Способ диагностики алкогольной миокардиодистрофии Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

1

Изобретение относится к медицине, а именно к нескольким смежным дисциплинам - кардиологии, иммунологии, и может быть применено для диагностики алкогольного поражения сердечной мышцы (алкогольной миокардиодистрофии).

Цель изобретения - повышение точности способа диагностики алкогольной миокардиодистрофии.

Способ осуществляют следующим об- разом.

Сыворотки больных с подозрением на на диагноз алкогольной кардиомиопатии (миокардиодистрофии) прогревают при 56°С 30 мин. После отстаивания добавляют взвесь 50%-ных формалиннзирован- ных эритроцитов для адсорбции в :ко- личестве мл на 1,0 ,мл сыворотки. Смесь встряхивают и оставляют на 18 ч

2

при . Для выявления антител к сердцу, пораженному алкогольной мио- кардиодистрофией, сыворотки больных, предварительно инактивированные и адсорбированные формалинизированными эритроцитами барана, последовательно истощали зритроцитарИым диагностику- мом, содержащим антиген нормального сердца, и эритроцитарным .диагности- кумом, содержащим антиген сердца, пораженного атеросклерозом. Количественное соотношение сьшоротки и диаг- ностикума 1:3, длительность истощения 60 мин, температура истощения 37°С, Полноту истощения сыворотки больного проверяли в РПГА с эритроцитами, сенсибилизированными антигенами здорового сердца и эритроцитами, сенсибилизированными антигенами сердца, пора1

О 00

женного атеросклерозом. Адсорбированные таким образом сыворотки исследуют в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакции торможения пассивной геь агглютинации (РТПГА) с препаратом формашинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных антигенами, выделенныкл из сердца, пораженного

рая переносится в следующую лунку. Таким способом производятся титрование - разведением кратностью, равной двум, и получение ряда разведений испытуемой сьиюротки от 1:2 до 1: :256, последняя лунка служит-контролем опытного диагностикума. Доведенный до рабочего разведения (1 мл

алкогольной миокардиодистрофией. Пре--|о диагностикума и 3 мл стандартно-соле- парат представляет собой 0,6%-ную вой смеси) опытный диагностикум ка- взвеоь танзированных эритроцитов формалинизированных по модифицированному методу Чизмеса в модификации

пельницей с мерной насадкой вносится в каждую лунку. Контрольный диагностикум проверяют с исходным разведепельницей с мерной насадкой вносится в каждую лунку. Контрольный диагностикум проверяют с исходным разведеЛеви и сенсибилизированных соответст-15 нием сыворотки. Осторожным покачиварая переносится в следующую лунку. Таким способом производятся титрование - разведением кратностью, равной двум, и получение ряда разведений испытуемой сьиюротки от 1:2 до 1: :256, последняя лунка служит-контролем опытного диагностикума. Доведенный до рабочего разведения (1 мл

диагностикума и 3 мл стандартно-соле- вой смеси) опытный диагностикум ка-

диагностикума и 3 мл стандартно-соле- вой смеси) опытный диагностикум ка-

пельницей с мерной насадкой вносится в каждую лунку. Контрольный диагностикум проверяют с исходным разведением сыворотки. Осторожным покачива

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в кардиологии. Цель изобретения - повышение точности диагностики алко гольной миркардиодистрофии. Способ диагностики алкогольной миокардиоди™ атрофии заключается в том, что из исследуемой сьшоротки крови путем ад- сорбиии удаляют антитела к здоровому сердцу и сердцу, пораженному атеросклерозом. Затем с помощью реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) определяют антитела к миокарду, пораженному алкогольной миокардиодист- рофией, специфичность которой подт тверждают реакцией торможения пассивной гемагглютинащш (РТПГА), и при уменьшении титров антител в РТПГА по сравнению с РПГА в четыре и более раз результат анализа считают положительным, что позволяет диагностировать алкогольную миокардиодистро- фию. Предлагаемый способ обеспечивает с высокую точность диагностики алко- гольной миокардиодистрофии (89,2%). (Л

вующими антигенньми комплексами, выделенными из сердца (50%-ные формали- низнрованные эритроциты обрабатывают 0,3% раствора танина при 37°С в течение 40 мин. Танизированные бараньи jn эритроциты отмывают дважды стандарт г; ным солевым, раствором (0,9%. NaCl -i- + 0,45 в 1 л) . Сенсибилизация эритроцитов антигенными комплексами проводится при 37 С в..течениег5 жат на самом дне лунки;

- .перех

ные формы, частичная агглютинация широкое колечко, иногда по краю

40 мин. Рекомендуемая доза антигена 20 мкг/мл по белку) позволяет полу-;. чать диагностикумы с наибольшей чув- заметна агглютинация. ствительностБю. После окончания сен- Для подтверждения специфичности сибилизации эритроциты два раза отмы-зо каждого положительного результата вают смесью ССР. Третий раз отмьгоают РПГА применяют РТПГА. смесью ССР с бычьим сывороточным альбумином в соотношении (100 мл ССР - 28 мг БСА). Осадок эритроцитов суспендируют в 10 мл смеси ССР и БСА и добавляют 0,37% -/раствора формалина. Каждая серия препарата содержит

35

К серии двукратных разведений испытуемой сыворотки, аналогичных для РПГА, добавляют 0,025 мл рабоч го разведения антигена (1:10 при н личии 1500 мкг/мл белка по Лоури в исходном антигене). К смеси сыворо ки и антигена через 30 мин инкубаци при -37 С добавляют диагностикум по

опытный и контрольный диагностикумы, приготовленные из одной серии формалинизированных эритроцитов. Контроль-.,, 0,025 мл:. Шкала учета не отличается

45

ньм препарат отличается от опытного тем, что не проходит обработки антигеном.

Выявляемые антитела в титре 1:8 и выше свидетельствуют о наличии у больного поражения миокарда, связанг-с ного с алкогольной интоксикацией.

Техника постановки реакции состоит в разливе раствора для реакдаи (стандартно-солевого раствора) капельницей с мерной на 0,025 мл насадкой во все лунки пластины микро- титратора Такачи. Прокгшенными и остуженными приспособлениями для разбавления исследуемая сьшоротка вно- gg сится в раствор первой лунки. Вращением приспособления для разбавления достигается перемешивание и обеспечивается захват 0.025 мл смеси,

от принятой для РПГА. В качестве об зательного контроля входит постанов ка РПГА и РТПГА с сывороткой больны с заведомо известным диагнозом.

Антиген для постановки РПГА получали -6 -нафтоловым методом. Для выделения антигенов использовали ткань нормального сердца, взятого от трупа человека, погибшего от травмы, а также патологически измененного серд ца, взятого от трупа пациента, страдавшего атеросклерозом, а также от трупа больного, длительное время страдавшего хроническим алкоголизмом с поражением сердца.

Ткань брали не подднее 12 ч после смерти, очищали от жира и кровеносны сосудов, гомогенизировали, проводили экстракв дю /5-нафтолом и этиловым

нием доводят смесь до/гомогенного .состояния в кгикдой лунке и оставляют пластину на неподвижной поверхности.

Учет результатов РПГА проводят через 1), ч по следукщей схеме: + - положительная РПГА, эритроциты .равномерно устилают всю сферу лунки; - - отрицательная РПГА, эритроциты равным (колечком или пуговкой .переходифичностизультата

ные формы, частичная агглютинация широкое колечко, иногда по краю

заметна агглютинация. Для подтверждения специфичности каждого положительного результата РПГА применяют РТПГА.

заметна агглютинация. Для подтверждения специфичности каждого положительного результата РПГА применяют РТПГА.

К серии двукратных разведений испытуемой сыворотки, аналогичных для РПГА, добавляют 0,025 мл рабочего разведения антигена (1:10 при наличии 1500 мкг/мл белка по Лоури в исходном антигене). К смеси сыворотки и антигена через 30 мин инкубации при -37 С добавляют диагностикум по

5

g

0

от принятой для РПГА. В качестве обязательного контроля входит постанов- . ка РПГА и РТПГА с сывороткой больных с заведомо известным диагнозом.

Антиген для постановки РПГА получали -6 -нафтоловым методом. Для выделения антигенов использовали ткань нормального сердца, взятого от трупа человека, погибшего от травмы, а также патологически измененного сердца, взятого от трупа пациента, страдавшего атеросклерозом, а также от трупа больного, длительное время страдавшего хроническим алкоголизмом с поражением сердца.

Ткань брали не подднее 12 ч после смерти, очищали от жира и кровеносных сосудов, гомогенизировали, проводили экстракв дю /5-нафтолом и этиловым

спиртом при в течение 30 мин и центрифугировали при 27000 об/мин. Супернатант многократно осаждали ацетоном и этиловым спиртом. Полученный антиген подвергали дальнейшей очистке методом колоночной гель-хроматографии на сефадексе Ж-200. Антиген, выделенный из пораженного алкоголем сердца, представляет собой ли- пополисахаридопептидньй комплекс без свободного липида, полученный /ь-наф- толовым методом. Содержание белка в нем, .определяемого по Лоури, составляет 450± 38 мкг на 1 мл, В диск- электрофорезе в 7,5% ПААГ он содержит 11 белковых зон. Значение белковых зон следующее: 0, 0,02-, 0,1-, 0,12; 0,-26; 0,44,40,52, 0,7; 0,82; 0,9; 0,99,

Пример. .Больной П,, госпитализирован в кардиологическое отделение областной больницы с диагнозом: ИБС, атеросклеротический кардиосклероз. Врач по косвенным признакам (тремор конечностей, гиперемия лица, гипергидролиз) заподозрил алкогольную миокардиодистрофию. Венозная кровь больного в количестве 10 мл была направлена на иммунологическое исследование. Из крови общепринятым методом готовили сыворотку, которую прогревали при 56°С в течение 30 мин, а затем

адсорбировали 50%-ным формалинизиро- ванными эритроцитами из расчета

сенсибилизированных антигенныьм комплексами, выделенными из ткани сердца, пораженного атеросклерозом. Титр этой реакции оказался равным 1:64, Затем сыворотку адсорбировали антигеном атеросклероза аналогично yкaзaннo y. Сыворотку больного ; проверяли на пол ноту адсорбции. Для этого сыворотку, адсорбированную антигенами, полученными от больного с кардиосклерозом и здорового, погибшего от травмы, исследовали последовательно в РИГА с соответствующими диагностикумами. Если титр в РИГА равен или менее 4, то приступали к следующему этапу исследования. После этого сыворотку исследовали в РИГА с препаратом фор- малинизированных эритроцитов, сен- сибилизированньк антигенами, выделенными из сердца, пораженного алкогольной миокардиодистрофией. Титр РПГА оказался равен 1:t28. Специфичность этой реакции подтверждали в РТПГА с использованием антигена алкогольной миокардиодистрофии. Реакции ставили в двух параллельных рядах полистироловой пластины. Сыворотку титровали в обоих рядах, после чего, в лунки первого ряда добавляли по одной капле цитрата, в лунки второго ряда по одной капле антигена (из расчета 3 мкг по белку в 0,025 мл антигена), Пластину оставляли на 130 мин при ,. а затем в каждую

0,025 мл, 50% бараньих эритроцитов на 35 дунку обоих рядов добавляли .диагностикум алкогольной миокардиодистрофии

Сыворотку с эритг о.

на 1 мл сыворотки

роцитами оставляли на 24 ч при +4 С, .затем эритроциты удаляли центрифугиг рованием. Обработанную сыворотку исследовали в РПГА на наличие антител к антигенам нормального сердца. Для этого использовали препарат фармали- низированных эритроцитов барана, которые сенсибилизировали антигенными субстанциями, вьщеленными из сердца здорового человека, погибшего от травмы. Результат этой реакции оказался положительным. Титр РИГА равнялся 1:32. Затем сыворотку этого больного адсорбировали антигенами нормального сердца. Для этого 3 мл диагностикума нормального сердца ; центрифугировали 5 мин при 6000 об/ /мин, надосадок сливали, а к осадцсу добавляли 1 мл сыворотки больного П. взбалтывали и оставляли в холодильнике на сутки. Затем сыворотку отсасывали и исследовали в РПГА с препаратом формалинизированных эритроцитов.

10

15

640876

сенсибилизированных антигенныьм комплексами, выделенными из ткани сердца, пораженного атеросклерозом. Титр этой реакции оказался равным 1:64, Затем сыворотку адсорбировали антигеном атеросклероза аналогично yкaзaннo y. Сыворотку больного ; проверяли на пол . ноту адсорбции. Для этого сыворотку, адсорбированную антигенами, полученными от больного с кардиосклерозом и здорового, погибшего от травмы, исследовали последовательно в РИГА с соответствующими диагностикумами. Если титр в РИГА равен или менее 4, то приступали к следующему этапу исследования. После этого сыворотку исследовали в РИГА с препаратом фор- малинизированных эритроцитов, сен- сибилизированньк антигенами, выделенными из сердца, пораженного алкогольной миокардиодистрофией. Титр РПГА оказался равен 1:t28. Специфичность этой реакции подтверждали в РТПГА с использованием антигена алкогольной миокардиодистрофии. Реакции ставили в двух параллельных рядах полистироловой пластины. Сыворотку титровали в обоих рядах, после чего, в лунки первого ряда добавляли по одной капле цитрата, в лунки второго ряда по одной капле антигена (из расчета 3 мкг по белку в 0,025 мл антигена), Пластину оставляли на 130 мин при ,. а затем в каждую

20

25

30

дунку обоих рядов добавляли .диагнос

тикум алкогольной миокардиодистрофии.

Учет реакции вели через 3 ч. Титр в РПГА оказался равен 1:128, титр в РТПГА 1:32. Уменьшение титра РТПГА по сравнению с титром РПГА более чем в 4 раза считается признаком специфичности. В результате такого исследования сыворотки крови больному П, поставили диагноз алкогольной миокар- диодистрофии.

Предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяющей с выоской степенью достоверности (89,2%) диагностировать у больных поражение сердца алкогольной этиологии.

Формула изобретения

Способ диагностики алкогольной миокардиодистрофии путем исследования организма больного, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, исследуют

7 14640878

сыворотку 1фови путем адсорбции еереакции пассивной гемагглютйкации антигеяами сердечной ткани, получен-и в реакции торможения пассивной ге- ной -от здорового лица и больного агглютинации, сравнивают титры антиатеросклерозом, далее определяют аи-g тел и при наличии различий показате- титела миокарда, полученноголей в 4 и более раз диагностируют от больных миокардиодистро ей валкогольную миокардиодистрофию.