Способ определения изоферментов креатинфосфокиназы в тканях Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОФЕРМЕНТОВ КРЕАТИНФОСФОКИНАЗЫ В ТКАНЯХ

Изобретение относится к биохимии, в частности к определению изоферментов креатинфосфокиназы в тканях, предпочтительно в сердце и мозге. Известен способ определения изоферментов креатинфосфокиназы в тканях путем экстракции креатинфосфокиназы на образца с последующим электрофоретическим разделением экстракта, Щ)и этом экстракт наносят на ацетатцеллюлозный носитель. Этот способ предусматривает 1шсьццение ацетнлцеляюлозного носителя электродныц трис-ввронаповым буфером (рН 8,8) с добавлением тиолредуцирующего агента, нанесение на носитель образца исследуемой ткани, проведение эле трофореза, -идентификацию среды гл1щилГЛ1ЩИНОВОГО буфера (рН 7,2), креатинфо фата, АДФ, АМФ, НАДФ, гексокиназы, глюкоао-6-фрсфатдегидрогеназы, фенозинмр-тасульфата, нктросинего тетразолия, ионов магния с последующим денситометрирова}шем. Носитель замачивают в трио-ввроналовый буфер (рН 8,8) с дoбa0Jшниe f в качества тиолредуцкрующего агента дитиотрейтола. Электрофорез проподят в течение 45 мин при 15° С и градиенте потенциала 250 В/см. Затем электрофорвзHbie ленты располагают на стеклянной пластине и сверху на них накладывают другие ацвтатцеллюлозные ленты, выдержанные предварительно 10 мин в инкубационной смеси (для приготовления инкубационной смеси к 15 мл 0,05 М глицил-глицинового буфера (рН 7,2) тфибавляют 0,11 мМ глюкозы, 0,15 мМ АДФ, 5,2 мМ НАДФ, 33 мМ-креатинфосфата, 10 мл (160 ед. Бюхера) гексокиназы, 1О мл (80 ед. Бюхера) гпюкозо-6фосфатдег4щрогеназьи Далее на каждую пару лент накладывают леиты, вьщержанные 10мин в темноте в индикаторной смеси (для получения индикаторной смеси готовят раствор фазозннметосульфата (1 мг/мл), хранят 1ФИ -Д., затем готЕОВят раствор тетразопия lunporoityuoi-o, 3&S71 для чврэ 27 мг тетразолня нитроголубого и 2 мМ АЦ{ОАс)514%О в 100 мл глицллгпициноЬого буфера (рН 7,2) фильтруют и зфанят при , непосредственно перед опыток 0,4 мл раствора фвйозинметасульфата смешивают с ДО мл ,раствора тетрааолия ixwiy6oro) и инкубируют 1ч при 37° С. Окрашенные пятна денситоме-грируют С I. Недостатком известного способа явйя- to

ется малодоступность носителя, а также дитиотрейтола, используемого в качестве тиолредуиирующего агента. Кроме того, известный способ длителен, так как продолжительность анализа 3 ч, в частности много времени занимает ицентификация вследствие того, что Инкубацию проводят двалоды (по 1 ч каждый раз).

Кроме того, известный способ имеет недостаточную разрешающую ппособность, так как в исследуемых образцах он позволяет обнаруясить только 3 изофер мента КК.

Целые изобретения является ускоре1ше способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения изофер ментов креатинфосфокиназы в тканях путем экстракции креатинфосфокиназы иэ образца с последующим электрофоретическим разделением экстракта, при этом экстракт наносят на ацетатцеллюлозный -носитель, предварительно насыщенный буфером с добавлением тиолредуцирующего агента, полученную электрофорох-рамму инкубируют в среде, содержащей глицил-глициновый буфер с , креатинфосфат, АДФ, АМФ, НАДФ, гексокиназу, глюкозу, глюкозо-6-фосфатдигидрогеназу, фенозинметасульфат, нитросиний течраэолий, хлОг. ркстый. магний с последующей денситометрией окршиенных участков форограммы в качестве носителя используют пленку Впапипар, в качестве тколредуцирующего агента - гаю атион, инкубируют в течение 6-14 мин, а компоненты инкуБащюнной среды взяты в следующих количествах:

Креатинфосфат, мМ11,0-33,0

АДФ, мМ, , 1,1-1,5

АМФ, мМ 11,0-13,о

НХДФ, мМ0,37-0,82

Глюкоза, мМ7,0-20,0

Гексокиназа, ME5-7

Глюк 030-6-фосфатдегидрогеназа, ME5-7

Ф еноз1шметасульфат, мМ0,65-0,98

ровальной бумагой. Полоски помещают в камеру для электрофореза, натягивают их и включают иалрхкенле на 10 мин. Затем ток выключают и наносят образцы

5 исследуемой ткани. Проводят электрофо- ретическое разделение в режиме, опреде-г ляемом видом исследуемой ткани.

Для проведения креатинфосфокиназной реакции, используемой для идентификации

20 изоферментов,. полоски ацётатцеллюлозы предварительно пропитывают 10 мин инкубационной смесью следующего состава: глицил-глициновый буфер 1О мл (рН 7,2); Креатинфосфат 40 мг; АДФ 6 мг; АМФ

25 50 мг; НАДФ 3 мг; гексокииоза 0,2 мг; глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа 10 ед.; фенозинметалсульфат 2 мг; нитросиний тетразолий 3 мг; Mq;CC( мг.

Затем полоски плотно накладывают на

30 полоски с образцами тканей, вынутые из

камеры для электрофореза. Такие двойные - полоски инкубируют в термостате при , 37° С 10 мин. Проявленные полоски осветляют вазелиновым маслом и деситоJJ метрируют.

Предложенным способом проведено 25 опытов с электрофоретическим рааделением изоферментов крёантШ1фосфокиназы в тканях сердца и мозга. Во всех случаях

д предлагаемый способ позволил получить 4 фракции .из сердца - ММ, MB, ВВ и митохондриальную фракцию и 2 фракции из ткани мозга - ВВ и митоховдриальиую.

Пример 1. Применение предлагаемого способа для разделения изоферментов креатинфосфокиназы в сердечной мышо

це.

Полоски ацетатцеллюлозной пленки Владипор № 5 на 1О мин замачивают. в электродный трис-вероналовый буфер, содержащий 10 мл глутатиона. Затем помещают в камеру для электрофореза, натягивают их, включают рабочее напряженке на 10 мин. Ток Выключают и наносят образец ткани - экстракт сердечной мышцы, электрофорез проводят при напряжении 200 В 7О мин. Затем полоски с образцом ткани вынимают из камеры S4 Ндтросиний тетрааопнй, 0,31-0,61 мМ 10,0-31,6 Хлористый магний, мМ Способ .осуществляется следующим образом. Полоски ацетатцеллюлозной пленки Владипор замачивают на Ю-15 мин в электродный трис-вероналовый буфет {рН 8,8), содержащий 10 мл глутатиона. Затем избыток влаги удаляют фильт