Способ получения биомассы @ @ Советский патент 1983 года по МПК C12N1/00 

4

00 00 Изобретение относится к способам получения-биомасс, обогащенных биоло гически активными веществами. Известен способ получения биомасс микроорганизмов с РНК-лигаэной актив ностью, где в качестве продуцента ис пользуют E.Coli В, а в качестве индуктора РНК-лигазы фаг. Т Выход биомассы не указан. Активность РНКлигазы 3,7 ед. на мг белка 1. Наиболее близким к предлагаемому является способ заключающийся в том, что биомассу с полинуклеотидкиназнрй активностью получают культивированием бактерии E.Coli В на питательной среде, содержащей г/л; аммоний хлори тый 1; магний сернокислый 0,13; калий фосфорнокислый однозамещенный 3, натрий фосфорнокислый двузамещенный 6,0; глюкоза 4,0; казаминовые кисло.ты 2,0. Температура выращивания 37 С. Условия индукции ферментов фагом: плот ность культуры E.Coli 2 l0 клeтoк7мл множественность инфекции 4 фаговых частицы на клетку. В качестве биости мулятора добавляют триптофан 0,01 г/ Накопление фермента проводят в течение 12 мин после инфекции фагом. Выход биомассы 2,5 г/л. Активность полинуклеотидкиназы 40 ед/мг белка 2. Однако при этом сравнительно низкий выход биомассы, так как на стади ях инфицирования культуры и постинфекционной инкубации не обеспечены УСЛОВИЯ для интенсивного протекания процесса. Цель изобретения - повышение выхо да биомассы. Поставленная цель достигается тем что в способе получения биомассы E.Coli В на питательной среде, содер жащей источники углерода и азота, ми неральные соли и ростовые факторы, в питательную среду дополнительно вводят глутатион в концентрации 0,01 0,015 г/л, инфицирование биомассы фа гом ат№ 82 осуществляют при плотности культуры 3,0-3,3-10 клеток/мл культуральной жидкости, а постинфекционную инкубацию проводят в течение .28-30 мин при рН 7,5-7,6. 1 Пример. Культуру E.Coli В выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: NH/C11,0+1,2 MgS04-7H20 0,13+0,15 .3,0+3,5 КН2Р04 9,0+10,0 Na2HPO4 Глюкоза10,0+15,0 Гидролизат казеина8,0-1,0,0 Дрожжевой экстракт 1,0-1,2 рН7,2-7,4 Глюкозу вводят в питательную среду в виде стерильного раствора. Проводят культивирование в условиях принудительной аэрации до тех пор, пока плотность культуры достигнет 3,0-3,3-10 клеток/мл-культуральной жидкости, и осуществляют инфицирование фагом из расчета 2 фаговые частицы на 1 клетку бактерии, одновременно добавляют глутатион в концентрации 0,010-0,015 г/л и продолжают культивирование 28-30 мин, поддерживая рН 7,5-7 ,6. Процесс прекращают охлаждением культуральной жидкости др 5с. Выход биомассы 7,0-8,5 г/л г Активность псэлинуклеотидкиназы 45-47 ед/мг бел Активность РНКлипазы5,5,2 ед/мк белка. П р и м е р 2. Питательная среда содержит, г/л: NH4C1. 1,2 MgSO.-7H90 0,13 КН„Р343,.0 ЫаьНР049 ,0 Глюкоза . 15,0 Гидролизат казеина10,0 Дрожжевой экстракт 1,2 рН .7,2-7,4 Глюкозу вводят в питательную среду в виде стерильного раствора. Выращив ание Е.Со11 В. 1) Инокуляция посевного материала. Культура E.Coli В поддерживается на столбиках МПА вазелиновым маслом, пересевается один раз в 4 месяца. Для подмолаживания культуру засевают в 100 мл основной среды с содержанием глюкозы 0,5 г/л, инкубируют 10-12,4 при 37±1°С стационарно. Инокулят,готовят, пересевая 10-12 часовую культуру на 1 л свежей среды с содержанием глюкозы 1,0 г/л из расчета 1: 8 и выращивают в течение 4-5 ч в условиях аэрации. 2) Ферментация культуры E.Coli В производится после добавления ViHOKyлята 1:20 по отношению к объему среды. Ферментация производится при 37±1°С в условиях принудительной аэрации (2 л воздуха на 1 л питатеЛьной среды) . ; 3) Инфицирование E.Coli В фагом T.cim82. Когда плотность культуры достигает З ЗхЮ клеток/мл (по калибровочной кривой), прекращают аэрирование, добавляют суспензию бактериофага из расчета 2 фаговые частицы на 1 клетку бактерии, т.э. 6, на 1 мл культуральной жидкости. Одновременно добавляют глутатион 0,015 г/л. 4) Постинфекционнре инкубирование проводят при рН 7,5-7,6, регулируемое раствором и аэрации 2л воздуха на 1, л питательной среды в течение 28 мин, после чего быстро охлаждают культуральную жидкость до 5°С. 8,5 г/л, Выход биомассы Активность по47 ед/мг белка линуклеотидкинаэы . Активность РНК5,0 ед/мг белк липазы , П р и м е р 3. Питательная среда содержит, г/л: NH4Ci1,S MgSQa-7H2O0,15 КН„Р043,5 NajHPO 10,0 Глюкоза10,0 Гидролизат казеина8,0 Дрохркевой экстракт1,0 рН7,2-7,4 Введение глюкозы, инокуляция посе ного материала, ферментация культуры подобны примеру 1... Инфицирование E.Coli В фагом проводят,когда плотность культуры до тигает З-Ю клеток в мл,добавляют су пензию бактериофагаиз расчета 2 фаговые частицы на 1 клетку бактерии, т.е. на 1 мл культуральной жидкости, глутат.ион добавляют в коли честве 0,01 г/л. Постинфекционную ин кубацию проводят 30 мин. Выход биомассы 0,7 г/л. Активность полинуклео гидкинаэы 45 ед/мг белка. Активность РНК липазы 5,2 ед/мг белка. П р и м е р 4. Питательная среда, введение глюкозы, инокуляция посевного материала, ферментация культуры IE.Coli Вподобны примеру 1. Инфицирование E.Coli В фагом Т.ат 82 проводят , когда плотность культу/ры достигает 3,2-10 клеток в 1 мл кулЬтуральной жидкости, добавляют суспензию бактериофага из расчета 2 фаговые частицы на 1 клетку бакте ии т.е. 6,4-l(FEOE на 1 мл культуральной жидкости, глутатион добавляют в количестве 0,013 г/л. Прстинфекционную инкубацию проводятГ в течение 29 MHk. Выход биомассы 8,0 г/л. Активност полинуклеотидкиназы 46 ед/мг белка. Активность РНК-лигазы 5,1 ед/мл.белка. Применение предлагаемого способа обеспечивает хороший выход биомассы (7,0-8,0 г/л) с активностью полинуклеотидкиназы 45-47 ед/мг белка и РНКлипазы 5-5,2 ед/мг белка. Выращивание культуры до плотности клеток 3-3,3x10 в 1 мл культуральной жидкости,множественность инфицирования 2 фаговых частиц на бактериальную клетку достаточна для того, чтобы катздая микробная клетка была атакована фаговой частицей, при этом не чызЕДвая лизирования клеток извне, что может иметь место при более высокой множественности инфицирования. Добавление глутатиона в питательную среду способствует прикреплению фаговых час- тиц к поверхности клеток E.Coli и активизирует мембранные процессы. Таким образом достигается 98-100% инфицирование клеток фагом, что интенсифицирует накопление ферментов, так как фаг яйляется индуктором и полинуклеотидкиназы и РНК-липазы. Осуществление постинфекционной инкубации в течение 28-30 мин .способствует накоплению РНК-.. . липазы в то же время без снижения активности полинуклеотидкиназы, максимум активности которой наблюдается к 23-25-ой минуте постинфекционной инкубации. Образованию и стабилизации целевых ферментов и биомассы способствует ведение постинфекционной инкуба-ции при рН 7,5-7,б. .Технико-экономический эффект предлагаемого способа заключается в обеспечении получения ферментов РНК-липазы и полинуклеотидкиназы комплексным путем. Способ обеспечивает повышение выхода биомассы и целенаправленное на-г копление в ней ферментного комплекса полинуклеотидкиназы и РНК-линзы в 3-3,5 раза.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ . Е.СОЫ, включсиощий культивирование Es ijierichia Coli В на питательной среде, содержащий источники углерода te азота, минеральные соли и ростовые факторы, инфицирование, прл5гчен-. ,ной биомассы фаг9м Т. am 82 и инкубацию с послёдукхцим в(:Шелднием ферментов нуклинового обмена, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы в питательную среду допо11нительно вводят -глутативн в концентрации 0,01в,015 г/л, инфицирование биомассы фагом осуществляют при плотности культуры 3,0-3,3-10 клеток в 1 мм кульi туральной жидкости, а постинфекционную)Щ инкубацию проводят в течение 28- л 130 мин при рН 7,5-7,6.