Способ определения активности изоферментных фракций адеаминникотинамиддинуклеотидфосфатзависимой изоцитратдегидрогенозы Советский патент 1980 года по МПК A61B10/00 G01N33/16 

-изобретение относится к области медицинской биохимии, а именно определению активности ферментов, , Известен способ определения активности изоферментных фракций ад енинникотинамиддинуклеотидфосфат-еависимой изо цитратдегидрогенааы (АНАДФ-ИДГ) путе электрофоретического разделения исследу емого материала в полиакриламидном геле с последующей инкубацией геля в рас воре, содержащем феназинметасульфат и тетразолий, и определением отдельных изоферментных фракций по оптической плотнрсти окрашенных зон геля l. Однако, этот рпособ. является недостаточно чувствительным и не позволяет с достаточной степенью достоверности судить об активности минорных иаоферментных фракций (1, 3, 4 и ) и их изменениях при различных воздействиях, а также требует длительной инкубации, необходимой для появления окрашивания. Целью изобретения является повышени точности и ускорение способа. Это достигается тем, что в инкубационную среду дополнительно вносят раствор ретинола или ретинил ацетата в концентрации 2-3 мг/мл. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. С помощью зонального электрофореза в полиакриламидном геле в стандартном аппарате для электрофореза осуществляют разделение изофермёнтов АНАДФ-ИДГ, Исследуемый материал (вместе с Сефа- дексом G -25) вносят с помощью пипетки в трубки, содержащие ступенчатый градиент геля (10%; 7,5%; 3,5%) в расчете на акриламид, .В .качестве-концентрирующего слоя используют суспензию Софадекса - 20О. Исследуемый материал вносят в трубку из расчета . 2-3 мг белка на трубку. Электродным буфером служит раствор трис-НС1 буфера (рН 8,3| 0,5 М). Длительность .электрофореза, с оставляет около 4 ч при силе тока 2 мА на трубку. Об окончании электрофореза судят но продвижению инцика- тоцюй краски-бромфенолового синйго. Для очистки галя проводят првдваритель.ный электрофорез в режиме, соогветствуищем режиму основного электрофореза. После окончания электрофореза гели извлекают из трубок .и помещают в пробир-ки, заполненные инкубационной средой для выявленная активности НАДФ-ИДГ, включающей 0,.05М г-лйцйл-Глйцйновый буфер рН8,6 НАДФ-1,7 мМ, .5мМ MaCN-2 мМ, 15 мМ, тринатрие вую coJjb иарлименной кислоты - . 0,015 мМ, нитросиний тетразол:ий -: 0,36 мМ, раствор ретинола или ретинил- ацетата в концентрации 2-3 мг/мл. Про.бирки помещают в термостат и инкубируют в тенение lO мин при . Затем .в каждую пробирку вносят феназинмёТа-. сульфа в концентрации 0,06 мМ и инкубируют пробы в течение 5-20 мин при Той же Температуре. Интенсивность окрашивания в зонах локализации изсфермент- ных фракций регистрируют с помощью ден ситометра. Активность изоферментных фракций НАДФ-ИДГ выражают в условных единицах оптической плотности (пропорциональной плошади окрашенных зон) в пересчете на 1 мг балка в исследуемом образце за 1 мин времени Инкубации при .

740234 Предлагаемый способ значительно повышает актйЁность изофермэнтных фракций НАДФ-ИДГ. При этом наиболее значительно возрастает активность 1-й (в среднем в 17 раз) и 5-й фракции (в среднем в 5 раз). Активность остальных фракций (2,3,4-й) повышается в 3-5 раз. При этом внесение в среду витамина А позволяет в ряде случаев выявить активность так называемых минорных (1, 3, 4 и 5-й) фракций, не выявляющуюся (или выраженную в чрезвычайно малой степени) при использовании известного способа. При внесении в инкубациойную среду витамина А развитие интенсивности окраски происходит уже на 10 - 2О-й минутах инкубации, тогда как при использовании существующего метода для развития выраженной окраски требуется не менее 30-40, а в ряде случаев и 60 мин. Средние результаты исследований по Сопостаблению определения активности . изофврме,нтных фракций НАДФ-еависимой Йзоцитратдегидрогеназы с помощью известного и предлагаемого способов приведены в таблице.

AKTHiBHocTb изоферментных

Формула изобретен и я

Способ определения активности изофер- ,, ментных фракций аденинникотИнамиддинук- пеотидфосфат...ависимой иэоцитратдегидро-: геназы (НАДФ-ИДГ) путём электрофореf йчесКёгу раёйёЯёШй исгслёдуёШгб мат е -- s dK5«e ci; -i -Jфракций НАДФ-ИДГ, единица оптической плотности в мин

риала в полиакриламидном геле с последующей инкубацией геля в растворе, содержащем феназинметасульфат и тетразолий, и определением отдельных изоферментных фракций по оптической гшотности окрашенных зон геля, отличающийся, тем,, что, с целью повышения

57402346

точности и ускорения способа, в инкуба-Источники информации,

ционную среду дополнительно вносят раст- принятые во вн гмание при вкспертиае вор ретинола или рвтинип-ацетата в ко-1. Вестник АМН СССР, MJ 11, о.51,

нечной концентрации 2-3 мг/мл.197й,.