескольких факторов риска на время выживаемости.

Как показано в прилагаемых примерах, референтные (пороговые) значения можно определить как значения, при которых пациентов можно дифференцировать со статистической значимостью в отношении клинического количественного показателя (например, OS). Пороговые значения можно определить эмпирически путем тестирования ряда пороговых значений для определения значения, обеспечивающего статистическую значимость (например, р<0,05 при использовании логарифмического рангового критерия), предпочтительно значения с наивысшей статистической значимостью. Предпочтительно пороговые значения определяют из данных ROC-анализа - см. [N77], включенную в данный документ посредством ссылки. Необязательно пороговое значение представляет собой медианный показатель для биомаркера, значение верхнего квартиля показателя для биомаркера или значение нижнего квартиля показателя для биомаркера.

При расчете референтных значений может быть удобно осуществлять включение коэффициента умножения или деления, чтобы выразить значение в желаемом порядке величины. Например, если установлено, что пороговое значение равно 0,001, его можно удобно выразить как 1, включив коэффициент умножения 1000. Затем показания биомаркеров для исследуемых образцов умножают на тот же коэффициент для сравнения с референтным значением. Аналогичным образом референтные числа и значения биомаркеров можно преобразовывать с получением других значений по любой желаемой шкале (будь то числовая, визуальная (например, цветовая диаграмма), акустическая или другая), и показания для биомаркеров все еще можно достоверным образом сравнивать с указанными референтными значениями при условии, что последовательно выполняется одно и то же преобразование. Таким образом, настоящее изобретение не должно ограничиваться способом представления данных относительно биомаркеров. Скорее показания и референтные значения, используемые в настоящем изобретении, будут такими, которые являются репрезентативными для основных данных, ввиду чего (например) референтное значение для биомаркера, представляющее плотность, составляющую 100 ICOS-положительных клеток на мм² в центральной части опухоли, может быть выражено как "100 клеток на мм²" или как "0". В последнем случае применяется вычитание 100, поэтому в случае образца опухолевой ткани, на основе которого рассчитывается плотность, составляющая 110 клеток на мм², данное значение затем преобразуется в 10 для сравнения с референтным значением, составляющим 0.

Пример применения анализа на основе логистической регрессии для идентификации биомаркерных переменных, которые можно использовать как руководство для определения прогноза и лечения для пациентов, можно найти в исследовании, проведенном Kagamu et al. [27]. В этом исследовании идентифицируют статус CD4+ Т-клеток в периферической крови пациентов в качестве биомаркеров, которые могут обеспечивать идентифицирование пациентов, у которых наблюдается раннее прогрессирование заболевания после лечения ниволумабом, что позволяет классифицировать пациентов как не способных демонстрировать ответ на лечение или способных демонстрировать ответ на лечение. Авторами описывается формула, основанная на значениях процентного содержания CD62L^low CD4+ Т-клеток и CD25+FOXP3+ клеток в периферической крови пациентов с немелкоклеточным раком легкого, для прогнозирования в отношении неспособности демонстрировать ответ на лечение. Прогностическую формулу разрабатывали с использованием данных для исследовательской когорты с помощью модели логистической регрессии. Эффективность прогностической формулы оценивали с использованием данных для независимой валидационной когорты. Кривые выживаемости оценивали с использованием способа Каплана-Мейера. Все значения Р являлись двусторонними, и р<0,05 рассматривали как статистически значимый уровень. Тесты на различия между двумя популяциями проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Сравнение нескольких групп проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным анализом Тьюки.

Этот тип моделирования может в целом применяться по отношению к клиническим данным, относящимся к пациентам, страдающим от рака, для идентифицирования биомаркеров и комбинаций биомаркеров, которые позволяют проводить информативную классификацию пациентов, например, в соответствии с прогнозируемой выживаемостью и/или вероятностью ответа на лечение. Доступен ряд пакетов программного обеспечения для проведения статистического анализа и моделирования, включая SAS 9.4 (SAS Institute Inc.) и Prism 8 (GraphPad).

Примеры

Большое количество информации можно извлечь из среза опухолевой ткани, а также получить представление о природе ТМЕ, наблюдая за пространственным расположением клеток, включая распределение, распространение, кластеризацию и пространственную близость различных типов клеток по отношению друг к другу. Ранее сообщалось, что плотность иммунных клеток, находящихся в пределах 20 мкм относительно меланомной клетки, ассоциирована с ответом на блокаторы иммунных контрольных точек (Gide et al. 2020). В настоящем изобретении авторами настоящего изобретения раскрывается, что пространственное расположение иммунных клеток, экспрессирующих ICOS и/или FOXP3, в ТМЕ является биомаркером для прогнозирования течения заболевания, а также для определения ответа на иммунотерапию. В приведенных ниже примерах авторами настоящего изобретения описываются анализы ICOS-положительных, ЕОХР3-положительных и дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток в ТМЕ образцов пораженной НСС ткани, характеризуя ТМЕ с точки зрения плотности, значений отношения показателей, межклеточных расстояний и значений числа этих клеток. Авторы настоящего изобретения проводили совместное окрашивание на ICOS и FOXP3 и измеряли плотность одноположительных по ICOS клеток, одноположительных по FOXP3 клеток и дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток на мм², отношение различных окрашенных клеток (например, отношение одноположительных по FOXP3 клеток к дважды положительным по ICOS и FOXP3 клеткам), расстояние между различными окрашенными клетками (например, среднее расстояние от дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток до одноположительных по ICOS клеток) и число дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток в области влияния (определяемой радиусом, составляющим 30 мкм) вокруг одноположительных по ICOS клеток.

Авторы настоящего изобретения проводили поиск ассоциаций между этими количественными измерениями для ТМЕ и клиническими исходами или клиническими метаданными. Авторами настоящего изобретения описывается, каким образом такие количественные измерения представляют биомаркеры для прогнозирования течения заболевания (включая общую выживаемость) и для определения ответа на иммунотерапию антителом к ICOS и/или антителом к TReg.

Дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки идентифицируют как активные TReg, характерные для иммуносупрессивного ТМЕ. Было обнаружено, что опухоли, относящиеся к НСС, содержат высокую долю ICOS+ TReg, что указывает на в высокой степени иммуносупрессивную среду. Все из более высокой плотности ICOS+клеток, более высокого отношения дважды положительных ICOS+FOXP3+ клеток к общему числу FOXP3+ клеток, более высокой степени пространственной близости между ICOS+ TReg и другими ICOS+ клетками, а также более высокого значения числа ICOS+ TReg в областях влияния было ассоциировано с более низкой общей выживаемостью.

Авторами настоящего изобретения описывается, каким образом иммунотерапия антителом к TReg и/или антителом к ICOS может обеспечить клиническую пользу, включая увеличение выживаемости, для пациентов, у которых проявляются эти биомаркеры в ТМЕ. Антитело к ICOS, представляющее собой KY1044, является идеальным кандидатным терапевтическим средством вследствие его способности нацеливаться на ICOS-положительные клетки и избирательно истощать количество клеток с высокой экспрессией ICOS, удаляя в высокой степени иммуносупрессивные TReg и повышая противоопухолевый иммунный ответ.

Пример 1. Увеличение числа и значения отношения для ICOS-положительных TReg в ТМЕ по сравнению с перитуморальной тканью

Ранее сообщалось, что в когорте из 20 пациентов с НСС наблюдалось увеличение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток в ТМЕ по сравнению с прилегающей нормальной тканью [3]. В настоящем исследовании авторами настоящего изобретения была проведена оценка данных, относящихся к большой когорте пациентов, которые подтверждают и расширяют предыдущие полученные результаты. Авторами настоящего изобретения было обнаружено значительное увеличение количества дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток в ТМЕ по сравнению с перитуморальной тканью в образцах пораженной НСС ткани. Авторами настоящего изобретения также наблюдалось значительное увеличение значения отношения ICOS-положительных TReg (дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки) к общему количеству TReg (FOXP3-положительные клетки) (р<0,001) в центральной части опухоли по сравнению с перитуморальной тканью. Считается, что высокая плотность инфильтрирующих опухоль TReg является неблагоприятным прогностическим индикатором в случае НСС. Учитывая тот факт, что ICOS+FOXP3+ клетки, как сообщается, обладают сильным иммуносупрессивным действием за счет продуцирования как TGF-B, так и IL-10 [N78], результаты, полученные авторами настоящего изобретения, указывают на то, что применительно к опухолям, относящимся к НСС, существенную пользу должна принести стратегия, направленная на истощение количества дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток. В случае опухолей с более высокими значениями отношения дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток к ICOS-отрицательным FOXP3-положительным клеткам должна иметь место наибольшая польза.

Образцы опухолевой ткани

Опухолевые ткани первоначально собраны у пациентов с НСС, перенесших гепатэктомию в госпитале Национального Тайваньского университета, Тайбэй, Тайвань. Фиксированные формалином, залитые парафином срезы тканей (толщиной 5 мкм) получали для настоящего исследования с использованием архивных тканей.

Данные относительно пациентов

В общей сложности 142 пациента (мужчины:женщины = 112:30, медианный возраст 61,0 года) включали в исследуемую когорту. Среди них у 87 (61,3%) имелась хроническая инфекция, вызванная вирусом гепатита В (HBV), у 33 (23,2%) имелась хроническая инфекция, вызванная вирусом гепатита С (HCV), и у 22 (15,5%) не имелось инфекции, вызванной HBV/HCV. Ни у одного пациента не имелось двойного положительного результата на HBV и HCV. У пациентов, характеризующихся AFP<20 нг/мл или характеризующихся ранней стадией заболевания, медианный показатель общей выживаемости (OS) являлся значительно улучшенным. OS рассчитывали с даты гепатэктомии до даты смерти пациента или последнего дня в рамках его периода последующего наблюдения. Медианную OS рассчитывали как период времени после постановки диагноза, в течение которого половина пациентов в когорте все еще проходила исследование. В этой когорте медианная OS составляла 100,3 месяца. Возраст, половая принадлежность и вирусная этиология не имели значимого уровня ассоциации с изменениями OS.

Иммуногистохимический анализ

Проводили последовательный двойной мультиплексный IHC-анализ для обнаружения клеток, экспрессирующих ICOS и FOXP3, в срезах ткани толщиной 5 мкм, который осуществляли следующим образом. Микроскопические препараты тканей депарафинизировали, регидратировали и автоклавировали в цитратном буфере (рН 6,0) в течение 10 минут, используя для демаскирования антигена камеру для снятия маскировки с последующим блокированием перекисью водорода, а затем содержащим казеин блокирующим реагентом (Background Sniper, BioCare Medical) для уменьшения неспецифического окрашивания фона. Затем микроскопические препараты инкубировали с антителом к ICOS (разведение 1:800; клон D1K2T; Cell Signaling) при температуре 4°С в течение ночи. Применяли набор для обнаружения МАСН1 Universal HRP-Polymer (BioCare Medical), включая вторичное антитело для обнаружения D1K2T, и проводили автоматическое обнаружение на основе DAB в соответствии с рекомендациями производителя. DAB (3,3'-диаминобензидин) является производным бензола и обеспечивает окрашивание в коричневый цвет.

Стадии блокирования повторяли, а затем микроскопические препараты инкубировали с антителом к FOXP3 (разведение 1:800; клон 236А/Е7; Abcam) при температуре 4°С в течение ночи. Осуществляли применение набора для обнаружения МАСН1 Universal HRP-Polymer, включая вторичное антитело для обнаружения, и набора Vina Green Chromogen (BioCare Medical) в соответствии с рекомендациями производителя. Хромоген Vina Green обеспечивает окрашивание в зеленый цвет, используемое в данном случае в качестве вторичного окрашивания для FOXP3. Микроскопические препараты контрастно окрашивали гематоксилином и подсинивающим реагентом, который превращает первоначальное характеризующееся растворимостью красное окрашивание, обеспечиваемое гематоксилином, в ядре в характеризующуюся нерастворимостью форму с синим окрашиванием. Щелочное значение рН подсинивающего раствора также вызывает преобразование протравного лакообразующего красителя в ткани и делает его более стойким. Результатом является окрашивание всех клеточных ядер, что показывает общую архитектуру ткани и обеспечивает контекстуальный фон, на котором можно наблюдать два IHC-хромогена, облегчая последующий анализ, осуществляемый патологом или с помощью компьютера. Наконец, все микроскопические препараты удаляли из прибора, промывали, обезвоживали и помещали в постоянную заливочную среду в соответствии со стандартными процедурами IHC-анализа.

Патологическое исследование на основе цифровых технологий Микроскопические препараты подвергнутых IHC-окрашиванию срезов ткани толщиной 5 мкм сканировали при 20-кратном увеличении с использованием цифрового сканера Hamamatsu Nanozoomer в светлопольном режиме. Двойной IHC-анализ изображений целых микроскопических препаратов выполняли с помощью платформы Indica Labs HALO®. Вкратце, способ предусматривал 3-хромогенную цветовую деконволюцию для разделения IHC-хромогенов (х2) плюс контрастное окрашивание. Клеточные объекты формировали путем применения взвешенных значений оптической плотности для отдельных хромогенов. Затем каждый положительный тип клеток идентифицируют с использованием определенных параметров размера, формы и окрашивания внутриклеточных компартментов. Была осуществлена разработка и интеграция в алгоритм классификатора для автоматической сегментации представляющих интерес областей ткани для анализа. Дополненный алгоритм применяли ко всем изображениям срезов ткани в исследовании, проводимом автоматизированным и объективным образом, с получением подробных данных относительно каждой клетки. Рассматривали все отсканированные изображения и определяли и вручную аннотировали следующие области:

• инвазивный край: граница опухоли, определенная патологом,

• центральная часть (ТМЕ): центр опухоли, находящийся на расстоянии >500 мкм внутрь от инвазивного края,

• перитуморальная строма: ткань вокруг опухоли, находящаяся на расстоянии >500 мкм снаружи от инвазивного края.

Складки ткани и/или артефакты окрашивания исключали из анализа путем исключения, выполняемого вручную.

Результаты и выводы

Плотность ICOS+FOXP3+ клеток была значительно выше (р<0,001 согласно парному Т-критерию) в ТМЕ (центральной части опухоли), чем в перитуморальной области. Фигура 2.

Отношение ICOS-положительных TReg (дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток) к общему числу FOXP3 клеток также было значительно выше в ТМЕ (центральной части опухоли), чем в перитуморальной области (р<0,001 согласно парному Т-критерию). Фигура 3.

Эти полученные результаты согласуются с более ранней работой применительно к НСС, в которой ICOS⁺ TReg были более распространены в ТМЕ, чем в перитуморальной области [3].

Большое число и доля TReg, экспрессирующих ICOS, при НСС предполагает наличие в высокой степени иммуносупрессивной среды в этих опухолях. Иммунотерапия антителом к ICOS и/или антителом к TReg, вероятно, принесет пользу при НСС с данными характеристиками.

Эти эффекты являлись более выраженными при видах рака, связанных с вирусами, что указывает на то, что ассоциированные с вирусами или индуцированные вирусами виды рака (например, HBV-положительная НСС, HCV-положительная НСС) могут характеризоваться большей вероятностью ответа на иммунотерапию антителом к ICOS и/или антителом к TReg, хотя полученный результат не продемонстрировал достижения статистической значимости в рамках настоящего исследования.

Пример 2. ICOS является биомаркером для прогнозирования течения заболевания

При задействовании той же когорты пациентов с НСС, что и в примере 1, авторы настоящего изобретения обнаружили связь между выживаемостью пациентов и плотностью ICOS+ клеток и долей ICOS+ TReg в образцах опухолевой ткани. Более высокая плотность ICOS-положительных клеток была связана с более короткой OS. Более высокая доля ICOS-положительных TReg также была связана с более короткой OS.

Обработка образцов

Образцы опухолевой ткани обрабатывали и проводили IHC-анализ и патологическое исследование на основе цифровых технологий, как описано в примере 1.

Анализ данных

Ассоциации между количественными измерениями, выполненными в отношении клеток, и выживаемостью анализировали путем построения кривых Каплана-Мейера для популяций пациентов, разделенных в соответствии с результатами различных количественных измерений, выполненных в отношении клеток. Различия в отношении выживаемости между популяциями пациентов сравнивали посредством логарифмического рангового критерия. Процедуры анализа посредством логарифмического рангового критерия Каплана-Мейера выполняли с использованием Graphpad Prism 8.3.1.

Процедуры статистического анализа проводили с использованием программного обеспечения для статистического анализа SAS (версия 9.4, SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США). Двустороннее значение р, составляющее <0,05, рассматривалось, как статистически значимое. OS и RFS для пациентов в разных подгруппах оценивали с использованием способа Каплана-Мейера, а сравнение осуществляли с использованием логарифмического рангового критерия. Непарный Т-критерий использовали для сравнения различий в значениях плотности клеток.

Отношение рисков (HR, критерий Мантеля-Хенселя) с 95% доверительными интервалами (CI) также использовали для оценки степени ассоциации между отношением ICOS+ TReg к общему числу TReg и прогнозом в отношении рака, представленного НСС.

Результаты и выводы

Каждый из эффектов величины доли ICOS+ TReg и плотности ICOS+ клеток, оказываемых в отношении прогноза течения НСС, исследовали путем построения кривых Каплана-Мейера, а различия в OS сравнивали посредством логарифмического рангового критерия. Пациенты с высоким отношением ICOS⁺FOXP3⁺/общее количество FOXP3⁺ клеток (р=0,074) или с высокой плотностью ICOS+ клеток в ТМЕ были ассоциированы с более короткой OS (р<0,05).

Результаты продемонстрировали значительную корреляцию между высокой плотностью клеток с ICOS и плохим прогнозом (плохой выживаемостью), свидетельствуя о том, что низкий уровень экспрессии ICOS, проявляющийся в виде более низкой плотности ICOS+ клеток в ТМЕ, является предиктором лучшей выживаемости пациентов с НСС.Авторы настоящего изобретения обнаружили, что у пациентов, у которых имеется 120 или больше ICOS-положительных клеток на мм² в ТМЕ, медианная OS была более чем вдвое ниже по сравнению с другими пациентами. У пациентов с низким значением плотности (<120 клеток на мм²) медианная выживаемость составляла 147,3 месяца, тогда как у пациентов с высоким значением плотности (>=120 клеток на мм²) медианная выживаемость составляла 68,9 месяцев. Фигура 4. Пороговое значение, составляющее 120 клеток, является округленным значением. Статистическая значимость наблюдалась при других схожих пороговых значениях числа, например, 123 клетки на мм². Отношение рисков (HR, критерий Мантеля-Хенселя) с 95% доверительными интервалами (CI) для ассоциации между плотностью ICOS+ клеток и прогнозом в отношении рака, представленного НСС, согласно расчетам составило 0,5774 с CI 0,3346-0,9963; р<0,05.

Когда анализ проводили с использованием количественных показателей для безрецидивной выживаемости (RFS), а не общей выживаемости (OS), логарифмический ранговый критерий (Мантела-Кокса) не показал статистической значимости для разницы в % RFS для популяций пациентов, стратифицированных в соответствии с самым высоким квартилем (≤120 клеток на мм²) по сравнению с 3 нижними квартилями (<120 клеток на мм²).

Высокая доля ICOS-положительных TReg в популяции TReg также была ассоциирована с худшим прогнозом в отношении выживаемости. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что для пациентов, у которых 50% или больше TReg являлись ICOS-положительными, медианная OS была более чем вдвое ниже по сравнению с другими пациентами. У пациентов с низким значением отношения (<0,5) медианная выживаемость составляла 147,3 месяца, тогда как у пациентов с высоким значением отношения (>=0,5) медианная выживаемость составляла 61,6 месяца. Фигура 5. Отношение рисков для ассоциации составляло 0,5870 с доверительными интервалами CI, составляющими 0,3486-0,9885; р=0,0451.

Пороговое значение отношения, составляющее 0,5 в этой популяции, определили эмпирически как отношение, при котором пациентов можно было дифференцировать со статистической значимостью относительно времени выживаемости. Разделение когорты с использованием медианного отношения (0,33) аналогичным образом обеспечивало разделение пациентов на пациентов с более продолжительным и более коротким периодами выживаемости, и пациенты с более высоким отношением характеризовались более продолжительным периодом выживаемости, но без достижения статистической значимости. То же самое имело место при разделении когорты на пациентов, характеризующихся верхним квартилем по сравнению с характеризующимися нижним квартилем величины отношения, т.е. разница наблюдалась, но не достигала статистической значимости.

Когда была проведена оценка эффекта в отношении RFS (а не в отношении OS), в ходе которой когорту разделяли по пороговому значению отношения, составляющему 0,5, авторы настоящего изобретения увидели четкое разделение данных, при этом значение % RFS было выше у пациентов с отношением, составляющим <0,50. Это отражает ту же тенденцию, наблюдаемую в случае OS, но разница для RFS не являлась статистически значимой в соответствии с логарифмическим ранговым критерием (Мантела-Кокса).

В заключение следует отметить, что пациенты с более высокой плотностью ICOS+ клеток и/или более высоким отношением ICOS+ TReg к общему количеству TReg в ТМЕ характеризовались худшей выживаемостью, и лечение с помощью терапевтического средства на основе антитела к TReg должно устранять по меньшей мере одну причину, по которой это происходит, путем снижения числа ICOS+ TReg и обуславливания противоопухолевого ответа с улучшением выживаемости.

Пример 3. ICOS является прогностическим биомаркером при HBV-положительной НСС

Хроническая инфекция, вызываемая вирусом гепатита В (HBV), связана с патогенезом НСС. При дополнительном анализе данных из примера 2 авторы настоящего изобретения обнаружили, что высокая плотность ICOS-положительных клеток на мм² в ТМЕ HBV-положительных опухолей была ассоциирована с плохим прогнозом. Если сосредоточить внимание на HBV-положительных опухолях, относящихся к НСС, результаты продемонстрировали значительную корреляцию между высокой плотностью клеток с ICOS и плохим прогнозом, свидетельствуя о том, что низкий уровень экспрессии ICOS, проявляющийся в виде более низкой плотности ICOS+ клеток в ТМЕ, является предиктором лучшей выживаемости пациентов с НСС, ассоциированной с инфекцией, вызванной HBV.

В то время как для дифференциации популяций пациентов с HBV-независимой НСС (пример 2) использовали пороговое значение, составляющее 120 клеток на мм², для HBV-положительной НСС определяли более низкое пороговое значение, составляющее 100 клеток на мм². Пациенты, у которых имелось 100 или более ICOS-положительных клеток на мм² в ТМЕ (верхний квартиль), продемонстрировали медианную OS, составляющую 26,1 месяца, тогда как OS являлась неопределенной/не достигнутой для пациентов, которые характеризовались значением, составляющим менее чем 100 клеток с ICOS на мм² (три нижние квартиля). Фигура 6. Статистическая значимость согласно логарифмическому ранговому критерию (Мантела-Кокса) составляла р<0,05. Тот же анализ, выполняемый в отношении RFS, а не в отношении OS, не продемонстрировал достижения статистической значимости.

Отношение рисков (HR, критерий Мантеля-Хенселя) с 95% доверительными интервалами (CI) также использовали для оценки степени ассоциации между плотностью ICOS-положительных клеток и прогнозом в отношении рака, представленного НСС (OS). HR составило 0,4345 с CI 0,2131-0,8861, р=0,0219.

Пример 4. ICOS является прогностическим биомаркером при НСС 2 стадии по классификации AJCC

При дополнительном анализе данных из примера 2 авторы настоящего изобретения обнаружили, что высокая плотность ICOS-положительных клеток на мм² в ТМЕ опухолей при НСС 2 стадии по классификации AJCC была ассоциирована с плохим прогнозом. Аналогично примеру 3, авторы настоящего изобретения обнаружили, что если сосредоточить внимание на опухолях при НСС AJCC2, результаты продемонстрировали значительную корреляцию между высокой плотностью клеток с ICOS и плохим прогнозом, свидетельствуя о том, что низкий уровень экспрессии ICOS, проявляющийся в виде более низкой плотности ICOS+ клеток в ТМЕ, является предиктором лучшей выживаемости пациентов с НСС AJCC2.

В то время как для дифференциации популяций пациентов с HBV-независимой НСС (пример 2) использовали пороговое значение, составляющее 120 клеток на мм², для НСС 2 стадии по классификации AJCC определяли более низкое пороговое значение, составляющее 100 клеток на мм². Пациенты, у которых имелось 100 или более ICOS-положительных клеток на мм² в ТМЕ (верхний квартиль), продемонстрировали более низкую медианную OS по сравнению с пациентами, которые характеризовались значением, составляющим менее чем 100 клеток с ICOS на мм² (три нижние квартиля). Фигура 7. Статистическая значимость согласно логарифмическому ранговому критерию (Мантела-Кокса) составляла р<0,01.

Пациенты, у которых имелось 100 или более ICOS-положительных клеток на мм² в ТМЕ (верхний квартиль), также продемонстрировали более низкий % RFS по сравнению с пациентами, которые характеризовались значением, составляющим менее чем 100 клеток с ICOS на мм² (три нижние квартиля). Фигура 8. Статистическая значимость согласно логарифмическому ранговому критерию (Мантела-Кокса) составляла р<0,05.

Авторы настоящего изобретения полагают, что более низкое пороговое значение, составляющее 100 клеток на мм² будет также являться подходящим для НСС более поздних стадий, например, НСС 3 стадии. Это можно подтвердить посредством анализа образцов и данных относительно выживаемости для 18 пациентов, характеризующихся 3 стадией по классификации AJCC, из настоящей когорты.

Пример 5. Межклеточные расстояния являются биомаркерами для определения прогноза

Распределение иммунных клеток относительно друг друга может влиять не только на противоопухолевый иммунный статус пациента, но также и на выживаемость пациента. Используя образцы опухолевой ткани, полученные в той же когорте пациентов с НСС, что и в случае предыдущих примеров, авторы настоящего изобретения измеряли расстояния между дважды положительными по ICOS и FOXP3 клетками и одноположительными по ICOS (ICOS-положительными FOXP3-отрицательными) клетками. Дважды положительные по ICOS и FOXP3 клетки представляют собой активные TReg, которые являются в высокой степени иммуносупрессивными в отношении CD8+ цитотоксических Т-клеток и CD4+ Т-хелперных клеток. Одноположительные по ICOS клетки рассматриваются как лимфоциты, не являющиеся TReg, такие как активированные CD8+ цитотоксические Т-клетки и CD4+ Т-хелперные клетки. Таким образом, в этом исследовании авторы настоящего изобретения изучали расстояние между эффекторными Т-клетками, которые могут опосредовать противоопухолевый иммунный ответ, и активными TReg, которые могут подавлять этот ответ. Хотя в данном случае изучались межклеточные расстояния в мертвой ткани, считается, что способы, используемые для взятия образца и сохранения ткани, а также используемые методики IHC-анализа и патологического исследования на основе цифровых технологий, обеспечивают сохранение целостности ткани, ввиду чего расстояния между клетками являются репрезентативными для расстояний в опухоли in vivo непосредственно перед взятием образца.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что среднее расстояние от одноположительных по ICOS клеток до ближайшей дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетки коррелировало с общей выживаемостью. Более короткое расстояние между клетками было ассоциировано с более коротким периодом выживаемости.

Измерение межклеточной пространственной близости

Плотность клеток и расстояния между клетками с экспрессией только ICOS или только FOXP3 и клетками с двойной экспрессией IC0S/FOXP3 в центральной части, крае и перитуморальной области опухоли количественно определяли посредством патологического исследования на основе цифровых технологий, которое выполняли следующим образом.

Проводили количественную оценку клеток, положительных по нескольким хромогенным маркерам, в пределах определенной области. Провели количественную оценку клеток, в которых совместно локализовались несколько хромогенных маркеров.

Исследовали пространственные отношения различных идентифицированных клеточных популяций. Алгоритм классификации разрабатывали с использованием подхода "случайного леса" и осуществляли его применение по отношению к каждому изображению целого микроскопического препарата для идентификации жизнеспособной ткани в пределах каждой области (край/центральная часть/перитуморальная ткань). Разрабатывали отдельный специализированный алгоритм для мультиплексного IHC-анализа для количественного определения одноположительных по IHC-окрашиванию на FOXP3 и ICOS и дважды положительных по IHC-окрашиванию на ICOS/FOXP3 клеток. В частности, красители, представленные гематоксилином и IHC-хромогенами, дифференцированно взвешивали с целью сегментации клеток в пределах областей и обеспечения точного подсчета клеток. Пороговые значения корректировали для каждого хромогена, чтобы определить клетки, положительные только в отношении FOXP3 (бирюзовый хромоген для клеточных ядер), только в отношении ICOS (коричневый хромоген 3,3'-диаминобензидин (DAB)), а также характеризующиеся дважды положительным по FOXP3/ICOS статусом. Значения числа одно- и дважды положительных по FOXP3 и ICOS клеток нормализовали по площади жизнеспособной ткани для каждой области с получением числа положительных клеток на мм² ткани на область для каждого изображения целого микроскопического препарата.

Данные относительно результатов клеточного анализа дополнительно использовали для построения графика пространственного расположения обнаруженных клеточных фенотипов в пределах центральной части опухоли. Эти графики впоследствии использовали для генерирования данных относительно пространственной близости и относительного пространственного распределения для одноположительных по ICOS и дважды положительных по FOXP3/ICOS клеток с использованием модуля пространственного анализа, встроенного в платформу Halo. Для каждой совокупности срезов на тип рака первоначально получали данные относительно среднего расстояния от каждой одноположительной по ICOS клетки до ближайшей к ней дважды положительной по FOXP3/ICOS клетки в центральной части опухоли для изображения полного микроскопического препарата. За этим следовало измерение числа дважды положительных по FOXP3/ICOS клеток, находящихся в пределах 30 мкм относительно каждой одноположительной по ICOS клетки в центральной части опухоли, в расчете на изображение полного микроскопического препарата. Затем проводили анализ пространственной близости для дважды положительных по FOXP3/ICOS клеток, находящихся в пределах 30 мкм относительно одноположительной по ICOS клетки, с получением среднего расстояния до этих клеток от ближайшей к ним одноположительной по ICOS клетки.

Анализ данных

Анализ данных в целом проводили, как описано в примере 2.

Результаты и выводы

Авторами настоящего изобретения был проведен расчет средней величины (среднего значения) расстояния от одноположительных по ICOS клеток до ближайшей к ним дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетки в каждом из 142 образцов пораженной НСС ткани, полученных в когорте Taiwan NTU. Медианное среднее расстояния в этой когорте составило 105 мкм. Используя это медианное значение в качестве порогового значения для стратификации когорты, авторы настоящего изобретения обнаружили, что у пациентов со средним расстоянием, составляющим менее 105 мкм, общая выживаемость была значительно ниже, чем у пациентов со средним расстоянием, составляющим 105 мкм или больше. Фигура 9. Эта стратификация не продемонстрировала статистически значимой ассоциации с RFS. Отношение рисков (HR, критерий Мантеля-Хенселя) с 95% доверительными интервалами (CI) использовали для оценки степени ассоциации между расстоянием от одноположительных ICOS+ клеток до ближайшей дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетки и общей выживаемостью при раке, представленном НСС. Авторами настоящего изобретения было рассчитано HR, которое составило 1,692 (большое расстояние относительно малого расстояния), и CI составил 1,063-2,694; р=0,0266.

Таким образом, более короткое расстояние между ICOS+FOXP3+ клетками и ICOS+FOXP3- клетками было значимо ассоциировано с более короткой OS (р<0,05), позволяя предположить, что ICOS+ TReg вызывают активную иммуносупрессию ICOS+ TEff в ТМЕ пораженной НСС ткани.

Пример 6. Зональное влияние иммуносупрессивных TReg в радиусе TEff

Исходя из предыдущих примеров авторы настоящего изобретения дополнительно изучили пространственное распределение ICOS+FOXP3+ и одноположительных ICOS+ клеток, чтобы определить потенциальные последствия наличия высокой плотности в высокой степени иммуносупрессивных дважды положительных ICOS+FOXP3+ TReg, находящихся рядом с одноположительными ICOS+ клетками (потенциально эффекторными клетками). Сосредоточившись на ТМЕ, авторы настоящего изобретения идентифицировали и подсчитали число дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, которые находились в пределах 30 мкм относительно любой одноположительной по ICOS клетки.

Определяя зону с учетом радиуса 30 мкм вокруг каждой одноположительной по ICOS клетки, авторы настоящего изобретения измерили общее число дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, попадающих в любую одну или несколько таких зон в ТМЕ, затем разделили это количество клеток на общее число одноположительных по ICOS клеток в области ТМЕ с получением значения отношения, которое авторы настоящего изобретения называют коэффициентом зонального влияния.

Авторы настоящего изобретения идентифицировали статистически значимую ассоциацию между общей выживаемостью и коэффициентом зонального влияния. В случае образцов, полученных от пациентов, характеризующихся коэффициентом зонального влияния, составляющим<0,1, OS пациентов (но не RFS) была значительно выше, чем таковая в случае образцов, характеризующихся средней величиной, составляющей ≥0,1. Фигура 10 и таблица Е6-1.

Пример 7. Значимость иммунотерапии

Приведенные выше примеры показывают, что все следующие характеристики ассоциированы с худшей OS:

- более высокий уровень экспрессии ICOS (более высокая плотность ICOS+ клеток) в центральной части опухоли (ТМЕ),

- более высокое отношение ICOS⁺FOXP3⁺ клеток к общему числу FOXP3⁺ клеток,

- большая пространственная близость (более короткое расстояние) между ICOS⁺ TReg и другими ICOS+ клетками,

- большее число ICOS+FOXP3+ TReg, находящихся в пределах 30 мкм относительно одноположительных по ICOS клеток.

Авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что иммуносупрессивное ТМЕ клинически значимо при НСС. TReg может подавлять функцию и пролиферацию CD4+и CD8+ TEff. Это согласуется с более ранними исследованиями, в которых увеличение количества TReg и снижение количества CD8+ Т-клеток в ТМЕ было ассоциировано с неблагоприятным прогнозом у пациентов с солидными опухолями, включая НСС [2].

Истощение/снижение числа положительных в отношении ICOS^high TReg в таких опухолях, например, с помощью антитела, такого как KY1044, должно обеспечивать улучшение иммунной обстановки за счет снижения уровня иммуносупрессии, а также обеспечивать клиническую пользу в случае пациентов с НСС и другими опухолями, характеризующимися этими признаками.

Было показано, что KY1044 обеспечивает истощение количества ICOS+FOXP3+ TReg у пациентов, страдающих от рака. В нескольких когортах пациентов в клиническом испытании монотерапии на основе KY1044 антитело KY1044 снижало отношение ICOS+FOXP3+ TReg ко всем FOXP3+ TReg в течение периода от исходного уровня (скрининг) до 8 дней после второго цикла дозирования (C2D8) при дозировании с 3-недельными интервалами. Фигура 11.

Пример 8. Расчет значений биомаркеров в образце опухолевой ткани, полученном от пациента

Авторы настоящего изобретения иллюстрируют определение показаний для биомаркеров в образце опухолевой ткани, полученном в когорте пациентов, описанной в примерах 1-6.

Микроскопический препарат ткани получали из образца опухолевой ткани, окрашивали на ICOS и FOXP3 и подвергали анализу с использованием цифровых технологий, как описано в примере 1. Фигуры 12-14.

Определяли и количественно характеризовали площадь центральной части опухоли (AREA_ТМЕ).

Следующие данные регистрировали для клеток в центральной части опухоли:

- число одноположительных по ICOS клеток (SPICOS_NB_ТМЕ);

- число ЕОХР3-положительных клеток (TOTFOXP_NB_TME);

- число дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток (DP_NB_TME);

- средняя величина (среднее значение) расстояния от каждой одноположительной по ICOS клетки до ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клетки (DIST_SPICOS_TME), представляющая межклеточную пространственную близость между ICOS+FOXP3+ клетками и ICOS+FOXP3- клетками; при этом расчет этой средней величины выполнялся автоматически с помощью программного обеспечения Halo® на основании количественных измерений расстояния между ними и данных по количеству клеток; и число дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, которые находились в пределах 30 мкм относительно любой одноположительной по ICOS клетки (DP_NB_30UMSPICOSROI_TME).

В результате суммирования числа одноположительных по ICOS клеток и числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток получают общее число ICOS-положительных клеток (TOTICOS_NB_ТМЕ).

В результате деления общего числа ICOS-положительных клеток на площадь центральной части опухоли получают плотность ICOS-положительных клеток (TOTICOS_DEN_TME).

В результате деления числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток на общее число FOXP3-положительных клеток получают долю FOXP3-положительных клеток, которые являются ICOS-положительными ("доля ICOS+TReg") (RATIO_DP_TO_TOTFOXP_TME).

В результате деления числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, которые находились в пределах 30 мкм относительно любой одноположительной по ICOS клетки, на общее число одноположительных по ICOS клеток в ТМЕ получают коэффициент зонального влияния (RATIO_DP_30UMSPICOSROI_ТО_SPICOS_ТМЕ).

Каждый показатель из плотности ICOS+ клеток, межклеточной пространственной близости, доли ICOS+ TReg и коэффициента зонального влияния является биомаркером для определения прогноза и лечения для пациентов, как представлено в настоящем изобретении. Показания для биомаркеров для пациента можно сравнивать с референтными значениями для когорты. Иллюстративные данные относительно биомаркеров из образца будут указывать на неблагоприятный прогноз, поскольку плотность ICOS-положительных клеток превышает 100 на мм², отношение клеток ICOS+FOXP3+ к общему числу FOXP3+ клеток превышает 0,5, среднее расстояние от ICOS+FOXP3- клетки до ближайшей к ней ICOS+FOXP3+ клетки является меньшим чем 105 мкм, и коэффициент зонального влияния превышает 0,1. Ожидается, что пациент с опухолью, относящейся к НСС, характеризующийся такими данными, будет иметь относительно короткий период выживаемости по сравнению с другими пациентами с НСС. Данные относительно биомаркеров указывают на то, что пациент получит пользу от лечения иммунотерапевтическим средством на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, которое может продлить период выживаемости пациента.

Пример 9. Расчет доли ICOS+ TReg

Микроскопический препарат ткани получали из другого образца опухолевой ткани, полученного в когорте пациентов, описанной в примерах 1-6. Срез ткани окрашивали на ICOS и FOXP3 и подвергали анализу с использованием цифровых технологий, как описано в примере 1. Фигура 15.

Зарегистрированные результаты анализа в отношении доли ICOS+ TReg являлись следующими:

число дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток в ТМЕ=11066,

число одноположительных по FOXP3 клеток в ТМЕ=10842,

общее число FOXP3 клеток в ТМЕ=21908,

значение отношения=11066/21908=0,51.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Kymab Limited

<120> Опухолевые биомаркеры для иммунотерапии

<130> K00061-1 WO

<150> GB2007099.1

<151> 2020-05-14

<160> 78

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gly Val Thr Phe Asp Asp Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ile Asn Trp Asn Gly Gly Asp Thr

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ala Arg Asp Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr His Val Pro Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 4

<211> 372

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgtag cctctggagt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct 120

ccagggaagg ggctggartg ggtctctggt attaattgga atggtggcga cacagattat 180

tcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctacaaatga atagtctgag agccgaggac acggccttgt attactgtgc gagggatttc 300

tatggttcgg ggagttatta tcacgttcct tttgactact ggggccaggg aatcctggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 5

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Val Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr His Val Pro Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 1368

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 6

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgtag cctctggagt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct 120

ccagggaagg ggctggartg ggtctctggt attaattgga atggtggcga cacagattat 180

tcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctacaaatga atagtctgag agccgaggac acggccttgt attactgtgc gagggatttc 300

tatggttcgg ggagttatta tcacgttcct tttgactact ggggccaggg aatcctggtc 360

accgtctcct cagccagcac caagggcccc tctgtgttcc ctctggcccc ttccagcaag 420

tccacctctg gcggaacagc cgctctgggc tgcctcgtga aggactactt ccccgagcct 480

gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg accagcggag tgcacacctt ccctgctgtg 540

ctgcagtcct ccggcctgta ctccctgtcc tccgtcgtga ccgtgccttc cagctctctg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccct ccaacaccaa ggtggacaag 660

aaggtggaac ccaagtcctg cgacaagacc cacacctgtc ccccttgtcc tgcccctgaa 720

ctgctgggcg gaccttccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 780

tcccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg 840

aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag 900

gaacagtaca actccaccta ccgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg 960

ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgcctgc ccccatcgaa 1020

aagaccatct ccaaggccaa gggccagccc cgggaacccc aggtgtacac actgccccct 1080

agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gtctcgtgaa aggcttctac 1140

ccctccgata tcgccgtgga atgggagtcc aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc 1200

accccccctg tgctggactc cgacggctca ttcttcctgt acagcaagct gacagtggac 1260

aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1320

aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg agccccggca agtgatga 1368

<210> 7

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Val Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr His Val Pro Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 8

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 8

Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr

1 5

<210> 9

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 9

Gly Ala Ser

1

<210> 10

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 10

His Gln Tyr Asp Met Ser Pro Phe Thr

1 5

<210> 11

<211> 324

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 11

gaaattgtgt tgacgcagtc tccagggacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agaagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cgtggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcgatgg gtctgggaca gacttcactc tctccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcac cagtatgata tgtcaccatt cactttcggc 300

cctgggacca aagtggatat caaa 324

<210> 12

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 12

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Arg Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Asp Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Met Ser Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 645

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 13

gaaattgtgt tgacgcagtc tccagggacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agaagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cgtggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcgatgg gtctgggaca gacttcactc tctccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcac cagtatgata tgtcaccatt cactttcggc 300

cctgggacca aagtggatat caaacgtacg gtggccgctc cctccgtgtt catcttccca 360

ccttccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcttctgtcg tgtgcctgct gaacaacttc 420

tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480

caggaatccg tgaccgagca ggactccaag gacagcacct actccctgtc ctccaccctg 540

accctgtcca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600

ggcctgtcta gccccgtgac caagtctttc aaccggggcg agtgt 645

<210> 14

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 14

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Arg Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Asp Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Met Ser Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 15

<211> 990

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 15

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210> 16

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 16

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 17

<211> 990

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 17

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210> 18

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 18

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 19

<211> 990

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 19

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 990

<210> 20

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 20

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 21

<211> 990

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 21

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acatcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210> 22

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 22

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 23

<211> 990

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 23

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agtggagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cgcgggggca 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210> 24

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 24

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 25

<211> 978

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 25

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300

aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540

gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600

aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960

tccctgtctc cgggtaaa 978

<210> 26

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 26

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 27

<211> 978

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 27

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgacctcca gcaacttcgg cacccagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300

aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480

atggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540

gtggtcagcg tcctcaccgt cgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600

aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 960

tccctgtctc cgggtaaa 978

<210> 28

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 28

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Met Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 29

<211> 978

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 29

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300

aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540

gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600

aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960

tccctgtctc cgggtaaa 978

<210> 30

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 30

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 31

<211> 978

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 31

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300

aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540

gtggtcagcg tcctcaccgt cgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600

aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatctc cgtggagtgg 780

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 960

tccctgtctc cgggtaaa 978

<210> 32

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 32

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 33

<211> 981

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 33

gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300

aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840

gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960

ctctccctgt ctctgggtaa a 981

<210> 34

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 34

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 35

<211> 981

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 35

gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300

aaatatggtc ccccgtgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcgtgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840

gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 960

ctctccctgt ctctgggtaa a 981

<210> 36

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 36

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 37

<211> 981

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 37

gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300

aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 960

ctctccctgt ctctgggtaa a 981

<210> 38

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 38

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 39

<211> 981

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 39

gcctccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacggccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccagt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300

aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcgcctgaat ttgagggggg accatcagtc 360

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtca tcgatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840

gacggatcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960

ctctccctgt ctctgggtaa a 981

<210> 40

<211> 981

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 40

gcctccacca agggacctag cgtgttccct ctcgccccct gttccaggtc cacaagcgag 60

tccaccgctg ccctcggctg tctggtgaaa gactactttc ccgagcccgt gaccgtctcc 120

tggaatagcg gagccctgac ctccggcgtg cacacatttc ccgccgtgct gcagagcagc 180

ggactgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagct ccagcctcgg caccaaaacc 240

tacacctgca acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggagagc 300

aagtacggcc ccccttgccc tccttgtcct gcccctgagt tcgagggagg accctccgtg 360

ttcctgtttc cccccaaacc caaggacacc ctgatgatct cccggacacc cgaggtgacc 420

tgtgtggtcg tggacgtcag ccaggaggac cccgaggtgc agttcaactg gtatgtggac 480

ggcgtggagg tgcacaatgc caaaaccaag cccagggagg agcagttcaa ttccacctac 540

agggtggtga gcgtgctgac cgtcctgcat caggattggc tgaacggcaa ggagtacaag 600

tgcaaggtgt ccaacaaggg actgcccagc tccatcgaga agaccatcag caaggctaag 660

ggccagccga gggagcccca ggtgtatacc ctgcctccta gccaggaaga gatgaccaag 720

aaccaagtgt ccctgacctg cctggtgaag ggattctacc cctccgacat cgccgtggag 780

tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaaaacaa cccctcccgt gctcgatagc 840

gacggcagct tctttctcta cagccggctg acagtggaca agagcaggtg gcaggagggc 900

aacgtgttct cctgttccgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagagc 960

ctctccctgt ccctgggcaa g 981

<210> 41

<211> 981

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 41

gccagcacca agggcccttc cgtgttcccc ctggcccctt gcagcaggag cacctccgaa 60

tccacagctg ccctgggctg tctggtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgagc 120

tggaacagcg gcgctctgac atccggcgtc cacacctttc ctgccgtcct gcagtcctcc 180

ggcctctact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgcctagct cctccctcgg caccaagacc 240

tacacctgta acgtggacca caaaccctcc aacaccaagg tggacaaacg ggtcgagagc 300

aagtacggcc ctccctgccc tccttgtcct gcccccgagt tcgaaggcgg acccagcgtg 360

ttcctgttcc ctcctaagcc caaggacacc ctcatgatca gccggacacc cgaggtgacc 420

tgcgtggtgg tggatgtgag ccaggaggac cctgaggtcc agttcaactg gtatgtggat 480

ggcgtggagg tgcacaacgc caagacaaag ccccgggaag agcagttcaa ctccacctac 540

agggtggtca gcgtgctgac cgtgctgcat caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600

tgcaaggtca gcaataaggg actgcccagc agcatcgaga agaccatctc caaggctaaa 660

ggccagcccc gggaacctca ggtgtacacc ctgcctccca gccaggagga gatgaccaag 720

aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggattctacc cttccgacat cgccgtggag 780

tgggagtcca acggccagcc cgagaacaat tataagacca cccctcccgt cctcgacagc 840

gacggatcct tctttctgta ctccaggctg accgtggata agtccaggtg gcaggaaggc 900

aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagtcc 960

ctgagcctgt ccctgggaaa g 981

<210> 42

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 42

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 43

<211> 981

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 43

gcctccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacggccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccagt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300

aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcgcctccag ttgcgggggg accatcagtc 360

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtca tcgatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840

gacggatcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960

ctctccctgt ctctgggtaa a 981

<210> 44

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 44

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 45

<211> 321

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 45

cgtacggtgg ccgctccctc cgtgttcatc ttcccacctt ccgacgagca gctgaagtcc 60

ggcaccgctt ctgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag 120

tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aactcccagg aatccgtgac cgagcaggac 180

tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag 240

aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc caccagggcc tgtctagccc cgtgaccaag 300

tctttcaacc ggggcgagtg t 321

<210> 46

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 46

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 47

<211> 321

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 47

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggag 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgccgg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

<210> 48

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 48

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Gly Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 49

<211> 321

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 49

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

cggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggag 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

<210> 50

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 50

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Arg Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 51

<211> 321

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 51

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

<210> 52

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 52

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 53

<211> 321

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 53

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcaac accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg c 321

<210> 54

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 54

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 55

<211> 312

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 55

cccaaggcca accccacggt cactctgttc ccgccctcct ctgaggagct ccaagccaac 60

aaggccacac tagtgtgtct gatcagtgac ttctacccgg gagctgtgac agtggcttgg 120

aaggcagatg gcagccccgt caaggcggga gtggagacga ccaaaccctc caaacagagc 180

aacaacaagt acgcggccag cagctacctg agcctgacgc ccgagcagtg gaagtcccac 240

agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac agtggcccct 300

acagaatgtt ca 312

<210> 56

<211> 104

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 56

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

1 5 10 15

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

20 25 30

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

35 40 45

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

50 55 60

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

65 70 75 80

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

85 90 95

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100

<210> 57

<211> 318

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 57

ggtcagccca aggccaaccc cactgtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagctccaa 60

gccaacaagg ccacactagt gtgtctgatc agtgacttct acccgggagc tgtgacagtg 120

gcctggaagg cagatggcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccaa accctccaaa 180

cagagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcccga gcagtggaag 240

tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300

gcccctacag aatgttca 318

<210> 58

<211> 318

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 58

ggtcagccca aggccaaccc cactgtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagctccaa 60

gccaacaagg ccacactagt gtgtctgatc agtgacttct acccgggagc tgtgacagtg 120

gcctggaagg cagatggcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccaa accctccaaa 180

cagagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcccga gcagtggaag 240

tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300

gcccctacag aatgttca 318

<210> 59

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 59

Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 60

<211> 318

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 60

ggccagccta aggccgctcc ttctgtgacc ctgttccccc catcctccga ggaactgcag 60

gctaacaagg ccaccctcgt gtgcctgatc agcgacttct accctggcgc cgtgaccgtg 120

gcctggaagg ctgatagctc tcctgtgaag gccggcgtgg aaaccaccac cccttccaag 180

cagtccaaca acaaatacgc cgcctcctcc tacctgtccc tgacccctga gcagtggaag 240

tcccaccggt cctacagctg ccaagtgacc cacgagggct ccaccgtgga aaagaccgtg 300

gctcctaccg agtgctcc 318

<210> 61

<211> 318

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 61

ggccagccta aagctgcccc cagcgtcacc ctgtttcctc cctccagcga ggagctccag 60

gccaacaagg ccaccctcgt gtgcctgatc tccgacttct atcccggcgc tgtgaccgtg 120

gcttggaaag ccgactccag ccctgtcaaa gccggcgtgg agaccaccac accctccaag 180

cagtccaaca acaagtacgc cgcctccagc tatctctccc tgacccctga gcagtggaag 240

tcccaccggt cctactcctg tcaggtgacc cacgagggct ccaccgtgga aaagaccgtc 300

gcccccaccg agtgctcc 318

<210> 62

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 62

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 63

<211> 318

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 63

ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa 60

gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg 120

gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180

caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240

tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300

gcccctacag aatgttca 318

<210> 64

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 64

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 65

<211> 312

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 65

cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc ccaccctcct ctgaggagct tcaagccaac 60

aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac ttctacccgg gagccgtgac agttgcctgg 120

aaggcagata gcagccccgt caaggcgggg gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc 180

aacaacaagt acgcggccag cagctacctg agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac 240

aaaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac agttgcccct 300

acggaatgtt ca 312

<210> 66

<211> 104

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 66

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

1 5 10 15

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

20 25 30

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

35 40 45

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

50 55 60

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

65 70 75 80

Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

85 90 95

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100

<210> 67

<211> 318

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 67

ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccac cctcctctga ggagcttcaa 60

gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata agtgacttct acccggggcc agtgacagtt 120

gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag gcgggggtgg agaccaccac accctccaaa 180

caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240

tcccacaaaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300

gcccctacgg aatgttca 318

<210> 68

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 68

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Pro Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 69

<211> 318

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 69

ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccac cctcctctga ggagcttcaa 60

gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg 120

gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180

caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240

tcccacaaaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300

gcccctacag aatgttca 318

<210> 70

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 70

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 71

<211> 318

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 71

ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa 60

gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg 120

gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180

caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240

tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300

gcccctacag aatgttca 318

<210> 72

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 72

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 73

<211> 318

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 73

ggtcagccca aggctgcccc atcggtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa 60

gccaacaagg ccacactggt gtgcctgatc agtgacttct acccgggagc tgtgaaagtg 120

gcctggaagg cagatggcag ccccgtcaac acgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180

cagagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240

tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300

gcccctgcag aatgttca 318

<210> 74

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 74

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Asn Thr Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

100 105

<210> 75

<211> 318

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 75

ggtcagccca aggctgcccc atcggtcact ctgttcccac cctcctctga ggagcttcaa 60

gccaacaagg ccacactggt gtgtctcgta agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg 120

gcctggaagg cagatggcag ccccgtcaag gtgggagtgg agaccaccaa accctccaaa 180

caaagcaaca acaagtatgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcccga gcagtggaag 240

tcccacagaa gctacagctg ccgggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300

gcccctgcag aatgctct 318

<210> 76

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 76

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

100 105

<210> 77

<211> 318

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 77

ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccac cctcctctga ggagcttcaa 60

gccaacaagg ccacactggt gtgtctcgta agtgacttca acccgggagc cgtgacagtg 120

gcctggaagg cagatggcag ccccgtcaag gtgggagtgg agaccaccaa accctccaaa 180

caaagcaaca acaagtatgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcccga gcagtggaag 240

tcccacagaa gctacagctg ccgggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300

gcccctgcag aatgctct 318

<210> 78

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 78

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Ser Asp

20 25 30

Phe Asn Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

100 105

<---

Изобретение относится к иммунологии и медицине. Представлены биомаркеры для прогнозирования развития опухолей при гепатоцеллюлярной карциноме и других видах рака, измерение биомаркеров для назначения средства противораковой иммунотерапии, нацеленного против ICOS+ регуляторных Т-клеток, например, выбора пациентов для лечения с помощью антитела к ICOS. Биомаркеры предусматривают (i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток, (ii) среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой, (iii) долю FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и (iv) плотность ICOS-положительных клеток. Изобретение способствует прогнозированию течения заболевания и терапии у пациентов. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 15 ил., 4 табл., 9 пр.

1. Способ прогнозирования развития раковой солидной опухоли у пациента, предусматривающий

предоставление образца ткани из центральной части опухоли, полученного от пациента,

определение одного или нескольких из следующих биомаркеров в указанном образце:

(i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

(ii) среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

(iii) доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

(iv) плотность ICOS-положительных клеток, и

предоставление прогноза для пациента на основе указанных одного или нескольких биомаркеров, где на более короткую продолжительность выживаемости, безрецидивной выживаемости (RFS), выживаемости без прогрессирования (PFS) или времени до прогрессирования (TTP) для пациента указывает

более высокое отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

более короткое среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

более высокая доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и/или

более высокая плотность ICOS-положительных клеток.

2. Способ определения вероятности того, что раковая солидная опухоль у пациента продемонстрирует ответ на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, предусматривающий

предоставление образца ткани из центральной части опухоли, полученного от пациента, и

определение одного или нескольких из следующих биомаркеров в указанном образце:

(i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

(ii) среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

(iii) доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

(iv) плотность ICOS-положительных клеток, где

на более высокую вероятность того, что пациент продемонстрирует ответ на иммунотерапевтическое средство, указывает

более высокое отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

более короткое среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

более высокая доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и/или

более высокая плотность ICOS-положительных клеток.

3. Способ по п. 1, предусматривающий определение отношения числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток и

сравнение указанного отношения с референтным значением, где отношение, превышающее референтное значение, указывает на

прогноз более короткой продолжительности выживаемости, RFS, PFS или TTP или на повышенную вероятность ответа на иммунотерапевтическое средство, необязательно, где опухоль представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, и референтным значением является отношение, представляющее собой отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток, составляющее 0,1.

4. Способ по любому из пп. 1-3, предусматривающий определение среднего расстояния между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой и

сравнение указанного расстояния с референтным значением, где

расстояние меньшее, чем референтное значение, указывает на прогноз более короткой продолжительности выживаемости, RFS, PFS или TTP или на повышенную вероятность ответа на иммунотерапевтическое средство, необязательно, где опухоль представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, и референтным значением является среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой, составляющее 105 мкм.

5. Способ по любому из пп. 1-4, предусматривающий определение доли FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

сравнение указанной доли с референтным значением, где

доля, превышающая референтное значение, указывает на прогноз более короткой продолжительности выживаемости, RFS, PFS или TTP или на повышенную вероятность ответа на иммунотерапевтическое средство, необязательно, где опухоль представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, и референтным значением является ICOS-положительный статус у половины количества FOXP3-положительных клеток.

6. Способ по любому из пп. 1-5, предусматривающий определение плотности ICOS-положительных клеток и

сравнение указанной плотности с референтным значением, где

плотность, превышающая референтное значение, указывает на прогноз более короткой продолжительности выживаемости, RFS, PFS или TTP или на повышенную вероятность ответа на иммунотерапевтическое средство, необязательно, где:

a) опухоль представляет собой гепатоцеллюлярную карциному и референтным значением является плотность, составляющая 120 ICOS-положительных клеток на 1 мм²,

b) опухоль представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, ассоциированную с инфекцией, вызванной вирусом гепатита В, или гепатоцеллюлярную карциному 2 или более поздней стадии и где референтным значением является плотность, составляющая 100 ICOS-положительных клеток на 1 мм².

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, предусматривающий определение посредством указанных одного или нескольких биомаркеров того, что пациент характеризуется прогнозом более короткой продолжительности выживаемости, RFS, PFS или TTP, необязательно предусматривающий определение отношения числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток и

сравнение указанного отношения с референтным значением, где отношение, превышающее референтное значение, указывает на прогноз более короткой продолжительности выживаемости, RFS, PFS или TTP,

определение того, что указанное отношение превышает референтное значение, и

предоставление прогноза более короткой продолжительности выживаемости, RFS, PFS или TTP.

8. Способ по любому из пп. 1-6, предусматривающий определение посредством указанных одного или нескольких биомаркеров того, что пациент характеризуется прогнозом большей продолжительности выживаемости, RFS, PFS или TTP, необязательно предусматривающий определение отношения числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток и

сравнение указанного отношения с референтным значением, где отношение, превышающее референтное значение, указывает на прогноз более короткой продолжительности выживаемости, RFS, PFS или TTP,

определение того, что указанное отношение является более низким, чем референтное значение, и

предоставление прогноза большей продолжительности выживаемости, RFS, PFS или TTP.

9. Применение биомаркера для прогнозирования развития раковой солидной опухоли у пациента или определения вероятности того, что раковая опухоль у пациента продемонстрирует ответ на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, где биомаркер представлен одним или несколькими из следующих биомаркеров, определяемых в ткани из центральной части опухоли, полученной от пациента:

(i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

(ii) среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

(iii) доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

(iv) плотность ICOS-положительных клеток.

10. Способ определения вероятности того, что раковая опухоль у пациента продемонстрирует ответ на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, по любому из пп. 2-8, предусматривающий идентифицирование пациента как характеризующегося повышенной вероятностью ответа на иммунотерапевтическое средство и необязательно, таким образом, осуществление выбора иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg для лечения указанного пациента, необязательно, дополнительно предусматривающий определение отношения числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

сравнение указанного отношения с референтным значением, где отношение, превышающее референтное значение, указывает на повышенную вероятность ответа на иммунотерапевтическое средство,

определение того, что указанное отношение превышает референтное значение, и, таким образом, идентифицирование пациента как характеризующегося повышенной вероятностью ответа на иммунотерапевтическое средство, а также дополнительно предусматривающий введение иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg указанному пациенту.

11. Применение иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg для лечения раковой солидной опухоли у пациента, где в отношении опухоли было определено, что она предусматривает один или несколько из следующих биомаркеров:

отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток, при этом указанное отношение превышает референтное значение,

среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой, при этом указанное расстояние является меньшим, чем референтное значение,

доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, при этом указанная доля превышает референтное значение, и

плотность ICOS-положительных клеток, при этом указанная плотность превышает референтное значение, необязательно, где:

a) опухоль представляет собой гепатоцеллюлярную карциному и в отношении опухоли было определено, что она предусматривает следующие биомаркеры:

отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток, при этом указанное отношение превышает 0,1,

среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой, при этом указанное расстояние составляет менее 105 мкм,

доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, при этом указанная доля превышает половину от их количества, и

плотность ICOS-положительных клеток, при этом указанная плотность превышает 120 клеток на 1 мм², или

b) опухоль представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, ассоциированную с инфекцией, вызванной вирусом гепатита В, или представляет собой гепатоцеллюлярную карциному 2 или более поздней стадии и где в отношении опухоли было определено, что она предусматривает следующие биомаркеры:

отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток, при этом указанное отношение превышает 0,1,

среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой, при этом указанное расстояние составляет менее 105 мкм,

доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, при этом указанная доля превышает половину от их количества, и

плотность ICOS-положительных клеток, при этом указанная плотность превышает 100 клеток на 1 мм².

12. Способ мониторинга ответа у пациента на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg по отношению к раковой солидной опухоли, предусматривающий

предоставление образца ткани из центральной части опухоли, полученного от пациента, который получил иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg,

определение одного или нескольких из следующих биомаркеров в указанном образце:

(i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

(ii) среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

(iii) доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

(iv) плотность ICOS-положительных клеток,

сравнение значений указанных одного или нескольких биомаркеров в указанном образце со значениями тех же одного или нескольких биомаркеров в образце ткани из центральной части опухоли, полученном от пациента до введения указанного иммунотерапевтического средства, и

определение того, произошло ли изменение в значениях указанных одного или нескольких биомаркеров, и осуществление таким образом оценки того, развивается ли у пациента ответ на иммунотерапевтическое средство, где на наличие ответа указывает одно или несколько из следующих изменений относительно значений для образца, полученного до введения указанного иммунотерапевтического средства:

снижение отношения числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

увеличение среднего расстояния между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

снижение доли FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и/или

снижение плотности ICOS-положительных клеток, необязательно, предусматривающий:

а) измерение снижения отношения числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток по сравнению со значением, имеющимся до терапии, и

назначение пациенту продолжения лечения с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg,

b) измерение увеличения среднего расстояния между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой и

назначение пациенту продолжения лечения с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg,

с) измерение снижения доли FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

назначение пациенту продолжения лечения с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg и/или

d) измерение снижения плотности ICOS-положительных клеток и назначение пациенту продолжения лечения с помощью иммунотерапевтического средства на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg.

13. Применение биомаркера для мониторинга ответа у пациента на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg по отношению к солидной злокачественной опухоли, где биомаркер представлен одним или несколькими из следующих биомаркеров, определяемых в ткани из центральной части опухоли, полученной от пациента:

(i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

(ii) среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

(iii) доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

(iv) плотность ICOS-положительных клеток,

при этом на наличие ответа на иммунотерапевтическое средство указывают одно или несколько из следующих изменений по сравнению с образцом ткани из центральной части опухоли, полученным до введения иммунотерапевтического средства:

снижение отношения числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

увеличение среднего расстояния между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

снижение доли FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

снижение плотности ICOS-положительных клеток.

14. Способ идентифицирования референтного значения для классификации пациентов с раковыми солидными опухолями в соответствии с ожидаемым для них прогнозом или ожидаемым для них ответом на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, предусматривающий

предоставление образцов ткани из центральной части опухоли, полученных от каждого пациента из популяции пациентов с раковыми солидными опухолями идентичного типа, для которых известен исход заболевания или известен ответ на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg,

определение одного или нескольких из следующих биомаркеров в каждом из указанных образцов:

(i) отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток,

(ii) среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой,

(iii) доля FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки, и

(iv) плотность ICOS-положительных клеток,

сопоставление данных для каждого из указанных одного или нескольких биомаркеров с данными относительно исхода заболевания или ответа на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg у каждого пациента и

группирование данных для каждого из указанных одного или нескольких биомаркеров с определением порогового числового значения, которое определяет две группы статистически значимых данных относительно исхода заболевания или ответа на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg,

где указанное пороговое значение представляет собой референтное значение для классификации пациентов с идентичным типом раковых солидных опухолей в соответствии с ожидаемым для них прогнозом или ожидаемым для них ответом на иммунотерапевтическое средство на основе антитела к ICOS и/или антитела к TReg, необязательно, где

a) взятие образцов осуществляют в популяции пациентов с раком печени, почечноклеточным раком, раком головы и шеи, меланомой, немелкоклеточным раком легкого, раком мочевого пузыря, раком яичника, раком шейки матки, раком желудка, раком поджелудочной железы, раком молочной железы (включая трижды негативный рак молочной железы), карциномой, лейомиосаркомой, раком анального канала, плоскоклеточным раком и раком пищевода или

b) взятие образцов осуществляют в популяции пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой.

15. Способ или применение по любому из пп. 2-14, где:

a) иммунотерапевтическое средство представляет собой антитело к ICOS,

b) иммунотерапевтическое средство обеспечивает избирательное истощение количества или подавление активности TReg и/или

с) иммунотерапевтическое средство представляет собой антитело, которое связывает TReg и опосредует клеточные эффекторные функции, необязательно, где антитело представляет собой IgG, содержащий Fc-область, которая опосредует клеточные эффекторные функции, необязательно, где иммунотерапевтическое средство представляет собой антитело, которое связывает ICOS, CD25, CCR8, CTLA-4, GITR или представленный на молекуле MHC эпитоп FOXP3, необязательно, где антитело связывает ICOS.

16. Способ или применение по п. 15, где:

(i) антитело связывает ICOS, где

a) один или несколько биомаркеров предусматривают плотность ICOS-положительных клеток, и/или

b) антитело содержит ICOS-связывающий сайт, содержащий CDR из KY1044, при этом

HCDR1 представлена SEQ ID NO: 1, HCDR2 представлена SEQ ID NO: 2, HCDR3 представлена SEQ ID NO: 3, LCDR1 представлена SEQ ID NO: 8, LCDR2 представлена SEQ ID NO: 9 и LCDR3 представлена SEQ ID NO: 10, и/или

c) антитело содержит аминокислотную последовательность VH-домена, на по меньшей мере 90% идентичную последовательности VH-домена KY1044 под SEQ ID NO: 5, и аминокислотную последовательность VL-домена, на по меньшей мере 90% идентичную последовательности VL-домена KY1044 под SEQ ID NO: 12, необязательно,

где антитело содержит VH-домен KY1044 под SEQ ID NO: 5 и VL-домен KY1044 под SEQ ID NO: 12, или

антитело представляет собой человеческий IgG1κ, содержащий тяжелую цепь из KY1044 под SEQ ID NO: 7 и легкую цепь из KY1044 под SEQ ID NO: 14; или

(ii) антитело связывает CD25, CCR8, CTLA-4, GITR или представленный на молекуле MHC эпитоп FOXP3, необязательно, где один или несколько биомаркеров предусматривают отношение числа дважды положительных по ICOS и FOXP3 клеток, находящихся в пределах определенного радиуса влияния вокруг одноположительных по ICOS клеток, к общему числу одноположительных по ICOS клеток, среднее расстояние между каждой ICOS-положительной FOXP3-отрицательной клеткой и ближайшей к ней дважды положительной по ICOS и FOXP3 клеткой и/или долю FOXP3-положительных клеток, которую составляют ICOS-положительные клетки.