Способ получения иммобилизованных клеток дрожжей @ @ N112,обладающих L-лизинамидазной и L- @ -аминокапролактамгидролизной активностями Советский патент 1986 года по МПК C12N11/00 C12N11/00 C12R1/00 

Изобретение относится к биотехно- логии, а именно к способам иммобилизации клеток дрожжей, обладающих L- лизинамидазной и L-Ы-аминокапролак- тамгидролазной активностями, и пред- ;; назначено для получения биокатализатора, который может быть использован в технологическом процессе, производства L-лизина из DL-лизинамида или DL-o -аминокапролактама, О

Цель изобретен ия - увеличение ферментативной активности и стабильности препарата.

Бифункциональный реагент, а именно глутаровый альдегид, легко вступа- 15 щают в стакан с 50 мл 1%-ного раство- ет-в реакцию со свободными аминогруп- ра глутарового альдегида. После конПример. Способ иммобилизации клеток в-ойтимальных условиях.

0,75 мл 50%-ного раствора поли- этиленимина растворяют в 7-8 мл воды (рН доводят до 8,5 прибавлением 1 н. НС1), прибавляют 0,22 г агара, объем смеси доводят водой до 10 мл и подогревают до для полного растворения. Смесь охлаждают до , прибавляют 1,6 г сухих клеток, перемешивают и охлаждают льдом и водой до 5 с, Образовавптйся блок геля с включенными клетками измельчают продавливанием через сито и полученные гранулы помепами. При этом образуются прочные ковалектные связи между отдельными молекулами полизтиленимина через глутаровый альдегид. В такую цепь могут быть включены свободные аминогруппы, находящиеся на поверхности клеточной стенки или мембраны. Такая сшивка становится препятствием для вымывания клеток из гранул агарового геля и это приводит к повьпиению фермента- |тивной стабильности препарата иммо- билизованньк клеток. Кроме того, после обработки гранул иммобилизованного препарата раствором глутарового альдегида определенной концентрации повышается их механическая прочность. Повьшение ферментативной активности препарата достигается благодаря увеличению весового соотношения клетки (гельобразующие Материалы, которые по предлагаемому способу иммобилизации составляют 1,6/0,6, а по известному 1,0/1,0). Предварительная обработка суспензии клеток раствором глутарового альдегида приводит к потере ферментативной активности на 40%. Препарат иммобилизованных клеток, полученный в отсутствие поли- этиленимина, после обработки глутаро- вым альдегидом теряет ферментативную активность на 35%. Только присутствие полиэтиленимина в препарате иммобилизованных клеток делает возможной обработку глутаровым альдегидом практически без потери ферментативной активности. Оптимальные концентрации агара, полиэтиленимина, клеток и глутарового альдегида, найденные путем планирования экспериментов симплекс- методом, необходимо поддерживать на указанном уровне для увеличения активности и стабильности целевого продукта.

щают в стакан с 50 мл 1%-ного раство- ра глутарового альдегида. После конПример. Способ иммобилизации клеток в-ойтимальных условиях.

0,75 мл 50%-ного раствора поли- этиленимина растворяют в 7-8 мл воды (рН доводят до 8,5 прибавлением 1 н. НС1), прибавляют 0,22 г агара, объем смеси доводят водой до 10 мл и подогревают до для полного растворения. Смесь охлаждают до , прибавляют 1,6 г сухих клеток, перемешивают и охлаждают льдом и водой до 5 с, Образовавптйся блок геля с включенными клетками измельчают продавливанием через сито и полученные гранулы пометактирования смеси в течение 20 мин при 4-6 С гранулы промывают дистиллиованной водой. Получают препарат им- мобилизованных клеток, который облаает L-оС-аминокапролактамгидролизной активностью 160 Е/мл, L-лизинамидаз- ной - 158 Е/мл. Единица ферментативной активности - количество фермента, образующего 1 мкмоль лизина в минуту. Активность биокатализатора рассчитывают на сухой вес препарата. Активность в Е/М.Л получают делением значения активности на сухой вес (Е/г) на величину набухаемости (мл/г).

Результаты опытов 1-9 (из серии экспериментов, вьтолненных при оптимизации способа иммобилизации методом симплекс-планирования), показывающие влияние изменения концентраций исходных материалов на ферментативную активность и выход иммобилизованного препарата, приведены в табл. 1 .

При неодинаковой исходной концентрации клеток наиболее характерным показателем эффективности процесса иммобилизации является выход ферментативной активности. Опыты 1 и 2 показывают приемлемые пределы изменения концентраций полизтиленимина, агара и глутарового альдегида. Препарат, полученный в опыте 3 механически непрочен (легко распадается на мелкие частицы при перемешивании), поэтому указанная концентрация глутарового альдегида является непригодной (слишком малой). Выход ферментативной активности уменьшается, если концентрации полиэтиленимина и агара недостаточны (опыт 4). Отрицательное влия

ние на выход ферментативной активности оказывает повьппение концентраций полиэтн ленимина, агара и глутарового альдегида до значений, представленных

31

в опыте 5. Уровень активности биока- талиэатора зависит от концентрации иммобилизуемых клеток (опыты 6-9). Гель насьщается клетками при irx. концентрации 160-180 мг/мл,и дальней- шее повышение исходной концентрации клеток ведет к понижению выхода ферментативной активности. .

Для определения L- о( -аминокапрола тимгидролазной активности в термоста тируемую при 50°С ячейку, перемешиваемую магнитной мешалкой, помещают 3 мл 0,1 М раствора субстрата L-o( - аминокапролактама,- рН 8,0, к которому прибавляют препарат иммобилизо- ванных клеток. После 1-2 мин перемешивания берут контрольную пробу для определения фоновой концентрации лизина . Длительность ферментативной реакции 30 мин. Содержание лизина в пробах определяют фурфурольным методом.

В случае определения лизинамидаз- ной активности ферментативную реакцию проводят аналогично. В качестве

.субстрата используют 0,1 М раствор L-лизинамида. Пробы контроля и ферментативной реакции обрабатывают реактивом, содержащим фурфурол, и измеряют оптическую плотность окрашенного продукта реакции при волнах дли,ной 370 и 430 нм. Концентрацию лизина определяют по калибровочному графику зависимости разности оптической

плотности А

зга

MJO

от концентрации

лизина в калибровочной смеси,, содержащей лизин и лизинамид.

5

- 10 t5

20

5

0

5

484

Для определения стабильности иммобилизованных клеток через термоста- тируемые при 50 С колонки, заполненные испытуемыми препаратами, со ско- ростью 12 мл/ч прокачивают 0,1 М раствор L-лизина рН 8,25 (консервант- толуол). Через определенные интервалы времени извлекают образцы препаратов, хорошо отмывают водой и определяют остаточную активность.

Данные о препаратах иммобилизованных клеток Cryptococcus species № 112, полученных по предлагаемому и известному методам, представлены в табл. 2. Приведенные данные получены в параллельных опытах, -выполненных с использованием одной партии клеток Cryptococcus species № 112.

Результаты табл. 2 показывают, что при использовании предлагаемого способа ферментативная активность полученного препарата иммобилизованных клеток Cryptococcus species № 112 увеличивается в 5 раз; способ существенно повьш1ает ферментативную стабильность препарата, т.е. в тесте стабильности при в течение 20 сут начальный уровень активности остается 100%-ным (согласно известному способу - 20%).

Увеличение активности и стабильности приводит к существенному увеличению продуктивности биокатализатора и снижению себестоимости продукта ферментативной реакции L-лизина.

Таблица 1

Продолжение табл.I