Смешанные ангидриды 4-бром-2,2,5,5-тетраметил-1-оксилпирролин-3-карбоновой кислоты в качестве спиновых меток для биоорганических соединений белково-пептидной природы Советский патент 1983 года по МПК C07D207/22 C07D207/46 

Изобретение относится к новым химическим соединениям, конкретно к смешанным ангидридам 4-бром1 -2,2,5,5-тетраметил-1 -оксилпирролин- -3-карбоновой кислоты общей формулы

. соос&ов

Вг HjC.VcH3

сн о где R изобутил, этил, в качестве ацилирующих спиновых меток для биоорганических соединений белково-пептидной природы. Указанные свойства позволяют лрё полагать возможность применения эти Соединений в молекулярной биологии Известны смешанные-ангидриды угольной и 2,2,5,5-тeтpaмeтил-l-oкc пиppoлин-3-кapбoнoвoй кислоты О используемые в качестве ацилирующих спиновых меток для биоорганических соединений белково-пептиднрй природы Ci.. Недостатком этих соединений является их трудная доступность, поскольку основным соединением в их синтезе является кислота б / получаемая сложным многостадийным синтезом; кроме того, недостатком яв .ляется ма;лая устойчивость при хра.нении, что затрудняет их использование в качестйе спиновых меток. Так, уже после 10-15 дней хранения смешанных анпздридов кислоты П. появляются продукту их гидролитического разложения. Известна устойчивая ацилирующ;ая спиновая метка 3-азидокарбонил-Йбром-2,2,5,5-тетраметилпирролин-1-. : рксил ij С2 3. . Недостатком указанной спиновой метки является недостаточная универсальность, поскольку соединение может использоваться как ацилирующа спиновая метка для биоорганических , соединений белково-пептидной природы, содержащих свободные аминогруппы, н6 не взаимодействует со свобод ными гидроксигруппами. того, соединение Ш способно перегруппиро.вьшаться в соответствующий изоциана который взаимодействует с биоорга.ническимй соединениями по механизму карбамоилирования. Целью изобретения является получение стабильной универсальной ацилирующей спиновой метки для биоорганических соединений белково-пептидной природы. Поставленная цель достигается смешанными ангидридами 4-бром-2,2,5,5-тетраметил-1-оксилпирролин-3-карбоновой кислоты формулы I. в качестве ацйлирующих спиновых меток для биоорганических соединений белково-пептндиой природы.

Указанные соединения получают взаимодействием 4-бром-3-карбокси-2,2, 5,5-тетраметилпирролин-1-оксила с соответствующим хлорформиатом при охлаждении в среде сухого бензола. Выход соединений - 9б%.

Соединения общей фо1 1у;шТпредставляют собой желтые кристаллы,

хранящиеся на воздухе без следов разложения в течение шести месяцев. При м е р 1. ИзобутилоксикарбОнил 4-бром-2,2,5,5-тетраметил-1оксилпирролин-3-карбоксилат. 1,32 г (5 мМоль) 4-бром-З-карбокси-2,2,5,5-тетраметилпирролин-1оксила растворяют в 15 мл сухого бе и зола, добавляют 0,77 мл (5,5 мМоль) сухого триэтиламина и к образовав пейся смеси прикапывают при охлаждении и при перемешивании во льду раствор 0,75 г (5,5 мМоль) изобутилхлорформиата в 10 мл сухого бензола. Перемешивание продолжают 4 ч при 20®С, выпавший осадок отфильтровывают, промывают бензолом, фильтрат и смывные воды упаривают в вакууме и получают 1,79 г (98%) соединения обв(ей формулы I, где R - изобутцп, т.пл. 130°С (разл.). Найдено, %: С 46,77; Н 5,99; N 4,15. : Вычислено, % С 46,29; Н 5,83; N3,86; Мол.масса 363,23. Масс.-спектр 362 (Mf,364 (М) ЭПР (СНСе) ац,1,5 мТ,,0046,ИК (КВг) ,1605 (), 1735, 1800 (). Пример. Этилоксикарбонил 4-бром-2,2,5,5-тетраметил-1-оксилпирролин-3-карб.оксилат (соединение Общей формулы I у где R - этил). Получают аналогично из 1,32 г (5 мМоль) соединения I и 0,6 г (5,5 мМоль) этилхлорформиата. Выход 1.,6 г (98%). Т.пл. . Найдено,. %: N 4,27. G j H BrNOj Вычислено/ %:К4,1Б. Мол. масса 335,18. МаСс-спектр 334 () , 336 () , ЭПР (CHCCj) , afj 1,5-МТ, g 2,0046, ИК (КВг) 1605 (), 1730, 1800 ). Указанные смешанные ангидриды общей формулы I могут быть использованы как ацилирующиё спиновые метки для биоорганйческих соединений белково-пептиДной природы, что подтверждается их взаимодействием с глутамил-изолейцил-пролил-пролином, содержащим свободные аминогруппы, и тирозил-фениЛайанйном содержащим свободные гидроксигруппы. 36,5 мг соединения общей формулы I , где R - изобутил, растворяют в 0,1 мл тетрагццрофурана и затем .добавляют раствор хлоргидрата бенэило :вого эфира глутамилизолейцил-пролил-пролина в 0,1 мл тетрагидрофура на и 0,028 мл триэтиламина. Инкубацию пептида g меткой проводят в течение суток при комнатной температуре. Полноту ацилирования контролируют -бумажном элек1рофорезом (900 В) в 1 И уксусной кислоте (рН 2,4) по исчезновению нингридрид го окрашивания исходного тетрапепти jcia. Иесвяэавшуюся метку отделяют с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле 5/40 в системе этилац тат - хлороформ (1:1). Индивидуальность спин-меченого пептида проверяют хроматографией на пластин ке Силуфола в системах бутанол- уксусная кислота - вода (13:2:5)R 0,44, хлорофЬрм - метанол (S:1)R 0,46, этилацетатпиридинуксусная кис лота - вода (5:5:1:3)R 0,53, уксусная кислота - этилацетат - бута НОЛ - вода (1:2,1:1) к,, 0,75 СеСЗпЮз,ае (с о,). Спектр ЭНР спин-меченного пептида характеризуется временем вращательной корреляции t(S 1 10- сек . Аналогичные результаты получены при использовании в качестве спиновой метки соединения общей формулы I , где R - этил. 40 мг метилового эфира трет-бути оксикарбонилтирозилфенилаланина растЕ)оряю в 0,2 ЛАП тетрагидрофурана .и добавляют 70 мг соединения общей формулы I , где R - этил, и 0,025 мл триэтиламина до pH-vlO. Ин-гкубацию пептида с меткой проводят в течение 16 ч при комнатной температуре . Полноту ацилирования контролируют по исчезновению в Уф-спектре полосы поглощения свободного гидроксила тирозина. После окончания реакции растворитель упаривают, . остаток растворяют в абс. эфире и высаживают петролейным эфиром. Инг дивидуальность спин-меченого пептида проверяют хроматографией на пластинке Силуфола и системах хлороформ - метиловый спирт (9,5:0,5)Rp 0,475, хлороформ - этилацетат (1:1) Rf 0,82. Спектр ЭПР спин-меченрго пептида характеризуется временем вращательной коррекции5«1-10 Я Таким образом, соединения общей формулы являются ацилирупцш4И спиновыми метками для биоорганических соединений белково-пеПтидной .природы. По устойчивости соединения общей формулы I превосходят смешан- . ные ангидриды 2,2,5,5-тетраметил-1- : оксилпирролинкарбоновой кислоты 1J ) кроме того, соединения общей формулы I являются более универсальными, чем известная ацилирующая спиновая .метка 3-азодокарбонил-4-бром-2,2,5,5тетраметилпирролин-1-оксил W так как взаимодействуют как с амино, так и с оксигрупп-ами биоорганйчес ких соединений белково-пептидной природы.:

Смешанные ангидриды 4 бром-2,2,5,5-тетраметил-1-Ьксилпирролин 3-карбоновой кислоты общей соосоон Sf HjC- у СН5 где R - иаобутил, этил, в качестве спиновых меток для бйоорганических соединений белково(Л пептндиой природы. .