Способ получения ксилозы путем ферментативного гидролиза водных растворов ксиланов Советский патент 1983 года по МПК C07H3/02 C13D1/00 

Изобретение относится к усоверше ствованному способу ферментативного полученияКСИЛОЗЫ, важного продукта пищевой промьшленности. Известен способ получения ксилозы ферментативным гидролизом водных рартворов ксиланов посредством ксиланазы и| -ксилозидазы при комнатной температуре в течение 6-8 ч. В резул1 тате ферментативного гидролиза получают гидролизат, содержащий ксилозу и ксилобиозу в соотношении 1:1 1. Недостатком известного способа является низкий выход целевого продукта. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Поставленная цепь достигается спо собом получения ксилозы, заключающимся в ферментативном гидролизе водных растворов ксилана при в течение k ч путем обработки ксйланазой и р)-ксилозидазой и, в случае необходимости, ферментом, отщепляющим уроновую кислоту, которые.раздельно иммобилизованы на неорганичес ком носителе, выбранном из группы: пористое стекло, силикагель или кизельгур. В результате ферментативного гидролиза получают практически только ксилозу без примесей ксилобио зы. Выход 98,5%. Гидролиз ксилана с помощью фермента, связанного с носителем, отличается от гидролиза с помощью свободных ферментов тем, что благодаря более высокой стабильности связанных ферментов могут выбираться более высокие температуры, в результате чего реакция идет быстрее. Температуры в пределах 30-60 С, предпочтительно в пределах ,. дают, как правило, оптимальные результата. Выход ксилозы в соответствии с предлагаемым способом заметно выше, чем тогда, .когда с носителем про изводят одновременное связывание кси ланазы, -ксилозидазы и фермента, вызывающего отщепление уроновой кислоты, и пытаются осуществить фермент ный гидролиз ксиланов за счет того, что на водный раствор ксиланов воздействуют с помощью носителя, содержащего все эти три фермента. В описании и в примерах, когда речь идет о процентах,подразумеваются весовые проценты. При мер 1. Процесс выделения (варки). 400 г древесины красного бука в форме рубленной щепы подвергают сушке на воздухе, обрабатывают на дефибраторе с помощью водяного пара при 185-190°С в течение 6-7 мин и под соответствующим давлением в 12 aYM приблизительно в течение tO с. Полученный таким образом сырой волокнистый материал вымывают из дефибратора, в результате чего получают л пульпы, которая была загружена на сито. Выход волокнистого материала составляет 83 из расчета на исходную древесину (абс-i сух). Промытый и отжатый на прессе волокнистый материал затем суспендируют при комнатной температуре в 5 л 1%-ного раствора NaOH и 30 мин спустя отделяют от щелочной вытяжки путем Фильтрации и прессования. После промывки водой, разбавленной кислотой и вновь водой, выход волонистого материала составляет 66% на исходную древесину (абс. сух). Соответствующим образом обработке подвергают и другие виды древесины, в том числе и в форме крупных опилок, а также в форме рубленной соломы. В табл. 1 представлены средние значения выходов волокнистого материала (абс. сух.).. При м е р 2. Углеводородный состав после водной и щелочной обработки. Часть общего количества экстракта, получен чого по примеру 1, продуктов водного и щелочного процессов подвергают полному гидролизу (см. табл. 2). П р и м е р 3. Разделение и получение концентратов ксиланазы и / -ксилозидазы на основе ферментного препарата. 220 г ферментного препарата Целлюзиме (ксиланаза, ксилозидаза, энзим, отщепляющий «-О-метилглюкуроновую кислоту) подвергают растворению в 4,8 л 0,02 М буферного раствора аммоний-ацетатного буфера при рН 5. Нерастворяющийся остаток частично удаляют путем пропускания через пористый стеклянный фильтр. Затем раствор фермента фильтруют с осветлением через тефлоновый фильтр. Далее ультрафильтруют раствор фермента на приборе для ультрафильтрации TCF-10 фирNfci Аминкон (Лексингтон, Массачузетс) .i Применяют следующие Аминкон-улът рафильтры (даны в порядке их исполь зования). Область выделения мол. в. X М 100 А100000 X М 300300000 Р М 3030000 D М 5500 Очищенный раствор сырого фермента фильтруют первоначально через фильтр с областью выделения мол. в. 100000. После этого кс ланаза преимущест венно находится в ультрафильтрате, j -Ксилозидаза (неизвестный фермент, вызывающий отщепление -0-метил-глукуроновой кислоты от кислых ксилоолигомеров) находится преимущественно в остатке. Этот остаток ультрафильтрации профильтровывают через ультрафильтр отделяющий мол. в. 300000. В конце /названной операции р)-ксилозидаза вместе с активным ферментационным компонентом, вызывающим отщепление уроновой кислоты, определяется толь ,ко в светлом растворе ультрафильтра та, а густой темно-коричневый остаток не содержит активных компоненто -ксилозидазы и уроновой кислоты. Полученный при первой ультрафильт рации фильтрат подвергают далее следующей обработке. Ультрафильтрация на Р М 30: ксила иаза после этого этапа снова в ультрафильтрате. Вещества, не обладающие aктивнoctью ксиланазы, выделяются в достаток. Ультрафильтрация на D М 5: ксиланаза находится в остатке; на этом этапе ее концентрируют. Одновременно наибольшее количество углеводов (в исходном материале 39%) выделяется |В ультрафильтрат. В табл. 3 приведены значения активности по ксиланазе, Р -ксилозидазе ji ферменту, вызывающему отщепление уроновой кислоты. Представленные величины обозначены условными единицами. Одна условная единица, сооответствует такому количеству фермента, которое содержание сахара в разлагае MOMjpacTBOpe повышает при 1м1 моль ксилозы для ксиланазы и Р -ксилозидазы и на 1 мк моль tO-мети л глюкуроновой кислоты для фермента, отщепляющего кислоту (разлагаемый раствор - }% ксилана буковой дре весины для ксиланазы, 2 ; ммоль п-нит рофен лксилопиранозида для })-ксилози 0 дазы, 0,02 мкг/мкл -0-метилглюкуронозил-ксилотриозы для фермента, от- щепляющего кислоту). Для измеренияактивности pi-ксилозидазы осуществляют взаимодействие разбавленного раствора п-нитрофенилксилозида в объеме 1,5 мл с 2 мл 0,1 М боратного буфера рН . Анализ высвободившегося п-нитрофенола проводят непосредственно в спектре 20 нм по его ослаблению. Количество п-нитрофенола считывают по тарировочной кривой и пересчитывают на ксилозу. В качестве субстрата, отщепляющего уроновую кислоту, служит t-O-Meтилглюкуронозил-ксилотриоза. Пример. Отложение фермента на носителе. В качестве носителя фермента выбирают пористое стекло. Ксилонолитические ферменты связываются с носителем через альдегид глютариновой кислоты. 1 г пористого стекла в течение ночи подогревают с обратным холодильником 105ё-ного раствора гамма-амино-пропил-трйэтоксилана в толуоле. За счет :этого носитель получает группу ;амина. После этого производят интенсивную промывку последовательно толуолом и ацетоном. Затем носитель интенсивно перемеш1 ёают с 20 кл 5 -ного раствора альдегида глютариновой кислоты в 0,02 М фосфатном буфере при рН 6,5. Перваначально ё течение 15 мин перемешивание производят под вакуумом, а затем дальнейшую инкубацию осуществляют при нормальном давлении. Далее проводят отсасывание, и материал носителя подвергают тщательной промывке 200 мл буферного раствбра. На основе такого активированного материала носителя получают два ферг ментных препарата,.связанных с носителем:а) 1 г такого активированного носителя перемешивают в течение ночи с 5 мл ксилоназного ферментного раствора с активностью 657 усл. ед,, по- лученного Q соответствии с примером 3. Далее осуществляют -промыв1 су через пористый стеклянный фильтр с помоью раствора 1 М NaCl в -0,02 М фосфатном буфере с рН А, после чего промывку осуществляют0,02 М раствором фосфатного с рН 5 до тех 5 пор, пока вода промывки не будет содержать фермента. Полученный таким образом препарат 1 содержит на t г 6 усл. ед. -связанной эффективной ксилоназы. б) Работу проводят как указано в пункте а, однако используют 5 мл раствора, полученного в соответствии с примером 3 который содержит 3.3 усл. ед. р -ксилозидазы и 60 усл. ед. фермента, отщепляющего урбноёую кислоту. . Полученкшй препарат 2 содержит в связанном состоянии на 1 г приблизительно 33 усл. ед. |Ь-ксилозидазы и 60 усл. ед. фермента, производящего отщепление уроновой кислоты. П р и.м е р 5. Гидролиз ксилана древесины бука. 2 мл раствора ксилана, полученного по примеру 1 в результате промывки водой древесины бука после ее варки (этот раствор содержит 1,3.% ксилана), инкубируют с 60 мг препара та 1 Л С 60 МГ препарата 2, получен ных как в примере , причем во время инкубации в водянойбане содержимое ее перемешивают встряхиванием, а температуру в ней поддержи вают равной . Спустя 4 ч в результате гидролиза ксилана буковой древесины образуются мономерные компоненты ксилозы и -0-метил-гл10куроновая кислота. На фиго 1 показана хроматограмма после k ч инкубирования. Из нее видно, что в растворе произоиша полная деструкция ксилана до ксилозы. Раствор не содержит ксилобиозы. П р и м е р 6. В качестве носителя для фермента выбран силикагель (меркогель SI 1000). Работают точно так, как указано в примере , причем получают оба следующих ферментативных препарата, связанных с носите-, лем: а)1 г активированного носителя, содержащего 59 ед. связанной ксилана зы; б)1 г активированного носителя, содержащего около 2 ед,р -ксилозида зы и 59 ед, фермента в связанной фор ме, отщепляющего уроновую кислоту, П р и м,е р 7. Работают как описа но в примере 4,. причем в качестве материала-носителя применяют кизельгур (инфузорная земля). При этом получают следующие два ферментативных препарата, связайных с носителем: 50 а) 1 г активированного носителя содержит 52 ед. связанной ксиланазы; б 1 г активированного носителя содержит 30 ед.Ь-ксилозидазы и б7 ед. связанного фермента, отщепляющего уроновую кислоту. Примере. Гидролиз ксилана букового дерева. 2 мл раствора ксилана, полученного согласно примеру Т промывкой водой из переведенного в растворимую форму букового дерева (раствор содрржит 1,3 ксилана), инкубируют 60 мг препарата 1 и 60 мг препарата 2, полученных согласно примеру , при на встряхиваемой водяной бане. Гидролиз ксилана производят аналитически хроматографией на колонке с применением ионообменной смолы. Через ч ксилан букового дерева гидролизуют на его мономерные состав;ные части и )-П-метил-глюкуроновую кислоту. На фиг. 2 приведена хроматограмма после четырехчасового инкубирования. Отсюда очевидно, что в растворе происходит полное расщепление ксилана до ксилозы. Раствор не содержит ксилобиозы. Сравнительный опыт. По 2 мл раст.воров ксилана, полученных согласно примеру 1 (раствор содержит 13 мг ксилана в 1 мл), обрабатывают в течение 4 ч при тремя ниже описанными препаратами ферментов: а)60 мг фермента (3,8 ед активной ксиланазы соответственно относительной активности ), связанного с носителем, полученного согласно примеру k} б)60 мг препарата, связанного с носителем, полученного следующим образом: 1 г пористого стекла активи;руют- согласно примеру Ц. 1 г активированного таким образом носителя перемешивают ночь с 5 мл неочищенного фермента, применяемого в примере 3 затем промывают согласно при- меру а. Относительную активность . полученного таким образом продукта не определяют, поскольку последующий опыт показал, что при помощи этого ферментативного препарата ксилан не может расщепляться до ксилозы; в) Смесь 60 мг препарата, получен ного согласно примеру А а (3,8 ед. ксиланазы соответственно относительной активности ) и 60 мг препэ7101рата, полученного согласно примеру k б (2 ед.| -ксилозидазы и 3,6 ед. фермента, отщепляющего уроновую кислоту, соответственно относительной активности 100%). 10508 Расщепление ксиланов в трех растворах контролируется через 3 м хроматографией на колонке согласно примеру 5. Содержание ксилобиозы и ксилозы в растворах показано но. фиг 3. Т а б л и ц а 1

Т а б л и ц а 3

СПОСОБ ПОЛУ1 ЕНИЯ КСИЛОЗЫ ПУТЕМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ВОДНЫХ РАСТВОРОВ КСИЛАНОВ посредством фер- ; ментной системы, включающей ксиланазу и ft-ксилозидазу, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, .ферментативный гидролиз осуществляют при в течение 4 ч, а в качестве ферментной системы используют ксиланазу и р -ксилозидазу и, в случае необходимости, фермент, отщепляющий уроновую кислоту, раздельно иммобилизованные на неорганическом носителе, выбранном из группы: пористое стекло, силикагель или кизельгур. (О ел

има (0 S 2568 7968 1290 1996 гА480 13 52 - 1011 1817 21173 19730 -