СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ТКАНЕЙ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК C12P19/34 C07H21/04 C07H1/08 

Область техники, к которой относится изобретение

Медицина, фармацевтическая и пищевая промышленность.

Уровень техники

Известны способы получения препаратов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из различного сырья, (патент RU 2108797, МПК A61K 35/60, С07Н 21/04, опубл. 20.04.1998; патент RU 2072855, МПК A61K 35/60, С07Н 21/04, опубл. 10.02.1997; патент RU 2055482, МПК A23J 3/04, A23J 3/00, A23J 3/34, A61K 35/60, опубл. 10.03.199; патент RU 2039564, МПК A61K 35/56, С07Н 21/04, опубл. 20.07.1995; патент RU 2072855, МПК A61K 35/60, С07Н 21/04, опубл. 10.02.1997; патент RU 2488634, МПК С12Р 19/34, С07Н 21/04, опубл. 27.07.2013). В основе всех способов лежит разрушение клеток, обеспечение выхода ДНК в раствор, очистка от балластных веществ, извлечение целевого продукта. В ряде способов используют ультразвук для получения низкомолекулярных фракций ДНК. (патент RU 2663132, МПК С07Н 1/08; С07Н 21/04 опубл. 01.08.2018; патент RU 2039564, МПК A61K 35/56, С07Н 21/04, опубл. 20.07.1995, патент ЕР 2289903, МПК С07Н 1/08, опубл.02.03.2011).

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты (патент RU 2663132, МПК С07Н 1/08, С07Н 21/04 опубл. 01.08.2018), включающий гомогенизацию сырья, автолиз собственными ферментами, дополнительный протеолиз ферментными препаратами, осаждение ДНК полимерными сорбентами и деполимеризацию ультразвуком.

Недостатками данного способа являются:

- длительная инкубация при температурах оптимальных для развития микроорганизмов, что ведет к риску загрязнения препарата пирогенными веществами.

- отсутствие спиртовой обработки, обуславливающее риск контаминации конечного продукта вирусными частицами, что делает невозможным применение полученной субстанции в производстве инъекционных препаратов без дополнительной противовирусной обработки.

- применение ультразвука требует наличия соответствующей дорогостоящей аппаратуры.

Предлагаемым изобретением решается задача снижения трудоемкости и упрощения технологии, при повышении качества и безопасности получаемого продукта

Раскрытие сущности изобретения

Способ получения низкомолекулярной ДНК из животного сырья, включающее молоки рыб, или отходы переработки птицы, крупного рогатого скота или свиней, заключающийся в том, что очищенное от жира и посторонних включений сырье предварительно измельчают на шнековом измельчителе, затем гомогенизируют и замораживают, в таком виде возможно хранение и транспортировка сырья без потери качества. Необходимое количество сырья размораживают, и гомогенизируют в буферном растворе в соотношении 1 к 2,5-3, устанавливая рН оптимальную для применяемого ферментного препарата. Обрабатывают протеолитическим ферментом при нагревании до 55-65°С в течение 2-3 часов. Затем термически деактивируют ферментный препарат при 90-95°С в течение 30-60 минут. Получившуюся смесь разделяют на центрифуге, либо фильтрованием, удаляя осадок и жировые компоненты. Жидкую фазу концентрируют на ультрафильтрационной установке с отсечением 15 кДа. В концентрат добавляют соляную кислоту до концентрации 0,05-0,1М, выдерживают от 5 до 30 минут, контролируя степень деполимеризации хроматографически либо электрофорезом, затем нейтрализуют кислоту добавлением раствора гидроксида натрия, до нейтральных значений рН. В получившийся раствор добавляют хлористый натрий до концентрации 10-11% и выдерживают 1 час, затем добавляют 2,5 объема охлажденного этилового спирта. Выпавший осадок отделяют центрифугированием. Полученный препарат содержит фрагменты ДНК от 350 до 800 п. н. молекулярной массой от 250 до 500 кДа.

Осуществление изобретения

Пример 1

1 кг молок лосося промыли, удаляя посторонние включения, остатки соединительной ткани, измельчили в гомогенизаторе и заморозили до температуры -25°С. Разморозили, и добавили 3 литра 0,2М раствора гидрокарбоната натрия. Нагрели смесь до 65°С и внесли 40 г. Протозима, ферментного препарата на основе щелочной протеазы, получаемого ферментацией штамма микроорганизмов Bacillus licheniformis. Инкубировали смесь при постоянном перемешивании 3 часа. Далее установили температуру 95°С на 30 минут. Затем раствор охладили до комнатной температуры и центрифугировали при 10000g. Осадок и жировую фракцию удалили. Полученный раствор ДНК в объеме 2,7 л сконцентрировали на ультрафильтрационной установке, с мембраной порогом отсечения 15кДа, до 1000 мл и добавили 1,5 литра 0,1М цитратного буфера рН 6. Довели объем раствора в ультрафильтрационной установке до 500 мл. Добавили 5 литров дистиллята и сконцентрировали до 500 мл. Затем добавили 25 мл 2М раствора соляной кислоты. Перемешивали 10 минут и нейтрализовали кислоту добавлением 25 мл 2М раствора гидроксида натрия. К раствору деполимеризованной ДНК добавили 55 г. хлорида натрия и после полного растворения перемешивали 1 час и затем осадили ДНК добавлением 1,35 л охлажденного до -25°С 96% этилового спирта. Осадок ДНК отделили центрифугированием.

Пример 2

1 кг семенников крупного рогатого скота измельчили на шнеково-ножевом измельчителе и заморозили до температуры -25°С. Размороженные до комнатной температуры семенники гомогенизировали в 2,8 л 0,1М цитратного буфера рН 7.

Установили температуру 55 °С и внесли 40 гр Протозима НП, ферментного препарата на основе нейтральной протеазы, получаемого ферментацией штамма микроорганизмов Bacillus subtilis. Инкубировали смесь при постоянном перемешивании 3 часа. Далее установили температуру 95°С на 1 час. Затем раствор охладили до комнатной температуры и центрифугировали при 10000g. Осадок и жировую фракцию удалили. Полученный раствор ДНК в объеме 2,3 л сконцентрировали на ультрафильтрационной установке, с мембраной порогом отсечения 15кДа, до 1000 мл и добавили 5 литров дистиллята. Довели объем раствора в ультрафильтрационной установке до 500 мл. повторно добавили 5 литров дистиллята и сконцентрировали до 500 мл. Затем добавили 20 мл 2М раствора соляной кислоты. Перемешивали 20 минут и нейтрализовали кислоту добавлением 20 мл 2М раствора гидроксида натрия. К раствору деполимеризованной ДНК добавили 55 г. хлорида натрия и после полного растворения перемешивали 1 час, затем осадили ДНК добавлением 1,35 л охлажденного до -25°С 96% этилового спирта. Осадок ДНК отделили центрифугированием.

Пример 3

1 кг селезенки свиньи измельчили и заморозили до температуры -25°С. Разморозили при комнатной температуре и гомогенизировали в 3 л. 0,1М цитратного буфера рН 7. Установили температуру 55°С и внесли 40 г. Протозима НП, ферментного препарата на основе нейтральной протеазы, получаемого ферментацией штамма микроорганизмов Bacillus subtilis. Инкубировали смесь при постоянном перемешивании 2 часа. Далее установили температуру 90°С на 1 час. Затем раствор охладили до комнатной температуры и добавили 400 г кизельгура. Раствор фильтруют, фильрат содержащий ДНК в объеме 2,4 л сконцентрировали на ультрафильтрационной установке, с мембраной порогом отсечения 15кДа, до 1000 мл и добавили 5 литров дистиллированной воды. Довели объем раствора в ультрафильтрационной установке до 500 мл. и повторно добавив 5 литров дистиллята сконцентрировали до 500 мл. Затем добавили 18 мл 2М раствора соляной кислоты. Перемешивали 30 минут и нейтрализовали кислоту добавлением 18 мл 2М раствора гидроксида натрия. К раствору деполимеризованной ДНК добавили 55 г. хлорида натрия и после полного растворения перемешивали 1 час, затем осадили ДНК добавлением 1,35 л охлажденного до -25°С 96% этилового спирта. Осадок ДНК отделили центрифугированием.

Изобретение относится к области химии, фармацевтики и медициы, а именно к способу получения низкомолекулярной ДНК из животного сырья, заключающемуся в том, что измельченное сырье подвергают однократному замораживанию-оттаиванию, гомогенизируют и обрабатывают протеолитическими ферментами с последующим отделением содержащего ДНК раствора, отличающемуся тем, что в раствор добавляют соляную кислоту до конечной концентрации 0,05-0,07М для деполимеризации ДНК, выделение целевого продукта проводят спиртовым осаждением. Технический результат заключается в упрощении технологии получения низкомолекулярной ДНК из животного сырья при повышении качества и безопасности получаемого продукта. 3 пр.

Способ получения низкомолекулярной ДНК из животного сырья, заключающийся в том, что измельченное сырье подвергают однократному замораживанию-оттаиванию, гомогенизируют и обрабатывают протеолитическими ферментами с последующим отделением содержащего ДНК раствора, отличающийся тем, что в раствор добавляют соляную кислоту до конечной концентрации 0,05-0,07М для деполимеризации ДНК, выделение целевого продукта проводят спиртовым осаждением.