Способ получения белкового конъюгата "барназа-моноклональное антитело" с молекулярным спейсером-дигидразидом адипиновой кислоты Российский патент 2025 года по МПК C12N9/22 C07K16/28 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается бифункциональных молекул-посредников при создании «модульных» Т-лимфоцитов с универсальным химерным антигенным рецептором (UCAR). При этом в качестве молекул-посредников используются конъюгаты терапевтических моноклональных антител (МКАТ) с белком барназа, а в качестве распознающего домена в составе UCAR Т-лимфоцитов - белок барстар, образующий с барназой прочный молекулярный комплекс.

Терапия с использованием препаратов адоптивной иммунотерапии на основе генетически модифицированных лимфоцитов в лечении онкогематологических заболеваний представляет одно из наиболее активно развивающихся направлений в современной медицине [1]. В последние несколько лет повышается количество исследований в области получения и изучения «модульных» или универсальных CAR, использующих молекулы-посредники, которые одновременно специфичны к домену в составе CAR и при этом способны участвовать в нацеливании на опухоль ассоциированные антигены [2, 3, 4]. Использование молекул-посредников позволяет контролировать нежелательные эффекты, возникающие при терапии с использованием CART-клеток: нейротоксичность, цитокиновый шторм и неконтролируемая скорость лизиса опухоли [5, 6, 7]. Это достигается за счёт подбора количества вводимых молекул-посредников, так как сами CART-лимфоциты неспособны эффективно распознавать целевые антигены на опухолевых клетках. Использование панели конъюгатов к различным опухоль ассоциированным антигенам позволяет быстро реагировать на утрату антигенной специфичности, ведущую к рефрактерности к проводимой терапии [8].

При создании молекул-посредников необходимо не допустить как потерю активности центра связывания МКАТ, так и барстар-связывающей активности, которая может быть связана со стерическими трудностями при взаимодействии с антителом. Для пространственного разделения молекулы барназы от МКАТ предлагается использовать молекулу дигидразид адипиновой кислоты в качестве молекулярного спейсера.

Известен способ иммуноферментного анализа, включающий в себя получение молекул конъюгатов барназа-антитело химическим и генно-инженерным методом. Химический метод подразумевает использование серной кислоты для остановки процесса конъюгирования, что недопустимо при получении препаратов в вводимых человеку в дальнейшем. Генно-инженерный метод подразумевает использование для конъюгирования мини-антител, что ограничивает спектр использования данного метода [9].

Цель изобретения - разработка способа получения бифункциональной белковой молекулы - конъюгата «барназа-моноклональное антитело» с молекулярным спейсером - дигидразидом адипиновой кислоты со специфичностью (способностью взаимодействия) как к B-клеточным антигенам (CD20, SLAMF7), так и белку барстар.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание способа получения молекулы-посредника барназа-МКАТ с использованием дополнительного молекулярного спейсера - дигидразида адипиновой кислоты.

Способ включает в себя присоединение белка барназы к карбогидратному компоненту МКАТ, расположенному на его Fc-фрагменте, через дополнительный молекулярный спейсер - дигидразид адипиновой кислоты. Это обеспечивает увеличение степени подвижности между молекулами МКАТ и барназы относительно друг друга в конъюгате, облегчает стерическую доступность молекулы конъюгата, как к опухоль-ассоциированным антигенам (CD20, SLAMF7), так и к белку барстар в составе UCAR Т-лимфоцитов. Способ обеспечивает получение молекулы-посредника между UCAR Т-лимфоцитами и опухолевыми клетками без повреждения центра связывания антигена МКАТ в результате конъюгирования с барназой.

Способ получения белкового конъюгата «барназа-моноклональное антитело» с молекулярным спейсером - дигидразидом адипиновой кислоты, отличающийся использованием дигидразида адипиновой кислоты в качестве молекулярного спейсера, который позволяет осуществить специфическое взаимодействие между Fc-фрагментом моноклонального антитела и барназой без потери барназой барстар-связывающей активности, необходимой для взаимодействия с UCAR Т-лимфоцитами, и с увеличением подвижности между молекулами антитела и барназы относительно друг друга в конъюгате.

Для этого проводят конъюгирование барназы по сахарной компоненте Fc-фрагмента МКАТ с использованием периодатного метода.

«Пришивка» мономера барназы к окисленному периодатом карбогидратному компоненту МКАТ осуществляется через дополнительный молекулярный спейсер - дигидразид адипиновой кислоты через свободную SH-группу цистеина с использованием бифункционального реагента сульфо- SIAB. Такой подход гарантирует отсутствие повреждения участка, ответственного за специфическую связывающую активность МКАТ, а также полное сохранение барназой барстар-связывающей активности, увеличивает степень подвижности между молекулами антигена и барназы относительно друг друга в конъюгате.

При проведении патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории клеточных технологий ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России.

Способ предусматривает следующую последовательность действий:

Этап 1. Подготовка растворов коммерческих препаратов МКАТ. Для подготовки растворов коммерческих препаратов антител Ритуксимаб или Обинутузумаб с концентрацией 10 мг/мл (20 мг) диализуют 12 часов, против 1 л ацетатного буфера при температуре 4 °С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Затем концентрацию раствора доводят до 7 мг/мл с использованием ацетатного буфера и аликвотируют препарат, отправляя на хранение на минус 70 °С до последующего использования.

Этап 2. Подготовка раствора мономеров барназы. Раствор барназы с концентрацией 10 мг/мл диализуют напротив 1 л ацетатного буфера при температуре 4 °С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течении 12 часов. После этого доводят концентрацию белка до 8 мг/мл боратным буфером и восстанавливают дисульфидную связь димера барназы путём обработки 2 мл раствора дитиотреитола (ДДТ) (50 мг/мл) с образованием мономера за счёт реакции с сульфгидрильной группой, реакционную смесь инкубируют 3 часа при температуре 24 °С, перемешивая. Затем производят диафильтрацию с пятикратной заменой боратного буфера, чтобы удалить избыток ДДТ, микрофильтрацию через стерилизующие микрофильтры с диаметром пор 0,2 мкм, чтобы удалить белковые агрегаты. В завершении подготовки раствора доводят концентрацию белка до 8 мг/мл боратным буфером, аликвотируют и хранят при температуре минус 70 °С до последующего использования.

Этап 3. Периодатная активация карбогидратов антител. Для проведения периодатной активации 0,1 мл водного раствора натрия метапериодата (2 мг) добавляют к раствору 7 мг МКАТ (в 1 мл 100 мМ Na ацетатного буфера, pH 5,5), раствор перемешивают и помещают в холодильник на 4 °С без доступа света на 40 минут. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл этиленгликоля и последующей инкубацией в течении 30 минут при комнатной температуре, после этого раствор диализуют против 0,5 л 100мМ ацетатного буфера (pH 5,5) и 0,5 л дистиллированной воды в течение 12 ч при температуре 4 С° с постоянным перемешиванием на магнитной мешалке для удаления низкомолекулярных реагентов.

Этап 4. «Пришивка» спейсера дигидразида адипиновой кислоты к альдегидным группам активированных антител. Для процесса соединения молекулярного спейсера с активированным МКАТ растворяют 5 мг дигидразида адипиновой кислоты в 0,1 мл дистиллированной воды и добавляют к активированным МКАТ. После этого реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 часов, добавляют 100 мкл свежеприготовленного водного раствора боргидрата натрия (5 мг/мл) и ещё раз инкубируют 30 минут. Затем смесь диализуют против двух смен по 1 л дистиллированной воды и 1 л фосфатного буферного раствора (pH 7.5) при 4 °С в течении ночи и концентрируют до 0,4 мл с помощью центрифужных пробирок для ультрафильтрации с пределом исключения 30 кД.

Этап 5. Модифицированные антитела активируют раствором sulfo-SIAB (2,6 мг/мл). Для этого к 1 мл (4,9 мг/мл) гидразидных антител добавляют 100 мкл (260 мкг) раствора sulfo-SIAB. Реакционную смесь инкубируют 4 часа при комнатной температуре в темноте. Для удаления непрореагировавшего сшивателя (sSIAB) используют обессоливающую колонку, 7 кДа, уравновешенную боратным буфером.

Этап 6. Синтез конъюгата МКАТ-барназа. Раствору активированных sSIAB антител добавляют 5 мг (0,625 мл; 8 мг/мл) мономера 45 белка барназы. Смесь инкубируют 3 часа при комнатной температуре в темноте. Для остановки реакции и нейтрализации оставшихся активных йодацетильных групп вносят 0,5 мг L-цистеина гидрохлорида в 0,1 мл воды и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Далее раствор конъюгата концентрируют на ультрафильтрационной ячейке с пределом исключения мембраны 30 кДа до объёма 0,5 мл для дальнейшей очистки на гельфильтрационной колонке. Для этого колонку хроматографическую для гель-фильтрации уравновешивают фосфатным буферным раствором (PBS), после чего наносят 500 мкл образца и проводят элюцию тем же буфером со скоростью 0,5 мл/мин.

Этап 7. Концентрирование конъюгата. Концентрирование конъюгата МКАТ-барназа проводят методом ультрафильтрации с использованием микроконцентратора с отсечкой по молекулярной массе 30 кДа при 3000 g в течение 5 мин при температуре (4±1)°С. После чего стерилизуют раствора конъюгата фильтрацией одноразовым медицинским шприцем через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм под ламинарным потоком стерильного воздуха в стерильные микропробирки с завинчивающейся крышкой.

Проверка контроля качества осуществлялась при использовании гельпроникающей хроматографии и методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по Лэммли. Хроматограммы препаратов готовых конъюгатов приведены на фигурах 1 и 2, где на фигуре 1 изображена хроматограмма (гель-фильтрация) раствора конъюгата «Обинутузумаб-дигидразид-sSIAB-Барназа», а на фигуре 2 - хроматограмма (гель-фильтрация) раствора конъюгата «Ритуксимаб-дигидразид-sSIAB-Барназа».

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить конъюгат без потери барназой барстар-связывающей активности, без повреждения связывающего участка МКАТ и с увеличенной степенью подвижности между барназой и антителом.

Список литературы:

1. Sadelain M., Brentjens R., Rivière I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. (англ.) // Cancer discovery. - 2013. - Vol. 3, no. 4. - P. 388-398.

2. Ma J. S., Kim J. Y., Kazane S. A., et al. Versatile strategy for controlling the specificity and activity of engineered T cells. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2016. - V. 113, № 4. - P. 450-458.

3. Susann A., Claudia A., Anja F. et al. A novel nanobody-based target module for retargeting of T lymphocytes to EGFR-expressing cancer cells via the modular UniCAR platform // Oncoimmunology. - 2017. - V. 6, № 4. - e1287246 (17 pages).

4. Cho J.H., Collins J.J., Wong W. W. Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses // Cell. - 2018. - №173. - Р. 1426–1438.

5. Davila M.L., Riviere I., Wang X. et al. Efficacy and toxicity management of 19-28z CAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia // Sci Transl Med. - 2014. - № 6 (224). - Р. 224-225.

6. Brentjens R.J., Davila M.L., Riviere I. et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy- refractory acute lymphoblastic leukemia // Sci Transl Med. - 2013. - № 5(177). - Р 177-188.

7. Lee D.W., Kochenderfer J.N., Stetler-Stevenson M. et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial // Lancet. - 2015. - № 385(9967). - Р517-528.

8. Mechanisms of relapse after CD19 CAR T-Cell therapy for acute lymphoblastic leukemia and its prevention and treatment strategies / X. Xu, Q. Sun, X. Liang, Z. Chen, X. Zhang, X. Zhou, M. Li, H. Tu, Y. Liu, S. Tu, Y. Li // Front. in Immunol. - 2019. - Vol.10. - Article 2664.

9. Способ Иммуноферментного Определения Антигенов: патент №2303783 Российская Федерация :МПК G01N 33/535 / Борис Борисович Дзантиев; Дмитрий Николаевич Ермоленко; Александр Евгеньевич Урусов; заявитель Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук; заявлен 21.11.2005; опубликован 27.07.2007.

Изобретение относится к области химии и биотехнологии, а именно к способу получения белкового конъюгата "барназа-моноклональное антитело" с молекулярным спейсером - дигидразидом адипиновой кислоты, включающему подготовку растворов препаратов моноклональных антител Ритуксимаб и Обинутузумаб, подготовку раствора мономера барназы, периодатную активацию карбогидратов антител, соединение молекулярного спейсера дигидразида адипиновой кислоты с активированными антителами, активацию модифицированных антител раствором sulfo-SIAB, синтез и концентрирование конъюгата "барназа-моноклональное антитело". Технический результат заключается в получении конъюгата с использованием дополнительного молекулярного спейсера - дигидразида адипиновой кислоты. 2 ил., 1 пр.

Способ получения белкового конъюгата "барназа-моноклональное антитело" (МКАТ-барназа) с молекулярным спейсером - дигидразидом адипиновой кислоты, включающий

подготовку растворов препаратов моноклональных антител, при которой моноклональные антитела Ритуксимаб и Обинутузумаб с концентрацией 10 мг/мл диализуют 12 часов против 1 л ацетатного буфера при температуре 4°С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке, затем концентрацию полученного раствора доводят до 7 мг/мл с использованием ацетатного буфера и аликвотируют раствор, отправляя на хранение на минус 70°С до последующего использования,

подготовку раствора мономера барназы, при которой раствор барназы с концентрацией 10 мг/мл диализуют напротив 1 л ацетатного буфера при температуре 4°С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 12 часов, после чего доводят концентрацию белка до 8 мг/мл боратным буфером и восстанавливают дисульфидную связь димера барназы путем обработки 2 мл раствора дитиотреитола 50 мг/мл с образованием мономера за счёт реакции с сульфгидрильной группой, реакционную смесь инкубируют 3 часа при температуре 24°С, перемешивая, затем производят диафильтрацию с пятикратной заменой боратного буфера, чтобы удалить избыток дитиотреитола, микрофильтрацию через стерилизующие микрофильтры с диаметром пор 0,2 мкм и доводят концентрацию белка до 8 мг/мл боратным буфером, аликвотируют и хранят при температуре минус 70°С до последующего использования,

периодатную активацию карбогидратов антител, при которой 0,1 мл водного раствора натрия метапериодата добавляют к раствору 7 мг моноклональных антител, полученный раствор перемешивают и помещают в холодильник на 4°С без доступа света на 40 минут, после чего реакцию останавливают добавлением 50 мкл этиленгликоля и последующей инкубацией в течение 30 мин при комнатной температуре, после этого раствор диализуют против 0,5 л 100 мМ ацетатного буфера и 0,5 л дистиллированной воды в течение 12 ч при температуре 4°С с постоянным перемешиванием на магнитной мешалке,

соединение молекулярного спейсера дигидразида адипиновой кислоты с активированными антителами, при котором растворяют 5 мг дигидразида адипиновой кислоты в 0,1 мл дистиллированной воды и добавляют к активированным моноклональным антителам, после этого реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 часов, добавляют 100 мкл свежеприготовленного водного раствора боргидрата натрия в расчете 5 мг/мл и еще раз инкубируют 30 минут, затем смесь диализуют против двух смен по 1 л дистиллированной воды и 1 л фосфатного буферного раствора с pH 7,5 при 4°С в течение ночи и концентрируют до 0,4 мл с помощью центрифужных пробирок для ультрафильтрации с пределом исключения 30 кДа,

активацию модифицированных антител раствором sulfo-SIAB (sSIAB) 2,6 мг/мл, для чего к 1 мл при 4,9 мг/мл гидразидных антител добавляют 100 мкл раствора sulfo-SIAB, затем реакционную смесь инкубируют 4 часа при комнатной температуре в темноте, при этом для удаления непрореагировавшего сшивателя sSIAB используют обессоливающую колонку 7 кДа, уравновешенную боратным буфером,

синтез конъюгата МКАТ-барназа, при котором к раствору активированных sSIAB антител добавляют 5 мг мономера белка барназы, полученную смесь инкубируют 3 часа при комнатной температуре в темноте, вносят 0,5 мг L-цистеина гидрохлорида в 0,1 мл воды и инкубируют 30 минут при комнатной температуре, далее раствор конъюгата концентрируют на ультрафильтрационной ячейке с пределом исключения мембраны 30 кДа до объема 0,5 мл, и колонку хроматографическую для гель-фильтрации уравновешивают фосфатным буферным раствором PBS, после чего наносят 500 мкл образца и проводят элюцию тем же буфером со скоростью 0,5 мл/мин,

концентрирование конъюгата "барназа-моноклональное антитело" проводят методом ультрафильтрации с использованием микроконцентратора с отсечкой по молекулярной массе 30 кДа при 3000 g в течение 5 мин при температуре 4°С, после чего стерилизуют раствор конъюгата фильтрацией одноразовым медицинским шприцем через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм под ламинарным потоком стерильного воздуха в стерильные микропробирки с завинчивающейся крышкой.