ЖИДКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ИЗ ЛЕПРОМ БОЛЬНЫХ ЛЕПРОЙ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано, в частности, для культивирования микобактерий при посеве образцов из лепрозных источников - лепром больных лепрой людей и экспериментально зараженных животных.

Из практики медицины известна жидкая среда Сотона для культивирования микобактерий, содержащая двуосновной фосфорнокислый калий, сернокислую магнезию, лимонно-аммиачное железо, лимонную кислоту, аспарагин, глицерин, дистиллированную воду (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под. ред. М.О.Биргера. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. - 464 с.). Известная среда не дает возможности получить технический результат - повышение высеваемости микобактерий при посеве образцов из лепром больных лепрой.

Из практики медицины известна среда Моделя для культивирования микобактерий, содержащая двуосновной фосфорнокислый калий, щавелевокислый аммоний, сернокислое железо, сернокислую магнезию, глицерин, дистиллированную воду (Драбкина Р.О. Микробиология туберкулеза / М.: 1963. - 255 с.). Известная среда не дает возможности получить технический результат - повышение высеваемости микобактерий при посеве образцов из лепром больных лепрой.

Наиболее близкой предлагаемой является среда Школьниковой, содержащая калий однозамещенный фосфорнокислый - 0,15 г, натрий двузамещенный фосфорнокислый - 0,25 г, магний сернокислый - 0,05 г, натрий лимоннокислый - 0,15 г, лимоннокислое аммиачное железо - 0,005 г, L-аспарагин - 0,1 г, глицерин - 3,5 г (или 3,0 мл), дистиллированную воду до 100 мл (Пр. МЗ №109 от 21. 03 2003 г. Приложение №11, С.270-271). Известная среда не дает возможности получить технический результат - повышение высеваемости микобактерий при посеве всех образцов из лепром больных лепрой.

Сходство известной среды с предлагаемой заключается в том, что они обе относятся к медицине, а именно к микробиологии, и содержат глицерин, солевую композицию, включающую калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированную воду.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение высеваемости возбудителя при посеве образцов из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией.

Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением положительного результата.

Решение поставленной задачи состоит в том, что питательная среда, включающая калий однозамещенный фосфорнокислый - 0,15 г, натрий двузамещенный фосфорнокислый - 0,25 г, магний сернокислый - 0,05 г, натрий лимоннокислый - 0,15 г, лимоннокислое аммиачное железо - 0,005 г, глицерин - 3,5 г (или 3,0 мл), дополнительно содержит хлорид натрия и мочевину при следующем весовом соотношении компонентов: хлорид натрия - 0,5-3,0 г, мочевина - 1,0-4,0 г, дистиллированная вода до 100 мл.

Предлагаемой жидкой питательной средой достигается результат - увеличение высеваемости возбудителя при посеве образцов из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией, а также сокращение сроков выделения возбудителя (на 7 дней), повышение высеваемости микобактерий из лепром больных лепрой (до 83,3%).

Известно, что не существует общепризнанных питательных сред для культивирования М.leprae, несмотря на то, что попытки получить культуру возбудителя лепры продолжаются 135 лет с момента открытия М.leprae А.Гансеном в 1874 году.

Проведенный анализ патентной и научной литературы показал, что предлагаемая среда для культивирования микобактерий, выделенных из лепром больных лепрой, ранее не применялась.

Отсутствие воспроизводимости при культивировании М.leprae на искусственных питательных средах создает определенные трудности для изучения биологии возбудителя лепры и создания различных биологических препаратов на основе М.leprae. Лабораторные животные (мыши, крысы, броненосцы), в организме которых размножаются М.leprae, выделенные из пораженных тканей больных лепрой людей, до настоящего времени являются единственным источником бактериальной массы, используемой в лепрологии для научных и практических целей. В частности, изучение чувствительности к противолепрозным препаратам производят на мышах, зараженных в подушечку лапки (Shepard C.C. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice // J. Exp. Med., 1960, - V.36. - P.445-454). Пассирование М.leprae на животных - длительный процесс, занимающий от 1,5 до 2 лет. Кроме этого, отсутствие сред для культивирования М.leprae делает невозможным бактериологическую диагностику лепры. Предлагаемая авторами жидкая питательная среда позволяет получить визуально обнаруживаемый рост культуры микобактерий, выделенных из лепром больных лепрой людей и тканей экспериментально зараженных животных. Следуя теории о двухфазности жизненного цикла в природном существовании М.leprae, внеорганизменная фаза которого может протекать в почве, авторы предлагают простую жидкую питательную среду, не содержащую сложных органических соединений: аминокислот, ферментов и других белков, витаминов, нуклеиновых кислот, микобактинов и т.п. В качестве источника азота и углерода авторы добавляют в питательную среду простое органическое соединение - мочевину (CF₆N₂O), которая в качестве метаболита всегда присутствует как в макроорганизме, так и в почве. Основываясь на галотолерантности микобактерий, природным резервуаром которых является почва (Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. и др.: под ред. А.И.Нетрусова. - Экология микроорганизмов // М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с.), авторы добавляют к питательной среде хлорид натрия в качестве ингибитора возможных сапрофитных контаминантов. Питательная среда имеет следующий состав: глицерин (С₃Н₈О₃) - 3,5 г (или 3,0 мл), солевая композиция: калий однозамещенный фосфорнокислый (KH₂PO₄) - 0,15 г, натрий двузамещенный фосфорнокислый (Na₂HPO₄) - 0,25 г, магний сернокислый (MgSO₄×7H₂O) - 0,05 г, натрий лимоннокислый (Na₂C₆H₅O₇×2H₂O) - 0,15 г, лимоннокислое аммиачное железо (FeNH₄C₆H₅O₇) - 0,005 г, мочевина (CH₆H₂O) - 1,0-4,0 г, хлорид натрия (NaCI) - 0,5-3,0 г, дистиллированная вода - до 100 мл.

Предлагаемую жидкую питательную среду готовят следующим образом. Солевую композицию, глицерин (3,5 г или 3,0 мл), хлорид натрия (1,5 г) растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют в паровом стерилизаторе при 120°С в течение 20 минут. К 98 мл стерильной среды добавляют 2 г кристаллической мочевины, перемешивают, разливают по 5 мл среды в пробирки и стерилизуют при 112°С в течение 15 минут.

Культивирование микобактерий из лепром больных лепрой на предлагаемой авторами жидкой питательной среде осуществляют следующим образом: ткань лепромы человека больного лепрой или лапу мыши, зараженной М.leprae интраплантарно по методу Shepard C.C., предварительно обрабатывают 5% раствором серной кислоты с последующим промыванием физиологическим раствором, измельчают ножницами и гомогенизируют. Гомогенат центрифугируют при 1000 об/мин (3 мин). Собирают надосадочную жидкость и подсчитывают в ней количество микобактерий по методу Shepard C.C., McRae D.H. Посевы осуществляют градуированной пипеткой в объеме 0,1 мл надосадочной жидкости на жидкую питательную среду, разлитую по 5 мл в пробирки.

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицей 1.

Таблица 1 Зависимость показателей роста микобактерий от содержания компонентов среды Содержимое компонентов среды Количество образцов Сроки появления видимого роста (сутки) Средний срок выделения культуры Глицерин, солевая композиция в диет. воде (мл) Мочевина (г) NaCl (г) 98,5 1,0 0,5 4 20-70 45 96,5 2,0 1,5 4 14-60 27 93,0 4,0 3,0 4 28-80 54

Таким образом, оптимальным соотношением компонентов среды, обеспечивающим решение поставленной задачи, является: глицерин и солевая композиция в дистиллированной воде - 96,5 мл, мочевина - 2,0 г, хлорид натрия - 1,5 г.

Предлагаемая жидкая питательная среда прошла успешную апробацию в ФГУ «НИИ по изучению лепры Росздрава» в 2008-2009 гг. при культивировании микобактерий из 2 образцов лепром от больного лепроматозной лепрой и 11 образцов от экспериментально зараженных животных.

Ниже приводим сводную таблицу результатов апробации жидкой питательной среды для культивирования микобактерий из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией.

Таблица 2 Оценка высеваемости микобактерий на различных питательных средах Жидкая питательная среда Количество образцов Высеваемость (%) Глицерин, солевая композиция, дистиллированная вода с мочевиной и хлоридом натрия 13 83,3 Среда Школьниковой (официальная, Пр. МЗ РФ №109) 13 25,0 Среда Сотона 10 10,0 Среда Моделя 10 0,0

Таким образом, приведенные данные подтверждают большую эффективность предлагаемой жидкой питательной среды для культивирования микобактерий из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией по сравнению с известными жидкими питательными средами.

Ниже приводятся результаты апробации среды.

Пример 1

Штамм М.leprae (I-пассаж) первично получен из лепромы больного Ку-ва Т.С., и.б. №3893, диагноз: лепра, лепроматозный тип (LLs), пассировали на мышах линии СВА по методу Shepard C.C. Ткань лапы мыши, зараженной интраплантарно, после предварительной обработки 5% раствором серной кислоты с последующим промыванием физиологическим раствором измельчают ножницами и гомогенизируют. Гомогенат центрифугируют при 1000 об/мин (3 мин). Собирают надосадочную жидкость и подсчитывают в ней количество микобактерий по методу Shepard C.C., McRae D.H. Посевы осуществляют градуированной пипеткой в объеме 0,1 мл надосадочной жидкости на жидкую питательную среду, разлитую по 5 мл в пробирки. Посевная доза составила 1×10⁴ клеток. Питательная среда имеет следующий состав: глицерин (3,5 г или 3 мл) и солевую композицию, включающую калий однозамещенный фосфорнокислый (0,15 г), натрий двузамещенный фосфорнокислый (0,25 г), магний сернокислый (0,05 г), натрий лимоннокислый (0,15 г), лимоннокислое аммиачное железо (0,005 г), дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она вместо L-аспарагина дополнительно содержит хлорид натрия и мочевину при следующем весовом соотношении компонентов:

хлорид натрия - 0,5 г;

мочевина - 1,0 г;

солевая композиция и глицерин в дистиллированной воде - остальное (98,5 мл).

Одновременно посевы производят на питательную среду Школьниковой (Пр. МЗ №109 от 21.03 2003 г. Приложение №11, С.270-271). Посевы выдерживали в термостате при 30°С.

Через 70 суток после первичного посева материала обнаружен рост на предлагаемой авторами среде в виде придонного осадка. При микроскопии мазка выделенной культуры, окрашенного по методу Циля-Нильсена, обнаружены мелкие кислотоустойчивые палочки. При окраске мазка аурамин-родамином регистрировали характерное для микобактерий золотисто-желтое свечение палочек в ультрафиолетовых лучах.

На среде Школьниковой роста бактерий не было обнаружено в течение всего срока наблюдения (8 месяцев).

Таким образом, из данного примера видно, что микобактерии растут только на предлагаемой авторами среде.

Пример 2

Штамм М.leprae (DC пассаж) первично получен из лепромы больного Кр-ва В.А., и.б. №3863, диагноз: лепра, лепроматозный тип (LLs), пассировали на мышах линии СВА по методу Shepard C.C. Подготовку материала и посев на среды осуществляли аналогично первому примеру. Посевная доза составила 2,4×10⁷ клеток. Питательная среда имеет следующий состав: глицерин и солевая композиция, включающая калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированная вода, отличающаяся тем, что она вместо L-аспарагина дополнительно содержит хлорид натрия и мочевину при следующем весовом соотношении компонентов:

хлорид натрия - 3,0 г;

мочевина - 4,0 г;

солевая композиция и глицерин в дистиллированной воде - остальное (93,0 мл).

Через 60 суток после первичного посева материала обнаружен рост на предлагаемой авторами среде. На среде Школьниковой рост обнаружен позже на 1 неделю.

Таким образом, из данного примера видно, что рост микобактерий на предлагаемой среде опережает рост на среде Школьниковой.

Штамм М.leprae (VIII пассаж) первично получен из лепромы больной Му-вой М.С., и.б. №3120, диагноз: лепра, лепроматозный тип (LLs), пассировали на мышах линии СВА по методу Shepard C.C.

Подготовку материала и посев на среду осуществляли аналогично первому примеру. Посевная доза составила 3,4×10⁷ клеток.

Через 1,5 месяца после первичного посева материала визуализирован рост только на предлагаемой авторами среде.

На среде Школьниковой роста бактерий не было обнаружено в течение всего срока наблюдения (8 месяцев).

Таким образом, из данного примера видно, что видимый рост микобактерий обнаруживают только на предлагаемой авторами среде.

Пример 3

Лепрома с правого плеча больного Мо-ва, и.б. №3894, диагноз: лепра, погранично-лепроматозная форма (ВL). Подготовку материала и посев на среду осуществляли аналогично первому примеру. Посевная доза составила 4,2×10⁶ клеток. Питательная среда имеет следующий состав: глицерин и солевая композиция, включающая калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированная вода, отличающаяся тем, что она вместо L-аспарагина дополнительно содержит хлорид натрия и мочевину при следующем весовом соотношении компонентов:

хлорид натрия - 1,5 г;

мочевина - 2,0 г;

солевая композиция и глицерин в дистиллированной воде - остальное (96,5 мл).

Через 14 суток после первичного посева материала обнаружен рост на предлагаемой авторами среде в виде хлопьевидного осадка. При микроскопии мазка выделенной культуры, окрашенного по методу Циля-Нильсена, обнаружены мелкие кислотоустойчивые палочки. При окраске мазка аурамин-родамином регистрировали характерное для микобактерий золотисто-желтое свечение палочек в ультрафиолетовых лучах. На среде Школьниковой роста бактерий не было обнаружено в течение всего срока наблюдения (2 месяца).

Таким образом, из данного примера видно, что видимый рост микобактерий обнаружен только на предлагаемой авторами среде.

Пример 4

Штамм М.leprae (III пассаж) первично получен из лепромы больной Ка-ной А.П., и.б. №3541, диагноз: лепра, погранично-лепроматозная форма (BL), пассировали на мышах линии СВА по методу Shepard C.C. Подготовку материала и посев на среды осуществляли аналогично первому примеру. Посевная доза составила 1,5×10⁸ клеток. Питательная среда имеет следующий состав: глицерин и солевая композиция, включающая калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированная вода, отличающаяся тем, что она вместо L-аспарагина дополнительно содержит хлорид натрия и мочевину при следующем весовом соотношении компонентов:

хлорид натрия - 0,1 г;

мочевина - 0,5 г;

солевая композиция и глицерин в дистиллированной воде - остальное (99,4 мл).

Визуального роста микобактерий не обнаружено в течение всего срока наблюдения (8 месяцев).

Пример 5

Штамм М.leprae (IV пассаж) первично получен из лепромы больной Ка-ной А.П., и.б. №3541, диагноз: лепра, погранично-лепроматозная форма (BL), пассировали на мышах линии СВА по методу Shepard C.C. Подготовку материала и посев на среды осуществляли аналогично первому примеру. Посевная доза составила 3,0×10⁷ клеток. Питательная среда имеет следующий состав: глицерин и солевая композиция, включающую калии однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированная вода, отличающаяся тем, что она вместо L-аспарагина дополнительно содержит хлорид натрия и мочевину при следующем весовом соотношении компонентов:

хлорид натрия - 4,0 г;

мочевина - 5,0 г;

солевая композиция и глицерин в дистиллированной воде - остальное (91,0 мл).

Визуального роста микобактерий не обнаружено в течение всего срока наблюдения (8 месяцев).

Предлагаемая среда позволяет обеспечить рост и размножение микобактерий при посеве материала из лепрозных источников и высокую частоту высеваемости (83,3%), по сравнению с прототипом (25,0%).

Таким образом, авторами предложена новая, никем ранее не предлагаемая жидкая питательная среда для культивирования микобактерий при посеве образцов из лепром больных лепрой. Предлагаемая среда может быть рекомендована для использования в научных и клинических лабораториях противолепрозных учреждений системы здравоохранения.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано, в частности, для культивирования микобактерий из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией. Жидкая питательная среда по изобретению содержит калий однозамещенный фосфорнокислый 0,15 г, натрий двузамещенный фосфорнокислый 0,25 г, магний сернокислый 0,05 г, натрий лимоннокислый 0,15 г, лимоннокислое аммиачное железо 0,005 г, глицерин 3,5 г или 3,0 мл, хлорид натрия 0,5-3,0 г, мочевину 1,0-4,0 г и дистиллированную воду до 100 мл. Питательная среда по изобретению обеспечивает повышение высеваемости возбудителя лепры при посеве образцов из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией. 2 табл.

Жидкая питательная среда для культивирования микобактерий из лепром больных лепрой людей, включающая калий однозамещенный фосфорнокислый 0,15 г, натрий двузамещенный фосфорнокислый 0,25 г, магний сернокислый 0,05 г, натрий лимоннокислый 0,15 г, лимоннокислое аммиачное железо 0,005 г, глицерин 3,5 г (или 3,0 мл), отличающаяся тем, что дополнительно содержит хлорид натрия и мочевину при следующем весовом соотношении компонентов: хлорид натрия 0,5-3,0 г, мочевина 1,0-4,0 г, дистиллированная вода до 100 мл.