ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА FLT3 Российский патент 2024 года по МПК C07K14/705 C07K16/30 A61K35/17 C07K19/00 C12N15/62 C12N15/63 C12N5/10 A61P35/02 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 62/514,634, поданной 2 июня 2017 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

[0002] Содержание предварительной заявки на патент США № 62/514,574, поданной 2 июня 2017 г., и 62/660,908, поданной 20 апреля 2018 г., и заявки PCT под названием «АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К FLT3, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ», поданной 31 мая 2018 г., все из которых раскрывают антитела, специфичные к FLT3, полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0003] Данная заявка подается в электронном виде посредством EFS-Web и содержит список последовательностей, представленный в электронном виде в формате.txt. Файл.txt содержит перечень последовательностей под названием ALGN_010_01WO_SeqList_ST25.txt, созданный 24 мая 2018 года и имеющий размер 238 Кб. Перечень последовательностей, содержащийся в этом файле формата.txt, является частью описания и полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0004] В настоящей заявке предложены антитела, специфичные к Fms-подобной тирозинкиназе 3 (FLT3), химерные антигенные рецепторы (CAR), специфически связывающиеся с FLT3 (CAR к FLT3), полинуклеотиды, кодирующие CAR к FLT3, и сконструированные иммунные клетки, содержащие FLT3-специфичные CAR (например, T-клетки с FLT3-специфичными CAR). Изобретение, кроме того, относится к способам конструирования иммунных клеток для экспрессии FLT3-специфичных CAR, и к способам применения FLT3-специфичных антител и T-клеток с FLT3-специфичными CAR для лечения состояний, связанных с FLT3 (например, злокачественных клеток, экспрессирующих FLT3).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0005] Адоптивный перенос иммунных клеток, генетически модифицированных для обеспечения возможности распознавания антигенов, связанных со злокачественным новообразованием, является перспективным новым подходом к лечению рака (см., например, Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)). Т-клетки могут быть генетически модифицированы для экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR) - слитых белков, состоящих из антигенраспознающего фрагмента и доменов, активирующих Т-клетки (см., например, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993) и Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009)).

[0006] FLT3 является антигеном-мишенью острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), он сверхэкспрессируется на бластных клетках пациентов с ОМЛ по сравнению со здоровыми клетками и экспрессируется на большинстве клеток пациента (Carow et al, Feb 2, 1996 Blood: 87(3); Birg et al. Nov 1992 Blood: 80(10)). Ген FLT3 часто мутирован у пациентов с ОМЛ, и мутации связаны с плохим прогнозом (Abu-Duhier et al. Br J Haematol. 2000 Oct;111(1):190-5, Yamamoto et al. April 15, 2001; Blood: 97 (8)). Низкомолекулярные ингибиторы FLT3 продемонстрировали активность в клинических испытаниях; однако ответы обычно являются временными из-за приобретения резистентности. Кроме того, ингибиторы киназы лечат только долю пациентов, экспрессирующих мутированную форму FLT3, что подчеркивает острую необходимость в улучшенных методах лечения.

[0007] Соответственно, существует потребность в альтернативных методах лечения рака и, в частности, злокачественных новообразований, сопровождающихся нарушением экспрессии FLT3. В настоящей заявке предложены способы и композиции, направленные на удовлетворение этой потребности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] В настоящей заявке предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, специфически связывающиеся с Fms-подобной тирозинкиназой 3 (FLT3), химерные антигенные рецепторы (CAR), специфически связывающиеся с FLT3, и сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие такие CAR (например, T-клетки с FLT3-специфичными CAR). Также предложено получение таких антител, CAR и иммунных клеток. Кроме того, предложено применение таких антител, CAR и сконструированных иммунных клеток, например, для лечения состояния, связанного со злокачественными клетками, экспрессирующими FLT3 (например, рака). В одном из аспектов в настоящей заявке предложено выделенное антитело, специфически связывающееся с FLT3, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую любую из частичных последовательностей VH, приведенных в таблице 2, и/или вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую любую из частичных последовательностей VL, приведенных в таблице 2.

[0009] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложено выделенное антитело, специфически связывающееся с FLT3, где антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательности определяющей комплементарность области 1 (CDR1), CDR2 и CDR3, приведенные в таблице 3, и/или (b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, приведенные в таблице 3.

[0010] В настоящей заявке также предложены химерные антигенные рецепторы (CAR), связывающиеся с FLT3. Показано, что экспрессия FLT3-специфичных CAR в Т-клетках эффективна в активации Т-клеток при контакте с FLT3. Предложенные в настоящей заявке FLT3-специфичные CAR связывают человеческий FLT3 и проявляют цитотоксическую активность при контакте с клетками, экспрессирующими FLT3.

[0011] Соответственно, в еще одном аспекте в настоящей заявке предложен FLT3-специфичный химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий внеклеточный лиганд-связывающий домен, первый трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где внеклеточный домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), связывающийся с внеклеточным доменом FLT3. В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке предложены CAR к FLT3, содержащие внеклеточный лиганд-связывающий домен, первый трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где внеклеточный домен содержит scFv, связывающийся с определенными доменами мишени FLT3, например, связывающийся с SEQ ID NO: 199 (домен 1), SEQ ID NO: 200 (домен 2), SEQ ID NO: 201 (домен 3), SEQ ID NO: 254 (домен 2-3), SEQ ID NO: 202 (домен 4), или SEQ ID NO: 203 (домен 5), SEQ ID NO: 254 (домен 2-3), или SEQ ID NO: 202 (домен 4).

[0012] В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичные CAR содержат внеклеточный домен, содержащий scFv, где scFv связывается с доменом 4 мишени FLT3 (SEQ ID NO: 202).

[0013] В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичные CAR содержат внеклеточный домен, содержащий scFv, где scFv связывается с доменом 2 мишени FLT3 (SEQ ID NO: 200).

[0014] Внеклеточный домен FLT3-специфичных CAR содержит scFv, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где каждая из областей VH и VL содержит три определяющие комплементарность области (CDR), специфичные к FLT3.

[0015] В некоторых вариантах осуществления область VH содержит (i) первую определяющую комплементарность область (CDR1) VH, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 294, 295, 296, 300, 301, 305, 306, 307, 311, 312, 316, 317 или 318; (ii) вторую определяющую комплементарность область (CDR2) VH, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 297, 298, 302, 303, 308, 309, 313, 314, 319, 320 или 322; и (iii) третью определяющую комплементарность область (CDR3) VH, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 299, 304, 310, 315 или 321; и/или область VL содержит (i) первую определяющую комплементарность область (CDR1) VL, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 323, 326, 328, 331, 336, 338, 340, 343, 345, 348 или 350; (ii) вторую определяющую комплементарность область (CDR2) VL, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 324, 329, 332, 334, 341 или 346; и (iii) третью определяющую комплементарность область (CDR3) VL, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 325, 327, 330, 333, 335, 337, 339, 342, 344, 347 или 349.

[0016] В некоторых вариантах осуществления предложены FLT3-специфичные CAR, содержащие scFv, содержащий область VH, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 или 293.

[0017] В некоторых вариантах осуществления предложены FLT3-специфичные CAR, содержащие scFV, содержащий область VL, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 или 292.

[0018] В некоторых вариантах осуществления предложены FLT3-специфичные CAR, содержащие scFV, содержащий область VH и область VL, где область VH имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 или 293; и область VL имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 или 292.

[0019] В некоторых вариантах осуществления область VH содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 или 293, или ее вариант с одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами в остатках, не входящих в CDR, и/или область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 или 292, или ее вариант с одной или несколькими аминокислотными заменами в аминокислотах, не входящих в CDR.

[0020] В некоторых вариантах осуществления область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 90, 91 или 92; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93 или 94; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 95; и вариабельная область легкой цепи (VL) содержит следующие CDR: CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 171; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 172; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 173.

[0021] В некоторых вариантах осуществления область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19.

[0022] В некоторых вариантах осуществления область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43, 44 или 45; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46 или 47; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48; и вариабельная область легкой цепи (VL) содержит следующие CDR: CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 147; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 148; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 149.

[0023] В некоторых вариантах осуществления область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.

[0024] В некоторых вариантах осуществления область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 49, 44 или 50; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51 или 52; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53; и вариабельная область легкой цепи (VL) содержит следующие CDR: CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 150; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 151; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 152.

[0025] В некоторых вариантах осуществления область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.

[0026] В некоторых вариантах осуществления область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60, 61 или 62; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63 или 64; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65; и вариабельная область легкой цепи (VL) содержит следующие CDR: CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 156; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 157; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 158.

[0027] В некоторых вариантах осуществления область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.

[0028] В некоторых вариантах осуществления каждая CDR определена в соответствии с определением согласно Kabat, определением согласно Chothia, комбинацией определения согласно Kabat и определения согласно Chothia, определением AbM или контактным определением CDR.

[0029] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит домен 4-1BB. В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичный CAR содержит второй внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления второй внутриклеточный сигнальный домен содержит домен 4-1BB.

[0030] В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичные CAR, раскрытые в настоящей заявке, могут содержать стеблевой домен между внеклеточным лиганд-связывающим доменом и первым трансмембранным доменом. В некоторых вариантах осуществления стеблевой домен выбран из группы, состоящей из шарнира CD8α, шарнира IgG1 и шарнира FcγRIIIα. В некоторых вариантах осуществления стеблевой домен представляет собой шарнир человеческого CD8α, шарнир человеческого IgG1 или шарнир человеческого FcγRIIIα.

[0031] В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичные CAR, раскрытые в настоящей заявке, могут содержать один или более эпитопов, специфичных к одному или более моноклональным антителам. В некоторых вариантах осуществления эпитоп, специфичный к моноклинальному антителу, представляет собой эпитоп CD20. В некоторых вариантах осуществления эпитоп CD20 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 229 или SEQ ID NO: 230.

[0032] В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичный CAR содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 235, 236, 237 или 242. В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичный CAR содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 235. В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичный CAR содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 236.

[0033] В некоторых вариантах осуществления первый трансмембранный домен содержит трансмембранный домен α-цепи CD8.

[0034] В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичный CAR может содержать другой внеклеточный лиганд-связывающий домен, не являющийся специфичным к FLT3.

[0035] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен(ы), первый трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен(ы) находятся на одном полипептиде.

[0036] В некоторых вариантах осуществления CAR может содержать второй трансмембранный домен, где первый трансмембранный домен и внеклеточный лиганд-связывающий домен(ы) находятся на первом полипептиде, и где второй трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен(ы) находятся на втором полипептиде. В иллюстративном варианте осуществления первый трансмембранный домен содержит трансмембранный домен из α-цепи высокоаффинного рецептора IgE (FcεRI), а второй трансмембранный домен содержит трансмембранный домен из γ- или β-цепи FcεRI.

[0037] В некоторых вариантах осуществления CAR может содержать третий полипептид, содержащий третий трансмембранный домен, слитый с внутриклеточным сигнальным доменом из костимулирующей молекулы, где третий трансмембранный домен содержит трансмембранный домен из γ- или β-цепи FcεRI.

[0038] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложен выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую FLT3-специфичный CAR, описанный в настоящей заявке.

[0039] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложен вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, кодирующий FLT3-специфичный CAR, описанный в настоящей заявке.

[0040] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложена сконструированная иммунная клетка, экспрессирующая на своей поверхностной клеточной мембране FLT3-специфичный CAR, описанный в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка может содержать другой CAR, не являющийся специфичным к FLT3. В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка может содержать полинуклеотид, кодирующий полипептид суицида. В некоторых вариантах осуществления полипептид суицида представляет собой RQR8.

[0041] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка происходит от воспалительного Т-лимфоцита, цитотоксического Т-лимфоцита, регуляторного Т-лимфоцита или хелперного Т-лимфоцита.

[0042] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка может содержать нарушение одного или более эндогенных генов, где эндогенный ген кодирует TCRα, TCRβ, CD52, глюкокортикоидный рецептор (GR), дезоксицитидинкиназу (dCK) или белок иммунной контрольной точки, такой как, например, белок программируемой смерти-1 (PD-1).

[0043] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка получена от здорового донора. В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка получена от индивидуума, страдающего от заболевания или нарушения.

[0044] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложена сконструированная иммунная клетка, экспрессирующая на своей поверхностной клеточной мембране FLT3-специфичный CAR, как описано в настоящей заявке, для применения в качестве лекарственного средства. В еще одном аспекте в настоящей заявке предложено к FLT3-специфичное антитело для применения в качестве лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство, содержащее FLT3-специфичный CAR, экспрессирующий иммунные клетки или FLT3-специфичные антитела, предназначено для применения для лечения заболевания или нарушения, связанного с FLT3. В одном из вариантов осуществления заболевание или нарушение, связанное с FLT3, представляет собой рак гемопоэтического происхождения, такой как лимфома или лейкоз. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из множественной миеломы, злокачественного новообразования из плазматических клеток, лимфомы Ходжкина, нодулярной лимфомы Ходжкина с лимфоидным преобладанием, болезни Калера и миеломатоза, лейкоза из плазматических клеток, плазмоцитомы, В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ), хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), фолликулярной лимфомы, лимфомы Беркитта, лимфомы маргинальной зоны, мантийноклеточной лимфомы, крупноклеточной лимфомы, лимфобластной лимфомы из B-клеток предшественников, миелоидного лейкоза, макроглобулинемии Вальденстрема, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, лимфомы из лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы Беркитта, первичной медиастинальной (тимусной) крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфоплазмоцитарной лимфомы, макроглобулинемии Вальденстрема, нодулярной В-клеточной лимфомы маргинальной зоны, лимфомы маргинальной зоны селезенки, внутрисосудистой крупноклеточной В-клеточной лимфомы, первичной выпотной лимфомы, лимфоматоидного гранулематоза, крупноклеточной В-клеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, первичной лимфомы центральной нервной системы, первичной кожной диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (типа нижних конечностей), положительной по вирусу Эпштейна-Барр диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы пожилых, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, связанной с воспалением, внутрисосудистой крупноклеточной B-клеточной лимфомы, ALK-позитивной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, плазмабластной лимфомы, крупноклеточной B-клеточной лимфомы, возникающей при HHV8-ассоциированной многоцентровой болезни Кастлемана, неклассифицированной B-клеточной лимфомы с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и лимфомой Беркитта, неклассифицированной B-клеточной лимфомы с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и классической лимфомой Ходжкина, и других раковых заболеваний, связанных с гемопоэтическими клетками, например, ОЛЛ или ОМЛ.

[0045] В одном из аспектов в настоящей заявке предложена популяция клеток, содержащая сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие FLT-специфичные CAR, описанные в настоящей заявке, где (ii) указанная популяция клеток содержит процентную долю стволовых клеток памяти и клеток центральной памяти, превышающую 20%, 30% или 40%, и/или (iii) указанная популяция клеток обеспечивает лизис клеток, экспрессирующих FLT3, составляющий более 10%, 20%, 30% или 40%.

[0046] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложен способ конструирования иммунной клетки, экспрессирующей любой из FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, включающий: обеспечение иммунной клетки; и введение в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего указанный FLT3-специфичный CAR, в результате чего указанная иммунная клетка экспрессирует указанный FLT3-специфичный CAR.

[0047] В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение иммунной клетки; введение в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего указанный FLT3-специфичный CAR; и введение по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего CAR, не являющийся специфичным к FLT3.

[0048] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложен способ лечения субъекта, страдающего от заболевания или нарушения, связанного с FLT3, включающий: обеспечение иммунной клетки, экспрессирующей на поверхности FLT3-специфичный CAR, как описано в настоящей заявке; и введение указанных иммунных клеток указанному субъекту. Изобретение также относится к способам лечения субъектов, страдающих от заболевания или нарушения, связанного с FLT3, где способ включает обеспечение FLT3-специфичных антител, описанных в настоящей заявке, и введение указанных антител указанному субъекту.

[0049] В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке предложена фармацевтическая композиция, содержащая сконструированную иммунную клетку, экспрессирующую FLT3-специфичные CAR, как описано в настоящей заявке. В других вариантах осуществления изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим любое из FLT3-специфичных антител, описанных в настоящей заявке.

[0050] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложен способ лечения состояния, связанного со злокачественными клетками, экспрессирующими FLT3, у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей сконструированную иммунную клетку, как описано в настоящей заявке, или FLT3-специфичных антител, как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак гемопоэтического происхождения, такой как лимфома или лейкоз. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из множественной миеломы, злокачественного новообразования из плазматических клеток, лимфомы Ходжкина, нодулярной лимфомы Ходжкина с лимфоидным преобладанием, болезни Калера и миеломатоза, лейкоза из плазматических клеток, плазмоцитомы, В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ), хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), фолликулярной лимфомы, лимфомы Беркитта, лимфомы маргинальной зоны, мантийноклеточной лимфомы, крупноклеточной лимфомы, лимфобластной лимфомы из B-клеток предшественников, миелоидного лейкоза, макроглобулинемии Вальденстрема, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, лимфомы из лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы Беркитта, первичной медиастинальной (тимусной) крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфоплазмоцитарной лимфомы, макроглобулинемии Вальденстрема, нодулярной В-клеточной лимфомы маргинальной зоны, лимфомы маргинальной зоны селезенки, внутрисосудистой крупноклеточной В-клеточной лимфомы, первичной выпотной лимфомы, лимфоматоидного гранулематоза, крупноклеточной В-клеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, первичной лимфомы центральной нервной системы, первичной кожной диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (типа нижних конечностей), положительной по вирусу Эпштейна-Барр диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы пожилых, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, связанной с воспалением, внутрисосудистой крупноклеточной B-клеточной лимфомы, ALK-позитивной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, плазмабластной лимфомы, крупноклеточной B-клеточной лимфомы, возникающей при HHV8-ассоциированной многоцентровой болезни Кастлемана, неклассифицированной B-клеточной лимфомы с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и лимфомой Беркитта, неклассифицированной B-клеточной лимфомы с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и классической лимфомой Ходжкина, и других раковых заболеваний, связанных с гемопоэтическими клетками, например, ОЛЛ или ОМЛ.

[0051] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложен способ ингибирования роста или прогрессирования опухоли у субъекта, имеющего злокачественные клетки, экспрессирующие FLT3, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей сконструированную иммунную клетку, как описано в настоящей заявке, или FLT3-специфичное антитело, как описано в настоящей заявке.

[0052] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложен способ ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих FLT3, у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей сконструированную иммунную клетку, как описано в настоящей заявке, или FLT3-специфичного антитела, как описано в настоящей заявке.

[0053] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложен способ индукции регрессии опухоли у субъекта, имеющего злокачественные клетки, экспрессирующие FLT3, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей сконструированную иммунную клетку, как описано в настоящей заявке, или FLT3-специфичного антитела, как описано в настоящей заявке.

[0054] В некоторых вариантах осуществления любой из вышеуказанных способов дополнительно включает введение одного или более дополнительных видов терапии, таких как, например, моноклональное антитело и/или химиотерапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело может представлять собой, например, антитело, связывающееся с ингибитором контрольных точек, такое как, например, антитело к PD-1 или антитело к PD-L1. В некоторых вариантах осуществления любой из указанных выше способов дополнительно включает введение субъекту ингибитора рецепторной тирозинкиназы, ингибитора mTOR, эпигенетического модулятора, ингибитора протеасомы, иммуномодулирующего агента, такого как леналидомид, ингибитора сигнального пути Hedgehog или ингибиторов изоцитратдегидрогеназы (IDH).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0055] На ФИГ. 1 показаны репрезентативные графики FACS, демонстрирующие эффективную трансдукцию активированных T-клеток конструкцией P3A1 CAR относительно нетрансдуцированного контроля, и эффективности трансдукции для всех конструкций в виде процента CAR-экспрессирующих T-клеток и значений средней интенсивности флуоресценции (MFI).

[0056] На ФИГ. 2 показана экспрессия маркеров активации CD25 и 4-1BB в Т-клетках, трансдуцированных различными конструкциями CAR, оцененная с помощью проточной цитометрии.

[0057] На ФИГ. 3 показан фенотип T-клеток с CAR в конце культивирования, как определено с помощью проточного цитометрического анализа экспрессии маркеров CD62L и/или CD45RO.

[0058] На ФИГ. 4 показана общая схема эксперимента по анализу долгосрочной уничтожающей способности и ответа различных T-клеток с CAR на повторное воздействие клеток-мишеней, измеренное как кратное размножение и цитотоксическая активность (процент лизиса) на 6 день.

[0059] На ФИГ. 5 показана противоопухолевая активность T-клеток с CAR, экспрессирующих конструкцию P3A1 или P3E10, в двух дозах с использованием ортотопической мышиной модели человеческого ОМЛ. Биолюминесцентные сигналы, численно выраженные как общий поток (фотонов/сек), показаны в разные моменты времени.

[0060] На ФИГ. 6 показана чувствительность Т-клеток, экспрессирующих на клеточной поверхности FLT3-специфичный CAR, содержащий эпитопы CD20, к комплементзависимой цитотоксичности (CDC), индуцированной антителом к CD20 ритуксимабом.

[0061] На ФИГ. 7 показано восстановление эндогенных клеток-предшественников костного мозга у мышей, получавших T-клетки с CAR к мышиному FLT3, экспрессирующие эпитопы CD20, а затем получавших ритуксимаб.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0062] В одном из аспектов изобретение, раскрытое в настоящей заявке, относится к химерным антигенным рецепторам (CAR) и иммунным клеткам, содержащим CAR (например, CAR-T-клеткам, T-клеткам с CAR), специфически связывающимся с FLT3 (например, человеческим FLT3). Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим данные CAR, композициям, содержащим иммунные клетки, экспрессирующие данные CAR, и способам получения и применения данных CAR и экспрессирующих CAR иммунных клеток. Изобретение также относится к способам лечения состояния, связанного с FLT3-опосредованными патологиями у субъекта, такого как рак, опосредованный злокачественными клетками, экспрессирующими FLT3, с помощью FLT3-специфичных CAR и иммунных клеток, экспрессирующих данные CAR, как описано в настоящей заявке.

[0063] В одном из аспектов изобретение, раскрытое в настоящей заявке, относится к антителам, специфически связывающимся с FLT3 (например, человеческим FLT3). Изобретение также относится к композициям, содержащим данные антитела, и способам применения данных антител. Например, в настоящей заявке предложены способы лечения состояния, связанного с FLT3-опосредованными патологиями у субъекта, такого как рак, с помощью данных антител.

Общие методы

[0064] При осуществлении изобретения будут применяться, если не указано иное, традиционные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие методы подробно описаны в литературе, например, в источниках Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Определения

[0065] В контексте настоящей заявки термин «внеклеточный лиганд-связывающий домен» относится к полипептиду, способному связывать лиганд или способному взаимодействовать с молекулой клеточной поверхности. Например, внеклеточный лиганд-связывающий домен может быть выбран для распознавания лиганда, действующего как маркер клеточной поверхности на клетках-мишенях, связанных с конкретным патологическим состоянием.

[0066] Термины «стеблевой домен» или «шарнирный домен» в настоящей заявке используются взаимозаменяемо для обозначения любого полипептида, выполняющего функцию связывания трансмембранного домена с внеклеточным лиганд-связывающим доменом. В частности, стеблевые домены используют для обеспечения большей гибкости и доступности внеклеточного лиганд-связывающего домена.

[0067] Термин «внутриклеточный сигнальный домен» относится к части белка, передающей сигнал, регулирующий эффекторную функцию, и направляющей клетку на выполнение специализированной функции.

[0068] «Костимулирующая молекула» в контексте настоящей заявки относится к родственному партнеру по связыванию на иммунных клетках, например, Т-клетках, который специфически связывается с костимулирующим лигандом, тем самым опосредуя костимулирующий ответ клетки, такой как, не ограничиваясь перечисленным, пролиферация. Костимулирующие молекулы включают, не ограничиваясь перечисленным, молекулу ГКГС I класса, BTLA и Толл-подобный рецептор. Примеры костимулирующих молекул включают CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антиген-1, ассоциированный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 и лиганд, специфически связывающийся с CD83, и тому подобное.

[0069] «Костимулирующий лиганд» относится к молекуле на антигенпрезентирующей клетке, специфически связывающей родственную костимулирующую сигнальную молекулу на Т-клетке, обеспечивая тем самым сигнал, который, в дополнение к первичному сигналу, обеспечиваемому, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, нагруженной пептидом, опосредует Т-клеточный ответ, включая, не ограничиваясь перечисленным, активацию пролиферации, дифференцировку и тому подобное. Костимулирующий лиганд может включать, не ограничиваясь перечисленным, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцибельный костимулирующий лиганд (ICOS-L), молекулу межклеточной адгезии (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, рецептор лимфотоксина-β, 3/TR6, ILT3, ILT4, агонист или антитело, связывающее Толл-подобный рецептор, и лиганд, специфически связывающийся с B7-H3. Костимулирующий лиганд также включает, помимо прочего, антитело, специфически связывающееся с костимулирующей молекулой, присутствующей на Т-клетке, такое как, не ограничиваясь перечисленным, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антиген-1, ассоциированный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, специфически связывающийся с CD83.

[0070] «Антитело» представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т. д., посредством по меньшей мере одного антигенраспознающего сайта, расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. В контексте настоящей заявки указанный термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), одноцепочечные (scFv) и доменные антитела (включая, например, антитела акул и верблюдовых) и слитые белки, содержащие антитело, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, содержащую антигенраспознающий сайт. Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA, IgE, IgD или IgM (или их подкласс), и антитело не обязательно должно относиться к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела иммуноглобулины могут отнесены к разным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них дополнительно делятся на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Хорошо известны структуры субъединиц и трехмерная конфигурация различных классов иммуноглобулинов.

[0071] В контексте настоящей заявки термин «антигенсвязывающий фрагмент» или «антигенсвязывающая часть» антитела относится к одному или более фрагментам интактного антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с данным антигеном (например, FLT3). Антигенсвязывающие функции антитела могут выполняться фрагментами интактного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают Fab; Fab'; F(ab')₂; Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; фрагмент однодоменного антитела (dAb) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) и выделенную определяющую комплементарность область (CDR).

[0072] Антитело, антигенсвязывающий фрагмент, конъюгат антитела или полипептид, который «специфически связывается» с мишенью (например, белком FLT3), является термином, хорошо известным в данной области техники, и способы определения такого специфического связывания также хорошо известны в данной области техники. Говорят, что молекула проявляет «специфическое связывание», если она взаимодействует или ассоциирует с конкретной клеткой или веществом более часто, более быстро, с большей продолжительностью и/или с большей аффинностью, чем с альтернативными клетками или веществами. Антитело «специфически связывается» с мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, легче и/или с большей продолжительностью, чем с другими веществами. Например, антитело, специфически связывающееся с эпитопом FLT3, представляет собой антитело, связывающее этот эпитоп с большей аффинностью, авидностью, легче и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими эпитопами FLT3 или эпитопами, отличными от FLT3. Из этого определения также ясно, что, например, антитело (или фрагмент или эпитоп), которое специфически связывается с первой мишенью, может специфически связываться или не связываться со второй мишенью. Как таковое, «специфическое связывание» не обязательно требует (хотя может включать) исключительное связывание. Обычно, но не обязательно, указание на связывание означает специфическое связывание.

[0073] «Вариабельная область» антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или к вариабельной области тяжелой цепи антитела, по отдельности или в комбинации. Как известно в данной области техники, каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных областей (FR), связанных тремя определяющими комплементарность областями (CDR), также известными как гипервариабельные области. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости посредством FR и вместе с CDR из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител. Существует по меньшей мере два метода определения CDR: (1) подход, основанный на межвидовый вариабельности последовательностей (т. е. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948). В контексте настоящей заявки CDR может относиться к CDR, определенным посредством любого из подходов, или комбинацией обоих подходов.

[0074] «CDR» вариабельного домена представляют собой аминокислотные остатки в вариабельной области, идентифицированные в соответствии с определениями согласно Kabat, Chothia, совмещением Kabat и Chothia, AbM, контактными и/или конформационными определениями, или любым способом определения CDR, хорошо известным в данной области техники. CDR антител могут быть идентифицированы как гипервариабельные области, первоначально определенные Kabat et al. См., например, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Положения CDR также могут быть идентифицированы как структурные петлевые структуры, первоначально описанные Chothia и др. См., например, Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989. Другие подходы к идентификации CDR включают «определение AbM», представляющее собой компромисс между Kabat и Chothia и полученное с использованием программного обеспечения для моделирования антител AbM компании Oxford Molecular (в настоящее время Accelrys®), или «контактное определение» CDR на основе наблюдаемых контактов с антигенами, как изложено в MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745, 1996. В еще одном подходе, называемом в настоящей заявке «конформационным определением» CDR, положения CDR могут быть идентифицированы как остатки, вносящие энтальпийный вклад в связывание антигена. См., например, Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008. Тем не менее, другие определения границ CDR могут не следовать строго одному из вышеприведенных подходов, но, тем не менее, будут перекрываться по меньшей мере с частью CDR согласно Kabat, хотя они могут быть сокращены или удлинены в свете прогнозирования или экспериментальных данных о том, что конкретные остатки или группы остатков, или даже целые CDR не оказывают значительного влияния на связывание антигена. В контексте настоящей заявки CDR может относиться к CDR, определенным посредством любого подхода, известного в данной области техники, включая комбинации подходов. В используемых в настоящей заявке способах могут быть использованы CDR, определенные в соответствии с любым из этих подходов. Для любого данного варианта осуществления, содержащего более одной CDR, CDR могут быть определены в соответствии с любым из определений согласно Kabat, Chothia, расширенным, AbM, контактным и/или конформационным определением.

[0075] В контексте настоящей заявки «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, то есть, отдельные антитела в составе популяции являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, поскольку они направлены против одной области детерминанты. Кроме того, по сравнению с препаратами поликлональных антител, которые обычно содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Определение «моноклональное» указывает на то, что антитело получено из по существу однородной популяции антител; его не следует интерпретировать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения согласно изобретению могут быть получены с гибридомным способом, впервые описанным в источнике Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975, или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК, такими как описанные в патенте США № 4,816,567. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек, генерируемых с использованием методик, описанных, например, в источнике McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990.

[0076] В контексте настоящей заявки термин «гуманизированное» антитело относится к формам антител нечеловеческого происхождения (например, мышиным), которые представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), содержащие минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения. В одном из аспектов гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменены остатками из CDR отличного от человека вида (антитело-донор), такого как мышь, крыса или кролик, имеющей желаемую специфичность, аффинность и антигенсвязывающую способность. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, не содержащиеся ни в антителе-реципиенте, ни в импортированных CDR или каркасных последовательностях, но включенные для дальнейшего улучшения и оптимизации характеристик антитела. В целом, гуманизированное антитело может содержать по существу все из по меньшей мере одного, и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все области CDR соответствуют областям CDR иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, а все или по существу все FR области соответствуют FR областям консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. В оптимальном варианте гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области или домена (Fc) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина. Предпочтительными являются антитела, имеющие Fc-области, модифицированные, как описано в WO 99/58572. В других формах гуманизированных антител одна или более CDR (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 или CDR H3) изменены относительно исходного антитела; такие CDR также называются одной или более CDR, «производными из» одной или более CDR из исходного антитела.

[0077] В контексте настоящей заявки «человеческое антитело» означает антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или полученного с использованием любого из методов получения человеческих антител, известных специалистам в данной области техники или раскрытых в настоящей заявке. Это определение человеческого антитела включает антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид человеческой тяжелой цепи или по меньшей мере один полипептид человеческой легкой цепи. Одним из таких примеров является антитело, содержащее полипептиды мышиной легкой цепи и человеческой тяжелой цепи. Человеческие антитела могут быть получены с помощью различных методов, известных в данной области техники. В одном из вариантов осуществления человеческое антитело выбрано из фаговой библиотеки, где данная фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Человеческие антитела также могут быть получены путем иммунизации животных, которым были трансгенно введены локусы человеческого иммуноглобулина вместо эндогенных локусов, например, мышей, у которых гены эндогенного иммуноглобулина были частично или полностью инактивированы. Этот подход описан в патентах США №№ 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; и 5,661,016. В качестве альтернативы, человеческое антитело может быть получено путем иммортализации человеческих В-лимфоцитов, продуцирующих антитело, направленное против антигена-мишени (такие В-лимфоциты могут быть получены от индивидуума или посредством клонирования кДНК отдельной клетки, или могут быть иммунизированы in vitro). См., например, Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991; и патент США № 5,750,373.

[0078] Термин «химерное антитело» предназначен для обозначения антител, в которых последовательности вариабельной области получены из одного вида, а последовательности константной области получены из другого вида, таких как антитело, в котором последовательности вариабельной области получены из мышиного антитела, а последовательности константной области получены из человеческого антитела.

[0079] «Моновалентное антитело» содержит один антигенсвязывающий сайт на молекулу (например, IgG или Fab). В некоторых случаях моновалентное антитело может иметь более одного антигенсвязывающего сайта, но связывающие сайты происходят от разных антигенов.

[0080] «Двухвалентное антитело» содержит два антигенсвязывающих сайта на молекулу (например, IgG). В некоторых случаях два связывающих сайта имеют одинаковую антигенную специфичность. Однако двухвалентные антитела могут быть биспецифичными.

[0081] Антитела согласно изобретению могут быть получены с использованием методов, хорошо известных в данной области техники, например, рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или комбинаций таких технологий или других технологий, хорошо известных в данной области техники (см., например, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999 и Fellouse, F.A., et al, J. MoI. Biol., 373(4):924-40, 2007).

[0082] Как известно в данной области техники, «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», используемые в настоящей заявке взаимозаменяемо, относятся к цепям нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который может быть включен в цепь ДНК- или РНК-полимеразой. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Модификация структуры нуклеотида, если она имеет место, может быть сообщена до или после сборки цепи. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с метящим компонентом. Другие типы модификаций включают, например, «кэпы», замену одного или более природных нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, группы с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т. д.) и с заряженными связями (например, тиофосфаты, дитиофосфаты и т. д.), группами, содержащими боковые фрагменты, такими как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т. д.), группами с интеркаляторами (например, акридин, псорален и т. д.), группами, содержащими комплексообразователи (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, металлы с окислительными свойствами и т. д.), группами, содержащими алкилаторы, группами с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т. д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть заменена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами или активирована для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или может быть конъюгирована с твердыми носителями. 5'- и 3'-концевые ОН-группы могут быть фосфорилированы или замещены аминами или фрагментами органических кэпирующих групп длиной от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть подвергнуты взаимодействию со стандартными защитными группами. Полинуклеотиды также могут содержать формы аналогов сахаров рибозы или дезоксирибозы, общеизвестные в данной области техники, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидо-рибозу, карбоциклические аналоги сахаров, альфа- или бета-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и аналоги нуклеотидов с удаленным азотистым основанием, такие как метилрибозид. Одна или более фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связующими группами. Эти альтернативные связующие группы включают, не ограничиваясь перечисленным, варианты осуществления, в которых фосфат заменен на P(O)S («тиоэфир»), P(S)S («дитиоэфир»), (O)NR₂ («амидат»), P(O)R, P(O)OR', CO или CH₂ («формацеталь»), где каждый R или R' независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий простую эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть одинаковыми. Приведенное выше описание относится ко всем полинуклеотидам, упоминаемым в настоящей заявке, включая РНК и ДНК.

[0083] Как известно в данной области техники, «константная область» антитела относится к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, по отдельности или в комбинации.

[0084] В контексте настоящей заявки термин «по существу чистый» относится к материалу, чистому по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или даже по меньшей мере на 99% (т. е., не содержащему загрязняющих веществ).

[0085] «Клетка-хозяин» включает отдельную клетку или клеточную культуру, которая может быть или была реципиентом для вектора(ов) для включения полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и потомство необязательно должно быть полностью идентичным (по морфологии или по комплементарности геномной ДНК) исходной родительской клетке из-за естественной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные in vivo полинуклеотидом(ами) согласно настоящему изобретению.

[0086] Как известно в данной области техники, термин «Fc-область» используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. «Fc-область» может представлять собой Fc-область с нативной последовательностью или вариантную Fc-область. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG обычно определена как участок от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Pro230 до ее карбоксильного конца. Нумерация остатков в Fc-области представляет собой нумерацию в антителе EU, как описано Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Fc-область иммуноглобулина обычно содержит две константные области, СН2 и СН3.

[0087] В данной области техники «Fc-рецептор» и «FcR» описывают рецептор, связывающийся с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является человеческий FcR с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является рецептор, связывающий антитело IgG (гамма-рецептор), и он включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), имеющие схожие аминокислотные последовательности, отличающиеся главным образом их цитоплазматическими доменами. Обзор FcR содержится в источниках Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995. «FcR» также включает неонатальный рецептор FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976; и Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994).

[0088] Термин «конкурировать», используемый в настоящей заявке в отношении антитела, означает, что первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (или часть) связывается с эпитопом способом, достаточно схожим со связыванием второго антитела или его антигенсвязывающей части, так что результат связывания первого антитела с его родственным эпитопом заметно снижается в присутствии второго антитела по сравнению со связыванием первого антитела в отсутствие второго антитела. Альтернатива, где связывание второго антитела с его эпитопом также обнаружимо снижается в присутствии первого антитела, может иметь, но не обязательно имеет место. То есть, первое антитело может ингибировать связывание второго антитела с его эпитопом без того, чтобы это второе антитело ингибировало связывание первого антитела с его соответствующим эпитопом. Однако в тех случаях, когда каждое антитело обнаружимо ингибирует связывание другого антитела с его родственным эпитопом или лигандом, будь то в одинаковой, большей или меньшей степени, указанные антитела считаются «перекрестно конкурирующими» друг с другом за связывание их соответствующего(их) эпитопа(ов). Как конкурирующие, так и перекрестно конкурирующие антитела охватываются изобретением. Независимо от механизма, посредством которого происходит такая конкуренция или перекрестная конкуренция (например, стерическое затруднение, конформационное изменение или связывание с общим эпитопом или его частью), специалисту в данной области техники ясно, основываясь на содержании настоящей заявки, что такие конкурирующие и/или перекрестно конкурирующие антитела охватываются настоящей заявкой и могут быть пригодны для раскрытых в ней способов.

[0089] В контексте настоящей заявки термин «аутологичный» означает, что клетки, клеточная линия или популяция клеток, используемых для лечения пациентов, происходят от указанного пациента.

[0090] В контексте настоящей заявки термин «аллогенный» означает, что клетки или популяция клеток, используемых для лечения пациентов, происходят не от указанного пациента, а от донора.

[0091] В контексте настоящей заявки термин «лечение» представляет собой подход для получения полезных или желаемых клинических результатов. Для целей данного изобретения полезные или желаемые клинические результаты включают, не ограничиваясь перечисленным, одно или более из следующего: снижение пролиферации (или разрушение) опухолевых или раковых клеток, ингибирование метастазирования опухолевых клеток, уменьшение или снижение размера опухоли, экспрессирующей FLT3, ремиссию заболевания, связанного с FLT3 (например, рака), уменьшение симптомов, возникающих в результате заболевания, связанного с FLT3 (например, рака), улучшение качества жизни пациентов, страдающих от заболевания, связанного с FLT3 (например, рака), уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, связанного с FLT3 (например, рака), задержку прогрессирования заболевания, связанного с FLT3 (например, рака), излечение заболевания, связанного с FLT3 (например, рака), и/или продление выживаемости пациентов, имеющих заболевание, связанное с FLT3 (например, рак).

[0092] «Улучшение» означает снижение интенсивности или уменьшение одного или более симптомов по сравнению с отсутствием введения FLT3-специфичного CAR или FLT3-специфичной T-клетки с CAR. «Улучшение» также включает сокращение или уменьшение продолжительности симптома.

[0093] В контексте настоящей заявки термин «эффективная дозировка» или «эффективное количество» лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для достижения любого одного или нескольких полезных или желаемых результатов. Для профилактического применения полезные или желаемые результаты включают устранение или уменьшение риска, снижение степени тяжести или отсрочку начала заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнений и промежуточных патологических проявлений в ходе развития заболевания. Для терапевтического применения полезные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как снижение частоты возникновения или улучшение одного или более симптомов различных заболеваний или состояний, связанных с FLT3 (таких как, например, множественная миелома), уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, усиление действия другого лекарственного средства и/или отсрочка прогрессирования заболевания, связанного с FLT3, у пациентов. Эффективная дозировка может быть введена за одно или более введений. Для целей данного изобретения эффективная дозировка лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для осуществления профилактического или терапевтического лечения, будь то напрямую или опосредованно. Как понимается в клиническом контексте, эффективная дозировка лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может достигаться или не достигаться в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, «эффективная дозировка» может рассматриваться в контексте введения одного или более терапевтических агентов, и можно считать, что один агент вводится в эффективном количестве, если в сочетании с одним или более другими агентами может быть достигнут или достигается желаемый результат.

[0094] Термины «индивидуум», «пациент» или «субъект» используются в настоящей заявке взаимозаменяемо и относятся к млекопитающему. Млекопитающие включают, не ограничиваясь перечисленным, людей, обезьян, свиней, других сельскохозяйственных животных, животных для участия в спортивных состязаниях, домашних животных, приматов, лошадей, собак, кошек, грызунов, включая мышей, крыс, морских свинок и т. д. Субъект является млекопитающим, и эти термины используется в настоящей заявке взаимозаменяемо. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой нечеловекообразного примата. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека или обезьяну, например, яванского макака.

[0095] В контексте настоящей заявки термин «вектор» означает конструкцию, способную доставлять и, в некоторых вариантах осуществления, экспрессировать один или более представляющих интерес генов или последовательностей в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, не ограничиваясь перечисленным, вирусные векторы, векторы экспрессии на основе голой ДНК или РНК, плазмидные, космидные или фаговые векторы, векторы экспрессии на основе ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими агентами, векторы экспрессии на основе ДНК или РНК, заключенные в липосомы, и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

[0096] В контексте настоящей заявки термин «последовательность контроля экспрессии» означает последовательность нуклеиновой кислоты, управляющую транскрипцией нуклеиновой кислоты. Последовательность контроля экспрессии может представлять собой промотор, такой как конститутивный или индуцибельный промотор, или энхансер. Последовательность контроля экспрессии функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей транскрипции.

[0097] В контексте настоящей заявки термин «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемый эксципиент» включает любой материал, который в сочетании с активным ингредиентом позволяет ингредиенту сохранять биологическую активность и не вызывает реакцию иммунной системы субъекта. Примеры включают, не ограничиваясь перечисленным, любые стандартные фармацевтические носители, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода, и различные типы смачивающих агентов. Примеры разбавителей для аэрозольного или парентерального введения включают забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) или нормальный (0,9%) физиологический раствор. Композиции, содержащие такие носители, готовят хорошо известными общепринятыми способами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005).

[0098] Термин «k_on» в контексте настоящей заявки относится к константе скорости ассоциации антитела или scFv CAR с антигеном.

[0099] Термин «k_off» в контексте настоящей заявки относится к константе скорости диссоциации антитела или scFv CAR из комплекса антитело/антиген.

[00100] Термин «K_D» в контексте настоящей заявки относится к равновесной константе диссоциации взаимодействия антитело-антиген или взаимодействия scFv-антиген.

[00101] Упоминание «приблизительного» значения или параметра в настоящей заявке включает (и описывает) варианты осуществления, относящиеся к этому значению или параметру как таковым. Например, упоминание «приблизительно X» включает описание «X». Числовые диапазоны включают границы диапазонов.

[00102] Подразумевается, что везде, где варианты осуществления в настоящей заявке описаны с помощью выражения «содержит», также предусматриваются в остальном аналогичные варианты осуществления, описанные с помощью выражений «состоящий из» и/или «по существу состоящий из».

[00103] В тех случаях, когда аспекты или варианты осуществления изобретения описаны с помощью формулы Маркуша или другой группы альтернатив, изобретение охватывает не только всю группу, перечисленную в целом, но и каждого члена группы в отдельности и все возможные подгруппы основной группы, а также основную группу, где отсутствует один или более членов. Изобретение также предусматривает явное исключение одного или более любых членов группы в заявленном изобретении.

[00104] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют такие же значения, которые обычно подразумеваются специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае противоречия настоящее описание, включая определения, имеет преимущество. Во всем тексте описания и формулы изобретения слово «содержать» или его вариации, такие как «содержит» или «содержащий», будут подразумевать включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключая любое другое целое число или группу целых чисел. Если контекст не требует иного, термины в единственном числе включают множественное число, а термины во множественном числе включают единственное число.

[00105] Примеры методов и материалов описаны ниже, хотя методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящей заявке, также могут быть использованы на практике или для испытания настоящего изобретения. Материалы, методы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Антитела к FLT3

[00106] Настоящее изобретение относится к антителам, связывающимся с FLT3 [например, человеческим FLT3 (например, идентификационный номер: NP_004110 или SEQ ID NO: 198)] и характеризующимся любой одной или более из следующих характеристик: (a) лечат, предупреждают, улучшают один или более симптомов состояния, связанного со злокачественными клетками, экспрессирующими FLT3, у субъекта (например, рака, такого как ОМЛ); (b) ингибируют рост или прогрессирование опухоли у субъекта (имеющего злокачественную опухоль, экспрессирующую FLT3); (c) ингибируют метастазирование раковых (злокачественных) клеток, экспрессирующих FLT3, у субъекта (имеющего одну или более злокачественных клеток, экспрессирующих FLT3); (d) индуцируют регрессию (например, долгосрочную регрессию) опухоли, экспрессирующей FLT3; (e) проявляют цитотоксическую активность в злокачественных клетках, экспрессирующих FLT3; (f) блокируют взаимодействие FLT3 с другими, пока не установленными, факторами; и/или (g) индуцируют эффект «свидетеля», уничтожающий или ингибирующий рост не экспрессирующих FLT3 злокачественных клеток поблизости.

[00107] В одном из аспектов предложено выделенное антитело, специфически связывающееся с FLT3, содержащее (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую (i) первую определяющую комплементарность область (CDR1) VH, содержащую последовательность, представленную в 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246 или 247; (ii) CDR2 VH, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253 или 255; и iii) CDR3 VH, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250 или 254; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую (i) CDR1 VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273 или 275; (ii) CDR2 VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266 или 271; и (iii) CDR3 VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272 или 274.

[00108] В еще одном аспекте предложено выделенное антитело, специфически связывающееся с FLT3, содержащее: область VH, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 или 293; и/или область VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 или 292.

[0100] В некоторых вариантах осуществления предложено выделенное антитело, специфически связывающееся с FLT3, содержащее: область VH, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 275, 289 или 291; и/или область VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 274, 288 или 290.

[0101] В некоторых вариантах осуществления предложено антитело, имеющее любую из частичных последовательностей легкой цепи, приведенных в таблице 2, и/или любую из частичных последовательностей тяжелой цепи, приведенных в таблице 2.

[0102] В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящей заявке, содержат константную область. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящей заявке, относятся к человеческому подклассу IgG1, IgG2 or IgG2Δa, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящей заявке, содержат гликозилированную константную область. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящей заявке, содержат константную область, обладающую сниженной аффинностью связывания с одним или более человеческими Fc-гамма-рецепторами.

[0103] Антитела, предложенные в настоящей заявке, могут включать моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc и т. д.), химерные антитела, одноцепочечные (ScFv) и/или гуманизированные антитела. Антитела могут иметь мышиное, крысиное, человеческое или любое другое происхождение (включая химерные или гуманизированные антитела).

FLT3-специфичные CAR и способы их получения

[0104] В настоящей заявке предложены CAR, связывающиеся с FLT3 (например, человеческим FLT3 (например, SEQ ID NO: 198 или идентификационный номер NP_004110). FLT3-специфичные CAR, предложенные в настоящей заявке, включают одноцепочечные CAR и многоцепочечные CAR. CAR обладают способностью перенаправлять Т-клеточную специфичность и реактивность на FLT3 без рестрикции по ГКГС, используя антигенсвязывающие свойства моноклональных антител. Не рестриктированное по ГКГС распознавание антигена дает Т-клеткам, экспрессирующим CAR, способность распознавать антиген независимо от процессинга антигена, таким образом обходя основной механизм ускользания опухоли от иммунного ответа.

[0105] В некоторых вариантах осуществления CAR, предложенные в настоящей заявке, содержат внеклеточный лиганд-связывающий домен (например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv)), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен находятся в одном полипептиде, то есть, в одной цепи. Многоцепочечные CAR и полипептиды также предложены в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления многоцепочечные CAR содержат: первый полипептид, содержащий трансмембранный домен и по меньшей мере один внеклеточный лиганд-связывающий домен, и второй полипептид, содержащий трансмембранный домен и по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен, где полипептиды собираются вместе с образованием многоцепочечного CAR.

[0106] В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичный многоцепочечный CAR основан на высокоаффинном рецепторе IgE (FcεRI). FcεRI, экспрессируемый на тучных клетках и базофилах, запускает аллергические реакции. FcεRI представляет собой тетрамерный комплекс, состоящий из одной α-субъединицы, одной β-субъединицы и двух γ-субъединиц, связанных дисульфидной связью. α-субъединица содержит IgE-связывающий домен. β- и γ-субъединицы содержат ITAM, опосредующие передачу сигнала. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен цепи FcRα удаляют и заменяют FLT3-специфичным внеклеточным лиганд-связывающим доменом. В некоторых вариантах осуществления многоцепочечный FLT3-специфичный CAR содержит scFv, специфично связывающийся с FLT3, шарниром CD8α и ITAM цепи FcRβ. В некоторых вариантах осуществления CAR может содержать или не содержать цепь FcRγ.

[0107] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен содержит scFv, содержащий вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела, специфичного к антигену-мишени, связанные гибким линкером. Одноцепочечные вариабельные фрагменты получают путем связывания вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи с использованием коротко линкерного пептида (Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Примером линкерного пептида является GS-линкер, имеющий аминокислотную последовательность (GGGGS)₃ (SEQ ID NO: 232), который соединяет приблизительно 3,5 нм между карбокси-концом одной вариабельной области и амино-концом другой вариабельной области. Были разработаны и использованы линкеры с другими последовательностями (Bird et al., 1988, цитируемый выше). Как правило, линкеры могут представлять собой короткие гибкие полипептиды, например, состоящие приблизительно из 20 или менее аминокислотных остатков. В свою очередь, линкеры могут быть модифицированы для осуществления дополнительных функций, таких как присоединение лекарственных средств или присоединение к твердым носителям. Одноцепочечные варианты могут быть получены либо рекомбинантно, либо синтетически. Для синтетического получения scFv может быть использован автоматический синтезатор. Для рекомбинантного получения scFv подходящая плазмида, содержащая полинуклеотид, кодирующий scFv, может быть введена в подходящую клетку-хозяина, либо эукариотическую, такую как клетки дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих, либо прокариотическую, такую как E. coli. Полинуклеотиды, кодирующие представляющий интерес scFv, могут быть получены с помощью обычных манипуляций, таких как лигирование полинуклеотидов. Полученный scFv может быть выделен с использованием стандартных методов очистки белка, известных в данной области техники.

[0108] Внеклеточный домен FLT3 состоит из 5 иммуноглобулиновых доменов, причем домен 5 находится ближе всего к клеточной мембране, а домен 1 находится дальше всего (в линейном расположении; Verstraete, July 7, 2011; Blood: 118 (1)). Последовательности пяти внеклеточных доменов FLT3 приведены в таблице 1 ниже.

Таблица 1

Внеклеточный домен FLT3 № Последовательность 1 NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQA GEYLLFIQSEATNYTILFTVSIR (SEQ ID NO: 199) 2 NTLLYLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRL (SEQ ID NO: 200) 3 FTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVE (SEQ ID NO: 201) 4 KGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLN (SEQ ID NO: 202) 5 IRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDN (SEQ ID NO: 203)

[0109] Домен 2-3 содержит последовательность домена 2 и домена 3 (SEQ ID NO: 254).

[0110] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, связывается с доменом 1, 2, 3, 4 или 5 внеклеточного домена FLT3.

[0111] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, связывается с доменом 1 внеклеточного домена FLT3.

[0112] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, связывается с доменом 2 внеклеточного домена FLT3.

[0113] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, связывается с доменом 3 внеклеточного домена FLT3.

[0114] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, связывается с доменом 4 внеклеточного домена FLT3.

[0115] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, связывается с доменом 5 внеклеточного домена FLT3.

[0116] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, связывается с доменом 2-3 внеклеточного домена FLT3.

[0117] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, связывается с доменом 2-3 или 4 внеклеточного домена FLT3.

[0118] В еще одном аспекте предложен CAR, специфически связывающийся с FLT3, содержащий внеклеточный лиганд-связывающий домен, содержащий: область VH, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 или 293; и/или область VL, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 или 292. В некоторых вариантах осуществления VH и VL связаны друг с другом гибким линкером. В некоторых вариантах осуществления гибкий линкер содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 232.

[0119] В еще одном аспекте предложен FLT3-специфичный химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий внеклеточный лиганд-связывающий домен, первый трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где внеклеточный домен содержит одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv), содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где область VH содержит (i) первую определяющую комплементарность область (CDR1) VH, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 294, 295, 296, 300, 301, 305, 306, 307, 311, 312, 316, 317 или 318; (ii) вторую определяющую комплементарность область (CDR2) VH, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 297, 298, 302, 303, 308, 309, 313, 314, 319, 320 или 322; и (iii) третью определяющую комплементарность область (CDR3) VH, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 299, 304, 310, 315 или 321.

[0120] В еще одном аспекте предложен FLT3-специфичный химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий внеклеточный лиганд-связывающий домен, первый трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где внеклеточный домен содержит одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv), содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где область VL содержит (i) первую определяющую комплементарность область (CDR1) VL, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 323, 326, 328, 331, 336, 338, 340, 343, 345, 348 или 350; (ii) вторую определяющую комплементарность область (CDR2) VL, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 324, 329, 332, 334, 341 или 346; и (iii) третью определяющую комплементарность область (CDR3) VL, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 325, 327, 330, 333, 335, 337, 339, 342, 344, 347 или 349.

В еще одном аспекте предложен FLT3-специфичный химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий внеклеточный лиганд-связывающий домен, первый трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где внеклеточный домен содержит одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv), содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где (a) область VH содержит (i) первую определяющую комплементарность область (CDR1) VH, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 294, 295, 296, 300, 301, 305, 306, 307, 311, 312, 316, 317 или 318; (ii) вторую определяющую комплементарность область (CDR2) VH, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 297, 298, 302, 303, 308, 309, 313, 314, 319, 320 или 322; и (iii) третью определяющую комплементарность область (CDR3) VH, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 299, 304, 310, 315 или 321; и (b) область VL содержит (i) первую определяющую комплементарность область (CDR1) VL, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 323, 326, 328, 331, 336, 338, 340, 343, 345, 348 или 350; (ii) вторую определяющую комплементарность область (CDR2) VL, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 324, 329, 332, 334, 341 или 346; и (iii) третью определяющую комплементарность область (CDR3) VL, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 325, 327, 330, 333, 335, 337, 339, 342, 344, 347 или 349.

[0121] В некоторых вариантах осуществления CAR согласно изобретению содержит внеклеточный лиганд-связывающий домен, имеющий любую из частичных последовательностей легкой цепи, приведенных в таблице 2, и/или любую из частичных последовательностей тяжелой цепи, приведенных в таблице 2.

[0122] В таблице 2 подчеркнутые последовательности представляют собой последовательности CDR согласно Kabat, а выделенные жирным - CDR согласно Chothia, за исключением последовательностей CDR2 тяжелой цепи P4F6, P4C7, P3A1, P5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2 и P7F9, в которых последовательность CDR согласно Chothia подчеркнута, а последовательность CDR согласно Kabat выделена жирным.

[0123] В настоящей заявке также предложены части CDR антигенсвязывающих доменов антител к FLT3 или части CDR внеклеточных лиганд-связывающих доменов CAR к FLT3 (включая CDR согласно Chothia, Kabat и области контакта CDR). Определение областей CDR хорошо известно специалистам в данной области техники. Понятно, что в некоторых вариантах осуществления CDR могут представлять собой комбинацию CDR согласно Kabat и Chothia (также называемые «комбинированными CR» или «расширенными CDR»). В некоторых вариантах осуществления CDR представляют собой CDR согласно Kabat. В других вариантах осуществления CDR представляют собой CDR согласно Chothia. Другими словами, в вариантах осуществления, где присутствует более одной CDR, CDR могут быть представлять собой любые из CDR согласно Kabat, Chothia, комбинированных CDR или их комбинаций. В таблице 3 приведены примеры последовательностей CDR, предложенных в настоящей заявке.

Таблица 3

Тяжелая цепь МАТ CDRH1 CDRH2 CDRH3 P4F6 SYGIS (SEQ ID NO: 37) (Kabat);
GGTFGSY (SEQ ID NO: 38) (Chothia);
GGTFGSYGIS (SEQ ID NO: 39) (Расширенная) GIIPIFGTVTYAQKFQG (SEQ ID NO: 40) (Kabat);
IPIFGT (SEQ ID NO: 41) (Chothia) DSWSGATGASDT (SEQ ID NO: 42) P4C7 SYTIS (SEQ ID NO: 43) (Kabat);
GGTFSSY (SEQ ID NO: 44) (Chothia)
GGTFSSYTIS (Расширенная) (SEQ ID NO: 45) GIIPAFGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 46) (Kabat);
IPAFGI (SEQ ID NO: 47) (Chothia) GGSYSLDYFDI (SEQ ID NO: 48) P3A1 SYDIS (SEQ ID NO: 49) (Kabat);
GGTFSSY (SEQ ID NO: 44) (Chothia);
GGTFSSYDIS (SEQ ID NO: 50) (Расширенная) GIIPVSGRANYAQKFQG (SEQ ID NO: 51) (Kabat);
IPVSGR (SEQ ID NO: 52) (Chothia) VRPTYWPLDY (SEQ ID NO: 53) P5A3 SYYIG (SEQ ID NO: 54) (Kabat);
GGTFSSY (SEQ ID NO: 55) (Chothia);
GGTFSSYYIG (SEQ ID NO: 56) (Расширенная) GIIPWFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 57) (Kabat);
IPWFGT (SEQ ID NO: 58) (Chothia) DHHDSPSGYTSGGFDV (SEQ ID NO: 59) P9B5 SYAMS (SEQ ID NO: 60) (Kabat);
GFIFASY (SEQ ID NO: 61) (Chothia);
GFIFASYAMS (SEQ ID NO: 62) (Расширенная) EISSSGGSTTYADSVKG (SEQ ID NO: 63) (Kabat);
SSSGGS (SEQ ID NO: 64) (Chothia) DRVMAGLGYDPFDY (SEQ ID NO: 65) P9F1 SFAMS (SEQ ID NO: 66) (Kabat);
GFIFSSF (SEQ ID NO: 67) (Chothia);
GFIFSSFAMS (SEQ ID NO: 68) (Расширенная) DISGSGASTYYADSVKG (SEQ ID NO: 69) (Kabat);
SGSGAS (SEQ ID NO: 70) (Chothia) ASGGSGSYWPYMDP (SEQ ID NO: 71) P1B4 RYALS (SEQ ID NO: 72) (Kabat);
GGVFSRY (SEQ ID NO: 73) (Chothia);
GGVFSRYALS (SEQ ID NO: 74) (Расширенная) GIIPMLGFANYAQKFQG (SEQ ID NO: 75) (Kabat);
IPMLGF (SEQ ID NO: 76) (Chothia) LDFGALDY (SEQ ID NO: 77) P1B11 SFDIS (SEQ ID NO: 78) (Kabat);
GGTFRSF (SEQ ID NO: 79) (Chothia);
GGTFRSFDIS (SEQ ID NO: 80) (Расширенная) RIIPILGYANYAQKFQG (SEQ ID NO: 81) (Kabat);
IPILGY (SEQ ID NO: 82) (Chothia) DLGAPWAGYPFDP (SEQ ID NO: 83) P7H3 SYAMH (SEQ ID NO: 84) (Kabat);
GFTFSSY (SEQ ID NO: 85) (Chothia);
GFTFSSYAMH (SEQ ID NO: 86) (Расширенная) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 87) (Kabat);
SGSGGS (SEQ ID NO: 88) (Chothia) GTRWWWGDAFDH (SEQ ID NO: 89) P3E10 SYAIQ (SEQ ID NO: 90) (Kabat);
GGTFSSY (SEQ ID NO: 91) (Chothia);
GGTFSSYAIQ (SEQ ID NO: 92) (Расширенная) GIVGSWGLANYAQKFQG (SEQ ID NO: 93) (Kabat);
VGSWGL (SEQ ID NO: 94) (Chothia) SAFGELAS (SEQ ID NO: 95) P1A5 RYALS (SEQ ID NO: 96) (Kabat);
GGVFSRY (SEQ ID NO: 97) (Chothia);
GGVFSRYALS (SEQ ID NO: 98) (Расширенная) GIIPMLGFANYAQKFQG (SEQ ID NO: 99) (Kabat);
IPMLGF (SEQ ID NO: 100) (Chothia) LDFGALDY (SEQ ID NO: 101) P5F7 SYAMN (SEQ ID NO: 102) (Kabat);
GFTFSSY (SEQ ID NO: 103) (Chothia);
GFTFSSYAMN (SEQ ID NO: 104) (Расширенная) SISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 105) (Kabat);
SGGGRS (SEQ ID NO: 106) (Chothia) DLSPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: 107) P4H11 SYAMN (SEQ ID NO: 108) (Kabat);
GFTFSSY (SEQ ID NO: 109) (Chothia);
GFTFSSYAMN (SEQ ID NO: 110) (Расширенная) SISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 111) (Kabat);
SGGGRS (SEQ ID NO: 112) (Chothia) DLSPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: 113) P15F7 NYAMN (SEQ ID NO: 114) (Kabat);
GFTFNNY (SEQ ID NO: 115) (Chothia);
GFTFNNYAMN (SEQ ID NO: 116) (Расширенная) VISGSGGTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 117) (Kabat);
SGSGGT (SEQ ID NO: 118) (Chothia) GIWDLRY (SEQ ID NO: 119) P12B6 SYAIS (SEQ ID NO: 120) (Kabat);
GGTFMSY (SEQ ID NO: 121) (Chothia);
GGTFMSYAIS (SEQ ID NO: 122) (Расширенная) GIIPIFGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 123) (Kabat);
IPIFGI (SEQ ID NO: 124) (Chothia) ETLIYPIPFEL
(SEQ ID NO: 125) P8B6 SYAVS (SEQ ID NO: 126) (Kabat);
GGTFSSY (SEQ ID NO: 127) (Chothia);
GGTFSSYAVS (SEQ ID NO: 128) (Расширенная) GIIPIFGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 129) (Kabat);
IPIFGI (SEQ ID NO: 130) (Chothia) EGIGGDLRYDGYDA (SEQ ID NO: 131) P14G2 NYVMN (SEQ ID NO: 132) (Kabat);
GFTFSNY (SEQ ID NO: 133) (Chothia);
GFTFSNYVMN (SEQ ID NO: 134) (Расширенная) AISGSGATTYYADSVKG (SEQ ID NO: 135) (Kabat);
SGSGAT (SEQ ID NO: 136) (Chothia) GLWAGGI (SEQ ID NO: 137) P7F9 SYAMS (SEQ ID NO: 138) (Kabat);
GFTFSSY (SEQ ID NO: 139) (Chothia);
GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 140) (Расширенная) AIGGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 141) (Kabat);
GGSGGS (SEQ ID NO: 142) (Chothia) DYYAFSDPAYGGMDV (SEQ ID NO: 143) P08B06EE SYAVS (SEQ ID NO: 294) (Kabat);
GGTFSSY (SEQ ID NO: 295) (Chothia);
GGTFSSYAVS (SEQ ID NO: 296) (Расширенная) GIIPIFGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 297) (Kabat);
IPIFGI (SEQ ID NO: 298) (Chothia) EGIGGDLRYEGYDA (SEQ ID NO: 299) P04A04 SYYIT (SEQ ID NO: 300)
GGTFSSY (SEQ ID NO: 295) (Chothia)
GGTFSSYYIT (SEQ ID NO: 301) (Расширенная) RIMPAFGWTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 302) (Kabat)
MPAFGW (SEQ ID NO: 303) (Chothia) DEFGAFDV (SEQ ID NO: 304) P01A05 RYALS (SEQ ID NO: 305) (Kabat);
GGVFSRY (SEQ ID NO: 306) (Chothia);
GGVFSRYALS (SEQ ID NO: 307) (Расширенная) IPMLGF (SEQ ID NO: 308) (Chothia)
GGIIPMLGFANYAQKFQG (SEQ ID NO: 309) (Kabat) LDFGALDY (SEQ ID NO: 3110) P08B03 SYDIS (SEQ ID NO: 311) (Kabat);
GGTFSSY (SEQ ID NO: 295) (Chothia);
GGTFSSYDIS (SEQ ID NO: 312) (Расширенная) RIIPSFGAANYAQKFQG (SEQ ID NO: 313) (Kabat)
IPSFGA (SEQ ID NO: 314) (Chothia ) DDGEGWTPPFGY (SEQ ID NO: 315) P5F7g;
P10A02g;
P10A04g;
P10A05g;
P10A07g;
P10B03g;
P10B06g SYAMN (SEQ ID NO: 316) (Kabat);
GFTFSSY (SEQ ID NO: 317) (Chothia);
GFTFSSYAMN (SEQ ID NO: 318) (Расширенная) SISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 319) (Kabat);
SGGGRS (SEQ ID NO: 320) (Chothia) DLSPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: 321) P5F7g2;
P5F7g3 SYAMN (SEQ ID NO: 316) (Kabat);
GFTFSSY (SEQ ID NO: 317) (Chothia);
GFTFSSYAMN (SEQ ID NO: 318) (Расширенная) AISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 322) (Kabat);
SGGGRS (SEQ ID NO: 320) (Chothia) DLSPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: 321) P5F7g4 SYAMS (SEQ ID NO: 138) (Kabat);
GFTFSSY (SEQ ID NO: 317) (Chothia);
GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 140) (Расширенная) AISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 322) (Kabat);
SGGGRS (SEQ ID NO: 320) (Chothia) DLSPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: 321) Легкая цепь МАТ CDRL1 CDRL2 CDRL3 P4F6 RASHSVSSSYLA (SEQ ID NO: 144) GASSRAT (SEQ ID NO: 145) QQYGSPPRT (SEQ ID NO: 146) P4C7 RASQYVSASLLA (SEQ ID NO: 147) GASTRAT (SEQ ID NO: 148) QQYARSST (SEQ ID NO: 149) P3A1 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 150) AASSLQS (SEQ ID NO: 151) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 152) P5A3 TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 153) EVSKRPS (SEQ ID NO: 154) SSYAGSNTVV (SEQ ID NO: 155) P9B5 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO: 156) RNNQRPS (SEQ ID NO: 157) AAWDDSLSGVV (SEQ ID NO: 158) P9F1 SGSGSNIGSNYVY (SEQ ID NO: 159) RNNQRPS (SEQ ID NO: 160) AAWDGSLSRPV (SEQ ID NO: 161) P1B4 RASQSVPNEQLA (SEQ ID NO: 162) DASSRAT (SEQ ID NO: 163) QQYGSPPLT (SEQ ID NO: 164) P1B11 RASQSVSSSELA (SEQ ID NO: 165) DASSRAT (SEQ ID NO: 166) QQYDSSPLT (SEQ ID NO: 167) P7H3 GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO: 168) YDSDRPS (SEQ ID NO: 169) QVWDSSTAWV (SEQ ID NO: 170) P3E10 RASQSVPSSQLA (SEQ ID NO: 171) DASSRAT (SEQ ID NO: 172) QQYGSSPLT (SEQ ID NO: 173) P1A5 RASQAVDSSDLA (SEQ ID NO: 174) DAYTRPS (SEQ ID NO: 175) QQYGSSPLT (SEQ ID NO: 176) P5F7 RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 177) DTFTRAT (SEQ ID NO: 178) QQYGSSPPT (SEQ ID NO: 179) P4H11 RASQSVSNTYLA (SEQ ID NO: 180) DTSSRAT (SEQ ID NO: 181) QQYGSSLT (SEQ ID NO: 182) P15F7 RASQSISTYLN (SEQ ID NO: 183) AASNLQS (SEQ ID NO: 184) QQSYSIPLT (SEQ ID NO: 185) P12B6 RASQIVSSSYLA (SEQ ID NO: 186) GASSRAS (SEQ ID NO: 187) QQYGGSPYT (SEQ ID NO: 188) P8B6 RASQSVSHSYLA (SEQ ID NO: 189) GASFRAA (SEQ ID NO: 190) QQYGSDPYT (SEQ ID NO: 191) P14G2 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 192) DASDLQR (SEQ ID NO: 193) QQSYNTPWT (SEQ ID NO: 194) P7F9 TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 195) DDSDRPS (SEQ ID NO: 196) QVWDSSSDHWV (SEQ ID NO: 197) P08B06EE RASQSVSHSYLA (SEQ ID NO: 323) GASFRAA (SEQ ID NO: 324) QQYGSEPYT (SEQ ID NO: 325) P04A04 RASQSVTSSQLA (SEQ ID NO: 326) GASFRAA (SEQ ID NO: 324) QQYGSSLLIT (SEQ ID NO: 327) P01A05 RASQAVDSSDLA (SEQ ID NO: 328) DAYTRPS (SEQ ID NO: 329) QQYGSSPLT (SEQ ID NO: 330) P08B03 RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 331) DAYTRAT (SEQ ID NO: 332) QQYGSPYT (SEQ ID NO: 333) P5F7g RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 331) DTFTRAT (SEQ ID NO: 334) QQYGSSPPT (SEQ ID NO: 335) P10A02g RASQDVSDLLA (SEQ ID NO: 336) DAYTRAT (SEQ ID NO: 332) QQYASSPIT (SEQ ID NO: 337) P10A04g RASQKVSDLLA (SEQ ID NO: 338) DAYTRAT (SEQ ID NO: 332) QQYTGSPIT (SEQ ID NO: 339) P10A05g RASLSVSDLLA (SEQ ID NO: 340) DAYSRAT (SEQ ID NO: 341) QQYSSNPIT (SEQ ID NO: 342) P10A07g RASGSVSDLLA (SEQ ID NO: 343) DAYSRAT (SEQ ID NO: 341) QQYASYPIT (SEQ ID NO: 344) P10B03g RASQSVSDLLA (SEQ ID NO: 345) DAFSRAT (SEQ ID NO: 346) QQYGTPPIT (SEQ ID NO: 347) P10B06g RASESVSDLLA (SEQ ID NO: 348) DAYSRAT (SEQ ID NO: 341) QQYSASPIT (SEQ ID NO: 349) P5F7g2 RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 331) DTFTRAT (SEQ ID NO: 334) QQYGSSPPT (SEQ ID NO: 335) P5F7g3;
P5F7g4 RASQSVSSLLA (SEQ ID NO: 350) DAYTRAT (SEQ ID NO: 332) QQYTGSPIT (SEQ ID NO: 339)

[0124] Изобретение охватывает модификации CAR и полипептидов согласно изобретению, приведенных в таблице 2, включая функционально эквивалентные CAR, имеющие модификации, не оказывающие существенного влияния на их свойства, и варианты, имеющие повышенную или сниженную активность и/или аффинность. Например, аминокислотная последовательность может быть мутирована для получения антитела с желаемой аффинностью связывания с FLT3. Модификация полипептидов является обычной практикой в данной области техники и не нуждается в подробном описании в настоящей заявке. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, одной или более делециями или добавлениями аминокислот, не вызывающими значительных отрицательных изменений функциональной активности, или развивающими (усиливающими) аффинность полипептида к его лиганду, или применение химических аналогов.

[0125] Инсерции в аминокислотную последовательность включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примеры концевых инсерций включают антитело с N-концевым метионильным остатком или антитело, слитое с эпитопной меткой. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние с N- или C-концом антитела фермента или полипептида, увеличивающих период полужизни антитела в кровотоке.

[0126] В вариантах с заменой в молекуле антитела по меньшей мере один аминокислотный остаток удален, а другой остаток вставлен на его место. Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают гипервариабельные области, но также рассматриваются изменения FR. Консервативные замены приведены в таблице 4 под заголовком «консервативные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены более существенные изменения, обозначенные как «иллюстративные замены» в таблице 4, или как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислот, и продукты могут быть подвергнуты скринингу.

Таблица 4: аминокислотные замены

Исходный остаток
(природная аминокислота) Консервативные замены Иллюстративные замены Ala (A) Val Val; Leu; Ile Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn Asn (N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg Asp (D) Glu Glu; Asn Cys (C) Ser Ser; Ala Gln (Q) Asn Asn; Glu Glu (E) Asp Asp; Gln Gly (G) Ala Ala His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; Норлейцин Leu (L) Ile Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; Ile Phe (F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr; Phe Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин

[0127] В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке предложен CAR, содержащий внеклеточный лиганд-связывающий домен, связывающийся с FLT3 и конкурирующий за связывание с FLT3 с CAR, описанным в настоящей заявке, включая CAR, содержащий внеклеточный домен, содержащий P4F6, P4C7, P3A1, P5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2, P7F9, P08B06EE, P04A04, P01A05, P08B03, P5F7g, P10A02g, P10A04g, P10A05g, P10A07g, P10B03g, P10B06g, P5F7g2, P5F7g3 и P5F7g4.

[0128] В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке предложен CAR, специфически связывающийся с FLT3, где CAR содержит область VH, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4; и/или область VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке предложен CAR, специфически связывающийся с FLT3, где CAR содержит область VH, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6; и/или область VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к CAR, специфически связывающемуся с FLT3, где CAR содержит область VH, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10; и/или область VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке предложен CAR, специфически связывающийся с FLT3, где CAR содержит область VH, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20; и/или область VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19.

[0129] В некоторых вариантах осуществления изобретение также относится к CAR, содержащим части CDR антител к анти-FLT3 антителам на основе областей контакта CDR. Области контакта CDR представляют собой области антитела, наделяющие его специфичностью к антигену. Как правило, области контакта CDR включают положения остатков в CDR и зонах Вернье, конформационная свобода которых ограничена для поддержания надлежащей петлевой структуры, чтобы антитело связывало конкретный антиген. См., например, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2007. Определение областей контакта CDR хорошо известно специалистам в данной области техники.

[0130] Аффинность связывания (K_D) лиганд-связывающего домена FLT3-специфичного CAR, как описано в настоящей заявке, с FLT3 (таким как человеческий FLT3 (например, (SEQ ID NO: 198)), может составлять, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1000 нМ, например, от приблизительно 0,5 до приблизительно 500 нМ или, например, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 250 нМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания равна любой из приблизительно 1000 нМ, 750 нМ, 500 нМ, 400 нМ, 300 нМ, 250 нМ, 200 нМ, 100 нМ, 90 нМ, 80 нМ, 70 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 45 нМ, 40 нМ, 35 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 19 нМ, 18 нМ, 17 нМ, 16 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 7,5 нМ, 7 нМ, 6,5 нМ, 6 нМ, 5,5 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,3 нМ или 0,1 нМ.

[0131] В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания (K_D) scFv лиганд-связывающего домена FLT3-специфичного CAR, как описано в настоящей заявке, с FLT3, составляет от приблизительно 10 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 90 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 80 нМ, от приблизительно 20 нМ до приблизительно 70 нМ, от приблизительно 25 нМ до приблизительно 75 нМ или от приблизительно 40 нМ до приблизительно 110 нМ. В одном из вариантов осуществления аффинности связывания scFv, описанные в данном абзаце, относятся к человеческому FLT3.

[0132] В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания (K_D) scFv лиганд-связывающего домена FLT3-специфичного CAR, как описано в настоящей заявке, с доменом 4 внеклеточного домена человеческой FLT3 составляет от приблизительно 1 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 20 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 25 нМ до приблизительно 105 нМ, от приблизительно 40 нМ до приблизительно 80 нМ, от приблизительно 40 нМ до приблизительно 100 нМ или от приблизительно 50 нМ до приблизительно 100 нМ.

[0133] В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания (K_D) scFv лиганд-связывающего домена FLT3-специфичного CAR, как описано в настоящей заявке, с доменом 2-3 внеклеточного домена человеческой FLT3 составляет от приблизительно 5 нМ до приблизительно 30 нМ, от приблизительно 5 нМ до приблизительно 25 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 30 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 40 нМ или от приблизительно 10 нМ до приблизительно 25 нМ.

[0134] В иллюстративном варианте осуществления K_D ScFv измерена, как описано в примере 1.

[0135] В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания составляет менее чем приблизительно 1000 нМ, 900 нМ, 800 нМ, 250 нМ, 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 7,5 нМ, 7 нМ, 6,5 нМ, 6 нМ, 5 нМ.

Эпитопы, специфичные к моноклональным антителам

[0136] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен любого из FLT3-специфичных CAR, раскрытых в настоящей заявке, может содержать один или более эпитопов, специфичных к моноклональному антителу (т. е., специфически распознаваемых им). Эти эпитопы в настоящей заявке также называются МАТ-специфичными эпитопами. В этих вариантах осуществления внеклеточный домен содержит полипептиды VH и VL, специфически связывающиеся с FLT3, и один или более эпитопов, связывающихся с одним или более моноклональными антителами (МАТ). CAR, содержащие МАТ-специфичные эпитопы, могут быть одноцепочечными или многоцепочечными.

[0137] Включение эптиопов, специфичных к моноклональным антителам, во внеклеточный домен CAR, описанных в настоящей заявке, позволяет отбирать и элиминировать сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие указанные CAR. В некоторых вариантах осуществления эта особенность также способствует восстановлению эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3, элиминированных путем введения сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих указанные CAR.

[0138] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу сортировки и/или элиминации сконструированных иммунных клеток, наделенных CAR, содержащими МАТ-специфичные эпитопы, и способу стимуляции восстановления эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3, таких как клетки-предшественники костного мозга.

[0139] Для создания CAR, содержащих эпитопы, специфичные к моноклональному антителу, может быть использовано несколько пар эпитоп-моноклональное антитело; в частности, уже одобренных для медицинского применения, таких как, в качестве неограничивающего примера, эпитоп CD20/ритуксимаб.

[0140] В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, специфичное к эпитопу, может быть конъюгировано с цитотоксическим лекарственным средством. Также возможно усилить цитотоксичность CDC с помощью сконструированных антител с привитым(и) компонентом(ами) системы комплемента. В некоторых вариантах осуществления активация T-клеток с CAR может быть модулирована путем элиминации клеток с использованием антитела, распознающего эпитоп.

[0141] Изобретение также охватывает способы отбора сконструированных иммунных клеток, наделенных FLT3-специфичными CAR, экспрессирующими МАТ-специфичный(ые) эпитоп(ы), и терапевтические способы, где активация сконструированных иммунных клеток, наделенных этими CAR, модулируется путем элиминации клеток с использованием антитела, нацеленного на внешний лиганд-связывающий домен указанных CAR.

[0142] CAR, содержащие один или более эпитопов, специфически распознаваемых моноклональным антителом, раскрыты в заявке WO2016/120216, полностью включенной в настоящую заявку посредством ссылки. Эпитоп может быть выбран из любого числа эпитопов, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления эпитоп может представлять собой мишень моноклонального антитела, одобренного для медицинского применения, такой как, например, не ограничиваясь перечисленным, эпитоп CD20, распознаваемый ритуксимабом. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 229.

CPYSNPSLC (SEQ ID NO: 229)

[0143] В некоторых вариантах осуществления эпитоп может быть расположен между scFv и шарниром CAR. В некоторых вариантах осуществления в CAR могут быть использованы два экземпляра одного и того же эпитопа, разделенные линкерами. Например, полипептид, содержащий 2 копии эпитопа, представленного в SEQ ID NO: 229, разделенных линкерами, как представлено в gsggggscpysnpslcsggggscpysnpslcsggggs (SEQ ID NO: 230), может быть использован в CAR между вариабельной областью легкой цепи и шарниром.

[0144] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный связывающий домен CAR, содержащий полипептиды VH и VL и МАТ-специфичный(ые) эпитоп(ы), может иметь различные структуры в зависимости от положения вставленного эпитопа и использования линкеров. Например, внеклеточный связывающий домен FLT3-специфичного CAR, содержащий МАТ-специфичные эпитопы, может иметь одну из следующих структур:

V₁-L₁-V₂-(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-;

V₁-L₁-V₂-(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-;

V₁-L₁-V₂-(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-Эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

Эпитоп1-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-Эпитоп3-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x;

(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-Эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-Эпитоп3-(L)_x-Эпитоп4-(L)_x-;

(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-Эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-Эпитоп3-(L)_x-Эпитоп4-(L)_x-;

V₁-(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-V₂;

V₁-(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x;

V₁-(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-Эпитоп3-(L)_x;

V₁-(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-Эпитоп3-(L)_x-Эпитоп4-(L)_x;

(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-V₂; or,

(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-V₂-(L)_x-Эпитоп3-(L)_x;

где

V₁ представляет собой V_L, и V₂ представляет собой V_H, или V₁ представляет собой V_H, и V₂ представляет собой V_L;

L₁ представляет собой линкер, подходящий для связывания цепи V_H с цепью V_L;

L представляет собой линкер, содержащий остатки глицина и серина, и каждый L во внеклеточном связывающем домене может быть идентичным или отличаться от другого L в том же внеклеточном связывающем домене, например, SGGGG, GGGGS или SGGGGS, и

х равен 0 или 1, и каждый х выбран независимо от других; и

Эпитоп 1, Эпитоп 2, Эпитоп 3 и Эпитоп 4 представляют собой МАТ-специфичные эпитопы и могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления Эпитоп 1, Эпитоп 2 и Эпитоп 4 представляют собой МАТ-специфичный эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 229, и Эпитоп 3 представляет собой МАТ-специфичный эпитоп, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 231.

[0145] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный связывающий домен CAR содержит следующую последовательность

V₁-L₁-V₂-(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-; или

(L)_x-Эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-Эпитоп2-(L)_x-Эпитоп3-(L)_x-Эпитоп4-(L)_x-, где V_1, V_2, L_1, L, x и Эпитоп 1, Эпитоп 2, Эпитоп 3 и Эпитоп 4 являются такими, как определено выше.

[0146] В некоторых вариантах осуществления любой из FLT3-специфичных CAR, раскрытых в настоящей заявке, может содержать один или более МАТ-специфичных эпитопов, выбранных из эпитопа CD52, эпитопа CD20, эпитопа CD3, эпитопа CD41, эпитопа CD25, эпитопа CD30, эпитопа EGFR, эпитопа TNFα, эпитопа VEGF, эпитопа белка комплемента С5, эпитопа CD11a, эпитопа CD33, эпитопа интегрина альфа-4, эпитопа Fc-области IgE, эпитопа F-белка RSV, эпитопа рецептора IL-6, эпитопа рецептора HER2, эпитопа интегрина α₄β₇, эпитопа BAFF (фактора активации B-клеток), эпитопа IL-1β, эпитопа RANKL, эпитопа CTLA4, эпитопа CD34, эпитопа IL-12 и/или эпитопа IL-23.

[0147] В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичные CAR, раскрытые в настоящей заявке, могут содержать один или более МАТ-специфичных эпитопов, выбранных из эпитопов, специфично распознаваемых алемтузумабом, ибритумомабом тиуксетаном, муромонабом-CD3, тозитумомабом, абциксимабом, базиликсимабом, брентуксимабом ведотином, цетуксимабом, инфликсимабом, ритуксимабом, бевацизумабом, цертолизумабом пеголом, даклизумабом, экулизумабом, эфализумабом, гемтузумабом, натализумабом, омализумабом, паливизумабом, ранибизумабом, тоцилизумабом, трастузумабом, ведолизумабом, адалимумабом, белимумабом, канакинумабом, деносумабом, голимумабом, ипилимумабом, офатумумабом, панитумумабом, QBEND-10 и/или устекинумабом.

[0148] В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичные CAR содержат один или более МАТ-специфичных эпитопов, выбранных из эпитопов, раскрытых в таблице 5:

Таблица 5: Примеры МАТ-специфичных эпитопов, которые могут применяться во внеклеточном связывающем домене FLT3-специфичных CAR согласно изобретению, таких как, например, мимотопы и эпитопы с их соответствующими МАТ

Ритуксимаб Мимотоп SEQ ID NO: 229 CPYSNPSLC Паливизумаб Эпитоп SEQ ID NO: 255 NSELLSLINDMPITNDQKKLMSNN Цетуксимаб Мимотоп 1 SEQ ID NO: 256 CQFDLSTRRLKC Мимотоп 2 SEQ ID NO: 257 CQYNLSSRALKC Мимотоп 3 SEQ ID NO: 258 CVWQRWQKSYVC Мимотоп 4 SEQ ID NO: 259 CMWDRFSRWYKC Ниволумаб Эпитоп 1 SEQ ID NO: 260 SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR Эпитоп 2 SEQ ID NO:261 SGTYLCGAISLAPKAQIKE QBEND-10 Эпитоп SEQ ID NO: 262 ELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTA Алемтузумаб Эпитоп SEQ ID NO: 263 GQNDTSQTSSPS

[0149] Внутриклеточный сигнальный домен CAR согласно изобретению отвечает за внутриклеточную передачу сигналов после связывания внеклеточного лиганд-связывающего домена с мишенью, что приводит к активации иммунной клетки и иммунному ответу. Внутриклеточный сигнальный домен обладает способностью активировать по меньшей мере одну из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которой экспрессируется CAR. Например, эффекторная функция Т-клетки может представлять собой цитолитическую или хелперную активность, включая секрецию цитокинов.

[0150] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен для применения в CAR может представлять собой цитоплазматические последовательности, например, не ограничиваясь перечисленным, T-клеточного рецептора и корецепторов, которые действуют совместно, инициируя передачу сигнала после связывания антигенного рецептора, а также любые производное или вариант этих последовательностей и любую синтетическую последовательность, имеющую аналогичные функциональные возможности. Внутриклеточные сигнальные домены включают два разных класса цитоплазматических сигнальных последовательностей: последовательности, инициирующие первичную антиген-зависимую активацию, и последовательности, действующие антиген-независимым образом, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности могут содержать сигнальные мотивы, известные как активирующие мотивы иммунорецептора на основе тирозина, ITAM. ITAM представляют собой хорошо охарактеризованные сигнальные мотивы, обнаруженные в интрацитоплазматическом хвосте множества рецепторов, которые служат сайтами связывания для тирозинкиназ класса syk/zap70. Примеры ITAM, используемых в изобретении, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, ITAM, происходящие из TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3Δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать сигнальный домен CD3ζ, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 70%, например, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 210. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR согласно изобретению содержит домен костимулирующей молекулы.

[0151] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR согласно изобретению содержит часть костимулирующей молекулы, выбранную из группы, состоящей из фрагмента 41BB (GenBank: AAA53133.) и CD28 (NP_006130.1). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 209 и SEQ ID NO: 213. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 209 и SEQ ID NO: 214.

[0152] CAR экспрессируются на поверхностной мембране клетки. Таким образом, CAR может содержать трансмембранный домен. Подходящие трансмембранные домены для CAR, раскрытого в настоящей заявке, обладают способностью (a) экспрессироваться на поверхности клетки, например, иммунной клетки, такой как, например, не ограничиваясь перечисленным, лимфоциты или естественные киллеры (NK), и (b) взаимодействовать с лиганд-связывающим доменом и внутриклеточным сигнальным доменом для направления клеточного ответа иммунной клетки против заданной клетки-мишени. Трансмембранный домен может происходить либо из природного, либо из синтетического источника. Трансмембранный домен может происходить из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. В качестве неограничивающих примеров трансмембранный полипептид может представлять собой субъединицу Т-клеточного рецептора, такую как α, β, γ или Δ, полипептид, составляющий комплекс CD3, рецептор IL-2 p55 (a-цепь), p75 (β-цепь) или γ-цепь, цепь субъединицы Fc-рецепторов, в частности, Fcγ-рецептор III, или белки CD. В качестве альтернативы, трансмембранный домен может быть синтетическим и может содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых вариантах осуществления указанный трансмембранный домен происходит из α-цепи человеческого CD8 (например, NP_001139345.1).

[0153] Трансмембранный домен связан с внеклеточным лиганд-связывающим доменом посредством стеблевого домена (также называемого шарнирным доменом). Стеблевой домен может содержать вплоть до 300 аминокислот, например, от 10 до 100 аминокислот или от 25 до 50 аминокислот. Стеблевая область может происходить из всей или части встречающейся в природе молекулы, например, из всей или часть внеклеточной области CD8, CD4 или CD28, или из всей или части константной области антитела. В качестве альтернативы, стеблевой домен может представлять собой синтетическую последовательность, соответствующую встречающейся в природе стеблевой последовательности, или может представлять собой полностью синтетическую стеблевую последовательность. В некоторых вариантах осуществления указанный стеблевой домен представляет собой часть α-цепи человеческого CD8 (например, NP_001139345.1). В еще одном частном варианте осуществления указанные трансмембранные и шарнирные домены содержат часть α-цепи человеческого CD8, например, которая является по меньшей мере на 70% или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 206 и 208. В некоторых вариантах осуществления стеблевой домен FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, содержит шарнир CD8α, шарнир IgG1 или шарнир FcγRIIIα. В некоторых вариантах осуществления стеблевой домен содержит шарнир человеческого CD8α, шарнир человеческого IgG1 или шарнир человеческого FcγRIIIα. В некоторых вариантах осуществления CAR, раскрытые в настоящей заявке, могут содержать внеклеточный лиганд-связывающий домен, специфически связывающий FLT3, шарнирный и трансмембранный домены человеческого CD8α, сигнальный домен CD3ζ и сигнальный домен 4-1BB.

[0154] В таблице 6 приведены иллюстративные последовательности доменов, которые могут быть использованы в CAR, раскрытых в настоящей заявке.

Таблица 6: Иллюстративные последовательности компонентов CAR

Домен Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: Сигнальный пептид CD8α MALPVTALLLPLALLLHAARP 204 Шарнир FcγRIIIα GLAVSTISSFFPPGYQ 205 Шарнир CD8α TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD 206 Шарнир IgG1 EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 207 Трансмембранный (ТМ) домен CD8α IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC 208 Внутриклеточный сигнальный домен (ISD) 41BB KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 209 Внутриклеточный сигнальный домен (ISD) CD3ζ RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 210 FcεRI α-TM-IC (трансмембранный и внутриклеточный домен α-цепи FcεRI) FFIPLLVVILFAVDTGLFISTQQQVTFLLKIKRTRKGFRLLNPHPKPNPKNN 211 FcεRIβ-ΔITAM (β-цепь FcεRI без ITAM) MDTESNRRANLALPQEPSSVPAFEVLEISPQEVSSGRLLKSASSPPLHTWLTVLKKEQEFLGVTQILTAMICLCFGTVVCSVLDISHIEGDIFSSFKAGYPFWGAIFFSISGMLSIISERRNATYLVRGSLGANTASSIAGGTGITILIINLKKSLAYIHIHSCQKFFETKCFMASFSTEIVVMMLFLTILGLGSAVSLTICGAGEELKGNKVPE 212 41BB-IC (костимулирующий домен 41BB) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 213 CD28-IC (костимулирующий домен CD28) RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS 214 FcεRIγ-SP (сигнальный пептид) MIPAVVLLLLLLVEQAAA 215 FcεRI γ-ΔITAM (γ-цепь FcεRI без ITAM) LGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKS 216 GSG-P2A (полипептид GSG-P2A рибосомального пропуска) GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP 217 GSG-T2A (полипептид GSG-T2A рибосомального пропуска) GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP 218

[0155] В раковых клетках обычно наблюдается подавление или мутация антигенов-мишеней, что создает варианты ускользания от иммунной системы с потерей антигена. Таким образом, чтобы компенсировать ускользание опухоли от иммунной системы и сделать иммунную клетку более специфичной к мишени, FLT3-специфичный CAR может содержать один или более дополнительных внеклеточных лиганд-связывающих доменов, чтобы одновременно связывать разные элементы в мишени, тем самым увеличивая активацию и функцию иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления внеклеточные лиганд-связывающие домены могут быть размещены один за другим на одном и том же трансмембранном полипептиде, и необязательно могут быть разделены линкером. В некоторых вариантах осуществления указанные разные внеклеточные лиганд-связывающие домены могут быть размещены на разных трансмембранных полипептидах, составляющих CAR. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к популяции CAR, каждый из которых содержит отличающийся внеклеточный лиганд-связывающий домен. В частности, изобретение относится к способу конструирования иммунных клеток, включающему обеспечение иммунной клетки и экспрессию на поверхности клетки популяции CAR, каждый из которых содержит разные внеклеточные лиганд-связывающие домены. В еще одном конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу конструирования иммунной клетки, включающему обеспечение иммунной клетки и введение в указанную клетку полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, составляющие популяцию CAR, каждый из которых содержит разные внеклеточные лиганд-связывающие домены. Под популяцией CAR подразумевают по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть или более CAR, каждый из которых содержит разные внеклеточные лиганд-связывающие домены. Разные внеклеточные лиганд-связывающие домены согласно изобретению могут, например, одновременно связывать разные элементы в мишени, тем самым увеличивая активацию и функцию иммунных клеток. Изобретение также относится к выделенной иммунной клетке, содержащей популяцию CAR, каждый из которых содержит разные внеклеточные лиганд-связывающие домены.

[0156] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложены полинуклеотиды, кодирующие любые из CAR и полипептидов, описанных в настоящей заявке. Полинуклеотиды могут быть получены и экспрессированы методами, известными в данной области техники.

[0157] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложены композиции (такие как фармацевтические композиции), содержащие любую из клеток согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит клетку, содержащую полинуклеотид, кодирующий любой из CAR, описанных в настоящей заявке. В других вариантах осуществления композиция содержит один из или оба полинуклеотида, представленных в SEQ ID NO: 245 и SEQ ID NO: 246 ниже:

Вариабельная область тяжелой цепи P3E10

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCAGGCAGCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCGGCACATTCTCTAGCTACGCCATCCAGTGGGTGCGGCAGGCACCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGTGGGAAGCTGGGGCCTGGCAAACTACGCCCAGAAGTTTCAGGGCAGAGTGACCATCACCACCGATAAGTCTACAAGCACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCTCTGAGGTCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCACCTCCGCCTTCGGCGAGCTGGCATCTTGGGGACAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCC (SEQ ID NO: 245)

Вариабельная область легкой цепи P3E10

GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCAGGCACCCTGTCCCTGTCTCCAGGAGAGAGGGCCACACTGTCCTGTAGGGCCAGCCAGTCCGTGCCTTCTAGCCAGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCTATGACGCCTCCTCTAGAGCCACAGGCATCCCAGATAGGTTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACACTGACCATCTCCAGGCTGGAGCCCGAGGATTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTACGGCAGCTCCCCTCTGACATTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGG (SEQ ID NO: 246)

[0158] В других вариантах осуществления композиция содержит один из или оба полинуклеотида, представленных в SEQ ID NO: 247 и SEQ ID NO: 248 ниже:

Вариабельная область тяжелой цепи P3A1

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCAGCGGCGGCACATTCTCTAGCTACGATATCTCTTGGGTGAGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGAGGAATCATCCCCGTGAGCGGAAGGGCAAACTACGCACAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATCACCACAGACAAGTCCACATCTACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCTCTGAGAAGCGAGGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGAGTGAGGCCTACCTACTGGCCACTGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCC (SEQ ID NO: 247)

Вариабельная область легкой цепи P3A1

GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCTAGCCTGAGCGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACAATCACCTGTAGGGCCTCTCAGAGCATCTCCTCTTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCAGCAAGCTCCCTGCAGTCCGGAGTGCCATCTCGGTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACAGACTTTACACTGACCATCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGTCCTATTCTACACCACTGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 248).

[0159] В других вариантах осуществления композиция содержит один из или оба полинуклеотида, представленных в SEQ ID NO: 249 и SEQ ID NO: 250 ниже:

Вариабельная область тяжелой цепи P9B5

GAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGAGCTGCGCAGCATCCGGCTTCATCTTTGCCTCTTACGCAATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGAGCGAGATCAGCTCCTCTGGCGGCAGCACCACATATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACAATCAGCCGGGACAACTCTAAGAATACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGAGATAGAGTGATGGCCGGCCTGGGCTATGACCCATTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCC (SEQ ID NO: 249).

Вариабельная область легкой цепи P9B5

CAGAGCGTGCTGACCCAGCCACCTTCCGCCTCTGGAACACCCGGCCAGAGGGTGACCATCAGCTGTTCCGGCTCTAGCTCCAACATCGGCTCCAATTACGTGTATTGGTACCAGCAGCTGCCCGGCACAGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGAAACAATCAGAGGCCATCTGGCGTGCCCGACCGCTTCTCTGGCAGCAAGTCCGGCACCTCTGCCAGCCTGGCAATCAGCGGACTGCGGTCCGAGGACGAGGCCGATTACTATTGCGCAGCATGGGACGATTCCCTGTCTGGAGTGGTGTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGACCGTGCTG (SEQ ID NO: 250).

[0160] В других вариантах осуществления композиция содержит один из или оба полинуклеотида, представленных в SEQ ID NO: 251 и SEQ ID NO: 252 ниже:

Вариабельная область тяжелой цепи P4C7

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGCAGCTCCGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCAGCGGCGGCACATTCTCTAGCTACACCATCTCCTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGAGGAATCATCCCAGCCTTCGGCATCGCCAACTACGCCCAGAAGTTTCAGGGCCGCGTGACAATCACCGCCGACAAGTCCACATCTACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGGAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAAGGGCGGCAGCTACTCCCTGGACTATTTTGATATCTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCC (SEQ ID NO: 251)

Вариабельная область легкой цепи P4C7

GAGATCGTGCTGACACAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGAGCCCAGGCGAGAGGGCCACACTGTCCTGTAGGGCATCTCAGTACGTGTCCGCCTCTCTGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCCCCAAGACTGCTGATCTACGGAGCATCCACAAGAGCCACCGGCATCCCCGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCTCTGGAACCGACTTCACCCTGACCATCTCTAGACTGGAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTATGCCAGGTCTAGCACATTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 252)

[0161] В настоящей заявке также описаны векторы экспрессии и введение композиций полинуклеотидов.

[0162] В еще одном аспекте в настоящей заявке предложен способ получения любого из полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке.

[0163] Полинуклеотиды, комплементарные любой из таких последовательностей, также охватываются изобретением. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой молекулы ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают молекулы гяРНК (гетерогенной ядерной РНК), содержащие интроны и соответствующие молекуле ДНК один-к-одному, и молекулы мРНК, не содержащие интронов. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не обязательно должны, присутствовать в полинуклеотиде согласно изобретению, и полинуклеотид может, но не обязательно должен, связываться с другими молекулами и/или материалами носителя.

[0164] Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (то есть, эндогенную последовательность, кодирующую антитело или его часть) или могут содержать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотидов содержат одну или более замен, добавлений, делеций и/или инсерций, так что иммунореактивность кодируемого полипептида не уменьшается по сравнению с нативной иммунореактивной молекулой. Влияние на иммунореактивность кодируемого полипептида в целом можно оценить, как описано в настоящей заявке. Варианты обычно демонстрируют по меньшей мере приблизительно 70% идентичность или по меньшей мере приблизительно 80% идентичность, или даже по меньшей мере приблизительно 90% или 95% идентичность полинуклеотидной последовательности, кодирующей нативное антитело или его часть.

[0165] Считается, что две полинуклеотидные или полипептидные последовательности являются «идентичными», если последовательность нуклеотидов или аминокислот в этих двух последовательностях одинакова при выравнивании для максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения между двумя последовательностями обычно выполняют путем сравнения последовательностей в пределах окна сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей. «Окно сравнения» в контексте настоящей заявки относится к сегменту из по меньшей мере приблизительно 20 смежных положений, обычно от 30 до приблизительно 75 или от 40 до приблизительно 50, в котором последовательность может быть сравнена с референсной последовательностью из такого же числа смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей.

[0166] Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено с использованием программы Megalign в наборе программного обеспечения для биоинформатики Lasergene (DNASTAR, Inc., Мадисон, Висконсин) с использованием параметров по умолчанию. Эта программа включает в себя несколько схем выравнивания, описанных в следующих источниках: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. в Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

[0167] Как правило, «процент идентичности последовательностей» определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в пределах окна сравнения из по меньшей мере 20 положений, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (то есть, гэпы) в количестве 20 процентов или менее, обычно от 5 до 15 процентов или от 10 до 12 процентов, по сравнению с референсными последовательностями (не содержащими добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых в обеих последовательностях присутствуют идентичные основания нуклеиновой кислоты или аминокислотные остатки, с получением количества совпадающих положений, деления количества совпадающих положений на общее количество положений в референсной последовательности (т. е., размер окна сравнения) и умножения результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей.

[0168] Варианты могут также, или альтернативно, быть по существу гомологичными нативному гену, или его части или комплементу. Такие полинуклеотидные варианты способны гибридизоваться в умеренно жестких условиях с природной последовательностью ДНК, кодирующей нативное антитело (или комплементарную последовательность).

[0169] Подходящие «умеренно жесткие условия» включают предварительную промывку в растворе 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ ЭДТА (pH 8,0); гибридизацию при 50-65°С, 5 х SSC, в течение ночи; с последующей промывкой дважды при 65°C в течение 20 минут каждым из 2X, 0,5X и 0,2X SSC, содержащим 0,1% SDS.

[0170] В контексте настоящей заявки термин «высокожесткие условия» или «условия высокой жесткости» представляют собой такие, при которых: (1) для промывки используют низкую ионную силу и высокую температуру, например, 0,015 М хлорида натрия/0,0015 М цитрата натрия/0,1% додецилсульфата натрия при 50°С; (2) в ходе используют гибридизации денатурирующий агент, такой как формамид, например, 50 об.% формамида с 0,1% бычьего сывороточного альбумина/0,1% фиколла/0,1% поливинилпирролидона/50 мМ натрий-фосфатного буфера при рН 6,5 с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°С; или (3) используют 50% формамида, 5 х SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5 х раствора Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% декстрансульфата при 42°C, с промывкой при 42°C в 0,2 x SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамида при 55°C с последующей промывкой при высокой жесткости с помощью 0,1 х SSC, содержащего ЭДТА, при 55°C. Специалисту в данной области техники будет ясно, как регулировать температуру, ионную силу и т. д. по мере необходимости для адаптации к таким факторам, как длина зонда и тому подобное.

[0171] Кроме того, специалистам в данной области техники будет ясно, что вследствие вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, как описано в настоящей заявке. Некоторые из этих полинуклеотидов обладают минимальной гомологией с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее, полинуклеотиды, которые варьируются из-за различий в использовании кодонов, специально предусмотрены изобретением. Кроме того, аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности, предложенные в настоящей заявке, входят в объем изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, измененные в результате одной или более мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но не обязательно должны, иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей в базе данных).

[0172] Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть получены с использованием химического синтеза, рекомбинантных методов или ПЦР. Способы химического синтеза полинуклеотидов хорошо известны в данной области техники и не требуют подробного описания в настоящей заявке. Специалист в данной области техники может использовать предложенные в настоящей заявке последовательности и коммерчески доступный синтезатор ДНК для получения желаемой последовательности ДНК.

[0173] Для получения полинуклеотидов с использованием рекомбинантных методов полинуклеотид, содержащий желаемую последовательность, может быть вставлен в подходящий вектор, а вектор, в свою очередь, может быть введен в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации, как обсуждается далее в настоящей заявке. Полинуклеотиды могут быть введены в клетки-хозяева любым способом, известным в данной области техники. Клетки трансформируют путем введения экзогенного полинуклеотида путем прямого поглощения, эндоцитоза, трансфекции, F-спаривания или электропорации. После введения экзогенный полинуклеотид может поддерживаться внутри клетки в виде неинтегрированного вектора (такого как плазмида) или интегрироваться в геном клетки-хозяина. Амплифицированный таким образом полинуклеотид может быть выделен из клетки-хозяина способами, хорошо известными в данной области техники. См., например, Sambrook et al., 1989.

[0174] В качестве альтернативы, ПЦР позволяет воспроизводить последовательности ДНК. Технология ПЦР хорошо известна в данной области техники и описана в патентах США №№ 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 и 4,683,202, а также в источнике PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

[0175] РНК можно получить, используя выделенную ДНК в подходящем векторе и вставляя ее в подходящую клетку-хозяина. Когда клетка реплицируется и ДНК транскрибируется в РНК, РНК может быть выделена с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, как, например, изложено в источнике Sambrook et al., 1989, цитируемом выше.

[0176] Подходящие векторы клонирования могут быть сконструированы в соответствии со стандартными методиками или могут быть выбраны из большого числа векторов клонирования, доступных в данной области техники. Хотя выбранный вектор клонирования может варьироваться в зависимости от клетки-хозяина, которую предполагается использовать, пригодные векторы клонирования, как правило, будут обладать способностью к саморепликации, могут иметь одну мишень для конкретной рестрикционной эндонуклеазы и/или могут нести гены маркера, который может быть использован при отборе клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18, pUC19, Bluescript (например, pBS SK+) и его производные, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, фаговые ДНК и челночные векторы, такие как pSA3 и pAT28. Эти и многие другие векторы клонирования доступны от коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Strategene и Invitrogen.

[0177] Векторы экспрессии обычно представляют собой реплицируемые полинуклеотидные конструкции, содержащие полинуклеотид согласно изобретению. Подразумевается, что вектор экспрессии должен быть реплицируемым в клетках-хозяевах либо в виде эписом, либо в виде части, интегрированной в хромосомную ДНК. Подходящие векторы экспрессии включают, не ограничиваясь перечисленным, плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и вектор(ы) экспрессии, раскрытые в публикации заявки PCT № WO 87/04462. Компоненты вектора могут, как правило, включать, не ограничиваясь перечисленным, одно или более из следующего: сигнальную последовательность; точку начала репликации; один или более маркерных генов; подходящие элементы контроля транскрипции (такие как промоторы, энхансеры и терминаторы). Для экспрессии (т. е., трансляции) обычно также требуется один или более элементов контроля трансляции, таких как сайты связывания рибосомы, сайты инициации трансляции и стоп-кодоны.

[0178] Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяина любым из ряда подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, ДЭАЭ-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфицирование (например, где вектор представляет собой инфекционный агент, такой как вирус осповакцины). Выбор вводимых векторов или полинуклеотидов часто будет зависеть от особенностей клетки-хозяина.

[0179] Полинуклеотид, кодирующий FLT3-специфичный CAR, раскрытый в настоящей заявке, может существовать в кассете экспрессии или в векторе экспрессии (например, плазмиде для введения в бактериальную клетку-хозяина или в вирусном векторе, таком как бакуловирусный вектор, для трансфекции клетки-хозяина насекомого, или плазмиде или вирусном векторе, таком как лентивирус, для трансфекции клетки-хозяина млекопитающего). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид или вектор может включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательности рибосомального пропуска, такие как, например, не ограничиваясь перечисленным, последовательность, кодирующая пептид 2А. Пептиды 2A, которые были обнаружены в подгруппе афтовирусов пикорнавирусов, вызывают рибосомальный «пропуск» при переходе от одного кодона к следующему без образования пептидной связи между двумя аминокислотами, кодируемыми кодонами (см. (Donnelly and Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008)). Под «кодоном» подразумевается три нуклеотида на мРНК (или на смысловой цепи молекулы ДНК), которые транслируются рибосомой в один аминокислотный остаток. Таким образом, два полипептида могут быть синтезированы из одной непрерывной открытой рамки считывания в мРНК, когда полипептиды разделены последовательностью олигопептида 2А, которая находится в рамке. Такие механизмы рибосомального пропуска хорошо известны в данной области техники и, как известно, используются рядом векторов для экспрессии нескольких белков, кодируемых одной матричной РНК.

[0180] Чтобы направить трансмембранные полипептиды в секреторный путь клетки-хозяина, в некоторых вариантах осуществления в полинуклеотидной последовательности или векторной последовательности обеспечена секреторная сигнальная последовательность (также известная как лидерная последовательность, препропоследовательность или предпоследовательность). Указанная секреторная сигнальная последовательность функционально связана с трансмембранной последовательностью нуклеиновой кислоты, то есть, две последовательности соединены в правильной рамке считывания и расположены так, чтобы направлять вновь синтезированный полипептид в секреторный путь клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены с 5'-конца относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые секреторные сигнальные последовательности могут быть расположены в других местахе представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты (см., например, Welch et al., патент США № 5,037,743; Holland et al., патент США № 5,143,830). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 204 или 215. Специалистам в данной области техники будет ясно, что ввиду вырожденности генетического кода в последовательностях этих молекул полинуклеотидов возможны значительные вариации. В некоторых вариантах последовательности нуклеиновых кислот согласно изобретению кодон-оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих, например, для экспрессии в клетках приматов (например, человека или обезьяны). Оптимизация состава кодонов относится к обмену в представляющей интерес последовательности кодонов, которые, как правило, редки в высокоэкспрессируемых генах данного вида, на кодоны, которые обычно часто встречаются в высокоэкспрессируемых генах таких видов, где такие кодоны кодируют те же аминокислоты, что и заменяемые кодоны.

Способы конструирования иммунной клетки

[0181] В настоящей заявке предложены способы получения иммунных клеток для применения в иммунотерапии. В некоторых вариантах осуществления указанные способы включают получение иммунных клеток, введение CAR согласно изобретению в иммунные клетки и размножение клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу конструирования иммунной клетки, включающему: обеспечение клетки и экспрессию на поверхности указанной клетки по меньшей мере одного CAR, как описано выше. Способы конструирования иммунных клеток описаны, например, в публикациях патентных заявок PCT №№ WO/2014/039523, WO/2014/184741, WO/2014/191128, WO/2014/184744 и WO/2014/184143, каждая из которых полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления способ включает: трансфекцию клетки по меньшей мере одним полинуклеотидом, кодирующим CAR, как описано выше, и экспрессию полинуклеотидов в клетке.

[0182] До конструирования клеток от субъекта может быть получен их источник с помощью множества неограничивающих способов. Клетки могут быть получены из ряда источников, включая, не ограничиваясь перечисленным, мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань вилочковой железы, ткань из очага инфекции, асцит, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах осуществления может быть использовано любое количество Т-клеточных линий, доступных и известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть получены от здорового донора или от донора, страдающего от заболевания или нарушения, например, от индивидуума, у которого диагностирован рак, или от индивидуума, у которого диагностирована инфекция. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть частью смешанной популяции клеток, имеющих разные фенотипические характеристики.

[0183] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды представлены в лентивирусных векторах для стабильной экспрессии в клетках.

[0184] В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать стадию генетической модификации клетки путем нарушения или инактивации по меньшей мере одного гена, экспрессирующего, например, не ограничиваясь перечисленным, компонент TCR, мишень для иммуносупрессивного агента, ген HLA и/или белок иммунной контрольной точки, такой как, например, PDCD1 или CTLA-4. Под нарушением или инактивацией гена подразумевается, что представляющий интерес ген не экспрессируется в форме функционального белка. В некоторых вариантах осуществления ген, подлежащий нарушению или инактивации, выбран из группы, состоящей, например, не ограничиваясь перечисленным, из TCRα, TCRβ, CD52, глюкокортикоидного рецептора (GR), дезоксицитидинкиназы (DCK), PD-1 и CTLA-4. В некоторых вариантах осуществления указанный способ включает инактивацию одного или более генов путем введения в клетки редкощепящей эндонуклеазы, способной селективно инактивировать ген путем селективного расщепления ДНК. В некоторых вариантах осуществления редкощепящая эндонуклеаза может представлять собой, например, эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (нуклеазу TALE), или эндонуклеазу Cas9.

[0185] В некоторых вариантах осуществления с редкощепящей эндонуклеазой используют дополнительный каталитический домен для повышения ее способности инактивировать гены-мишени. Например, дополнительный каталитический домен может представлять собой фермент, осуществляющий процессинг концов ДНК. Неограничивающие примеры ферментов, осуществляющих процессинг концов ДНК, включают 5-3'-экзонуклеазы, 3-5'-экзонуклеазы, 5-3'-щелочные экзонуклеазы, 5'-флэп-эндонуклеазы, хеликазы, фосфатазы, гидролазы и независимые от матрицы ДНК-полимеразы. Неограничивающие примеры такого каталитического домена включают белковый домен или каталитически активное производное белкового домена, выбранное из группы, состоящей из hExoI (EXO1_HUMAN), ExoI дрожжей (EXO1_YEAST), E. coli ExoI, человеческого TREX2, мышиного TREX1, человеческого TREX1, бычьего TREX1, крысиного TREX1, TdT (терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы), человеческого DNA2, DNA2 дрожжей (DNA2_YEAST). В некоторых вариантах осуществления дополнительный каталитический домен может обладать 3'-5'-экзонуклеазной активностью, а в некоторых вариантах осуществления указанный дополнительный каталитический домен представляет собой TREX, например каталитический домен TREX2 (WO2012/058458). В некоторых вариантах указанный каталитический домен кодируется одноцепочечным полипептидом TREX. Дополнительный каталитический домен может быть слит с нуклеазным слитым белком или химерным белком. В некоторых вариантах осуществления дополнительный каталитический домен слит с помощью, например, пептидного линкера.

[0186] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию введения в клетки экзогенной нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере последовательность, гомологичную части последовательности целевой нуклеиновой кислоты, так что между последовательностью целевой нуклеиновой кислоты и экзогенной нуклеиновой кислотой происходит гомологичная рекомбинация. В некоторых вариантах осуществления указанная экзогенная нуклеиновая кислота содержит первую и вторую части, гомологичные 5'- и 3'-области целевой последовательности нуклеиновой кислоты, соответственно. Экзогенная нуклеиновая кислота может также содержать третью часть, расположенную между первой и второй частью, не имеющую гомологии с 5'- и 3'-областями последовательности целевой нуклеиновой кислоты. После расщепления последовательности целевой нуклеиновой кислоты стимулируется событие гомологичной рекомбинации между последовательностью целевой нуклеиновой кислоты и экзогенной нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления в донорской матрице могут быть использованы гомологичные последовательности, состоящие по меньшей мере из приблизительно 50 п.н., более чем приблизительно 100 п.н. или более чем приблизительно 200 п.н. Экзогенная нуклеиновая кислота может состоять из, например, не ограничиваясь перечисленным, от приблизительно 200 п. н. до приблизительно 6000 п. н., например, от приблизительно 1000 п. н. до приблизительно 2000 п. н. Общие гомологии нуклеиновых кислот расположены в областях, фланкирующих место разрыва в 3'-5'- и 5'-3'-направлении, а вводимая последовательность нуклеиновой кислоты расположена между двумя плечами.

[0187] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота последовательно содержит первую область гомологии с последовательностями в 3'-5'-направлении от указанного расщепления; последовательность для инактивации гена-мишени, выбранного из группы, состоящей из TCRα, TCRβ, CD52, глюкокортикоидного рецептора (GR), дезоксицитидинкиназы (DCK) и белка иммунной контрольной точки, такого как, например, белок программируемой смерти-1 (PD-1); и второй участок гомологии с последовательностями в 5'-3'-направлении от расщепления. Стадия введения полинуклеотида может быть осуществлена одновременно, до или после введения или экспрессии редкощепящей эндонуклеазы. В зависимости от местоположения целевой последовательности нуклеиновой кислоты, в которой произошло событие разрыва, такая экзогенная нуклеиновая кислота может быть использована для нокаута гена, например, когда экзогенная нуклеиновая кислота расположена в открытой рамке считывания гена, или для введения новых представляющих интерес последовательностей или генов. Вставки последовательностей с использованием такой экзогенной нуклеиновой кислоты могут быть использованы для модификации существующего гена-мишени путем коррекции или замены гена (в качестве неограничивающего примера можно привести аллельный обмен), или для повышения или снижения экспрессии гена-мишени (в качестве неограничивающего примера можно привести обмен промоторами), коррекции или замены гена-мишени. В некоторых вариантах осуществления инактивация гена, выбранного из группы, состоящей из TCRα, TCRβ, CD52, GR, DCK и белков иммунной контрольной точки, может быть осуществлена в точном месте в геноме, на которое нацелена специфическая нуклеаза TALE, где указанная специфическая нуклеаза TALE катализирует расщепление, и где экзогенная нуклеиновая кислота последовательно содержит по меньшей мере область гомологии и последовательность для инактивации одного гена-мишени, выбранного из группы, состоящей из TCRα, TCRβ, CD52, GR, DCK, белков иммунной контрольной точки, которая интегрирована посредством гомологичной рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления несколько генов могут быть последовательно или одновременно инактивированы с использованием соответственно нескольких нуклеаз TALE и специфического нацеливания на один определенный ген и несколько конкретных полинуклеотидов для специфической инактивации генов.

[0188] В некоторых вариантах осуществления способ включает инактивацию одного или более дополнительных генов, выбранных из группы, состоящей из TCRα, TCRβ, CD52, GR, DCK и белков иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах осуществления инактивация гена может быть достигнута путем введения в клетки по меньшей мере одной редкощепящей эндонуклеазы, так что редкощепящая эндонуклеаза специфически катализирует расщепление в последовательности-мишени клеточного генома; и, необязательно, введение в клетки экзогенной нуклеиновой кислоты, последовательно содержащей первую область гомологии последовательностям в 3'-5'-направлении от расщепления, последовательность, подлежащую вставке в клеточный геном, и вторую область гомологии последовательностям в 5'-3'-направлении от расщепления; где введенная экзогенная нуклеиновая кислота инактивирует ген и интегрирует по меньшей мере одну экзогенную полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес рекомбинантный белок. В некоторых вариантах осуществления экзогенная полинуклеотидная последовательность интегрирована в ген, кодирующий белок, выбранный из группы, состоящей из TCRα, TCRβ, CD52, GR, DCK и белка иммунной контрольной точки.

[0189] В еще одном аспекте стадия генетической модификации клеток может включать: модификацию Т-клеток путем инактивации по меньшей мере одного гена, экспрессирующего мишень для иммуносупрессивного агента, и размножение клеток, необязательно в присутствии иммуносупрессивного агента. Иммуносупрессивный агент представляет собой агент, подавляющий функцию иммунной системы посредством одного из нескольких механизмов действия. Иммуносупрессивный агент может снизить степень и/или агрессивность иммунного ответа. Неограничивающие примеры иммуносупрессивных агентов включают ингибиторы кальциневрина, мишени рапамицина, блокаторы α-цепи интерлейкина-2, ингибиторы инозинмонофосфатдегидрогеназы, ингибиторы дигидрофолат-редуктазы, кортикостероиды и иммуносупрессивные антиметаболиты. Некоторые цитотоксические иммуносупрессивные агенты действуют путем ингибирования синтеза ДНК. Другие могут действовать посредством активации Т-клеток или путем ингибирования активации T-хелперов. Способы согласно изобретению позволяют придавать Т-клеткам для иммунотерапии устойчивость к иммуносупрессивным агентам путем инактивации мишени иммуносупрессивного агента в Т-клетках. В качестве неограничивающих примеров, мишенями для иммуносупрессивного агента могут служить рецептор иммуносупрессивного агента, такой как, например, не ограничиваясь перечисленным, CD52, глюкокортикоидный рецептор (GR), члены семейства генов FKBP и члены семейства генов циклофилина.

[0190] В некоторых вариантах осуществления генетическая модификация способа включает экспрессию в обеспеченных для конструирования клетках одной редкощепящей эндонуклеазы, так что указанная редкоцепящая эндонуклеаза специфически катализирует расщепление в одном гене-мишени, тем самым инактивируя ген-мишень. В некоторых вариантах осуществления способ конструирования клеток включает по меньшей мере одну из следующих стадий: обеспечение Т-клетки, например, из клеточной культуры или из образца крови; выбор гена в указанной Т-клетке, экспрессирующего мишень для иммуносупрессивного агента; введение в указанную Т-клетку редкощепящей эндонуклеазы, способной к селективной инактивации путем расщепления ДНК, например, путем инициирования двухцепочечного разрыва гена, кодирующего мишень для иммуносупрессивного агента, и размножение клеток, необязательно в присутствии иммуносупрессивного агента.

[0191] В некоторых вариантах осуществления способ включает: обеспечение Т-клетки, например, из клеточной культуры или из образца крови; выбор гена в указанной Т-клетке, экспрессирующего мишень для иммуносупрессивного агента; трансфекцию указанной Т-клетки нуклеиновой кислотой, кодирующей редкощепящую эндонуклеазу, способную к селективной инактивации путем расщепления ДНК, например, инициирования двухцепочечного разрыва гена, кодирующего мишень для иммуносупрессивного агента, и экспрессию редкощепящих эндонуклеаз в указанных Т-клетках; и размножение клеток, необязательно в присутствии иммуносупрессивного агента.

[0192] В некоторых вариантах осуществления редкощепящая эндонуклеаза специфически нацелена на CD52 или GR. В некоторых вариантах осуществления ген, выбранный для инактивации, кодирует CD52, а лечение иммуносупрессивным агентом включает гуманизированное антитело, нацеленное на антиген CD52. В некоторых вариантах осуществления ген, выбранный для инактивации, кодирует GR, а лечение иммуносупрессивным агентом включает кортикостероид, такой как дексаметазон. В некоторых вариантах осуществления ген, выбранный для инактивации, представляет собой член семейства генов FKBP или его вариант, и лечение иммуносупрессивным агентом включает FK506, также известный как такролимус или фуджимицин. В некоторых вариантах осуществления член семейства генов FKBP представляет собой FKBP12 или его вариант. В некоторых вариантах осуществления ген, выбранный для инактивации, представляет собой член семейства генов циклофилина или его вариант, и лечение иммуносупрессивным агентом включает циклоспорин.

[0193] В некоторых вариантах осуществления редкощепящая эндонуклеаза может представлять собой, например, мегануклеазу, нуклеазу с цинковыми пальцами или нуклеазу TALE (TALEN). В некоторых вариантах осуществления редкощепящая эндонуклеаза представляет собой нуклеазу TALE.

[0194] В настоящей заявке также предложены способы конструирования Т-клеток, подходящих для иммунотерапии, включающие: генетическую модификацию Т-клеток путем инактивации по меньшей мере белка иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах осуществления белок иммунной контрольной точки представляет собой, например, PD-1 и/или CTLA-4. В некоторых вариантах осуществления способы генетической модификации клетки включают: модификацию Т-клеток путем инактивации по меньшей мере одного белка иммунной контрольной точки; и размножение клеток. Белки иммунной контрольной точки включают, не ограничиваясь перечисленным, белок программируемой смерти-1 (PD-1, также известный как PDCD1 или CD279, идентификационный номер: NM-005018), цитотоксический T-лимфоцитарный антиген 4 (CTLA-4, также известный как CD152, идентификационный номер GenBank AF414120.1), LAG3 (также известный как CD223, идентификационный номер: NM-002286.5), Tim3 (также известный как HAVCR2, идентификационный номер GenBank: JX049979.1), BTLA (также известный как CD272, идентификационный номер: NM-181780.3), BY55 (также известный как CD160, идентификационный номер GenBank: CR541888.1), TIGIT (также известный как VSTM3, идентификационный номер: NM-173799), B7H5 (также известный как C10orf54, гомолог мышиного гена vista, идентификационный номер: NM-022153.1), LAIR1 (также известный как CD305, идентификационный номер GenBank: CR542051.1), SIGLEC10 (идентификационный номер GeneBank: AY358337.1), 2B4 (также известный как CD244, идентификационный номер: NM-001166664.1), которые напрямую ингибируют иммунные клетки. Например, CTLA-4 представляет собой белок клеточной поверхности, экспрессируемый на отдельных CD4 и CD8 Т-клетках; при связывании его лигандов (В7-1 и В7-2) с антигенпрезентирующими клетками ингибируются активация и эффекторная функция Т-клеток.

[0195] В некоторых вариантах осуществления указанный способ конструирования клеток включает по меньшей мере одну из следующих стадий: обеспечение Т-клетки, например, из клеточной культуры или из образца крови; введение в указанную Т-клетку редкощепящей эндонуклеазы, способной к селективной инактивации путем расщепления ДНК, например, путем инициирования двухцепочечного разрыва одного гена, кодирующего белок иммунной контрольной точки; и размножение клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает: обеспечение Т-клетки, например, из клеточной культуры или из образца крови; трансфекцию указанной Т-клетки нуклеиновой кислотой, кодирующей редкощепящую эндонуклеазу, способную к селективной инактивации путем расщепления ДНК, например, путем инициирования двухцепочечного разрыва гена, кодирующего белок иммунной контрольной точки; экспрессию редкощепящих эндонуклеаз в указанных Т-клетках; размножение клеток. В некоторых вариантах осуществления редкощепящая эндонуклеаза специфически нацелена на ген, выбранный из группы, состоящей из PD-1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCRα и TCRβ. В некоторых вариантах осуществления редкощепящая эндонуклеаза может представлять собой мегануклеазу, нуклеазу с цинковыми пальцами или нуклеазу TALE. В некоторых вариантах осуществления редкощепящая эндонуклеаза представляет собой нуклеазу TALE.

[0196] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение может быть особенно подходящим для аллогенной иммунотерапии. В таких вариантах осуществления клетки могут быть модифицированы способом, включающим: инактивацию по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR) в Т-клетках; и размножение Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления генетическая модификация способа основана на экспрессии в обеспеченных для конструирования клетках одной редкощепящей эндонуклеазы, так что указанная редкоцепящая эндонуклеаза специфически катализирует расщепление в одном гене-мишени, тем самым инактивируя ген-мишень. В некоторых вариантах осуществления указанный способ конструирования клеток включает по меньшей мере одну из следующих стадий: обеспечение Т-клетки, например, из клеточной культуры или из образца крови; введение в указанную Т-клетку редкощепящей эндонуклеазы, способной к селективной инактивации путем расщепления ДНК, например, путем инициирования двухцепочечного разрыва по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент T-клеточного рецептора (TCR), и размножение клеток.

[0197] В некоторых вариантах осуществления способ включает: обеспечение Т-клетки, например, из клеточной культуры или из образца крови; трансфекцию указанной Т-клетки нуклеиновой кислотой, кодирующей редкощепящую эндонуклеазу, способную к селективной инактивации путем расщепления ДНК, например, путем инициирования двухцепочечного разрыва по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент T-клеточного рецептора (TCR); экспрессию редкощепящих эндонуклеаз в указанных T-клетках; отбор трансформированных T-клеток, не экспрессирующих TCR на своей клеточной поверхности; и размножение клеток.

[0198] В некоторых вариантах осуществления редкощепящая эндонуклеаза может представлять собой мегануклеазу, нуклеазу с цинковыми пальцами или нуклеазу TALE. В некоторых вариантах осуществления редкощепящая эндонуклеаза представляет собой нуклеазу TALE. В некоторых вариантах осуществления нуклеазы TALE распознают и расщепляют последовательность, кодирующую TCRα или TCRβ. В некоторых вариантах осуществления нуклеаза TALE содержит полипептидную последовательность, выбранную из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 или 226.

Полипептидные последовательности нуклеазы TALE:

Повтор TRAC_T01-L

LTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 219).

Повтор TRAC_T01-R

LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 220).

Повтор TRBC_T01-L

LTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 221).

Повтор TRBC_T01-R

NPQRSTVWYLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 222).

Повтор TRBC_T02-L

LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 223).

Повтор TRBC_T02-R

LTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 224).

Повтор CD52_T02-L

LTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 225).

Повтор CD52_T02-R

LTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 226).

[0199] В еще одном аспекте еще одна стадия генетической модификации клетки может представлять собой способ размножения T-клеток с дефицитом TCRα, включающий введение в T-клетку pTα (также известного как преTCRα) или его функционального варианта и размножение клеток, необязательно посредством стимуляции комплекса CD3. В некоторых вариантах осуществления способ включает: a) трансфекцию клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере фрагмент pTα для поддержания поверхностной экспрессии CD3; b) экспрессию указанного pTα в клетках; и c) размножение клеток, необязательно путем стимуляции комплекса CD3.

[0200] Также предложены способы получения Т-клеток для иммунотерапии, включающие стадии способа размножения Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная последовательность pTα может быть введена случайным образом или путем гомологичной рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления вставка может быть связана с инактивацией гена TCRα.

[0201] Могут быть использованы различные функциональные варианты pTα. «Функциональный вариант» пептида относится к молекуле, по существу схожей либо со всем пептидом, либо с его фрагментом. «Фрагмент» pTα или его функционального варианта относится к любому сокращенному варианту молекулы, то есть, более короткому пептиду, чем полноразмерный pTα. В некоторых вариантах осуществления pTα или функциональные варианты могут представлять собой, например, полноразмерный pTα или усеченную по C-концу версию pTα. Усеченный по С-концу pTα лишен одного или более остатков на С-конце. В качестве неограничивающих примеров у усеченной по С-концу версии pTα отсутствует 18, 48, 62, 78, 92, 110 или 114 остатков на С-конце белка. Варианты аминокислотной последовательности пептида могут быть получены посредством мутаций в ДНК, кодирующей пептид. Такие функциональные варианты включают, например, делеции, или инсерции, или замены остатков в аминокислотной последовательности. Также может быть осуществлена любая комбинация делеции, инсерции и замены для достижения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желаемой активностью, в частности, восстановлением функционального комплекса CD3. В иллюстративном варианте осуществления в различные версии pTα вводят по меньшей мере одну мутацию, как описано выше, чтобы влиять на димеризацию. В качестве неограничивающего примера, мутированный остаток может представлять собой по меньшей мере W46R, D22A, K24A, R102A или R117A человеческого белка pTα или положения в члене семейства pTα или гомологичном члене, полученные путем выравнивания с использованием метода CLUSTALW. Например, pTα или его вариант, как описано выше, содержит мутированный остаток W46R или мутированные остатки D22A, K24A, R102A и R117A. В некоторых вариантах осуществления указанный pTα или варианты также слиты с доменом, передающим сигнал, таким как, в качестве неограничивающих примеров, CD28, OX40, ICOS, CD27, CD137 (4-1BB) и CD8. Внеклеточный домен pTα или вариантов, как описано выше, могут быть слиты с фрагментом белка TCRα, в частности, с трансмембранным и внутриклеточным доменом TCRα. Варианты pTα также могут быть слиты с внутриклеточным доменом TCRα.

[0202] В некоторых вариантах осуществления версии pTα могут быть слиты с внеклеточным лиганд-связывающим доменом. В некоторых вариантах осуществления pTα или его функциональный вариант слит с одноцепочечным фрагментом (scFv) антитела, содержащим легкий и тяжелый вариабельный фрагмент моноклонального антигена, специфичного к антителу-мишени, связанные гибким линкером.

[0203] Термин «T-клетка с дефицитом TCRα» относится к выделенной T-клетке, не экспрессирующей функциональную α-цепь TCR. Это может быть достигнуто различными способами, в качестве неограничивающих примеров, путем конструирования Т-клетки таким образом, чтобы она не экспрессировала какой-либо функциональный TCRα на своей клеточной поверхности, или путем конструирования Т-клетки таким образом, чтобы она продуцировала очень малое количество функциональной цепи TCRα на своей поверхности, или путем конструирования Т-клетки для экспрессии мутированной или усеченной формы α-цепи TCR. Клетки с дефицитом TCRα утрачивают возможность размножаться при участии комплекса CD3. Таким образом, чтобы преодолеть эту проблему и обеспечить пролиферацию клеток с дефицитом TCRα, в клетки вводят pTα или его функциональный вариант, таким образом восстанавливая функциональный комплекс CD3. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение в указанные Т-клетки редкощепящих эндонуклеаз, способных к селективной инактивации путем расщепления ДНК одного гена, кодирующего один компонент Т-клеточного рецептора (TCR). В некоторых вариантах осуществления редкощепящая эндонуклеаза представляет собой нуклеазу TALE.

[0204] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие полипептиды согласно настоящему изобретению, могут представлять собой мРНК, которую вводят непосредственно в клетки, например, путем электропорации. В некоторых вариантах осуществления для временной пермеабилизации живых клеток для доставки в них материала может быть использована технология cytoPulse. Параметры могут быть изменены, чтобы определить условия для высокой эффективности трансфекции с минимальной смертностью.

[0205] В настоящей заявке также предложены способы трансфекции Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления способ включает: приведение Т-клетки в контакт с РНК и применение к Т-клетке последовательности быстрых импульсов, состоящей из: (a) электрического импульса с диапазоном напряжений от приблизительно 2250 до 3000 В на сантиметр; (b) длительности импульса 0,1 мс; (c) импульсного интервала между импульсами электрического тока на стадиях (а) и (b) приблизительно от 0,2 до 10 мс; (d) электрического импульса с диапазоном напряжений от приблизительно 2250 до 3000 В с длительностью импульса приблизительно 100 мс и импульсным интервалом приблизительно 100 мс между электрическим импульсом на стадии (b) и первым электрическим импульсом на стадии (c); и (e) четырех электрических импульсов с напряжением приблизительно 325 В с длительностью импульса приблизительно 0,2 мс и импульсным интервалом 2 мс между каждым из 4 электрических импульсов. В некоторых вариантах осуществления способ трансфекции Т-клетки включает приведение Т-клетки в контакт с РНК и применение к Т-клетке последовательности быстрых импульсов, содержащей: (a) электрический импульс с напряжением приблизительно 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 или 3000 В на сантиметр; (b) длительность импульса 0,1 мс; (c) и импульсный интервал приблизительно 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мс между электрическими импульсами на стадиях (a) и (b); (d) один электрический импульс с диапазоном напряжений от приблизительно 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 или 3000 В с длительностью импульса 100 мс и импульсным интервалом 100 мс между электрическим импульсом на стадии (b) и первым электрическим импульсом на стадии (c); и (e) 4 электрических импульса с напряжением приблизительно 325 В с длительностью импульса приблизительно 0,2 мс и импульсным интервалом приблизительно 2 мс между каждым из 4 электрических импульсов. Любые значения, включенные в диапазон значений, описанный выше, раскрыты в настоящей заявке. Среда для электропорации может представлять собой любую подходящую среду, известную в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления среда для электропорации имеет проводимость в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 1,0 миллиСименс.

[0206] В некоторых вариантах осуществления, в качестве неограничивающих примеров, РНК кодирует редкощепящую эндонуклеазу, один мономер редкощепящей эндонуклеазы, такой как половина нуклеазы TALE, CAR, по меньшей мере один компонент многоцепочечного химерного антигенного рецептора, pTα или его функциональный вариант, экзогенную нуклеиновую кислоту и/или один дополнительный каталитический домен.

Сконструированные иммунные клетки

[0207] Изобретение также относится к сконструированным иммунным клеткам, содержащим любой из полинуклеотидов CAR, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления CAR может быть введен в иммунную клетку в виде трансгена посредством плазмидного вектора. В некоторых вариантах осуществления плазмидный вектор также может содержать, например, маркер отбора, обеспечивающий идентификацию и/или отбор клеток, получивших вектор.

[0208] Полипептиды CAR могут быть синтезированы in situ в клетке после введения в клетку полинуклеотидов, кодирующих полипептиды CAR. В качестве альтернативы, полипептиды CAR могут быть получены вне клеток и затем введены в клетки. Способы введения полинуклеотидной конструкции в клетки известны в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления для интеграции полинуклеотидной конструкции в клеточный геном могут быть использованы способы стабильной трансформации. В других вариантах осуществления для временной экспрессии полинуклеотидной конструкции могут быть использованы способы временной трансформации, а полинуклеотидная конструкция может быть не интегрирована в клеточный геном. В других вариантах осуществления могут быть использованы вирус-опосредованные способы. Полинуклеотиды могут быть введены в клетку любым подходящим способом, таким как, например, рекомбинантные вирусные векторы (например, ретровирусы, аденовирусы), липосомы и тому подобное. Способы временной трансформации включают, например, не ограничиваясь перечисленным, микроинъекцию, электропорацию или бомбардировку частицами. Полинуклеотиды могут быть включены в векторы, такие как, например, плазмидные векторы или вирусные векторы.

[0209] В настоящей заявке также предложены выделенные клетки и клеточные линии, полученные описанными выше способами конструирования клеток, предложенных в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка содержит по меньшей мере один CAR, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка содержит популяцию CAR, где каждый CAR содержит разные внеклеточные лиганд-связывающие домены.

[0210] В настоящей заявке также предложены выделенные иммунные клетки, полученные согласно любому из описанных выше способов. Для экспрессии представляющего интерес CAR может быть использована любая иммунная клетка, способная экспрессировать гетерологичные ДНК. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка, используемая для экспрессии любого из CAR, описанных в настоящей заявке, представляет собой T-клетку. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка, используемая для экспрессии CAR, может происходить, например, не ограничиваясь перечисленным, из стволовой клетки. Стволовые клетки могут представлять собой взрослые стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки нечеловеческого происхождения, более конкретно, стволовые клетки нечеловеческого происхождения, стволовые клетки пуповинной крови, клетки-предшественники, стволовые клетки костного мозга, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, тотипотентные стволовые клетки или гемопоэтические стволовые клетки. Иллюстративными стволовыми клетками человека являются клетки CD34+.

[0211] В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей поверхностной клеточной мембране FLT3-специфичный CAR согласно изобретению, содержат процентную долю стволовых клеток памяти и клеток центральной памяти, превышающую 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или 60%. В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей поверхностной клеточной мембране FLT3-специфичный CAR согласно изобретению, содержат процентную долю стволовых клеток памяти и клеток центральной памяти от приблизительно 10% до приблизительно 60%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 10% до приблизительно 40%, от приблизительно 15% до приблизительно 50%, от приблизительно 15% до приблизительно 40%, от приблизительно 20% до приблизительно 60% или от приблизительно 20% до приблизительно 70%.

[0212] В некоторых вариантах осуществления процентную долю стволовых клеток памяти и клеток центральной памяти измеряют, как описано в примере 2d.

[0213] Иммунная клетка, используемая для экспрессии любого из CAR, описанных в настоящей заявке, также может представлять собой дендритную клетку, дендритную клетку-киллер, тучную клетку, NK-клетку, B-клетку или T-клетку, выбранную из группы, состоящей из воспалительных T-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хелперных Т-лимфоцитов. В некоторых вариантах осуществления клетка может происходить из группы, состоящей из CD4+ T-лимфоцитов и CD8+ T-лимфоцитов.

[0214] В одном из вариантов осуществления иммунная клетка представляет собой воспалительный Т-лимфоцит, экспрессирующий любой из CAR, описанных в настоящей заявке. В одном из вариантов осуществления иммунная клетка представляет собой цитотоксический Т-лимфоцит, экспрессирующий любой из CAR, описанных в настоящей заявке. В одном из вариантов осуществления иммунная клетка представляет собой регуляторный Т-лимфоцит, экспрессирующий любой из CAR, описанных в настоящей заявке. В одном из вариантов осуществления иммунная клетка представляет собой хелперный Т-лимфоцит, экспрессирующий любой из CAR, описанных в настоящей заявке.

[0215] В настоящей заявке также предложены клеточные линии, полученные из трансформированной Т-клетки согласно любому из описанных выше способов. В настоящей заявке также предложены модифицированные клетки, устойчивые к иммуносупрессивному лечению. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка согласно изобретению содержит полинуклеотид, кодирующий CAR.

[0216] Иммунные клетки согласно изобретению могут быть активированы и размножены либо до, либо после генетической модификации Т-клеток с использованием способов, в целом описанных, например, не ограничиваясь перечисленным, в патентах США №№ 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; и публикации заявки на патент США № 20060121005. Т-клетки могут быть размножены in vitro или in vivo. Как правило, Т-клетки согласно изобретению могут быть размножены, например, путем приведения в контакт с агентом, стимулирующим комплекс CD3-TCR и костимулирующую молекулу на поверхности Т-клеток, создавая активирующий сигнал для Т-клетки. Например, для создания активирующего сигнала для T-клетки могут быть использованы химические вещества, такие как ионофор кальция A23187, форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) или митогенные лектины, такие как фитогемагглютинин (PHA).

[0217] В некоторых вариантах осуществления популяции Т-клеток могут быть стимулированы in vitro путем приведения в контакт с, например, антителом к CD3 или его антигенсвязывающим фрагментом, или антителом к CD2, иммобилизованным на поверхности, или путем приведения в контакт с активатором протеинкиназы C (например, бриостатином) в комбинации с ионофором кальция. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток используют лиганд, связывающий вспомогательную молекулу. Например, популяция Т-клеток может быть приведена в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации Т-клеток. Условия, подходящие для культивирования Т-клеток, включают подходящие среды (например, минимальные питательные среды или среды RPMI 1640 или X-vivo 5 (Lonza)), которые могут содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку (например, эмбриональную бычью или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFp и TNF, или любые другие добавки для роста клеток, известные специалисту в данной области техники. Другие добавки для роста клеток включают, не ограничиваясь перечисленным, поверхностно-активное вещество, плазманат и восстановители, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут включать RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a- MEM, F-12, X-Vivo 1 и X-Vivo 20, Optimizer, с добавками аминокислот, пирувата натрия и витаминов, бессывороточные либо с добавками подходящего количества сыворотки (или плазмы) или определенного набора гормонов, и/или количества цитокина(ов), достаточного для роста и размножения Т-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, а не в культуры клеток, предназначенные для введения субъекту. Клетки-мишени поддерживают в условиях, необходимых для поддержания роста, например, при подходящей температуре (например, 37°C) и атмосфере (например, воздух и 5% CO₂). Т-клетки, подвергнутые стимуляции в течение различного времени, могут демонстрировать разные характеристики.

[0218] В некоторых вариантах осуществления клетки согласно изобретению могут быть размножены путем совместного культивирования с тканью или клетками. Клетки также могут быть размножены in vivo, например, в крови субъекта после введения клетки субъекту.

[0219] В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка согласно настоящему изобретению содержит один инактивированный ген, выбранный из группы, состоящей из CD52, GR, PD-1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, HLA, TCRα и TCRβ, и/или экспрессирует CAR, многоцепочечный CAR и/или трансген pTα. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка содержит полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, содержащие многоцепочечный CAR. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка согласно настоящему изобретению содержит два инактивированных гена, выбранных из группы, состоящей из: CD52 и GR, CD52 и TCRα, CDR52 и TCRβ, GR и TCRα, GR и TCRβ, TCRα и TCRβ, PD-1 и TCRα, PD-1 и TCRβ, CTLA-4 и TCRα, CTLA-4 и TCRβ, LAG3 и TCRα, LAG3 и TCRβ, Tim3 и TCRα, Tim3 и TCRβ, BTLA и TCRα, BTLA и TCRβ, BY55 и TCRα, BY55 и TCRβ, TIGIT и TCRα, TIGIT и TCRβ, B7H5 и TCRα, B7H5 и TCRβ, LAIR1 и TCRα, LAIR1 и TCRβ, SIGLEC10 и TCRα, SIGLEC10 и TCRβ, 2B4 и TCRα, 2B4 и TCRβ, и/или экспрессирует CAR, многоцепочечный CAR и трансген pTα.

[0220] В некоторых вариантах осуществления TCR делают нефункциональным в клетках согласно изобретению путем инактивации гена TCRα и/или гена(ов) TCRβ. В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения модифицированных клеток, полученных от индивидуума, где клетки могут пролиферировать независимо от сигнального пути главного комплекса гистосовместимости (ГКГС). Модифицированные клетки, которые могут пролиферировать независимо от сигнального пути ГКГС, подходящие для получения этим способом, включены в объем настоящего изобретения. Раскрытые в настоящей заявке модифицированные клетки могут быть использованы для лечения нуждающихся в этом индивидуумов от реакции отторжения трансплантата (HvG) и реакции «трансплантат против хозяина» (GvHD); поэтому в объем настоящего изобретения входит способ лечения нуждающихся в этом индивидуумов от реакции отторжения трансплантата (HvG) и реакции «трансплантат против хозяина» (GvHD), включающий лечение указанного индивидуума путем введения указанному индивидууму эффективного количества модифицированных клеток, включающих инактивированные гены TCRα и/или TCRβ.

[0221] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки сконструированы так, чтобы они были устойчивыми к одному или более химиотерапевтическим препаратам. Химиотерапевтический препарат может представлять собой, например, аналог пуринового нуклеотида (PNA). Тем самым иммунную клетку делают пригодной для лечения рака при сочетании адоптивной иммунотерапии и химиотерапии. Примеры PNA включают, например, клофарабин, флударабин и цитарабин, по отдельности или в комбинации. PNA метаболизируются дезоксицитидинкиназой (dCK) в моно-, ди- и трифосфатный PNA. Их трифосфатные формы конкурируют с АТФ за синтез ДНК, действуют как проапоптотические агенты и являются мощными ингибиторами рибонуклеотидредуктазы (RNR), которая участвует в продукции тринуклеотидов. В настоящей заявке предложены T-клетки с FLT3-специфичными CAR, содержащие инактивированный ген dCK. В некоторых вариантах осуществления клетки с нокаутом dCK получают путем трансфекции Т-клеток с использованием полинуклеотидов, кодирующих специфичную нуклеазу TAL, направленную против генов dCK, например, путем электропорации мРНК. T-клетки с FLT3-специфичными CAR с нокаутом dCK устойчивы к PNA, включая, например, клорофарабин и/или флударабин, и поддерживают цитотоксическую активность Т-клеток в отношении клеток, экспрессирующих FLT3.

[0222] В некоторых вариантах осуществления выделенные клетки или клеточные линии согласно изобретению могут содержать pTα или его функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка или клеточная линия может быть дополнительно генетически модифицирована путем инактивации гена TCRα.

[0223] В некоторых вариантах осуществления T-клетка с CAR содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид суицида, такой как, например, RQR8. См., например, заявку WO2013153391A, полностью включенную в настоящую заявку посредством ссылки. В T-клетках с CAR, содержащих указанный полинуклеотид, полипептид суицида экспрессируется на поверхности T-клетки с CAR. В некоторых вариантах осуществления полипептид суицида содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 227.

CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV (SEQ ID NO: 227).

[0224] Полипептид суицида также может содержать сигнальный пептид на аминоконце. В некоторых вариантах осуществления полипептид суицида содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 228.

mgtsllcwmalcllgadhadacpysnpslcsggggselptqgtfsnvstnvspakptttacpysnpslcsggggspaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrrrvckcprpvv (SEQ ID NO: 228).

[0225] Когда полипептид суицида экспрессируется на поверхности T-клетки с CAR, связывание ритуксимаба с эпитопами ритуксимаба полипептида вызывает лизис клетки. С полипептидом, экспрессируемым на клеточной поверхности, может связываться более чем одна молекула ритуксимаба. Каждый эпитоп ритуксимаба полипептида может связывать отдельную молекулу ритуксимаба. Удаление T-клеток с FLT3-специфичными CAR может происходить in vivo, например, путем введения субъекту ритуксимаба. Решение об удалении перенесенных клеток может быть принято из-за нежелательных эффектов, выявленных у субъекта, связанных к перенесенными клетками, например, при выявлении неприемлемыех уровней токсичности.

[0226] В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности любой из FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, после введения пациенту могут уменьшать количество, уничтожать или лизировать эндогенные клетки, экспрессирующие FLT3, у указанного пациента. В одном из вариантов осуществления процент уменьшения количества или лизиса эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3, или клеток клеточной линии, экспрессирующей FLT3, с помощью сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих любой из FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, составляет по меньшей мере приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%, или более. В одном из вариантов осуществления процент уменьшения количества или лизиса эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3, или клеток клеточной линии, экспрессирующей FLT3, с помощью сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих любой из FLT3-специфичных CAR, описанных в настоящей заявке, составляет от приблизительно 5% до приблизительно 95%, от приблизительно 10% до приблизительно 95%, от приблизительно 10% до приблизительно 90%, от приблизительно 10% до приблизительно 80%, от приблизительно 10% до приблизительно 70%, от приблизительно 10% до приблизительно 60%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 10% до приблизительно 40%, от приблизительно 20% до приблизительно 90%, от приблизительно 20% до приблизительно 80%, от приблизительно 20% до приблизительно 70%, от приблизительно 20% до приблизительно 60%, от приблизительно 20% до приблизительно 50%, от приблизительно 25% до приблизительно 75% или от приблизительно 25% до приблизительно 60%. В одном из вариантов осуществления эндогенные клетки, экспрессирующие FLT3, представляют собой эндогенные клетки костного мозга, экспрессирующие FLT3.

[0227] В одном из вариантов осуществления процент уменьшения количества или лизиса клеток-мишеней, например, клеточной линии, экспрессирующей FLT3, с помощью сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих на своей поверхностной клеточной мембране FLT3-специфичный CAR согласно изобретению, может быть измерен с использованием анализа, описанного в примере 2e.

Способ отбора CAR-положительных иммунных клеток

[0228] В одном из аспектов предложены способы отбора популяции иммунных клеток in vitro, где субпопуляция указанной популяции иммунных клеток содержит сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие любой из FLT3-специфичных CAR, содержащих эпитопы, специфичные к моноклональным антителам, описанных в настоящей заявке. Способ включает приведение указанной популяции иммунных клеток в контакт с моноклональным антителом, специфичным к указанным эпитопам, и отбор иммунных клеток, связывающихся с моноклональным антителом, с получением популяции клеток, обогащенной сконструированными иммунными клетками, экспрессирующими FLT3-специфичный CAR.

[0229] В некоторых вариантах осуществления указанное моноклональное антитело, специфичное к указанному эпитопу, необязательно конъюгировано с флуорофором. В этом варианте осуществления стадия отбора клеток, связывающихся с моноклональным антителом, может быть осуществлена с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS). В некоторых вариантах осуществления указанное моноклональное антитело, специфичное к указанному эпитопу, необязательно конъюгировано с магнитной частицей. В этом варианте осуществления стадия отбора клеток, связывающихся с моноклональным антителом, может быть осуществлена с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS).

[0230] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный связывающий домен CAR содержит МАТ-специфичный эпитоп с SEQ ID NO: 262. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный связывающий домен CAR содержит МАТ-специфичный эпитоп с SEQ ID NO: 262, а антитело, используемое для приведения в контакт с популяцией иммунных клеток, представляет собой QBEND-10.

[0231] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный связывающий домен CAR содержит МАТ-специфичный эпитоп SEQ ID NO: 229. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный связывающий домен CAR содержит МАТ-специфичный эпитоп SEQ ID NO: 229, а антитело, используемое для приведения в контакт с популяцией иммунных клеток, представляет собой ритуксимаб.

[0232] В некоторых вариантах осуществления популяция иммунных клеток, экспрессирующих CAR к FLT3, полученная при использовании способа сортировки иммунных клеток in vitro, описанного выше, содержит по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% иммунных клеток, экспрессирующих CAR к FLT3. В некоторых вариантах осуществления популяция иммунных клеток, экспрессирующих CAR к FLT3, полученная при использовании способа сортировки иммунных клеток, экспрессирующих CAR, in vitro, описанного выше, содержит по меньшей мере 85% иммунных клеток, экспрессирующих CAR к FLT3.

[0233] В некоторых вариантах осуществления МАТ, используемые в способе сортировки in vitro, предварительно связывают с подложкой, такой как колонка, или с гранулами, как это обычно осуществляется специалистами в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки, экспрессирующие CAR, представляют собой T-клетки.

[0234] Согласно изобретению клетки, подлежащие введению реципиенту, могут быть обогащены in vitro из исходной популяции. Способы размножения исходной популяции хорошо известны в данной области техники и могут включать отбор клеток, экспрессирующих антиген, такой как антиген CD34, с использованием комбинаций центрифугирования в градиенте плотности, очистки с помощью иммуномагнитных гранул, аффинной хроматографии и флуоресцентно-активируемой сортировки клеток, известных специалистам в данной области техники.

[0235] Проточная цитометрия широко используется в данной области техники и представляет собой способ, хорошо известный специалисту для сортировки и количественной оценки определенных типов клеток в популяции клеток. В целом, проточная цитометрия представляет собой способ количественной оценки компонентов или структурных особенностей клеток, главным образом, оптическими средствами. Поскольку различные типы клеток можно различить путем количественной оценки структурных особенностей, проточную цитометрию и сортировку клеток можно использовать для подсчета и сортировки клеток разных фенотипов в смеси.

[0236] Проточный цитометрический анализ включает две основные стадии: 1) мечение выбранных типов клеток одним или более маркерами для мечения, и 2) определение количества меченых клеток относительно общего количества клеток в популяции.

[0237] Основной способ мечения типов клеток заключается в связывании меченых антител с маркерами, экспрессируемыми конкретным типом клеток. Антитела либо непосредственно мечены флуоресцентным соединением, либо мечены косвенно с использованием, например, флуоресцентно-меченого второго антитела, распознающего первое антитело.

[0238] В некоторых вариантах осуществления способ, используемый для сортировки иммунных клеток, экспрессирующих CAR, представляет собой магнитно-активируемую сортировку клеток (MACS).

[0239] Магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS) представляет собой способ разделения различных популяций клеток в зависимости от их поверхностных антигенов (молекул CD) с использованием суперпарамагнитных наночастиц и колонок. Для получения чистых популяций клеток требуется несколько простых стадий. Клетки в одноклеточной суспензии метят магнитными микрогранулами. Образец наносят на колонку, состоящую из ферромагнитных сфер, покрытых безопасным для клеток покрытием, позволяющим быстро и бережно разделять клетки. Немеченые клетки проходят через колонку, в то время как клетки с магнитной меткой удерживаются в колонке. Элюат может быть собран как немеченая клеточная фракция. После короткой стадии промывки колонку удаляют из сепаратора, и клетки с магнитной меткой элюируют из колонки.

[0240] В некоторых вариантах осуществления МАТ, используемое в способе сортировки иммунных клеток, экспрессирующих CAR, выбрано из алемтузумаба, ибритумомаба тиуксетана, муромонаба-CD3, тозитумомаба, абциксимаба, базиликсимаба, брентуксимаба ведотина, цетуксимаба, инфликсимаба, ритуксимаба, бевацизумаба, цертолизумаба пегола, даклизумаба, экулизумаба, эфализумаба, гемтузумаба, натализумаба, омализумаба, паливизумаба, ранибизумаба, тоцилизумаба, трастузумаба, ведолизумаба, адалимумаба, белимумаба, канакинумаба, деносумаба, голимумаба, ипилимумаба, офатумумаба, панитумумаба, QBEND-10 и/или устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления указанное МАТ представляет собой ритуксимаб. В еще одном варианте осуществления указанное МАТ представляет собой QBEND-10.

Терапевтические применения

[0241] Выделенные клетки, полученные описанными выше способами, или клеточные линии, происходящие из таких выделенных клеток, экспрессирующих FLT3-специфичные CAR, могут применяться в качестве лекарственного средства. Аналогичным образом, FLT3-специфичные антитела, раскрытые в настоящей заявке, могут применяться в качестве лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления такое лекарственное средство может применяться для лечения заболевания или состояния, связанного с FLT3. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние, связанное с FLT3, включает злокачественные клетки, экспрессирующие FLT3, например, рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак гемопоэтического происхождения, такой как лимфома или лейкоз. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой множественную миелому, злокачественное новообразование из плазматических клеток, лимфому Ходжкина, нодулярную лимфому Ходжкина с лимфоидным преобладанием, болезнь Калера и миеломатоз, лейкоз из плазматических клеток, плазмоцитому, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, В-клеточную неходжкинскую лимфому (НХЛ), острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), фолликулярную лимфому, лимфому Беркитта, лимфому маргинальной зоны, мантийноклеточную лимфому, крупноклеточную лимфому, лимфобластную лимфому из B-клеток предшественников, миелоидный лейкоз, макроглобулинемию Вальденстрема, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, лимфому маргинальной зоны, лимфому из лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, мантийноклеточную лимфому, лимфому Беркитта, первичную медиастинальную (тимусную) крупноклеточную В-клеточную лимфому, лимфоплазмоцитарную лимфому, макроглобулинемию Вальденстрема, нодулярную В-клеточную лимфому маргинальной зоны, лимфому маргинальной зоны селезенки, внутрисосудистую крупноклеточную В-клеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, лимфоматоидный гранулематоз, крупноклеточную В-клеточную лимфому, богатую Т-клетками/гистиоцитами, первичную лимфому центральной нервной системы, первичную кожную диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (типа нижних конечностей), вирус Эпштейна-Барр-позитивную диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому пожилых, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, связанную с воспалением, внутрисосудистую крупноклеточную B-клеточную лимфому, ALK-позитивную крупноклеточную B-клеточную лимфому, плазмабластную лимфому, крупноклеточную B-клеточную лимфому, возникающую при HHV8-ассоциированной многоцентровой болезни Кастлемана, неклассифицированную B-клеточную лимфому с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и лимфомой Беркитта, неклассифицированную B-клеточную лимфому с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и классической лимфомой Ходжкина, или другие раковые заболевания, связанные с гемопоэтическими клетками. В иллюстративном варианте осуществления рак представляет собой ОМЛ. В примерном варианте осуществления рак является ОЛЛ.

[0242] В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка согласно изобретению или клеточная линия, происходящая из выделенных клеток, или антитело могут применяться при изготовлении лекарственного средства для лечения рака у нуждающегося в этом субъекта.

[0243] В настоящей заявке также предложены способы лечения субъектов. В некоторых вариантах осуществления способ включает предоставление иммунной клетки согласно изобретению нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах осуществления способ включает стадию введения трансформированных иммунных клеток согласно изобретению нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение антитела согласно изобретению нуждающемуся в этом субъекту.

[0244] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки согласно изобретению могут подвергаться устойчивому размножению Т-клеток in vivo и могут сохраняться в течение продолжительного периода времени.

[0245] Способы лечения согласно изобретению могут быть улучшающими, лечебными или профилактическими. Способ согласно изобретению может быть либо частью аутологичной иммунотерапии, либо частью аллогенной иммунотерапии. Изобретение особенно подходит для аллогенной иммунотерапии. Т-клетки от доноров могут быть трансформированы в неаллореактивные клетки с использованием стандартных протоколов и размножены по мере необходимости с получением тем самым T-клеток с CAR, которые могут быть введены одному или нескольким субъектам. Такая CAR-T-клеточная терапия может быть доступна как готовый к использованию терапевтический продукт.

[0246] Клетки, которые могут быть использованы в раскрытых способах, описаны в предыдущем разделе. Лечение может быть использовано для лечения субъектов, у которых диагностирован, например, рак. Раковые заболевания, подлежащие лечению, включают, например, не ограничиваясь перечисленным, рак, связанный с В-лимфоцитами, включая любой из перечисленных выше видов рака. Типы раковых заболеваний, подлежащих лечению CAR и T-клетками с CAR согласно изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленным, некоторые лейкозы или лимфоидные злокачественные новообразования. Также включены опухоли/раковые заболевания взрослых пациентов и педиатрические опухоли/раковые заболевания. В некоторых вариантах осуществления лечение может осуществляться в комбинации с одной или более противораковыми терапиями, выбранными из группы, состоящей из терапии антителами, химиотерапии, терапии цитокинами, терапии дендритными клетками, генной терапии, гормональной терапии, лазерной терапии и радиационной терапии.

[0247] В некоторых вариантах осуществления лечение можно вводить субъектам, проходящим иммуносупрессивное лечение. Действительно, изобретение в общем основано на клетках или популяции клеток, которые были сделаны устойчивыми по меньшей мере к одному иммуносупрессивному агенту вследствие инактивации гена, кодирующего рецептор для такого иммуносупрессивного агента. В этом аспекте иммуносупрессивное лечение должно способствовать отбору и размножению Т-клеток согласно изобретению у субъекта. Введение клеток или популяции клеток согласно изобретению может быть осуществлено любым удобным способом, включая вдыхание аэрозоля, инъекцию, пероральный прием, трансфузию, имплантацию или трансплантацию. Композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть введены субъекту подкожно, внутрикожно, внутриопухолево, интранодально, интрамедуллярно, внутримышечно, с помощью внутривенной или внутрилимфатической инъекции или внутрибрюшинно. В некоторых вариантах осуществления композиции клеток согласно изобретению вводят путем внутривенной инъекции.

[0248] В некоторых вариантах осуществления введение клеток или популяции клеток может включать введение, например, от приблизительно 10⁴ до приблизительно 10⁹ клеток на кг массы тела, включая все целочисленные значения количества клеток в пределах этого диапазона. В некоторых вариантах осуществления введение клеток или популяции клеток может включать введение приблизительно от 10⁵ до 10⁶ клеток на кг массы тела, включая все целочисленные значения количества клеток в пределах этого диапазона. Клетки или популяция клеток могут быть введены в одной или более дозах. В некоторых вариантах осуществления указанное эффективное количество клеток может быть введено в виде разовой дозы. В некоторых вариантах осуществления указанное эффективное количество клеток может быть введено в виде более чем одной дозы в течение некоторого периода времени. Время введения определяет лечащий врач в зависимости от клинического состояния субъекта. Клетки или популяция клеток могут быть получены из любого источника, такого как банк крови или донор. В то время как индивидуальные потребности варьируются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств данного типа клеток для конкретного заболевания или состояний находится в компетенции специалиста в данной области техники. Эффективное количество означает количество, обеспечивающее терапевтическую или профилактическую пользу. Вводимая доза будет зависеть от возраста, состояния здоровья и массы тела реципиента, вида сопутствующего лечения, если таковое имеется, частоты лечения и характера желаемого эффекта. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество клеток или композиции, содержащей эти клетки, вводят парентерально. В некоторых вариантах осуществления введение может представлять собой внутривенное введение. В некоторых вариантах осуществления введение может осуществляться непосредственно путем инъекции в опухоль.

[0249] В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки вводят субъекту в сочетании (например, до, одновременно или после) с любым количеством релевантных способов лечения, включая, не ограничиваясь перечисленным, лечение с помощью агентов, такое как терапия моноклональными антителами, антагонистом CCR2 (например, INC-8761), противовирусная терапия, цидофовир и интерлейкин-2, цитарабин (также известный как ARA-C) или лечение натализумабом для пациентов с РС (рассеянным склерозом) или эфализумабом для пациентов с псориазом, или другие методы лечения для пациентов с ПМЛ (прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатией). В некоторых вариантах осуществления T-клетки с FLT3-специфичными CAR вводят субъекту в сочетании с одним или более из следующего: антитело к PD-1 (например, ниволумаб, пембролизумаб или PF-06801591), антитело к PD-L1 (например, авелумаб, атезолизумаб или дурвалумаб), антитело к OX40 (например, PF-04518600), антитело к 4-1BB (например, PF-05082566), антитело к MCSF (например, PD-0360324), антитело к GITR и/или антитело к TIGIT. В некоторых вариантах осуществления FLT3-специфичный CAR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 236, вводят субъекту в сочетании с антителом к PD-L1 авелумабом. В дополнительных вариантах осуществления Т-клетки согласно изобретению могут применяться в комбинации с химиотерапией, радиационной терапией, иммуносупрессивными агентами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антителами или другими иммунодеструктивными агентами, такими как CAMPATH, антителами к CD3 или другими методами лечения антителами, цитоксином, флударибином, циклоспорином, FK506, рапамицином, микофеноловой кислотой, стероидами, FR901228, цитокинами и/или облучением. Эти лекарственные средства ингибируют кальций-зависимую фосфатазу кальциневрин (циклоспорин и FK506) или ингибируют киназу p70S6, которая важна для передачи сигналов, индуцированных фактором роста (рапамицин) (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). В дополнительных вариантах осуществления Т-клетки согласно изобретению могут применяться в комбинации с ингибиторами рецепторной тирозинкиназы, такими как мидостаурин и сунитиниб, ингибиторами mTOR, такими как рапамацин и эверолимус, эпигенетическими модуляторами, такими как вормостат, ингибиторами протеасом, такими как бортезомиб, иммуномодулирующими агентами, такими как леналидомид, ингибиторами сигнального пути Hedgehog, такими как эрисмодегиб и PF-04449913, или ингибиторами изоцитратдегидрогеназы (IDH), такими как AG-120 и AG-221. В дополнительном варианте осуществления композиции клеток согласно изобретению вводят субъекту в сочетании с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга, абляционной Т-клеточной терапии с использованием любого химиотерапевтического средства, такого как флударабин, наружной дистанционной лучевой терапией (XRT), циклофосфамидом или антителами, такими как OKT3 или CAMPATH. В некоторых вариантах осуществления композиции клеток согласно изобретению вводят после абляционной B-клеточной терапии, такой как агенты, взаимодействующие с CD20, например, ритуксан. Например, в некоторых вариантах осуществления субъекты могут проходить стандартное лечение высокими дозами химиотерапевтических препаратов с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В отдельных вариантах осуществления после трансплантации субъекты получают инфузию размноженных иммунных клеток согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления размноженные клетки вводят до или после хирургического вмешательства.

[0250] В некоторых вариантах осуществления предложены способы элиминации сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих FLT3-специфичный CAR, у субъекта, которому были введены указанные клетки. Элиминация может быть осуществлена путем ингибирования или устранения.

[0251] В одном из аспектов способ элиминации сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих FLT3-специфичный CAR, содержащий эпитоп, специфичный к моноклональному антителу, включает приведение указанной сконструированной иммунной клетки в контакт с моноклональным антителом, специфичным к указанному эпитопу.

[0252] В некоторых вариантах осуществления способ элиминации у субъекта, которому были введены сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие FLT3-специфичный CAR, содержащий эпитоп, специфичный к моноклональному антителу, включает введение указанному субъекту моноклонального антитела, специфичного к указанному эпитопу. В этих вариантах осуществления введение субъекту моноклонального антитела, специфичного к эпитопу, присутствующему во внеклеточном домене CAR, устраняет или ингибирует активность сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR, у субъекта. В одном из аспектов элиминация сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR, позволяет восстановить эндогенную популяцию клеток, экспрессирующих FLT3.

[0253] В одном из аспектов изобретение относится к способу стимуляции восстановления эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3, у субъекта, которому были введены сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на клеточной поверхности FLT3-специфичный CAR, содержащий эпитоп, специфичный к моноклональному антителу, где способ включает введение указанному субъекту моноклонального антитела, специфичного к указанному эпитопу. В некоторых вариантах осуществления эндогенные клетки, экспрессирующие FLT3, представляют собой эндогенные клетки костного мозга, экспрессирующие FLT3. В одном из аспектов термин «восстановление» относится к увеличению количества эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3. Количество эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3, может увеличиваться из-за увеличения пролиферации эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3, и/или из-за снижения устранения эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3, посредством сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR к FLT3. В некоторых вариантах осуществления введение моноклонального антитела субъекту приводит к элиминации сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR к FLT3, и увеличению количества эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3, например, эндогенных экспрессирующих FLT3 клеток-предшественников костного мозга, у субъекта. В одном из вариантов осуществления введение моноклонального антитела субъекту увеличивает количество эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3, по меньшей мере приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% по сравнению с количеством эндогенных клеток, экспрессирующих FLT3, до введения моноклонального антитела.

[0254] В одном из аспектов предложен способ лечения FLT3-опосредованного состояния у субъекта, включающий: (a) введение субъекту сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих на клеточной поверхности FLT3-специфичные CAR, содержащие один или более эпитопов, специфичных к одному или более моноклональным антителам; и (b) последующую элиминацию сконструированных иммунных клеток у субъекта путем введения субъекту одного или более моноклональных антител, специфичных к указанному эпитопу.

[0255] В некоторых вариантах осуществления МАТ, используемые в способе для элиминации экспрессирующих сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR, выбраны из алемтузумаба, ибритумомаба тиуксетана, муромонаба-CD3, тозитумомаба, абциксимаба, базиликсимаба, брентуксимаба ведотина, цетуксимаба, инфликсимаба, ритуксимаба, бевацизумаба, цертолизумаба пегола, даклизумаба, экулизумаба, эфализумаба, гемтузумаба, натализумаба, омализумаба, паливизумаба, ранибизумаба, тоцилизумаба, трастузумаба, ведолизумаба, адалимумаба, белимумаба, канакинумаба, деносумаба, голимумаба, ипилимумаба, офатумумаба, панитумумаба, QBEND-10, устекинумаба и их комбинаций.

[0256] В некоторых вариантах осуществления указанный эпитоп, специфичный к моноклональному антителу (МАТ-специфичный эпитоп), представляет собой эпитоп или мимотоп CD20, например, SEQ ID NO: 229, и МАТ, специфичное к указанному эпитопу, представляет собой ритуксимаб.

[0257] В некоторых вариантах осуществления стадия введения моноклонального антитела субъекту включает введение субъекту моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления количество специфичного к эпитопу МАТ, вводимого субъекту, является достаточным для элиминации по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% иммунных клеток, экспрессирующих CAR, у субъекта.

[0258] В некоторых вариантах осуществления стадия введения моноклонального антитела субъекту включает введение субъекту 375 мг/м² ритуксимаба один или несколько раз в неделю.

[0259] В некоторых вариантах осуществления, когда иммунные клетки, экспрессирующие CAR, содержащий МАТ-специфичный эпитоп (иммунные клетки, экспрессирующие CAR), элиминированы в анализе CDC (комплементзависимой цитотоксичности) с использованием специфичного к эпитопу МАТ, количество жизнеспособных иммунных клеток, экспрессирующих CAR, снижается, например, по меньшей мере по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%.

[0260] В некоторых вариантах осуществления со специфичными к эпитопу МАТ, которые используются для истощения иммунных клеток, экспрессирующих CAR, связано цитотоксическое лекарственное средство. Путем сочетания нацеливающих способностей моноклональных антител со способностью цитотоксических лекарственных средств к уничтожению клеток конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) обеспечивает чувствительную дискриминацию между здоровой и пораженной тканью по сравнению с использованием лекарственного средства по отдельности. Разрешения для продажи были получены для нескольких ADC; технология их получения, особенно на линкерах, широко представлена в следующих источниках уровня техники (Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; патент США № 4,975,278).

[0261] В некоторых вариантах осуществления специфичное к эпитопу МАТ для инфузии предварительно конъюгируют с молекулой, способной стимулировать комплементзависимую цитотоксичность (CDC). Следовательно, система комплемента помогает или дополняет способность антител выводить из организма патогенные микроорганизмы. При стимуляции одним или более агентами запускается активирующий каскад, выражающийся в существенном усилении ответа и активации комплекса, уничтожающего клетки путем разрушения клеточной мембраны. Для конъюгации с МАТ могут быть использованы различные молекулы, такие как гликаны [Courtois, A, Gac-Breton, S., Berthou, C, Guezennec, J., Bordron, A. and Boisset, C. (2012), Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibody fragments is acquired by immunogenic glycan coupling, Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458; http://www.ejbiotechnology.info DOI: 10.2225/voll5-issue5).

Наборы

[0262] Изобретение также относится к наборам для применения в настоящих способах. Наборы согласно изобретению включают один или более контейнеров, содержащих полинуклеотид, кодирующий FLT3-специфичный CAR, сконструированную иммунную клетку, содержащую полинуклеотид, кодирующий FLT3-специфичный CAR, или FLT-специфичное антитело, как описано в настоящей заявке, и инструкции по применению в соответствии с любым из способов согласно изобретению, описанных в настоящей заявке. Как правило, эти инструкции содержат описание введения сконструированной иммунной клетки для вышеописанных методов лечения.

[0263] Инструкции, относящиеся к применению сконструированных иммунных клеток или антител, как описано в настоящей заявке, обычно включают информацию о дозировке, режиме дозирования и способе введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут представлять собой разовые дозы, упаковки с несколькими дозами (например, многодозовые упаковки) или субъединичные дозы. Инструкции, поставляемые в наборах согласно изобретению, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковку (например, листе бумаги, включенном в набор), но также приемлемы машиночитаемые инструкции (например, инструкции, хранящиеся на магнитном или оптическом диске для хранения информации).

[0264] Наборы согласно настоящему изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, не ограничиваясь перечисленным, флаконы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, герметичные майларовые или пластиковые пакеты) и тому подобное. Также рассматриваются упаковки для применения в комбинации с конкретным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, аэрозольный аппарат) или инфузионное устройство, такое как мининасос. Набор может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). Контейнер также может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой FLT3-специфичный CAR или FLT3-специфичное антитело. Контейнер может дополнительно содержать второй фармацевтически активный агент.

[0265] Наборы могут необязательно содержать дополнительные компоненты, такие как буферы и информацию для интерпретации. Обычно набор содержит контейнер и этикетку или вкладыш(и) в упаковку, размещенные на контейнере или связанные с ним.

[0266] Следующие примеры предлагаются только для иллюстративных целей и никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны в настоящей заявке, будут ясны специалистам в данной области техники из предшествующего описания изобретения и будут входить в объем прилагаемой формулы изобретения.

[0267] Иллюстративные материалы согласно настоящему изобретению были депонированы в Американской коллекции типовых культур, 10801 Университетский Бульвар, Манассас, Вирджиния. 20110-2209, USA, 1 июня 2017 г. Вектор P3E10-VL, имеющий номер доступа в ATCC PTA-124228, представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи P3E10, и вектор P3E10-VH, имеющий номер доступа в ATCC PTA-124227, представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи P3E10. Депонировние было осуществлено в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры и положений к нему (Будапештский договор). Указанный договор обеспечивает сохранение депонированной жизнеспособной культуры в течение 30 лет с даты депонирования. Депонированная культура будет доступна в ATCC в соответствии с условиями Будапештского договора и согласно соглашению между Pfizer, Inc. и ATCC, которое гарантирует постоянный и неограниченный открытый доступ к потомству депонированной культуры при выдаче соответствующего патента США или публичном раскрытии информации в любой патентной заявке США или иностранной заявке, в зависимости от того, что произойдет раньше, и обеспечивает доступность потомства для лица, квалифицированного Экспертизой по патентам и товарным знакам США согласно статье 35 Кодекса США, раздел 122, и соответствующими правилами (включая п. 37 Свода федеральных законоположений, Раздел 1.14, со ссылкой, в частности, на 886 OG 638).

[0268] Правопреемник настоящей заявки согласился с тем, что если депонированная культура материалов погибнет или будет утрачена или уничтожена при культивировании в подходящих условиях, незамедлительно при получении уведомления материалы будут заменены тем же материалом. Доступность депонированных материалов не должна рассматриваться как разрешение на осуществление изобретения в нарушение прав, предоставленных любым правительством в соответствии с его патентным законодательством.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Определение кинетики и аффинности взаимодействий человеческой FLT3 и антител к FLT3 при 37°C

[0269] В этом примере была определена кинетика и аффинность различных антител к FLT3 при 37°C. Все эксперименты проводили на биосенсоре на эффекте поверхностного плазмонного резонанса Biacore T200 (GE Lifesciences, Пискатауэй, Нью-Джерси).

[0270] Подготовку сенсорного чипа проводили при 25°C с использованием подвижного буфера из 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,05 об.% Tween-20 при pH 7,4. Сенсорный чип против человеческого Fc получали путем активации всех проточных ячеек сенсорного чипа Biacore CM4 смесью 1:1 (об./об.) 400 мМ EDC и 100 мМ NHS в течение 7 минут при скорости потока 10 мкл/мин. Реагент против человеческого Fc (козье IgG против человеческого Fc, SouthernBiotech, номер по каталогу 2081-01) разбавляли до 30 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия при pH 4,5 и вводили во все проточные ячейки в течение 7 минут при 20 мкл/мин. Все проточные ячейки блокировали 100 мМ этилендиамина в 150 мМ боратном буфере при рН 8,5 в течение 7 минут при 10 мкл/мин.

[0271] Эксперименты проводили при 37°C с использованием подвижного буфера из 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,05 об.% Tween-20 при pH 7,4, 1 мг/мл BSA. Антитела к FLT3 захватывали из неразбавленных супернатантов на нижерасположенные проточные ячейки (проточные ячейки 2, 3 и 4) со скоростью потока 10 мкл/мин в течение 1 минуты. На каждой из проточных ячеек были захвачены разные антитела. Проточную ячейку 1 использовали в качестве контрольной поверхности. После захвата антител к FLT3 аналит (буфер, человеческий FLT3 (hFLT3)) инъецировали со скоростью 30 мкл/мин во все проточные ячейки в течение двух минут. После инъекции аналита контролировали диссоциацию в течение 10 минут с последующей регенерацией всех проточных ячеек с помощью трех 1-минутных инъекций 75 мМ фосфорной кислоты. Для каждого захваченного антитела к FLT3 были выполнены следующие инъекции аналита: буфер, 11 нМ hFLT3, 33 нМ hFLT3, 100 нМ hFLT3 и 300 нМ hFLT3. Буферные циклы собирали для каждого захваченного антитела к FLT3 для целей двойного контроля (двойной контроль, как описано в Myszka, D.G. Improving biosensor analysis. J. Mol. Recognit. 12, 279-284 (1999)). Сенсограммы после двойного контроля в целом аппроксимировали к простой 1:1 модели связывания Ленгмюра с массовым переносом.

[0272] Параметры кинетики и аффинности для исследованных антител к FLT3 приведены в таблице 7. Антитела, представленные в таблице 7, имеют те же области VH и VL, что и CAR с тем же названием, представленные в таблице 8.

Таблица 7

Формат IgG Формат scFv huFlt3 mFlt3 домен k_a (1/мс) k_d (1/с) t_1/2
(мин) K_D (нМ) Kd
(нМ) k_a (1/мс) k_d (1/с) t_1/2
(мин) K_D
(нМ) P4F6 1 1,40E+05 3,50E-03 3,3 25 36,1 1,32E+05 1,99E-03 5,8 15,1 P4C7 1 1,60E+05 1,20E-03 9,3 7,7 402,4 1,21E+05 1,64E-03 7 13,6 P3A1 2-3 9,50E+04 6,00E-03 1,9 64 - 1,07E+05 1,67E-03 6,9 15,67 P5A3 2-3 9,80E+04 1,00E-02 1,2 102 19,3 8,10E+04 1,75E-02 0,7 216 P9B5 2-3 4,20E+04 4,70E-04 24,4 11 1,5 3,80E+04 6,87E-04 16,8 18,1 P9F1 2-3 1,80E+05 2,30E-02 0,5 127 - 2,26E+05 2,86E-02 0,4 126,5 P1B4 4 1,80E+05 5,80E-03 2 32 - 1,20E+05 3,27E-03 3,5 27,3 P1B11 4 1,20E+05 5,50E-03 2,1 45 - 8,47E+04 2,57E-03 4,5 30,3 P7H3 4 9,90E+05 1,80E-03 6,6 2 0,9 2,05E+05 1,87E-03 6,2 9,1 P3E10 4 1,80E+05 1,90E-02 0,6 106 - 1,72E+05 1,12E-02 1 65,1 P1A5 4 1,78E+06 3,47E-04 33 0,19 - 2,59E+05 2,92E-04 40 1,1 P4A4 4 1,16E+06 4,69E-04 25 0,4 - P1G12 4 6,17E+05 2,92E-04 40 0,47 6,5 P4E5 4 1,20E+06 1,51E-04 77 0,13 18,9 P5A4 4 5,53E+05 1,01E-04 114 0,18 - P5F7 4 6,36E+05 1,52E-04 76 0,24 - 1,89E+05 1,97E-04 59 1 P4H11 4 6,18E+04 1,44E-02 1 233 - 1,60E+05 9,33E-03 1 58,3 P15F7 5 1,40E+05 5,50E-03 2,1 38 - P12B6 5 1,10E+05 9,00E-03 1,3 84 - P7D3 5 7,10E+04 5,20E-03 2,2 72 - P7A6 5 3,40E+04 3,70E-04 31 11 P8B6 5 9,30E+04 2,30E-04 51 2,5 - P14G2 5 1,40E+05 1,10E-03 10,7 8 - 9,35E+04 3,05E-04 37,9 3,3 P7F9 4 1,10E+05 1,30E-03 8,9 12 13,8 8,70E+04 2,41E-03 4,8 27,7

Пример 2. Получение T-клеток с FLT3-специфичными CAR

а) Плазмиды

[0273] Следующие кодон-оптимизированные последовательности CAR к FLT3, перечисленные в приведенной ниже таблице 8, были синтезированы и субклонированы в лентивирусный вектор, такой как pLVX-EF1a-IRES-Puro (Clontech), с использованием сайтов рестрикции EcoRI (5') и MluI (3') (удаляя таким образом кассету IRES-Puro).

Таблица 8: Иллюстративные FLT3-специфичные CAR

CAR Аминокислотная последовательность CAR Компоненты P1A5 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGVFSRYALSWVRQAPGQGLEWMGGIIPMLGFANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATLDFGALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQAVDSSDLAWYQQKPGQAPRLLIYDAYTRPSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 233) Сигнальный пептид CD8α;
VH P1A5_VHVL;
GS-линкер;
VL P1A5_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ P1B4 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGVFSRYALSWVRQAPGQGLEWMGGIIPMLGFANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATLDFGALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVPNEQLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSPPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 234) Сигнальный пептид CD8α;
VH P1B4_VHVL;
GS-линкер;
VL P1B4_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ P3A1 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYDISWVRQAPGQGLEWMGGIIPVSGRANYAQKFQGRVTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVRPTYWPLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystpltfgqgtkveikTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 235) Сигнальный пептид CD8α;
VH P3A1_VHVL;
GS-линкер;
VL P3A1_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ P3E10 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIQWVRQAPGQGLEWMGGIVGSWGLANYAQKFQGRVTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATSAFGELASWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVPSSQLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 236) Сигнальный пептид CD8α;
VH P3E10_VHVL;
GS-линкер;
VL P3E10_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ P4C7 MALPVTALLLPLALLLHAARPQvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssytiswvrqapgqglewmggiipafgianyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycakggsysldyfdiwgqgtlvtvssGGGGSGGGGSGGGGSeivltqspgtlslspgeratlscrasqyvsasllawyqqkpgqaprlliygastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqyarsstfgqgtkveikTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 237) Сигнальный пептид CD8α;
VH P4C7_VHVL;
GS-линкер;
VL P4C7_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ P4H11 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSNTYLAWYQQKPGQAPRLLIYDTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 238) Сигнальный пептид CD8α;
VH P4H11_VHVL;
GS-линкер;
VL P4H11_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ P5F7 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 239) Сигнальный пептид CD8α;
VH P5F7_VHVL;
GS-линкер;
VL P5F7_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ P7H3 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTRWWWGDAFDHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSTAWVFGGGTKLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 240) Сигнальный пептид CD8α;
VH P7H3_VHVL;
GS-линкер;
VL P7H3_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ P8B6 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAVSWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIEGIGGDLRYDGYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSHSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASFRAAGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSDPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 241) Сигнальный пептид CD8α;
VH P8B6_VHVL;
GS-линкер;
VL P8B6_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ P9B5 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFASYAMSWVRQAPGKGLEWVSEISSSGGSTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRVMAGLGYDPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGGGTKLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 242) Сигнальный пептид CD8α;
VH P9B5_VHVL;
GS-линкер;
VL P9B5_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ P12B6 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFMSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARETLIYPIPFELWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGGSPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 243) Сигнальный пептид CD8α;
VH P12B6_VHVL;
GS-линкер;
VL P12B6_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ P14G2 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYVMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGATTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGLWAGGIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASDLQRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPWTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 244) Сигнальный пептид CD8α;
VH P14G2_VHVL;
GS-линкер;
VL P14G2_VHVL;
шарнир CD8α;
ТМ домен CD8α;
ISD 41BB;
ISD CD3ζ

[0274] В некоторых экспериментах последовательности, кодирующей CAR, предшествует последовательность, кодирующая флуоресцентный белок, такой как BFP (синий флуоресцентный белок), и отделенная от такой последовательности последовательностью, кодирующей саморасщепляющийся пептид 2A. Лентивирусы получали с использованием psPAX2, упаковочной плазмиды, содержащей ген gag-pol ВИЧ-1, и плазмиды экспрессии VSV-G pMD2.G.

b) Активация Т-клеток и лентивирусная трансдукция

[0275] Нетронутые Т-клетки выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС) с использованием набора для выделения клеток Pan T (Miltenyi Biotec), и активировали в течение трех дней антителами к CD2, CD3 и CD28 человека (набор для активации/размножения T-клеток - Miltenyi Biotec). Лентивирусные векторы (LV) получали путем временной трансфекции клеток HEK-293T/17 в субконфлюентном состоянии (Американская коллекция типовых культур (ATCC)) в 6-луночных планшетах. Вкратце, плазмиды pLVX, psPAX2 и pMD2.G трансфицировали в соотношении 4:3:1, соответственно, используя Lipofectamine 2000 (Invitrogen), следуя инструкциям производителя. На следующий день среды заменяли средой для культивирования Т-клеток (5% человеческой сыворотки группы АВ в среде X-vivo-15 (Lonza)), и через 48 ч после трансфекции собирали супернатант LV и фильтровали через 0,45 мкм шприцевой фильтр (Millipore). Активированные Т-клетки высевали в количестве 0,25 × 10⁶ клеток/мл в среду для культивирования Т-клеток, содержащую 40 нг/мл IL-2, и трансдуцировали путем добавления равного объема свежего супернатанта LV. В этих экспериментах использовали LV, содержащие следующие конструкции CAR: P1A5, P1B4, P3A1, P3E10, P4C7, P4H11, P7H3, P9B5, P12B6 и P14G2. Клетки культивировали при 37°С и 5% СО2 в течение трех дней и использовали для анализа методом проточной цитометрии, или размножали в свежей среде для Т-клеток, содержащей 20 нг/мл IL-2.

c) Измерение эффективности трансдукции методом проточной цитометрии

[0276] Для определения эффективность трансдукции различных лентивирусных конструкций CAR к FLT3 проводили анализ методом проточной цитометрии на Т-клетках через 72 ч после трансдукции. Вкратце, отдельные клетки подвергали сортировке с использованием параметров прямого рассеяния и бокового рассеяния и рассчитывали эффективность трансдукции как процент BFP-положительных клеток. В других случаях клетки, экспрессирующие CAR, определяли окрашиванием антителом к CD20 ритуксимабом, которое связывает эпитопы CD20 в молекуле CAR, а затем конъюгированным с FITC античеловеческим IgG. На ФИГ. 1 показано, что активированные Т-клетки были эффективно трансдуцированы разными конструкциями CAR к FLT3 с различной эффективностью (от 30% до 70%).

d) FLT3CAR к FLT3-T клетки дифференцируются в ходе культивирования, но сохраняют высокий процент субпопуляции T-клеток памяти

[0277] Экспрессия маркеров активации CD25 и 4-1BB (CD137) на T-клетках с CAR в ходе культивирования была связана с истощением Т-клеток и повышенной дифференцировкой в направлении фенотипа эффекторных клеток памяти (Long et al., 2015). В этом эксперименте Т-клетки, трансдуцированные CAR P1A5, P1B4, P3A1, P3E10, P4C7, P4H11, P7H3, P9B5, P12B6 и P14G2, окрашивали антителами к CD25 и CD137 через десять дней после стимуляции и анализировали методом проточной цитометрии. Степень активации Т-клеток определяли по процентной доле T-клеток с CAR, положительных по CD25 и 4-1BB. Для сравнения была включена популяция не трансдуцированных (NT) Т-клеток (ФИГ. 2). Экспрессия некоторых FLT3CAR к FLT3 (P1A5, P12B6 и P14G2) была связана с «активированным» состоянием (ФИГ. 2), тогда как экспрессия других CAR к FLT3, включая P9B5, P3E10, P4C7 и P3A1, приводила к уровням маркеров активации, которые были сопоставимы с нетрансдуцированными клетками (ФИГ. 2). Более высокие уровни экспрессии маркера активации приводят к повышенной дифференцировке T-клеток с CAR, что можно оценить к 15 дню после стимуляции путем измерения экспрессии CD62L и CD45RO на их клеточной поверхности. В этом эксперименте T-клетки с CAR окрашивали такими маркерами с использованием специфических антител и классифицировали на четыре различные категориии или субпопуляции с возрастающей степенью дифференцировки: 1) CD62L^ВЫСОК CD45RO^НИЗК стволовые клетки памяти (Tscm); 2) CD62L^ВЫСОК CD45RO^ВЫСОК клетки центральной памяти (Tcm); CD62L^НИЗК CD45RO^ВЫСОК эффекторные клетки памяти (Tem); и CD62L^НИЗК CD45RO^НИЗК эффекторные (Teff) клетки. На ФИГ. 3 показаны репрезентативные графики FACS для T-клеток с CAR P9B5 (низкая дифференцировка) и клеток T-клеток с CAR P14G2 (высокая дифференцировка), а также состав субпопуляций Т-клеток всех различных T-клеток с CAR к FLT3 на 15 день после стимуляции. T-клетки с CAR, демонстрирующие «активированный» фенотип, также показали более дифференцированный фенотип (т. е. более высокую процентную долю клеток Tem и более низкую процентную долю клеток Tscm) к концу культивирования (ФИГ. 3). В частности, экспрессия CAR к FLT3 P9B5, P3A1, P7H3 и P3E10 была связана с высокой процентной долей стволовых клеток памяти и клеток центральной памяти, что коррелировало с повышенной персистентностью и противоопухолевой эффективностью у субъектов с ОЛЛ и ХЛЛ (Xu et al., Blood. 2014;123(24):3750-3759).

e) Анализ пролиферации и долгосрочной уничтожающей активности in vitro

[0278] Способность T-клеток с CAR пролиферировать и осуществлять лизис клеток-мишеней, экспрессирующих родственный антиген, является эффективным способом оценки их активности in vitro. Для контроля жизнеспособности клеток-мишеней с помощью люминесценции экспрессирующие FLT3 клетки Molm13 стабильно трансдуцировали для экспрессии гена люциферазы. Затем эти Luc+ клетки-мишени инкубировали с T-клетками с CAR к FLT3 и измеряли уничтожающую активность, а также пролиферацию T-клеток с CAR с помощью люминесценции и подсчета жизнеспособных клеток, соответственно. Для более строгого анализа, предназначенного для повышенной нагрузки на эффекторные клетки (CAR-T-клетки, Т-клетки с CAR), в исходную культуру периодически добавляли новые клетки-мишени и определяли долгосрочную уничтожающую активность T-клеток с CAR по люминесценции в конце культивирования (ФИГ. 4). В соответствии с более высокой пролиферативной способностью стволовых клеток памяти и Т-клеток центральной памяти, популяции T-клеток с CAR P9B5, P3A1, P7H3 и P3E10 показали более высокое мишень-зависимое размножение и долгосрочную цитотоксическую активность in vitro, тогда как T-клетки с CAR с более высокой степенью дифференцировки, такие как P12B6 и P14G2, слабо размножались в присутствии клеток-мишеней и имели сниженную уничтожающую активность.

f) Активность T-клеток с FLT3-специфичными CAR в анализе на ортотопической мышиной модели

[0279] Этот пример иллюстрирует лечение ОМЛ с помощью T-клеток c CAR к FLT3 с использованием ортотопической модели с Eol1. Исследование эффективности T-клеток с CAR к FLT3in vivo проводили с клетками Eol1, экспрессирующими люциферазу и GFP, в ортотопической модели. Триста тысяч клеток Eol1 Luc2AGFP вводили внутривенно через хвостовую вену самкам животных CB17/SCID в возрасте 6-8 недель. Посредством внутрибрюшинной инъекции D-люциферина (Regis Technologies, Мортон Гров, Иллинойс) (200 мкл на животное в дозе 15 мг/мл) с последующей анестезией изофлуораном и последующей биолюминесцентной визуализацией (BLI) всего тела осуществляли контроль опухолевой нагрузки. Биолюминесцентные сигналы, испускаемые при взаимодействии между люциферазой, экспрессируемой опухолевыми клетками, и люциферином, регистрировали путем визуализации с использованием IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, Массачусетс) и численно выражали как общий поток (фотонов/сек) с использованием Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Аламеда, Калифорния).

[0280] Когда общий поток достигал в среднем 30E6 для всех животных (на 10 день после имплантации опухоли), животных случайным образом распределяли на три группы. Каждой группе вводили одну из следующих клеток: 1) нетрансдуцированные Т-клетки, используемые в качестве контроля, 2) T-клетки с CAR к FLT3, экспрессирующие P3E10 («P3E10 V1»), или 3) T-клетки с CAR к FLT3, экспрессирующие P3A1 («P3A1 v1»). Все клетки 1-3 обладают TCRα. T-клетки с CAR к FLT3 получали, как описано в примере выше. Конструкции CAR к FLT3 P3E10 и P3A1 показаны в таблице 8 выше. Разовую дозу 2,5 или 5 миллионов контрольных (NT) или T-клеток с CAR к FLT3(P3E10 или P3A1) вводили путем болюсной инъекции в хвостовую вену. Животных умерщвляли, когда они теряли более 15% общей массы тела, что является конечной точкой для ортотопических моделей с Eol1.

[0281] Результаты исследования суммированы на ФИГ. 5. Разовая доза 5 миллионов P3E10 или P3A1 T-клеток с CAR к FLT3 или 2,5 миллиона P3E10 T-клеток с CAR к FLT3 приводила к более низкому общему потоку с 13-43 дня после имплантации опухоли по сравнению с отрицательным контролем. Таким образом, лечение T-клетками с CAR к FLT3 ингибировало прогрессирование опухоли по сравнению с отрицательным контролем.

[0282] Эти результаты показывают, что T-клетки с CAR к FLT3 эффективны для ингибирования прогрессирования опухоли.

Пример 3. Элиминация FLT3-специфичных CAR-Т-клеток, экспрессирующих эпитопы CD20

a) T-клетки с FLT3-специфичными CAR, экспрессирующие эпитопы CD20, чувствительны к комплементзависимой цитотоксичности (CDC) в присутствии ритуксимаба

[0283] Чувствительность FLT3-специфичных CAR-Т-клеток к комплементу в присутствии антитела к CD20 оценивали in vitro с использованием анализа CDC. В этом эксперименте Т-клетки, трансдуцированные лентивирусной конструкцией для экспрессии CAR к FLT3, содержащего эпитопы CD20 во внеклеточном домене, смешивали с 25% комплемента (AbD serotec) в присутствии или в отсутствие ритуксимаба (100 мкг/мл) и инкубировали при 37°С и 5% CO₂ в течение 4 часов. Элиминацию T-клеток с CAR к FLT3 определяли с помощью анализа методом проточной цитометрии с использованием биотинилированного белка FLT3. На ФИГ. 6 показано, что клетки, экспрессирующие CAR к FLT3 и эпитопы CD20, были эффективно элиминированы в присутствии антитела и комплемента, в то время как контрольные FLT3-специфичные CAR T-клетки, не экспрессировавшие эпитопы CD20, подвергались минимальному воздействию.

[0284] Эти результаты демонстрируют, что T-клетки с FLT3-специфичными CAR, экспрессирующие эпитопы CD20, могут быть элиминированы in vitro в присутствии ритуксимаба и комплемента.

b) Элиминация T-клеток с CAR к FLT3 после введения ритуксимаба позволяет восстановить экспрессирующие FLT3 предшественники костного мозга у мышей NSG

[0285] Способность антитела к CD20 ритуксимаба опосредовать элиминацию FLT3-специфичных CAR-Т-клеток, экспрессирующих эпитопы CD20, и облегчать восстановление костного мозга была исследована на мышах. В этом эксперименте мыши получали Т-клетки, экспрессирующие либо CAR к FLT3, способный связываться с мышиным белком FLT3 на поверхности предшественников костного мозга (T-клетки с α-мышиным CAR к FLT3) и содержащий эпитоп CD20, распознаваемый ритуксимабом, либо контрольный CAR, с незначительным связыванием с мышиным белком FLT3. Анализ клеток костного мозга методом проточной цитометрии использовали для демонстрации цитотоксической активности CAR-Т-клеток в отношении экспрессирующих FLT3 гемопоэтических предшественников, рассматриваемой как уменьшение количества предшественников по сравнению с мышами, получавшими контрольные CAR-Т-клетки, или с необработанными мышами (ФИГ. 7, секция B). После подтверждения уничтожающей активности CAR-Т-клеток мышам давали ритуксимаб в течение четырех дней подряд и подсчитывали циркулирующие остаточные CAR-Т-клетки методом проточной цитометрии на 13 день. На ФИГ. 7, секция C показано, что T-клетки с CAR к FLT3 в крови этих мышей были элиминированы по сравнению с контрольной группой, не получавшей ритуксимаб. Наконец, анализ методом проточной цитометрии клеток костного мозга показал, что только мыши, получавшие ритуксимаб (день 20), показали восстановление костного мозга (ФИГ. 7, секция D).

[0286] Этот эксперимент демонстрирует, что зависимая от ритуксимаба элиминация T-клеток с CAR к FLT3, экспрессирующих эпитопы CD20, уменьшает повреждение тканей, экспрессирующих FLT3, таких как костный мозг, обеспечивая быстрое восстановление костного мозга из остаточных клеток-предшественников.

[0287] Хотя раскрытые идеи были описаны со ссылкой на различные применения, способы, наборы и композиции, следует понимать, что без отклонения от идей, изложенных в настоящей заявке, и заявленного изобретения ниже могут быть внесены различные изменения и модификации. Вышеприведенные примеры предоставлены для лучшей иллюстрации раскрытых идей и не предназначены для ограничения объема идей, предложенных в настоящей заявке. Хотя настоящие идеи были описаны в отношении этих иллюстративных вариантов осуществления, специалисту в данной области техники будет ясно, что многочисленные вариации и модификации этих иллюстративных вариантов осуществления возможны без проведения излишних экспериментов. Все такие вариации и модификации находятся в рамках настоящего изобретения.

[0288] Все источники, цитируемые в настоящей заявке, включая патенты, патентные заявки, статьи, учебники и тому подобное, и цитируемые в них источники, в той части, в которой они еще не включены, настоящим полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. В случае, если одна или более ссылок на литературу и аналогичные материалы отличаются или противоречат данной заявке, включая, не ограничиваясь перечисленным, определения терминов, использование терминов, описанные методы или тому подобное, данная заявка имеет преимущество.

Вышеприведенное описание и примеры подробно описывают отдельные конкретные варианты осуществления изобретения и описывают наилучший порядок действий, рассматриваемый авторами. Однако следует иметь в виду, что независимо от того, насколько подробно вышеприведенное может быть описано в тексте, изобретение может быть осуществлено многими способами, и изобретение следует толковать в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и любыми ее эквивалентами.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ALLOGENE THERAPEUTICS, INC.

SASU, Barbra Johnson

DETTLING, Danielle Elizabeth

SOMMER, Cesar Adolfo

YEUNG, Yik Andy

HAMZE, Moustafa Marc

<120> ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА FLT3

<130> ALGN-010/01WO

<150> US 62/514,634

<151> 2017-06-02

<160> 353

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 1

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 121

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Trp Ser Gly Ala Thr Gly Ala Ser Asp Thr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 3

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Val Ser Ala Ser

20 25 30

Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Arg Ser Ser

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 4

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Val Ser Gly Arg Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Arg Pro Thr Tyr Trp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 110

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 7

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser

85 90 95

Asn Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 8

<211> 125

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Trp Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp His His Asp Ser Pro Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Gly Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 9

<211> 110

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 9

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 10

<211> 123

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 10

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Val Met Ala Gly Leu Gly Tyr Asp Pro Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 110

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 11

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu

85 90 95

Ser Arg Pro Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 12

<211> 123

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 12

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Ser Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Ala Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Trp Pro Tyr Met Asp Pro

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 13

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Asn Glu

20 25 30

Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Glu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 16

<211> 122

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Tyr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Leu Gly Ala Pro Trp Ala Gly Tyr Pro Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 17

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Trp

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 18

<211> 121

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 18

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Arg Trp Trp Trp Gly Asp Ala Phe Asp His Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 19

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Ser Ser

20 25 30

Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Val Gly Ser Trp Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ser Ala Phe Gly Glu Leu Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 21

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 21

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ala Val Asp Ser Ser

20 25 30

Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 23

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 24

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 24

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 25

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 25

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Thr

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 26

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 26

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 28

<211> 116

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 28

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Ile Trp Asp Leu Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 29

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Met Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Thr Leu Ile Tyr Pro Ile Pro Phe Glu Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 31

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser His Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Phe Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Asp Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 32

<211> 123

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Glu Gly Ile Gly Gly Asp Leu Arg Tyr Asp Gly Tyr Asp Ala

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 34

<211> 116

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 34

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ser Gly Leu Trp Ala Gly Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 110

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 35

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn

20 25 30

Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val

35 40 45

Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu

65 70 75 80

Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser

85 90 95

Asp His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 36

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 36

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Asp Pro Ala Tyr Gly Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 37

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 37

Ser Tyr Gly Ile Ser

1 5

<210> 38

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 38

Gly Gly Thr Phe Gly Ser Tyr

1 5

<210> 39

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 39

Gly Gly Thr Phe Gly Ser Tyr Gly Ile Ser

1 5 10

<210> 40

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 40

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 41

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 41

Ile Pro Ile Phe Gly Thr

1 5

<210> 42

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 42

Asp Ser Trp Ser Gly Ala Thr Gly Ala Ser Asp Thr

1 5 10

<210> 43

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 43

Ser Tyr Thr Ile Ser

1 5

<210> 44

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 44

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 45

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 45

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Ile Ser

1 5 10

<210> 46

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 46

Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 47

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 47

Ile Pro Ala Phe Gly Ile

1 5

<210> 48

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 48

Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 49

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 49

Ser Tyr Asp Ile Ser

1 5

<210> 50

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 50

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Ile Ser

1 5 10

<210> 51

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 51

Gly Ile Ile Pro Val Ser Gly Arg Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 52

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 52

Ile Pro Val Ser Gly Arg

1 5

<210> 53

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 53

Val Arg Pro Thr Tyr Trp Pro Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 54

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 54

Ser Tyr Tyr Ile Gly

1 5

<210> 55

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 55

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 56

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 56

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Ile Gly

1 5 10

<210> 57

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 57

Gly Ile Ile Pro Trp Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 58

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 58

Ile Pro Trp Phe Gly Thr

1 5

<210> 59

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 59

Asp His His Asp Ser Pro Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Gly Phe Asp Val

1 5 10 15

<210> 60

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 60

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 61

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 61

Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe

1 5

<210> 62

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 62

Gly Phe Ile Phe Ala Ser Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 63

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 63

Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 64

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 64

Ser Ser Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 65

<211> 14

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 65

Asp Arg Val Met Ala Gly Leu Gly Tyr Asp Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 66

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 66

Ser Phe Ala Met Ser

1 5

<210> 67

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 67

Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe

1 5

<210> 68

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 68

Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe Ala Met Ser

1 5 10

<210> 69

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 69

Asp Ile Ser Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 70

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 70

Ser Gly Ser Gly Ala Ser

1 5

<210> 71

<211> 14

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 71

Ala Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Trp Pro Tyr Met Asp Pro

1 5 10

<210> 72

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 72

Arg Tyr Ala Leu Ser

1 5

<210> 73

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 73

Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr

1 5

<210> 74

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 74

Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr Ala Leu Ser

1 5 10

<210> 75

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 75

Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 76

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 76

Ile Pro Met Leu Gly Phe

1 5

<210> 77

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 77

Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210> 78

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 78

Ser Phe Asp Ile Ser

1 5

<210> 79

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 79

Gly Gly Thr Phe Arg Ser Phe

1 5

<210> 80

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 80

Gly Gly Thr Phe Arg Ser Phe Asp Ile Ser

1 5 10

<210> 81

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 81

Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Tyr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 82

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 82

Ile Pro Ile Leu Gly Tyr

1 5

<210> 83

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 83

Asp Leu Gly Ala Pro Trp Ala Gly Tyr Pro Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 84

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 84

Ser Tyr Ala Met His

1 5

<210> 85

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 85

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 86

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 86

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His

1 5 10

<210> 87

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 87

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 88

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 88

Ser Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 89

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 89

Gly Thr Arg Trp Trp Trp Gly Asp Ala Phe Asp His

1 5 10

<210> 90

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 90

Ser Tyr Ala Ile Gln

1 5

<210> 91

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 91

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 92

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 92

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Gln

1 5 10

<210> 93

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 93

Gly Ile Val Gly Ser Trp Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 94

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 94

Val Gly Ser Trp Gly Leu

1 5

<210> 95

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 95

Ser Ala Phe Gly Glu Leu Ala Ser

1 5

<210> 96

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 96

Arg Tyr Ala Leu Ser

1 5

<210> 97

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 97

Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr

1 5

<210> 98

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 98

Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr Ala Leu Ser

1 5 10

<210> 99

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 99

Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 100

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 100

Ile Pro Met Leu Gly Phe

1 5

<210> 101

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 101

Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210> 102

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 102

Ser Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 103

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 103

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 104

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 104

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn

1 5 10

<210> 105

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 105

Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 106

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 106

Ser Gly Gly Gly Arg Ser

1 5

<210> 107

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 107

Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 108

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 108

Ser Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 109

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 109

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 110

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 110

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn

1 5 10

<210> 111

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 111

Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 112

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 112

Ser Gly Gly Gly Arg Ser

1 5

<210> 113

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 113

Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 114

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 114

Asn Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 115

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 115

Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

1 5

<210> 116

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 116

Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Asn

1 5 10

<210> 117

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 117

Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 118

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 118

Ser Gly Ser Gly Gly Thr

1 5

<210> 119

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 119

Gly Ile Trp Asp Leu Arg Tyr

1 5

<210> 120

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 120

Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 121

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 121

Gly Gly Thr Phe Met Ser Tyr

1 5

<210> 122

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 122

Gly Gly Thr Phe Met Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5 10

<210> 123

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 123

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 124

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 124

Ile Pro Ile Phe Gly Ile

1 5

<210> 125

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 125

Glu Thr Leu Ile Tyr Pro Ile Pro Phe Glu Leu

1 5 10

<210> 126

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 126

Ser Tyr Ala Val Ser

1 5

<210> 127

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 127

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 128

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 128

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Val Ser

1 5 10

<210> 129

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 129

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 130

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 130

Ile Pro Ile Phe Gly Ile

1 5

<210> 131

<211> 14

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 131

Glu Gly Ile Gly Gly Asp Leu Arg Tyr Asp Gly Tyr Asp Ala

1 5 10

<210> 132

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 132

Asn Tyr Val Met Asn

1 5

<210> 133

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 133

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

1 5

<210> 134

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 134

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Val Met Asn

1 5 10

<210> 135

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 135

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 136

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 136

Ser Gly Ser Gly Ala Thr

1 5

<210> 137

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 137

Gly Leu Trp Ala Gly Gly Ile

1 5

<210> 138

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 138

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 139

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 139

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 140

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 140

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 141

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 141

Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 142

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 142

Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 143

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 143

Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Asp Pro Ala Tyr Gly Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 144

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 144

Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 145

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 145

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 146

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 146

Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Pro Arg Thr

1 5

<210> 147

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 147

Arg Ala Ser Gln Tyr Val Ser Ala Ser Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 148

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 148

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 149

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 149

Gln Gln Tyr Ala Arg Ser Ser Thr

1 5

<210> 150

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 150

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 151

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 151

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 152

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 152

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 153

<211> 14

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 153

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 154

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 154

Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 155

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 155

Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Thr Val Val

1 5 10

<210> 156

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 156

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr

1 5 10

<210> 157

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 157

Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 158

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 158

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val

1 5 10

<210> 159

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 159

Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr

1 5 10

<210> 160

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 160

Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 161

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 161

Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu Ser Arg Pro Val

1 5 10

<210> 162

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 162

Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Asn Glu Gln Leu Ala

1 5 10

<210> 163

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 163

Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 164

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 164

Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Pro Leu Thr

1 5

<210> 165

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 165

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Glu Leu Ala

1 5 10

<210> 166

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 166

Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 167

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 167

Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 168

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 168

Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His

1 5 10

<210> 169

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 169

Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser

1 5

<210> 170

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 170

Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Trp Val

1 5 10

<210> 171

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 171

Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Ser Ser Gln Leu Ala

1 5 10

<210> 172

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 172

Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 173

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 173

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 174

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 174

Arg Ala Ser Gln Ala Val Asp Ser Ser Asp Leu Ala

1 5 10

<210> 175

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 175

Asp Ala Tyr Thr Arg Pro Ser

1 5

<210> 176

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 176

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 177

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 177

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 178

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 178

Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 179

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 179

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Thr

1 5

<210> 180

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 180

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Thr Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 181

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 181

Asp Thr Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 182

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 182

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Thr

1 5

<210> 183

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 183

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 184

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 184

Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser

1 5

<210> 185

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 185

Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Leu Thr

1 5

<210> 186

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 186

Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 187

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 187

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser

1 5

<210> 188

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 188

Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 189

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 189

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser His Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 190

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 190

Gly Ala Ser Phe Arg Ala Ala

1 5

<210> 191

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 191

Gln Gln Tyr Gly Ser Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 192

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 192

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 193

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 193

Asp Ala Ser Asp Leu Gln Arg

1 5

<210> 194

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 194

Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 195

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 195

Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln

1 5 10

<210> 196

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 196

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser

1 5

<210> 197

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 197

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Trp Val

1 5 10

<210> 198

<211> 993

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 198

Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Gly Gly Gln Leu Pro Leu Leu Val Val

1 5 10 15

Phe Ser Ala Met Ile Phe Gly Thr Ile Thr Asn Gln Asp Leu Pro Val

20 25 30

Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn Asn Asp Ser Ser Val Gly

35 40 45

Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu Ser Pro Glu Asp Leu Gly

50 55 60

Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr Val Tyr Glu Ala Ala Ala

65 70 75 80

Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr Leu Gln Val Leu Val Asp

85 90 95

Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val Phe Lys His Ser Ser Leu

100 105 110

Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn Arg Gly Val Val Ser Met

115 120 125

Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala Gly Glu Tyr Leu Leu Phe

130 135 140

Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Leu Phe Thr Val Ser Ile

145 150 155 160

Arg Asn Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met

165 170 175

Glu Asn Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro

180 185 190

Ile Val Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu

195 200 205

Glu Ser Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu

210 215 220

Phe Gly Thr Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu

225 230 235 240

Cys Thr Arg Leu Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr Thr

245 250 255

Leu Pro Gln Leu Phe Leu Lys Val Gly Glu Pro Leu Trp Ile Arg Cys

260 265 270

Lys Ala Val His Val Asn His Gly Phe Gly Leu Thr Trp Glu Leu Glu

275 280 285

Asn Lys Ala Leu Glu Glu Gly Asn Tyr Phe Glu Met Ser Thr Tyr Ser

290 295 300

Thr Asn Arg Thr Met Ile Arg Ile Leu Phe Ala Phe Val Ser Ser Val

305 310 315 320

Ala Arg Asn Asp Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys Ser Ser Ser Lys His Pro

325 330 335

Ser Gln Ser Ala Leu Val Thr Ile Val Glu Lys Gly Phe Ile Asn Ala

340 345 350

Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp Gln Tyr Glu Glu Phe Cys

355 360 365

Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln Ile Arg Cys Thr Trp Thr

370 375 380

Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln Lys Gly Leu Asp Asn Gly

385 390 395 400

Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys His Gln Pro Gly Glu Tyr

405 410 415

Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln Phe Thr Lys Met Phe Thr

420 425 430

Leu Asn Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu Ala Glu Ala Ser Ala Ser

435 440 445

Gln Ala Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro Leu Pro Ser Trp Thr Trp

450 455 460

Lys Lys Cys Ser Asp Lys Ser Pro Asn Cys Thr Glu Glu Ile Thr Glu

465 470 475 480

Gly Val Trp Asn Arg Lys Ala Asn Arg Lys Val Phe Gly Gln Trp Val

485 490 495

Ser Ser Ser Thr Leu Asn Met Ser Glu Ala Ile Lys Gly Phe Leu Val

500 505 510

Lys Cys Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Thr Ser Cys Glu Thr Ile Leu

515 520 525

Leu Asn Ser Pro Gly Pro Phe Pro Phe Ile Gln Asp Asn Ile Ser Phe

530 535 540

Tyr Ala Thr Ile Gly Val Cys Leu Leu Phe Ile Val Val Leu Thr Leu

545 550 555 560

Leu Ile Cys His Lys Tyr Lys Lys Gln Phe Arg Tyr Glu Ser Gln Leu

565 570 575

Gln Met Val Gln Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val

580 585 590

Asp Phe Arg Glu Tyr Glu Tyr Asp Leu Lys Trp Glu Phe Pro Arg Glu

595 600 605

Asn Leu Glu Phe Gly Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val

610 615 620

Met Asn Ala Thr Ala Tyr Gly Ile Ser Lys Thr Gly Val Ser Ile Gln

625 630 635 640

Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Lys Ala Asp Ser Ser Glu Arg Glu

645 650 655

Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Met Met Thr Gln Leu Gly Ser His Glu

660 665 670

Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Leu Ser Gly Pro Ile Tyr

675 680 685

Leu Ile Phe Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Tyr Leu Arg

690 695 700

Ser Lys Arg Glu Lys Phe His Arg Thr Trp Thr Glu Ile Phe Lys Glu

705 710 715 720

His Asn Phe Ser Phe Tyr Pro Thr Phe Gln Ser His Pro Asn Ser Ser

725 730 735

Met Pro Gly Ser Arg Glu Val Gln Ile His Pro Asp Ser Asp Gln Ile

740 745 750

Ser Gly Leu His Gly Asn Ser Phe His Ser Glu Asp Glu Ile Glu Tyr

755 760 765

Glu Asn Gln Lys Arg Leu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Asn Val Leu Thr

770 775 780

Phe Glu Asp Leu Leu Cys Phe Ala Tyr Gln Val Ala Lys Gly Met Glu

785 790 795 800

Phe Leu Glu Phe Lys Ser Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn

805 810 815

Val Leu Val Thr His Gly Lys Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu

820 825 830

Ala Arg Asp Ile Met Ser Asp Ser Asn Tyr Val Val Arg Gly Asn Ala

835 840 845

Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Phe Glu Gly Ile

850 855 860

Tyr Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu

865 870 875 880

Ile Phe Ser Leu Gly Val Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Val Asp Ala

885 890 895

Asn Phe Tyr Lys Leu Ile Gln Asn Gly Phe Lys Met Asp Gln Pro Phe

900 905 910

Tyr Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Ile Ile Met Gln Ser Cys Trp Ala Phe

915 920 925

Asp Ser Arg Lys Arg Pro Ser Phe Pro Asn Leu Thr Ser Phe Leu Gly

930 935 940

Cys Gln Leu Ala Asp Ala Glu Glu Ala Met Tyr Gln Asn Val Asp Gly

945 950 955 960

Arg Val Ser Glu Cys Pro His Thr Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Phe Ser

965 970 975

Arg Glu Met Asp Leu Gly Leu Leu Ser Pro Gln Ala Gln Val Glu Asp

980 985 990

Ser

<210> 199

<211> 135

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 199

Asn Gln Asp Leu Pro Val Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn

1 5 10 15

Asn Asp Ser Ser Val Gly Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu

20 25 30

Ser Pro Glu Asp Leu Gly Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr

35 40 45

Val Tyr Glu Ala Ala Ala Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr

50 55 60

Leu Gln Val Leu Val Asp Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val

65 70 75 80

Phe Lys His Ser Ser Leu Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn

85 90 95

Arg Gly Val Val Ser Met Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala

100 105 110

Gly Glu Tyr Leu Leu Phe Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile

115 120 125

Leu Phe Thr Val Ser Ile Arg

130 135

<210> 200

<211> 82

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 200

Asn Thr Leu Leu Tyr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met Glu Asn

1 5 10 15

Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro Ile Val

20 25 30

Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu Glu Ser

35 40 45

Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu Phe Gly

50 55 60

Thr Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu Cys Thr

65 70 75 80

Arg Leu

<210> 201

<211> 102

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 201

Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr Thr Leu Pro Gln Leu

1 5 10 15

Phe Leu Lys Val Gly Glu Pro Leu Trp Ile Arg Cys Lys Ala Val His

20 25 30

Val Asn His Gly Phe Gly Leu Thr Trp Glu Leu Glu Asn Lys Ala Leu

35 40 45

Glu Glu Gly Asn Tyr Phe Glu Met Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Arg Thr

50 55 60

Met Ile Arg Ile Leu Phe Ala Phe Val Ser Ser Val Ala Arg Asn Asp

65 70 75 80

Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys Ser Ser Ser Lys His Pro Ser Gln Ser Ala

85 90 95

Leu Val Thr Ile Val Glu

100

<210> 202

<211> 88

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 202

Lys Gly Phe Ile Asn Ala Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp

1 5 10 15

Gln Tyr Glu Glu Phe Cys Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln

20 25 30

Ile Arg Cys Thr Trp Thr Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln

35 40 45

Lys Gly Leu Asp Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys

50 55 60

His Gln Pro Gly Glu Tyr Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln

65 70 75 80

Phe Thr Lys Met Phe Thr Leu Asn

85

<210> 203

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 203

Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu Ala Glu Ala Ser Ala Ser Gln Ala

1 5 10 15

Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro Leu Pro Ser Trp Thr Trp Lys Lys

20 25 30

Cys Ser Asp Lys Ser Pro Asn Cys Thr Glu Glu Ile Thr Glu Gly Val

35 40 45

Trp Asn Arg Lys Ala Asn Arg Lys Val Phe Gly Gln Trp Val Ser Ser

50 55 60

Ser Thr Leu Asn Met Ser Glu Ala Ile Lys Gly Phe Leu Val Lys Cys

65 70 75 80

Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Thr Ser Cys Glu Thr Ile Leu Leu Asn

85 90 95

Ser Pro Gly Pro Phe Pro Phe Ile Gln Asp Asn

100 105

<210> 204

<211> 21

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 204

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 205

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 205

Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln

1 5 10 15

<210> 206

<211> 45

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 206

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 207

<211> 231

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 207

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 208

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 208

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 209

<211> 42

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 209

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 210

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 210

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 211

<211> 52

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 211

Phe Phe Ile Pro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly

1 5 10 15

Leu Phe Ile Ser Thr Gln Gln Gln Val Thr Phe Leu Leu Lys Ile Lys

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro Asn

35 40 45

Pro Lys Asn Asn

50

<210> 212

<211> 215

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 212

Met Asp Thr Glu Ser Asn Arg Arg Ala Asn Leu Ala Leu Pro Gln Glu

1 5 10 15

Pro Ser Ser Val Pro Ala Phe Glu Val Leu Glu Ile Ser Pro Gln Glu

20 25 30

Val Ser Ser Gly Arg Leu Leu Lys Ser Ala Ser Ser Pro Pro Leu His

35 40 45

Thr Trp Leu Thr Val Leu Lys Lys Glu Gln Glu Phe Leu Gly Val Thr

50 55 60

Gln Ile Leu Thr Ala Met Ile Cys Leu Cys Phe Gly Thr Val Val Cys

65 70 75 80

Ser Val Leu Asp Ile Ser His Ile Glu Gly Asp Ile Phe Ser Ser Phe

85 90 95

Lys Ala Gly Tyr Pro Phe Trp Gly Ala Ile Phe Phe Ser Ile Ser Gly

100 105 110

Met Leu Ser Ile Ile Ser Glu Arg Arg Asn Ala Thr Tyr Leu Val Arg

115 120 125

Gly Ser Leu Gly Ala Asn Thr Ala Ser Ser Ile Ala Gly Gly Thr Gly

130 135 140

Ile Thr Ile Leu Ile Ile Asn Leu Lys Lys Ser Leu Ala Tyr Ile His

145 150 155 160

Ile His Ser Cys Gln Lys Phe Phe Glu Thr Lys Cys Phe Met Ala Ser

165 170 175

Phe Ser Thr Glu Ile Val Val Met Met Leu Phe Leu Thr Ile Leu Gly

180 185 190

Leu Gly Ser Ala Val Ser Leu Thr Ile Cys Gly Ala Gly Glu Glu Leu

195 200 205

Lys Gly Asn Lys Val Pro Glu

210 215

<210> 213

<211> 42

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 213

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 214

<211> 41

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 214

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 215

<211> 18

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 215

Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala

1 5 10 15

Ala Ala

<210> 216

<211> 43

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 216

Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu

1 5 10 15

Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile Gln Val

20 25 30

Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser

35 40

<210> 217

<211> 22

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 217

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 218

<211> 21

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 218

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 219

<211> 530

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 219

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 220

<211> 530

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 220

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 221

<211> 530

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 221

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

340 345 350

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 222

<211> 539

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 222

Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

1 5 10 15

Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

20 25 30

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln

35 40 45

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

50 55 60

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

65 70 75 80

Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu

85 90 95

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

100 105 110

Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln

115 120 125

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

130 135 140

Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly

145 150 155 160

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

165 170 175

Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp

180 185 190

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu

195 200 205

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

210 215 220

Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

225 230 235 240

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

245 250 255

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

260 265 270

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

275 280 285

Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

290 295 300

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln

305 310 315 320

Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

325 330 335

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

340 345 350

Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu

355 360 365

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

370 375 380

Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln

385 390 395 400

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

405 410 415

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly

420 425 430

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

435 440 445

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

450 455 460

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu

465 470 475 480

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

485 490 495

Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

500 505 510

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

515 520 525

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu

530 535

<210> 223

<211> 530

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 223

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 224

<211> 530

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 224

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 225

<211> 530

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 225

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

340 345 350

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 226

<211> 530

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 226

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 227

<211> 136

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 227

Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro

20 25 30

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys

35 40 45

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

50 55 60

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

65 70 75 80

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

85 90 95

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

100 105 110

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val

115 120 125

Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val

130 135

<210> 228

<211> 157

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 228

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser

35 40 45

Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser

50 55 60

Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro

65 70 75 80

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

85 90 95

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

100 105 110

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

115 120 125

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg

130 135 140

Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val

145 150 155

<210> 229

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 229

Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys

1 5

<210> 230

<211> 37

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 230

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ser

35

<210> 231

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 231

Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser

1 5 10 15

Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala

20

<210> 232

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 232

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 233

<211> 484

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 233

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly

35 40 45

Val Phe Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn

65 70 75 80

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser

85 90 95

Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser

145 150 155 160

Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

165 170 175

Arg Ala Ser Gln Ala Val Asp Ser Ser Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg

195 200 205

Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

275 280 285

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

305 310 315 320

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

340 345 350

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

355 360 365

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

370 375 380

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

385 390 395 400

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

405 410 415

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

420 425 430

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

435 440 445

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

450 455 460

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

465 470 475 480

Leu Pro Pro Arg

<210> 234

<211> 484

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 234

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly

35 40 45

Val Phe Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn

65 70 75 80

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser

85 90 95

Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser

145 150 155 160

Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

165 170 175

Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Asn Glu Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg

195 200 205

Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

275 280 285

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

305 310 315 320

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

340 345 350

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

355 360 365

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

370 375 380

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

385 390 395 400

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

405 410 415

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

420 425 430

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

435 440 445

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

450 455 460

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

465 470 475 480

Leu Pro Pro Arg

<210> 235

<211> 485

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 235

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly

35 40 45

Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Val Ser Gly Arg Ala Asn

65 70 75 80

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser

85 90 95

Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Arg Pro Thr Tyr Trp Pro Leu Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

165 170 175

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 236

<211> 484

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 236

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly

35 40 45

Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Val Gly Ser Trp Gly Leu Ala Asn

65 70 75 80

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser

85 90 95

Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Ala Phe Gly Glu Leu Ala Ser Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser

145 150 155 160

Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

165 170 175

Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Ser Ser Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg

195 200 205

Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

275 280 285

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

290 295 300

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

305 310 315 320

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

340 345 350

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

355 360 365

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

370 375 380

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

385 390 395 400

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

405 410 415

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

420 425 430

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

435 440 445

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

450 455 460

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

465 470 475 480

Leu Pro Pro Arg

<210> 237

<211> 486

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 237

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly

35 40 45

Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Ile Ala Asn

65 70 75 80

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser

85 90 95

Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Phe

115 120 125

Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr

165 170 175

Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Val Ser Ala Ser Leu Leu Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala

195 200 205

Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Arg Ser Ser Thr Phe Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 238

<211> 490

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 238

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp

115 120 125

Gly Tyr Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

165 170 175

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Thr

180 185 190

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

195 200 205

Ile Tyr Asp Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

225 230 235 240

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu

245 250 255

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 239

<211> 490

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 239

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp

115 120 125

Gly Tyr Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

165 170 175

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

180 185 190

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

195 200 205

Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

225 230 235 240

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro

245 250 255

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 240

<211> 487

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 240

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Arg Trp Trp Trp Gly Asp Ala

115 120 125

Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val

145 150 155 160

Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg

165 170 175

Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser

195 200 205

Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly

210 215 220

Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Trp Val Phe Gly

245 250 255

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 241

<211> 490

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 241

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly

35 40 45

Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn

65 70 75 80

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser

85 90 95

Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile Glu Gly Ile Gly Gly Asp Leu Arg Tyr

115 120 125

Asp Gly Tyr Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu

165 170 175

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser His Ser Tyr

180 185 190

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

195 200 205

Tyr Gly Ala Ser Phe Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

225 230 235 240

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Asp Pro Tyr

245 250 255

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 242

<211> 492

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 242

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Ile Phe Ala Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Thr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Val Met Ala Gly Leu Gly Tyr

115 120 125

Asp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

145 150 155 160

Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg

165 170 175

Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr

180 185 190

Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

195 200 205

Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser

225 230 235 240

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser

245 250 255

Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

275 280 285

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

290 295 300

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

305 310 315 320

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

325 330 335

Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

340 345 350

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

355 360 365

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

435 440 445

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 243

<211> 487

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 243

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly

35 40 45

Thr Phe Met Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn

65 70 75 80

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser

85 90 95

Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Thr Leu Ile Tyr Pro Ile Pro Phe

115 120 125

Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr

165 170 175

Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala

195 200 205

Ser Ser Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro Tyr Thr Phe Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 244

<211> 482

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 244

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Ser Asn Tyr Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ala Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ser Gly Leu Trp Ala Gly Gly Ile Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

145 150 155 160

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

165 170 175

Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

180 185 190

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Gln Arg

195 200 205

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

210 215 220

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

245 250 255

Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

260 265 270

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

275 280 285

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

290 295 300

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

305 310 315 320

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

340 345 350

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

355 360 365

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

370 375 380

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

385 390 395 400

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

405 410 415

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

420 425 430

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

435 440 445

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

450 455 460

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

465 470 475 480

Pro Arg

<210> 245

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная нуклеотидная последовательность

<400> 245

caggtgcagc tggtgcagag cggagcagag gtgaagaagc caggcagctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg cctctggcgg cacattctct agctacgcca tccagtgggt gcggcaggca 120

ccaggacagg gcctggagtg gatgggagga atcgtgggaa gctggggcct ggcaaactac 180

gcccagaagt ttcagggcag agtgaccatc accaccgata agtctacaag caccgcctat 240

atggagctgt cctctctgag gtccgaggac acagccgtgt actattgcgc cacctccgcc 300

ttcggcgagc tggcatcttg gggacagggc acactggtga ccgtgagctc c 351

<210> 246

<211> 325

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная нуклеотидная последовательность

<400> 246

gagatcgtgc tgacacagag cccaggcacc ctgtccctgt ctccaggaga gagggccaca 60

ctgtcctgta gggccagcca gtccgtgcct tctagccagc tggcctggta ccagcagaag 120

ccaggccagg cccccagact gctgatctat gacgcctcct ctagagccac aggcatccca 180

gataggttct ctggcagcgg ctccggcacc gactttacac tgaccatctc caggctggag 240

cccgaggatt tcgccgtgta ctattgccag cagtacggca gctcccctct gacatttggc 300

cagggcacca aggtggagat caagg 325

<210> 247

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная нуклеотидная последовательность

<400> 247

caggtgcagc tggtgcagag cggagcagag gtgaagaagc ccggcagctc cgtgaaggtg 60

tcttgcaagg ccagcggcgg cacattctct agctacgata tctcttgggt gaggcaggcc 120

ccaggccagg gactggagtg gatgggagga atcatccccg tgagcggaag ggcaaactac 180

gcacagaagt ttcagggccg ggtgaccatc accacagaca agtccacatc taccgcctat 240

atggagctgt cctctctgag aagcgaggat acagccgtgt actattgcgc cagagtgagg 300

cctacctact ggccactgga ctattggggc cagggcacac tggtgaccgt gagctcc 357

<210> 248

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная нуклеотидная последовательность

<400> 248

gacatccaga tgacccagtc cccatctagc ctgagcgcct ccgtgggcga tagagtgaca 60

atcacctgta gggcctctca gagcatctcc tcttacctga attggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgca gcaagctccc tgcagtccgg agtgccatct 180

cggttctccg gctctggcag cggcacagac tttacactga ccatctctag cctgcagcct 240

gaggatttcg ccacctacta ttgccagcag tcctattcta caccactgac ctttggccag 300

ggcacaaagg tggagatcaa g 321

<210> 249

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная нуклеотидная последовательность

<400> 249

gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60

agctgcgcag catccggctt catctttgcc tcttacgcaa tgagctgggt gaggcaggcc 120

cctggcaagg gactggagtg ggtgagcgag atcagctcct ctggcggcag caccacatat 180

gccgactccg tgaagggccg cttcacaatc agccgggaca actctaagaa taccctgtac 240

ctgcagatga actccctgag agccgaggac acagccgtgt actattgcgc cagagataga 300

gtgatggccg gcctgggcta tgacccattt gattactggg gccagggcac actggtgacc 360

gtgagctcc 369

<210> 250

<211> 330

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная нуклеотидная последовательность

<400> 250

cagagcgtgc tgacccagcc accttccgcc tctggaacac ccggccagag ggtgaccatc 60

agctgttccg gctctagctc caacatcggc tccaattacg tgtattggta ccagcagctg 120

cccggcacag cccctaagct gctgatctac agaaacaatc agaggccatc tggcgtgccc 180

gaccgcttct ctggcagcaa gtccggcacc tctgccagcc tggcaatcag cggactgcgg 240

tccgaggacg aggccgatta ctattgcgca gcatgggacg attccctgtc tggagtggtg 300

tttggcggcg gcacaaagct gaccgtgctg 330

<210> 251

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная нуклеотидная последовательность

<400> 251

caggtgcagc tggtgcagag cggagcagag gtgaagaagc ctggcagctc cgtgaaggtg 60

tcttgcaagg ccagcggcgg cacattctct agctacacca tctcctgggt gcggcaggcc 120

ccaggccagg gactggagtg gatgggagga atcatcccag ccttcggcat cgccaactac 180

gcccagaagt ttcagggccg cgtgacaatc accgccgaca agtccacatc taccgcctat 240

atggagctgt cctctctgcg gagcgaggat accgccgtgt actattgcgc caagggcggc 300

agctactccc tggactattt tgatatctgg ggccagggca cactggtgac cgtgagctcc 360

<210> 252

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная нуклеотидная последовательность

<400> 252

gagatcgtgc tgacacagtc ccctggcacc ctgtctctga gcccaggcga gagggccaca 60

ctgtcctgta gggcatctca gtacgtgtcc gcctctctgc tggcctggta tcagcagaag 120

cctggccagg ccccaagact gctgatctac ggagcatcca caagagccac cggcatcccc 180

gacaggttca gcggctccgg ctctggaacc gacttcaccc tgaccatctc tagactggag 240

cctgaggact tcgccgtgta ctattgccag cagtatgcca ggtctagcac atttggccag 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 253

<211> 1455

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная нуклеотидная последовательность

<400> 253

atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgccgctcgc 60

ccccaggtgc agctggtcca gagcggagcc gaggtgaaga aaccaggcag ctccgtgaag 120

gtcagctgca aggccagcgg cgggacattc tctagttacg ccatccagtg ggtgcggcag 180

gcccctggcc agggactgga atggatggga ggcattgtcg gctcttgggg gctggccaac 240

tacgctcaga agtttcaggg cagagtgacc atcaccacag ataaatcaac aagcactgca 300

tatatggagc tgtcaagcct gaggagcgaa gacaccgccg tctactattg cgcaacatct 360

gccttcggcg agctggctag ttggggacag gggacactgg tgactgtctc ctctggggga 420

ggaggatcag gaggaggagg aagcggagga ggaggctccg agattgtgct gactcagagc 480

cccggcaccc tgagcctgtc tcctggagaa cgggctacac tgagctgtag agcaagtcag 540

tcagtgccta gttcacagct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc tcctagactg 600

ctgatctatg acgccagctc cagggctaca ggcattccag atcgcttcag cggatccggc 660

tctgggactg actttaccct gacaatctcc aggctggagc ctgaagattt cgccgtgtac 720

tattgccagc agtacggctc tagtccactg acatttggac agggcactaa ggtcgagatc 780

aaaactacca caccagcacc acgaccacct acccctgcac caacaattgc ctctcagcct 840

ctgagtctga gaccagaggc ctgcaggcca gcagcaggag gagcagtgca caccagaggc 900

ctggactttg cctgcgatat ctatatttgg gctcctctgg caggaacttg tggcgtgctg 960

ctgctgtccc tggtcatcac cctgtactgc aagcgaggcc ggaagaaact gctgtatatt 1020

ttcaaacagc ccttcatgcg acccgtgcag actacccagg aggaagatgg ctgcagctgt 1080

cggttccccg aggaagagga aggcgggtgt gagctgcgcg tcaagtttag tcgatcagct 1140

gacgcacctg cctaccagca gggccagaat cagctgtata acgagctgaa tctggggcgg 1200

agagaggaat acgacgtgct ggataaaagg cgaggaaggg acccagaaat gggaggcaag 1260

cctcgacgga aaaacccaca ggagggcctg tacaatgaac tgcagaagga taaaatggct 1320

gaggcatata gcgaaatcgg gatgaaggga gagagaaggc gcgggaaagg acatgacggc 1380

ctgtaccagg ggctgtccac tgcaaccaag gacacctatg atgccctgca tatgcaggca 1440

ctgcctccaa ggtga 1455

<210> 254

<211> 185

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная аминокислотная последовательность

<400> 254

Asn Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met Glu

1 5 10 15

Asn Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro Ile

20 25 30

Val Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu Glu

35 40 45

Ser Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu Phe

50 55 60

Gly Thr Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu Cys

65 70 75 80

Thr Arg Leu Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr Thr Leu

85 90 95

Pro Gln Leu Phe Leu Lys Val Gly Glu Pro Leu Trp Ile Arg Cys Lys

100 105 110

Ala Val His Val Asn His Gly Phe Gly Leu Thr Trp Glu Leu Glu Asn

115 120 125

Lys Ala Leu Glu Glu Gly Asn Tyr Phe Glu Met Ser Thr Tyr Ser Thr

130 135 140

Asn Arg Thr Met Ile Arg Ile Leu Phe Ala Phe Val Ser Ser Val Ala

145 150 155 160

Arg Asn Asp Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys Ser Ser Ser Lys His Pro Ser

165 170 175

Gln Ser Ala Leu Val Thr Ile Val Glu

180 185

<210> 255

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 255

Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp

1 5 10 15

Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn

20

<210> 256

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb-специфичный эпитоп

<400> 256

Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys

1 5 10

<210> 257

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb-специфичный эпитоп

<400> 257

Cys Gln Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Ala Leu Lys Cys

1 5 10

<210> 258

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb-специфичный эпитоп

<400> 258

Cys Val Trp Gln Arg Trp Gln Lys Ser Tyr Val Cys

1 5 10

<210> 259

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb-специфичный эпитоп

<400> 259

Cys Met Trp Asp Arg Phe Ser Arg Trp Tyr Lys Cys

1 5 10

<210> 260

<211> 25

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 260

Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp

1 5 10 15

Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg

20 25

<210> 261

<211> 19

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 261

Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln

1 5 10 15

Ile Lys Glu

<210> 262

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb-специфичный эпитоп

<400> 262

Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser

1 5 10 15

Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala

20

<210> 263

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mAb-специфичный эпитоп

<400> 263

Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ser

1 5 10

<210> 264

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P08B06EE

<400> 264

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser His Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Phe Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Glu Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 265

<211> 123

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P08B06EE

<400> 265

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Glu Gly Ile Gly Gly Asp Leu Arg Tyr Glu Gly Tyr Asp Ala

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 266

<211> 109

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P04A04

<400> 266

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser

20 25 30

Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu

85 90 95

Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 267

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P04A04

<400> 267

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Met Pro Ala Phe Gly Trp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Glu Phe Gly Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 268

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P01A05

<400> 268

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ala Val Asp Ser Ser

20 25 30

Asp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 269

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P01A05

<400> 269

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 270

<211> 106

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P08B03

<400> 270

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 271

<211> 121

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P08B03

<400> 271

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ser Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asp Asp Gly Glu Gly Trp Thr Pro Pro Phe Gly Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 272

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P5F7

<400> 272

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 273

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P5F7

<400> 273

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 274

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P5F7g

<400> 274

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 275

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P5F7g

<400> 275

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 276

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P10A02g

<400> 276

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Asp Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 277

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P10A02g

<400> 277

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 278

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P10A04g

<400> 278

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Lys Val Ser Asp Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Gly Ser Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 279

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P10A04g

<400> 279

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 280

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P10A05g

<400> 280

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Leu Ser Val Ser Asp Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Tyr Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Asn Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 281

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P10A05g

<400> 281

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 282

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P10A07g

<400> 282

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Ser Val Ser Asp Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Tyr Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 283

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P10A07g

<400> 283

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 284

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P10B03g

<400> 284

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Pro Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 285

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P10B03g

<400> 285

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 286

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P10B06g

<400> 286

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Asp Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Tyr Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Ser Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 287

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P10B06g

<400> 287

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 288

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P5F7g2

<400> 288

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 289

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P5F7g2

<400> 289

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 290

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P5F7g3

<400> 290

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Gly Ser Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 291

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P5F7g3

<400> 291

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 292

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь mAb P5F7g4

<400> 292

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Gly Ser Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 293

<211> 124

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь mAb P5F7g4

<400> 293

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 294

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 294

Ser Tyr Ala Val Ser

1 5

<210> 295

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 295

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 296

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 296

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Val Ser

1 5 10

<210> 297

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 297

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 298

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 298

Ile Pro Ile Phe Gly Ile

1 5

<210> 299

<211> 14

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 299

Glu Gly Ile Gly Gly Asp Leu Arg Tyr Glu Gly Tyr Asp Ala

1 5 10

<210> 300

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 300

Ser Tyr Tyr Ile Thr

1 5

<210> 301

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 301

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Ile Thr

1 5 10

<210> 302

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 302

Arg Ile Met Pro Ala Phe Gly Trp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 303

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 303

Met Pro Ala Phe Gly Trp

1 5

<210> 304

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 304

Asp Glu Phe Gly Ala Phe Asp Val

1 5

<210> 305

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 305

Arg Tyr Ala Leu Ser

1 5

<210> 306

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 306

Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr

1 5

<210> 307

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 307

Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr Ala Leu Ser

1 5 10

<210> 308

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 308

Ile Pro Met Leu Gly Phe

1 5

<210> 309

<211> 18

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 309

Gly Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

1 5 10 15

Gln Gly

<210> 310

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 310

Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210> 311

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 311

Ser Tyr Asp Ile Ser

1 5

<210> 312

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 312

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Ile Ser

1 5 10

<210> 313

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 313

Arg Ile Ile Pro Ser Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 314

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 314

Ile Pro Ser Phe Gly Ala

1 5

<210> 315

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 315

Asp Asp Gly Glu Gly Trp Thr Pro Pro Phe Gly Tyr

1 5 10

<210> 316

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 316

Ser Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 317

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 317

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 318

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 318

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn

1 5 10

<210> 319

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 319

Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 320

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 320

Ser Gly Gly Gly Arg Ser

1 5

<210> 321

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 321

Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 322

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 322

Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 323

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 323

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser His Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 324

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 324

Gly Ala Ser Phe Arg Ala Ala

1 5

<210> 325

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 325

Gln Gln Tyr Gly Ser Glu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 326

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 326

Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Gln Leu Ala

1 5 10

<210> 327

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 327

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Leu Ile Thr

1 5 10

<210> 328

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 328

Arg Ala Ser Gln Ala Val Asp Ser Ser Asp Leu Ala

1 5 10

<210> 329

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 329

Asp Ala Tyr Thr Arg Pro Ser

1 5

<210> 330

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 330

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 331

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 331

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 332

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 332

Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 333

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 333

Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 334

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 334

Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 335

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 335

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Thr

1 5

<210> 336

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 336

Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Asp Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 337

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 337

Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Ile Thr

1 5

<210> 338

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 338

Arg Ala Ser Gln Lys Val Ser Asp Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 339

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 339

Gln Gln Tyr Thr Gly Ser Pro Ile Thr

1 5

<210> 340

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 340

Arg Ala Ser Leu Ser Val Ser Asp Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 341

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 341

Asp Ala Tyr Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 342

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 342

Gln Gln Tyr Ser Ser Asn Pro Ile Thr

1 5

<210> 343

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 343

Arg Ala Ser Gly Ser Val Ser Asp Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 344

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 344

Gln Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Ile Thr

1 5

<210> 345

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 345

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 346

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2 mAb

<400> 346

Asp Ala Phe Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 347

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 347

Gln Gln Tyr Gly Thr Pro Pro Ile Thr

1 5

<210> 348

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 348

Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Asp Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 349

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3 mAb

<400> 349

Gln Gln Tyr Ser Ala Ser Pro Ile Thr

1 5

<210> 350

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1 mAb

<400> 350

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 351

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкерный пептид

<400> 351

Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 352

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкерный пептид

<400> 352

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 353

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкерный пептид

<400> 353

Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<---

Группа изобретений относится к иммунотерапии, нацеленной на FLT3. Предложены химерные антигенные рецепторы (CAR), специфически связывающиеся с FLT3, полинуклеотиды, кодирующие CAR к FLT3, сконструированные иммунные клетки, содержащие FLT3-специфичные CAR, способы конструирования иммунных клеток для экспрессии FLT3-специфичных CAR и способы применения T-клеток с FLT3-специфичными CAR для лечения злокачественных новообразований, сопровождающихся нарушением экспрессии FLT3. 19 н. и 58 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 пр.

1. Специфичный к Fms-подобной тирозинкиназе 3 (FLT3) химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий cигнальный пептид CD8α, внеклеточный лиганд-связывающий домен, шарнирный домен CD8α или CD28, трансмембранный домен CD8α и внутриклеточный сигнальный домен,

где указанный внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен CD3ζ и сигнальный домен 4-1BB,

где внеклеточный лиганд-связывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где

(a) область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 90, 91 или 92; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93 или 94; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 95; и область VL содержит CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 171; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 172; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 173;

(b) область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 84, 85 или 86; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 87 или 88; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 89; и область VL содержит CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 168; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 169; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 170;

(c) область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 49, 44 или 50; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51 или 52; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53; и область VL содержит CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 150; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 151; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 152;

(d) область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60, 61 или 62; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63 или 64; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65; и область VL содержит CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 156; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 157; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 158; или

(e) область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43, 44 или 45; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46 или 47; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48; и область VL содержит CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 147; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 148; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 149.

2. FLT3-специфичный CAR по п. 1, где область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 84, 85 или 86; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 87 или 88; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 89; и область VL содержит CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 168; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 169; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 170.

3. FLT3-специфичный CAR по п. 1, где область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60, 61 или 62; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63 или 64; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65; и область VL содержит CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 156; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 157; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 158.

4. FLT3-специфичный CAR по п. 1, где область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43, 44 или 45; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46 или 47; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48; и область VL содержит CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 147; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 148; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 149.

5. Специфичный к Fms-подобной тирозинкиназе 3 (FLT3) химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий cигнальный пептид CD8α, внеклеточный лиганд-связывающий домен, шарнирный домен CD8α или CD28, трансмембранный домен CD8α и внутриклеточный сигнальный домен,

где указанный внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен CD3ζ и сигнальный домен 4-1BB,

где внеклеточный домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где

область VH включает CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 49, 44 или 50; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51 или 52; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53; и область VL содержит CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 150; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 151; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 152.

6. Специфичный к Fms-подобной тирозинкиназе 3 (FLT3) химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий cигнальный пептид CD8α, внеклеточный лиганд-связывающий домен, шарнирный домен CD8α или CD28, трансмембранный домен CD8α и внутриклеточный сигнальный домен,

где указанный внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен CD3ζ и сигнальный домен 4-1BB,

где внеклеточный домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где область VH содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 90, 91 или 92; CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93 или 94; и CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 95; и область VL содержит CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 171; CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 172; и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 173.

7. FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1-6, где область VH содержит одну или более консервативных аминокислотных замен в остатках, не входящих в CDR.

8. FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1-7, где область VL содержит одну или более аминокислотных замен в аминокислотах, не входящих в CDR.

9. Специфичный к Fms-подобной тирозинкиназе 3 (FLT3) химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий cигнальный пептид CD8α, внеклеточный лиганд-связывающий домен, шарнирный домен CD8α или CD28, трансмембранный домен CD8α и внутриклеточный сигнальный домен,

где указанный внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен CD3ζ и сигнальный домен 4-1BB,

где внеклеточный домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где

(a) область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19;

(b) область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17;

(c) область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5;

(d) область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9; или

(e) область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.

10. FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1, 5 и 7-9, где область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.

11. FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1, 6 и 7-9, где область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19.

12. FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1, 2 и 7-9, где область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17.

13. FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1, 4 и 7-9, где область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.

14. FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1, 3 и 7-9, где область VH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, и область VL содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.

15. FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1-14, где указанный внеклеточный лиганд-связывающий домен дополнительно содержит один или более эпитопов, специфичных к моноклональному антителу, где указанные один или более эпитопов содержат эпитопы CD20.

16. FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1-14, где указанный внеклеточный лиганд–связывающий домен дополнительно содержит один или более эпитопов для моноклонального антитела, где указанные один или более эпитопов выбраны из группы, состоящей из эпитопа CD52, эпитопа CD20, эпитопа CD3, эпитопа CD41, эпитопа CD25, эпитопа CD30, эпитопа EGFR, эпитопа TNFα, эпитопа VEGF, эпитопа белка комплемента С5, эпитопа CD11a, эпитопа CD33, эпитопа интегрина альфа-4, эпитопа Fc-области IgE, эпитопа F-белка RSV, эпитопа рецептора IL-6, эпитопа рецептора HER2, эпитопа интегрина α₄β7, эпитопа BAFF (фактора активации B-клеток), эпитопа IL-1β, эпитопа RANKL, эпитопа CTLA4, эпитопа CD34, эпитопа IL-12, эпитопа IL-23 и их комбинаций.

17. FLT3-специфичный CAR по п. 15 или 16, где эпитоп представляет собой эпитоп, специфично распознаваемый алемтузумабом, ибритумомабом тиуксетаном, муромонабом-CD3, тозитумомабом, абциксимабом, базиликсимабом, брентуксимабом ведотином, цетуксимабом, инфликсимабом, ритуксимабом, бевацизумабом, цертолизумабом пеголом, даклизумабом, экулизумабом, эфализумабом, гемтузумабом, натализумабом, омализумабом, паливизумабом, ранибизумабом, тоцилизумабом, трастузумабом, ведолизумабом, адалимумабом, белимумабом, канакинумабом, деносумабом, голимумабом, ипилимумабом, офатумумабом, панитумумабом, QBEND-10 или устекинумабом.

18. FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 15-17, где эпитоп представляет собой эпитоп CD20.

19. FLT3-специфичный CAR по п. 18, где эпитоп CD20 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 229.

20. FLT3-специфичный CAR по п. 1, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 235, 236, 237 или 242.

21. FLT3-специфичный CAR по п. 1, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 235.

22. FLT3-специфичный CAR по п. 1, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 236.

23. FLT3-специфичный CAR по п. 1, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 237.

24. FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1-23, где cигнальный пептид CD8α, внеклеточный лиганд-связывающий домен(ы), шарнирный домен CD8α или CD28, трансмембранный домен CD8α и внутриклеточный сигнальный домен(ы) находятся на одном полипептиде.

25. Полинуклеотид, кодирующий FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1-24.

26. Полинуклеотид по п. 25, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты вектора, имеющего номер доступа в ATCC (Американской коллекции типовых культур) PTA–124227.

27. Полинуклеотид по п. 25, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты вектора, имеющего номер доступа в ATCC PTA–124228.

28. Полинуклеотид по п. 25, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 253.

29. Полинуклеотид по п. 25, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 248.

30. Полинуклеотид по п. 25, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 247.

31. Полинуклеотид по п. 25, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 246.

32. Полинуклеотид по п. 25, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 245.

33. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 25-32.

34. Сконструированная иммунная клетка, экспрессирующая FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1-24, содержащая экспрессионный вектор по п. 33.

35. Сконструированная иммунная клетка по п. 34, содержащая другой CAR, не являющийся специфичным к FLT3.

36. Сконструированная иммунная клетка по п. 34 или 35, содержащая полинуклеотид, кодирующий полипептид суицида.

37. Сконструированная иммунная клетка по п. 36, где полипептид суицида представляет собой RQR8.

38. Сконструированная иммунная клетка по любому из пп. 34-37, происходящая от воспалительного Т–лимфоцита, цитотоксического Т–лимфоцита, регуляторного Т–лимфоцита или хелперного Т–лимфоцита.

39. Сконструированная иммунная клетка по любому из пп. 34-38, в которой разрушены один или более эндогенных генов, где эндогенный ген кодирует TCRα, TCRβ, CD52, глюкокортикоидный рецептор (GR), дезоксицитидинкиназу (dCK) или белок иммунной контрольной точки.

40. Сконструированная иммунная клетка по п. 39, где белок иммунной контрольной точки представляет собой белок программируемой смерти–1 (PD–1).

41. Сконструированная иммунная клетка по любому из пп. 34-40, полученная от здорового донора.

42. Сконструированная иммунная клетка по любому из пп. 34-40, полученная от донора, страдающего от заболевания или нарушения.

43. Сконструированная иммунная клетка по любому из пп. 34-42 для применения в качестве лекарственного средства.

44. Сконструированная иммунная клетка по п. 43, где лекарственное средство предназначено для применения в лечении рака, выбранного из группы, состоящей из множественной миеломы, злокачественного новообразования из плазматических клеток, лимфомы Ходжкина, нодулярной лимфомы Ходжкина с лимфоидным преобладанием, болезни Калера и миеломатоза, лейкоза из плазматических клеток, плазмоцитомы, В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ), хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), фолликулярной лимфомы, лимфомы Беркитта, лимфомы маргинальной зоны, мантийноклеточной лимфомы, крупноклеточной лимфомы, лимфобластной лимфомы из B-клеток предшественников, миелоидного лейкоза, макроглобулинемии Вальденстрема, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, лимфомы из лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы Беркитта, первичной медиастинальной (тимусной) крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфоплазмоцитарной лимфомы, макроглобулинемии Вальденстрема, нодулярной В-клеточной лимфомы маргинальной зоны, лимфомы маргинальной зоны селезенки, внутрисосудистой крупноклеточной В-клеточной лимфомы, первичной выпотной лимфомы, лимфоматоидного гранулематоза, крупноклеточной В-клеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, первичной лимфомы центральной нервной системы, первичной кожной диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (типа нижних конечностей), положительной по вирусу Эпштейна–Барр диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы пожилых, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, связанной с воспалением, внутрисосудистой крупноклеточной B-клеточной лимфомы, ALK-позитивной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, плазмабластной лимфомы, крупноклеточной B-клеточной лимфомы, возникающей при HHV8–ассоциированной многоцентровой болезни Кастлемана, неклассифицированной B-клеточной лимфомы с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и лимфомой Беркитта, неклассифицированной B-клеточной лимфомы с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и классической лимфомой Ходжкина, и других раковых заболеваний, связанных с гемопоэтическими клетками.

45. Сконструированная иммунная клетка по любому из пп. 34-44, где FLT3-специфичный CAR содержит внеклеточный домен, содержащий ScFv,

где scFv связывается с внеклеточным доменом человеческой FLT3 с K_D, составляющей от 10 нМ до 80 нМ, или

где scFv связывается с доменом 4 внеклеточного домена человеческой FLT3 с K_D, составляющей от 1 нМ до 100 нМ, или

где scFv связывается с доменом 2–3 внеклеточного домена человеческой FLT3 с K_D, составляющей от 5 нМ до 30 нМ.

46. Популяция клеток для лечения заболевания или нарушения, связанных с нарушенной экспрессией FLT3, у нуждающегося в этом субъекта, содержащая сконструированные иммунные клетки по любому из пп. 34-45, где

(i) указанная популяция клеток содержит процентную долю стволовых клеток памяти и клеток центральной памяти, превышающую 20%, 30% или 40%, и/или

(ii) указанная популяция клеток обеспечивает лизис клеток, экспрессирующих FLT3, составляющий более 10%, 20%, 30% или 40%.

47. Способ конструирования иммунной клетки, экспрессирующей FLT3-специфичный CAR, включающий:

обеспечение иммунной клетки; и

введение в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1–24;

в результате чего указанная иммунная клетка экспрессирует указанный FLT3-специфичный CAR.

48. Способ конструирования иммунной клетки, включающий:

обеспечение иммунной клетки;

введение в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1–24; и

введение в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего CAR, не являющийся специфичным к FLT3,

посредством чего обеспечивается сконструированная иммунная клетка, экспрессирующая FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 1–24 и CAR, не специфичный в отношении FLT3.

49. Способ лечения злокачественного новообразования, сопровождающегося нарушенной экспрессией FLT3, у нуждающегося в этом субъекта, включающий:

a) обеспечение популяции иммунных клеток, экспрессирующих FLT3-специфичный CAR, по любому из пп. 1–24; и

b) введение указанной популяции иммунных клеток указанному субъекту.

50. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или нарушения, связанного с FLT3, у нуждающегося в этом субъекта, содержащая сконструированные иммунные клетки по любому из пп. 34-42.

51. Способ лечения заболевания или нарушения, связанных с нарушенной экспрессией FLT3, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества фармацевтической композиции по п. 50 или сконструированных иммунных клеток по любому из пп. 34-42.

52. Способ по п. 51, где заболевание или нарушение, связанное с FLT3, представляет собой рак.

53. Способ по п. 52, где рак выбран из группы, состоящей из множественной миеломы, злокачественного новообразования из плазматических клеток, лимфомы Ходжкина, нодулярной лимфомы Ходжкина с лимфоидным преобладанием, болезни Калера и миеломатоза, лейкоза из плазматических клеток, плазмоцитомы, В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ), хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), фолликулярной лимфомы, лимфомы Беркитта, лимфомы маргинальной зоны, мантийноклеточной лимфомы, крупноклеточной лимфомы, лимфобластной лимфомы из B-клеток предшественников, миелоидного лейкоза, макроглобулинемии Вальденстрема, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, лимфомы из лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы Беркитта, первичной медиастинальной (тимусной) крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфоплазмоцитарной лимфомы, макроглобулинемии Вальденстрема, нодулярной В-клеточной лимфомы маргинальной зоны, лимфомы маргинальной зоны селезенки, внутрисосудистой крупноклеточной В-клеточной лимфомы, первичной выпотной лимфомы, лимфоматоидного гранулематоза, крупноклеточной В-клеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, первичной лимфомы центральной нервной системы, первичной кожной диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (типа нижних конечностей), положительной по вирусу Эпштейна-Барр диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы пожилых, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, связанной с воспалением, внутрисосудистой крупноклеточной B–клеточной лимфомы, ALK-позитивной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, плазмабластной лимфомы, крупноклеточной B-клеточной лимфомы, возникающей при HHV8–ассоциированной многоцентровой болезни Кастлемана, неклассифицированной B-клеточной лимфомы с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и лимфомой Беркитта, неклассифицированной B-клеточной лимфомы с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и классической лимфомой Ходжкина, и других раковых заболеваний, связанных с гемопоэтическими клетками.

54. Способ ингибирования роста или прогрессирования опухоли у субъекта, имеющего злокачественные клетки, экспрессирующие FLT3, включающий введение указанному субъекту эффективного количества фармацевтической композиции по п. 50 или сконструированных иммунных клеток по любому из пп. 34-42.

55. Способ ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих FLT3, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества фармацевтической композиции по п. 50 или сконструированных иммунных клеток по любому из пп. 34-42.

56. Способ индукции регрессии опухоли у субъекта, имеющего злокачественные клетки, экспрессирующие FLT3, включающий введение указанному субъекту эффективного количества фармацевтической композиции по п. 50 или сконструированных иммунных клеток по любому из пп. 34-42.

57. Способ по любому из пп. 51-56, включающий введение указанному субъекту терапии нуклеозидным аналогом.

58. Способ по п. 57, где терапия нуклеозидным аналогом представляет собой флударабин или клофарабин.

59. Способ по любому из пп. 51-56, включающий введение указанному субъекту ингибитора рецепторной тирозинкиназы, ингибиторов mTOR, эпигенетического модулятора, ингибитора протеасомы, иммуномодулирующего агента, ингибитора сигнального пути Hedgehog или ингибиторов изоцитратдегидрогеназы (IDH).

60. Способ по любому из пп. 51-56, включающий введение указанному субъекту ингибитора протеасомы, иммуномодулирующего агента или ингибитора сигнального пути Hedgehog, или их комбинации.

61. Способ по любому из пп. 51-56, включающий введение указанному субъекту леналидомида.

62. Способ отбора популяции иммунных клеток in vitro, где указанная популяция содержит сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 15-19, включающий:

a. приведение указанной популяции иммунных клеток в контакт с моноклональным антителом, специфичным к указанным одному из более эпитопам; и

b. отбор иммунных клеток, связывающихся с моноклональным антителом, с получением популяции клеток, обогащенной сконструированными иммунными клетками, экспрессирующими FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 15-19.

63. Способ по п. 62, где моноклональное антитело, специфичное к указанному эпитопу, конъюгировано с флуорофором, и, необязательно, стадию отбора клеток, связывающихся с моноклональным антителом, осуществляют посредством флуоресцентно–активируемой сортировки клеток (FACS).

64. Способ по п. 62, где моноклональное антитело, специфичное к указанному эпитопу, конъюгировано с магнитной частицей, и, необязательно, стадию отбора клеток, связывающихся с моноклональным антителом, осуществляют посредством магнитно–активируемой сортировки клеток (MACS).

65. Способ по любому из пп. 62-64, где эпитоп представляет собой эпитоп CD20.

66. Способ по п. 65, где эпитоп CD20 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 229, и, необязательно, моноклональное антитело представляет собой ритуксимаб.

67. Способ по любому из пп. 62-66, где популяция клеток, обогащенная сконструированными иммунными клетками, содержит по меньшей мере 70% иммунных клеток, экспрессирующих CAR к FLT3.

68. Способ элиминации сконструированных иммунных клеток у субъекта, где субъекту были введены сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 15-19, где способ включает введение указанному субъекту моноклонального антитела, специфичного к указанным одному или более эпитопам.

69. Способ по п. 68, где эпитоп представляет собой эпитоп CD20.

70. Способ по п. 69, где эпитоп CD20 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 229, и, необязательно, моноклональное антитело представляет собой ритуксимаб.

71. Способ по любому из пп. 68-70, где моноклональное антитело конъюгировано с молекулой, способной активировать систему комплемента.

72. Способ по любому из пп. 68-70, где цитотоксическое лекарственное средство связано с моноклональным антителом.

73. Способ стимуляции восстановления эндогенных экспрессирующих FLT3 клеток-предшественников костного мозга у субъекта, которому были введены сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие FLT3-специфичный CAR по любому из пп. 15-19, где способ включает введение указанному пациенту моноклонального антитела, специфичного к указанным одному или более эпитопам.

74. Способ по п. 73, где эпитоп представляет собой эпитоп CD20.

75. Способ по п. 74, где эпитоп CD20 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 229, и, необязательно, моноклональное антитело представляет собой ритуксимаб.

76. Способ по любому из пп. 73-75, где моноклональное антитело конъюгировано с молекулой, способной активировать систему комплемента.

77. Способ по любому из пп. 73-75, где цитотоксическое лекарственное средство связано с моноклональным антителом.