Спин-меченые производные олигорибонуклеотидов как спиновые зонды для исследования механизма действия ферментов и способ их получения Советский патент 1979 года по МПК A61K51/08 C07H21/02 A61K123/00 

(54) СПИН-МЕЧЕНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ОЛИГОРИБОНУКЛЕОТИДОВ

КАК СПИНОВЫЕ ЗОНДЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ полученных спин-меченых динуклеозид монофосфатов с нуклеозид-5-дифосфатами при участий полинуклеотидфосфорилазы в трис-буфере при рН 9,0-9,2. Получение исходных веществ. Пример 1. (1-ОКСИЛ-2 ,2 , 5 -тетраметил-З-карбонилпирролин)-аденозин-2(3 )-фосфат. К суспензии 0,2 г (0,47 М) Ру-сол аденозин-2 (З)-фосфата в 3 мл абсолютного пиридина добавляют хлорангид рид, полученный из 1,1 г 2,2,5,5-тет раметил-З-карбоксипирролин-1-оксила в 2,5 мл абсолютного пиридина при охлаждении в бане из сухого льда и . ацетона. Образовавшийся раствор оставляют рри комнатной температуре на 3,5 ч. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают абсолютным пириди ном. К охлажденному фильтрату добавляют 3,5 мл дистиллированной воды и раствор экстрагируют три раза хлороформом (20, 10, 5 мл). Хлороформный слой сушат безводным .и упарива досуха при комнатной температуре. К осадку добавляют 8 мл 50%-ного водного пиридина, раствор охлаждают, приливают 7 мл предварительно охла1жденнрго 2 н.. NaOH и оставляют при комнатной температуре на 15 мин. Затем быстро добавляют Дауэкс 50x4 (100-200 мевд) в Ру форме до рН 7,5. Смолу отфильтровывают и промывают тремя объемами 2 М водного пиридина .Фильтрат и каждую из промывок пропускают через колонку с 40 мл свеже го Дауэкс 50x4 (100-200 меш) в РуФорме. Объединенные промывки упаривают при добавлении пиридина до выпадения осадка кислоты. Из этой сме си (рН 6-7) кислоту-раликал экстраг гируют эфиром (л-10О мл) . Водный ра.с вор упарившот на роторе при комнатной температуре досуха. Получают 0,19 г спин-меченого производного, загрязненного исходным нуклеотидом, Далее очистку проводят методом препаративной БХ в системе (А). Выход 60%-, RJ 0,61 (А); ,8б Уфспектр:Л д(.282 нм. 4 Пример 2. N -(1-оксил 2,2,5,5-тетраметил-З-карбонилпирролин)-цитидин-2(з)-фосфат получают аналогично описанному в примере 1 . Время гидролиза перацильного производного 30 мин. Выход 70%J R 0,69 (А)г Уф-спектр: /.д,д,260, 303 НМ. Пример 3. (1-оксил2,2 ,,5-тетраметил-З-карбонилпирролин)-цитидин получают аналогично описанному в примере 1. Очистку про водят методом препаративной ТСХ на пластинках из силуфола в системе н- бутанрл, насыщенный водой. С адсо бента спин-меченый цитидин элюируют этанолом. Выход 60%; Rj 0,84 (Б); 1,12. Т.пл. 132-134 . УФ-спектр Л7лс кс2бО, 303 нм. Спектр ЭПР (хлоро орм): N 15,6; содержание спинов: , 8- 10 спин/моль. Для Н. 25 N40/ ычислено, %: С 52,80; Н б,1б;Ы 13,68. Найдено, %: С 53,19; 52,97; 6,45; 6,35; N 13,93; 13,81. Пример 4. (l-oкcил,2,5,5-тетраметил-З-карбонилпирроин) -цитидин-2, 3-циклофосфат .153 о.е . (8 мкМ) спин-меченого цитидин-2 (3)осфата растворяют в 1 мл воды, довоят рН раствора 0,1 н. НС6 до 6,0 и добавляют 25 мг п-толуолсульфоната циклогексил- )i- N- (N-метилморфолиний) -этилкарбодиамида. Реакционную смесь оставляют на 4 ч при комнатной температуре, поддерживая рН равным примерно 6,0. Затем реакционную смесь упаривают досуха на роторе. Остаток промывают несколько раз эфиром, после чего растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и делят методом препаративного электрофореза на бумаге. После обессоливания в системе этанол:вода-7 : 3 получаиот 85 о.е. (56%) хроматографически чистого циклофосфата. R,: 0,91 (А); U 0,62: УФ-спектр: , 303 нм. Пример 5. N -(1-оксил-2,2,5,5-тeтpaмeтил-3-кapбoнилпиppoлин) -аденозин-2, 3-циклофосфат получают аналогично описанному в примере 4. Выход 52%; RJ 0,85 (А); О 64 ; УФ-спектр: (ис282 нм. Получение целевбго продукта. П р и М е р 6. (1-оксил-2,2,5,5-тетраметил-3-карбонилпирролин)-цитидилил-()-цитидин. 136 о.е. (8 мкМ) спин-меченого цитидин-2,3-цйклофосфата и 80 мкМ цитидина в ОД6 мл ОР5 М трис-НСе-буфера (рН 7,6), содержащего панкреатическую рибонуклеазу в концентрации 0,16 , инкубируют при 0-4°С около двух недель. Спин-меченый цитидилил-( )-цитидин выделяют методом препаративного электрофореза на бумаге. Дополнительную очистку проводят, хроматографируя в системе (Б). Получают 23 о.е. (30%). Rf 0,84 (А); ,58; УФ-спектр :Лдлакс262Г, 303 нм. П р и М е р 7. Гуанилил-( ) (1-ОКСИЛ-2,2,5, 5-тетраметил-З-карбонилпирролин)-цитидин. 60 мкМ гуанозин-2,3-циклофосфата (гуанидиниевая соль) и 180 мкМ спин-меченого цитидина в б мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,0), содержащего рибонуклеазу Т в концентрации 50 ед.акт/мл, инкубируют в течение 5-6 ч при . Затем реакционную смесь делят методом препаративного электрофореза на бумаге. Полосы, ,со- держащие спин-меченый гуанилил-().-цитидин, прищивают к новым листам бумаги и хроматографируют в системе .В. Получают 153 о.е. ( 5 мкМ). Выход 20%; R 0,7 (Б); UOTH 1/5;. УФ-спектр :Л,щ. 259, 302 нм. 5 Примере. Гуанилил-()-N- {1-ОКСИЛ-2 ,2,5, 5-тетрс1метил-3карбонилпирролин, -цитидил-( з-гЗ)-уридин. 145 о.е. (5 мкМ) GpC , 2,5 мкМ уридин-Б-дифосфата (динатриевая соль) и 3 мг ПНФ-азы М. lysodeiticus растворяют в 0,5 мл 0,05 М трис-НС8-буфера {рН 9,0-9,2) содержащего 0,01 М МдСВг и 0,05 мМ ЭДТА, и инкубируют при 36-37°С. Через 2 ч всю реакционную смесь наносят на бумагу и хроматографируют в системе Б. Полосы, соответствующие различным компонентам реакционной смеси, элюируют. водой и дополнитель но очищают с помощью электрофореза и хроматографии в системе.А. Получают 10 о.е. (15%) (Rp(Up) 1,55 (А); иот.„0,б5; УФ-спектр: Л |,дс(кс 259, 307 нм) и 5 о.е. GpCp ™upU (WUp) 1,02 (А); иотнО68; УФ-спектр Vc,Kc259, 307 нм) . Хрсииатографию и электрофорез пров дят на бумаге марки ленинградская М И FN-3. При хроматографии ис-. пользуют следующие системы растворителей: этанол - 1 М ацетат аммония (рН 7,5), 7:3 (А); этанол - концентрированный аммиак - вода-65:10:25 (Б); изопропанол-концентрированный аммиак - вода-7:2:1 (В). Электрофорез на бумаге проводят в приборе Для вертикального электрофореза фир1ии Labor (Венгрия) в течение 2 ч с градиентом напряжения 20 В/см в 0,0 триэтилс1ммонийбикар6онате, рЛ 7,5. Формула изобретения . - , I. Спин-меченые производные олиго рибонуклеотидов общей формулы NpN , 3 NpN и NpNpN, где Np ч N - нуклеотиды и нуклеозиды пиримидинового и пуринового ряда; Np и производные аденозин-3-фосфата или иитидин-З-фосфата и соответственно цитидина, содержащие спиновую, метку в виде остатка 1-оксил-2,2,5,5-тетраметил-3-карбонилпирролина в качестве заместителя по амино-группе адеиина или цитозина, спиновые зонды для исследования механизма действия ферментов. 2. Способ получения соединений ПОП.1, отличающийся тем, что спин-меченые нуклеозид-2, 3-циклофосфаты или нуклеозиды пиримидинового и пуринового ряда подвергают взаимодействию соответственно с нуклеозидами или нуклеотидами при температуре 0-4°С в присутствии специфических рибонуклеаз в соответствующем буферном растворе с последующим взаимодействием при температуре 36-37 с полученных спин-меченых динуклеозидмонофосфатов с нуклеозид-5-дифосфатами при участии полинуклеотидфосфорилазн в трис-буфере при рН 9,0-9,2. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Сухоруков Б.И., Петров А.И, Спин-меченые нуклеозиды, нуклеозид-5-моно-,ди- и -трифосфаты.- Биофизика, 1975, Ifl, с.965. 2.Табак М., Рууге Э.К., Смирнова И.Н., Петров А.И., Сухоруков Б.И., Твердислов В.А. Взаимодействие мембранного препарата Na, К-АТФ-азы со , -Ь d 14 «л |1 Л С А О. ЗОЛ j спин-меченым аналогом АТФ.-Биохимия, 1977, 42, 3, с. 476.