СЛИТЫЙ БЕЛОК, ВКЛЮЧАЮЩИЙ БЕЛОК IL-2 И БЕЛОК CD80, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/55 C07K14/705 C07K19/00 C12P21/02 C12N15/62 A61K38/20 A61K47/68 A61P31/12 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к слитому белку, включающему белок IL-2 и белок CD80, и к его применению. В частности, настоящее изобретение относится к новому слитому белку, обладающему терапевтической и иммуностимулирующей эффективностью для лечения рака.

Предпосылки создания изобретения

Интерлейкин 2 (IL-2), также называемый фактором роста T-клеток (TCGF), представляет собой глобулярный гликопротеин, который играет центральную роль в продукции, выживании и гомеостазе лимфоцитов. IL-2 имеет размер белка 15,5 кДа - 16 кДа и состоит из 133 аминокислот. IL-2 опосредует различные иммунные действия путем связывания с IL-2 рецептором, состоящим из трех отдельных субъединиц.

Кроме того, IL-2 синтезируется преимущественно активированными T-клетками, в частности CD4+ хелперными T-клетками. IL-2 стимулирует пролиферацию и дифференциацию T-клеток и индуцирует продукцию цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) и дифференциацию лимфоцитов периферической крови в цитотоксические клетки и лимфокин-активированные киллерные клетки (LAK клетки).

Кроме того, IL-2 вовлечен в пролиферацию и дифференциацию B-клеток, промотирует синтез иммуноглобулинов B-клетками и стимулирует продукцию, пролиферацию и активацию природных киллерных клеток (NK клеток). Поэтому IL-2 используют в качестве противоракового средства, поскольку он может увеличивать популяции лимфоцитов и усиливать функцию иммунных клеток в живом организме. В настоящее время терапия с использованием IL-2 одобрена и применяется для пациентов с метастатической почечно-клеточной карциномой и злокачественной меланомой.

Однако IL-2 выполняет двойную функцию в иммунных ответах, поскольку является важным не только для опосредования увеличения числа иммунных клеток и их активности, но также для поддержания иммунной толерантности. Кроме того, сообщалось, что IL-2 не может быть оптимальным для ингибирования роста опухоли. Причина заключается в том, что в присутствии IL-2 может происходить индуцированная активацией гибель клеток (AICD) в возникающих цитотоксических Т-лимфоцитах, а иммунные ответы могут ингибироваться IL-2-зависимыми регуляторными Т-клетками (Treg-клетками) (Imai et al., Cancer Sci 98, 416-423, 2007).

Кроме того, тяжелые сердечно-сосудистые, легочные, почечные, печеночные, желудочно-кишечные, нейрональные, кожные, гематологические и системные побочные эффекты возникают у пациентов, которые получали иммунотерапию IL-2. Поэтому различные мутации IL-2 были изучены для улучшения терапевтической эффективности IL-2 и минимизации его побочных эффектов (US 5229109 B). Однако еще предстоит решить много проблем, чтобы использовать IL-2 в фармакологических целях.

Между тем, CD80, также известный как B7-1, является членом семейства мембраносвязанных белков B7, которые участвуют в иммунной регуляции, связываясь со своим лигандом посредством передачи костимуляторных ответов и коингибирующих ответов. CD80 представляет собой трансмембранный белок, экспрессируемый на поверхности Т-клеток, В-клеток, дендритных клеток и моноцитов. Известно, что CD80 связывается с CD28, CTLA4 (CD152) и PD-L1. CD80, CD86, CTLA4 и CD28 вовлечены в костимуляторно-коингибиторную систему. Например, они регулируют активность Т-клеток и вовлечены в их пролиферацию, дифференцировку и выживание.

Например, когда CD80 и CD86 взаимодействуют с CD28, генерируются костимулирующие сигналы для активации Т-клеток. В результате, CD80 связывается с CTLA4 и стимулирует CTLA4 для его активации. Как результат, CD80 ингибирует ответы Т-клеток до активации иммунного ответа, вызываемого взаимодействием CD80/CD28. Эта петля обратной связи обеспечивает тонкую регуляцию иммунных ответов.

Кроме того, известно, что CD80 связывается с PD-L1, другим членом семейства B7, с аффинностью, подобной той, с которой CD28 связывается с PD-L1. PD-L1 известен как один из двух лигандов для белка запрограммированной смерти-1 (PD-1), а PD-L1, как известно, вовлечен в регуляцию Т-клеток. Связывание CD80 с PD-L1 является еще одним механизмом, который может блокировать взаимодействие PD-1/PD-L1, которое может предотвращать ингибирование Т-клеточных ответов в опухолях. В то же время, однако, увеличение уровней CD80 заставляет CD80 связываться с CD28, так что индуцируется CTLA4, тем самым индуцируя или ингибируя Т-клеточные ответы.

Раскрытие изобретения

Техническая задача

Авторами настоящего были осуществлены исследования для разработки IL-2, который является безопасным и эффективным. В результате, авторы настоящего изобретения обнаружили, что новый слитый белок, включающий, в одной молекуле, белок IL-2 и белок CD80, может активировать иммунные клетки и эффективно регулировать Treg клетки, создав, таким образом, настоящее изобретение.

Решение задачи

Для достижения указанной выше цели, в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается слитый белок, включающий белок IL-2 и белок CD80.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается димер слитого белка, полученный путем связывания двух слитых белков друг с другом.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается полинуклеотид, кодирующий слитый белок.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается вектор, включающий полинуклеотид.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается трансформированная клетка, в которую введен вектор.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция для профилактики или лечения рака или инфекционного заболевания, включающая, в качестве активного ингредиента, слитый белок или димер слитого белка.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается применение слитого белка для лечения рака или инфекционного заболевания.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается применение слитого белка для получения лекарственного средства для лечения рака или инфекционного заболевания.

Полезные эффекты изобретения

Слитый белок, включающий белок IL-2 и белок CD80, может не только активировать иммунные клетки благодаря IL-2, но также эффективно регулировать Treg клетки благодаря CD80. Поэтому слитый белок может атаковать раковые клетки эффективным образом, и, таким образом, может эффективно использоваться для лечения рака или инфекционного заболевания.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 схематически иллюстрирует вариант осуществления слитого белка.

Фиг. 2 иллюстрирует механизм, посредством которого слитый белок регулирует два разных типа иммунных клеток; однако, должно быть понятно, что механизм, посредством которого проявляется действие слитого белка, не ограничивается этим.

Фиг. 3 иллюстрирует механизм, посредством которого слитый белок проявляет противораковый эффект.

Фиг. 4 схематически иллюстрирует структуру слитого белка. В данном случае, каждый из GI101 и mGI101 представляет собой вариант осуществления слитого белка по изобретению, и GI101C1, GI101C2 и mGI101C1 являются сравнительными примерами для сравнения с активностью слитого белка.

Фиг. 5 иллюстрирует различные варианты осуществления слитого белка по изобретению. Белки человеческого и мышиного происхождения можно объединить для получения слитого белка. Белок CD80 и белок IL-2 могут быть связаны друг с другом через различные линкеры, отличные от Fc.

Фиг. 6 иллюстрирует результат, полученный путем идентификации полученного слитого белка (GI101) методом SDS-PAGE.

Фиг. 7 иллюстрирует количества слитого белка (GI101) на основании поглощения.

Фиг. 8 иллюстрирует результат, полученный путем анализа полученного слитого белка (GI101) методом эксклюзионной хроматографии (SEC).

Фиг. 9 иллюстрирует результат, полученный путем идентификации полученного слитого белка mGI101 методом SDS-PAGE.

Фиг. 10 иллюстрирует результаты, полученные путем идентификации полученного слитого белка GI101C1 методом SDS-PAGE.

Фиг. 11 иллюстрирует результаты, полученные путем идентификации полученного слитого белка GI101C2 методом SDS-PAGE.

Фиг. 12 иллюстрирует результат, полученный путем идентификации полученного слитого белка mGI101C1 методом SDS-PAGE.

Фиг. 13 иллюстрирует результаты, полученные путем идентификации полученного слитого белка GI102-M45 методом SDS-PAGE.

Фиг. 14 иллюстрирует результаты, полученные путем идентификации полученного слитого белка GI102-M61 методом SDS-PAGE.

Фиг. 15 иллюстрирует результаты, полученные путем идентификации полученного слитого белка GI102-M72 методом SDS-PAGE.

Фиг. 16 иллюстрирует аффинность связывания между hCTLA4 и GI101.

Фиг. 17 иллюстрирует аффинность связывания между hPD-L1 и GI101.

Фиг. 18 иллюстрирует аффинность связывания между hPD-L1 и hPD-1.

Фиг. 19 иллюстрирует аффинность связывания между mCTLA4 и mGI101.

Фиг. 20 иллюстрирует аффинность связывания между mPD-L1 и mGI101.

Фиг. 21 и 22 иллюстрируют результаты, полученные путем идентификации способности к связыванию между GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) и CTLA-4, и между GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) и PD-L1. Было определено, что GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) обладает высокой способностью к связыванию в отношении CTLA-4 и PD-L1.

Фиг. 23 иллюстрирует эффект GI101 на PD-1/PD-L1 связывание. GI101 эффективно ингибировал PD-1/PD-L1 связывание.

Фиг. 24 иллюстрирует результаты, полученные путем определения аффинности связывания между GI101 и IL-2Rα или IL-2Rβ.

Фиг. 25 иллюстрирует результаты, полученные путем определения аффинности связывания между GI101 и IL-2Rα.

Фиг. 26 иллюстрирует результаты, полученные путем определения аффинности связывания между GI101 и IL-2Rβ.

Фиг. 27 иллюстрирует результаты, полученные путем определения аффинности связывания между IL-2Rα и GI102-M45.

Фиг. 28 иллюстрирует результаты, полученные путем определения аффинности связывания между IL-2Rα и GI102-M61.

Фиг. 29 иллюстрирует результаты, полученные путем определения аффинности связывания между IL-2Rα и GI102-M72.

Фиг. 30 иллюстрирует результаты, полученные путем определения аффинности связывания между IL-2Rβ и GI102-M45.

Фиг. 31 иллюстрирует результаты, полученные путем определения аффинности связывания между IL-2Rβ и GI102-M61.

Фиг. 32 иллюстрирует результаты, полученные путем определения аффинности связывания между IL-2Rβ и GI102-M72.

Фиг. 33 и 34 иллюстрируют результаты, полученные путем измерения количества IFN-γ, секретируемого из клеток, когда клетки подвергают обработке GI101, GI101C1, GI101C2 или IL-2 при соответствующих концентрациях и осуществляют инкубацию.

Фиг. 35 и 36 иллюстрируют результаты, полученные путем определения эффектов GI101, GI101C1, GI101C2 и IL-2 (Пролейкин) на пролиферацию CD8+ T-клеток.

Фиг. 37 иллюстрирует результаты, полученные путем определения эффектов GI101 и GI102 на пролиферацию CD8+ T-клеток и CD4+ T-клеток. Фиг. 37A иллюстрирует процент CD8+ T-клеток и CD4+ T-клеток, Фиг. 37B иллюстрирует способность к пролиферации CD8+ T-клеток, и Фиг. 37C иллюстрирует количественное отношение CD4+/FoxP3+ Treg клеток.

Фиг. 38 и 39 иллюстрируют результаты, полученные путем определения эффектов GI101 и GI101w на пролиферацию CD8+ T-клеток и NK клеток.

Фиг. 40 и 41 иллюстрируют результаты, полученные путем определения эффекта GI101 на эффекторные T-клетки.

Фиг. 42 иллюстрирует результаты, полученные путем определения эффектов mGI101 и mGI102-M61 на иммунные клетки мыши.

Фиг. 43 и 44 иллюстрируют результаты, полученные путем определения эффекта GI101 на раковые клетки, сверхэкспрессирующие PD-L1.

Фиг. 45 и 46 иллюстрируют результаты, полученные путем определения опухоль-ингибирующего эффекта GI101 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши.

Фиг. 47 иллюстрирует результаты, полученные путем определения опухоль-ингибирующего эффекта mGI101 у мышей с трансплантированными клетками меланомы, полученными от мыши.

Фиг. 48 иллюстрирует ингибирование опухоли, обеспечиваемое mGI101, у мышей с трансплантированными клетками меланомы, полученными от мыши.

Фиг. 49 иллюстрирует результаты, полученные путем определения опухоль-ингибирующего эффекта mGI101, в зависимости от его дозы, у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши.

Фиг. 50 иллюстрирует результаты, полученные путем анализа выживаемости мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши, которым вводили mGI101.

Фиг. 51 иллюстрирует результаты, полученные путем определения опухоль-ингибирующего эффекта GI101 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши.

Фиг. 52 иллюстрирует результаты, полученные при обработке мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши, hIgG4, анти-PD-1 антителом или GI101, с последующим анализом, методом FACS, CD8+ T-клеток, IFN-γ T-клеток, CD4+ T-клеток и Treg клеток в раковых тканях.

Фиг. 53 графически иллюстрирует результаты, полученные при обработке мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши, hIgG4, анти-PD-1 антителом или GI101, с последующим анализом, методом FACS, CD8+ T-клеток, IFN-γ T-клеток, CD4+ T-клеток и Treg клеток в раковых тканях.

Фиг. 54 иллюстрирует результаты, полученные при обработке мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши, hIgG4, анти-PD-1 антителом или GI101, с последующим анализом, методом FACS, макрофагов в раковых тканях.

Фиг. 55 графически иллюстрирует результаты, полученные при обработке мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши, hIgG4, анти-PD-1 антителом или GI101, с последующим анализом, методом FACS, макрофагов в раковых тканях.

Фиг. 56 иллюстрирует результаты, полученные при обработке мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши, hIgG4, анти-PD-1 антителом или GI101, с последующим анализом, методом FACS, дендритных клеток в раковых тканях.

Фиг. 57 графически иллюстрирует результаты, полученные при обработке мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши, hIgG4, анти-PD-1 антителом или GI101, с последующим анализом, методом FACS, дендритных клеток в раковых тканях.

Фиг. 58 иллюстрирует результаты, полученные путем определения опухоль-ингибирующего эффекта GI101 у мышей с трансплантированными клетками рака легкого, полученными от мыши.

Фиг. 59 графически иллюстрирует результаты, полученные при обработке мышей с трансплантированными клетками рака легкого, полученными от мыши, hIgG4, анти-PD-1 антителом или GI101, с последующим анализом, методом FACS, CD8+ T-клеток, IFN-γ T-клеток, CD4+ T-клеток и Treg клеток в раковых тканях.

Фиг. 60 графически иллюстрирует результаты, полученные при обработке мышей с трансплантированными клетками рака легкого, полученными от мыши, hIgG4, анти-PD-1 антителом или GI101, с последующим анализом, методом FACS, макрофагов в раковых тканях.

Фиг. 61 графически иллюстрирует результаты, полученные при обработке мышей с трансплантированными клетками рака легкого, полученными от мыши, hIgG4, анти-PD-1 антителом или GI101, с последующим анализом, методом FACS, дендритных клеток в раковых тканях.

Фиг. 62 иллюстрирует результаты, полученные путем определения опухоль-ингибирующего эффекта mGI102-M61 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши.

Фиг. 63 иллюстрирует результаты, полученные путем анализа выживаемости мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши, которым вводили mGI102-M61.

Фиг. 64 иллюстрирует результаты, полученные путем определения опухоль-ингибирующего эффекта mGI101 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши.

Фиг. 65 иллюстрирует ингибирование опухоли при применении mGI101 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши.

Фиг. 66 иллюстрирует результаты, полученные при 15-дневных клинических наблюдениях за обезьянами, которым вводили PBS или GI101.

Фиг. 67 и 68 иллюстрируют результаты, полученные путем измерения в дни -1, 1, 8, и 15 массы тела обезьян, которым вводили PBS или GI101.

Фиг. 69 иллюстрирует 15-дневное потребление пищи обезьянами, которым вводили PBS или GI101.

Фиг. 70-72 иллюстрируют результаты, полученные путем анализа крови в дни -1, 1, 8, и 15 у обезьян, которым вводили PBS или GI101.

Фиг. 73-79 иллюстрируют результаты, полученные путем осуществления клинического и химического анализа в дни -1, 1, 8 и 15 у обезьян, которым вводили PBS или GI101.

Фиг. 80 и 81 иллюстрируют результаты, полученные путем анализа цитокинов в дни -1, 1, 8 и 15 у обезьян, которым вводили PBS или GI101.

Фиг. 82-87 иллюстрируют результаты, полученные путем анализа иммунных клеток в дни -1, 1, 8 и 15 у обезьян, которым вводили PBS или GI101.

Фиг. 88 иллюстрирует результаты, полученные путем умерщвления, в день 16, обезьян, которым вводили PBS или GI101, для получения тканей селезенки и патологического анализа тканей селезенки.

Фиг. 89 иллюстрирует слитые белки, в каждом из которых белок CD80 и белок IL-2 связаны с белком-носителем. В частности, Фиг. 89A иллюстрирует слитый белок, в котором белок CD80 и белок IL-2 связаны с N-концом и C-концом белка-носителя, соответственно. Кроме того, Фиг. 89B иллюстрирует слитый белок, в котором белок CD80 и белок IL-2 связаны с C-концом и N-концом белка-носителя, соответственно.

Лучший способ осуществления изобретения

Слитый белок, включающий белок IL-2 и белок CD80

В одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается слитый белок, включающий белок IL-2 и белок CD80.

В контексте настоящей заявки термин "IL-2" или "интерлейкин-2", если не указано иное, относится к любому IL-2 дикого типа, полученному от любого позвоночного животного, включая млекопитающих, например, приматов (таких как человек) и грызунов (таких как мыши и крысы). IL-2 может быть получен из клеток животного, а также включает белок, полученный из рекомбинантных клеток, способных продуцировать IL-2. Кроме того, IL-2 может представлять собой IL-2 дикого типа или его вариант.

В настоящем описании IL-2 или его вариант могут быть представлены общим термином "белок IL-2" или "полипептид IL-2". IL-2, белок IL-2, полипептид IL-2 и вариант IL-2 специфически связываются с, например, рецептором IL-2. Это специфическое связывание можно определить способами, известными специалистам в данной области.

Вариант осуществления IL-2 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36. В данном случае, IL-2 также может быть в зрелой форме. В частности, зрелый IL-2 может не содержать сигнальную последовательность и может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В данном случае, IL-2 можно использовать в формате, охватывающем фрагмент IL-2 дикого типа, в котором часть N-конца или C-конца IL-2 дикого типа усечена.

Кроме того, фрагмент IL-2 может быть в форме, в которой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 последовательных аминокислот отсечены с N-конца белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36. Кроме того, фрагмент IL-2 может быть в форме, в которой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 последовательных аминокислот отсечены с C-конца белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36.

В контексте настоящей заявки термин “вариант IL-2” относится к форме, в которой часть аминокислот в полноразмерном IL-2 или вышеописанном фрагменте IL-2 заменена. То есть, вариант IL-2 может иметь аминокислотную последовательность, отличную от IL-2 дикого типа или его фрагмента. Однако вариант IL-2 может обладать активностью, эквивалентной или подобной активности IL-2 дикого типа. В данном случае, "активность IL-2" может, например, относиться к специфическому связыванию с рецептором IL-2, при этом специфическое связывание можно измерить способами, известными специалистам в данной области.

В частности, вариант IL-2 можно получить путем замены части аминокислот в IL-2 дикого типа. Вариант осуществления IL-2 варианта, полученного путем аминокислотной замены, можно получить путем замены по меньшей мере одной из 38-ой^, 42-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 можно получить путем замены по меньшей мере одной из 38-ой, 42-ой, 45-ой, 61-ой или 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 другой аминокислотой. Кроме того, когда IL-2 присутствует в форме, в которой часть N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 усечена, аминокислота в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, может быть заменена другой аминокислотой. Например, когда IL-2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, его IL-2 вариант можно получить путем замены по меньшей мере одной из 58-ой, 62-ой, 65-ой, 81-ой или 92-ой аминокислоты в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 другой аминокислотой. Эти аминокислотные остатки соответствуют 38-ому, 42-ому, 45-ому, 61-ому и 72-ому аминокислотным остаткам в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, соответственно. В соответствии с вариантом осуществления, одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислот могут быть заменены при условии, что такой вариант IL-2 сохраняет активность IL-2. В соответствии с другим вариантом осуществления, могут быть заменены от одной до пяти аминокислот.

В одном варианте осуществления вариант IL-2 может быть в форме, в которой заменены две аминокислоты. В частности, вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой и 42-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой и 45-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 42-ой и 45-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 42-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 42-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Кроме того, вариант IL-2 может быть в форме, в которой заменены три аминокислоты. В частности, вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой, 42-ой и 45-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой, 42-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой, 42-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой, 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой, 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 42-ой, 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 42-ой, 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Кроме того, вариант IL-2 может быть в форме, в которой заменены четыре аминокислоты. В частности, вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой, 42-ой, 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой, 42-ой, 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 38-ой, 42-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить путем замены 42-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Кроме того, вариант IL-2 может быть в форме, в которой заменены пять аминокислот. В частности, вариант IL-2 можно получить путем замены каждой из 38-ой, 42-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 другой аминокислотой.

В данном случае, "другая аминокислота", введенная путем замены, может представлять собой любую, выбранную из группы, состоящей из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина. Однако, что касается аминокислотных замен для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 38-ая аминокислота не может быть заменена аргинином, 42-ая аминокислота не может быть заменена фенилаланином, 45-ая аминокислота не может быть заменена тирозином, 61-ая аминокислота не может быть заменена глутаминовой кислотой и 72-ая аминокислота не может быть заменена лейцином.

Что касается аминокислотных замен для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 38-ая аминокислота, аргинин, может быть заменена аминокислотой, отличной от аргинина. Предпочтительно, что касается аминокислотных замен для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 38-ая аминокислота, аргинин, может быть заменена аланином (R38A).

Что касается аминокислотных замен для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 42-ая аминокислота, фенилаланин, может быть заменена аминокислотой, отличной от фенилаланина. Предпочтительно, что касается аминокислотных замен для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 42-ая аминокислота, фенилаланин, может быть заменена аланином (F42A).

Что касается аминокислотных замен для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 45-ая аминокислота, тирозин, может быть заменена аминокислотой, отличной от тирозина. Предпочтительно, что касается аминокислотных замен для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 45-ая аминокислота, тирозин, может быть заменена аланином (Y45A).

Что касается аминокислотных замен для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 61-ая аминокислота, глутаминовая кислота, может быть заменена аминокислотой, отличной от глутаминовой кислоты. Предпочтительно, что касается аминокислотных замен для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 61-ая аминокислота, глутаминовая кислота, может быть заменена аргинином (E61R).

Что касается аминокислотных замен для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 72-ая аминокислота, лейцин, может быть заменена аминокислотой, отличной от лейцина. Предпочтительно, что касается аминокислотных замен для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 72-ая аминокислота, лейцин, может быть заменена глицином (L72G).

В частности, вариант IL-2 можно получить с использованием по меньшей мере одной замены, выбранной из группы, состоящей из R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 можно получить с использованием аминокислотных замен в двух, трех, четырех или пяти положениях из положений, выбранных из группы, состоящей из R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может быть в форме, в которой заменены две аминокислоты. В частности, вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A и F42A. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A и Y45A. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A и E61R. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A и L72G. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен F42A и Y45A. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен F42A и E61R. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен F42A и L72G. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может быть в форме, в которой заменены три аминокислоты. В частности, вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A, F42A и Y45A. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A, F42A и E61R. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A, F42A и L72G. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен F42A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен F42A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен F42A, E61R и L72G. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен Y45A, E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может быть в форме, в которой заменены четыре аминокислоты. В частности, вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A, F42A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A, F42A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A, F42A, E61R и L72G. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A, Y45A, E61R и L72G. Кроме того, в одном варианте осуществления вариант IL-2 можно получить с использованием замен F42A, Y45A, E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 можно получить с использованием замен R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G.

Предпочтительно, вариант осуществления варианта IL-2 может содержать любую выбранную из следующих комбинаций замен (a) - (d) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10:

(a) R38A/F42A

(b) R38A/F42A/Y45A

(c) R38A/F42A/E61R

(d) R38A/F42A/L72G

В данном случае, когда IL-2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, аминокислотная замена может присутствовать в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, даже когда IL-2 представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, аминокислотная замена может присутствовать в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 22, 23 или 24.

Кроме того, вариант IL-2 может характеризоваться низкой токсичностью in vivo. В данном случае, низкая токсичность in vivo может быть побочным эффектом, вызванным связыванием IL-2 с альфа-цепью рецептора IL-2 (IL-2Rα). Различные варианты IL-2 были разработаны для уменьшения побочного эффекта, вызываемого связыванием IL-2 с IL-2Rα, и такие варианты IL-2 могут быть такими, которые раскрыты в патенте США № 5229109 и корейском патенте № 1667096. В частности, варианты IL-2, описанные в настоящей заявке, имеют низкую способность к связыванию с альфа-цепью рецептора IL-2 (IL-2Rα) и, таким образом, обладают более низкой токсичностью in vivo, чем IL-2 дикого типа.

В контексте настоящей заявки "CD80", также называемый "B7-1", представляет собой мембранный белок, присутствующий в дендритных клетках, активированных В-клетках и моноцитах. CD80 обеспечивает костимулирующие сигналы, необходимые для активации и выживания Т-клеток. CD80 известен как лиганд для двух разных белков, CD28 и CTLA-4, присутствующих на поверхности Т-клеток. CD80 состоит из 288 аминокислот и может, в частности, иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. Кроме того, в контексте настоящей заявки термин "белок CD80" относится к полноразмерному CD80 или фрагменту CD80.

В контексте настоящей заявки термин "фрагмент CD80" относится к расщепленной форме CD80. Кроме того, фрагмент CD80 может представлять собой внеклеточный домен CD80. Вариант осуществления фрагмента CD80 можно получить элиминированием аминокислот с 1 по 34 с N-конца, которые представляют собой сигнальную последовательность CD80. В частности, вариант осуществления фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из аминокислот с 35 по 288 в SEQ ID NO: 11. Кроме того, вариант осуществления фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из аминокислот с 35 по 242 в SEQ ID NO: 11. Кроме того, вариант осуществления фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из аминокислот с 35 по 232 в SEQ ID NO: 11. Кроме того, вариант осуществления фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из аминокислот с 35 по 139 в SEQ ID NO: 11. Кроме того, вариант осуществления фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из аминокислот с 142 по 242 в SEQ ID NO: 11. В одном варианте осуществления фрагмент CD80 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Кроме того, белок IL-2 и белок CD80 могут быть связаны друг с другом через линкер или носитель. В частности, IL-2 или его вариант и CD80 (B7-1) или его фрагмент могут быть связаны друг с другом через линкер или носитель. В настоящем описании линкер и носитель могут использоваться взаимозаменяемо.

Линкер связывает два белка. Вариант осуществления линкера может включать 1-50 аминокислот, альбумин или его фрагмент, Fc домен иммуноглобулина или т.п. В данном случае, Fc домен иммуноглобулина относится к белку, который содержит константную область 2 тяжелой цепи (CH2) и константную область 3 тяжелой цепи (CH3) иммуноглобулина и не содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепи и константную область 1 легкой цепи (CH1) иммуноглобулина. Иммуноглобулин может представлять собой IgG, IgA, IgE, IgD или IgM, и предпочтительно может представлять собой IgG4. В данном случае, Fc домен иммуноглобулина G4 дикого типа может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Кроме того, Fc домен иммуноглобулина может представлять собой вариант Fc домена, а также Fc домен дикого типа. Кроме того, в контексте настоящей заявки термин "вариант Fc домена" может относиться к форме, которая отличается от Fc домена дикого типа паттерном гликозилирования, имеет высокое гликозилирование по сравнению с Fc доменом дикого типа, или имеет низкое гликозилирование по сравнению с Fc доменом дикого типа или дегликозилированную форму. Кроме того, он включает негликозилированный Fc домен. Fc домен или его вариант может быть адаптирован так, чтобы иметь отрегулированное количество сиаловых кислот, фукозилирования или гликозилирования, посредством условий культивирования или генетических манипуляций с хозяином.

Кроме того, гликозилирование Fc-домена иммуноглобулина можно модифицировать обычными методами, такими как химические методы, ферментативные методы и методы генной инженерии с использованием микроорганизмов. Кроме того, вариант домена Fc может быть в смешанной форме соответствующих областей Fc иммуноглобулинов, IgG, IgA, IgE, IgD и IgM. Кроме того, вариант Fc домена может быть в форме, в которой некоторые аминокислоты Fc домена заменены другими аминокислотами. Вариант осуществления варианта Fc домена может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

Слитый белок может иметь структуру, в которой, с использованием Fc домена в качестве линкера (или носителя), белок CD80 и белок IL-2 или белок IL-2 и белок CD80 связаны с N-концом и C-концом линкера или носителя, соответственно (Фиг. 89). Связывание между N-концом или C-концом Fc домена и CD-80 или IL-2, необязательно, может достигаться при помощи линкерного пептида.

В частности, слитый белок может состоять из следующей структурной формулы (I) или (II):

N'-X-[линкер (1)]_n-Fc домен-[линкер (2)]_m-Y-C' (I)

N'-Y-[линкер (1)]_n-Fc домен-[линкер (2)]_m-X-C' (II)

В представленных структурных формулах (I) и (II):

N′ представляет собой N-конец слитого белка,

C′ представляет собой C-конец слитого белка,

X представляет собой белок CD80,

Y представляет собой белок IL-2,

линкеры (1) и (2) представляют собой пептидные линкеры, и

n и m каждый независимо имеет значение 0 или 1.

Предпочтительно, слитый белок может состоять из структурной формулы (I). Белок IL-2 является таким, как описано выше. Кроме того, белок CD80 является таким, как описано выше. В соответствии с вариантом осуществления, белок IL-2 может представлять собой вариант IL-2, имеющий от одной до пяти аминокислотных замен по сравнению с IL-2 дикого типа. Белок CD80 может представлять собой фрагмент, полученный путем усечения на примерно до 34 последовательных аминокислотных остатков N-конца или C-конца CD80 дикого типа. Альтернативно, CD белок может представлять собой внеклеточный иммуноглобулин-подобный домен, обладающий активностью связывания с рецепторами CTLA-4 и CD28 на поверхности T-клеток.

В частности, слитый белок может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 26, 28 или 30. В соответствии с другим вариантом осуществления, слитый белок включает полипептид, имеющий идентичность последовательности 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, 26, 28 или 30. В данном случае, идентичность означает, например, процент гомологии и может быть определена с использованием программы сравнения гомологии, такой как BlastN программа National Center of Biotechnology Information (NCBI).

Пептидный линкер (1) может быть включен между белком CD80 и Fc доменом. Пептидный линкер (1) может состоять из 5-80 последовательных аминокислот, 20-60 последовательных аминокислот, 25-50 последовательных аминокислот или 30-40 последовательных аминокислот. В одном варианте осуществления пептидный линкер (1) может состоять из 30 аминокислот. Кроме того, пептидный линкер (1) может содержать по меньшей мере один цистеин. В частности, пептидный линкер (1) может содержать один, два или три цистеина. Кроме того, пептидный линкер (1) может происходить из шарнирной области иммуноглобулина. В одном варианте осуществления пептидный линкер (1) может представлять собой пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

Пептидный линкер (2) может состоять из 1-50 последовательных аминокислот, 3-30 последовательных аминокислот или 5-15 последовательных аминокислот. В одном варианте осуществления пептидный линкер (2) может представлять собой (G4S)_n (где n представляет собой целое число, имеющее значение 1-10). В данном случае, в (G4S)_n, n может иметь значение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном варианте осуществления пептидный линкер (2) может представлять собой пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается димер, полученный путем связывания двух слитых белков, каждый из которых включает белок IL-2 и белок CD80. Слитый белок, включающий IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент, описан выше.

В данном случае, связывание между слитыми белками, образующими димер, может достигаться посредством, но не ограничивается этим, дисульфидной связи, образованной цистеинами, присутствующими в линкере. Слитые белки, образующие димер, могут представлять собой одинаковые или отличные друг от друга слитые белки. Предпочтительно, димер может представлять собой гомодимер. Вариант осуществления слитого белка, составляющего димер, может представлять собой белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

Полинуклеотид, кодирующий слитый белок

Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается полинуклеотид, кодирующий слитый белок, включающий белок IL-2 и белок CD80. В частности, полинуклеотид может содержать нуклеотидую последовательность SEQ ID NO: 8, 25, 27 или 29. Слитый белок, включающий белок IL-2 и белок CD80, описан выше. В полинуклеотиде один или несколько нуклеотидов могут быть изменены путем замены, делеции, вставки или их комбинации. Когда нуклеотидную последовательность получают путем химического синтеза, можно использовать синтетические способы, хорошо известные в данной области техники, такие как способы, описанные Engels и Uhlmann (Angew Chem IntEd Eng., 37: 73-127, 1988). Такие способы могут включать способы с использованием триэфира, фосфита, фосфорамидита и H-фосфата, ПЦР и другие аутопраймерные способы, способы синтеза олигонуклеотидов на твердых подложках и т.п.

В соответствии с вариантом осуществления, полипептид может содержать нуклеотидную последовательность, имеющую идентичность с SEQ ID NO: 8, 25, 27 или 29 по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 86%, по меньшей мере около 87%, по меньшей мере около 88%, по меньшей мере около 89%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 91%, по меньшей мере около 92%, по меньшей мере около 93%, по меньшей мере около 94%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или по меньшей мере около 100%.

Полинуклеотид может дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую сигнальную последовательность или лидерную последовательность. В контексте настоящей заявки термин "сигнальная последовательность" относится к сигнальному пептиду, который направляет секрецию белка-мишени. Сигнальный пептид транслируется и затем расщепляется в клетке-хозяине. В частности, сигнальная последовательность представляет собой аминокислотную последовательность, которая инициирует миграцию белка через мембрану эндоплазматического ретикулума (ER). В варианте осуществления сигнальная последовательность может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Сигнальные последовательности хорошо известны в данной области техники, что касается их характеристик. Такие сигнальные последовательности обычно содержат от 16 до 30 аминокислотных остатков и могут содержать больше или меньше аминокислотных остатков, чем указанное количество аминокислотных остатков. Типичный сигнальный пептид состоит из трех областей, т.е. основной N-концевой области, центральной гидрофобной области и более полярной C-концевой области. Центральная гидрофобная область содержит от 4 до 12 гидрофобных остатков, которые вызывают иммобилизацию сигнальной последовательности во время миграции незрелого полипептида через мембранный липидный бислой.

После инициации сигнальные последовательности расщепляются в просвете ER клеточными ферментами, обычно известными как сигнальные пептидазы. В данном случае, сигнальная последовательность может быть секреторной сигнальной последовательностью tPa (активатор тканевого плазминогена), HSV gDs (сигнальная последовательность гликопротеина D вируса простого герпеса) или гормона роста. Предпочтительно можно использовать секреторную сигнальную последовательность, используемую в высших эукариотических клетках, включая млекопитающих и т.п. Кроме того, можно использовать сигнальную последовательность, включенную в IL-2 и/или CD-80 дикого типа, или сигнальную последовательность, которая была замещена кодоном с высокой частотой экспрессии в клетке-хозяине.

Вектор с полинуклеотидом, кодирующим слитый белок

Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается вектор, включающий полинуклеотид.

Вектор может быть введен в клетку-хозяина для рекомбинации и вставки в геном клетки-хозяина. Или вектор понимается как нуклеиновокислотное средство, содержащее полинуклеотидную последовательность, которая является автономно реплицируемой как эписома. Векторы включают линейные нуклеиновые кислоты, плазмиды, фагмиды, космиды, РНК-векторы, вирусные векторы и их аналоги. Примеры вирусного вектора включают, но не ограничиваются этим, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы.

В частности, вектор может включать плазмидную ДНК, фаговую ДНК и т.п.; и коммерчески разработанные плазмиды (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP и т.п.), E. coli-происходящие плазмиды (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 и т.п.), Bacillus subtilis-происходящие плазмиды (pUB110, pTP5 и т.п.), дрожжевые плазмиды (YEp13, YEp24, YCp50 и т.п.), фаговую ДНК (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λ gt10, λ gt11, λ ZAP и т.п.), векторы на основе вирусов животных (ретровирусы, аденовирусы, вирусы коровьей оспы и т.п.), векторы на основе вирусов насекомых (бакуловирусы и т.п.). Поскольку вектор демонстрирует разные уровни экспрессии и модификации белка в зависимости от клетки-хозяина, предпочтительно выбирать и использовать клетку-хозяина, которая наиболее подходят для такой цели.

В контексте настоящей заявки термин "экспрессия гена" или "экспрессия" целевого белка понимается как означающий транскрипцию последовательностей ДНК, трансляцию транскриптов мРНК и секрецию слитых белковых продуктов или их фрагментов. Подходящим вектором экспрессии может быть RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) или его вариант. Векторы экспрессии могут дополнительно содержать человеческий цитомегаловирусный (CMV) промотор для промотирования непрерывной транскрипции гена-мишени в клетках млекопитающих и сигнальную последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста для повышения уровня стабильности РНК после транскрипции.

Трансформированная клетка, экспрессирующая слитый белок

Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается трансформированная клетка, в которую введен вектор.

Клетки-хозяева для трансформированной клетки могут включать, но не ограничиваются этим, прокариотические клетки, эукариотические клетки и клетки млекопитающих, растений, насекомых, грибов или бактерий. В качестве примера прокариотических клеток можно использовать E.coli. Кроме того, в качестве примера эукариотических клеток можно использовать дрожжи. Кроме того, в качестве клеток млекопитающих можно использовать клетки CHO, клетки F2N, клетки CSO, клетки BHK, клетки меланомы Боуса, клетки HeLa, клетки 911, клетки AT1080, клетки A549, клетки HEK 293, клетки HEK293T или т.п. Однако клетки млекопитающих этим не ограничиваются, и могут использоваться любые клетки, которые известны специалистам в данной области техники в качестве клеток-хозяев.

Кроме того, для введения вектора экспрессии в клетку-хозяина можно использовать CaCl₂ осаждение по методу Ханахана, эффективность которого была повышена за счет использования восстановителя, такого как диметилсульфоксид (DMSO), при CaCl₂ осаждении, электропорацию, осаждение фосфатом кальция, слияние протопластов, перемешивание с использованием карбидокремниевого волокна, опосредованную агробактериями трансформацию, трансформацию с использованием ПЭГ, декстрансульфат-, липофектамин- или сухую/ингибирование-опосредованную трансформацию или т.п.

Как описано выше, для оптимизации свойств слитого белка в качестве терапевтического средства или для любой другой цели паттерн гликозилирования слитого белка (например, сиаловые кислоты, фукозилирования, гликозилирования) можно регулировать путем манипуляции, используя методы, известные специалистам в данной области, со связанными с гликозилированием генами, которыми обладают клетки-хозяева.

Способ продукции слитого белка

Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ продукции слитого белка, включающкго белок IL-2 и белок CD80, при этом способ включает культивирование трансформированных клеток. В частности, способ получения может включать i) культивирование трансформированных клеток для получения культуры; и ii) сбор слитого белка из культуры.

Культивирование трансформированных клеток можно осуществить с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. В частности, культивирование можно осуществить периодическим способом или можно осуществить непрерывно периодическим культивированием с подпиткой или повторяющимся периодическим культивированием с подпиткой.

Применение слитого белка или его димера

Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака или инфекционного заболевания, и/или для повышения эффективности лечения рака или инфекционного заболевания, при этом композиция включает, в качестве активного ингредиента, слитый белок, включающий белок IL-2 и белок CD80, или димер слитого белка, где два слитых белка связаны.

Слитый белок, включающий белок IL-2 и белок CD80, или димер слитого белка, где два слитых белка связаны, описаны выше.

Рак может быть выбран из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого миелоидного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнной железы и лимфомы. Кроме того, инфекционное заболевание может представлять собой любое заболевание, выбранное из группы, состоящей из гепатита B, гепатита C, инфекции, вызываемой вирусом папилломы человека (HPV), цитомегаловирусной инфекции, вирусного респираторного заболевания и гриппа.

Предпочтительная доза фармацевтической композиции варьируется в зависимости от состояния и массы тела пациента, тяжести заболевания, формы лекарственного средства, пути и продолжительности введения, и ее может соответствующим образом выбрать специалист в данной области. В фармацевтической композиции для лечения или профилактики рака или инфекционного заболевания по настоящему изобретению активный ингредиент может содержаться в любом количестве (эффективном количестве) в зависимости от применения, лекарственной формы, цели составления смеси и т.п., при условии, что активный ингредиент может проявлять противораковую активность или демонстрировать терапевтический эффект в отношении инфекционного заболевания. Его обычное эффективное количество будет определяться в диапазоне от 0,001% до 20,0% по массе в расчете на общую массу композиции. Термин "эффективное количество" относится к количеству активного ингредиента, способному индуцировать противораковый эффект или эффект лечения инфекционного заболевания. Такое эффективное количество может быть определено экспериментально специалистами в данной области на основании общих знаний.

В контексте настоящей заявки термин "лечение" может использоваться для обозначения как терапевтического, так и профилактического лечения. В данном случае, профилактика может использоваться для обозначения того, что патологическое состояние или заболевание индивидуума облегчается или ослабляется. В варианте осуществления термин "лечение" включает как применение, так и любую форму введения для лечения заболевания у млекопитающего, включая человека. Кроме того, термин включает ингибирование или замедление заболевания или прогрессирования заболевания; и включает значения восстановления или исправления нарушенной или утраченной функции, чтобы частично или полностью облегчить заболевание; стимулирование неэффективных процессов; или облегчение серьезного заболевания.

В контексте настоящей заявки термин "эффективность" относится к способности, которая может быть определена на основании одного или нескольких параметров, например, выживаемости или безрецидивной выживаемости в течение определенного периода времени, такого как один год, пять лет или десять лет. Кроме того, параметр может включать ингибирование размера по меньшей мере одной опухоли у индивидуума.

Фармакокинетические параметры, такие как биодоступность, и лежащие в основе этого параметры, такие как скорость клиренса, также могут влиять на эффективность. Таким образом, "повышенная эффективность" (например, повышение эффективности) может быть обусловлена улучшенными фармакокинетическими параметрами и улучшенной эффективностью, которые могут быть измерены путем сравнения скорости клиренса и роста опухоли у тестируемых животных или людей или путем сравнения таких параметров, как выживаемость, рецидив или безрецидивная выживаемость.

В контексте настоящей заявки термин "терапевтически эффективное количество" или "фармацевтически эффективное количество" относится к количеству соединения или композиции, эффективному для предотвращения или лечения рассматриваемого заболевания, которое является достаточным для лечения заболевания при разумном соотношении польза/риск в применении к медицинскому лечению и не вызывает побочных эффектов. Уровень эффективного количества может быть определен в зависимости от факторов, включающих состояние здоровья пациента, тип и тяжесть заболевания, активность лекарственного средства, чувствительность пациента к лекарственному средству, способ введения, время введения, путь введения и скорость экскреции, продолжительность лечения, композицию или одновременно используемые лекарственные средства, и других факторов, хорошо известных в области медицины. В одном варианте осуществления терапевтически эффективное количество означает количество лекарственного средства, эффективное для лечения рака.

В настоящем изобретении фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой любой носитель при условии, что носитель является нетоксичным веществом, подходящим для доставки пациенту. В качестве носителя могут содержаться дистиллированная вода, спирт, жир, воск и инертное твердое вещество. Фармацевтически приемлемый адъювант (буфер, диспергатор) также может содержаться в фармацевтической композиции.

В частности, путем включения фармацевтически приемлемого носителя в дополнение к активному ингредиенту можно получить фармацевтическую композицию в виде композиции для парентерального введения, в зависимости от способа введения, с использованием обычных способов, известных в данной области. Термин "фармацевтически приемлемый" означает, что носитель не обладает большей токсичностью, чем может перенести субъект, для которого это должно применяться (которому назначено), не ингибируя при этом активность активного ингредиента.

Когда фармацевтическую композицию получают для парентерального введения, ее можно получить в виде препаратов для инъекций, трансдермальных пластырей, назальных ингалянтов или суппозиториев с подходящими носителями, в соответствии со способами, известными в данной области. В случае введения в виде инъекций в качестве подходящего носителя можно использовать стерильную воду, этанол, полиол, такой как глицерин или пропиленгликоль, или их смесь; и предпочтительно можно использовать изотонический раствор, такой как раствор Рингера, фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), содержащий триэтаноламин или стерильную воду для инъекций, и 5% раствор декстрозы или т.п. Формулирование фармацевтических композиций известно в данной области, и, в частности, можно сослаться на Remington's Pharmaceutical Sciences (19-е изд., 1995) и т.п. Этот документ считается частью настоящего описания.

Предпочтительная доза фармацевтической композиции может составлять от 0,01 мг/кг до 10 г/кг или от 0,01 мг/кг до 1 г/кг в день в зависимости от состояния пациента, массы тела, пола, возраста, степени тяжести заболевания у пациента и пути введения. Дозу можно вводить один раз в день или можно разделить на несколько раз в день. Такая доза не должна рассматриваться как ограничивающая объем настоящего изобретения в любом аспекте.

Субъектами, для которых можно применять (которым прописана) фармацевтическую композицию, являются млекопитающие и люди, при этом люди являются особенно предпочтительными. В дополнение к активному ингредиенту, фармацевтическая композиция по настоящей заявке может дополнительно содержать любое соединение или природный экстракт, которые уже были оценены на безопасность и известны как обладающие противораковой активностью или терапевтическим эффектом при инфекционном заболевании, чтобы стимулировать или усилить противораковую активность.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предлагается применение слитого белка, содержащего белок IL-2 и белок CD80, для лечения рака или инфекционного заболевания.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предлагается применение слитого белка, содержащего белок IL-2 и белок CD80, для усиления терапевтического эффекта на рак или инфекционное заболевание.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предлагается применение слитого белка, содержащего белок IL-2 и белок CD80, для изготовления лекарственного средства для лечения рака или инфекционного заболевания.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ лечения рака или инфекционного заболевания и/или способ усиления терапевтического эффекта на рак или инфекционное заболевание, включающий введение субъекту слитого белка, включающего белок IL-2 и белок CD80, или димера слитого белка, где связаны два слитых белка.

Субъектом может быть индивидуум, страдающий раком или инфекционным заболеванием. Кроме того, субъектом может быть млекопитающее, предпочтительно человек. Слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80, или димер слитого белка, где связаны два слитых белка, является таким, как описано выше.

Способ введения, доза и частота введения слитого белка или димера слитого белка могут варьироваться в зависимости от состояния пациента и наличия или отсутствия побочных эффектов, и, таким образом, слитый белок или димер слитого белка можно вводить субъекту различными способами и в различных количествах. Оптимальный способ введения, доза и частота введения могут быть выбраны в соответствующем диапазоне специалистами в данной области. Кроме того, слитый белок или димер слитого белка можно вводить в комбинации с другими лекарственными средствами или физиологически активными веществами, терапевтический эффект которых известен в отношении подлежащего лечению заболевания, или их можно сформулировать в виде комбинированных препаратов с другими лекарственными средствами.

Благодаря активности IL-2 слитый белок в варианте осуществления настоящего изобретения может активировать иммунные клетки, такие как природные киллерные клетки. Таким образом, слитый белок можно эффективно использовать при раке и инфекционных заболеваниях. В частности, было установлено, что по сравнению с диким типом вариант IL-2 с двумя-пятью аминокислотными заменами, в частности, вариант IL-2, который содержит аминокислотные замены в двух, трех, четырех или пяти положениях из положений, выбранных из группы, состоящей из R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G, имеет низкую способность к связыванию с альфа-цепью рецептора IL-2 и, таким образом, демонстрирует улучшенные характеристики в отношении фармакологических побочных эффектов обычного IL-2. Таким образом, такой вариант IL-2, когда он используется отдельно или в форме слитого белка, может снизить частоту возникновения синдрома сосудистой (или капиллярной) проницаемости (VLS), общеизвестной проблемы с IL-2.

Вариант осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно при помощи следующих примеров. Однако следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не ограничивается ими.

I. Получение слитого белка

Пример получения 1. Получение hCD80-Fc-IL-2 варианта (2M): GI101

Для получения слитого белка, включающего фрагмент CD80 человека, Fc домен и вариант IL-2, полинуклеотид синтезировали через сервиз Синтез Генов Invitrogen GeneArt компании ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 8), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирный участок Ig (SEQ ID NO: 3), Fc домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6), имеющий две аминокислотные замены, в указанном порядке от N-конца. Полинуклеотид встраивали в pcDNA3_4 вектор. Кроме того, вектор вводили в CHO клетки (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 9. После введения вектора осуществляли культивирование в течение 7 дней в условиях 37°C, 125 об/мин и CO₂ концентрации 8%. Затем культуру собирали и слитый белок очищали из культуры. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI101".

Очистку осуществляли с использованием хроматографии, содержащей смолу с белком А MabSelect SuRe. Слитый белок связывали на ней в условиях 25 мМ Tris, 25 мМ NaCl, pH 7,4. Затем осуществляли элюирование с использованием 100 мМ NaCl, 100 мМ уксусной кислоты, pH 3. 20% 1 M Tris-HCl при pH 9 помещали в пробирку-сборник и затем собирали слитый белок. Для собранного слитого белка буфер заменяли путем диализа PBS буфером в течение 16 часов.

Затем измеряли поглощение при длине волны 280 нм, с течением времени, с использованием эксклюзионной хроматографии на TSKgel G3000SWXL колонке (TOSOH Bioscience) с получением высококонцентрированного слитого белка. Затем выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (Фиг. 6). Было определено, что слитый белок содержался при концентрации 2,78 мг/мл, как было показано методом NanoDrop (Фиг. 7). Кроме того, результаты, полученные в анализе с использованием эксклюзионной хроматографии, представлены на Фиг. 8.

Пример получения 2. Получение mCD80-Fc-IL-2 варианта (2M): mGI101

Для получения слитого белка, включающего мышиный CD80, Fc домен и вариант IL-2, полинуклеотид синтезировали через сервиз Синтез Генов Invitrogen GeneArt компании ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 14), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), mCD80 (SEQ ID NO: 13), шарнирный участок Ig (SEQ ID NO: 3), Fc домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6) с двумя аминокислотными заменами, в указанном порядке от N-конца. Полинуклеотид встраивали в pcDNA3_4 вектор. Кроме того, вектор вводили в CHO клетки (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 15. После введения вектора осуществляли культивирование в течение 7 дней в условиях 37°C, 125 об/мин и CO₂ концентрации 8%. Затем культуру собирали и слитый белок очищали из культуры. Очищенный слитый белок был обозначен как "mGI101".

Очистку и сбор слитого белка осуществляли таким же способом, как в Примере получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (Фиг. 9). Было обнаружено, что слитый белок содержался при концентрации 1,95 мг/мл, как было определено по поглощению при 280 нм с использованием NanoDrop.

Пример получения 3. Получение hCD80-Fc: GI101C1

Для получения слитого белка, включающего фрагмент CD80 человека и Fc домен, полинуклеотид синтезировали через сервиз Синтез Генов Invitrogen GeneArt компании ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 16), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирный участок Ig (SEQ ID NO: 3) и Fc домен (SEQ ID NO: 4). Полинуклеотид встраивали в pcDNA3_4 вектор. Кроме того, вектор вводили в CHO клетки (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 17. После введения вектора осуществляли культивирование в течение 7 дней в условиях 37°C, 125 об/мин и CO₂ концентрации 8%. Затем культуру собирали и слитый белок очищали из культуры. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI101C1".

Очистку и сбор слитого белка осуществляли таким же способом, как в Примере получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (Фиг. 10). Было обнаружено, что слитый белок содержался при концентрации 3,61 мг/мл, как было определено по поглощению при 280 нм с использованием NanoDrop.

Пример получения 4. Получение Fc-IL-2 варианта (2M): GI101C2

Для получения слитого белка, включающего Fc домен и вариант IL-2, полинуклеотид синтезировали через сервиз Синтез Генов Invitrogen GeneArt компании ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 18), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), Fc домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6) с двумя аминокислотными заменами, в указанном порядке от N-конца. Полинуклеотид встраивали в pcDNA3_4 вектор. Кроме того, вектор вводили в CHO клетки (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 19. После введения вектора осуществляли культивирование в течение 7 дней в условиях 37°C, 125 об/мин и CO₂ концентрации 8%. Затем культуру собирали и слитый белок очищали из культуры. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI101C2".

Очистку и сбор слитого белка осуществляли таким же способом, как в Примере получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (Фиг. 11). Было обнаружено, что слитый белок содержался при концентрации 4,79 мг/мл, как было определено по поглощению при 280 нм с использованием NanoDrop.

Пример получения 5. Получение mCD80-Fc: mGI101C1

Для получения слитого белка, включающего мышиный CD80 и Fc домен, полинуклеотид синтезировали через сервиз Синтез Генов Invitrogen GeneArt компании ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 20), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), mCD80 (SEQ ID NO: 13), шарнирный участок Ig (SEQ ID NO: 3) и Fc домен (SEQ ID NO: 4) в указанном порядке от N-конца. Полинуклеотид встраивали в pcDNA3_4 вектор. Кроме того, вектор вводили в CHO клетки (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 21. После введения вектора осуществляли культивирование в течение 7 дней в условиях 37°C, 125 об/мин и CO₂ концентрации 8%. Затем культуру собирали и слитый белок очищали из культуры. Очищенный слитый белок был обозначен как "mGI101C1".

Очистку и сбор слитого белка осуществляли таким же способом, как в Примере получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (Фиг. 12). Было обнаружено, что слитый белок содержался при концентрации 2,49 мг/мл, как было определено по поглощению при 280 нм с использованием NanoDrop.

Слитые белки, полученные в Примерах получения 1-5, представлены в Таблице 1 ниже.

Таблица 1 Наименование N-конец Линкер C-конец Пример получения 1 (GI101) фрагмент hCD80 Fc домен hIL-2m Пример получения 2 (mGI101) фрагмент mCD80 Fc домен hIL-2m Пример получения 3 (GI101C1) фрагмент CD80 Fc домен - Пример получения 4 (GI101C2) - Fc домен IL-2m Пример получения 5 (mGI101C1) фрагмент mCD80 Fc домен -

Пример получения 6. Получение CD80-Fc-IL-2: GI101w

Для получения слитого белка, включающего фрагмент CD80 человека, Fc домен и человеческий IL-2, полинуклеотид синтезировали через сервиз Синтез Генов Invitrogen GeneArt компании ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 31), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирный участок Ig (SEQ ID NO: 3), Fc домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и зрелый человеческий IL-2 (SEQ ID NO: 10) в указанном порядке от N-конца. Полинуклеотид встраивали в pcDNA3_4 вектор. Кроме того, вектор вводили в CHO клетки (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 32. После введения вектора осуществляли культивирование в течение 7 дней в условиях 37°C, 125 об/мин и CO₂ концентрации 8%. Затем культуру собирали и слитый белок очищали из культуры. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI101w". Очистку и сбор слитого белка осуществляли таким же способом, как в Примере получения 1.

Пример получения 7. Получение hCD80-Fc-IL-2 варианта (3M): GI102-M45

Для получения слитого белка, включающего фрагмент CD80 человека, Fc домен и вариант IL-2 (3M) (R38A, F42A, Y45A) (GI102-M45) с тремя аминокислотными заменами, полинуклеотид синтезировали через сервиз Синтез Генов Invitrogen GeneArt компании ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 25), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирный участок Ig (SEQ ID NO: 3), Fc домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (SEQ ID NO: 22) в указанном порядке от N-конца. Полинуклеотид встраивали в pcDNA3_4 вектор. Кроме того, вектор вводили в CHO клетки (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 26. После введения вектора осуществляли культивирование в течение 7 дней в условиях 37°C, 125 об/мин и CO₂ концентрации 8%. Затем культуру собирали и слитый белок очищали из культуры. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI102-M45".

Очистку и сбор слитого белка осуществляли таким же способом, как в Примере получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (Фиг. 13).

Пример получения 8. Получение hCD80-Fc-IL-2 варианта (3M): GI102-M61

Для получения слитого белка, включающего фрагмент CD80 человека, Fc домен и вариант IL-2 (3M) (R38A, F42A, E61R) (GI102-M61) с тремя аминокислотными заменами, полинуклеотид синтезировали через сервиз Синтез Генов Invitrogen GeneArt компании ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 27), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирный участок Ig (SEQ ID NO: 3), Fc домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (SEQ ID NO: 23) в указанном порядке от N-конца. Полинуклеотид встраивали в pcDNA3_4 вектор. Кроме того, вектор вводили в CHO клетки (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 28. После введения вектора осуществляли культивирование в течение 7 дней в условиях 37°C, 125 об/мин и CO₂ концентрации 8%. Затем культуру собирали и слитый белок очищали из культуры. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI102-M61".

Очистку и сбор слитого белка осуществляли таким же способом, как в Примере получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (Фиг. 14).

Пример получения 9. Получение hCD80-Fc-IL-3M: GI102-M72

Для получения слитого белка, включающего фрагмент CD80 человека, Fc домен и вариант IL-2 (3M) (R38A, F42A, L72G) (GI102-M72) с тремя аминокислотными заменами, полинуклеотид синтезировали через сервиз Синтез Генов Invitrogen GeneArt компании ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 29), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирный участок Ig (SEQ ID NO: 3), Fc домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (SEQ ID NO: 24) в указанном порядке от N-конца. Полинуклеотид встраивали в pcDNA3_4 вектор. Кроме того, вектор вводили в CHO клетки (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 30. После введения вектора осуществляли культивирование в течение 7 дней в условиях 37°C, 125 об/мин и CO₂ концентрации 8%. Затем культуру собирали и слитый белок очищали из культуры. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI102-M72".

Очистку и сбор слитого белка осуществляли таким же способом, как в Примере получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (Фиг. 15).

Пример получения 10. Получение mCD80-Fc-IL-3M: mGI102-M61

Для получения слитого белка, включающего фрагмент CD80 мыши, Fc домен и вариант IL-2 (3M) (R38A, F42A, E61R) (GI102-M61) с тремя аминокислотными заменами, полинуклеотид синтезировали через сервиз Синтез Генов Invitrogen GeneArt компании ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 33), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент mCD80 (SEQ ID NO: 13), шарнирный участок Ig (SEQ ID NO: 3), Fc домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (SEQ ID NO: 23) в указанном порядке от N-конца. Полинуклеотид встраивали в pcDNA3_4 вектор. Кроме того, вектор вводили в CHO клетки (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 34. После введения вектора осуществляли культивирование в течение 7 дней в условиях 37°C, 125 об/мин и CO₂ концентрации 8%. Затем культуру собирали и слитый белок очищали из культуры. Очищенный слитый белок был обозначен как "mGI102-M61".

Очистку и сбор слитого белка осуществляли таким же способом, как в Примере получения 1.

II. Определение аффинности связывания между слитым белком и его лигандом

Для определения аффинности связывания между слитым белком и его лигандом аффинность связывания измеряли с использованием Octet RED 384.

Экспериментальный пример 1. Определение аффинности связывания между hCTLA-4 и GI101

AR2G биосенсор (Amine Reactive 2^nd gen, ForteBio, Cat: 18-5092) предварительно гидратировали с использованием 200 мкл дистиллированной воды в 96-луночном микропланшете (GreinerBio-one, Cat: 655209). Лиганд (CTLA-4, Человеческий CTLA-4/CD152, His tag, Sino Biological, Cat: 11159-H08H), предназначенный для связывания с AR2G биосенсором, разбавляли с использованием 10 мМ ацетатного буфера (pH 5, AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095) до концентрации 5 мкг/мл. При этом, GI101, предназначенный для связывания с лигандом, разбавляли 1X AR2G кинетическим буфером (AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095) до концентрации 1000 нМ, 500 нМ, 250 нМ, 125 нМ или 62,5 нМ. Активационный буфер получали путем смешивания 20 мМ EDC и 10 мМ s-NHS (AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095) в дистиллированной воде. 80 мкл каждого реагента вносили в 384-луночный микропланшет (Greiner Bio-one, Cat: 781209) и устанавливали программу.

Таким образом, аффинность связывания между hCTLA-4 и GI101 измеряли, как проиллюстрировано на Фиг. 16.

Экспериментальный пример 2. Определение аффинности связывания между hPD-L1/GI101 и hPD-L1/PD-1

Ni-NTA (Nickel charged Tris-NTA, Ni-NTA биосенсоры, ForteBio, 18-5101) предварительно гидратировали с использованием 200 мкл 1X Ni-NTA кинетического буфера (10X Kinetics buffer, ForteBio, 18-1042) в 96-луночном микропланшете (GreinerBio-one, Cat: 655209). Лиганд (Человеческий PD-L1/B7-H1 белок, His-tag, Sino biological, Cat: 10084-H08H), предназначенный для связывания с Ni-NTA биосенсорами, разбавляли 1X Ni-NTA кинетическим буфером до концентрации 5 мкг/мл. GI101, предназначенный для связывания с лигандом, разбавляли 1X Ni-NTA кинетическим буфером при 1000 нМ, 500 нМ, 250 нМ, 125 нМ или 62,5 нМ. При этом, человеческий PD-1/PDCD1 (Человеческий PD-1/PDCD1, Fc Tag, Sino Biological, Cat: 10377-H02H), предназначенный для связывания с лигандом, разбавляли 1X Ni-NTA кинетическим буфером до концентрации 2000 нМ, 1,000 нМ, 500 нМ, 250 нМ или 125 нМ. Затем 80 мкл каждого реагента вносили в 384-луночный микропланшет и устанавливали программу.

Таким образом, аффинность связывания между hPD-L1 и GI101 измеряли, как проиллюстрировано на Фиг. 17. При этом, аффинность связывания между hPD-L1 и hPD-1 измеряли, как проиллюстрировано на Фиг. 18.

Экспериментальный пример 3. Определение аффинности связывания между mCTLA-4 и mGI101

Аффинность связывания между mCTLA-4 и mGI101 исследовали таким же способом, как в Экспериментальном примере 1. В этом примере использовали следующее оборудование: Биосенсор: AR2G, Лиганд: mCTLA-4 (рекомбинантная мышиная CTLA-4 Fc химера, R&D Systems, Cat: 434-CT-200), Аналит: mGI101 (500 нМ, 250 нМ, 125 нМ, 62,5 нМ, 31,3 нМ).

Таким образом, аффинность связывания между mCTLA-4 и mGI101 измеряли, как проиллюстрировано на Фиг. 19.

Экспериментальный пример 4. Определение аффинности связывания между mPD-L1 и mGI101

Аффинность связывания между mPD-L1 и mGI101 определяли таким же способом, как в Экспериментальном примере 1. В этом примере использовали следующее оборудование. Биосенсор: AR2G, Лиганд: mPD-L1 (рекомбинантная мышиная B7-H1/PD-L1 Fc химера, R&D Systems, Cat: 434-CT-200), Аналит: mGI101 (500 нМ, 250 нМ, 125 нМ, 62,5 нМ, 31,3 нМ).

Таким образом, аффинность связывания между mPD-L1 и mGI101 измеряли, как проиллюстрировано на Фиг. 20.

Экспериментальный пример 5. Определение способности к связыванию GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) с CTLA-4 и PD-L1

Определение кинетики связывания осуществляли с использованием устройства Octet RED 384 (ForteBio, Pall Life Science) при перемешивании при 30°C и 1000 об/мин. Способность к связыванию с CTLA-4 измеряли с использованием биосенсорного чипа Amine Reactive 2 generation (AR2G), а способность к связыванию с PD-L1 измеряли с использованием биосенсорного чипа Nickel charged Tris-NTA (Ni-NTA). AR2G биосенсорный чип активировали комбинацией 400 мМ EDC и 100 мМ сульфо-NHS. Затем человеческий CTLA-4-His Tag (Sino Biological, Cat: 11159-H08H) разбавляли 10 мМ ацетатного буфера (pH 5) до 5 мкг/мл и загружали на AR2G биосенсорный чип в течение 300 секунд и фиксировали.

Затем связывание CTLA-4 с GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v), GI-101C1 (hCD80-Fc), Ипилимумабом (Bristol-Myers Squibb) и GI-101C2 (Fc-hIL-2v) при различных концентрациях измеряли в течение 300 секунд и его диссоциацию также измеряли в течение 300 секунд. С другой стороны, Человеческий PD-L1-His Tag (Sino biological, Cat: 10084-H08H) разбавляли 1X Ni-NTA кинетическим буфером до концентрации 5 мг/мл и загружали на Ni-NTA биосенсорный чип в течение 600 секунд и фиксировали. Затем связывание PD-L1-GI-101, GI-101C1, hPD-1-Fc (Sino biological, Cat: 10377-H02H) и GI101C2 при различных концентрациях измеряли в течение 300 секунд и его диссоциацию также измеряли в течение 300 секунд. Анализ кинетики связывания осуществляли с использованием программы Octet Data Analysis HT ver. 10, предоставленной Pall Corporation. Результаты проиллюстрированы на Фиг. 21 и 22.

Экспериментальный пример 6. Определение эффекта GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) на связывание PD-1/PD-L1

Эксперимент по блокированию осуществляли с использованием устройства Octet RED 384 (ForteBio, Pall Life Science) при перемешивании при 30°C и 1000 об/мин. Человеческий PD-L1-His Tag (Sino biological, Cat: 10084-H08H) разбавляли кинетическим буфером 1XNi-NTA до концентрации 5 мг/мл и загружали на Ni-NTA биосенсорный чип в течение 600 секунд и фиксировали. Для осуществления эксперимента по блокированию осуществляли возможность связывания hPD-L1, фиксированного на биосенсорном чипе, с GI-101 при различных концентрациях (300 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 12,5 нМ и 0 нМ) в течение 600 секунд и затем снова осуществляли возможность связывания с конкурентным человеческим PD-1 (100 нМ) в течение 600 секунд, чтобы измерить насколько больше hPD-1 может связаться с ним. С другой стороны, осуществляли возможность связывания hPD-L1 с hPD-1 при различных концентрациях (300 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 12,5 нМ и 0 нМ) в течение 600 секунд и затем снова осуществляли возможность связывания с конкурентным GI-101 (100 нМ) в течение 600 секунд, чтобы измерить насколько больше GI-101 может связаться с ним. Эксперимент по блокированию анализировали с использованием меню связывания с эпитопом программы Octet Data Analysis HT ver. 10, предоставленной Pall Corporation. Результаты проиллюстрированы на Фиг. 23.

Экспериментальный пример 7. Определение аффинности связывания между IL-2Rα или IL-2Rβ и GI101

Способность к связыванию для IL-2Rα измеряли с использованием биосенсора AR2G, а способность к связыванию для IL-2Rβ измеряли с использованием биосенсоров Ni-NTA (Nickel charged Tris-NTA, Ni-NTA Biosensors, ForteBio, 18-5101).

Лиганд (IL-2Rα-His Tag, Acro, Cat: ILA-H52H9), предназначенный для связывания с AR2G биосенсором, разбавляли с использованием 10 мМ ацетатного буфера (pH 5, AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095) до концентрации 5 мкг/мл. AR2G биосенсор активировали буфером, полученным путем смешивания 400 мМ EDC и 100 мМ сульфо-NHS, и затем разбавленный лиганд загружали на AR2G биосенсор в течение 300 секунд и фиксировали.

Тем временем, лиганд (IL-2Rβ-His Tag, Acro, Cat: CD2-H5221), предназначенный для связывания с Ni-NTA биосенсором, разбавляли с использованием 1X Ni-NTA кинетического буфера до концентрации 5 мкг/мл. Разбавленный лиганд загружали на Ni-NTA биосенсор в течение 600 секунд и фиксировали.

Затем GI101, GI101w или Пролейкин (Novartis, hIL-2), при различных концентрациях, предназначенные для связывания с лигандом, загружали на него в течение 300 секунд. Затем измеряли их связывание, а также измеряли диссоциацию в течение 300 секунд. Анализ кинетики связывания осуществляли с использованием программы Octet Data Analysis HT ver. 10, предоставленной Pall Corporation. Результаты проиллюстрированы на Фиг. 24-26.

Как результат, было определено, что GI101 обладает низкой способностью к связыванию в отношении альфа цепи рецептора IL-2, IL-2Rα, и высокой способностью к связыванию в отношении IL-2Rβ, по сравнению с GI101w и Пролейкином.

Экспериментальный пример 8. Измерение аффинности связывания между слитым белком и лигандом

Для определения аффинности связывания между слитым белком и его лигандом, аффинность связывания измеряли с использованием Octet RED 384.

Экспериментальный пример 8.1. Определение аффинности связывания между рецептором IL2 альфа и GI101-M45, GI101-M61 или GI101-M72

AR2G биосенсор (Amine Reactive 2nd gen, ForteBio, Cat: 18-5092) предварительно гидратировали с использованием 200 мкл дистиллированной воды (DW) в 96-луночном микропланшете (GreinerBio-one, Cat: 655209). Лиганд (Человеческий IL-2 R альфа белок, His Tag, Acro, ILA-H52H9), предназначенный для связывания с биосенсором, разбавляли с использованием 10 мМ ацетатного буфера (pH 5) (AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095) до концентрации 5 мкг/мл. Аналит (GI101-M45, GI101-M61, GI101-M72), предназначенный для связывания с лигандом, разбавляли 1X AR2G кинетическим буфером (AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095) до 500 нМ, 250 нМ, 125 нМ и 62,5 нМ, соответственно. Активационный буфер получали путем смешивания 20 мМ EDC и 10 мМ s-NHS (AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095) в DW. 80 мкл каждого реагента вносили в 384-луночный микропланшет (Greiner Bio-one, Cat: 781209) и устанавливали программу.

Как результат, аффинность связывания между IL2 альфа рецептором и GI101-M45 проиллюстрирована на Фиг. 27. При этом, аффинность связывания между IL2 альфа рецептором и GI101-M61 проиллюстрирована на Фиг. 28, а аффинность связывания между IL2 альфа рецептором и GI101-M72 проиллюстрирована на Фиг. 29.

Экспериментальный пример 8.2. Определение аффинности связывания GI102-M45, GI102-M61 и GI102-M72 с IL-2Rβ

Биосенсоры Ni-NTA предварительно гидратировали с использованием 200 мкл 1X Ni-NTA кинетического буфера (10X Kinetics buffer, ForteBio, 18-1042) в 96-луночном микропланшете. Лиганд (Человеческий IL-2 R бета белок, His-Tag, Acro, CD2-H5221), предназначенный для связывания с биосенсором, разбавляли 1X Ni-NTA кинетическим буфером до концентрации 2 мкг/мл. GI102-M45, GI102-M61 или GI102-M72, предназначенные для связывания с лигандом, разбавляли 1X Ni-NTA кинетическим буфером до концентрации 500 нМ, 250 нМ, 125 нМ или 62,5 нМ. 80 мкл каждого реагента вносили в 384-луночный микропланшет и устанавливали программу.

Таким образом, аффинность связывания между IL-2Rβ и GI102-M45 измеряли, как проиллюстрировано на Фиг. 30, а аффинность связывания между IL-2Rβ и GI102-M61 измеряли, как проиллюстрировано на Фиг. 31. При этом, аффинность связывания между IL-2Rβ и GI102-M72 измеряли, как проиллюстрировано на Фиг. 32.

III. Определение иммунной активности слитого белка

Экспериментальный пример 9. Определение продукции IFN-γ, вызываемой слитым белком

Экспериментальный пример 9.1. Культивирование CFSE-меченных PBMC

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные у человека, метили карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловым эфиром (CFSE) путем их взаимодействия с 1 мкМ красителя CFSE CellTrace при 37°C в течение 20 минут. CFSE, не связанный с клетками, удаляли путем взаимодействия в течение 5 минут с культуральной средой, имеющей объем в 5 раз больше, чем объем раствора реакции окрашивания, а затем центрифугирования при 1300 об/мин в течение 5 минут. CFB-меченные PBMC ресуспендировали в культуральной среде (RPMI1640 среда, содержащая 10% FBS, 10 мМ HEPES, 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ заменимых аминокислот и 2 мМ L-глутамина) и затем добавляли в 96-луночный планшет при 1×10⁵ клеток на лунку. Осуществляли обработку с использованием 5 мкг/мл PHA (Лактин из Phaseolus Vulgaris, красной фасоли, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, Cat. No. L1668-5MG) и GI101, GI101C1, GI101C2 или IL-2 (Альдеслейкин; человеческий рекомбинантный IL-2, Novartis) и осуществляли инкубацию в 5% CO₂ инкубаторе при 37°C в течение 6 дней.

В данном случае, обработку с использованием GI101, GI101C1, GI101C2 и IL-2 осуществляли при концентрации 1 нМ, 10 нМ или 100 нМ. Клетки анализировали методом FACS и человеческий IFN-γ, присутствующий в культуральной среде, измеряли с использованием набора ELISA (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat. No. 430103).

Экспериментальный пример 9.2. FACS анализ

Клеточные осадки после центрифугирования, полученные путем удаления супернатанта, промывали FACS буфером (3% FBS, 10 мМ EDTA, 1M HEPES, 100 единиц/мл Пенициллина Стрептомицина, 10 мкг/мл, 1 мМ пирувата натрия) и затем подвергали взаимодействию с Fc блокатором (Biolegend, Cat. No. 422302) при 4°C в течение 5 минут. Затем осуществляли обработку с использованием APC анти-CD3 Ab (Biolegend, Cat. No. 300412) и PE анти-CD8a Ab (Biolegend, Cat. No. 300908) и реакции давали осуществиться при 4°С в течение 20 минут. Затем полученное вещество промывали FACS буфером. Клеточные осадки после центрифугирования ресуспендировали в FACS буфере и затем анализировали с использованием BD LSR Fortessa (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) и программы FlowJo.

Экспериментальный пример 9.3. Анализ человеческого IFN-γ методом ELISA

Количество человеческого IFN-γ, секретированного в супернатант каждого образца, в котором осуществляли культивирование клеток, измеряли с использованием набора ELISA, содержащего человеческий IFN-γ (Biolegend, Cat. No. 430103). Вкратце, антитела против человеческого IFN-γ добавляли в ELISA планшет и реакции давали осуществиться в течение ночи при 4°C, чтобы осуществить покрытие планшета этими антителаи. Затем осуществляли блокирование при комнатной температуре в течение 1 часа с использованием раствора PBS, к которому был добавлен 1% BSA. Осуществляли промывку промывочным буфером (0,05% Tween-20 в PBS) и затем стандартный раствор и каждый образец подходящим образом разбавляли и добавляли в планшет. Затем реакции давали осуществиться при комнатной температуре в течение 2 часов.

После завершения реакции планшет промывали и добавляли вторичные антитела (детекторные антитела). Реакции давали осуществиться при комнатной температуре в течение 1 часа. Осуществляли промывку промывочным буфером и затем добавляли раствор Авидин-HRP. Реакции давали осуществиться при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавляли раствор субстрата и индуцировали реакцию проявления цвета в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут. В завершение, добавляли H₂SO₄ для остановки реакции проявления цвета и измеряли поглощение при 450 нм с использованием спектрофотометра для микропланшетов Epoch (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA).

В результате, было обнаружено, что клетки, обработанные GI101, показали значительное повышение секреции IFN-γ по сравнению с клетками, обработанными GI101C1, GI101C2 или IL-2 (Фиг. 33 и 34).

Экспериментальный пример 10. Определение эффекта GI101 на пролиферацию CD8+ T-клеток

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные у человека, метили CFSE путем их взаимодействия с 1 мкМ красителя CFSE CellTrace при 37°C в течение 20 минут. CFSE, не связанный с клетками, удаляли путем взаимодействия в течение 5 минут с культуральной средой, имеющей объем в 5 раз больше, чем объем раствора реакции окрашивания, а затем центрифугирования при 1300 об/мин в течение 5 минут. CFB-меченные PBMC ресуспендировали в культуральной среде (RPMI1640 среда, содержащая 10% FBS, 10 мМ HEPES, 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ заменимых аминокислот и 2 мМ L-глутамина) и затем добавляли в 96-луночный планшет при 1×10⁵ клеток на лунку.

Затем осуществляли обработку с использованием 1 мкг/мл анти-CD3ε антитела (Biolegend Cat. No. L1668-5MG) и GI101, GI101C1, GI101C2 или Пролейкина (Novartis) и осуществляли инкубацию в 5% CO₂ инкубаторе при 37°C в течение 6 дней. Клетки обрабатывали GI101, GI101C1, GI101C2 и IL-2 при концентрации 100 нМ. Инкубированные клетки исследовали на степень их пролиферации путем измерения, используя FACS анализ и APC-TCRαβ и PE-CD8α антитела, доли CD8+ T-клеток, которые не были CFSE-меченными.

В результате, было обнаружено, что GI101 активировал пролиферацию CD8+ T-клеток in vitro в такой же степени, как IL-2 Пролейкин дикого типа (Фиг. 35 и 36).

Экспериментальный пример 11. Определение эффекта GI101 и GI102 на пролиферацию CD8+ T-клеток

Человеческие PBMC закупали у Allcells (Lot # 3014928, USA). Использовали 1M красителя CFSE CellTrace, который подвергали взаимодействию с человеческими PBMC в светоблокирующих условиях при комнатной температуре в течение 20 минут. Клетки метили CFSE путем их взаимодействия с 1 мМ красителя CFSE CellTrace при 37°C в течение 20 минут. CFSE, не связанный с клетками, удаляли путем взаимодействия в течение 5 минут с культуральной средой, имеющей объем в 5 раз больше, чем объем раствора реакции окрашивания, а затем центрифугирования при 1300 об/мин в течение 5 минут. CFB-меченные PBMC ресуспендировали в культуральной среде (RPMI1640 среда, содержащая 10% FBS, 10 мМ HEPES, 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ заменимых аминокислот и 2 мМ L-глутамина) и затем добавляли в 96-луночный планшет при 1×10⁵ клеток на лунку.

Затем CFB-меченные PBMC обрабатывали при помощи 1 мкг/мл анти-CD3ε антитела (OKT3, eBioscience, USA) и GI101, GI101C1, GI101C2 или Пролейкина (Novartis) и осуществляли инкубацию в 5% CO₂ инкубаторе при 37°C в течение 7 дней. Клетки подвергали обработке GI101, GI101C1, GI101C2 и IL-2 при концентрации 10 мМ.

Инкубированные клетки исследовали на степень их пролиферации путем измерения, используя FACS анализ и антитело против человеческого CD4-PE (Biolegend, USA), антитело против человеческого CD8-PE/Cy7 (Biolegend, USA) и антитело против человеческого FoxP3-APC (Biolegend, USA), доли CD8+ T-клеток, которые не были CFSE-меченными.

Как результат, группы обработки GI101, GI102_M61, GI101C2 и Пролейкином показали значительное повышение доли CD8+ T-клеток по сравнению с контрольной группой (без стимула), группой обработки только анти-CD3 антителом и группой обработки GI101C1. При этом, по сравнению с группой отрицательного контроля (без стимула) и группой обработки только анти-CD3, группы обработки GI101, GI101C2 и Пролейкином показали значительное повышение пролиферации CD4+/FoxP3+ Treg клеток, тогда как группы обработки GI102 и GI101C1 не показали значительного повышения пролиферации CD4+/FoxP3+ Treg клеток (Фиг. 37).

Экспериментальный пример 12. Определение эффекта GI101 или GI101w на пролиферацию CD8+ T-клеток и NK клеток

7-недельных C57BL/6 мышей закупали у Orient Bio (Busan, Korea) и разделяли на 3 группы, по 3 мыши в каждой группе, и мышам интраперитонеально вводили PBS, GI101 или GI101w. GI101 и GI101w соответственно получали при 40,5 мкг в 200 мкл PBS и вводили путем интраперитонеальной инъекции. Через пять дней после инъекции у мышей в каждой группе удаляли селезенки. Из них выделяли клетки и общее количество клеток измеряли с использованием гематоцитометра. Спленоциты исследовали на долю содержащихся в них CD8+ T-клеток и NK клеток методом FACS с использованием окрашивания APC-CD3ε антителом (Biolegend; 145-2C11), PE-NK1.1 антителом (Biolegend; PK136) и Pacific blue-CD8α антителом (BD; 53-6,7). Таким образом, рассчитывали количества CD8+ T-клеток и NK клеток, присутствующих в селезенке.

В результате, было определено, что GI101 активировал пролиферацию CD8+ T-клеток и NK клеток in vivo по сравнению с GI101w (Фиг. 38 и 39).

Экспериментальный пример 13. Определение эффекта GI101 на функцию T-клеток

Эксперимент осуществляли с использованием набора для биоанализа блокады CTLA-4 (Promega Cat. No. JA4005). Вкратце, эксперимент осуществляли следующим образом. CTLA-4 эффекторные клетки, которые хранили в жидком азоте, оттаивали на водяной бане при постоянной температуре 37°C в течение 3 минут и 0,8 мл CTLA-4 эффекторных клеток тщательно смешивали с 3,2 мл предварительно нагретого аналитического буфера (90% RPMI+10% FBS). Затем смесь добавляли в 96-луночный белый культуральный планшет (SPL, Cat. No. 30196) при 25 мкл на лунку. Затем добавляли 25 мкл GI101 при различных концентрациях. Для отрицательного контроля добавляли 25 мкл аналитического буфера. Затем белый культуральный планшет закрывали крышкой и выдерживали при комнатной температуре до подготовки aAPC/Raji клеток.

aAPC/Raji клетки, которые хранили в жидком азоте, оттаивали на водяной бане при постоянной температуре 37°C в течение 3 минут и 0,8 мл aAPC/Raji клеток тщательно смешивали с 3,2 мл предварительно нагретого аналитического буфера. Затем 25 мкл смеси добавляли в планшет и реакции давали осуществиться в 5% CO₂ инкубаторе при 37°C в течение 16 часов. После завершения реакции полученное вещество оставляли выстаиваться при комнатной температуре в течение 15 минут и затем к нему добавляли Bio-Glo реагент, соблюдая осторожность, чтобы избежать образования пузырьков. Bio-Glo реагент также добавляли в три из самых крайних лунок и эти лунки использовали в качестве холостых лунок для коррекции фонового сигнала. Реакции давали осуществиться при комнатной температуре в течение 10 минут и затем измеряли люминесценцию с использованием Cytation 3 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). Конечный анализ данных осуществляли путем расчета интенсивности сигнала люминесценции (RLU) (GI101-фон)/RLU (отсутствие обработки-фон).

В результате, было обнаружено, что GI101, связанный с CTLA-4, экспрессировался на эффекторных T-клетках и активировал функцию T-клеток, а не ингибировал ее (Фиг. 40 и 41).

Экспериментальный пример 14. Определение эффекта mGI101 и mGI102 на иммунные клетки

7-недельных C57BL/6 мышей закупали у Orient Bio (Korea) и разделяли на 3 группы, по 3 мыши в каждой группе, и мышам вводили внутривенно PBS, 3 мг/кг, 6 мг/кг или 12 мг/кг GI101 или 3 мг/кг, 6 мг/кг или 12 мг/кг mGI102 (mGI102-M61). В дни 1, 3, 5, 7 и 14 после инъекции селезенки мышей в каждой группе удаляли. Затем в тканях селезенки рассчитывали количества эффекторных CD8+ T-клеток, NK клеток и Treg клеток методом FACS с использованием соответствующих антител и соответственно рассчитывали количества эффекторных CD8+ T-клеток и NK клеток по отношению к количеству Treg клеток. Ниже представлена информация, касающаяся антител, используемых в каждом клеточном анализе:

Эффекторные CD8+ T-клетки: PB антитело против CD3ε мышиного (Biolegend, # 155612; KT3.1.1), FITC антитело против мышиного CD8α (BD, # 553031, 53-6.7), PE/Cy7 антитело против мышиного CD44 (Biolegend, # 103030; IM7), APC антитело против мышиного CD122 (Biolegend, # 123214; TM-β1)

NK клетки: PB антитело против мышиного CD3ε (Biolegend, # 155612; KT3,1,1), PE антитело против мышиного NK-1.1 (Biolegend, # 108708; PK136)

Treg клетки: FITC антитело против мышиного CD3 (Biolegend, # 100204; 17A2), PB антитело против мышиного CD4 (Biolegend, # 100531; RM4-5), PE антитело против мышиного CD25 (Biolegend, # 102008; PC61), APC антитело против мышиного Foxp3 (Invitrogen, # FJK-16s, 17-5773-82).

Как результат, группа, которой вводили mGI101 или mGI102 (mGI102-M61), показала значительное повышение количества CD8+ T-клеток и NK клеток во временных точках от 3 дней до 14 дней после введения, по сравнению с группой введения PBS. При этом было обнаружено, что группа, которой вводили mGI102, показала значительное повышение соотношений активированные CD8+ T-клетки/Treg клетки и NK клетки/Treg клетки во временных точках от 3 дней до 14 дней после введения по сравнению с группой введения PBS (Фиг. 42).

IV. Определение противоракового эффекта слитого белка

Экспериментальный пример 15. Определение эффекта GI101 на раковые клетки, сверхэкспрессирующие PD-L1

NCl-H292 раковую клеточную линию, сверхэкспрессирующую PD-L1, культивировали в течение 3 часов в культуральной среде, содержащей 10 мкг/мл Митомицина C (Sigma), и затем Митомицин C удаляли путем промывки культуральной средой. Затем 5×10⁴ клеток Митомицин C-обработанной NCl-H292 раковой клеточной линии инкубировали с 1×10⁵ PBMC клеток человека в 96-луночном планшете. Осуществляли обработку с использованием 5 мкг/мл PHA (Sigma) для T-клеточной активности. Кроме того, GI101C1 и GI101 при концентрации 50 нМ подвергали взаимодействию с IgG1-Fc (Biolegend) или абатецептом (= Orencia; Bristol-Myers Squibb) при концентрации 50 нМ в течение 30 минут при 4°C и затем полученное вещество использовали для обработки NCl-H292 раковых клеток. Через 3 дня собирали супернатант инкубированных клеток и количество IFN-γ определяли с использованием набора ELISA (Biolegend).

В качестве группы положительного контроля использовали человеческие PBMC, стимулированные PHA, в отсутствие Митомицин C-обработанной NCl-H292 раковой клеточной линии; а в качестве группы отрицательного контроля использовали человеческие PBMC, стимулированные PHA, в присутствии Митомицин C-обработанной NCl-H292 раковой клеточной линии. Экспериментальный способ с использованием набора IFN-γ ELISA осуществляли таким же способом, как в Экспериментальном примере 9.3.

Как результат, GI101 эффективно активировал иммунный ответ, который был ингибирован раковой клеточной линией сверхэкспрессирующей PD-L1. При этом, было обнаружено, что GI101 ингибировал передачу сигналов CTLA-4, экспрессируемого на эффекторных T-клетках (Фиг. 43 и 44).

Экспериментальный пример 16. Определение противоракового эффекта GI101 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши

5×10⁶ клеток/0,05 мл мышиной CT-26 раковой клеточной линии смешивали с 0,05 мл матригелевой матрицы без фенолового красного (BD) и осуществляли трансплантацию 0,1 мл смеси путем подкожного введения в правую дорсальную область 6-недельным самкам мышей BALB/c (Orient Bio). Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 80 мм³-120 мм³, затем субъектам внутривенно вводили 0,1 мл GI101. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения, а группе отрицательного контроля вводили PBS. Размер опухоли измеряли ежедневно для определения противоракового эффекта.

В результате, было обнаружено, что мыши с трансплантированной раковой клеточной линией CT-26, получавшие GI101, показали существенное уменьшение размера опухоли по сравнению с группой отрицательного контроля (Фиг. 45 и 46).

Экспериментальный пример 17. Определение противоракового эффекта mGI101 у мышей с трансплантированными клетками меланомы, полученными от мыши

C57BL/6 мышей (самки, 7-недельные), приобретенных у Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение 7 дней. Затем 5×10⁶ клеток раковой клеточной линии B16F10 (ATCC, USA) смешивали с 0,05 мл матригелевой матрицы без фенолового красного (BD) и аллотрансплантацию смеси осуществляли путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область мыши. Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 50 мм³-120 мм³, и затем отобранных мышей делили на равные группы на основании размера опухоли и массы тела, по 10 мышей в каждой группе.

Затем, используя разовый шприц (31G, 1 мл), hIgG4 при дозе 4 мг/кг вводили группе отрицательного контроля, а анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг вводили группе положительного контроля. Для экспериментальных групп осуществляли внутривенное введение mGI101 при дозе 1 мг/кг или 4 мг/кг. Кроме того, группы, которым вводили mGI101 при дозе 4 мг/кг и анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг, также были установлены как экспериментальные группы. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения. Размер опухоли измеряли ежедневно.

Как результат, исходный объем опухоли во всех группах был 90 мм³, и стандартная ошибка (S.E.) для каждой группы составляла 5 мм³-6 мм³. В группе отрицательного контроля изменение объема опухоли наблюдали в течение экспериментального периода, когда объем опухоли увеличивался от 90 мм³ до 1434 мм³ вплоть до 15 дней после введения.

В группе, которой вводили mGI101 при дозе 1 мг/кг, наблюдали, что объем опухоли увеличивался от 90 мм³ до 885 мм³ в течение экспериментального периода, который является таким же периодом, как для группы отрицательного контроля, и статистически значимое ингибирование роста опухоли наблюдали в некоторых измеряемых временных точках (p-значение: 0,5 в день 11, p-значение < 0,01 в день 7, p-значение <0,001 в день 3). В группе, которой вводили mGI101 при дозе 4 мг/кг, наблюдали, что объем опухоли увеличивался от 90 мм³ до 748 мм³ в течение экспериментального периода, который является таким же периодом, как для группы отрицательного контроля, и статистически значимое ингибирование роста опухоли наблюдали в некоторых измеряемых временных точках (p-значение: 0,5 в день 9, p-значение <0,01 в дни 7 и 11).

Кроме того, анализировали процент ингибирования роста опухоли с использованием в качестве сравнения группу, которой вводили mIgG при дозе 4 мг/кг, и сравнивая эту группу с каждой из других групп. В группе, которой вводили mGI101 при дозе 1 мг/кг, наблюдали ингибирование роста 36,5% по сравнению с группой отрицательного контроля, и не наблюдали никакой статистически значимой разницы (p-значение: 0,5). В группе, которой вводили mGI101 при дозе 4 мг/кг, наблюдали статистически значимый (p-значение: 0,5) процент ингибирования роста опухоли по сравнению с группой отрицательного контроля. Всего осуществляли два введения один раз каждые три дня после первого введения. Размер опухоли измеряли ежедневно.

Таким образом, было обнаружено, что в испытании на эффективность ингибирования роста опухоли B16F10, аллотрансплантата меланомы, введенного мышам C57BL/6, mGI101 показал эффект ингибирования роста опухоли дозозависимым образом (Фиг. 47 и 48).

Экспериментальный пример 18. Определение противоракового эффекта mGI101 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши

BALB/c мышей (самки, 7-недельные), приобретенных у Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение 7 дней. Затем 5×10⁶ клеток CT-26 раковой клеточной линии (ATCC, USA) смешивали с 0,05 мл матригелевой матрицы без фенолового красного (BD) и осуществляли аллотрансплантацию смеси путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область мыши. Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 28 мм³, и затем отобранных мышей делили на равные группы на основании размера опухоли и массы тела, по 10 мышей в каждой группе. Затем, используя разовый шприц (31G, 1 мл), hIgG4 при дозе 6 мг/кг вводили группе отрицательного контроля. Для экспериментальных групп осуществляли внутривенное введение mGI101 при дозе 3 мг/кг, 6 мг/кг или 12 мг/кг. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения. Размер опухоли измеряли ежедневно.

В результате, было обнаружено, что экспериментальная группа, которой вводили mGI101 при дозе 6 мг/кг или 12 мг/кг, показала существенное ингибирование роста опухоли в некоторых измеряемых временных точках и в конце испытания по сравнению с группой отрицательного контроля (Фиг. 49). При этом, в результате измерения выживаемости, было обнаружено, что экспериментальная группа, которой вводили mGI101 при дозе 6 мг/кг, показала существенное улучшение в некоторых измеряемых временных точках и в конце испытания по сравнению с группой отрицательного контроля (Фиг. 50).

Экспериментальный пример 19. Определение противоракового эффекта GI101 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши

Экспериментальный пример 19.1. Определение опухоль-ингибирующего эффекта

BALB/c мышей (самки, 7-недельные), приобретенных у Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение 7 дней. Затем 5×10⁶ клеток раковой клеточной линии CT-26 (ATCC, USA) суспендировали в 0,1 мл PBS и осуществляли аллотрансплантацию суспензии путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область мыши. Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 50 мм³-200 мм³, и затем отобранных мышей делили на равные группы на основании размера опухоли и массы тела, по 10 мышей в каждой группе. Затем, используя разовый шприц (31G, 1 мл), никакого лекарственного средства не вводили группе отрицательного контроля, а группам положительного контроля вводили внутривенно анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг, или анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг, и анти-CTLA-4 антитело при дозе 5 мг/кг. Для экспериментальных групп осуществляли внутривенное введение GI101 при дозе 0,1 мг/кг или 1 мг/кг. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения. Размер опухоли измеряли ежедневно.

Как результат, все группы мышей с трансплантированной раковой клеточной линией CT-26, которым вводили анти-PD-1 антитело, анти-PD-1 антитело и анти-CTLA-4 антитело или GI101 при дозе 0,1 мг/кг или 1 мг/кг, показали существенное ингибирование роста опухоли по сравнению с группой отрицательного контроля. В частности, экспериментальная группа, которой вводили GI101 при дозе 0,1 мг/кг, показала существенный опухоль-ингибирующий эффект по сравнению с группой обработки анти-PD-1 антителом (* p < 0,05) (Фиг. 51).

Экспериментальный пример 19.2. Анализ иммунных клеток в раковой ткани

Мышей каждой группы в Экспериментальном примере 19.1 умерщвляли, когда объем опухоли достигал в среднем 200 мм³, и раковые ткани собирали. Затем раковые ткани разделяли до уровня отдельных клеток для анализа иммунных клеток в них и затем осуществляли FACS анализ на иммунные клетки в раковых тканях с использованием следующих антител: антитело против мышиного CD3 (Biolegend, Cat. No. 100320), антитело против мышиного CD4 (Biolegend, Cat. No. 100526), антитело против мышиного CD8 (Biolegend, Cat. No. 100750), антитело против мышиного FoxP3 (eBioscience, Cat. No. 12-5773-82), антитело против мышиного CD25 (Biolegend, Cat. No. 102049), антитело против мышиного CD44 (eBioscience, Cat. No. 61-0441-82), антитело против мышиного PD-1 (Biolegend, Cat. No. 135218), антитело против мышиного IFN-гамма (Biolegend, Cat. No. 505832), антитело против мышиного CD49b (Biolegend, Cat. No. 108906), антитело против мышиного H2 (Invitrogen, Cat. No. A15443), антитело против мышиного CD11c (Biolegend, Cat. No. 117343), антитело против мышиного CD80 (eBioscience, Cat. No. 47-4801-82), антитело против мышиного CD86 (Biolegend, Cat. No. 104729), антитело против мышиного F4/80 (eBioscience, Cat. No. 47-4801-82) и антитело против мышиного CD206 (eBioscience, Cat. No. 17-2061-80).

Как результат, экспериментальная группа, которой вводили GI101 при дозе 0,1 мг/кг, показала значительное увеличение CD8+ T-клеток по сравнению с группой положительного контроля, которой вводили только анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг (* p < 0,05, Фиг. 52 и 53). При этом все экспериментальные группы, которым вводили GI101, показали существенно повышенный уровень экспрессии IFN-γ в T-клетках по сравнению с группой отрицательного контроля (* p < 0,05, Фиг. 52 и 53). При этом, экспериментальная группа, которой вводили GI101 при дозе 0,1 мг/кг, показала увеличение количества M1 макрофагов по сравнению с группой отрицательного контроля и группой положительного контроля, которой вводили только анти-PD-1 антитело (Фиг. 54 и 55). При этом, все экспериментальные группы, которым вводили GI101, показали повышенный уровень экспрессии CD86 в макрофагах и дендритных клетках (* p < 0,05, Фиг. 54-57).

Экспериментальный пример 20. Определение противоракового эффекта GI101 у мышей с трансплантированными клетками рака легкого, полученными от мыши

Экспериментальный пример 20.1. Определение опухоль-ингибирующего эффекта

C57BL/6 мышей (самки, 7-недельные), приобретенных у Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение 7 дней. Затем 5×10⁶ клеток раковой клеточной линии LLC2 (ATCC, USA) суспендировали в 0,1 мл PBS и осуществляли аллотрансплантацию суспензии путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область мыши. Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 50 мм³-200 мм³, и затем отобранных мышей делили на равные группы на основании размера опухоли и массы тела, по 10 мышей в каждой группе. Затем, используя разовый шприц (31G, 1 мл), никакого лекарственного средства не вводили группе отрицательного контроля, а группам положительного контроля вводили внутривенно анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг или анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг и анти-CTLA-4 антитело при дозе 5 мг/кг. Для экспериментальных групп осуществляли внутривенное введение GI101 при дозе 0,1 мг/кг или 1 мг/кг. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения. Размер опухоли измеряли ежедневно.

Как результат, все экспериментальные группы показали существенный опухоль-ингибирующий эффект по сравнению с группой отрицательного контроля (* p < 0,05) (Фиг. 58).

Экспериментальный пример 20.2. Анализ иммунных клеток в раковой ткани

Мышей каждой группы в Экспериментальном примере 20.1 умерщвляли, когда объем опухоли достигал в среднем 200 мм³, и раковые ткани собирали. Затем осуществляли FACS анализ таким же способом, как Экспериментальном примере 19.2 для анализа иммунных клеток в раковых тканях.

Как результат, экспериментальная группа, которой вводили GI101 при дозе 0,1 мг/кг, показала значительное увеличение CD8+ T-клеток по сравнению с группой положительного контроля, которой вводили только анти-PD-1 антитело (* p < 0,05, Фиг. 59). При этом, все экспериментальные группы, которым вводили GI101, показали существенно повышенный уровень экспрессии IFN-γ по сравнению с группой отрицательного контроля (* p <0,05, Фиг. 59). При этом, все экспериментальные группы, которым вводили GI101, показали повышенный уровень экспрессии CD86 в макрофагах и дендритных клетках (* p < 0,05, Фиг. 59 to 61).

Экспериментальный пример 21. Определение противоракового эффекта mGI102-M61 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши

BALB/c мышей (самки, 7-недельные), приобретенных у Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение 7 дней. Затем 5×10⁶ клеток раковой клеточной линии CT-26 (ATCC, USA) смешивали с 0,05 мл матригелевой матрицы без фенолового красного (BD) и осуществляли аллотрансплантацию смеси путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область мыши. Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 28 мм³, и затем отобранных мышей делили на равные группы на основании размера опухоли и массы тела, по 10 мышей в каждой группе. Затем, используя разовый шприц (31G, 1 мл), группе отрицательного контроля вводили hIgG4 при дозе 6 мг/кг. Для экспериментальных групп осуществляли внутривенное введение mGI102-M61 при дозе 3 мг/кг, 6 мг/кг или 12 мг/кг. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения. Размер опухоли измеряли ежедневно.

В результате было определено, что экспериментальная группа, которой вводили mGI102-M61 при дозе 12 мг/кг, показала существенное ингибирование роста опухоли в некоторых измеряемых временных точках и в конце испытания, по сравнению с группой отрицательного контроля (Фиг. 62). При этом, в результате измерения выживаемости, было определено, что экспериментальная группа, которой вводили mGI102-M61 при дозе 12 мг/кг, показала существенное улучшение в некоторых измеряемых временных точках и в конце испытания, по сравнению с группой отрицательного контроля (Фиг. 63).

Экспериментальный пример 22. Определение противоракового эффекта mGI101 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши

BALB/c мышей (самки, 7-недельные), приобретенных у Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение 7 дней. Затем 5×10⁶ клеток CT-26 раковой клеточной линии (ATCC, USA) смешивали с 0,05 мл матригелевой матрицы без фенолового красного (BD) и осуществляли аллотрансплантацию смеси путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область мыши. Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 200 мм³-250 мм³, и затем отобранных мышей делили на равные группы на основании размера опухоли и массы тела, по 10 мышей в каждой группе.

Затем, используя разовый шприц (31G, 1 мл), группе отрицательного контроля вводили hIgG4 при дозе 4 мг/кг. Для экспериментальных групп осуществляли внутривенное введение mGI101 при дозе 1 мг/кг, 4 мг/кг или 6 мг/кг. Кроме того, группы, которым вводили mCD80 при 4,9 мг/кг или Fc-IL-2v (GI101C2) при 2,8 мг/кг, были установлены как контрольные группы. При этом, группа, которой одновременно вводили mCD80 при 4,9 мг/кг и Fc-IL-2v (GI101C2) при 2,8 мг/кг, была установлена как контрольная группа.

При измерении объема опухоли было определено, что группа, которой вводили mGI101 при дозе 6 мг/кг, показала существенное ингибирование в некоторых измеряемых временных точках и в конце испытания, по сравнению с отрицательным контролем. Отличный процент ингибирования роста опухоли наблюдали по сравнению с группой, которой вводили комбинацию mCD80 и Fc-IL-2v (GI101C2) (Фиг. 64 и 65).

В заключение, в испытании эффективности ингибирования роста опухоли на BALB/c мышах с аллотрансплантатом CT-26, BALB/c мышиной клеточной линии колоректального рака, было продемонстрировано, что испытываемое вещество mGI101 обладало опухоль-ингибирующей эффективностью в условиях этого испытания по сравнению с отдельными препаратами mCD80 и IL-2v; и было определено, что mGI101 проявлял отличную противораковую эффективность по сравнению с группой, которой вводили комбинацию mCD80 и IL-2v (Фиг. 64 и 65). В частности, группа, которой вводили mGI101 при дозе 6 мг/кг, показала существенное ингибирование размера опухоли по сравнению с группой отрицательного контроля и группой, которой вводили комбинацию mCD80 и Fc-IL2v (GI101C2).

V. Оценка токсичности слитого белка

Экспериментальный пример 23. Оценка GI101 на токсичность с использованием обезьян

Экспериментальный пример 23.1. Содержание обезьян и введение лекарственного средства

В настоящем эксперименте использовали девять самцов Филиппинских обезьян (обезьяны Cynomolgus) возраста 2-3 лет. Эксперимент осуществляли в соответствии с "Act on Welfare and Management of Animals" в Японии и "Guidance for Animal Care and Use" компании Ina Research Inc. Протокол эксперимента был рассмотрен Комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных (IACUC) Ina Research Inc и затем одобрен AAALAC International (Accredited Unit No. 001107).

Эксперимент осуществляли, начиная за один день до введения лекарственного средства и вплоть до 15 дней после введения лекарственного средства. Каждую обезьяну наблюдали вокруг клетки и дополнительно проверяли стул. Массу тела измеряли с использованием цифровой шкалы (LDS-150H, Shimadzu Corporation) за день до введения лекарственного средства и в дни 1, 8 и 15 после введения лекарственного средства. При этом, оставшееся количество пищи измеряли со дня перед введением лекарственного средства вплоть до умерщвления обезьян.

В этом эксперименте одноразовый шприц (24G) заполняли лекарственным средством GI101 и всего осуществляли два введения внутривенным путем, при этом каждое введение осуществляли при скорости 0,17 мл/сек. GI101 вводили два раза, с недельным интервалом, при дозе 5 мг/кг/день или 10 мг/кг/день. Контрольной группе вводили PBS (pH 7,4) таким же способом.

Экспериментальный пример 23.2. Клиническое обследование, определение изменений массы тела и потребления пищи

Клиническое обследование и измерение изменений массы тела и потребления пищи осуществляли с дня перед введением лекарственного средства вплоть до дней 1, 8 и 15 после введения лекарственного средства. Как результат, GI101 не вызывал никакой токсичности (Фиг. 66-69).

Экспериментальный пример 23.3. Анализ крови

Кровь собирали у обезьян в Экспериментальном примере 23.1 за день до введения лекарственного средства и в дни 1, 8 и 15 после введения лекарственного средства. Кровь собирали через бедренную вену с использованием одноразового шприца (22G). Собранную кровь подвергали анализу с использованием Automated Hematology System XN-2000 (Sysmex Corporation) и Automated Blood Coagulation Analyzer CA-510 (Sysmex Corporation) на показатели, перечисленные в Таблице 2 ниже.

Таблица 2 Параметр Аббр. Единица Способ Оборудование Полный анализ крови Количество эритроцитов RBC 10⁶/мкл DC детекция методом проточной цитометрии с обжимным потоком XN-2000 Концентрация гемоглобина HGB г/дл SLS-гемоглобин XN-2000 Гематокрит HCT % Определение высоты импульса RBC XN-2000 Средний корпускулярный объем MCV фл HCT/RBC (×10⁴/мкл) × 1000 XN-2000 Средний эритроцитарный гемоглобин MCH пг HGB/RBC (×10⁴/мкл) × 1000 XN-2000 Средняя концентрация эритроцитарного гемоглобина MCHC г/дл HGB/HCT × 100 XN-2000 Процент ретикулоцитов RET %
RET # %
10⁹/л Проточная цитометрия XN-2000 Количество тромбоцитов PLT 10³/мкл Проточная цитометрия XN-2000 Количество лейкоцитов WBC 10³/мкл Проточная цитометрия XN-2000 Дифференцированный подсчет лейкоцитов ^a)Процент Diff WBC %
Diff WBC # %
10³/мкл Проточная цитометрия XN-2000 Тесты на коагуляцию Протромбиновое время PT сек. Анализ светорассеяния CA-510 Активированное частичное тромбопластиновое время APTT сек. Анализ светорассеяния CA-510 ^a) Нейтрофилы (NEUT), лимфоциты (LYMPH), моноциты (MONO), эозинофилы (EO) и базофилы (BASO)

Как результат, группа, которой вводили GI101 при дозе 5 мг/кг/день или 10 мг/кг/день, показала увеличение количества ретикулоцитов, лейкоцитов и лимфоцитов в день 15 (Фиг. 70-72).

Экспериментальный пример 23.4. Клинический и химический анализ

Кровь у обезьян в Экспериментальном примере 23.1 собирали за день до введения лекарственного средства и в дни 1, 8 и 15 после введения лекарственного средства. Кровь собирали таким же способом, как в Экспериментальном примере 23.3. Собранную кровь подвергали клиническому и химическому анализу с использованием клинического анализатора модели 7180 (Hitachi High-Technologies Corporation) на показатели, перечисленные в Таблице 3 ниже.

Таблица 3 Параметр Аббр. Единица Способ Аспарагинаминотрансфераза AST ед/л Метод в соответствии с JSCC Аланинаминотрансфераза ALT ед/л Метод в соответствии с JSCC Щелочная фосфатаза ALP ед/л Метод в соответствии с JSCC Лактатдегидрогеназа LD ед/л Метод в соответствии с JSCC Креатинкиназа CK ед/л Метод в соответствии с JSCC Глюкоза GLU мг/дл Ферментативный (Gluc-DH) Общий билирубин BIL мг/дл Ферментативный (BOD) Азот мочевины UN мг/дл Ферментативный (уреаза-LEDH) Креатинин CRE мг/дл Ферментативный Общий холестерин CHO мг/дл Ферментативный (холестерин оксидаза) Триглицериды TG мг/дл Ферментативный (GK-GPO с элиминацией свободного глицерина) Фосфолипиды PL мг/дл Ферментативный (холиноксидаза) Неорганический фосфор IP мг/дл Ферментативный (мальтозофосфорилаза) Кальций CA мг/дл OCPC Натрий NA мэкв/л Ион-селективный электрод Калий K мэкв/л Ион-селективный электрод Хлорид CL мэкв/л Ион-селективный электрод Общий белок TP г/дл Биуретовый Альбумин ALB г/дл BCG Отношение альбумин-глобулин A/G - Рассчитанное JSCC: Japan Society of Clinical Chemistry

Как результат, в клиническом и химическом анализе не было обнаружено никакой токсичности, вызываемой GI101 (Фиг. 73-79).

Экспериментальный пример 21.5. Анализ цитокинов

Кровь у обезьян в Экспериментальном примере 23.1 собирали за день до введения лекарственного средства и в дни 1, 8 и 15 после введения лекарственного средства. Кровь собирали таким же способом, как в Экспериментальном примере 23.3. С использованием устройства Bio-Plex 200 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) и набора для анализа Non-Human Primate Cytokine Magnetic Bead Panel (EMD Millipore) собранную кровь анализировали на TNF-α, IFN-γ IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 и IL-12. Как результат, не было обнаружено никакой токсичности, вызываемой GI101, что касается анализа цитокинов (Фиг. 80 и 81).

Экспериментальный пример 23.6. Анализ иммунных клеток

Кровь у обезьян в Экспериментальном примере собирали 23.1 за день до введения лекарственного средства и в дни 1, 8 и 15 после введения лекарственного средства. Кровь собирали таким же способом, как в Экспериментальном примере 23.3. С использованием проточного цитометра (LSRFortessa X-20, Becton, Dickinson and Company) собранную кровь анализировали на следующие показатели:

1) Ki67+CD4: CD45+/CD3+/CD4+/Ki67+

2) Ki67+CD8: CD45+/CD3+/CD8+/Ki67+

3) Ki67+Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/Ki67+

4) Ki67+ICOS+Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/Ki67+/CD278+

5) ICOS+Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/CD278+

6) Ki67+NK клетки: CD45+/CD16+ и CD56+/Ki67+.

Как результат, в анализе иммунных клеток все группы, которым вводили GI101, показали в день 15 увеличение количества T-клеток, CD4+ T-клеток, CD8+ T-клеток, регуляторных T-клеток, NK клеток и Ki67+ T-клеток, Ki67+ CD4+ T-клеток, Ki67+ CD8+ T-клеток, Ki67+ регуляторных T-клеток, Ki67+ ICOS+ регуляторных T-клеток, Ki67+ NK клеток, ICOS+ регуляторных T-клеток.

В частности, в лимфоцитах, доля T-клеток, CD4+ T-клеток, регуляторных T-клеток увеличивалась, а доля NK клеток уменьшалась, при этом доля CD8+ T-клеток не изменялась. Доля регуляторных T-клеток увеличивалась в день 3 и уменьшалась в дни 8 и 15. Однако при этом доля была больше, чем в контрольной группе.

Кроме того, что касается доли иммунных клеток, которые представляют собой Ki67+, в соответствующих иммунных клетках доля Ki67+ T-клеток, Ki67+ CD4+ T-клеток, Ki67+ CD8+ T-клеток, Ki67+ регуляторных T-клеток, Ki67+ ICOS+ регуляторных T-клеток, Ki67+ NK клеток и ICOS+ регуляторных T-клеток увеличивалась.

При этом, доля Ki67+ T-клеток, Ki67+ CD8+ T-клеток и Ki67+ NK клеток увеличивалась в дни 3, 8 и 15; доля Ki67+ CD4+ T-клеток и Ki67+ регуляторных T-клеток увеличивалась в дни 3 и 8; и доля Ki67+ ICOS+ регуляторных T-клеток и ICOS+ регуляторных T-клеток увеличивалась только в день 8 (Фиг. 82-87).

Экспериментальный пример 23.7. Патологический анализ

В день 16 обезьян в Экспериментальном примере 23.1 умерщвляли и все органы и ткани фиксировали с использованием 10% формалина. Однако яички фиксировали с использованием раствора формалина-сахарозы-уксусной кислоты (FSA), а глаза и зрительный нерв фиксировали с использованием 1% формальдегида-2,5% глутаральдегида в фосфатном буфере. Гематоксилиновое-эозиновое окрашивание осуществляли на органах и тканях, перечисленных в Таблице 4 ниже, и наблюдения осуществляли под оптическим микроскопом.

Таблица 4 Орган/ткань Фиксация Масса органа Получение образца HE-окрашивание Примечание Сердце O O - Левая вентрикулярная папиллярная мышца, правая вентрикулярная стенка и области, включающие коронарную артерию и клапан аорты Аорта (грудная) O - Грудинная кость O - Декальцифицированный Костный мозг грудинной кости - Бедренные кости O (R&L) - Дистальный суставной хрящ и диафиз; декальцифицированные Костный мозг бедренной кости O (R) - Декальцифицированный Тимус O O O Селезенка O O O Поднижнечелюстные лимфатические узлы O - O Мезентеральные лимфатические узлы O - O Трахея O - Декальцифицированная Бронхи O (R&L) O (R&L отдельно) - Левая передняя и правая задняя доли легкие Язык O - Поднижнечелюстные железы O (R&L) O (R&L вместе) Околоушные железы O (R&L) - Пищевод O - Желудок O - Кардия, тело и привратник Двенадцатиперстная кишка O - Тощая кишка O - Подвздошная кишка O - Пейеровы бляшки Слепая кишка O - Толстая кишка O - Прямая кишка O - Печень O O
(с желчным пузырем, из которого удалена желчь) O Левая латеральная доля и правая медиальная доля, включая желчный пузырь Желчный пузырь O Поджелудочная железа O O - Почки O (R&L) O (R&L отдельно) O (R&L) Мочевой пузырь O - Гипофиз O O Щитовидная железа O (R&L) O (R&L отдельно) Паращитовидная железа Надпочечники O (R&L) O (R&L отдельно) Яички O (R&L) O (R&L отдельно) Придатки яичка O (R&L) O (R&L отдельно) Предстательная железа O O Семенные пузырьки O O - Головной мозг O O - Большой мозг (лобная, теменная (включая базальные ганглии и гиппокамп) и затылочная доли); мозжечок; мост; и продолговатый мозг Спинной мозг (торакальный) O - Седалищный нерв O (L) - Глаза O (R&L) - Оптические нервы O (R&L) - Слезные железы O (R&L) - Скелетная мышца (двуглавая мышца бедра) O (L) - Кожа (торакальная) O - Место инъекции (хвостовая вена) O - Декальцифицированная Кожа грудной или средней области бедра с ID No. O - - O: осуществляли -: не осуществляли;
R&L: осуществляли с обоими правым и левым органами/тканями;
L: осуществляли либо с правым, либо с левым (обычно с левым) органом/тканью;
R: осуществляли либо с правым, либо с левым (обычно с правым) органом/тканью.

Как результат, группа, получавшая GI101 при дозе 5 мг/кг/день или 10 мг/кг/день, показала увеличение массы селезенки (Фиг. 88). Никаких существенных изменений в других тканях не наблюдали. В заключение, в группах, которым вводили GI101, наблюдались некоторые изменения, но никакой токсичности не наблюдалось.

VI. Экспериментальный пример 24 для определения противоракового эффекта GI102. Определение противоракового эффекта GI102-M45

Экспериментальный пример 24.1. Определение противоракового эффекта GI102-M45 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши

5×10⁶ клетки/0,05 мл мышиной CT-26 раковой клеточной линии смешивали с 0,05 мл матригелевой матрицы без фенолового красного (BD) и трансплантацию смеси осуществляли путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область 6-недельным самкам BALB/c мышей (Orient Bio). Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 80 мм³-120 мм³. Затем субъектам внутривенно вводили 0,1 мл GI102-M45. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения, а для отрицательного контроля вводили PBS. Размер опухоли измеряли ежедневно для определения противоракового эффекта. Активность GI102-M45 определяли таким же способом, как в Экспериментальном примере 16.

Экспериментальный пример 24.2. Определение противоракового эффекта GI102-M45 у мышей с трансплантированными клетками легкого, полученными от мыши

C57BL/6 мышей (самки, 7-недельные), приобретенных у Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение 7 дней. Затем 5×10⁶ клеток LLC2 раковой клеточной линии (ATCC, USA) суспендировали в 0,1 мл PBS и аллотрансплантацию суспензии осуществляли путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область мыши. Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 50 мм³-200 мм³, и затем отобранных мышей делили на равные группы на основании размера опухоли и массы тела, по 10 мышей в каждой группе. Затем, используя разовый шприц (31G, 1 мл), группе отрицательного контроля не вводили никакого лекарственного средства, а группам положительного контроля вводили внутривенно анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг или анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг и анти-CTLA-4 антитело при дозе 5 мг/кг. Для экспериментальных групп осуществляли внутривенное введение GI102-M45 при дозе 0,1 мг/кг или 1 мг/кг. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения. Размер опухоли измеряли ежедневно. Активность GI102-M45 определяли таким же способом, как в Экспериментальном примере 20.1.

Экспериментальный пример 25. Определение противоракового эффекта GI102-M61

Экспериментальный пример 25.1. Определение противоракового эффекта GI102-M61 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши

5×10⁶ клеток/0,05 мл мышиной CT-26 раковой клеточной линии смешивали с 0,05 мл матригелевой матрицы без фенолового красного (BD) и трансплантацию смеси осуществляли путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область 6-недельным самкам BALB/c мышей (Orient Bio). Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 80 мм³-120 мм³. Затем субъектам внутривенно вводили 0,1 мл GI102-M61. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения, а группе отрицательного контроля вводили PBS. Размер опухоли измеряли ежедневно для определения противоракового эффекта. Активность GI102-M61 определяли таким же способом, как в Экспериментальном примере 16.

Экспериментальный пример 25.2. Определение противоопухолевого эффекта GI102-M61 у мышей с трансплантированными клетками рака легкого, полученными от мыши

C57BL/6 мышей (самки, 7-недельные), приобретенных у Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение 7 дней. Затем 5×10⁶ клеток LLC2 раковой клеточной линии (ATCC, USA) суспендировали в 0,1 мл PBS и аллотрансплантацию суспензии осуществляли путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область мыши. Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 50 мм³-200 мм³, и затем отобранных мышей делили на равные группы на основании размера опухоли и массы тела, по 10 мышей в каждой группе. Затем, используя разовый шприц (31G, 1 мл), группе отрицательного контроля не вводили никакого лекарственного средства, а группам положительного контроля вводили внутривенно анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг или анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг и анти-CTLA-4 антитело при дозе 5 мг/кг. Для экспериментальных групп осуществляли внутривенное введение GI102-M61 при дозе 0,1 мг/кг или 1 мг/кг. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения. Размер опухоли измеряли ежедневно. Активность GI102-M61 определяли таким же способом, как в Экспериментальном примере 20.1.

Экспериментальный пример 26. Определение противоракового эффекта GI102-M72

Экспериментальный пример 26.1. Определение противоопухолевого эффекта GI102-M72 у мышей с трансплантированными клетками колоректального рака, полученными от мыши

5×10⁶ клеток/0,05 мл мышиной CT-26 раковой клеточной линии смешивали с 0,05 мл матригелевой матрицы без фенолового красного (BD) и трансплантацию смеси осуществляли путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область 6-недельным самкам BALB/c мышей (Orient Bio). Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 80 мм³-120 мм³. Затем субъектам внутривенно вводили 0,1 мл GI102-M72. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения, а группе отрицательного контроля вводили PBS. Размер опухоли измеряли ежедневно для определения противоракового эффекта. Активность GI102-M72 определяли таким же способом, как в Экспериментальном примере 16.

Экспериментальный пример 26.2. Определение противоракового эффекта GI102-M72 у мышей с трансплантированными клетками рака легкого, полученными от мыши

C57BL/6 мышей (самки, 7-недельные), приобретенных у Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение 7 дней. Затем 5×10⁶ клеток LLC2 раковой клеточной линии (ATCC, USA) суспендировали в 0,1 мл PBS и аллотрансплантацию суспензии осуществляли путем подкожного введения при 0,1 мл в правую дорсальную область мыши. Через определенный период времени после трансплантации раковых клеток измеряли объем опухоли и отбирали субъектов, у которых достигался объем около 50 мм³-200 мм³, и затем отобранных мышей делили на равные группы на основании размера опухоли и массы тела, по 10 мышей в каждой группе. Затем, используя разовый шприц (31G, 1 мл), группе отрицательного контроля не вводили никакого лекарственного средства, а группам положительного контроля вводили внутривенно анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг или анти-PD-1 антитело при дозе 5 мг/кг и анти-CTLA-4 антитело при дозе 5 мг/кг. Для экспериментальных групп осуществляли внутривенное введение GI102-M72 при дозе 0,1 мг/кг или 1 мг/кг. Всего осуществляли три введения один раз каждые три дня после первого введения. Размер опухоли измеряли ежедневно. Активность GI102-M72 определяли таким же способом, как в Экспериментальном примере 20.1.

--->

<110> GI Innovation, Inc.

<120> СЛИТЫЙ БЕЛОК, ВКЛЮЧАЮЩИЙ БЕЛОК IL-2 И БЕЛОК CD80,

И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> PCB907063GEE

<150> KR 10-2018-0110698

<151> 2018-09-17

<150> KR 10-2019-0001867

<151> 2019-01-07

<150> US 62/832013

<151> 2019-04-10

<150> KR 10-2019-0053436

<151> 2019-05-08

<160> 37

<170> KopatentIn 3.0

<210> 1

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнальный пептид (TPA)

<400> 1

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala

20 25

<210> 2

<211> 208

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hB7-1:35-242

<400> 2

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

<210> 3

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шарнир

<400> 3

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

20 25 30

<210> 4

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> fc иммуноглобулина

<400> 4

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

210 215

<210> 5

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 6

<211> 133

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hIL-2M

<400> 6

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 7

<211> 617

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок, включающий варианты IL-2 и фрагменты CD80

<400> 7

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Ile His Val Thr Lys Glu

20 25 30

Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu

35 40 45

Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val

50 55 60

Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn

65 70 75 80

Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala

85 90 95

Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr

100 105 110

Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser

115 120 125

Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro

130 135 140

Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser

180 185 190

Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr

210 215 220

Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

260 265 270

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg

275 280 285

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

290 295 300

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

305 310 315 320

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

340 345 350

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

355 360 365

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

370 375 380

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

385 390 395 400

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

420 425 430

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

435 440 445

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala

450 455 460

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

485 490 495

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

500 505 510

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe

515 520 525

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

530 535 540

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

545 550 555 560

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

565 570 575

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

580 585 590

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

595 600 605

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

610 615

<210> 8

<211> 1857

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101)

<400> 8

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560

accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620

cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac ctgatga 1857

<210> 9

<211> 592

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI101)

<400> 9

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 10

<211> 133

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hIL-2

<400> 10

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 11

<211> 288

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD80

<400> 11

Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr

1 5 10 15

Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys

20 25 30

Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu

35 40 45

Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile

50 55 60

Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp

65 70 75 80

Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr

85 90 95

Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly

100 105 110

Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg

115 120 125

Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr

130 135 140

Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile

145 150 155 160

Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu

165 170 175

Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp

180 185 190

Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met

195 200 205

Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg

210 215 220

Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro

225 230 235 240

Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly

245 250 255

Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg

260 265 270

Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val

275 280 285

<210> 12

<211> 215

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный Fc

<400> 12

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

1 5 10 15

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

20 25 30

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

35 40 45

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

50 55 60

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

65 70 75 80

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

85 90 95

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

100 105 110

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

115 120 125

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

130 135 140

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

145 150 155 160

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

165 170 175

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

180 185 190

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

195 200 205

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 13

<211> 306

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mCD80

<400> 13

Met Ala Cys Asn Cys Gln Leu Met Gln Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe

1 5 10 15

Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ser

20 25 30

Gln Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp

35 40 45

Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser

50 55 60

Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val

65 70 75 80

Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu

85 90 95

Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser

100 105 110

Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr

115 120 125

Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Ala Asp

130 135 140

Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr

145 150 155 160

Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe

165 170 175

Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr Thr Ile

180 185 190

Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln Leu Asp

195 200 205

Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly

210 215 220

Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro Glu Asp

225 230 235 240

Pro Pro Asp Ser Lys Asn Thr Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly Phe Gly

245 250 255

Ala Val Ile Thr Val Val Val Ile Val Val Ile Ile Lys Cys Phe Cys

260 265 270

Lys His Arg Ser Cys Phe Arg Arg Asn Glu Ala Ser Arg Glu Thr Asn

275 280 285

Asn Ser Leu Thr Phe Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ala Glu Gln Thr Val

290 295 300

Phe Leu

305

<210> 14

<211> 1848

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (mGI101)

<400> 14

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg 120

ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa 180

cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag 240

aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc 300

gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag 360

cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag 420

tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct 480

aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt 540

tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc 600

agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt 660

acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc 720

ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca 780

tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 840

gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 900

gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 960

accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1020

ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1080

ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 1140

tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1200

gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 1260

aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 1320

cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 1380

cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggaggtggt 1440

ggcggttctg cccctacctc cagctctacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg 1500

ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc 1560

gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacttgcag 1620

tgcctggaag aggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac 1680

ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa 1740

ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt 1800

ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagagc atcatctcca cactgacc 1848

<210> 15

<211> 616

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (mGI101)

<400> 15

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys

20 25 30

Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His

35 40 45

Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val

50 55 60

Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys

65 70 75 80

Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly

85 90 95

Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys

100 105 110

Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser

115 120 125

Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro

130 135 140

Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser

180 185 190

Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys

210 215 220

Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln

485 490 495

Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn

500 505 510

Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr

515 520 525

Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu

530 535 540

Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn

545 550 555 560

Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val

565 570 575

Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp

580 585 590

Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys

595 600 605

Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

610 615

<210> 16

<211> 1437

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101C1)

<400> 16

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctaggtgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc cctgggc 1437

<210> 17

<211> 454

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI101C1)

<400> 17

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

450

<210> 18

<211> 1176

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101C2)

<400> 18

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccatctc acgccgctga gtctaagtac ggccctcctt gtcctccatg tcctgctcca 120

gaagctgctg gcggaccctc tgtgttcctg tttcctccaa agcctaagga ccagctcatg 180

atctctcgga cccctgaagt gacctgcgtg gtggtggatg tgtctcaaga ggaccctgag 240

gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga 300

gaggaacagt tcaactccac ctacagagtg gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat 360

tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag gtgtccaaca agggcctgcc ttccagcatc 420

gaaaagacca tctccaaggc taagggccag cctagggaac cccaggttta caccctgcct 480

ccaagccaag aggaaatgac caagaaccag gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc 540

tacccttccg acattgccgt ggaatgggag tccaatggcc agcctgagaa caactacaag 600

accacacctc ctgtgctgga ctccgacggc tccttctttc tgtactctcg cctgaccgtg 660

gacaagtcta ggtggcaaga gggcaacgtg ttctcctgct ctgtgctgca cgaggccctg 720

cacaatcact acacccagaa gtccctgtct ctgtctcttg gcggaggcgg aggatctgct 780

cctacctcca gctccaccaa gaaaacccag ctccagttgg agcatctgct gctggacctc 840

cagatgatcc tgaatggcat caacaattac aagaacccca agctgaccgc catgctgacc 900

gctaagttct acatgcccaa gaaggccacc gagctgaagc acctccagtg cctggaagag 960

gaactgaagc ccctggaaga agtgctgaat ctggcccagt ccaagaactt ccacctgagg 1020

cctagggacc tgatctccaa catcaacgtg atcgtgctgg aactgaaagg ctccgagaca 1080

accttcatgt gcgagtacgc cgacgagaca gccaccatcg tggaatttct gaaccggtgg 1140

atcaccttct gccagtccat catctccaca ctgacc 1176

<210> 19

<211> 367

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI101C2)

<400> 19

Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

100 105 110

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 20

<211> 1434

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (mGI101C1)

<400> 20

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg 120

ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa 180

cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag 240

aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc 300

gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag 360

cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag 420

tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct 480

aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt 540

tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc 600

agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt 660

acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc 720

ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca 780

tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 840

gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 900

gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 960

accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1020

ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1080

ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 1140

tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1200

gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 1260

aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 1320

cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 1380

cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtccct gggc 1434

<210> 21

<211> 478

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (mGI101C1)

<400> 21

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys

20 25 30

Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His

35 40 45

Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val

50 55 60

Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys

65 70 75 80

Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly

85 90 95

Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys

100 105 110

Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser

115 120 125

Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro

130 135 140

Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser

180 185 190

Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys

210 215 220

Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

465 470 475

<210> 22

<211> 133

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> варианты IL-2 (3M, M45)

<400> 22

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 23

<211> 133

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> варианты IL-2 (3M, M61)

<400> 23

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 24

<211> 133

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> варианты IL-2 (3M, M72)

<400> 24

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 25

<211> 1851

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI102-M45)

<400> 25

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560

accgccatgc tgaccgctaa gttcgccatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620

cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c 1851

<210> 26

<211> 592

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI102-M45)

<400> 26

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 27

<211> 1851

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI102-M61)

<400> 27

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560

accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620

cagtgcctgg aaagggaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c 1851

<210> 28

<211> 592

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI102-M61)

<400> 28

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 29

<211> 1857

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI102-M72)

<400> 29

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560

accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620

cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatggggc ccagtccaag 1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac ctgatga 1857

<210> 30

<211> 592

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI102-M72)

<400> 30

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 31

<211> 1851

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101w)

<400> 31

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560

acccgcatgc tgacctttaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620

cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c 1851

<210> 32

<211> 592

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI101w)

<400> 32

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 33

<211> 1848

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (mGI102-M61)

<400> 33

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg 120

ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa 180

cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag 240

aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc 300

gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag 360

cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag 420

tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct 480

aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt 540

tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc 600

agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt 660

acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc 720

ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca 780

tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 840

gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 900

gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 960

accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1020

ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1080

ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 1140

tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1200

gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 1260

aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 1320

cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 1380

cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggaggtggt 1440

ggcggttctg cccctacctc cagctctacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg 1500

ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc 1560

gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacttgcag 1620

tgcctggaaa gggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac 1680

ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa 1740

ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt 1800

ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagagc atcatctcca cactgacc 1848

<210> 34

<211> 616

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (mGI102-M61)

<400> 34

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys

20 25 30

Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His

35 40 45

Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val

50 55 60

Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys

65 70 75 80

Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly

85 90 95

Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys

100 105 110

Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser

115 120 125

Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro

130 135 140

Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser

180 185 190

Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys

210 215 220

Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln

485 490 495

Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn

500 505 510

Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr

515 520 525

Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg

530 535 540

Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn

545 550 555 560

Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val

565 570 575

Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp

580 585 590

Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys

595 600 605

Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

610 615

<210> 35

<211> 153

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hIL-2 дикого типа

<400> 35

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 36

<211> 158

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL-2 с сигнальной последовательностью

<400> 36

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr

20 25 30

Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met

35 40 45

Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met

50 55 60

Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His

65 70 75 80

Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn

85 90 95

Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser

100 105 110

Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe

115 120 125

Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn

130 135 140

Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150 155

<210> 37

<211> 474

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность, кодирующая IL-2 с сигнальной

последовательностью

<400> 37

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgcccc taccagctcc tctaccaaga aaacccagct ccagttggag 120

catctgctgc tggacctcca gatgattctg aacgggatca acaactataa gaaccccaag 180

ctgacccgca tgctgacctt taagttctac atgcccaaga aggccaccga gctgaagcac 240

ctccagtgcc tggaagaaga actgaagccc ctggaagagg tgctgaatct ggcccagtcc 300

aagaacttcc acctgaggcc acgggacctg atcagcaaca tcaacgtgat cgtgctggaa 360

ctgaagggct ccgagacaac ctttatgtgc gagtacgccg acgagacagc caccatcgtg 420

gaatttctga accggtggat caccttctgc cagagcatca tctccacact gacc 474

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным слитым белкам на основе IL-2 и CD80, и может быть использовано в медицине для лечения рака. Сконструирован слитый белок, включающий последовательно соединенные от N- к С-концу: (1) внеклеточный домен белка CD80, (2) линкер из 5-80 последовательных аминокислот, (3) Fc домен, (4) линкер из 1-50 последовательных аминокислот и (5) вариант белка IL-2 с заменами по меньшей мере двух выбранных из 38-й, 42-й, 45-й, 61-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Изобретение обеспечивает получение слитого белка, который способен активировать природные киллерные клетки и контролировать активность регуляторных T-клеток (Treg). 7 н. и 14 з.п. ф-лы, 89 ил., 4 табл., 26 пр.

1. Слитый белок для активирования иммунных клеток и регулирования Treg клеток, который содержит вариант белка IL-2 и белок CD80, где слитый белок состоит из следующей структурной формулы (I) :

N'-X-[линкер (1)]_n-Fc домен-[линкер (2)]_m-Y-C', (I)

где

в структурной формуле (I)

N′ представляет собой N-конец слитого белка,

C′ представляет собой C-конец слитого белка,

X представляет собой внеклеточный домен белка CD80,

Y представляет собой белок IL-2,

где вариант белка IL-2 получают путем замены по меньшей мере двух выбранных из 38-й, 42-й, 45-й, 61-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10;

линкеры (1) и (2) представляют собой пептидные линкеры, где линкер (1) состоит из 5-80 последовательных аминокислот, и линкер (2) состоит из 1-50 последовательных аминокислот, и

n и m каждый имеет значение 1.

2. Слитый белок по п. 1, где вариант белка IL-2 получают путем по меньшей мере двух замен, выбранных из группы, состоящей из R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

3. Слитый белок по п. 1, где вариант белка IL-2 содержит любую выбранную из следующих комбинаций замен (a)-(d) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10:

(a) R38A/F42A

(b) R38A/F42A/Y45A

(c) R38A/F42A/E61R

(d) R38A/F42A/L72G.

4. Слитый белок по п. 1, где вариант белка IL-2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 22, 23 или 24.

5. Слитый белок по п. 1, где внеклеточный домен белка CD80 состоит из 35-й аминокислоты - 242-й аминокислоты в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.

6. Слитый белок по п. 1, где Fc домен является диким типом или вариантом.

7. Слитый белок по п. 1, где Fc домен имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

8. Слитый белок по п. 6, где вариант Fc домена имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

9. Слитый белок по п. 1, где линкер (1) представляет собой пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

10. Слитый белок по п. 1, где линкер (2) представляет собой пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.

11. Слитый белок по п. 1, где слитый белок имеет идентичность последовательности 85% или больше с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, 26, 28 или 30.

12. Димер слитого белка для активирования иммунных клеток и регулирования Treg клеток, где два слитых белка по любому из пп. 1-11 связаны друг с другом.

13. Димер слитого белка по п. 12, где димер слитого белка представляет собой гомодимер.

14. Полинуклеотид, кодирующий слитый белок по любому из пп. 1-11, где полинуклеотид имеет идентичность последовательности 85% или больше с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, 25, 27 или 29.

15. Вектор экспрессии млекопитающего для экспрессии слитого белка по п. 1, включающий полинуклеотид по п. 14.

16. Трансформированная клетка млекопитающего для экспрессии слитого белка по п. 1, в которую введен вектор экспрессии млекопитающего по п. 15, где клетка не является эмбриональной клеткой человека.

17. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения рака, включающая в качестве активного ингредиента:

слитый белок по любому из пп. 1-11 в эффективном количестве; или

димер слитого белка по п. 12 или 13 в эффективном количестве.

18. Фармацевтическая композиция по п. 17, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый носитель.

19. Фармацевтическая композиция по п. 17, где рак представляет собой любой, выбранный из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого миелоидного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнной железы и лимфомы.

20. Применение слитого белка по п. 1 для получения лекарственного средства для лечения рака.

21. Применение по п. 20, где рак представляет собой любой, выбранный из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого миелоидного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнной железы и лимфомы.