атб, после трансформации клеток E.coli отбирают клоны с иммунитетом к суперинфицирующему фагу лямбда и из них вьщеляют,рекомбинантную плазмидную ДНК pILL435.
3. Штамм Escherichia coli ВКМ В - 1449Д (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) - продуцент ДНК- лигазы Лага ТА. .
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pILL435, кодирующая синтез ДНКлигазы фага Т4, состоит из следующих элементов: -плазмидная ДНК вектора pBR322, размер которой 4,36 тпо, -Hindlll-EcoRI - фрагмент, содержащий часть гена ДНК-лигазы фага Т4 
Изобретение относится к микробиологической промышленности и молекулярной биологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, обусловливающую синтез ДНКлигазы фага Т4, способ конструирования данной рекомбинационной плазмидной ДНК и штамм, содержащий эту рекомбинантную плазмиду - суперпродуцент ДНК-лигазы фага Т4.
ДНК-лигаза фага Т4 - один из основны ферментов, используемых в генети ческой инженерии при конструировани гибридных молекул.
Известны рекомбинантные ДНК, определяющие синтез ДНК-лигазы фага Т4. Описанная в работе плазмида включает ДНК векторной плазмиды pBR313 и фрагмент ДНК фага Т4, содержащий полный ген ДНК-лигазы с собственным промотором. Описанная рекомбинантная плазмида не обеспечивает достаточно высокий уровень лигазной активности (см. табл. 1).
В работе jYj был сконструирован рекомбинантный фаг Д , содержащий полный ген ДНК-лигазы фага Т4.
Эффективный синтез ДНК-лигазы фага Т4, осуществляемый с промотора РП , векторного фага, обусловливал в 300 раз более высокое содержание этого фермента в сравнении с клетками E.coli, инфицированными фагом 14. Однако одновременно в инфицированных клетках рекомбинантный фаг продуцирует сопутствующие ферменты, например Л -экзонуклеазу фермент, который значительно затруняет очистку основного продукта.
Известный способ конструировани рекомбинантной плазмиды, содержаще ген ДНК-лигазы фага Т4, описанный в работе TQ , состоит в том, что фрагменты ДНК фага Т4, продуцируемые эндонуклеазой рестрикции Hindlll,
объединяют с мультикопийной векторной плазмой pBR131, предварительно гидролизованной эндонуклеазой рестрикции Hindlll. Гибридными плазмидами трансформируют клетки E.coli lig ts7, у которых при повышенной температуре не функционирует ДНКлигаза. Трансформанты с искомыми рекомбинантными плазмидами выращива )т при температуре, непермиссивной для роста клеток E.coli lig ts7 Из выросших клеток вьщеляют плазмидную ДНК, структуру которой исследую рестрикционным анализом. Было показано наличие в рекомбинантных плазмидах фрагмента размером 1,9 тпо (тысяч пар оснований), включающего полный ген ДНК-лигазы фага Т4. Однако содержание этого фермента в клетках в этом случае низкое (см. табл. 1).
К недостаткам данного способа можно отнести также то, что для конструирования рекомбинантной плазмиды не используют фрагменты ДНК, которые содержат промоторы, обеспечивающие высокий уровень синтеза ДНК-лигазы.
Применяемый в работе способ получения рекомбинантной ДНК предусматривает использование ДНК фага NM816 в качестве вектора. Фрагменты ДНК Т4, продуцируемые рестриктазой ЕсоRI при ограниченном гидролизе, вводят в ДНК этого фага и отбирают фаги, которые размножаются на E.coli lig ts7 при 37 С и образуют лизоген при 43 С. Были обнаружены рекомбинанты, содержащие ген ДНК-лигазы фага Т4. Эти рекомбинантные фаги получены введением в вектор трех EcoRI - фрагментов ДНК фага Т4, включающих полный ген ДНК-лигазы. Синтез ДНК-лигазы проходил после индукции профага, которую проводят следующим образом: лизогенные клет3
ки подращивают при температуре 30 С до титра 3,510 кл/мл, инкубируют 15 мин при 43°С, затем культивируют клетки при 37°С в течение 3 ч. Однако способ конструирования рекомбинантного фага лямбда с полным ген лигазы не обеспечивает получения штамма E.coli с достаточно высоким содержанием ДНК-лигазы фага Т4.
Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей полный ген ДНК-лигазы фага Т4 и регуляторную область фага лямбда, в литературе не описан.
Известны следующие штаммы-продуценты ДНК-лигазы фага Т4 (см. табл. 1)
а)клетки E.coli В, инфицированн фагом Т4 am N82, которые содержат п нашим данным 168 единиц фермента на грамм биомассы;
б)штамм T.coli К802, несущий плазмиду pTFH301 2 с Hindlll фрагментом ДНК фага Т4, включающим ген ДНК-лигазы фага Т4. Штамм имеет низкий уровень синтеза фермента lj;
в)штамм E.coli NM989 является производным от штамма E.coli АА125, лизогенным по фагу -7 с 1857 W am 403 Е am 1100 S amlOO Т4 lig, который несет ген ДНК-лигазы фага Т4 2 и обеспечивает при термоиндукции уровень синтеза ДНК-лигазы фага Т4, равный 4800 единиц на грамм клеток.
Уровень синтеза ДНК-лигазы Т4 в перечисленных штаммах недостаточн высок. Кроме того, перечисленные штаммы (а) и (в) продуцируют сопутствующие ферменты, которые усложняют способ получения ДНК-лигазы, что увеличивает время очистки и снижает выход конечного продукта.
Целью предлагаемых объектов изобретения является увеличение содержания ДНК-лигазы фага Т4 в клетках бактерий.
На фиг. 1 изображена схема рекомбинантной плазмидной ДНК pILL 435 с рестрикционной и генетической картами (Р.- - обозначение основных промоторов и направление транскрипции) ; на фиг. 2 - электрофореграмма фрагментов ДНК рекомбинантной цлазмиды pILL 435, полученных при гидролизе эндонуклеазами рестрикции Bglll (1), EcoRI (2),HindIII (3) и при совместном гидролизе Ват HI и Hpal (4), Hindlll и EcoRV (5), Sail и Hpal (6); электрофореграмма Bam HI - Фрагментов ДНК Ti. (7) ,
20034
EcoRII - фрагментов ДНК pBR 322 (8) , BamHI - Bgl 11 - фрагментов ДНК pIL 203 (9) ; слева приведены размеры фрагментов ДНК рILL 435, справа отмечены J размеры маркеров (в тыс. пар оснований) ; на фиг. 3 - схема конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pILL 435, обеспечивающей синтез ДНК-лигазы Т4; на фиг. 4 - электро0 фореграмма частично очищенных с помощью фосфоцеллюлозы Р-11 (пример 1) белков из экстрактов клеток: Е. coli АА125/рВР 322 lig 35 (2) Е. coli AAI25 (Т4 lig С1857 5 Wam 403 Eam 1100 Sam 100) (3) Е. coli AA125/pILL 435 (4) Электрофореграмма очищенного фермента ДНК-лигазы Т4(5)
0 и белковых маркеров с обозначенными размерами (1) Рекомбинантная плазмидная ДНК pILL435, кодирующая ДНК-лигазу фага Т4, состоит из следзтощих элемен5 тов:
-плазмидная ДНК вектора pBR322, размер которой 4,36 тпо,
-Hindlll-EcoRI - фрагмент, содержащий часть гена ДНК-лигазы фага Т4 (0,7 тпо) ,
0
-два EcoRI - фрагмента ДНК фага Т4 (0,5 и 0,4 тпо), включающие часть гена ДНК-лигазы Т4 с собственным промотором,
-EcoRI-EcoRV - фрагмент ДНК фага 5 лямбда (1,6 тпо) из района между
26780 и 27800 парами нуклеотидов генома фага .
-BamHI-Bglll - фрагмент фага лямбда (1,2 тпо), содержащий Р, промотор
0 и интактный ген N фага лямбда,
-два Bglll - фрагмента (2,4 и
0,6 тпо), содержащие гены регуляторов транскрипции с ранних промоторов фага лямбда с мутациями с 1857 5 (ts) и его атб и промоторы Р„ , Р,,„,
RE КК RМолекулярная масса гибридной плазмиды pILL435 равна 7,1 Мд (размер 11,1 тпо) (фиг. 1,2).
0 Для достижения цели используют способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей ДНКлигазу фага Т4, заключающийся в том, что смесь плазмидной ДНК pBR322
5 и ДНК фага i NM816-I подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции Hindlll и EcoRV, образовавшиеся фрагменты соединяют
5
ДНК-лигазой, затем полученной смесью трансформируют клетки E.coli lig ts7, трансформанты высевают на среду с ампициллином и из выросших при непермиссивных условиях клонов выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую полный ген ДНК-лигазы фага Т4, затем полученную ДНК гидролиззпот эндонуклеазой рестрикции BamHI, продукты гидролиза с помощью ДНК-лигазы соединяют с BamHI и BglII-фрагментами ДНК фага Д с 1857 его атб, после трансформации клеток E.coli отбирают клоны с иммунитетом к суперинфицирующему фагу лямбда и из них вьщеляют рекомбинантнута плазмидную ДНК plLL435 (фиг, 3).
Выбор штамма E.coli lig ts7 обусловлен тем, что клетки E.coli lig ts7, содержащие рекомбинантные плазмиды с интактным геном ДНК-лигазы Т4, способны расти при 43 С в отличие от клеток E.coli lig st7, не содержащих рекомбинантные плазмиды с полным геном ДНК-лигазы фага Т4.
Для достижения цели используют штамм Escherichia coli ВКМ В-1449Д (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) - продуцент ДНК-лигазы фага Т4.
Штамм-продуцент ДНК-лигазы фага Т4 получен трансформацией клеток E.coli АА125 плазмидой pILL435. Содержание ДНК-лигазы фага Т4 в сконструированном щтамме равно 50000 единиц на 1 г биомассы клето Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ В-1449Д.
Штамм Escherichia coli ВКМ В-1449Д характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки: клетк прямые, палочковидной формы 1,21,6 X 2,0 X 6,0 мк, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки: клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре, питательном агаре Дифко - колонии гладкие, круглые прижаты, блестяш е, серые, край роный, мутные. При росте в жидких средах - мясо-пептонном бульоне, LB-бульоне образует ровную интенсивную муть.
220036
Физиолого-биохимические признаки: клетки растут в пределах от 4 до 45°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: d-глюкозу, d-фруктозу, арабинозу, лактозу, трегалозу. Не усваивают ацетат, аданит, галактозу. В ка10 честве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. -Нитраты восстанавливают до 15 нитритов. Желатину не разжижают. Индол не образуют. Уреазная активность не обнарз живается.
Устойчивость к антибиотикам: проявляет устойчивость к ампициллину, 20 обусловленную наличием плазмиды pILL435.
Штамм E.coli ВКМ В-1449Д проявляет иммунитет к суперинфицирующему фагу лямбда.
П р и ме р 1. Клетки бактерий E.coli К802, содержащие плазменную ДНК pBR322, выращивают в 10 мл бульона до титра 1x10 кл/мл. Клетки
осаждают центрифугированием (5.000g, 5 мин, +4°С) и ресуспендируют в 0,1 мл лизирующего раствора (лизоцим - 2 мг/мл, трис-НС1, рН 8,025 мМ, ЭДТА - 10 мМ, глюкоза - 50 мМ), выдерживают 5 мин при О С. Далее прибавляют 0,2 мл раствора (ifeOH 0,2 N, додецилсульфат натрия - 1%) и перемешивают до осветления лизата. 150 мкл раствора 3 М ацетата натрия (рН 4,8) вносят в осветленный лизат,
Q осторожно перемешивают до заметного снижения вязкости раствора, выдерживают 1 ч при +4 С и образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (lOOOg, 5 мин, +4 С). К полученному
. супернатанту добавляют 2,5 объема охлажденного при -40 С этилового спирта и выдерживают 2 ч при -40 С. Образовавшийся осадок собирают, центрифугированием (5000g, 5 мин, 20 С) и ресуспендируют в 0,2 мл буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА).
Препарат вирионов фага NM816-1 получают инфекцией экспоненциально растущей культуры E.coli СбОО с множественностью 1 в среде LB (10 г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl на 1 л воды), содержащей Ю М MgSO. Лизис клеток завершают добавлением в среду хлоро7
форма (1:100). После удаления обломков клеток центрифугированием (бОООо, 30 мин, 4°С) клеточные ДНК и РНК лизата гидролизуют одновременно панкреатическими ДНКазой и РНКаз (по 10 мкг/мл) при 20 С, 1 ч. Первиную очистку и концентрирование фага проводят с помощью полиэтиленгликоля 6000 (Jomamoto К. R. et al., Virology, 40, 734-744, 1970). Окончательную очистку фага проводят равновесным центрифугированием в 4 М CsCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,01 М MgCl2 (Wilson G..G. et al., Моlec.Gen.Genet., 156,203-214, 1977). Очищенный препарат фага NM16-1 диализуют против буфера (10 мМ трисHG1, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА).
ДНК фага NM816-1 выделяют фенольным меотодом (Таняшин В. И. и др.. Мол. биол., 6, 803-815, 1974). Концентрацию ДНК фага и плазмиды определяют спектрофотометрически при 260 нм с использованием коэффициент экстинкции 0,02 . Плазмидную ДНК выделяют по методу Birnboim К. С Doly J., Nucl.Acids Res., 1979, 7, N 6, 1513-1523.
Полученные препараты ДНК плазмид pBR322 и фага NM816-1 используют для конструирования рекомбинантной плазмиды pBR322 lig 35 (схема фиг. 3) , которое проводят следующим образом: 0,5 мкг ДНК плазмиды pBR322 смещивают с 3 мкг ДНК фага NN816-1 и инкуби-руют с эндонуклеазами рестрикции Hindlll (5 ед.) и EcoRV (5 ед.) в буфере А (50 мМ трис-HCl, рН 7,6, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ 2меркаптоэтанол). Реакцию проводят при 37 С 1 ч. После инкубации смесь прогревают при 65-70 С 10 мин. Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза. Соединение фрагментов ДНК плазмиды и фага проводят в буфере А с добавлением АТФ и дитиотреитола до конечной концентрации 0,5 мМ и 5 мМ соответственно, и ДНК-лигазы фага Т4 (3000 ед/мл из расчета 1 мкл фермента на 5 мкг ДНК 8-10 ч при В С, затем смесь разводят в 10 раз буфером А с повторным добавлением ДНКлигазы фага Т4 и инкубируют смесь 10 ч. Полученную смесь рекомбинантных плазмид используют для трансформации клеток E.coli lig ts7. Трансформацию проводят следующим образом: 0,1 мл суспензии клеток
03
E.coli lig ts7 вносят в 10 мл питательного бульона LB и выращивают до титра 3x10 кл/мл. После 10-минутного охлаждения () клетки
собирают центрифугированием (5000g, 10 мин, 0°С), суспендируют в 10 мп 0,1 М раствора CaCl2 и вьщерживают 1 ч. Клетки повторно центрифугируют (5000g, 10 мин, О С), затем ресуспендируют в 0,5 мл 0,1 М CaClg
(О С) и используют для трансформации через 10-15 ч.
Смесь соединенных фрагментов ДНК инкубируют с компонентными (обработанными СаС) клетками 1 ч при
О С и 10 мин при комнатной температуре (18 - 22 С). После десятикратного разбавления бульоном LB трансформированные клетки подращивают 2 ч
и высевают на агаризованную среду LB с ампициллином (20 мкг/мл). Трансформанты отбирают при непермиссивной для исходных клеток E.coli lig ts7 температуре (43 С). Из
клеток, выросших за 24 ч клонов, выделяют плазмидную ДНК по методике, описанной выше.
Плазмидную ДНК, содержащую полный ген ДНК-лигазы фага Т4 и обозначенную pBR322 Iig35, использ тот в качестве реципиента при конструировании плазмиды pILL435 (схема фиг . 3). В качестве донора регуляторной области фага лямбда используют ДНК фага с 1857 его атб. Препарат вирионов этого фага получают термоиндукцией лизогенной культуры E.coli СбОО (Л с1857 его атб), которую проводят следующим образом: лизогенную культуру подращивают при 30 С до титра 3x10 кл/мл, затем инкубируют при 43 С 15 мин и продолжают выращивание при 37 С 1 ч с эффективной аэрацией. Лизис клеток завершают добавлением в среду хлороформа (1/100). Дальнейшую очистку фага и вьщеление ДНК проводят по методике, описанной в этом примере выще.
Полученные препараты ДНК плазмиды pBR322 Iig35 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamHI, а ДНК фага с1857 его атб гидролизуют одновременно эндонуклеазами рестрикции BamHI и BgllT. Полученные фрагменты ДНК плазмиды и фага смешивают в соотношении 1:10 и соединяют ДНК-лигазой фага Т4 по методике, описанной выше (схема фиг. 3). После трансформации компетентных клеток E.coli К802 отбирают клоны с иммунитетом к суперинфицирующему фагу лямбда. В данном эксперименте используют фаги, перечисленные в табл. 2. Из клеток клонов, обеспечивающи иммунитет- к фагу лямбда, известным методами выделяют плазмидную ДНК, обозначенную нами pILL435 и содержащую в своем составе три фрагмент области иммунитета фага лямбда, которые образуются при совместном гидролизе фаговой ДНК эндонуклеаза ми рестрикции BamHI и Bglll (фиг. 1 и 3) . Анализ генетических маркеров в р комбинантных плазмидах проводят сле дующим образом. Резистентность к ампициллину кле ток штамма E.coli lig ts7, содержащих плазмиду pILL 435, анализируют н агаризованной среде с содержанием ампициллина от 10 до 100 мкг/мл. Данные клетки растут на средах с этой концентрацией ампициллина. Наличие в клетках, содержащих плазму pILL435, репрессора фага лямбда, обусловливающего иммунитет клеток к суперинфицированию гомоим мунными фагами лямбда, устанавливают следующим образом: клетки и отдельных колонов высеваю.т в 1 мл МПБ и после выращивания до титра 210 - 6-10 кл/мл наносят микробиологической петлей на чашку с твердым агаром в виде полосы; посл 5-минутного подсушивания (20С) аккуратно наносят петлей суспензию различных фагов с титром 1-5х х10 б.е./мл и затем инкубируют при 6-8 ч. Для проверки наличия репрессора используют сЬаги 434 imir 7 /vimmZl , Tib, Ас126, / с1857, vir, i 1тат434, а также фаги и Т4 rll. Результ ты исследования даны в табл. 3. Знаком + отмечены фаги, способные размножаться на анализируемой куль туре . Из результатов, приведенных в табл. 3, следует, что плазмида pILL435 действительно содержит ген области иммунитета фага лямбда. От сутствие роста фага Т4 rll на штам ме, содержащем плазмиду pILL435, доказывает наличие в плазмиде функ ционирующего гена rex фага лямбда. Для анализа одновременного присутствия мутаций в генах с1 и его проводят рекомбинацию in vivo меж 0310 ду плазмидами и фагом f с, который образует негативные колонии с мутным центром за счет эффективной лизогенизации. Штаммы, содержащие плазмиды, выращивают в 10 мл бульона до титра 1,6x10 кл/мл, при 30°С инфицируют фагом Л iinm434 с множественностью 0,1, инкубируют при 30 С 4 ч, добавляют 1/100 часть (об/об) хлороформа и титруют на бактериальных газонах с клетками, содержащими и не содержащими фаг 434 в состоянии профага. Образование рекомбинантов дополнительно указывает на присутствие регуляторной области фага лямбда с1 в гибридных плазмидах pILL435. Гибридный фаг, полученный при рекомбинации с плазмидой pILL435, образует на газоне клеток E.coli о С600 при 37 С прозрачные негативные колонии, а при 30 С - мутные, что указывает на наличие термочувствительной мутации в гене с1 плазмиды PILL435. Анализ наличия в гибридных фагах супрессируемой мутации в гене его проводят сравнением эффективности титрования того фага на штаммах E.coli с различными супрессорньми мутациями при 30 и 43°С. Результаты анализа (см. табл. 3) указывают на одновременное присутствие в плазмиде pILL435 мутаций в генах его и с1 , а также на различную степень супрессии этих мутаций в зависимости от типа супрессора, присутствующего в штамме (Oppenheiro А., Oppenheim А. В. Virology, 75, 469-476, 1976). Из данных этой таблицы, следует, что гибридная плазмида pILL435 действительно содержит фрагмент ДНК фага лямбда с мутациями с 1857 и сгоб. Клетки штамма E.coli lig i:s7 из-за наличия термочувствительной мутации в гене бактериальной лигазы не способны расти при температуре 43°С. Трансформация клеток E.coli lig ts7 плазмидой pILL435 и последующие проверки роста трансформаторов при 30, 36, 43 С показывают, что клетки штамма E.coli lig ts7, содержащие плазмиду pILL435, приобретают способность расти при 43с. В целом клетки E.coli lig ts7, содержащие рекомбинантные плазмиды
n
pILL435, обладают следующими признаками:
Резистентность к ампициллину;
Иммунитет к фагам J cl 26,, г, 434immA, с 1857;
Не способны поддерживать размножение фагов Т4 rll;
Способны к росту при 43 С.
Определение активности ДНК-лигазы фага Т4,
0,5 г биомассы E.coli БКМ В-1449 суспендируют в 3 мл лизирующего буфера 0,2 М NaCl, 0,05 М трис-НС1 рН 7,5, 0,001 М восстановленного глютатиона, 100 мкг/мл лизоцима, выдерживают при ОС 10 ч, озвучивают ультразвуком 4 раза по 30 с при О С, затем центрифугируют (22300g, 2 ч, О С). Супернатант наносят на колонки с фосфоцеллюлозой Р11 (0,5 мл), предварительно уравновешенные буфером М (0,2М NaCl, 0,05 трис-НС, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол промывают этим буфером, фракции с активностью ДНК-лигазы злюируют буфером В, содержащим О,7 М NaCl. Элюат собирают по 0,5 мл и в каждой фракции определяют активность ДНКлигазы.
Реакционная смесь (20 мкл) содержит 5 пикомолей П-АТФ (40 Ки/мМ), 10 CaClg, 50 мМ трис-НС, рН 7,5, 10 мМ дитиотреитола, 1 мМ ЭДТА и от 2 до 15 мкл отдельных фракций, элюированных с колонки. Пробы инкубируют при 20°С 5 мин. Реакцию останавливают перенесением на фильтр Whatman 3 мМ с последующим немедленным погружением фильтра в холодный раствор 5%-ного ТХУ с 1%-ным пирофосфатом натрия. После инкубации (15 мин при О С) раствор сливают, заменяют свежим и выдерживают при О С 10 мин. Фильтры промывают последовательно холодной водопроводной водой, спиртом, ацетоном, высушивают на воздухе и просчитывают радиоактивность в сцинтилляционном счетчике. За 1 единицу фермента принимают количество ДНК-лигазы фага Т4, необходимое для образования АМФ-лигазного комплекса с 1 пи
комолем Н-АМФ. При определении активности в штамме фракции, содержащие фермент , объединяют, разводят пробы и считают активность, учитывая разведение.
Кроме того, уровень синтеза ДНКлигазы фага Т4 анализирзтот электро200312
форетически известными методами (Murray N. Е. et al., J. Mol.Biol., 132, 493-506, 1979) в каждой отдельной и объединенных фракциях г злюата (фиг. 4).
Пример 2. Ппазмиду pILL435 формируют в щтамм E.coli АА125 по методу, описанному в примере 1, и получают штамм-продуцент ДНК-лигазы
Q фага Т4 с активностью не менее 50000 ед/г биомассы клеток.
Для сравнения в табл. 4 приведены значения уровней синтеза ДНК-лигазы фага Т4 в различных штаммах E.coli,
. содержащих рекомбинантную плазмидную ДНК pILL435.
Предлагаемые изобретения позволяют получить штамм E.coli - продуцент ДНК-лигазы фага Т4. Уровень синтеза фермента в предлагаемом
0 штамме E.coli АА125, содержащем рекомбинантную плазмиду pILL435, не менее 50000 единиц на 1 г сырого веса биомассы клеток, что в 10 раз
2 выше уровня синтеза этого фермента в сравнении с лучшим из известных штаммов - E.coli NM989 (базовый объект, описанный в работе Murray N. Е. et al., J. Mol. Biol,, 132, 493, 1979). Полученный положи0тельный эффект предлагаемых изобретений достигается за счет свойств сконструированной новым способом плазмиды pILL435 с полным геном ДНК-лигазы фага Т4. Плазмида pILL435
содержит раннюю область фага
1с1857 его атб, что обеспечивает эффективный регулируемый синтез ДНК-лигазы фага Т4, осуществляемый под контролем раннего промотора
фага лямбда Р, (см. фиг. 1).
В данной плазмиде в отличие от ДНК фага NM989, используемого ранее, отсутствует ген 5 -экзонуклеазы и другие фаговые гены, продукты
5 которых затрудняют последующую очистку целевого продукта. В СССР и в других лабораториях мира для получения ДНК-лигазы до настоящего времени плазмида, определяющая синтез
0 ДНК-лигазы фага 14, не использовалась.
Предлагаемый способ конструирования плазмид дает возможность получить рекомбинантную плазмидную ДНК,
5 обеспечивающую увеличение синтеза ДНК-лигазы фага Т4. Использование Hindlll-EcoRV - фрагмента ДНК фага NM816-1 позволяет выделить полный
13
ген ДНК-лигазы с собственным промотором и расположить его в непосредственной близости от промотора Р , Регуляция транскрипции с данного промотора осуществляется генами регуляторами с 1857 и его атб, входящими в состав области иммунитета фага А . Плазмида pILL435 - автономСравнение уровней синтеза ДНК-лигазы бактериофага Т4 в различных штаммах
Штамм-продуцент
E.coli Б, инфицированный бактеТ4 am NB2 риофагом
E.coli 802, содержащий плазмидную pTFN3012 ДНК (1,9 тпо)
E.coli 802, содержащий плазмидную pBR3221ig35 ДНК (2,9 тпо)
E.coli NM989
E.coli АА125, содержащий плазмидpILL435 ную ДНК (ВКМ В-1449Д)
Определение активности ДНК-лигазы проводилось по методу Кнопфа (см. пример 1), Knopf R.W., Eur. J. Biochem., 73, 33-38, 1977.
Анализ генетических маркеров в клетках, содержащих и не содержащих рекомбинантную плазмиду pILL435
Плазмида PILL435
Плазмида
pILL435
отсутствует
б.е./мл - бляшкообразующие единицы в мл.
2200314
но реплицирующаяся система, не нуждающаяся подобно лизогенным фагам в индукции. Поэтому штамм, содержащий данную плазмиду, культивируется при
5 постоянной температуре и не требует ступенчатого изменения температурных режимов при выращивании биомассы клеток.
Таблица 1 E.coli
Активность, ед/г биомассы
Таблица
Эффективность титрования фагов лямбда с мутациями в генах репрессоров в различных условиях
Бактериофаг30/38 АЗ/Зб
W3350 С600 QD 5003 W 3350 С600 QD5003
АС18571,0 1,0 1,0 , 1,0 1,0 1,0
(cl857 его атб 0,05 0,47 - 0,03 0,15 Д1тт434 X pILL435 0,052 0,4 0,08 0,05 0,1 0,01
--- - ----.-- - - -«в ...-,.- -..«..,,.
отношение титров фага при температуре 30 и 38 С; отношение титров фага при температурах 43 и 38 С.
Уровень синтеза ДНК-лигазы фага Т4 в различных штаммах E.coli, содержащих рекомбинантную плазмидную ДНК pTLL435
Но-ШтаммАктивность
меред. Кнопфа
1E.coli QD5003/pILL43510000
2E.coli Sul/pILL43517000
3E.coli 802/pILL43540000
4E.coli C600/pILL43544000
5E.coli AA125/pILL435 BKM В-1449Д50000
Штаммы получены трансформацией плазмиды pILL435 (см. пример 1).
Таблица 4
Фрагменты ДНК
фагаТ4 m ФагаЛЫМ816-1
pBR 322
фага ЛС1857 CROame
Bglil
1234 567S9
щщ;щр§а. 1ШШ111ШШ Ш Ш Й|111|||11Vj „«sif ГЙ m m л
. Vl v.- -
Фиг. 2
iii
1,0
Mt
%i ШШ 0,9
0,6
Ш
Ш
йШг:
-..,.iiv,-4;-U.W:--}-.
teisswi wSS,j;. . ,..Ш:§йад5ж №йг лп:1 й йШ й;йщЩй :5;й-.-Ч-;; Г- г :А л ; 1| S li ifiSSl Li;.«i ,, й ;,4«4йч;-й-й.-ж: .. .Й;| й;:-Ж«й 1. lrS,4.:«S- -;i. :g;-: ;r vMdf.Kf- 5SS5S f: «бл..--.; ;й;;йШ«
2 3
4 5
94К g
67 К
т
43 К
ЗОК i
Ш
5й
| Velten J., Abelson J | |||
| J | |||
| Nol | |||
| Biol., 1980, 137, 235-248 | |||
| Wilson G | |||
| G., Murray N | |||
| E | |||
| J | |||
| Mol | |||
| Biol., 1979, , 471-492 | |||
| Panet A | |||
| et al., Biochemistry, 1975, 12, 5045-5050. |
