Способ получения вакцины против клещевого энцефелита Советский патент 1980 года по МПК C12K5/00 

Изобретение относится к микробиологической прсяиышленности и касается получения противовирусной вакцины.

Известен способ получения вакцины против клещевого энцефалита путем выращивания вируса-возбудителя в монослое культуры эмбрйонсш кур с последующей инактивацией вируса формалином и его осветления малоскоростным центрифугированием вирусосодержащего материала 1.

Однако известный способ не обеспечивает высокой иммунологической активности, чистоты и стабильности вакцины.

Целью изобретения является повышение иммунологической активности, чистоты и стабильности вакцины.

Эта цель достигается тем, что выращивание вируса проводят в объеме питательной среды 0,15-0,20 мл/см поверхности монослоя, содержащей (в вес. %) :

0,64-0,68

Натрий хлористый 0,035-0,045

Калий хлористый

Натрий фосфорнокислый двузамещен0,167-0,171

ный двуводный

Калий фосфорнокислый однозамещен0,0073-0,0077 ный

Магний сернокис0,008-0,012 лый С&ЛИВСЩНЪ1Й

0,08-0,12

Глюкоза 0,0018-0,0022

Феноловый красный

Натрий кислый

0,045-0,055

0

углекислый

После инактивации вируса его выделяют в процессе равновесного зонального ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы от 8 до 60 вес.% с добавлением стабили5заторов, отбирают фракции от 33 до 47% сахарозы,затем их объединяют и разводят.до 1:10-1:30 исходного объема.

Способ осуществляют следующим

0 образсад.

Во взвесь клетсж, трипсинизированнызс 9-10 дневных эмбрионов кур, вносят в виде суспензии мозга зараженных белых мышей вирус клещевого

5 энцефалита штамм Софьин или любой другой, подходящий для изготовления вакцины.

Инфицированную клеточную взвесь разводят до концентрации 3 млн/мл

0 питательной средой, состоящей из О, 5% гидролиэата лактальбумина и 3% сыворотки крупного рогатого скот в солевомрастворе Хенкса и высеозаю в 1-5-литровые круглые стеклянные бутыли, которые затем инкубируют пр температуре 37°С в роллерной устано ке при скорости вращения 10-12 об/м Через 20 ч,когда образуется плотный клеточный монослой, питательную сре ду удаляют/ культуру ткани промывают буферным солевым раствором следующего состава (вес.%) : NaCC 0,66; КСЕ 0,04; Na2HPO4-2Н2О 0,169;. КН2Р04 0,0075; MgSO4VHaO a,0l; глюкоза 0,1; феноловый красный 0,00 NaHCOj 0,05; рН 7,7-7,8. Затем в бутыли заливают подцерживаюшую питательную среду в количестве 0,15-0,2 мл на 1 см поверхности клеточного монослоя. Среда состоит из аминокислот и витаминов соответственно рецептуре среды 199 Паркера, человеческого альбумин в концентрации 0,1% и солей соответ ственно составу указанного буферног солевого раствора, рН среды 1,1-1,В Через 40-48 ч инкубации при 37°С в роллерной установке в бутыли вносят стеклянные бусы, встряхивают до полного разрушения клеточного монослоя и затем переносят содержимое , в подходящие емкости. При хорошем качестве культуры ткани производят двойной сбор в-ирусосодержащего материала: через 20-24 и 40-48 ч. В этом случае -производят полную замен поддерживающей питательной среды после первого сбора, клеточный моно слой разрушают при втором сборе. К собранному материалу прибавляю формалин в концентрации 0,05%, смесь инкубируют для инактивации ин фекционности при 32°С в течение 72 После этого материал подвергают предварительной очистке методом про точного центрифугирования при 600010000 д, а затем концентрируют и освобождают от белковых и других примесей на проточной ультрацентрифуге методом равновесного зональног ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы 8-60 вес.%, фактор разделения 90000 д. .Растворы сахарозы готовят на буфере следующего состава: М (моль) NaC6 0,1; NaiHP-O -KHjPO. 0,01; версен 0,001. К этому раствору для стабилизации вирусных антигенов прибавляют формалин 0,05% и человеческий альбумин 0,1%: После того как весь материал про пущен через ротор ультрацентрифуги, вращение ее поддерживают в тал же скоростном режиме еще 1 ч, затем вращение замедляют или прекращают полностью и фракционно извлекают содержимое ротора. После рефрактометрического определения концентрации сахарозы в полученных фракциях отбирают те, которые содержат от 33 до 47.вес.% сахарозы. Эти фракции объединяют и разводят средой 199 Паркера таким образом, чтобы конечный объем составил 1:10-1:30 от объема всего использованного для ультрацентрифугирования вирусосодержащего материала, прибавляют,%: желатин 1,0; амино-пептид АП-5 5,0; формалин 0,05 и мертиолат 0,01, разливают во флаконы или ампулы, замораживают при температуре ниже точки эвтектики и подвергают лиофильному высушиванию. Полученный препарат является готовой формой вакцины клешевого энцефалита культуральной, очищенной, концентрированнойf убитой, сухой для профилактики заболевания людей. Вакцину хранят и транспортируют в этой форме и непосредственно перед употреблением растворяют специальным растворителем, содержащим в дистиллированной воде 1-2 мг/мл гидроокиси алюминия. Вакцину вводят под кожу в объеме 0,5-1,0 мл. Предлагаемый способ обеспечивает получение вакцины повышенной иммуногенности, очищенной от белковых и других примесей, стабильной в процессе хранения и транспортировки. Формула изобретения Способ получения вакцины против клещевого энцефалита путем выращивания вируса-возбудителя в монослое культуры эмбрионов кур с последующей инактивацией вируса формалином и его осветления центрифугированием вирус ос од ержащего материала, о т л ичаюшийся jreM, что, с целью повышения иммунологической актив-, ности, чистоты и стабильности вакцины, выращивание вируса проводят в объеме питательной среды 0,15- 0,20 мл/см поверхности монослоя, содержащей (в вес.%) : 0,64-0,68 Натрий хлористый 0,035-0,045 Калий хлористый Натрий фосфорнокислый двузаме0,167-0,171 щенный двуводный Калий фосфорнокислый одноза0,0073-0,0077 мещенный Магний сернокис0,008-0,012 лый семивсдный 0,08-0,12 Глюкоза Феноловый крас0,0018-0,0022 ный . Натрий кислый 0,045-0,055 углекислый после инактивации вируса его выде 660389

ляют в процессе равновесного зональи разводят до 1:10-1:30 исходного

ного ультрацентрифугирования в гра-объема.

диенте плотности сахарозы от 8 доИсточники информации,

60 вес.% с добавлением стабилиза-принятые во внимание при экспертизе

торов, отбирают фракции от 33 до1. Авторское свидетельство СССР

47% сахарозы, затем их объединяют5 167967, С 12 К 5/00, 1964.