РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/837,518, поданной 23 апреля 2019 г.; предварительной заявке на патент США №62/859,699, поданной 10 июня 2019 г.; европейской заявке на патент №20305145.3, поданной 17 февраля 2020 г.; и европейской заявке на патент №20305146.6, поданной 17 февраля 2020 г., полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате с кодировкой ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей своей полноте. Копия указанного файла с кодировкой ASCII, созданная 17 апреля 2020 г., имеет название 704023_SA9-289PC_ST25.txt, и ее размер составляет 44783 байта.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] В данном документе предусмотрены антитела к CD38, характеризующиеся улучшенной цитотоксической активностью, а также стабильные составы на их основе.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] CD38 представляет собой гликозилированный мембранный белок II типа с молекулярной массой 45 килодальтон (кДа), который был идентифицирован как маркер лимфоцитов. CD38 играет роль в гомеостазе лейкоцитов посредством модуляции выживания и дифференцировки гемопоэтических клеток (Richards JO, et al., Mol Cancer Ther. 2008; 7(8):2517-27). CD38 функционирует в качестве рецептора, связывающего CD31, и участвует в клеточной адгезии и передаче сигналов. Функция CD38 в передаче сигналов, по-видимому, варьируется в зависимости от клеточной линии дифференцировки, стадии дифференцировки и, возможно, ассоциации с различными корецепторами (Richards JO, et al., 2008). CD38 также представляет собой эктофермент, катализирующий синтез и гидролиз циклической аденозиндифосфатрибозы (cADPR) от никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) до ADP-рибозы (DiLillo DJ, Ravetch JV., Cell. 2015; 161(5):1035-45). Эти продукты реакции участвуют в мобилизации кальция и внутриклеточной передаче сигналов (Derer S, et al., MAbs. 2014; 6(2):409-21).

[0003] Экспрессия CD38 у здоровых людей может быть обнаружена на NK-клетках, моноцитах, дендритных клетках, макрофагах, гранулоцитах, активированных Т- и В-клетках и плазматических клетках. В отличие от этого, экспрессия не была обнаружена в случае гемопоэтических стволовых клеток, покоящихся Т- и В-клеток или тканевых макрофагов. Кроме того, экспрессия CD38 наблюдается в случае некоторых гематологических злокачественных новообразований, таких как дискразии плазматических клеток (например, множественная миелома (MM), амилоидоз) и другие формы рака гематопоэтического происхождения, в том числе включая, например, болезнь Вальденстрема, неходжкинскую лимфому (NHL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) и острый миелогенный лейкоз (AML).

[0004] Экспрессия CD38 особенно выражена при ММ, поскольку >98% пациентов являются положительными по этому белку (Reinherz EL, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1980; 77(3):1588-92, Lin P, et al., Am J Clin Pathol. 2004; 121(4):482-8). Сильная и однородная экспрессия CD38 на злокачественных клональных клетках ММ контрастирует с паттерном ограниченной экспрессии на нормальных клетках, подтверждая, что этот антиген может быть применим для специфического нацеливания на опухолевые клетки.

[0005] ММ представляет собой злокачественное заболевание плазматических клеток, которое характеризуется экспрессией CD38 на клеточной поверхности, клональной пролиферацией плазматических клеток в костном мозге (BM) и продуцированием чрезмерного количества моноклонального иммуноглобулина (обычно типа IgG или IgA или свободной легкой цепи в моче (также обозначаемой как парапротеин, M-белок или M-компонент)). Данное заболевание в основном ассоциировано с пожилым возрастом, при этом возраст более чем 80% пациентов составляет 60 лет и старше.

[0006] Течение заболевания в случае ММ варьируется в зависимости от агрессивности заболевания и связанных с ним прогностических факторов. Было показано, что некоторые хромосомные аномалии при множественной миеломе ассоциированы с неблагоприятным клиническим исходом. Цитогенетические изменения высокого риска включают, среди прочего, del(17p), t(4;14), t(14;16) и амплификацию 1q. За последние два десятилетия медианная выживаемость увеличилась с 3 до 6 лет; однако прожитый некоторыми пациентами период может составлять более 10 лет (Ocio EM, et al., Expert Rev Hematol. 2014; 7(1):127-41). Варианты лечения и выживаемость зависят от возраста, состояния здоровья и статуса заболевания, которыми характеризуется пациент. Пациенты в возрасте примерно 65 лет с симптомами активного заболевания и хорошим физическим здоровьем, как правило, получают начальную терапию в виде трансплантации аутологичных стволовых клеток (ASCT). Для достижения циторедукции при заболевании перед забором стволовых клеток применяют индукционную химиотерапию. Режимы индукционного лечения включают алкилирующие средства, только дексаметазон, талидомид совместно с дексаметазоном, а также винкристин, Adriamycin® (доксорубицин) и дексаметазон (VAD; или модификации этого режима); однако последние два режима ассоциированы с более высокой токсичностью (Richardson PG, et al., Blood. 2010; 116(5):679-86, Arnulf B, et al., Haematologica. 2012; 97:1925-8). Лечение с помощью только Velcade® (бортезомиба), комбинаций с бортезомибом и Revlimid® (леналидомида) совместно с дексаметазоном продемонстрировало улучшенные результаты в качестве индукционной терапии, и эти средства демонстрируют более высокие показатели частоты ответа и более низкую токсичность (Richardson PG 2010, Kumar S, et al., Blood. 2012; 119(19):4375-82; Roussel M, et al., J Clin Oncol. 2014; 32:2712-7; Durie BGM, et al., Lancet. 2017; 389:519-27). Дополнительные одобренные лекарственные средства включают помалидомид (принадлежащий к тому же классу IMiD®, что и леналидомид), а также карфилзомиб и иксазомиб (принадлежащие к тому же классу ингибиторов протеасом, что и бортезомиб). В дополнение к этим новым видам лечения моноклональные антитела, в частности антитела к CD38, начали играть важную роль в лечении пациентов с миеломой. Даратумумаб, представляющий собой антитело к CD38, был одобрен для лечения ММ в качестве отдельного средства и в комбинации с другими средствами лечения ММ (Touzeau C, Moreau P., Expert Opin Biol Ther. 2017; 17(7):887-93; Tzogani K., et al., Oncologist. 2018; 23:1-11). Сообщалось о том, что исатуксимаб, представляющий собой антитело к CD38, обуславливает частоту ответа, составляющую 25-29%, в качестве монотерапии и частоту ответа, составляющую 60%, при комбинированной терапии в случае рецидивирующей или рефрактерной множественной миеломы (Martin T, et al., Blood. 2017; 129(25):3294-303); при этом недавние результаты исследования фазы 3 показали, что добавление изатуксимаба способно повысить выживаемость без прогрессирования при применении комбинации помалидомид-дексаметазон при рецидивирующей и рефрактерной множественной миеломе (J Clin Oncol 37, 2019 (suppl; abstr 8004)). Кроме того, элотузумаб, антитело к Slam-F7, был одобрен в комбинации с леналидомидом и дексаметазоном для лечения взрослых пациентов с ММ, которые ранее получали от одной до трех линий терапии, а также в комбинации с помалидомидом и дексаметазоном для лечения взрослых пациентов с ММ, которые ранее получали по меньшей мере два терапевтических средства, включая леналидомид и ингибитор протеасом (Bristol-Myers Squibb Company. EMPLICITI® (elotuzumab) [листок-вкладыш]. Адрес на веб-сайте Управления по контролю за продуктами и лекарственными средствами США: www-dot-accessdata-dot-fda.gov/drugsatfda_docs/label/2018/761035s008lbl.pdf. Пересмотрено в ноябре 2018 г.

[0007] Текущая цель терапии этих характеризующихся экспрессией CD38 заболеваний заключается в эффективном контроле заболевания, насколько это возможно, повышении качества жизни и продлении периода выживаемости. Например, пациенты с ММ в течение своей жизни будут подвергаться различным схемам лечения в количестве, составляющем в среднем от 4 до 8. Таким образом, несмотря на улучшение результатов лечения пациентов с помощью новых видов терапии, MM остается заболеванием со смертельных исходом. Таким образом, лечение пациентов, которые получали современные виды терапии и у которых при этом наблюдалось прогрессирование, в том числе при использовании видов терапии антителами, остается существенной трудноразрешимой неудовлетворенной медицинской потребностью.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] По сравнению с доступными в настоящее время видами лечения характеризующихся экспрессией CD38 заболеваний, включая виды лечения антителами, предполагается, что антитела, варианты их применения и способы лечения, представленные в данном документе, могут обеспечить более эффективные клинический ответ или лечение заболевания. В данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связывают CD38 человека и опосредуют более эффективное уничтожение клеток, которые экспрессируют CD38, составы и стандартные лекарственные формы, содержащие антитела, способы получения антител и способы применения антител.

[0009] В одном аспекте предусмотрены антитела, которые специфически связывают CD38 человека. В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат легкую цепь (LC), характеризующуюся аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8 и 9, и тяжелую цепь (НС), характеризующуюся аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 и 6.

[0010] В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, и HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, и HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, и HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, и HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 4.

[0011] В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 8, и HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 8, и HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 8, и HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6.

[0012] В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 9, и HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 9, и HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 9, и HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7.

[0013] В другом аспекте в данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие составленное антитело. В некоторых вариантах осуществления фармацевтических композиций антитело содержит HC и LC, характеризующиеся аминокислотными последовательностями, как описано выше, в комбинации с сахарозой, L-гистидином и полисорбатом 80. В некоторых вариантах осуществления антитело присутствует в концентрации 50 мг/мл, сахароза присутствует в концентрации 8% (вес/об.), L-гистидин присутствует в концентрации 10 мМ, полисорбат 80 (PS80) присутствует в концентрации 0,05% (об./об.), и композиция характеризуется pH 6,2. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция является лиофилизированной.

[0014] В другом аспекте в данном документе предусмотрены стандартные лекарственные формы, содержащие составленное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC и LC, характеризующиеся аминокислотными последовательностями, как описано выше, а стандартная лекарственная форма содержит 215 мг антитела, 6,21 мг L-гистидина, 344 мг сахарозы и 2,15 мг полисорбата 80. В некоторых вариантах осуществления стандартная лекарственная форма антитела является лиофилизированной.

[0015] В другом аспекте в данном документе предусмотрены способы получения фармацевтических композиций, содержащих антитело, которое специфически связывает CD38 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC и LC, характеризующиеся аминокислотными последовательностями, как описано выше, при этом способ включает экспрессию антитела в культуре клеток, подвергание антитела по меньшей мере одному из стадии хроматографической очистки и стадии ультрафильтрации с получением раствора очищенного антитела; и корректирование раствора очищенного антитела с получением состава на основе антитела. В некоторых вариантах осуществления состав на основе антитела содержит очищенное антитело, сахарозу, L-гистидин и полисорбат 80. В некоторых вариантах осуществления состав на основе антитела содержит антитело в концентрации 50 мг/мл, сахарозу в концентрации 8% вес/об., L-гистидин в концентрации 10 мМ и полисорбат 80 (PS80) в концентрации 0,05% об./об. В некоторых вариантах осуществления состав на основе антитела получают таким образом, что он характеризуется pH 6,2. В некоторых вариантах осуществления способа получения состава на основе антитела состав на основе антитела является лиофилизированным.

[0016] В другом аспекте предусмотрены способы получения восстановленного состава на основе антитела. В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный состав на основе антитела содержит сахарозу, L-гистидин, PS80 и антитело, которое специфически связывает CD38 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC и LC, характеризующиеся аминокислотными последовательностями, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный состав на основе антитела восстанавливают в разбавителе, за счет чего получают восстановленный состав на основе антитела. В некоторых вариантах осуществления восстановленный состав на основе антитела содержит антитело в концентрации 50 мг/мл, сахарозу в концентрации 8% вес/об., L-гистидин в концентрации 10 мМ и PS80 в концентрации 0,05% об./об. В некоторых вариантах осуществления восстановленный состав на основе антитела характеризуется pH 6,2.

[0017] В другом аспекте предусмотрены способы лечения пациента, у которого имеется множественная миелома. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение пациенту одной или нескольких доз антитела, которое специфически связывает CD38 человека, где антитело содержит HC и LC, характеризующиеся аминокислотными последовательностями, как описано выше.

[0018] В другом аспекте предусмотрены антитела для применения в способе лечения множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления антитело специфически связывает CD38 человека, при этом антитело содержит HC и LC, характеризующиеся аминокислотными последовательностями, как описано выше.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0019] На фиг.1 представлен график, показывающий начало разворачивания для mAb 1, 2, 3, 5, 6, 7 и 8.

[0020] На фиг.2 представлен график, показывающий изоэлектрическую точку (pI) для mAb 1, 3, 5, 6, 7 и 8.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0021] В данном документе предусмотрены антитела к CD38, которые обуславливают более эффективную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в отношении клеток, экспрессирующих высокие, средние и низкие уровни CD38 на своих клеточных поверхностях. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD38, предусмотренные в данном документе, также обуславливают более высокую активность, представленную антителозависимым клеточным фагоцитозом (ADCP), в отношении клеток, экспрессирующих CD38 на своих клеточных поверхностях. В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, характеризуются более низким значением изоэлектрической точки (pI), чем ожидаемое. Несмотря на более низкое значение pI, чем ожидаемое, а также начало разворачивания белка при более низкой температуре, что может отрицательно повлиять на стабильность антитела, особенно в ходе осуществления способов коммерческого получения, антитела, предусмотренные в данном документе, представлены в стабильной подходящей форме для введения пациентам-людям.

Антитела

[0022] В данном документе предусмотрены антитела к CD38, которые специфически связывают CD38 человека. Антитела к CD38, предусмотренные в данном документе, могут быть получены с применением рекомбинантных способов. Для рекомбинантного получения антитела к антигену нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, выделяют и вставляют в реплицируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. ДНК, кодирующая антитело, легко выделяется и секвенируется с применением обычных процедур (например, с применением олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела). Многие векторы являются доступными. Компоненты вектора обычно включают без ограничения одно или несколько из следующих: сигнальная последовательность, точка начала репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции. Вектором обычно трансформируют клетку-хозяина, подходящую для экспрессии нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку или прокариотическую клетку. В некоторых вариантах осуществления эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. Примерами применимых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линия клеток почки эмбриона человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомячка (BHK, ATCC CCL 10); клетки Сертоли мыши (™4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы линии Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4 и линия клеток гепатомы человека (Hep G2). Другие применимые линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (CHO), включая клетки DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)), и линии клеток миеломы, такие как NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, подходящих для продуцирования антител, см., например, в Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp.255-268. Антитело к CD38, полученное из клеток, может быть очищено с применением, например, хроматографии с гидроксиапатитом, хроматографии с гидрофобным взаимодействием, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, при этом аффинная хроматография является одной из типично предпочтительных стадий очистки. В целом, различные методики получения антител для применения в исследовании, тестировании и клинических областях применения хорошо известны из уровня техники, согласуются с вышеописанными методиками и/или считаются подходящими для специалиста в данной области.

[0023] В некоторых вариантах осуществления антитело экспрессируется линией клеток-хозяев CHO 8D6 (производное DXB11) с применением одноразового биореактора емкостью 500 л, работающего в режиме периодического культивирования с подпиткой. Процедура культивирования клеток инициируется размораживанием флакона с основным банком клеток с последующей серией стадий размножения клеток в системе посевных ферментеров. Затем клетки переносят в биореактор и выращивают с применением бессывороточной среды для культивирования клеток определенного химического состава. Культивирование прекращают для осуществления сбора антител через 10-14 дней. Клетки и дебрис клеточной культуры можно удалить из собранной клеточной культуры путем глубинной фильтрации.

[0024] Собранный материал затем подвергают дальнейшим стадиям хроматографии и фильтрации с получением очищенного антитела. Очищенное антитело составляют в виде жидкого раствора и хранят при температуре ≤ -30°C.

[0025] Перед размещением составленного антитела в подходящих флаконах жидкий раствор размораживают и фильтруют в стерильных условиях с применением устройства для фильтрации с размером пор 0,2 мкм. Составленное антитело размещают в подходящем контейнере, таком как стеклянный флакон USP типа 1, в количестве 4,3 мл/флакон. В некоторых вариантах осуществления наполненный флакон содержит избыточное количество составленного антитела, составляющее 0,3 мл. В некоторых вариантах осуществления составленное антитело является лиофилизированным во флаконе.

[0026] Термин “антитело” обычно относится к тетрамерному белку, содержащему две тяжелые цепи (HC) и две легкие цепи (LC). Каждый такой тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара содержит одну LC (обычно имеющую молекулярную массу приблизительно 25 кДа) и одну HC (обычно имеющую молекулярную массу приблизительно 50-70 кДа). Используемые в данном документе термины “HC” и “LC” относятся к любому полипептиду иммуноглобулина, содержащему последовательность вариабельного домена, достаточную для придания специфичности в отношении целевого антигена. Аминоконцевая часть каждой легкой и тяжелой цепи обычно содержит вариабельный домен из приблизительно 100-110 аминокислот или больше, который обычно отвечает за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи обычно содержит константный домен, который отвечает за эффекторную функцию. Таким образом, в типичном антителе полипептид полноразмерной HC иммуноглобулина содержит вариабельный домен (VH) и три константных домена (CH1, CH2 и CH3), при этом домен VH находится на аминоконце полипептида, а домен CH3 находится на карбоксильном конце, а полипептид полноразмерной LC иммуноглобулина содержит вариабельный домен (VL) и константный домен (CL), при этом домен VL находится на аминоконце полипептида, а домен CL находится на карбоксильном конце.

[0027] Термин “антитело” используется в данном документе в самом широком смысле и конкретно охватывает типичные антитела, как описано выше, включая моноклональные антитела и мультиспецифические антитела (например, би- и триспецифические антитела, если они проявляют необходимую биологическую активность, включая специфическое связывание с мишенью CD38 и способность индуцировать ADCC и ADCP).

[0028] Используемый в данном документе термин “Fc” обозначает молекулу, будь то в мономерной или мультимерной форме, содержащую последовательность, не являющуюся частью антигенсвязывающего фрагмента, которая получена в результате расщепления антитела или получена другими способами, и при этом она может содержать шарнирную область. Молекулы Fc составлены из мономерных полипептидов, которые могут быть связаны в димерные или мультимерные формы посредством ковалентной (т.е. дисульфидных связей) и нековалентной связей. Количество межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами типичных молекул Fc находится в диапазоне от 1 до 4 в зависимости от класса (например, IgG, IgA и IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2 и IgG4). Одним примером Fc является димер с дисульфидной связью, образуемый в результате расщепления IgG папаином.

[0029] Антитела, описанные в данном документе, могут быть выделенными. Термин “выделенный белок”, “выделенный полипептид” или “выделенное антитело” относится к белку, полипептиду или антителу, которые в силу своего происхождения или источника получения (1) не связаны с естественным образом связанными с ними компонентами, сопутствующими им в их нативном состоянии, (2) по сути не содержат других белков от того же биологического вида, (3) экспрессируются в клетке другого биологического вида и/или (4) не встречаются в природе. Таким образом, полипептид, синтезированный химическим путем или синтезированный в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит естественным образом, будет являться “выделенным” из естественным образом связанных с ним компонентов. Белок также можно сделать по сути не содержащим естественным образом связанных с ним компонентов путем выделения с применением методик очистки белка, хорошо известных в данной области техники.

[0030] В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, содержат аминокислотные последовательности HC и LC, представленные в таблице 1.

Таблица 1 mAb HC
SEQ ID NO: LC
SEQ ID NO: 2 2 7 3 3 7 4 4 7 5 5 8 6 5 9 7 6 8 8 6 9 9 10 7

СВОЙСТВА СВЯЗЫВАНИЯ

[0031] Термин “аффинность” относится к показателю притяжения между двумя полипептидами, такими как, например, рецептор/лиганд или антиген/антитело. Свойственное притяжение между двумя полипептидами может быть выражено как равновесная константа аффинности связывания (KD) для конкретного взаимодействия. Считается, что антитело специфически связывается с антигеном, когда KD составляет ≤1 мкМ, предпочтительно ≤100 нМ. Константу аффинности связывания KD можно измерить, например, с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (BIAcore®) или биослойной интерферометрии.

[0032] Термин “koff” относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Константу скорости диссоциации koff можно измерять, например, с помощью интерферометрии биослоя.

СВЯЗЫВАНИЕ С CD38

[0033] В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, представлены тетрамерным белком, содержащим две HC и две LC, и связываются с CD38 человека с аффинностью или KD от приблизительно 1,91×10^-10 M до приблизительно 6,7×10^-10 M при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано ниже. В некоторых вариантах осуществления HC и LC характеризуются аминокислотными последовательностями под SEQ ID NO: 2 и 7 (mAb 2), 3 и 7 (mAb 3), 4 и 7 (mAb 4), 5 и 8 (mAb 5), 5 и 9 (mAb 6), 6 и 8 (mAb 7) или 6 и 9 (mAb 8) соответственно.

[0034] В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC и LC, характеризующиеся аминокислотными последовательностями под SEQ ID NO: 3 и 7 соответственно, и антитело связывается с CD38 человека с аффинностью или KD приблизительно 2×10^-10 М. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC и LC, характеризующиеся аминокислотными последовательностями под SEQ ID NO: 5 и 8 соответственно, и антитело связывается с CD38 человека с аффинностью или KD приблизительно 6,7×10^-10 М. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC и LC, характеризующиеся аминокислотными последовательностями под SEQ ID NO: 5 и 9 соответственно, и антитело связывается с CD38 человека с аффинностью или KD приблизительно 4,15×10^-10 М. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC и LC, характеризующиеся аминокислотными последовательностями под SEQ ID NO: 6 и 8 соответственно, и антитело связывается с CD38 человека с аффинностью или KD приблизительно 3,85×10^-10 М. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC и LC, характеризующиеся аминокислотными последовательностями под SEQ ID NO: 6 и 9 соответственно, и антитело связывается с CD38 человека с аффинностью или KD приблизительно 1,91×10^-10 М.

СВЯЗЫВАНИЕ С FcγRIIIa (CD16a) И FcγRIIa (CD32a)

[0035] Антитела, предусмотренные в данном документе, также способны связываться с вариантом FcγRIIIa (CD16a) с более низкой аффинностью, содержащим фенилаланин (F) в аминокислотном положении 158 (158F), и способны связываться с вариантом FcγRIIIa (CD16a) с более высокой аффинностью, содержащим валин (V) в аминокислотном положении 158 (158V), со значениями KD, соответственно являющимися на порядок ниже, и со значениями KD, составляющими менее 100 нМ, как измерено с помощью SPR. В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, связываются с вариантом 158F и с вариантом 158V FcγRIIIa (CD16a) с KD менее 100 нМ, как измерено с помощью SPR, и при этом показатели связывания с вариантами 158F и 158V отличаются менее чем в 2 раза. В некоторых вариантах осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, связываются с вариантом (158F) FcγRIIIa (CD16a) с KD, составляющей приблизительно 59 нМ или меньше при измерении, например, с помощью SPR.

[0036] В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 2, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, и способно связываться с FcγRIIIa (158F) с KD приблизительно 53 нМ и связываться с FcγRIIIa (158V) с KD приблизительно 47 нМ, как измерено, например, с помощью SPR. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 3, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, и способно связываться с FcγRIIIa (158F) с KD приблизительно 59 нМ и связываться с FcγRIIIa (158V) с KD приблизительно 75 нМ, как измерено, например, с помощью SPR. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 4, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, и способно связываться с FcγRIIIa (158F) с KD приблизительно 51 нМ и связываться с FcγRIIIa (158V) с KD приблизительно 47 нМ, как измерено, например, с помощью SPR.

[0037] Антитела, предусмотренные в данном документе, также способны связываться с вариантом FcγRIIa (CD32a) с более низкой аффинностью, содержащим аргинин в аминокислотном положении 131 (131R), с KD ≤690 нМ, и способны связываться с вариантом FcγRIIa с более высокой аффинностью (CD32a), содержащим гистидин в положении 131 (131H), с KD менее приблизительно 270 нМ, как измерено, например, с помощью SPR.

[0038] В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 2, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, и способно связываться с FcγRIIa (CD32a) (131R) с KD приблизительно 690 нМ и связываться с FcγRIIa (CD32a) (131H) с KD приблизительно 120 нМ, как измерено, например, с помощью SPR. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 3, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, и способно связываться с FcγRIIa (CD32a) (131R) с KD ≤ приблизительно 125 нМ или ≤100 нМ и способно связываться с FcγRIIa (CD32a) (131H) с KD приблизительно 220 нм, как измерено, например, с помощью SPR. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 4, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, и способно связываться с FcγRIIa (CD32a) (131R) с KD приблизительно 510 нМ и способно связываться с FcγRIIa (CD32a) (131H) с KD приблизительно 60 нм, как измерено, например, с помощью SPR.

[0039] В некоторых вариантах осуществления антитело также способно связываться с 158F FcγRIIIa (CD16a) с кажущейся KD приблизительно 70 нМ или меньше и с 158V FcγRIIIa (CD16a) с кажущейся KD приблизительно 32 нМ или меньше, как измерено по связыванию с 158F или 158V FcγRIIIa (CD16a), экспрессируемыми клетками HEK, соответственно. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 2, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, также способно связываться с 158F FcγRIIIa (CD16a) с кажущейся KD приблизительно 70 нМ и способно связываться с 158V FcγRIIIa (CD16a) с кажущейся KD приблизительно 18 нМ, как измерено по связыванию с 158F или 158V FcγRIIIa (CD16a), экспрессируемыми клетками HEK, соответственно. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 3, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, также способно связываться с 158F FcγRIIIa (CD16a) с кажущейся KD приблизительно 60 нМ и способно связываться с 158V FcγRIIIa (CD16a) с кажущейся KD приблизительно 32 нМ, как измерено по связыванию с 158F или 158V FcγRIIIa (CD16a), экспрессируемыми клетками HEK, соответственно. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 4, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, также способно связываться с 158F FcγRIIIa (CD16a) с кажущейся KD приблизительно 44 нМ и способно связываться с 158V FcγRIIIa (CD16a) с кажущейся KD приблизительно 28 нМ, как измерено по связыванию с 158F или 158V FcγRIIIa (CD16a), экспрессируемыми клетками HEK, соответственно.

[0040] В некоторых вариантах осуществления антитело также способно связываться с вариантом FcγRIIa (CD32a), содержащим аргинин в аминокислотном положении 131 (131R), с кажущейся KD приблизительно 890 нМ или меньше и с вариантом 131H FcγRIIa (CD32a) с кажущейся KD приблизительно 840 нМ или меньше, как измерено по связыванию с 131R или 131H FcγRIIa (CD32a), экспрессируемыми клетками HEK, соответственно. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 2, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, также способно связываться с 131R FcγRIIa (CD32a) с кажущейся KD приблизительно 890 нМ и способно связываться с 131Н FcγRIIa (CD32a) с кажущейся KD приблизительно 840 нМ, как измерено по связыванию с 131R или 131H FcγRIIa (CD32a), экспрессируемыми клетками HEK, соответственно. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 3, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, также способно связываться с 131R FcγRIIa (CD32a) с кажущейся KD приблизительно 87 нМ и способно связываться с 131Н FcγRIIa (CD32a) с кажущейся KD приблизительно 222 нМ, как измерено по связыванию с 131R или 131H FcγRIIa (CD32a), экспрессируемыми клетками HEK, соответственно. В некоторых вариантах осуществления антитело, содержащее HC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 4, и LC, характеризующуюся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, также способно связываться с 131R FcγRIIa (CD32a) с кажущейся KD приблизительно 467 нМ и способно связываться с 131Н FcγRIIa (CD32a) с кажущейся KD приблизительно 544 нМ, как измерено по связыванию с 131R или 131H FcγRIIa (CD32a), экспрессируемыми клетками HEK, соответственно.

Механизм действия

[0041] Антитела, предусмотренные в данном документе, способны обеспечивать уничтожение CD38-экспрессирующих клеток посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) в отношении клеток, экспрессирующих высокий (~400000/клетка), средний (~100000/клетка) и низкий (~13000/клетка) уровни молекул CD38 на клеточной поверхности. Антитела, предусмотренные в данном документе, индуцируют такую ADCC в присутствии естественных клеток-киллеров (NK), которые экспрессируют вариант рецептора FcγIIIa (CD16a) с более низкой аффинностью (158F) и/или экспрессируют вариант рецептора FcγIIIa (CD16a) с более высокой аффинностью (158V). ADCC можно измерить с применением способов, известных в данной области техники, например, путем измерения лизиса клеток-мишеней в присутствии антитела и эффекторных клеток в клеточном анализе активности. Клетка-мишень может представлять собой, например, клетку, экспрессирующую CD38, такую как KMS12-BM, RPMI-8226 или MOLP-8. Кроме того, эффекторные клетки могут представлять собой, например, любые клетки, которые можно индуцировать для уничтожения клеток-мишеней посредством ADCC. В некоторых вариантах осуществления эффекторные клетки представляют собой первичные клетки, выделенные из крови человека, такие как мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) или NK-клетки человека, очищенные от PBMC. В другом варианте осуществления клетки представляют собой линию естественных клеток-киллеров, такую как клетки NK-92, которые экспрессируют FcγRIIIa (158V) или FcγRIIIa (158F) на клеточной поверхности (см. WO 06/023148). В еще других вариантах осуществления линия NK-клеток представляет собой линию клеток, такую как линия клеток Jurkat, которая была сконструирована для экспрессии 158F или 158V FcγIIIa (CD16a) (см., например, Promega, G701A).

[0042] Антитела, предусмотренные в данном документе, способны обеспечивать уничтожение клеток, экспрессирующих высокий уровень CD38 на клеточной поверхности, посредством антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP). Антитела, предусмотренные в данном документе, индуцируют такой ADCP в присутствии PBMC человека. В одном варианте осуществления антитела, предусмотренные в данном документе, индуцируют приблизительно 41% фагоцитоз CD38-экспрессирующих клеток посредством PMBC человека, которые экспрессируют FcγRIIIa (158V), при относительной ЕС50 212,6 пМ.

Фармацевтические композиции и составленные антитела

[0043] Термин “фармацевтический состав” относится к препарату, который представлен в такой форме, которая обеспечивает эффективную биологическую активность активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, неприемлемо токсичных для субъекта, которому будут вводить состав. Такие составы обычно являются стерильными. “Фармацевтически приемлемые” вспомогательные вещества (среды-носители, добавки) представляют собой вспомогательные вещества, которые можно целесообразно вводить субъекту-млекопитающему с обеспечением эффективной дозы используемого активного ингредиента.

[0044] Фармацевтические композиции и составы на основе антител, предусмотренные в данном документе, могут быть получены путем смешивания антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) и могут быть представлены в форме лиофилизированных составов или водных растворов.

[0045] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, содержат составленное антитело, предусматривающее антитело и одно или несколько из следующих вспомогательных веществ: сахарозу, L-гистидин и полисорбат 80 (PS80). В некоторых вариантах осуществления антитела содержат аминокислотные последовательности HC и LC любого из моноклональных антител, представленных в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления антитело присутствует в фармацевтической композиции в концентрации от 5 мг/мл до 50 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело присутствует в фармацевтической композиции в концентрации 5 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело присутствует в фармацевтической композиции в концентрации 10 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело присутствует в фармацевтической композиции в концентрации 20 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления антитело присутствует в фармацевтической композиции в концентрации 50 мг/мл. Концентрация каждого вспомогательного вещества выбирается таким образом, чтобы фармацевтическую композицию можно было подвергнуть разведению для введения путем инфузии. Например, в некоторых вариантах осуществления сахароза присутствует в концентрации от 8% (вес/об.) до 10% (вес/об.). В некоторых вариантах осуществления сахароза присутствует в концентрации 8% (вес/об.). В других вариантах осуществления сахароза присутствует в концентрации 10% (вес/об.). В некоторых вариантах осуществления L-гистидин присутствует в концентрации от 10 мМ до 20 мМ. В некоторых вариантах осуществления L-гистидин присутствует в концентрации 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления L-гистидин присутствует в концентрации 20 мМ. В некоторых вариантах осуществления PS80 присутствует в концентрации от 0,005% (об./об.) до 0,05% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления PS80 присутствует в концентрации 0,005% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления PS80 присутствует в концентрации 0,02% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления PS80 присутствует в концентрации 0,05% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления значение pH фармацевтической композиции является оптимизированным для поддержания стабильности антитела, например, когда фармацевтическая композиция находится в жидкой форме. В некоторых вариантах осуществления pH составленного антитела предусматривает значение pH, составляющее от приблизительно 6,0 до приблизительно 6,5. В некоторых вариантах осуществления составленное антитело характеризуется pH приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления составленное антитело характеризуется pH приблизительно 6,2. В некоторых вариантах осуществления составленное антитело характеризуется pH приблизительно 6,5. В некоторых вариантах осуществления составленное антитело характеризуется pH 6,0. В некоторых вариантах осуществления составленное антитело характеризуется pH 6,2. В некоторых вариантах осуществления составленное антитело характеризуется pH 6,5.

[0046] В некоторых вариантах осуществления антитело в фармацевтической композиции и/или составленные антитела, предусмотренные в данном документе, представлены в виде одной или нескольких изоформ, отличающихся зарядом. Изоформы, отличающиеся зарядом, обычно описываются как главная изоформа, кислотная(-ые) изоформа(-ы) и основная(-ые) изоформы(-ы). Главная изоформа относится к наиболее распространенной изоформе в данной партии антитела. Кислотная(-ые) изоформа(-мы) характеризуется(-ются) более низким значением изоэлектрической точки (pI) по сравнению с главной изоформой, а основные изоформы характеризуются более высоким значением pH по сравнению с главной изоформой. Изоформы, отличающиеся зарядом, могут представлять собой результат посттрансляционных модификаций аминокислотной последовательности HC и/или LC. Например, усиление дезамидирования, гликирования и сиалирования может вызвать снижение pI антитела. Превращение N-концевой глутаминовой кислоты в pyroGlu (или pyroQ) приводит к потере одного положительного заряда, что может вызвать снижение pI. Кроме того, присутствие C-концевого лизина может вызвать повышение pI антитела. Более того, амидирование С-концевого пролина может вызвать повышение pI антитела.

[0047] В некоторых вариантах осуществления антител (включая антитела в фармацевтической композиции и составленные антитела), предусмотренных в данном документе, аминокислота в положении 1 аминокислотной последовательности HC представляет собой пироглутамин. В некоторых вариантах осуществления антител, предусмотренных в данном документе, HC содержит C-концевую аминокислоту, представляющую собой глицин.

[0048] Изоформы, отличающиеся зарядом, в виде которых представлены антитела, предусмотренные в данном документе, могут быть разделены и количественно определены с применением способов разделения полипептидов на основе заряда, известных в данной области техники. Например, в некоторых вариантах осуществления слабая катионообменная колонка может применяться в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) с градиентным буфером на основе фосфата/хлорида натрия. В этой системе после загрузки антитела в колонку сначала элюируются кислотные изоформы антитела, затем главная изоформа, а затем основные изоформы антитела. В другом варианте осуществления может применяться капиллярное изоэлектрическое фокусирование (cIEF). Капиллярное изоэлектрическое фокусирование представляет собой способ разделения белков по их значениям изоэлектрической точки (pI). При cIEF антитела в образце мигрируют к своим изоэлектрическим точкам по градиенту pH внутри капилляра, за счет чего происходит разделение изоформ, отличающихся зарядом, по длине капилляра. Для идентификации и характеристики вариантов, разделенных посредством cIEF, изоформы, отличающиеся зарядом, могут быть выделены посредством хроматографии с сильным катионным обменом (SCX) и проанализированы посредством cIEF. Изображение разделенных изоформ, отличающихся зарядом, в капилляре получают с помощью камеры с полупроводниковой светочувствительной матрицей с использованием обнаружения по всей колонке и измерением оптической плотности при 280 нм. Распределение изоформ, отличающихся зарядом, в тестируемом образце сравнивают с эталонным стандартом с использованием cIEF для идентификации изоформ, отличающихся зарядом, в виде которых представлено антитело. В некоторых вариантах осуществления cIEF применяется в качестве средства контроля качества для подтверждения идентичности антитела во время коммерческого получения, и при этом осуществляемого путем определения для антитела распределения его изоформ, отличающихся зарядом, по сравнению с эталонным стандартом, например, тестируемого антитела, характеризующегося паттерном распределения изоформ, отличающихся зарядом, находящимся в пределах предварительно определенного паттерна распределения, или при сравнении с паттерном распределения эталонного стандарта.

[0049] В некоторых вариантах осуществления антитела (включая антитела в фармацевтической композиции и составленные антитела) характеризуются аминокислотными последовательностями HC и LC любого из моноклональных антител, представленных в таблице 1, и одним или несколькими параметрами применительно к изоформам, отличающимся зарядом, выбранными из группы, состоящей из по меньшей мере приблизительно 70% главной изоформы, не более приблизительно 30% кислотной изоформы и менее 4% основной изоформы. В некоторых вариантах осуществления антитело предусматривает 71% главной изоформы, 28% кислотной изоформы и менее 4% основной изоформы. В некоторых вариантах осуществления антитело предусматривает изоформы, отличающиеся зарядом, с изоэлектрическими точками в диапазоне от приблизительно 5,8 до приблизительно 9,0. В некоторых вариантах осуществления антитело предусматривает изоформы, отличающиеся зарядом, с изоэлектрическими точками в диапазоне от приблизительно 5,85 до приблизительно 8,97.

[0050] В некоторых вариантах осуществления антитела (включая антитела в фармацевтической композиции и составленные антитела) являются лиофилизированными. Антитела (включая антитела в фармацевтической композиции и составленные антитела) могут находиться в контейнере (например, флаконе) с тем, чтобы назначенная доза антитела могла быть извлечена из контейнера для введения пациенту.

[0051] В данном документе предусмотрены стандартные лекарственные формы, содержащие составленные антитела, которые специфически связывают CD38. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат аминокислотные последовательности HC и LC любого из моноклональных антител, представленных в таблице 1, а стандартная лекарственная форма содержит антитело и одно или несколько вспомогательных веществ, выбранных из группы, включающей сахарозу, L-гистидин и полисорбат 80. В некоторых вариантах осуществления стандартная лекарственная форма содержит приблизительно 215 мг антитела, приблизительно 6,21 мг L-гистидина, приблизительно 344 мг сахарозы и приблизительно 2,15 мг полисорбата 80. В некоторых вариантах осуществления стандартная лекарственная форма содержит 215 мг антитела, 6,21 мг L-гистидина, 344 мг сахарозы и 2,15 мг полисорбата 80. В некоторых вариантах осуществления стандартная лекарственная форма является лиофилизированной. Стандартная лекарственная форма может находиться в контейнере (например, флаконе) с тем, чтобы назначенная доза антитела могла быть извлечена из контейнера для введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления антитело, фармацевтический состав и/или составленное антитело находятся в стеклянном флаконе, снабженном эластомерной крышкой. В некоторых вариантах осуществления флакон содержит приблизительно 215 мг антитела. В некоторых вариантах осуществления флакон содержит 215 мг антитела. В некоторых вариантах осуществления объем заполнения флакона был установлен таким образом, чтобы обеспечить извлечение приблизительно 4 мл. В некоторых вариантах осуществления объем заполнения флакона был установлен таким образом, чтобы обеспечить извлечение 4 мл.

Способ получения

[0052] В данном документе предусмотрены способы получения антитела, фармацевтической композиции и стандартных лекарственных форм. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат аминокислотные последовательности HC и LC любого из моноклональных антител, представленных в таблице 1. В одном варианте осуществления способ включает экспрессию антитела в подходящей культуре клеток. Антитело подвергают по меньшей мере одной стадии хроматографии и по меньшей мере одной стадии ультрафильтрации, за счет чего получают очищенный раствор антитела. Раствор очищенного антитела корректируют с концентрированием антитела и добавлением вспомогательных веществ, а также регулированием pH. В одном варианте осуществления концентрацию антитела доводят до приблизительно 50 мг/мл; добавляют сахарозу, L-гистидин и полисорбат 80, а значение pH доводят до значения, составляющего по меньшей мере приблизительно 6,0. В одном варианте осуществления концентрацию антитела доводят до 50 мг/мл; добавляют сахарозу, L-гистидин и полисорбат 80, а значение pH доводят до значения, составляющего по меньшей мере 6,0. В некоторых вариантах осуществления значение pH составляет приблизительно 6,2. В некоторых вариантах осуществления значение pH составляет 6,2. В некоторых вариантах осуществления сахароза находится в концентрации приблизительно 8% вес/об., L-гистидин находится в концентрации приблизительно 10 мМ; и полисорбат 80 находится в концентрации приблизительно 0,05% об./об. В некоторых вариантах осуществления сахароза находится в концентрации 8% вес/об., L-гистидин находится в концентрации 10 мМ; и полисорбат 80 находится в концентрации 0,05% об./об. В некоторых вариантах осуществления антитело, фармацевтическая композиция и/или составленное антитело являются лиофилизированными.

[0053] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены способы получения восстановленного составленного антитела, где составленное антитело представлено в лиофилизированной форме и предусматривает аминокислотные последовательности HC и LC любого из моноклональных антител, представленных в таблице 1, сахарозу в концентрации приблизительно 8% вес/об., L-гистидин в концентрации приблизительно 10 мМ и полисорбат 80 в концентрации приблизительно 0,05% об./об. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены способы получения восстановленного составленного антитела, где составленное антитело представлено в лиофилизированной форме и предусматривает аминокислотные последовательности HC и LC любого из моноклональных антител, представленных в таблице 1, сахарозу в концентрации 8% вес/об., L-гистидин в концентрации 10 мМ и полисорбат 80 в концентрации 0,05% об./об. В некоторых вариантах осуществления перед применением составленное антитело восстанавливают в подходящем объеме воды для инъекции с получением раствора, содержащего антитело в концентрации приблизительно 50 мг/мл, сахарозу в концентрации приблизительно 8% вес/об., L-гистидин в концентрации приблизительно 10 мМ и полисорбат 80 в концентрации приблизительно 0,05% об./об., где pH восстановленного антитела составляет приблизительно 6,2. В некоторых вариантах осуществления перед применением составленное антитело восстанавливают в подходящем объеме воды для инъекции с получением раствора, содержащего антитело в концентрации 50 мг/мл, сахарозу в концентрации 8% вес/об., L-гистидин в концентрации 10 мМ и полисорбат 80 в концентрации 0,05% об./об., где pH восстановленного антитела составляет 6,2.

[0054] Используемый в данном документе термин “лечение” или “осуществление лечения” относится к клиническому вмешательству, предназначенному для изменения естественного развития патологии у индивидуума или в клетке, подлежащих лечению, в ходе течения клинической патологии. Требуемые эффекты лечения включают снижение скорости прогрессирования заболевания, облегчение или смягчение болезненного состояния, а также ремиссию или улучшение прогноза. Например, индивидуум успешно “лечится”, если один или несколько симптомов, связанных с раком, смягчены или устранены, включая без ограничения уменьшение пролиферации раковых клеток, разрушение раковых клеток, уменьшение симптомов, вызванных заболеванием, повышение качества жизни страдающих этим заболеванием, уменьшение дозы других медикаментов, необходимых для лечения заболевания, и/или повышение выживаемости индивидуумов.

[0055] В данном документе предусмотрены способы лечения или задержки прогрессирования множественной миеломы (такой как рецидивирующая множественная миелома или рецидивирующая и рефрактерная множественная миелома) у индивидуума, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела к CD38, предусмотренного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат аминокислотные последовательности HC и LC любого из моноклональных антител, представленных в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления антитело способно обеспечивать увеличение выживаемости в модели MM на мышах, где у мышей, относящихся к модели, экспрессируется вариант человеческого CD16a с низкой аффинностью (158F), и где мышам посредством инъекции было введено 500000 клеток EL4, экспрессирующих CD38 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько доз антитела к CD38 представлены в виде лиофилизированного состава, где перед введением лиофилизированный состав подвергается восстановлению с образованием восстановленного состава на основе антитела таким образом, что восстановленный состав на основе антитела характеризуется pH 6,2 и содержит антитело в концентрации приблизительно 50 мг/мл в жидкости, содержащей приблизительно 10 мМ L-гистидина, приблизительно 8% вес/об. сахарозы и приблизительно 0,05% об./об. полисорбата 80. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько доз антитела к CD38 представлены в виде лиофилизированного состава, где перед введением лиофилизированный состав подвергается восстановлению с образованием восстановленного состава на основе антитела таким образом, что восстановленный состав на основе антитела характеризуется pH 6,2 и содержит антитело в концентрации 50 мг/мл в жидкости, содержащей 10 мМ L-гистидина, 8% вес/об. сахарозы и 0,05% об./об. полисорбата 80.

[0056] В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз антитела. В некоторых вариантах осуществления доза антитела может составлять приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,5, приблизительно 1,0, приблизительно 2,5, приблизительно 5, приблизительно 10 или приблизительно 20 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления доза антитела может составлять 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 1,0, 2,5, 5, 10 и 20 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления антитело вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления антитело вводят подкожно.

Определения

[0057] Используемая в данном подробном описании и прилагаемой формуле изобретения форма единственного числа включают ссылку на форму множественного числа, если в содержании явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на “молекулу” необязательно включает комбинацию двух или более таких молекул и т.п.

[0058] Термин “приблизительно” относится к обычному диапазону ошибок для соответствующего значения, хорошо известному специалисту в данной области техники. Ссылка на “приблизительно” в отношении значения или параметра в данном документе включает (и описывает) варианты осуществления, которые направлены на данное значение или параметр per se. В некоторых вариантах осуществления термин “приблизительно” означает указанное значение плюс или минус 10% от указанного значения; например, “приблизительно 10 мг/кг” может охватывать диапазон от 9 до 11 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления термин “приблизительно” означает указанное значение плюс или минус 5% от указанного значения; например, “приблизительно 20 мг/кг” может охватывать диапазон от 19 до 21 мг/кг.

[0059] Термины “субъект” или “индивидуум” для целей лечения относятся к любому животному организму, классифицируемому как млекопитающее, включающему людей, домашних и сельскохозяйственных животных, животных зоопарков, животных, используемых в спорте, или домашних питомцев, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно млекопитающее является человеком.

[0060] Примеры приведены ниже с целью иллюстрации и описания определенных конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения. Однако объем формулы настоящего изобретения не должен каким-либо образом ограничиваться примерами, изложенными в данном документе.

ПРИМЕРЫ

1. Конструкция антител

[0061] Содержащие сконструированную Fc антитела к CD38 получали с мутациями в Fc-области антитела для повышения аффинности к активирующим рецепторам FcγRIIIa и FcγRIIa на эффекторных клетках.

[0062] Две гуманизированные тяжелые цепи (HC) (SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6) несут 14 и 10 мутаций в каркасных областях (по сравнению с SEQ ID NO: 1), что приводит к повышению показателя идентичности с последовательностью зародышевого типа Homo sapiens с 74,49% до 88,78% и 84,69% соответственно. Две гуманизированные легкие цепи (LC) (SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9) несут 17 и 15 мутаций в каркасных областях (по сравнению с SEQ ID NO: 7), что приводит к повышению показателя идентичности с последовательностью зародышевого типа Homo sapiens с 64,36% до 81,19% и 79,21% соответственно. Кроме того, в LC 2 и 3 метионин в положении 11 заменяли лейцином для того, чтобы избежать потенциально проблемного окисления метионина. Последовательности HC и LC представлены в таблице 2, а пары HC и LC mAb представлены в таблице 3.

Таблица 2 SEQ ID NO: ЦЕПЬ АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 1 ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ 1 QVQLVQSGAE VAKPGTSVKL SCKASGYTFT DYWMQWVKQR PGQGLEWIGT
IYPGDGDTGY AQKFQGKATL TADKSSKTVY MHLSSLASED SAVYYCARGD
YYGSNSLDYW GQGTSVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK
DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT
YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 2 ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ 2 Qvqlvqsgae vakpgtsvkl sckasgytft dywmqwvkqr pgqglewigt
iypgdgdtgy aqkfqgkatl tadkssktvy mhlsslased savyycargd
yygsnsldyw gqgtsvtvss astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk
dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt
yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkthtcp pcpapellgg pdvflfppkp
kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn
styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapeektis kakgqprepq
vytlppsrde ltknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv
ldsdgsffly skltvdksrw qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspg 3 ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ 3 Qvqlvqsgae vakpgtsvkl sckasgytft dywmqwvkqr pgqglewigt
iypgdgdtgy aqkfqgkatl tadkssktvy mhlsslased savyycargd
yygsnsldyw gqgtsvtvss astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk
dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt
yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkthtcp pcpapellag pdvflfppkp
kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn
styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapeektis kakgqprepq
vytlppsrde ltknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv
ldsdgsffly skltvdksrw qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspg 4 ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ 4 Qvqlvqsgae vakpgtsvkl sckasgytft dywmqwvkqr pgqglewigt
iypgdgdtgy aqkfqgkatl tadkssktvy mhlsslased savyycargd
yygsnsldyw gqgtsvtvss astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk
dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt
yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkthtcp pcpapellag pdvflfppkp
kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn
styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lplpeektis kakgqprepq
vytlppsrde ltknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv
ldsdgsffly skltvdksrw qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspg 5 ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ 5 Qvqlvqsgae vakpgasvkv sckasgytft dywmqwvrqa pgqglewigt
iypgdgdtsy aqkfqgrvtm tadtststvy melsslrsed tavyycargd
yygsnsldyw gqgtlvtvss astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk
dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt
yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkthtcp pcpapellag pdvflfppkp
kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn
styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapeektis kakgqprepq
vytlppsrde ltknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv
ldsdgsffly skltvdksrw qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspg 6 ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ 6 Qvqlvqsgae vakpgasvkv sckasgytft dywmqwvkqr pgqglewigt
iypgdgdtgy aqkfqgrvtm tadkststvy melsslrsed tavyycargd
yygsnsldyw gqgtlvtvss astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk
dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt
yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkthtcp pcpapellag pdvflfppkp
kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn
styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapeektis kakgqprepq
vytlppsrde ltknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv
ldsdgsffly skltvdksrw qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspg 7 ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ 1 divmtqshls mstslgdpvs itckasqdvs tvvawyqqkp gqsprrliys
asyryigvpd rftgsgagtd ftftissVqa edlavyycqq hysppytfgg
gtkleikrtv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv
dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg
lsspvtksfn rgec 8 ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ 2 divmtqspds lavslgerat inckssqdvs tvlawyqqkp gqsprrliys
asyryigvpd rfsgsgsgtd ftltisslqa edvavyycqq hysppytfgg
gtkleikrtv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv
dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg
lsspvtksfn rgec 9 ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ 3 divmtqspds lavslgerat inckssqdvs tvvawyqqkp gqsprrliys
asyryigvpd rfsgsgsgtd ftftisslqa edvavyycqq hysppytfgg
gtkleikrtv aapsvfifpp sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv
dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt lskadyekhk vyacevthqg
lsspvtksfn rgec 10 ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ 7 QVQLVQSGAE VAKPGTSVKL SCKASGYTFT DYWMQWVKQR PGQGLEWIGT
IYPGDGDTGY AQKFQGKATL TADKSSKTVY MHLSSLASED SAVYYCARGD
YYGSNSLDYW GQGTSVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK
DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT
YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG 11 huCD16a
(FcγRIIIa)
UniProtKB/Swiss-Prot P08637
Вариант “158V” выделен жирным шрифтом MWQLLLPTAL LLLVSAGMRT EDLPKAVVFL EPQWYRVLEK DSVTLKCQGA
YSPEDNSTQW FHNESLISSQ ASSYFIDAAT VDDSGEYRCQ TNLSTLSDPV
QLEVHIGWLL LQAPRWVFKE EDPIHLRCHS WKNTALHKVT YLQNGKGRKY
FHHNSDFYIP KATLKDSGSY FCRGLVGSKN VSSETVNITI TQGLAVSTIS
SFFPPGYQVS FCLVMVLLFA VDTGLYFSVK TNIRSSTRDW KDHKFKWRKD
PQDK 12 huFcγRIIa UniProtKB/Swiss-Prot P12318-1
Вариант “131H” выделен жирным шрифтом M™ETQMSQN VCPRNLWLLQ PLTVLLLLAS ADSQAAAPPK AVLKLEPPWI NVLQEDSVTL TCQGARSPES DSIQWFHNGN LIPTHTQPSY RFKANNNDSG EYTCQTGQTS LSDPVHLTVL SEWLVLQTPH LEFQEGETIM LRCHSWKDKP LVKVTFFQNG KSQKFSHLDP TFSIPQANHS HSGDYHCTGN IGYTLFSSKP VTITVQVPSM GSSSPMGIIV AVVIATAVAA IVAAVVALIY CRKKRISANS TDPVKAAQFE PPGRQMIAIR KRQLEETNND YETADGGYMT LNPRAPTDDD KNIYLTLPPN DHVNSNN 13 ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ 8 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGFTFN SFAMSWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGGTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYFCAKDK ILWFGEPVFD YWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK 14 ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ 4 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC

Таблица 3 mAb Тяжелая цепь
SEQ ID NO: Легкая цепь
SEQ ID NO: 1 1 7 2 2 7 3 3 7 4 4 7 5 5 8 6 5 9 7 6 8 8 6 9 9 10 7 10 13 14

2. Биохимическая характеристика

A: связывание с CD38

[0063] В одном эксперименте аффинность связывания и кинетические константы mAb 1-8 для CD38 человека измеряли с помощью SPR с применением инструмента Biacore®. Вкратце, антитела к CD38 захватывали на чипе CM5, с которым было ковалентно связано антитело к Fc. huCD38 в нескольких концентрациях вносили поверх тестируемых захваченных антител. Строили кривые связывания (сенсограммы), и процедуры кинетического анализа выполняли с применением программного обеспечения Biacore Evaluation.

[0064] Как показано в таблице 4, mAb 3 и 8 характеризовались наиболее высокой аффинностью к CD38 человека (Т-тесты для каждого варианта: р-значение >2).

Таблица 4. Аффинность к CD38 человека (n=3) mAb ka (1/Mс) CV для ka (%) kd (1/с) CV для kd (%) KD (M) CV для Kd (%) 1 3,55E+06 11,6 6,55E-04 3,4 1,80E-10 5,0 3 3,89E+06 13,8 6,59E-04 2,2 1,71E-10 13,1 5 2,78E+06 11,0 1,88E-03 29,1 6,99E-10 22,1 6 3,10E+06 15,8 8,55E-03 76,2 3,85E-10 18,7 7 3,18E+06 15,4 1,30E-03 9,5 4,15E-10 14,5 8 3,51E+06 19,2 6,50E-04 4,7 1,91E-10 24,0

[0065] В другом эксперименте аффинность связывания mAb 1 и 3 с CD38 человека измеряли с помощью SPR с применением инструмента Biacore®, как описано выше. mAb 1 характеризуется Kd 0,22 нМ, а mAb 3 характеризовалось Kd 0,20 нМ.

[0066] Влияние теплового стресса на аффинность связывания с CD38 человека. Аффинность связывания и кинетические константы mAb 1-8 для CD38 человека после подвергания mAb термическому воздействию (14 дней при 40°C в 10 мМ гистидине с pH 6, 8% сахарозе, 0,02% PS80) измеряли с помощью SPR с применением инструмента Biacore®. Использовали тот же протокол, что описан в вышеуказанном абзаце.

[0067] Как показано в таблице 5, образцы, подвергнутые термическому воздействию, демонстрировали значения аффинности и кинетические константы, крайне схожие с таковыми для соответствующих образцов CD38, не предусматривавших воздействия (таблица 4) (T-тесты для каждого варианта: р-значение >2).

Таблица 5. Эффект термического воздействия в отношении аффинности к CD38 человека (n=3) mAb ka (1/Mс) CV для ka (%) kd (1/с) CV для kd (%) KD (M) CV для KD (%) 1 4,00E+06 21,9 7,14E-04 5,5 1,83E-10 15,7 3 3,71E+06 8,2 6,71E-04 3,0 1,81E-10 5,3 5 2,95E+06 21,2 2,36E-03 4,4 8,28E-10 25,7 6 3,86E+06 27,9 1,28E-03 3,7 3,46E-10 24,0 7 3,39E+06 6,8 1,33E-03 5,9 3,94E-10 10,5 8 3,53E+06 25,2 6,63E-04 11,7 1,98E-10 31,5

B: измерение аффинности к Fc γRIIa, FcγRIIIa и FcγRIIb in silico

[0068] В одном эксперименте аффинность mAb к рецепторам 158V FcγRIIIa или рецепторам 158F FcγRIIIa измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR). mAb продуцировали в клетках HEK293 посредством транзиентной трансфекции согласно инструкциям поставщика (ThermoFisher Scientific) и очищали с применением аффинной хроматографии с белком A согласно инструкциям поставщика (GE Healthcare). Внеклеточные домены FcγRIIIa (CD16a) с V158 или F158 продуцировали с помощью C-концевой his-метки в клетках HEK293 посредством транзиентной экспрессии и очищали с применением афинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов (IMAC) согласно инструкциям поставщика (Ni-Sepharose GE, Healthcare). Определение аффинности посредством SPR на BIACore 2000 (GE Healthcare) выполняли с помощью анализа захвата с использованием антитела класса IgG к His-метке, иммобилизованного на чипе CM5. Затем к рабочему буферу добавляли FcγRIIIa-his-метка, а затем mAb к CD38 в концентрациях в диапазоне от 8 до 256 нМ. Анализ проводили с помощью реакции с двумя состояниями с приемлемыми значениями χ², составляющими менее 5 (что означает 2% от наиболее высокой тестируемой концентрации), и процентным значением для максимальной теоретической резонансной единицы, составляющем более 25 (что означает более продуктивного взаимодействия) с применением программного обеспечения BIAevaluation Software 4_1 (GE Healthcare).

[0069] Как показано в таблице 6, mAb 2-4 характеризуются аффинностью к 158V FcγRIIIa, в 9 раз превышающей таковую для mAb 1, и более чем в 27 раз более высокой аффинностью к рецептору 158F FcγRIIIa, чем для mAb 1.

Таблица 6 K_D (нМ) mAb 158V FcγRIIIa 158F FcγRIIIa 1 425 >1500 2 47 53 3 50 55 4 47 51

[0070] В другом эксперименте аффинность mAb 1 и 3 к рецепторам 158V FcγRIIIa или рецепторам 158F FcγRIIIa измеряли с использованием SPR, как описано выше. mAb 3 связывало 158V FcγRIIIa с KD 75 нМ, а mAb 3 связывало 158F FcγRIIIa с KD 59 нМ.

[0071] Аффинность mAb к рецепторам FcγRIIa, содержащим аргинин в аминокислотном положении 131 (131R FcγRIIa) или гистидин в аминокислотном положении 131 (131H FcγRIIa), измеряли с применением анализа сближения AlphaScreen.

[0072] Внеклеточные домены FcγRIIa с R131 или H131 были предоставлены компанией R&D System (партия 1330-CD) или Biorbyt (партия ORB138408) соответственно. Анализ представлял собой анализ сближения на основе гранул, описанный поставщиком (Perkin Elmer), позволяющий ранжировать варианты Fc к CD38 по конкуренции с антителом к CD38 на основе нативного IgG1. Биотинилированное антитело к CD38 на основе нативного IgG1 захватывали на донорных гранулах, а белок FcγRIIa-his-метка захватывали на акцепторных гранулах. Когда антитело к CD38 и FcγRIIa взаимодействуют, гранулы сближаются. Возбуждение донорных гранул при 680 нм вызывает высвобождение синглетного кислорода, который диффундирует и индуцирует световое излучение при 520-620 нм, исходящее от акцепторных гранул, когда они сближаются. Количество света прямо пропорционально степени взаимодействия и измеряется с применением многорежимного планшет-ридера EnVision (Perkin Elmer). Во время конкурентного анализа не содержащие метки конкурентные Fc-варианты mAb к CD38, представляющие собой DE (S239D/I332E, нумерация по Eu), ADE (G236A/S239D/I332E, нумерация по Eu) или ADLE (G236A/S239D/F243L/I332E, нумерация по Eu), применяли для оценки конкуренции за взаимодействие между биотинилированным антителом к CD38 на основе нативного IgG1 и белком FcγRIIa-his-метка. Концентрацию биотинилированного антитела к CD38 устанавливали по предварительно построенной калибровочной кривой. Не содержащие метки конкурентные mAb использовали в различных количествах, вследствие чего возрастающая концентрация не содержащих метки mAb могла обеспечивать вытеснение биотинилированного антитела к CD38 и уменьшение сигнала. Данные нормализовали по максимальному сигналу. Проводили два эксперимента, и IC50 оценили с помощью BIOST@T-SPEED-LTS 2.1.0.

[0073] Как показано в таблице 7, mAb 3 продемонстрировало превышающую более чем в 14 и 18 раз аффинность к 131R FcγRIIa и 131H FcγRIIa соответственно по сравнению с mAb 1.

Таблица 7. Аффинность к R131 FcγRIIa и H131 FcγRIIa Относительная IC50 (нМ) mAb R131 FcγRIIa H131 FcγRIIa 1 1741 268 2 687 119 3 125 15 4 508 58

C: измерение аффинности к Fc γRIIa, FcγRIIIa и FcγRIIb in vitro

[0074] HEK293T-FcγRIIIa-158F, HEK293T-FcγRIIIa-158V, HEK293T-FcγRIIa-131H, HEK293T-FcγRIIa-131R, HEK293T-FcγRI или HEK293T-FcγRIIb высевали в 96-луночных микропланшетах при 10⁵ клеток/лунка. Планшеты центрифугировали при 800 g в течение 1 минуты, и содержимое ресуспендировали в 50 мкл PBS, содержащего антитела в различных концентрациях, в течение 30 минут при 4°C. Затем добавляли 200 мкл PBS и 1% FBS для промывки клеток с последующим центрифугированием при 800 g в течение 1 минуты. Стадию промывки повторяли в общей сложности три раза перед окрашиванием клеток вторичным антителом, конъюгированным с FITC (фрагмент конъюгированного с FITC козьего антитела к IgG (H+L) человека, ссылочный номер 109-546-088, Jackson ImmunoResearch, конечная концентрация 10 мкг/мл), в течение 30 минут при 4°C. Клетки трижды промывали 200 мкл PBS и 1% FBS и ресуспендировали в 100 мкл PBS перед сбором на MACSVYB (канал B1). Как показано в таблице 8, mAb 2, 3 и 4 характеризовались в 32, в 38 и в 51 раз более высокой аффинностью к 158F FcγRIIIa, экспрессируемому на клетках HEK, по сравнению с mAb 1 соответственно, а mAb 2, 3 и 4 характеризовались в 9, в 5 и 6 раз более высокой аффинностью к 158V FcγRIIIa, экспрессируемому на клетках HEK, по сравнению с mAb 1 соответственно.

Таблица 8 mAb Средняя кажущаяся Kd (нМ) SEM Кратная разница в значениях аффинности по сравнению с mAb 1 158F FcγRIIIa 1 2269,1 771,4 1 2 70,1 13,1 32,4 3 60,4 10,4 37,6 4 44,2 9,1 51,4 158V FcγRIIIa 1 165,3 44,2 1 2 17,6 3,3 9,4 3 32,0 5,3 5,2 4 28,1 7,8 5,9

[0075] Как показано в таблице 9, mAb 3 характеризовалось в ~5 раз более высокой аффинностью к 131H FcγRIIa, экспрессируемому на клетках HEK, по сравнению с mAb 1, а mAb 3 характеризовалось в ~16 раз более высокой аффинностью к 131R FcγRIIa, экспрессируемому на клетках HEK, по сравнению с mAb 1.

Таблица 9 mAb Средняя Kd (нМ) SEM Разница в значениях аффинности по сравнению с mAb 1 131H FcγRIIa 1 1180,8 406,1 1 2 839,8 438,7 1,4 3 221,9 74,9 5,3 4 543,8 277,7 2,2 131R FcγRIIa 1 1420,3 166,5 1 2 891,1 131,1 1,6 3 87,4 13,9 16,3 4 467,3 153,6 3,0

[0076] Как показано в таблице 10, mAb 2, 3 и 4 характеризовались сходным уровнем аффинности связывания с FcγRI по сравнению с mAb 1 и в 1,8-3,9 раза более низкой аффинностью к FcγRIIb, экспрессируемому на клетках HEK, по сравнению с mAb 1.

Таблица 10 mAb Средняя Kd (нМ) SEM Разница в значениях аффинности по сравнению с mAb 1 FcγRI 1 24,2 4,2 1 2 13,5 1,7 1,8 3 14,7 3,2 1,6 4 15,9 2,7 1,5 FcγRIIb 1 1299,1 406,1 1 2 839,8 438,7 3,9 3 221,9 74,9 3,3 4 543,8 277,7 1,8

D: измерение видов цитотоксической активности in vitro

АНТИТЕЛОЗАВИСИМАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ (ADCC)

[0077] В ходе анализов антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) с применением в качестве эффекторных клеток линии клеток NK92, сконструированной с обеспечением сверхэкспрессии рецептора FcγRIIIa, исследование проводили с применением анализа высвобождения кальцеина-ацетилоксиметила (Calcein-AM; Invitrogen). В живых клетках нефлуоресцентный кальцеин AM превращается в зеленый флуоресцентный кальцеин. Меченые клетки-мишени инкубируют с антителом SAR442085 и эффекторными клетками NK-92. Лизис клеток-мишеней посредством ADCC приводит к высвобождению флуоресцентного кальцеина. Интенсивность флуоресценции пропорциональна уровню присутствующей активности ADCC.

[0078] Клетки-мишени множественной миеломы (MOLP-8, RPMI 8226, MM1R или KMS12-BM) метили кальцеином-AM (50 мкг разводили в 25 мкл DMSO, затем разводили 10 мкл кальцеина в 4 мл RPMI 1640+1% FBS+1% пробенецида для окрашивания 4 × 10⁶ клеток) в течение 30 мин, затем промывали и высевали в 96-луночные круглодонные планшеты при плотности 2 × 10⁴ клеток/лунка. Указанные тестируемые mAb или контрольное изотипическое mAb добавляли в различных концентрациях в диапазоне от 10 мкг/мл до 0,01 пг/мл на 30 мин для обеспечения опсонизации перед добавлением естественных клеток-киллеров (NK), трансдуцированных указанным вариантом FcγRIIIa. NK-клетки, экспрессирующие 158F или 158V, добавляли в качестве эффекторных клеток в соотношении E:T 5:1 (1 × 10⁵ NK-клеток на 2 × 10⁴ клеток-мишеней). Затем планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂, и 100 мкл супернатантов собирали и переносили в непрозрачные 96-луночные микропланшеты для анализа с применением флуорометрии на Tecan Infinite M1000 для измерения высвобождения кальцеина (фильтр возбуждения: 492 нм; испускание: 515 нм). Для максимального высвобождения клетки лизировали 2% Triton X-100. Значение флуоресценции фона культуральной среды вычитали из значений флуоресценции экспериментального высвобождения (A), спонтанного высвобождения клеток-мишеней (B) и максимального высвобождения клеток-мишеней (C). Процентные значения цитотоксичности и ADCC для каждого планшета (в двух повторностях) рассчитывали по следующей формуле:

цитотоксичность (%) = (A - B)/(C - B)×100%.

[0079] Каждый эксперимент повторяли по меньшей мере 3 раза. Значения полумаксимальной эффективной концентрации (ЕС50) рассчитывали путем подгонки точек данных к 4-параметрическому уравнению с использованием GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния).

Клетки-мишени с высокой плотностью рецепторов CD38

[0080] ADCC в отношении линии клеток множественной миеломы MOLP-8 оценивали in vitro, как описано выше. Клетки MOLP-8 демонстрируют высокую плотность рецепторов CD38 на клеточной поверхности (~400000/клетка).

[0081] В таблице 11 показано значение EC₅₀ для каждого тестируемого антитела, направленного против клеток MOLP-8, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих 158V. Как показано в таблице 11, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих высокоаффинный вариант FcγRIIIa (158V), mAb 2, 3 и 4 активировали ADCC клеток MOLP-8 при EC₅₀ в 24-33 раза ниже, чем для mAb 1.

Таблица 11 mAb EC₅₀
(нг/мл) SEM
(нг/мл) 1 3,3 0,91 2 0,1 0,03 3 0,14 0,02 4 0,12 0,02

[0082] В таблице 12 показано значение EC₅₀ для каждого тестируемого антитела, направленного против клеток MOLP-8, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих 158F. Как показано в таблице 12, mAb 4 продемонстрировало самую высокую активность ADCC, направленную против клеток MOLP-8, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих низкоаффиный вариант FcγRIIIa (158F), и при этом EC₅₀ была приблизительно в 97 раз ниже, чем для mAb 1. mAb 2 и 3 активировали ADCC в отношении клеток MOLP-8 при EC₅₀ в приблизительно в 59-69 раз ниже, чем для mAb 1, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих низкоаффинный вариант FcγRIIIa (158F).

Таблица 12 mAb EC50
(нг/мл) SEM
(нг/мл) 1 16,5 8,77 2 0,24 0,11 3 0,28 0,09 4 0,17 0,05

Клетки-мишени со средней плотностью рецепторов CD38

[0083] ADCC в отношении линии клеток множественной миеломы RPMI-8226 оценивали in vitro, как описано выше. Клетки RPMI-8226 демонстрируют среднюю плотность рецепторов CD38 на клеточной поверхности (~70000/клетка).

[0084] В таблице 13 показано значение EC₅₀ для каждого тестируемого антитела, направленного против клеток RPMI-8226, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих 158V. Как показано в таблице 13, mAb 2-4 при EC₅₀, являющейся приблизительно в 27 раз более низкой по сравнению с таковой для mAb 1, продемонстрировали аналогичные уровни повышенной способности активировать ADCC, направленную против клеток MM, экспрессирующих рецепторы CD38 при их средней плотности, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих характеризующийся более высокой аффинностью вариант FcγRIIIa (158V).

Таблица 13 mAb EC₅₀
(нг/мл) SEM
(нг/мл) 1 2,45 0,73 2 0,09 0,02 3 0,09 0,003 4 0,09 0,003

[0085] В таблице 14 показано значение EC₅₀ для каждого тестируемого антитела, направленного против клеток RPMI-8226, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих 158F. mAb 4 по сравнению с mAb 1 продемонстрировало в приблизительно 73 раза более высокую способность активировать ADCC, направленную против клеток MM, экспрессирующих рецепторы CD38 при их средней плотности, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих низкоаффинный вариант FcγRIIIa, тогда как mAb 3 продемонстрировало в приблизительно 65 раз более высокую, а mAb 2 продемонстрировало в приблизительно 49 раз более высокую способность активировать ADCC, направленную против клеток MM, экспрессирующих рецепторы CD38 при их средней плотности, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих низкоаффинный вариант FcγRIIIa, по сравнению с mAb 1.

Таблица 14 mAb EC₅₀
(нг/мл) SEM
(нг/мл) 1 5,83 1,67 2 0,12 0,04 3 0,09 0,01 4 0,08 0,01

Клетки-мишени с низкой плотностью рецепторов CD38

[0086] ADCC в отношении линии клеток множественной миеломы KMS-12BM оценивали in vitro, как описано выше. Клетки KMS-12BM демонстрируют низкую плотность рецепторов CD38 на клеточной поверхности (~13000/клетка).

[0087] В таблице 15 показано значение EC₅₀ для каждого тестируемого антитела, направленного против клеток KMS-12BM, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих характеризующийся более высокой аффинностью вариант FcγRIIIa (158V). Интересно отметить, что, как показано в таблице 15, mAb 2, 3 и 4 по сравнению с mAb 1 продемонстрировали повышенную способность активировать ADCC, направленную против клеток MM, экспрессирующих рецепторы CD38 при их низкой плотности, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих характеризующийся более высокой аффинностью вариант FcγRIIIa (158V). mAb 3 характеризовалось EC₅₀ в ~69 раз ниже, чем для mAb 1, а mAb 4 характеризовалось EC₅₀ в ~91 раз ниже, чем для mAb 1.

Таблица 15 mAb EC₅₀
(нг/мл) SEM
(нг/мл) 1 41 12 2 0,65 0,05 3 0,6 0,1 4 0,45 0,35

[0088] В таблице 16 показано значение EC₅₀ для каждого тестируемого антитела, направленного против клеток KMS-12BM, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих более низкоаффинный вариант FcγRIIIa (158F). Примечательно, что, как показано в таблице 16, mAb 2, 3 и 4 по сравнению с mAb 1 продемонстрировали повышенную способность активировать ADCC, направленную против клеток MM, экспрессирующих рецепторы CD38 при их низкой плотности, в присутствии NK-клеток, экспрессирующих более низкоаффинный вариант FcγRIIIa (158F). mAb 3 характеризовалось EC₅₀ в ~145 раз ниже, чем для mAb 1, а mAb 4 характеризовалось EC₅₀ в ~269 раз ниже, чем для mAb 1.

Таблица 16 mAb EC₅₀
(нг/мл) SEM
(нг/мл) 1 94 2,55 2 1,05 0,25 3 0,65 0,15 4 0,35 0,15

АНТИТЕЛОЗАВИСИМЫЙ КЛЕТОЧНЫЙ ФАГОЦИТОЗ (ADCP)

[0089] PBMC человека впервые выделяли из лейкоцитарной пленки, полученной от семи здоровых доноров из Etablissement Français du Sang. Все эти доноры демонстрировали один и тот же генотип FCGR3A и FCGR2A (FcγRIIIa-158V/V и FcγRIIa-131H/H). Кровь сначала собирали в пробирку Falcon на 50 мл. 15 мл Ficoll-Plaque™ PLUS 96% очень осторожно добавляли на дно пробирки Sepmate, затем в пробирку медленно добавляли кровь перед осуществлением центрифугирования при 1300 g в течение 10 минут. Затем кольцо с PBMC собирали и промывали с помощью 50 мл PBS, и осуществляли еще одну процедуру центрифугирования при 300 g в течение 5 минут. Процедуру промывки повторяли два раза перед окрашиванием РВМС магнитными гранулами, связывающими CD14, в соответствии с инструкциями производителя (Miltenyi; ссылочный номер 130-050-201), по сути предусматривающей инкубацию при 4°C в течение периода времени, составляющего 15 минут, перед положительным отбором с помощью AutoMACS pro (отбор Posseld). Моноциты собирали и затем промывали с помощью 50 мл PBS. Моноциты культивировали в течение 5 дней в RPMI1640, 10% FBS, 2% инактивированной сыворотке крови человека, 50 нг/мл GM-CSF в колбе Т75 при 37°C и 5% CO₂. Через 5 дней после культивирования моноциты дифференцировались в макрофаги. Для сбора макрофагов аккутазу (ThermoFisher, ссылочный номер: A1110501) помещали в колбы на 15 минут при 37°C для отделения клеток, затем добавляли 20 мл RPMI с 10% FBS, 1% глутамина для остановки активности аккутазы. Собранные клетки центрифугировали при 350 g в течение 10 минут с последующей промывкой в 20 мл PBS, и осуществляли еще одну процедуру центрифугирования при 300 g в течение 10 минут. Для двух экспериментов использовали макрофаги из партии макрофагов, замороженных в жидком азоте.

[0090] Макрофаги ресуспендировали в разбавителе С при концентрации 20 × 10⁶ клеток/мл (поставляется производителем в наборе для окрашивания №PKH26GL-1KT от Sigma Aldrich). На 1 объем макрофагов к клеткам добавляли 1 объем PKH26 (20 мкл, разведенного в 1 мл разбавителя C) с осуществлением инкубации в течение 5 минут в темном месте. На 1 минуту добавляли 5 мл FBS для инактивации реакции окрашивания перед доведением объема до 50 мл с помощью RPMI1640 с 10% FBS. Клетки MOLP-8, экспрессирующие CD38, окрашивали флуорохромом PKH67, а макрофаги, полученные из очищенных моноцитов, окрашивали PKH26, в результате чего их можно было различить с помощью проточной цитометрии. Затем клетки MOLP-8 и макрофаги помещали в условия культивирования в течение ночи в присутствии либо mAb 1, либо mAb 3 перед проведением анализа дважды положительной популяции (макрофаги, осуществившие фагоцитоз клеток MOLP-8) посредством проточной цитометрии.

[0091] mAb 3 по сравнению с mAb 1 проявляло повышенную активность ADCP, направленную против линии клеток MOLP-8, о чем свидетельствует более высокий процент (%) общего фагоцитоза, достигнутый во всех экспериментах, и более низкое (относительное) значение EC₅₀ (EC₅₀rel). Среднее геометрическое % общего фагоцитоза составляло 40,85% для mAb 3 по сравнению с 18,57% для mAb 1, а среднее геометрическое для EC₅₀rel составляло 31,87 нг/мл (или 212,57 пМ) для mAb 3 по сравнению с mAb 1, для которого значение превышало 64,86 нг/мл (или более 432,62 пМ). Исходя из значений EC₅₀rel, mAb 3, по-видимому, характеризовалось по меньшей мере в 2,035 раза более высокой активностью в отношении индуцирования ADCP, чем mAb 1.

Эффективность in vivo

[0092] Оценивали эффективность mAb 3 in vivo. Мышам C57BL/6 с гуманизированным FcγR (Smith P, DiLillo DJ, Bournazos S, Li F, Ravetch JV; Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109(16):6181-6) внутривенно путем инъекции вводили 500000 опухолевых клеток EL4-huCD38 в день 0. У мышей C57BL/6 с гуманизированным FcγR все мышиные гены, кодирующие FcγR, делетированы, а последовательности человеческого FcγR, кодируемые в виде трансгенов, встроены в геном мыши. Мыши C57BL/6 с гуманизированным FcγR воспроизводят паттерны экспрессии и уровни экспрессии huFcγR и являются применимыми в различных huIgG-опосредованных моделях воспаления, цитотоксичности и устранения опухоли. Для активирующих рецепторов FcγRIIIa и FcγRIIa человеческие варианты, встроенные в мышиную модель, представляли собой соответственно 158F huFcγRIIIa и 131R huFcγRIIa (низкоаффинные варианты рецепторов). Профиль экспрессии FcγR человека и уровни экспрессии воспроизводили на мышах.

[0093] Начиная с дня 1 после инъекции опухолевых клеток, тестируемые или контрольные mAb вводили внутрибрюшинно в дни 1, 4, 7 и 14. mAb изотипического контроля вводили в дозе 10 мг/кг. mAb 1, 3 и 10 вводили в дозах 10 и 1,25 мг/кг. В этой модели для оценки выживаемости первичными конечными точками эффективности были медианное время выживаемости (MST), процент увеличения продолжительности жизни (% ILS) и остающиеся в живых в течение длительного периода времени (определяемые как мыши с продолжительностью выживания, превышающей или равной 2-кратному MST для контрольной группы). Различия в выживаемости между группами оценивали с помощью модели Кокса.

[0094] Как показано в таблице 17, группа изотипического контроля характеризовалась MST, составляющим 39 дней. В данной модели двадцать процентов группы изотипического контроля продемонстрировало выживаемость в течение длительного периода времени. Группа, обработанная mAb 1 в дозе 10 мг/кг, характеризовалась MST, составляющим более 82,5 дней, показателем увеличенной продолжительности жизни, составляющим более 112%. Пятьдесят процентов группы, обработанной mAb 1 в дозе 10 мг/кг, являлось остающимися в живых в течение длительного периода времени. Мыши, обработанные mAb 1 в дозе 1,25 мг/кг, характеризовались MST, составляющим более 46,5 дней, и показателем увеличенной продолжительности жизни, составляющим более 19%. Тридцать процентов группы, обработанной mAb 1 в дозе 1,25 мг/кг, являлось остающимися в живых в течение длительного периода времени.

[0095] Группа, обработанная mAb 10 в дозе 10 мг/кг, характеризовалась MST, составляющим более 70 дней, показателем увеличенной продолжительности жизни, составляющим 70%. Пятьдесят процентов группы, обработанной mAb 10 в дозе 10 мг/кг, являлось остающимися в живых в течение длительного периода времени. Мыши, обработанные mAb 10 в дозе 1,25 мг/кг, характеризовались MST, составляющим более 42 дней, и показателем увеличенной продолжительности жизни, составляющим 8%. Только 10% группы, обработанной mAb 10 в дозе 1,25 мг/кг, являлось остающимися в живых в течение длительного периода времени.

[0096] Группа, обработанная mAb 3 в дозе 10 мг/кг, характеризовалась MST, составляющим более 90 дней, показателем увеличенной продолжительности жизни, составляющим более 131%. Примечательно, что 90% группы, обработанной mAb 3 в дозе 10 мг/кг, являлось остающимися в живых в течение длительного периода времени. mAb 3 в дозе 10 мг/кг характеризовалось статистически значимо более высокой активностью по сравнению с группой изотипического контроля (p=0,0351). Еще более неожиданным стало то, что мыши, обработанные mAb 3 в дозе 1,25 мг/кг, также характеризовались MST, составляющим более 90 дней, и показателем увеличенной продолжительности жизни, составляющим более 131%. Кроме того, 90% группы, обработанной mAb 3 в дозе 1,25 мг/кг, являлось остающимися в живых в течение длительного периода времени. mAb 3 в дозе 1,25 мг/кг характеризовалось статистически значимо более высокой активностью по сравнению с группой изотипического контроля (p=0,0380) и статистически значимо более высокой эффективностью, чем mAb 10 в той же дозе (p=0,0380).

[0097] Обработка в случае данной модели опухоли у мышей, несущих низкоаффинный huFcγRIIIa (F158/F158), осуществляемая с помощью mAb 1, mAb 3 и mAb 10 в дозе 10 мг/кг, приводила к статистически значимому увеличению продолжительности жизни и числа остающихся в живых в течение длительного периода времени. Однако неожиданно оказалось, что при дозе 1,25 мг/кг mAb 3 все еще демонстрировало статистически значимое повышение продолжительности жизни и числа остающихся в живых в течение длительного периода времени, в то время как mAb 1 и mAb 10 какой-либо активность не обладали.

Таблица 17 Средство Доза (мг/кг) Остающиеся в живых в течение длительного периода времени (%) MST (дни) % ILS Изотипический контроль 10 20 39 - mAb 3 10 90 >90 131% 1,25 90 >90 131% mAb 1 10 50 82,5 112% 1,25 30 46,5 19% mAb 10 10 50 70 79% 1,25 10 42 8%

E. Исследования стабильности

Термостабильность

[0098] Термостабильность mAb 1, 3, 5, 6, 7 и 8 измеряли посредством метода дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) с использованием калориметра Malvern MicroCal VP. Образцы тестировали в буфере, содержащем 10 мМ гистидин HCl при pH 6,0. Полученные образцы загружали в лунки 96-луночного круглодонного планшета Wheaton наряду с буфером в качестве эталона в трех повторностях. Используя скорость линейного изменения температуры 1°C/мин и диапазон 20-120°C, термограммы собирали и обрабатывали с применением программного обеспечения Origin 2.0.

[0099] Как показано в таблице 18, mAb 3, 5, 6, 7 и 8 продемонстрировали начало изменения конформации белка при приблизительно 40°C, при температуре на приблизительно 17 градусов ниже, чем температура начала разворачивания mAb 1, и на 15-20°C ниже, чем ее типичное значение для mAb (фиг.1). Кроме того, разворачивание домена CH2 mAb 3, 5, 6, 7 и 8 начиналось намного раньше, чем для mAb 1, при приблизительно 50°C по сравнению с 70°C.

Таблица 18. Термостабильность (°C) mAb T_onset T_m1 (CH2) T_m2 (Fab1) T_m3 (Fab2) T_m4
(CH3) 1 56,8 70,0 75,7 83,1 3 39,9 50,4 71,0 83,3 5 37,8 49,9 79,4 81,9 6 40,7 49,8 81,7 84,1 7 37,2 50,0 78,1 84,3 8 38,8 50,5 80,2 84,8

Изоэлектрическая точка

[00100] Изоэлектрическую точку (pI) каждого из mAb 1, 3, 5, 6, 7 и 8 измеряли посредством капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF). Теоретические значения pI определяли исходя из состава с использованием аналитической платформы SEDNTERP, а также предполагая значения pKa для следующих аминокислот: Arg=12, Asp=4,5, Glu=4,6, His=6,2, Lys=10,4 и Tyr=9,7. Предполагалось, что все сульфгидрильные боковые цепи в остатках Cys связаны дисульфидными связями и не влияют на pKa (Laue ™, Shah BD, Ridgeway ™, and Pelletier SL. Computer-aided interpretation of analytical sedimentation data for protein. In Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science. Harding SE, Rowe AJ, and Horton JC Eds. pp 90-124. Royal Society of Chemistry, 1991).

[00101] Неожиданным стало то, что, как показано в таблице 19, измеренная pI была ниже, чем pI для mAb 3, рассчитанная исходя из последовательности.

Таблица 19 mAb Рассчитанная pI Измеренная pI % “кислотных” форм % “основных” форм 1 7,46 7,47 16,6 19,0 3 7,46 6,95 20,1 44,0 5 6,72 5,67 20,7 23,6 6 6,72 5,66 16,8 21,5 7 7,11 6,01 25,8 48,5 8 7,11 6,22 11,5 25,7

Разработка состава на основе mAb 3

[0102] На основе результатов относительно термостабильности разрабатывали лиофилизированный состав для обеспечения соответствующей стабильности mAb 3, который был пригоден для хранения mAb при ≤ -30°C, а также для хранения лиофилизированного mAb при 2-8°C. Составы на основе mAb 3 с применением различных буферных систем и при различных значениях pH тестировали в исследованиях стабильности, включающих осуществление циклов замораживания-оттаивания, исследования перемешивания и при краткосрочной (12 недель) инкубации при стрессовых, обеспечивающих ускоренное старение и предполагаемых условиях хранения: 40°C, 25°C, 5°C, -30°C и -80°C. В этих экспериментах агрегацию и химическое разрушение белка оценивали в дополнение к образованию частиц (визуальный осмотр, подсчет частиц на основе метода светоблокировки и микропотоковая визуализация).

[0103] На основе результатов исследований по разработке составов выбирали состав, содержащий 10 мМ L-гистидин-HCl, 8% вес/об. сахарозы и 0,05% вес/об. полисорбата 80, характеризующийся pH 6,2.

Разработка способа лиофилизации

[0104] Для mAb 3 разрабатывали способ лиофилизации для обеспечения того, чтобы составленное антитело характеризовалось приемлемыми стабильностью и свойствами осадка после лиофилизации. Технологические параметры цикла лиофилизации (значения температуры сушки, давление в камере и т.д.) определяли на основании ряда циклов, выполненных в рамках разработки, с использованием лиофилизатора лабораторного масштаба (Genesis EL35, изготовленного компанией SP Scientific). Надежность цикла устанавливали путем проведения серии циклов лиофилизации с контролируемым изменением скорости замораживания, значений температуры сушки и вакууметрического давления в камере. Исследования стабильности лиофилизированного составленного антитела включали кратковременную (12 недель) инкубацию при стрессовых, обеспечивающих ускоренное старение и предполагаемых условиях хранения при 40°C, 25°C и 5°C. В ходе данных экспериментов свойства лиофилизированного порошка (внешний вид осадка, время восстановления, содержание кислорода в свободном пространстве, содержание влаги) оценивали в дополнение к оценке агрегации, химического разложения и образования частиц. На основании исследований по разработке состава и лиофилизации выбирали композицию на основе mAb 3, предусматривающую mAb 3 в количестве 50 мг/мл, 10 мМ L-гистидин-HCl, 8% вес/об. сахарозы, 0,05% вес/об. полисорбата 80 и pH 6,2. Составленное антитело хранят при ≤ -30°C, а лиофилизированное составленное антитело хранят при 2-8°C.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>SANOFI

Genzyme Corporation

<120>АНТИТЕЛА К CD38 И СОСТАВЫ

<130>704023: SA9-289PC

<150>US 62/837,518

<151>2019-04-23

<150>US 62/859,699

<151>2019-06-10

<150>EP 20305145.3

<151>2020-02-17

<150>EP 20305146.1

<151>2020-02-17

<160>14

<170>PatentIn версия 3.5

<210>1

<211>450

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210>2

<211>449

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210>3

<211>449

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210>4

<211>449

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210>5

<211>449

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210>6

<211>449

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210>7

<211>214

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>8

<211>214

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asp Val Ser Thr Val

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>9

<211>214

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asp Val Ser Thr Val

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>10

<211>449

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210>11

<211>254

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>11

Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala

1 5 10 15

Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro

20 25 30

Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln

35 40 45

Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu

50 55 60

Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr

65 70 75 80

Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu

85 90 95

Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln

100 105 110

Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys

115 120 125

His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn

130 135 140

Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro

145 150 155 160

Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val

165 170 175

Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln

180 185 190

Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln

195 200 205

Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly

210 215 220

Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp

225 230 235 240

Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys

245 250

<210>12

<211>317

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>12

Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu

1 5 10 15

Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp

20 25 30

Ser Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro

35 40 45

Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly

50 55 60

Ala Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn

65 70 75 80

Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn

85 90 95

Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser

100 105 110

Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr

115 120 125

Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His

130 135 140

Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln

165 170 175

Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly

180 185 190

Tyr Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro

195 200 205

Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile Ile Val Ala Val Val Ile

210 215 220

Ala Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr

225 230 235 240

Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala

245 250 255

Ala Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg

260 265 270

Gln Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr

275 280 285

Met Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr

290 295 300

Leu Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn

305 310 315

<210>13

<211>452

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>13

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210>14

<211>214

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Синтетический полипептид

<400>14

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитела, которые специфически связывают CD38 человека, фармацевтические композиции и стандартные лекарственные формы, содержащие указанные антитела, а также способы их получения. Кроме того, раскрыты способы применения антител для лечения заболевания, связанного с клетками, экспрессирующими CD38, например, рака. Изобретение обеспечивает более эффективное уничтожение клеток, которые экспрессируют CD38, и более эффективный клинический ответ. 7 н. и 19 з.п. ф-лы, 2 ил., 19 табл.

1. Антитело, которое специфически связывается с CD38 человека, где антитело содержит

a) тяжелую цепь (HC) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и

легкую цепь (LC) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

b) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

с) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

d) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

e) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, или

f) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

g) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9.

2. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с клетками, экспрессирующими CD38, содержащая в своем составе антитело,

где фармацевтическая композиция, содержащая в своем составе антитело, содержит антитело, сахарозу, L-гистидин и полисорбат 80 (PS80),

где антитело специфически связывается с CD38 человека и находится в концентрации 50 мг/мл,

сахароза присутствует в концентрации 8% (вес/об.),

L-гистидин присутствует в концентрации 10 мМ, и

PS80 присутствует в концентрации 0,05% (об./об.),

где рН состава равен 6,2, и

где антитело содержит

a) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

b) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

с) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

d) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

e) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, или

f) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

g) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9.

3. Стандартная лекарственная форма, содержащая в своем составе антитело, для лечения заболевания, связанного с клетками, экспрессирующими CD38,

где антитело специфически связывается с CD38 человека, и

где стандартная лекарственная формула, содержащая в своем составе антитело, содержит 215 мг антитела, 6,21 мг L-гистидина, 344 мг сахарозы и 2,15 мг полисорбата 80,

где входящее в состав антитело является лиофилизированным, и

где антитело содержит

a) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

b) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

с) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

d) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

e) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, или

f) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

g) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9.

4. Фармацевтическая композиция по п. 2 или стандартная лекарственная форма по п. 3, где фармацевтическая композиция или стандартная лекарственная форма, содержащая в своем составе антитела, является лиофилизированной.

5. Антитело по п. 1, антитело, входящее в состав фармацевтической композиции по п. 2 или 4 или в состав стандартной лекарственной формы по п. 3 или 4,

где аминокислота в положении 1 аминокислотной последовательности HC представляет собой пироглутамин.

6. Антитело по п. 1 или 5, антитело, входящее в состав фармацевтической композиции по любому из пп. 2, 4 или 5, или в состав стандартной лекарственной формы по любому из пп. 3-5,

где значение изоэлектрической точки (pI) антитела равно 5,8-9,0 при измерении посредством капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF).

7. Антитело по любому из пп. 1, 5 или 6, антитело, входящее в состав фармацевтической композиции по любому из пп. 2 или 4-6, или в состав стандартной лекарственной формы по любому из пп. 3-6,

где антитело включает главный вариант, отличающийся зарядом, и по меньшей мере один кислотный вариант, отличающийся зарядом, и

где антитело включает по меньшей мере одно из следующего:

a) HC по меньшей мере одного варианта, отличающегося зарядом, содержит по меньшей мере один дезамидированный аспарагин, выбранный из группы, состоящей из N289, N318, N387 и N392, пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO:1, или

b) антитело включает главный вариант, отличающийся зарядом, и по меньшей мере один кислотный вариант, отличающийся зарядом, где главный вариант с зарядом, который равен по меньшей мере 71% от количества антитела, а кислотный вариант имеет заряд, который равен не более 30% от количества антитела, или

c) главный вариант имеет заряд со значением изоэлектрической точки (pI) 7,5, и где один или несколько кислотных вариантов, отличающихся зарядом, имеют значение pI 5,8 при измерении посредством капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF).

8. Антитело по любому из пп. 1 или 5-7, антитело, входящее в состав фармацевтической композиции по любому из пп. 2 или 4-7, или в состав стандартной лекарственной формы по любому из пп. 3-7,

где антитело включает по меньшей мере один основный вариант, отличающийся зарядом, и где антитело имеет по меньшей мере одно из следующего:

a) основный вариант, отличающийся зарядом, составляет не более 4% от количества антитела, или

b) один или несколько основных вариантов, отличающихся зарядом, имеют значение pI 9,0 при измерении посредством капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF).

9. Антитело по любому из пп. 1 или 5-8, антитело, входящее в состав фармацевтической композиции по любому из пп. 2 или 4-8, или в состав стандартной лекарственной формы по любому из пп. 3-8, где антитело

a) способно уничтожать CD38-экспрессирующую клетку посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC),

где клетка характеризуется плотностью рецепторов CD38, составляющей ≤13000 сайтов расположения CD38 на поверхности клетки, в присутствии природных клеток-киллеров, экспрессирующих 158F, 158V или оба варианта 158F и 158V CD16a (FcγRIIIa), и/или

b) связывается с CD16a (FcγRIIIa), содержащим фенилаланин в аминокислотном положении 158 (158F), со значением K_D, равным 59 нМ, как измерено посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR), и

где антитело связывается с CD16a, содержащим валин в аминокислотном положении 158 (158V), с K_D, равной 75 нМ, как измерено посредством SPR, и/или

c) связывается с CD16a (FcγRIIIa), содержащим фенилаланин в аминокислотном положении 158 (158F), со значением K_D, равной 96 нМ, как измерено по связыванию с 158F FcγRIIIa, экспрессируемым клетками HEK, и

где антитело связывается с FcγRIIIa, содержащим валин в аминокислотном положении 158 (158V), с K_D, равной 40 нМ, как измерено по связыванию с 158V FcγRIIIa, экспрессируемым клетками HEK, и/или

d) связывается с CD32a (FcγRIIa), содержащим аргинин в аминокислотном положении 131 (131R), с K_D, равной 94 нМ, как измерено по связыванию с 131R FcγRIIa, экспрессируемым клетками HEK, и

где антитело связывается с FcγRIIa, содержащим гистидин в аминокислотном положении 131 (131H), со значением K_D, равной 222 нМ, как измерено по связыванию с 131H FcγRIIa, экспрессируемым клетками HEK.

10. Антитело по любому из пп. 1 или 5-9, антитело, входящее в состав фармацевтической композиции по любому из пп. 2 или 4-9, или в состав стандартной лекарственной формы по любому из пп. 3-9, где

a) антитело способно уничтожать CD38-экспрессирующую клетку посредством ADCC, где клетка характеризуется плотностью рецепторов CD38, составляющей >400000 рецепторов на поверхности клетки, и

способно уничтожать CD38-экспрессирующую клетку посредством ADCC, где клетка характеризуется плотностью рецепторов CD38, составляющей ≥100000 рецепторов на поверхности клетки, и

способно уничтожать CD38-экспрессирующую клетку посредством ADCC, где клетка характеризуется плотностью рецепторов CD38, составляющей ≤13000 рецепторов на поверхности клетки,

в присутствии природных клеток-киллеров, экспрессирующих 158F, 158V или оба варианта 158F и 158V CD16a (FcγRIIIa), и/или

b) антитело способно уничтожать CD38-экспрессирующую клетку посредством антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP) в присутствии мононуклеарных клеток периферической крови человека (PMBC), где клетка характеризуется плотностью рецепторов CD38, составляющей >400000 рецепторов на поверхности клетки.

11. Антитело по любому из пп. 1 или 5-10, антитело, входящее в состав фармацевтической композиции по любому из пп. 2 или 4-10, или в состав стандартной лекарственной формы по любому из пп. 9 или 10, где

a) в присутствии природных клеток-киллеров, экспрессирующих вариант CD16a (FcγRIIIa) с более высокой аффинностью (158V), антитело способно уничтожать клетки KMS-12BM посредством ADCC при EC₅₀, равной приблизительно 0,6 нг/мл, и/или

b) в присутствии природных клеток-киллеров, экспрессирующих вариант CD16a (FcγRIIIa) с более низкой аффинностью (158F), антитело способно уничтожать клетки KMS-12BM посредством ADCC при EC₅₀, составляющей приблизительно 0,65 нг/мл, и/или

c) в присутствии природных клеток-киллеров, экспрессирующих вариант CD16a (FcγRIIIa) с более высокой аффинностью (158V), антитело способно уничтожать клетки RPMI-8226 посредством ADCC при EC₅₀, составляющей приблизительно 0,09 нг/мл, и/или

d) в присутствии природных клеток-киллеров, экспрессирующих вариант CD16a (FcγRIIIa) с более низкой аффинностью (158F), антитело способно уничтожать клетки RPMI-8226 посредством ADCC при EC₅₀, составляющей приблизительно 0,09 нг/мл, и/или

e) в присутствии природных клеток-киллеров, экспрессирующих вариант CD16a (FcγRIIIa) с более высокой аффинностью (158V), антитело способно уничтожать клетки MOLP-8 посредством ADCC при EC₅₀, составляющей приблизительно 0,14 нг/мл, и/или

f) в присутствии природных клеток-киллеров, экспрессирующих вариант CD16a (FcγRIIIa) с более низкой аффинностью (158F), антитело способно уничтожать клетки MOLP-8 посредством ADCC при EC₅₀, составляющей приблизительно 0,28 нг/мл.

12. Антитело по любому из пп. 1 или 5-11, антитело, входящее в состав фармацевтической композиции по любому из пп. 2 или 4-11, или в состав стандартной лекарственной формы по любому из пп. 3-11,

где в присутствии PMBC человека, экспрессирующих вариант CD16a (FcγRIIIa) с более высокой аффинностью (158V), антитело способно уничтожать клетки MOLP-8 посредством ADCP при EC₅₀, составляющей приблизительно 31,87 нг/мл.

13. Антитело по любому из пп. 1 или 5-12, антитело, входящее в состав фармацевтической композиции по любому из пп. 2 или 4-12, или в состав стандартной лекарственной формы по любому из пп. 3-12,

где антитело способно повышать выживаемость мышей в модели опухоли на мышах, где мыши в модели экспрессирует CD16a (158F) человека, и где мышам инъекцией вводят 500000 клеток EL4, экспрессирующих CD38 человека.

14. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей антитело, которое специфически связывается с CD38 человека, где антитело содержит

a) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

b) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

с) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

d) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

e) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, или

f) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

g) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9,

где способ включает стадии:

i) экспрессии антитела в культуре клеток;

ii) по меньшей мере одну стадию очистки антитела, где очистка выбрана из группы, состоящей из хроматографии и ультрафильтрации, с получением раствора очищенного антитела; и

iii) корректирования раствора очищенного антитела с получением состава антитела, содержащего в своем составе антитело, где состав антитела содержит

- очищенное антитело в концентрации 50 мг/мл,

- сахарозу в концентрации 8% вес/об.,

- L-гистидин в концентрации 10 мМ и

- полисорбат 80 в концентрации 0,05% об./об.,

где рН состава антитела составляет 6,2; и

iv) лиофилизирования входящего в состав композиции антитела,

получая таким образом фармацевтическую композицию.

15. Способ получения восстановленного входящего в состав антитела, включающий

a) получение лиофилизированного состава антитела, содержащего сахарозу, L-гистидин, полисорбат 80 и антитело, которое специфически связывает CD38 человека; и

b) восстановление в разбавителе лиофилизированного состава антитела, где восстановленный состав антитела содержит

- антитело в концентрации 50 мг/мл,

- сахарозу в концентрации 8% вес/об.,

- L-гистидин в концентрации 10 мМ и

- полисорбат 80 в концентрации 0,05% об./об.,

где рН восстановленного состава антитела равно 6,2;

где антитело содержит

i) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

ii) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

iii) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

iv) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

v) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, или

vi) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

vii) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9.

16. Способ лечения пациента, включающий введение пациенту одной или нескольких доз антитела, которое специфически связывается с CD38 человека,

где пациента страдает заболеванием, связанным с клетками, экспрессирующими CD38,

где антитело содержит

a) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

b) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

с) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

d) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

e) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, или

f) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

g) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9.

17. Антитело для применения в лечении заболевания, связанного с клетками, экспрессирующими CD38,

где антитело специфически связывается с CD38 человека,

где антитело содержит

a) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

b) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

с) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, или

d) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

e) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, или

f) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, или

g) HC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и

LC с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9.

18. Способ по п. 16 или антитело для применения по п. 17, где заболевание имеет гематологическое происхождение.

19. Способ или антитело для применения по п. 18, где заболевание гематологического происхождения выбрано из группы, состоящей из амилоидоза, неходжкинской лимфомы (NHL), болезни Вальденстрема, множественной миеломы (MM), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и острого миелогенного лейкоза (AML).

20. Способ по любому из пп. 16, 18 или 19, или антитело для применения по любому из пп. 17-19,

где одна или несколько доз антитела представлены в виде лиофилизированного состава антитела, и

где перед введением лиофилизированный состав антитела восстанавливает с образованием восстановленного состава антитела таким образом, что восстановленный состав антитела имеет pH 6,2 и содержит антитело в концентрации 50 мг/мл в жидкости, содержащей 10 мМ L-гистидина, 8% (вес/об.) сахарозы и 0,05% (об./об.) полисорбата 80.

21. Способ по любому из пп.16 или 18-20 или антитело для применения по любому из пп.17-20,

где антитело вводят в дозе 20 мг/кг, 10 мг/кг, 5 мг/кг, 3 мг/кг или 1,5 мг/кг.

22. Способ по любому из пп. 16 или 18-21 или антитело для применения по любому из пп. 17-21,

где антитело представляет собой состав антитела, содержащий в своем составе антитело,

где входящее состав антитела содержит антитело в концентрации 50 мг/мл, сахарозу в концентрации 8% (вес/об.), L-гистидин в концентрации 10 мМ и полисорбат 80 (PS80) в концентрации 0,05% (об./об.),

где рН состава антитела составляет 6,2.

23. Способ по любому из пп. 16 или 18-22 или антитело для применения по любому из пп. 17-22,

где значение изоэлектрической точки (pI) антитела составляет от 5,8 до 9,0 при измерении посредством капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF).

24. Способ по любому из пп. 16 или 18-23 или антитело для применения по любому из пп. 17-23,

где аминокислота в положении 1 аминокислотной последовательности HC представляет собой пироглутамин.

25. Способ по любому из пп. 16 или 18-24 или антитело для применения по любому из пп. 17-24,

где антитело включает главный вариант, отличающийся зарядом, и по меньшей мере один кислотный вариант, отличающийся зарядом, и

где антитело включает по меньшей мере одно из следующего:

a) HC по меньшей мере одного варианта, отличающегося зарядом, содержит по меньшей мере один дезамидированный аспарагин, выбранный из группы, состоящей из N289, N318, N387 и N392, пронумерованных в соответствии с SEQ ID NO:1, или

b) антитело включает главный вариант, отличающийся зарядом, и по меньшей мере один кислотный вариант, отличающийся зарядом, где главный вариант, отличающийся зарядом, составляет по меньшей мере 71% от количества антитела, а кислотный вариант, отличающийся зарядом, составляет не более 30% от количества антитела, или

c) главный вариант, отличающийся зарядом, имеет изоэлектрическую точку (pI), равную 7,5, и где один или несколько кислотных вариантов, отличающихся зарядом, имеют pI, равную 5,8 при измерении посредством капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF).

26. Способ по любому из пп. 16 или 18-25 или применение по любому из пп. 17-25,

где антитело содержит по меньшей мере один основный вариант, отличающийся зарядом, и где антитело имеет по меньшей мере одно из следующего:

a) основный вариант, отличающийся зарядом, составляет не более 4% от количества антитела, или

b) один или несколько основных вариантов, отличающихся зарядом, имеют pI, равную 9,0 при измерении посредством капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF).

название	год	авторы	номер документа
ВИДЫ КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ РАКА, НАЦЕЛИВАЮЩИЕСЯ НА CD38 И TGF-БЕТА	2019	Адриан, Франциско Грегори, Ричард К. Шапиро, Гари Ван Де Вельде, Хельги	RU2808632C2
СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С CD38 И PD-L1 МОЛЕКУЛЫ	2017	Жуковски, Эжен Лежер, Оливье Морс, Ришар Ж.	RU2764201C2
Терапевтические антитела к CD47	2016	Маннинг, Памела Пюро, Робин Алмагро, Хуан, К. Карр, Роберт, У.	RU2748401C2
ТРИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К НИМ СПОСОБЫ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2020	Биркенфельд, Йерг Нейбел, Гари Дж. Цю, Хуавэй Регула, Йерг Сьюнг, Эдвард Вэй, Ронни У, Лань Син, Чжэнь Сюй, Лин Прад, Катрин Дабдуби, Тарик Камерон, Беатрис Лемуан, Сендрин Ян, Цжи-Юн	RU2822200C2
АНТИТЕЛА, ПОДХОДЯЩИЕ ДЛЯ ПАССИВНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ГРИППА, И ИХ КОМПОЗИЦИИ, КОМБИНАЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ	2015	Эстеллес Анджелес Каувар Лоуренс М. Вигил Адам Виттекинд Майкл	RU2720282C1
Антитела против ингибитора пути тканевого фактора и их применения	2016	Апгар Джеймс Р. Бенард Сьюзан Карвен Грегори Дж. Хетт Санита Р. Хольсти Мэттью Джасуджа Реема Джин Мэйси Цзюо Чжон Шон Питтман Дебра Сталь Марк	RU2815681C1
АНТИТЕЛА К CD38 И КОМБИНАЦИИ С АНТИТЕЛАМИ К CD3 И CD28	2018	Сюй, Лин Сьюнг, Эдвард Вэй, Ронни Нейбел, Гари Ян, Цжи-Юн Дабдуби, Тарик Камерон, Беатрис Лемуан, Сендрин Прад, Катрин У, Лань	RU2812910C2
АНТИ-SIRPα АНТИТЕЛА	2018	Верхейден, Гейсбертус Франсискус Мария Раувендал, Герард Арендс, Роланд Ян Ван Ден Берг, Тимо Карс Матлунг, Ханке Лотти Франке, Катарина	RU2771174C2
ТРИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ CD38, CD28 И CD3, А ТАКЖЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ	2019	Сюй, Лин Сьюнг, Эдвард Вэй, Ронни Нейбел, Гари Ян, Цжи-Юн Дабдуби, Тарик Камерон, Беатрис Лемуан, Сендрин Прад, Катрин У, Лань	RU2820351C2
УСТОЙЧИВЫЕ МУЛЬТИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА	2018	Жуковски, Эжен Леже, Оливье Морс, Ришар Ж.	RU2779602C2

US 9611322 B2, 04.04.2017
WO 2008047242 A2, 24.04.2008
XINHUA WANG et al., IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions, PROTEIN & CELL, 2018, vol
Разборный с внутренней печью кипятильник	1922	Петухов Г.Г.	SU9A1
Печь для непрерывного получения сернистого натрия	1921	Настюков А.М. Настюков К.И.	SU1A1
DILILLO D.J., RAVETCH J.V., Differential Fc-Receptor Engagement Drives an Anti-tumor Vaccinal Effect, CELL, 2015, vol
Вага для выталкивания костылей из шпал	1920	Федоров В.С.	SU161A1
Кипятильник для воды	1921	Богач Б.И.	SU5A1
WEI WANG et al.,

АНТИТЕЛА К CD38 И СОСТАВЫ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00

Описание патента на изобретение RU2826957C2

Похожие патенты RU2826957C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 826 957 C2

Реферат патента 2024 года АНТИТЕЛА К CD38 И СОСТАВЫ

Формула изобретения RU 2 826 957 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2826957C2

RU 2 826 957 C2