Способ получения вакцины таежного весенне-летнего энцефалитного вируса Советский патент 1983 года по МПК A61K39/12 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ТАЕЖНОГО ВЕСЕННЕ-ЛЕТНЕГО ЭНЦЕФАЛИТНОГО ВИРУСА

1

Изобретение относи гся к произвоц- вакцин.

Известен способ получения вакцины таежного весенне-летнего энцефалитного вируса путем культивирования вируса в культуре ткани или в суспензии эмбриональных клеток птиц с последующим от далением вируссоцержащей жидкости центрифугированием, инактивацией вируса и получением целевого тфодукта

Однако известный способ не обеспечивает высокой чистоты целевого прюдукта.

Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения вакцины таежного весенне-летнего энце- фалитного вируса путем культивирования вируса в культуре ткани или в суспензии (эмбриональных клеток птиц, с последуют i шим отделением вируссоцержашей жидкое- i ти центрифугированием, инактивацией вируса и получением целевого продукта

вируссодержащую жидкость HHaKTHEHv формалином или бета-пропиолактоном, затем обрабатывают протаминсульфатсхл, очистку осуществляют при непрерывном

5 центрифугировании с градиентом, плотности сахарозы от О до 5О%, отбирают фракции, имекщие поылиенную экстинкцию при 26О нм и соцеркашие частицы с константой седиментации в области .

10 2OOS и полученные фракции развоаят буферным раствором, преимущественно (фосфатным буферным раствором рН 7,6.

Кроме того, с целью стабилизации целевого продукта фракции развоаяг

15 буферным раствором, содержащим О,1% человеческого альбумина. Способ осуществляют спецующим образом.

20 Эмбриональные клетки кур суспенаи(руют в среде культуры клеток ТСМ 199 (Tissue CuCiure eй1uw 199), инфицируют вирусом и держат в суспензии при аэробных условиях при температуре в пре делах 25-38 0 в течение 1-5 аией. Затем клегки и осгагки клеток отаепяют путем центрифугирования. Полученную суспензию вируса инакгивируют с поМошью формалина или |) -пропиолактона и послёэтого концентрируют путем ультра фильтрации. Стации инактивации и концен трирования можно также проводить в обратной последовательности. Суспензия наряду с ТВЛЭ-вирусом содержит различные примеси, которые седиментируют частично быстрее или медленнее чем ТВЛЭ-вирус. Предпочтительно огцеляют быстрее сецимёнтирующие части путем осаждения с помощью протаминсульфата, прежде чем осуществляют собственный непрерывный сгособ ультрацентрифугирова ния с распределением градиентов плотное ти. Способ, в частности, осуществляют таким образом, что в роторе ультрацентр фуги, наполненном раствором буфера, целесообразно раствором фосфатного буфера, при 3000 оборотов в минуту полови на буферного раствора вытесняется 50 йым раствором сахарозы, и образуется благодаря этому градиент плотности О-5О% сахарозы. После этого суспензии, содержащей вирус, дают стечь через рогор при скорости вращения ротора 35ООО оборотов в минуту со скоростью истечения предпочтительно 3 л/ч. При выбранных условиях большая часть вирусных частиц вхоаит в градиенты плотности. Как только весь материал прощел аппарат цен трифуги тют еще один час, причем одновременно дают протекать раствору фосфатного буфера. Затем осторожно про водят ротор в состояние Покоя и содержимое его разделяют на отдельнью фракции. После этого в каждой фракции опре- деляюг экстинкпню при ам и одновременно )гстаяавлнвают содержание са- харозы во фракции. Локализация вируса в ;грааиенгах плотности делается возмож ной благодаря его экстннкпйн при 26Онм Вирус связывается в области при соцержании сахарозы примерво 4О% и ливает здесь отчетливое увеличение эко тявкцни при 260 нм. Йа чертеже прецставленв диаграмма этой зависимости,от1огда ввдиа экстинжпи отдёльньЬсфракпкй по отношению к грв-« . диентам плотности. Градиент плотности раствора сахарозы составляет 0-50%. Штрихпунктяраая ривая показывает распределение ахстинкции при 2 6О нм в oiW дельных фракциях. В области около 4О% сахарозы фракции 10, 11 & 12 имеют 373а4 повышенную, а фракция 11 максимальную экстинкцию. В этой фракции находятся почти исключительно частицы вируса с константой седиментации 20О S без редиментируюших заметно быстрее или медленнее чем вирус примесей. Пик соответствует концентрации сахарозы 39%. Другой пик у фракции номер 25, соот ветствуюший концентрации сахарозы менее чем 1О%, указывает на наличие примесей которые отсасываются. На диаграмме наглядно показано относительное протектнвное действие (определенное в прямом опыте зашиты ) отдельных фракций с помощью различной высоты колонн. Фракция 11, следовательно, имеет . самое высокое относительное защитное действие.. Собраннью содержащие вирус фракции теперь предпочтительно разбавляют буфером, содержащим человеческий альбумин для того, чтобы улучщить стабильность вирус-антигена, и затем обычным спосо . бом перерабатьюают далее в вакцины. Полученные вакцины имеют более высокую чистоту и лучше переносятся человеком, чем препараты, изготовленные обыч-. ным способом. в таблице приведены сравнительные результаты переносимости препаратов, полученных известным и предложенным способами, причем в первой графе приведены реакции с вакцинами, изготовленными известным способом, а во вторсА графе - реакции с вакцинами, полученными предложенным способом. В случав прививок с помощью полученных согласно изобретению вакцин не метля наблюдаться никакие нежелательные реакции - ни локальные, ни системные, ные реакции ни локальные, ни системные. Полученные согласно преаложенному способу вакцины отличаются незначнтель«ым содержанием протеина, не принимая ВО внимание добавленный человеческий альбумин. Это содержание протеина при равном антигеняом действии во много раз (по меньшей мере в 10) меньше, чем в случае до сих пор применяемых препаратов. Пример.. Суспензию эмбри)наль« ных клеток кур в ТОМ 199 (TDSSUEкультура-среда) инфиоируют ТВЛЭ-вирусом. После выдержки в течение 4 сут при содержащую вирус сустюнзию собирают и центрвф;ггирова анем при ЗОООт в теченне 1б мин при 4ГС отделяют клетки. 10 к полученной суспензии вируса прибаЕШЯЮТ формалин в гаком количестве, чтобы конечное раз вление составляло 1:200О, и затем суспензию выдерживаю в течение 30 мин при 37 С и 48 ч при комнатной температуре. . Затем инактивирдаанную суспензию вируса смешивают с0,5 мг/л протаминсульфата и смесь выдерживают в течение ночи при С, Образовавшийся осадок отделяют посредством центрифугирования при ЮОООГ в течение 30 мин при 4 С. Преаварительно обработанная указанном способом суспензия представляет собой /исходный материал для непрерывного ультрацентрифугирования в градиенте плотности. Суспензию вируса со скоростью потока 3 л/ч пропускают с помошью насоса через центрифугу, в которой в качестве сахаррзного градиента плотности соце| жится 0-5О% сахарозы в фосфатном буферном солевом растворе при рН 7,6. Объем составляет 4,5 л, время ценГрифугирования 1,5 ч. После остановки центрифуги содержимое ротора выкачивают и при этом разделяют на 16 фракций по 100 мл. Для каждой отдельной фракции определяют экстинкаию при 26О нм па спектрофотометре н уцеяьную плотность на рефрактометре. При этом наблюдает384я распределение, показанное на диаграмме. Пиковые фракции 10,11 и 12 с концентрацией сахара около 40% объединяют и разбавляют до 1:10 фосфатным буферным солевым раствором при значении рН 7,6, в котором содержится 0,1% человеческого альбумина. Защитную ахти ность полученного предложенным способом препарата определяют в прямом защитном опыте на мышах. Подвергаемый исследованию преп&рпт разбавляют (1:3;1:97 1:27,- 1:81; 1:243) и смешивают с 0,2% гидроокиси алюминия примененной в качестве средства, усил ваюшего препарата. При примевении в каждом случае 0,2 мл указанных разбавленных растворов 2 раза с промежутком в 1 неделю подкожно иммунизируют по 1О мышей (весом примерно по 10 г). Через две последующие нецали . мышей инфицируют 1ОО-1000 ТВЛЭ-БИрусом и рассчитывают защитную доауиГуо по методу Рида и Мюнха после наблюдения в течение 3 недель. При этом защитную дозу Ь1) определяют при разбавлении 1:30. Предложенный способ позв6л51ет повысить чистоту и стабильность вакцины таежного весенне-летнего энцeфaлитнo o . вируса.

Локальная

До 72 боль, %

До 64

ПоБьшденная

температура

тепа {объем).%..

37,

38-39 С

Вьш1е

36

25

19 14 4

1