Способ иммобилизации клеток микроорганизмов Советский патент 1983 года по МПК C12N11/04 

со

4 vj Изобретение относится к биоорганической химии и может быть использовано в химической промышленности. Известен метод иммобилизации ,клетокмикроорганизмов, обладающих /3-галактозидазной активностью в пористых частицах, получаемых обработкой смеси бычьего альбумина и микробных клеток глутаровым альдегидом при после замораживания до , вследствие чего образуется пористая структура, содержащая 70 мг клеток на 1 г сухого биокатализатора Активность получаемого препарата составляла 7,5-5% от исходной активности биокатализатора f1 . Недостатком этого способа является недостаточно высокая активность получаемого биокатализатора, Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ иммобилизации клеток микроорганизмов путем обработки раствора кЗррагенана клеточной суспензией с последующим гелеобразованием и добав лением гексаметилендиамина и глутаро вого альдегида 2. Применяемый в качестве полисахарной матрицы каррагенан представляет собой полисахарид из морских водорослей, обладающий молекулярным весом 100 000 - 800 000. Состоит из элемен тарных структурных единиц fi-D-галак тозосульфата и 3,6-ангидро-1-0-галак тозы,Гелеобразование каррагенана обычно вызывается добавлением ионов металлов, аминов, органических растворителей либо охлаждением до 10°С. До бавляемые в процессе получения гекса метилендиамин и глутаровь Й альдегид способствуют укреплению пространственной решетки геля и повышению оп рационной стабильности биокатализатора. В качестве микроорганизмов обычно используют Е. coli, Вас. ammoniagenes и Streptomyces phaeochromogene при этом выход по активности составляет для клеток Е. - 6,8%, B.ammoniagehes - 60,0 и S, phaeo-. chromogenes - k,% по сравнению с нативными клетками микроорганизмов. Недостат,ками известного способа являются использование экзотического полисахарида,выделяемого из морских водорослей, а также недостаточно высокая активность получаемого биоката лизатора. Целью изобретения является повышение активности биокатализатора. Указанная цель достигается тем, что согласно способу иммобилизации клеток микроорганизмов путем обработки клеточной суспензии раствором полисахарида с последующим гелеобразованием и добавлением гексаметилендиамина и глутарового альдегида, в качестве полисахарида используют полиурониды. При этом обычно используют клетки Bacillus subtilis и процесс ведут при следующем весовом соотношении компонентов полиурониды: клетки (в расчете на белок): 5%-ный раст вор глутарового альдегида: гексаметилендиамин 1:(0,06-0,15) : (27-270): :(1,5б-15,6). Сущность изобретения заключается в том, что в качестве матрицы используются полиурониды. Полиурониды (пектиновые вещества) - природный углеводный полимер, состоящий из неразветвленных цепей, которые построены из остатков о1-D-галактуроновых кислот, связанных (1 - t) связями, присутствуют в растворимой или нерастворимой форме практически во всех наземных растениях и в ряде водорослей . Известно, что клеточные стенки микроорганизмов содержат полисахариды различного, сложного строения. Количество полисахаридов в клетках микроорганизмов достигает 20-30 сухого веса клеток. Каждый индивидуальный полисахарид, обладающий только ему присущей структурой, оказывает сугубо специфическое действие на функциональную деятельность микробных клеток и тем мягче это действие, чем ближе эта структура к строению собственных полисахаридов микроорганизма. Полиурониды состоят из УРОН1ОВЫХ кислот , которые также входят в состав полисахаридов клеточной стенки микроорганизмов. Все это, вероятно, и обуславливает более мягкий контакт и действие внешнего полисахарида с клеточной стенкой микроорганизма, меньше нарушая жизненные функции микробных клеток, что в свою очередь приводит к повышению выхода активности иммобилизованных клеток, Кроме того, предлагаемый способ позволяет не только повысить активность биокатализатора, но и решить

задачу замены труднодоступного каррагенана широко распространенными в природе полисахаридами - полиуронидами....

Методика выделения полиуронида.

Растительное сырье (например, цитрусовое) измельчают, помещают в мешочек из .плотной ткани и заливают спиртом для удаления эфирных масел, пигментов и других примесей. накрывают и ставят не менее чем на 1 ч на водяную баню при 60-70°С. Затем материал отжимают на воронке Бюхнера и снова заливаюи спиртом.

Операцию повторяют до тех пор, пока экстракт не станет лишь слабожелтого цвета. Отмытую массу помещают в колбу с 0,03 NHC1 и нагревают 1 ч на кипящей водяной бане. Горячую вытяжку фильтруют через вату, остаток дважды промывают на фильтре « небольшими порциями горячей воды. По охлаждении фильтрат частично нейтрализуют аммиаком до слабо кислой реакции и упаривают до 60-80 мл. К остатку добавляют 2 объема спирта. Выпавший пектин отделяют центрифугированием. Сушат на воздухе.

Пример. К 0,370 г цитрусового полиуронида приливают 5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора рН 7,5 и нагревают до 80°С до растворения, затем охлаждают до и добавляют 2 мл суспензии

клеток с содержанием белка 22,5 мг/мл. Тщательно перемешивают и приливают 1,5 мл 0,5 М СаС1, полученный гель отжимают на воронке Бюхнера, продавливают через сито с диаметром отверстий 1 мм и к гранулированному гелю добавляют 5:10 (или 0,58 г) гексаметилендиамина в 5 мл 0,5 М CaCl2, перемеиГивают 2-5 мин и приливают (или 10 мл 5%-ного раствора) глутарового альдегида.

Таким образом, весовое соотношение добавляемых компонентов, если количество полиуронида (0,370 г)

взять за единицу, а также ведя расчет на белок используемых (0, г) , будет следующим: полиуронид: белок клеток: глутаровый альдегид:гексаметилендиамин

1:0,06:27:1,56.

Смесь осторожно перемешивают 1020 мин при 5С и переносят на воронку Бюхнера, где тщательно промывают фосфатным буферным раствором

при рН 7,5. Получают 6 г геля, обладающего триптофансинтёзной активностью в 69,7 от исходной активности нативных клеток.

В табл. 1 показана зависимость

активности получаемого биокаталиэатора от количества добавляемых клеток при постоянном количестве полиуронида (0,370 г), .Ь глутарового альдегида (10 мл) и гексаметилендиамина (0,580 г).

Т а б Л И ц а 1

В табл. 2 показана зависимость активности иммобилизо ванных клеток от количества армирующих агентов, т.е. от 5% глутарового альдегида

И 100% гексаметилендиамина , при постоянном количестве добавляемых клеток-(2 мл с содержанием белка в 22,5 мг/мл)..

51013V

ам . «сЬ

Гексаметилендиамин, г 0,580 1,16 2,32 З, 5,80

5%-ный глутаровый альдегид, мл10 20 0 60 100

Активность, мкМ/мин ни 1 иг белка 0,054 0,056 0, 0,0595 0,0580

Процент сохранения активности76,8 69,9 67,1 73,3 71,9

Предложенный способ иммобилизации 1$пользовать более доступное сыклеток микроорганизмов позволяет по-рье, присутствующее практически

лучить биокатализатор с высоким вы- /во всех наземных растениходом активности (до 69,7-70%), ис-;ях.

Та б л и ц a 2