РАСТВОР ДЛЯ КОНСЕРВАЦИИ ОРГАНОВ Российский патент 2025 года по МПК A01N1/122 

Область техники

Настоящее изобретение относится к растворам для сохранения органов, применяемым при трансплантации. Указанные растворы содержат ионы натрия, калия, магния, кальция, и хлорид-ионы, сульфат-ионы, гистидин. Предложенные растворы обладают выраженным органопротективным действием и имеют повышенную эффективность при органоконсервации.

Предшествующий уровень техники

Из ранних исследований известны растворы для консервации органов и тканей. Данные растворы, как правило, используются для сохранения функций органов при их эксплантации, хранении и трансплантации. Так, известен раствор Perfadex и Perfadex Plus, используемый для консервации легких. Данный раствор предназначен для консервации легких и не пригоден для консервации сердца. Из уровня техники, патент RU 2161405 (опубл. 10.01.2001, заявитель – Шарлотт-Мекленбург Хоспитал Асорити Дуинг Бизнесс Эз Каролинас Медикал Сентер (US)) также известен кардиоплегический раствор для остановки сердца, предназначенного для трансплантации, включающий на литр раствора: (а) сбалансированный изотонический раствор, включающий ионы натрия, калия, кальция и магния и бикарбонат в физиологически приемлемом количестве; (b) приблизительно от 0,5 мкМ до приблизительно 5,0 мкМ, содержащего амилорид соединения; и (с) воду. Данный раствор включает калийный диуретик амилорид, что может приводить к повышенному содержанию ионов калия в изолированном органе. В настоящее время на рынке коммерчески доступны консервирующие растворы Celsior, Custidiol и Eurocolins. Раствор Celsior (производитель – IGL Group) предназначен для консервации сердца, а также почек, печени и поджелудочной железы, в России используется для консервации легких. Данный раствор содержит, помимо ионов натрия, калия, магния и кальция, глутатион, маннитол, лактобионовую кислоту, глутаминовую кислоту и гистидин. Однако гистидин содержится в низкой концентрации, а осмотическое давление данного раствора невелико, в связи с чем раствор имеет низкую буферную емкость и слабо предотвращает отек тканей. Кроме того, раствор имеет ограниченный срок хранения, его нельзя замораживать и необходимо хранить при температуре 2-8°С. Срок годности после вскрытия упаковки составляет не более 24 ч.

Раствор Eurocollins (EC Group) был разработан в 1970-х и ранее наиболее часто использовался для легочной перфузии, как правило, заменяется другими, более усовершенствованными растворами. Раствор Eucollins включает повышенное содержание ионов калия (115 ммоль/л) и пониженное содержание ионов натрия (10 ммоль/л), а также глюкозу (декстрозу). Это инвертированный внутриклеточный раствор, поэтому он неоптимален для консервации сердца, в частности, в плане восстановления его насосной функции в период реперфузии. Наличие декстрозы может приводить к нестабильности раствора и образованию побочных веществ в растворе. Таким образом, раствор для консервации органов должен быть стабильным, в т.ч. при воздействии высоких и низких температур, и не приводить к гипотермии и побочным биохимическим эффектам. Custodiol представляет собой кардиоплегический и органоконсервирующий раствор и позволяет обеспечить защиту сердца в условиях общей умеренной гипотермии во время ишемии сердца продолжительностью до 180 мин после однократного введения. При этом данный раствор содержит гистидиновый буфер и гипонатриевый буфер, что обуславливает метаболическую защиту клеток тканей от развивающегося ацидоз. Однако Custodiol тоже внутриклеточный раствор с низкой концентрацией ионов натрия, что приводит к ионному дисбалансу в консервируемом органе это особенно неблагоприятно для сердца. Раствор также содержит кетоглутарат и маннитол, поэтому, его необходимо хранить при температуре 2-8°С, в защищенном от света места, что при применении может иметь существенные недостатки.

Таким образом, есть необходимость в разработке нового состава, который обладал бы повышенной эффективностью при консервации органов, имел бы предсказуемую стабильность и длительный срок хранения. Разработанный раствор достаточно прост в получении, например, может применяться стерилизация в автоклаве, что позволит избежать асептического розлива и повысить срок годности раствора.

Описание изобретения

Предложен раствор для консервации органов и/или тканей, который имеет следующий состав, ммоль/л:

Na⁺ – 110-120

K⁺ – 14-16

Mg²⁺ – 10-15

Cl^- – 126-138,4

SO₄^2- – 10-15

Ca²⁺ – 1-1,2

L-гистидин – 50-180

В некоторых вариантах реализации предложенный раствор предпочтительно имеет следующий состав, ммоль/л:

Na⁺ – 118

K⁺ – 15

Mg²⁺ – 12

Cl^- – 135

SO₄^2- – 12

Ca²⁺ – 1

L-гистидин – 160

Дополнительно, раствор согласно изобретению имеет рН 7,6-8,0 и/или осмолярность 320-450 мосм/л. Также предложено применение описанного раствора для консервации органов и/или тканей, в т.ч. для консервации изолированных органов, предназначенных для трансплантации.

Далее изобретение будет описано более подробно.

Описание фигур

На Фиг. 1. показаны размеры некроза миокарда при холодовой консервации сердца в растворе Custodiol и в растворе согласно изобретению (Solution 1). Результаты получены при исследовании по примеру 2.

На Фиг.2. приведены показатели оксигенации крови при реперфузии ex-vivo после консервации в растворе Cutodiol и в растворе согласно изобретению (Solution 1). Результаты получены при исследовании по примеру 3.

Подробное описание изобретения

Сущность настоящего изобретения заключается в получении нового состава, который обладал бы повышенной эффективностью при консервации органов, имел бы предсказуемую и повышенную стабильность и длительный срок хранения. Полученный раствор достаточно прост в получении, например, может подвергаться стерилизации в автоклаве, что позволит избежать асептического розлива и повысить срок годности раствора.

Предложен раствор для консервации органа или ткани, который имеет следующий состав, ммоль/л:

Na⁺ – 110-120

K⁺ – 14-16

Mg²⁺ – 10-15

Cl^- – 126-138,4

SO₄^2- – 10-15

Ca²⁺ – 1-1,2

L-гистидин – 50-180

В некоторых вариантах реализации предложенный раствор предпочтительно имеет следующий состав, ммоль/л:

Na⁺ – 118

K⁺ – 15

Mg²⁺ – 12

Cl^- – 135

SO₄^2- – 12

Ca²⁺ – 1

L-гистидин – 160

В качестве источников ионов могут быть использованы соответствующие соли: калия хлорид, магния хлорид, дигидрофосфаты натрия, калия, сульфаты магния, кальция и другие физиологически приемлемые соли. Источником ионов кальция для раствора для консервации и/или перфузии органов по настоящему изобретению может быть любая растворимая физиологически приемлемая соль, содержащая ион кальция, например, лактат кальция, глюконат кальция или, предпочтительно, хлорид кальция. Все указанные диапазоны, в т.ч. диапазоны концентраций, включают значения, указанные внутри данного диапазона.

Отдельно следует указать, что раствор согласно изобретению не содержит сахаров, в частности, глюкозу, декстрозу, маннитол.

Дополнительно, раствор согласно изобретению имеет рН 7,6-8,0 и/или осмолярность 320-450 мосм/л. Также предложено применение описанного раствора для консервации органов или тканей, в т.ч. для консервации изолированных органов, предназначенных для трансплантации. В качестве органов, предназначенных для консервации и в дальнейшем для трансплантации, могут рассматриваться органы и ткани: сердце, легкие, печень, почки, поджелудочная железа, тонкая кишка и толстая кишка.

Технический результат заключается в разработке и получении раствора для консервации органов или тканей, который обладает большей эффективностью, длительной стабильностью, может быть подвергнут замораживанию без потери свойств. Для указанных составов было выявлено более выраженное протективное и инфаркт-лимитирующее действие, а значит – более выраженное защитное действие на миокард при холодовой консервации. Раствор согласно изобретению не вызывает отек тканей, а также позволяет эффективно предотвращать повреждение клеток донорского органа, вызванное ацидозом.

Данный раствор может быть получен при простой технологии стерилизации в автоклаве, без применения асептического розлива. Указанный технический результат достигается за счет качественного и количественного состава раствора согласно изобретению.

Примеры

Пример 1

Получение раствора согласно изобретению

Готовили растворы с составом согласно изобретению.

Состав, ммоль/л:

Na⁺ – 110-120

K⁺ – 14-16

Mg²⁺ – 10-15

Cl^- – 126-138,4

SO₄^2- – 10-15

Ca²⁺ – 1-1,2

L-гистидин – 50-180

Для приготовления раствора согласно изобретению растворяли в воде для инъекций все указанные компоненты состава:

натрий 110-120 ммоль/л; калий 14-16 ммоль/л; магний 10-15 ммоль/л; хлорид-ион 126-138,4 ммоль/л; сульфат-анион 10-15 ммоль/л; кальций 1-1,2 ммоль/л, L-гистидин 50-180 ммоль/л.

Для ряда растворов использовали дискретные значения из выбранных интервалов концентраций. Таким образом, получали набор растворов с различной концентрацией.

Далее, полученные растворы разливали во флаконы, герметично закупоривали и проводили стерилизацию в автоклаве при условиях: 120°С, 8 минут; флаконы постепенно охлаждали и просматривали на включение механических частиц. Раствор хранили в темном месте при температуре +4С° в течение 3 мес.

Далее, в качестве модельного раствора для исследований использовали раствор со следующими концентрациями, ммоль/л:

Na⁺ – 118

K⁺ – 15

Mg²⁺ – 12

Cl^- – 135

SO₄^2- – 12

Ca²⁺ – 1

L-гистидин – 160

рН раствора составлял 7,85. Измерение проводили с помощью pH-метра HANNA HI 2002-02 (Hanna Instruments, Германия).

Пример 2

Оценка эффективности консервации сердца

Эксперименты выполнялись на 20 крысах-самцах стока Wistar массой 200-250 г, содержавшихся в условиях 12/12 часового светового режима и получавших стандартный корм и питьевую воду. Животных наркотизировали Золетилом (Virbac, Франция) 3 мг/кг и ксилазином (Alfasan International B.V., Нидерланды) 3 мг/кг, внутримышечно. Грудную клетку вскрывали широким чрездиафрагмальным билатеральным доступом, быстро вырезали сердце и помещали его в физиологический раствор. После изъятия сердца из грудной полости его подключали к модифицированному аппарату Лангендорфа. По окончании 10-минутного стабилизационного периода в течение 6 минут в коронарное русло вводились охлажденнные до +4°С консервирующие растворы. В зависимости от вводимого консервирующего раствора все животные были разделены случайным образом на две группы:

1. Группа введения раствора Custodiol (Dr. F.KOHLER CHEMIE, Германия) (n = 10).

2. Разработанный раствор (Solution 1) (n = 8). Раствор включал состав: натрий 118 ммоль/л; калий 15 ммоль/л; магний 12 ммоль/л; хлор-анион 135 ммоль/л; сульфат-анион 12 ммоль/л; кальций 1 ммоль/л; L-гистидин 160 ммоль/л.

По окончании шестиминутного периода сердце вместе с аортальной канюлей снималось с аппарата Лангендорфа и помещалось в емкость с консервирующим раствором длительностью 8 часов. Температура раствора при этом поддерживалась на уровне +4°С. После окончания 8-часового периода сердце вновь подключалось к аппарату Лангендорфа и перфузировалось в течение 2 часов раствором Кребса-Хенселейта при температуре 37°С. По окончании периода реперфузии сердца нарезались на 5 равных по толщине поперечных срезов и в течение 15 минут окрашивались трифенилтетразолием хлоридом (ТТХ). Затем получали цифровые фотографии срезов. Размер инфаркта рассчитывали планиметрически по площади ТТХ-негативных зон с помощью программного обеспечания ImageJ (National Institutes of Health, CША). Оценивали процентное отношение суммы площадей ТТХ-негативных зон к сумме общей площади среда сердца. Результаты представляли в виде медианы, 25-го и 75-го процентилей (Me [Q1; Q3]). Статистический анализ был выполнен с помощью Statistica v10.0 (StatSoft, Талса, США). Учитывая небольшие размеры выборки и ненормальное распределение, различия между группами были проанализированы с использованием непараметрического U-критерия Манна – Уитни. Различия считали значимыми при р < 0,05.

В результате проведенных экспериментам было выявлено более выраженное инфаркт-лимитирующее действие разработанного раствора по сравнению с применением Custodiol. Так, в группе Custodiol размер некроза миокарда составил 52,5 [44,8; 60,1] (%), в то время как в группе разработанного раствора размер некроза составил 40 [31,3; 48,1] (%), p = 0,021 (Фиг. 1). Таким образом, разработанный раствор имеет более выраженное защитное действие на миокард при холодовой консервации.

Пример 3

Оценка эффективности консервации почки производилось на модели трансплантации почки в хроническом эксперименте на крысах.

Исследование проведено на 40 крысах-самцах стока Wistar. Все животные были разделены на две группы: 1) применение Custodiol (Dr. F.KOHLER CHEMIE, Германия) (n = 20) в качестве консервирующего раствора, 2) применение разработанного консервирующего раствора (n = 20). Разработанный раствор имел состав: натрий 118 ммоль/л; калий 15 ммоль/л; магний 12 ммоль/л; хлор-анион 135 ммоль/л; сульфат-анион 12 ммоль/л; кальций 1 ммоль/л; L-гистидин 160 ммоль/л. В каждой группе 10 животных из 20 были донорами. Все животные наркотизировались с помощью ингаляционного введения изофлурана. Животное-донор интубировалось и подключалось к аппарату искусственной вентиляции легких. Во время операции крысу размещали на термостатируемом операционном столике. Доступ в брюшную полость обеспечивался с помощью срединной лапаротомии. После визуализации почки, проводилось выделение сосудистой ножки и мочеточника левой почки тупым способом. Артерия и вена выделялись вплоть до брюшной аорты и нижней полой вены, соответственно, мочеточник – на протяжении 2 см от почечной лоханки. Мочеточник катетеризировали периферическим венозным катетером 24G с установкой в просвет, после чего мочеточник пересекался. Далее накладывались лигатуры у места отхождения левой почечной артерии и впадения почечной вены. Выполнялось последовательное промывание через почечную артерию донорского органа 10% раствором гепарина и одним из консервирующих растворов, в зависимости от группы. Консервирующие растворы подавались с помощью инфузомата со скоростью потока 5 мл/мин в объеме 15-20 мл. В дальнейшем сосудистые структуры донорской почки пересекались. После чего донорская почка эксплантировалась и располагалась на подложке, смоченной консервирующим раствором при температуре +4°С. На почечных артерии и вене устанавливались манжеты. Почечные сосуды последовательно выворачивались вокруг манжеты и фиксировались узлом с помощью нерассасывающегося шовного материала. Холодовая консервация донорского органа проводилась в течение 3 часов. После завершения консервации производилась имплантация донорской почки реципиенту бесшовным методом манжет. Для этого наркотизированной крысе-реципиенту непосредственно перед процедурой имплантации вводили цефазолин натрия 0,5 г/кг и метилпреднизолон 30 мг/кг. Техника доступа и мобилизации органов брюшной полости не имела отличий от описанной выше. После визуализации левой почки реципиента производилась ее мобилизация. В области ворот почки накладывался сосудистый зажим Сатинского. Трансплантат укладывался в область почечного ложа. На сосуды реципиента устанавливались сосудистые клипсы. Артерия реципиента поперечно надрезалась на середине расстояния от клипсы до ворот почки, в полученный надрез вставлялась фиксированная на артерии трансплантата манжета. Далее она закреплялась в сосуде при помощи узла. Для имплантации почечной вены донора с манжетой использовалась аналогичная техника. Далее выполнялась катетеризация культи мочеточника реципиента стентом с фиксированным мочеточником донора. Собственная почка реципиента удалялась. После восстановления перфузии донорской почки операционная рана послойно ушивалась. Выведение животных из эксперимента осуществлялось на 4 день после оперативного вмешательства с забором почки для гистологического анализа. Гистологическое исследование почки выполнялось с использованием красителя гематоксилин-эозин. Ключевым параметром оценки был процент зоны некроза на поперечном срезе. Результаты представляли в виде медианы, 25-го и 75-го процентилей (Me [Q1; Q3]). Статистический анализ был выполнен с помощью Statistica v10.0 (StatSoft, Талса, США). Учитывая небольшие размеры выборки и ненормальное распределение, различия между группами были проанализированы с использованием непараметрического U-критерия Манна – Уитни. Различия считали значимыми при р < 0,05.

В результате проведенных экспериментов было выявлено, что зона некроза в группе применения Custodiol составила 12 [6; 21]%, в группе применения разработанного раствора 11,5 [6,0; 16,5]% (фиг 2). Значимых различий между исследованными группами выявлено не было (p = 0,86). Таким образом, применение нового консервирующего раствора показало схожую эффективность с основным раствором, применяемым сейчас для консервации почек.

Пример 4

Исследование стабильности полученных растворов

Стабильность раствора оценивали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Условия хроматографирования были аналогичны, представленным в работе [Eid S.M., Farag M.A., Bawazeer S. ACS Omega 2022, 7, 35, 31106–31114 https://doi.org/10.1021/acsomega.2c03228]: колонка Luna C18 Phenomenex (5µm, 100Å, 150×4.6 mm), элюент NaH2PO4 10 mM в смеси с ацетонитрилом (сорт 0) в соотношении 50/50 % (v/v), скорость потока 1 мл/мин, длина волны UV-детектора 225 нм. Время удерживания (retention time) целевого пика – L-гистидина составило 3.9±0.1 мин. Для валидации методики строили калибровочную кривую по стандартам следующих концентраций (80 ммоль/л, 160 ммоль/л, 320 ммоль/л). По результатам проведенных анализов можно сделать вывод о стабильности раствора при соответствующем хранении при температуре 4°С:

исходные и конечные площади пиков совпадали и соответствовали стандарту с концентрацией 160 ммоль/л. При постоянном инкубировании при температуре 50°С в течение недели определяемая концентрация целевого вещества составляла порядка 70 ммоль/л.

Изобретение относится к средствам сохранения изолированных органов и тканей. Водный раствор для консервации органа или ткани имеет следующий состав, ммоль/л: Na⁺ ионы 110-120, K⁺ ионы 14-16, Mg²⁺ ионы 10-15, Cl^- ионы 126-138,4, SO₄^2- ионы 10-15, Ca²⁺ ионы 1-1,2, L-гистидин 50-180, при этом в качестве воды используют воду для инъекций. Водный раствор для консервации органа или ткани применяют для консервации органов или тканей путем введения раствора в изолированную ткань или изолированный орган и хранения органа или ткани в этом растворе. Раствор применяют для консервации изолированных органов, таких как сердце или почки, предназначенных для трансплантации. Предлагаемый водный раствор для консервации органа или ткани является стабильным при длительном хранении, подходит для стерилизации в автоклаве, что позволяет избежать асептического розлива, обладает выраженным протективным и инфаркт-лимитирующим действием, не вызывает отек тканей, позволяет предотвращать повреждение клеток донорского органа, вызванное ацидозом. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 пр.

1. Водный раствор для консервации органа или ткани, который имеет следующий состав, ммоль/л:

Na⁺ ионы 110-120 K⁺ ионы 14-16 Mg²⁺ ионы 10-15 Cl^- ионы 126-138,4 SO₄^2- ионы 10-15 Ca²⁺ ионы 1-1,2 L-гистидин 50-180,

при этом в качестве воды используют воду для инъекций.

2. Раствор по п. 1, имеющий следующий состав, ммоль/л:

Na⁺ ионы 118 K⁺ ионы 15 Mg²⁺ ионы 12 Cl^- ионы 135 SO₄^2- ионы 12 Ca²⁺ ионы 1 L-гистидин 160

3. Применение раствора по п. 1 или 2 для консервации органов или тканей путем введения раствора в изолированную ткань или изолированный орган и хранения органа или ткани в этом растворе.

4. Применение по п. 3, отличающееся тем, что раствор применяют для консервации изолированных органов, предназначенных для трансплантации.

5. Применение по п. 4, отличающееся тем, что орган или ткань представляют собой сердце или почки.