Способ определения изоферментной активности гликогенфосфорилазы Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

00

о

О1 СП

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при биохимических исследованиях.

Известен способ разделения изоферментов гликогенфосфорилазы методом диск-электрофореза в геле полиакриламида, согласно которому образец гомогената наносят на поверхность полиакриламидного геля, заполняющего вертикально расположенную стеклянную трубку. Трубку помещают в электрофоретическую камеру и проводят электрофорез при напряжении 110-120 В силе -6-8 мА в течение двух часов. Затем полиакриламидный гель выдавливаю из трубки и помещают в кювету для окрашивания. Для выявления изоферментов реакцию ведут в сторону синтеза гликогена из глюкозо- -фосфата , с последующей окраской полисахарида раствором Люголя. После окрашивания на прозрачном фоне геля видны коричневого цвета фракции, которые оценивают в проходящем свете. Благодаря хорошей разрешающей способности геля четко выявляется спект изоферментов гликогенфосфорилазы Clj

Недостатком способа является длительность его осуществления (время проведения исследования составляет 24 ч и складывается из времени, затрачиваемого на полимеризацию геля, электрофореза и проведение биохимической реакции, ведущей к образованию необходимого количества гликоген продолжающейся 17 и более часов Изза этого ограничены возможности применения данного способа в медицине например, для диагностики инфаркта миокарда, и в эксперименте. Кроме того, осуществление способа ведет к значительным затратам реактивов, так как приходится инкубировать большое количество полиакриламидного геля и использовать значительное количество инкубационной смеси для его погружения и пропитки.

Цель изобретения - сокращение вре мени определения изоферментной активности.

Поставленная цель до.стигается тем, что согласно способу определения изоферментной активности гликогенфосфорилазы путем электрофорети.ческого разделения пробы на поддерживающей среде с проявлением в буфере и определением активности изоферментов спектррфотометрически,раэделение ведут в трис-веронал-мединаловом буфере на ацетатцеллюлозной пленке , а в качестве проявляющего буфера используют фосфатный буфер, содержащий 292,0-292,5 - гликогена, 18-20 10 аденин-5-фосфата натрия, 64-67 - клюко-1,6-дифосфата, 31 33 , сульфата магнезии, 80 90 ед/л глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 40-50 ед./л фосфоглюкомутазы, 6,4-6,6 10 никотинамиддинуклео: ид

фосфата (НАДФ) натрия и 31-33- этилендиаминтетрауксусной кислоты.

Образовавшийся в результате реакции никотинадениндинуклеотид проявляют в ультрафиолетовом свете.

Способ осуществляют следующим образом.

Образец гомогената наносят на ацетатцеллюлозную-пленку, которую затем помещают в электрофоретичёскую камеру. Электрофорез проводят при напряжении 340-360 В и силе тока 9 11 мА в течение 10-12 мин. По окончании электрофореза пленку извлекают и накладывают на другую пленку, пропитанную инкубирующим раствором, содержащим набор ферментов, НАДФ и гликоген, необходимые для проведения реакции. Пленки инкубируют при 37°С в течение 20-25 мин. Указанное время инкубации является оптимальным так как уменьшение времени инкубации приводит к недостаточной наработке НАДН, а увеличение не улучшает результаты. Затем пленку высушивают при той же температуре в течение 5 10 мин. Выявление фракций проводят при ультрафиолетовом освещении.

Пример 1. Ацетатцеллюлозную пленку для электрофореза Владимирского завода синтетических смол замачивают на 20-30 мин в буфере, состоящем из 1,34 г веронала, 10,3 г мединала и 5,06 г триса. Для приготовления буфера ингредиенты растворяют в дистиллированной воде при нагревании до в водяной бане и после охлаждения до доводят до объема 1л, рН раствора 8,8, ионная сила О,.075. Буфер и.спользуют в качестве электродного. После 25 мин выдержки, когда .пленки достаточно намокнут, на них наносят раствор исследуемого гомогената сердечной мышцы. Нанесение проводят пастеровской пипеткой с сильно оттянутым носиком. Количество наносимого гомогената около 10 мкл. Затем помещают в электрофоретичёскую камеру, располагая ее таким образом, чтобы сторона, на которую нанесены образцы, была обращена вниз. Электрофорез проводят при напряжении 350 В и силе тока 10 мА в течение 10 мин. До начала электрофореза на другую аналогично вымоченную в буфере пленку наносят инкубирующую смесь, которая состоит из растворов 1, 2, 3 и 4 в соотношении Л:1:0,1:1 соответственно.

Раствор 1 (моль) Гликоген Аденозин-5-монофосфат Nart Глюкозо-1,6-дифосфат

Этилендиаминаминотетрауксусная кислота (ЭДТА)

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОфЕРМЕНТНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗЫ путем электрофоретического разделения пробы на поддерживающей среде с проявлением в буфере и опре делением активности изоферментов спектрофотометрически, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения изоферментной активности, разделение ведут в трйс-веронал-мединаловом -буфере на ацетатцеллюлозной пленке, а в качестве проявляющего буфера используют фосфатный буфер, содержащий . 292,0 - 292,5 - 1(Г гликогена, 18 20-10 % адемин-5-фосфата натрия, 64-67 глюко-1,б-дифосфата, 31-33 сульфата магнезии, 80 90 ед./л глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. 40-50.ед/л фосфоглюкомутйзы, 6,4-6,6 10 М никотинамиддинуклеоi тидфосфата натрия и 31-33 1(ГМ этилендиаминтетрауксусной 1 ислЬ(Л ты.