Способ получения карбоксиметилированных @ -1,3-глюканов Советский патент 1983 года по МПК C08B37/00 A61K31/716 

Изобретение относится к способу получения новых карбоксиметилировэнных ,3 глюканрв , обладающих противоопухолевой активностью. Цель изобретения - получение новых соединений, расширяющих арсенал средств воздействия на живой органим. Поставленная цель достигается тем, что согласно основанному на известной реакции карбоксиметилирования углеводов tO способу получения карбоксиметилированных 1 -1 ,3 -глюканов общей формулы Н,ОК ROV n Н OR где хотя бы один из R представляет собой СН,СООН, а остальные - атомы водорода, со средней степенью полимеризации (п + 2) от 2 до 1000, где п - О или целое число, или их солей РЗ -1,3-глюкан формулы CHjOH. I CHjOH «JrVoU Nf-O. U- F H,OH 3vi4 TAY H (И Jn я OH где средняя степень полимеризации (n + 2) и п имеют вышеуказанные значения, подвергают взаимодействию с монохло уксусной кислотой и ее солью щелочного металла в присутствии щелочи с последующим выделением целевого продукта в свободном виде или в виде соли. Используемый согласно настоящему изобретению в исходный ,3-глюка (TAK-N) содержит Ь -1 ,3-связи в сво основных гликозидных звеньях и явля ется водонерастворимым обладает ср ней степенью полимеризации (DP) и может желатинировать при DP 170 при бО°в присутствии воды; его получаю путем выращивания микроорганизмов, таких как Agrobacterium radiobacte {iF013127 АТСС ), Agrobacterium radiobacter (iFO 13126, ATCC 21679, FeRM P-1166), Agrobacterium Faecali var, myxogenes NTE-V(iFO-131 0, ATC 21680,FERM p-ii68). в соответстзк-и с настоящим изобр тением используются также и низшие полимеры (TAK-D) , получаемые при частичном гидролизе р -глюкана {TAK-N). TAK-D получают при частичном гидролизе TAK-N {например,при кислотном гидролизе, щелочном и ферментативном гидролизе с р-1,3 глюканазой).. Пример 1. В80мл изопропилового спирта суспендируют 3 г TAK-N (средняя степень полимеризации ) и суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем медленно добавляют 8 мл 30%-ного раствора гидрата окиси натрия при перемешивании в течение примерно 69 мин. Затем смесь интенсивно перемешивают при комнатной температуре еще в течение примерно 90 мин для предотвращения образования геля. Добавляют 3,6 г монохлоруксусной кислоты и смесь Перемешивают при 60-70С в течение 5 ч, чтобы прошло карбоксиметилирование. Продукт выделяют фильтрованием и тщательно промывают смесью метанола и уксусной кислоты (7:3 по объему). Осадок собирают фильтрованием, хорошо промывают водным метанолом, метанолом и ацетоном в вышеуказанном порядке и высушивают под пониженным давлением 4 Получают 2,9 г карбоксиметилированного PJ-1 ,3-глюкана (СМТАК). Карбоксиметильное содержание, (число карбоксиметильных групп на глюкозный остаток) 0,. Пример 2. изрпропилового спирта суспендируют 1,5 г TAK-N (степень полимеризации 540j и суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем при перемешивании добавляют 2 мл 30 -ного раствора гидрата окиси натрия четырьмя порциями, т.е. по 0,5 мл с интервалом в 15 мин. Затем смесь перемешивают при комнатной температуре еще в течение 90 мин, после чего тремя порциями добавляют 0,9 г монохлоруксусной кислоты, т.е. по 0,3.г, с интервалами по 10 мин. Карбоксиметилирование проводят при при перемешивании в течение 150 мин. Продукт собирают центрифугированием,растворяют в 50 мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой. К нейтральному раствору добавляют 120 мл метанола и полученный осадок собирают центрифугированием. Осадок промывают смесью 300 мл 80 -ного водного метанола и 100 мл этанола, а затем смесью 3 300 мл 80 -ного водного метанола и 200 мл эфира. Продукт лиофилизируют, выделяется 1,7 г .Карбоксиме.тильное содержание 0,75Пример 3- В мл изопропиловго спирта суспендируют 1,5 г TAK(степень полимеризации ) и суспен зию перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем че тырьмя порциями добавляют мл 30 ного раствора гидрата окиси натрия т.е. по 1 мл с интервалами по 15 ми после чего перемешивают при комнатной температуре в течение 90 мин. После этого добавляют 1,8 г монохлор уксусной кислоты тремя порциями, т.е по 0,6 г каждая с интервалами по 10 минут. Смесь перемешивают при в течение 150 мин. Образовавшийся в результате карОоксиметилирования продукт собирают центрифугированием, растворяют в О мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой. К нейтральному раствору добавляют 90 мл метанола и полученный осадок собирают центрифугированием. Осадок хорошо промывают смесью 200 мл ВО -ного водного метанола и 100 мл этанола, а затем смесью 200 мл ВО -ного водного этанола и 200 мл эфира. Затем продук,т лиофилизируют, получают 2,О г СМТАК. Карбоксиметильное содержание 1,07. Пример А. В 33 мл воды сус пендируют 3,2 г TAK-N (степень поли меризации 255) и при перемешивании при комнатной температуре добавляют 1 г гидрата окиси натрия с последую щим добавлением 2,4 г монохлорацета та натрия. Карбоксиметилирование проводят при комнатной температуре при постоянном перемешивании в тече ние 2 ч. После этого добавляют снов 1 г гидрата окиси натрия и 2,А г монохлорацетата натрия и затем реак цию проводят при комнатной температуре при перемешивании в течение 3 ч.Затем добавляют еще 1 г гидрата окиси натрия и 2, монохлораце тата натрия. Реакцию продолжают при комнатной температуре при перемешивании еще в Течение 2 ч. К этой реа ционной смеси добавляют 1 л этанола и полученный осадок хорошо промывают этанолом на стеклянном фильтре до тех пор, пока фильтрат не перестает давать красный цвет с фенолфталеином 1k Затем осадок .высушивают при и пониженном давлении. Полученный порошок (3.7 г) растворяют в 90 мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой с последующим добавлением 210 мл этанола. Полученный осадок собирают центрифугированием, промывают В0|-ным этанолом и лиофилизируют. Получают, 2,6 г СМТАК. Карбоксиметильное содержание 0,30. П р и м е р 5. В 66 мл воды суспендируют 6, ) г TAK-N (степень полимеризации 255)и в условиях охлаждения льдом при перемешивании добавляют tr гидрата окиси натрия, а затем 9,6 г монохлорацетата натрия. Карбоксиметилирование проводят при охлажде НИИ льдом, при перемешивании в течении 2 ч. Затем снова добавляют г гидрата окиси натрия и 9,6 г монохлорацетата натрия и смесь перемешивают при охлаждении льдом в течение 3ч. После этого добавляют еще г гидрата окиси натрия и 9,6 г е монохлорацетата натрия и реакцию продолжают при охлаждении льдом и при перемешивании в течение 3- К реакционной смеси добавляют 1 л этанола и полученный осадок хорошо промывают этанолом на стеклянном фильтре до тех пор, пока фильтрат не перестает давать красную окраску с фенолфталеином, после чего продукт высушивают при 50С и пониженном давлении. Полученный порошок (В,6 г) растворяют в 172 мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой. Затем после добавления 4ВО мл этанола осадок собирают центрифугированием, промывают 80%-ным этанолом и лиофилизируют. . Получают 5,6 г СМТАК. Карбоксиметильное, Содержание 0,36. Пример б. изопропилового спирта суспендируют 1,5 г TAK-D - низший полимер, получаемый при частичном гидролизе TAK-N, степень- полимеризации 299- Карбоксиметилирование проводят аналогично примеру 2. Продукт промывают, как в примере 2, получают 1,9 г СМТАК. Карбоксиметильное содержание 0,59Указанный TAK-D суспендируют в Q мл изопропилового спирта и аналогично примеру 3 осуществляют карбоксиметилирование. Реакционный продукт промывают, как в примере 3, получают 2,2 г СМТАК. Карбоксиметильное содержание 1,13. Пример 7. изопропи лового спирта суспендируют 1,5 г TAK-D (степень полимеризации 113). Аналогично примеру 2 проводят карбо ксиметилирование. Реакционный продукт собирают центрифугированием, растворяют в tO мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой. К нейтральному раствору добавляют 90 ил метанола и полученный осадок собирают центрифугированием, .а затем хорошо промывают сначала 200 мл 80 -ного метанола, а потом 200 мл водного этанола, после чего лиофилизируют. Получают 1,4 г СМТАК. Карбоксильное содержание 0,51. Аналогично описанному из 1,5 г TAK-D (степень полимеризации 68) получают 1, г СМТАК. Карбоксильное содержание 0,36. Пример 8, изопропиЛО8ОГО спирта суспендируют 1,5 г TAK-D (степень полимеризации 113). Аналогично примеру 3 проводят карбо ксиметилирование. Реакционный продук промывают, как в примере Т, получают 2,3 г СМТАК (карбоксильное со держание 1,22). Аналогично описанному из 1,5 г TAK-D (степень полимеризации 68 получают I, г СМТАК, Карбоксильное содержание 0,. Пример 9 В 0 мл изопропилового спирта суспендируют 1,3 г TAK-N(DP 960),и суспензию перемешива ют при комнатной температуре в Течение 30 мин. Затем при перемешивани четырьмя равными порциями добавляют 2 мл 30%-ного раствора гидрата окиси натрия с интервалами по 15 мин. Смес затем перемешивают прикомнатной те пературе в течение 90 мин. Затем добавляют 0,9 г монохлоруксусной кис лоты тремя равными порциями с интевалами по 10 мин. Карбоксиметилирова ние проводят таким образом при 50 С припёремешивании в течение 150 мин. Продукт собирают центрифугированием и промывают 20 мл 95%-ного изопропилового спирта . Оста .ток повторно суспендируют в 20 95 -ного изопропилового спирта нейтрализуют уксусной кислотой лученный осадок собирают центрифугированием, хорошо промывают водным метанолом, метанолом и ацето ном в указанном порядке и высушиваю под пониженным давлением. Получают n 1.6 г СМТАК. Карбоксиметильное содержание 0,40. Пример 10, В+Омл изопропилового спирта суспендируют 1,5 г TAK-D(DP 15) и суспензию перемешив юи при комнатной температуре в .течение 30 мин. Затем при перемешивании добавляют 2, мл 30 -ного гидрата окиси натрия четырьмя равными порцияfM с интервалами по 15 мин. Смесь перемешивают при комнатной температуре 90 мин, добавляют 1,08 г монохлоруксусной кислоты тремя равными порциями с интервалами по 10 мин. Карбоксиметилирование проводят при при перемешивании в течение 150 мин. Продукт промывают, как в примере 7, получают 0,8 г СМТАК. Карбоксильное содержание 0,19. Пример 11.ВЗЗмл воды растворяют 3, г TAK-D (степень полимеризации 2), при перемешивании при .комнатной температуре добавляют 1 г гидрата окиси натрия, а затем 2,9 г монохлорацетата натрия.Реакцию карбоксиметилирования проводят ,при комнатной Температуре при постоянном перемешивании в течение 2ч. Затем снова добавляют 1 г гидрата окиси натрия и 2,9 г монохлорацетата натрия, затем реакцию проводят при тех же условиях в течение 3ч. После чего добавляют 1 г гидрата окиси натрия и 2,9 г монохлорацетата натрия. Реакцию проводят при тех же условиях еще в течение 2 ч. К реакционной смеси добавляют 1 л этанола и полученный осадок хорошо промывают этанолом на стеклянном фильтре, высушивают при 50°С и пониженном давлении. Полученный; порошок (3s7 г) добавляют к Во мл горячего {95°С) этиленгликоля и смесь перемешивают . Полученный осадок удаляют фильтрованием на стеклянном фильтре как можно быстрее. Фильтрат концентрируют под пониженным давлением и остаток сушат при 60®С. Получают 2,5 г СМТАК. Карбоксильное содержание 0,30, Данные, характеризующие полученные новые соединения, представлены в табл.1. Пример 12. В 30 мл раствора азотной кислоты ( азотная кислота: метанол - 1:10 по объему суспен дируют 1,5 г СМТАК. Суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч и фильтруют через стеклянный фильтр. Твердый остаток на стеклянном фильтре промывают 60 мл 90%-ного метанола и после этого 301Гйл метанола. Промытый твердый осадок cytпeндиpyют в 300 мл дистиллированной йоды. Затем прибавляют 370 мг гидрата окиси кальция и смесь перемешивают в течение k ч, после чего фильтруют через фильтровальную бумагу. Фильтрат нейтрализуют 0,1 н.соляной кислотой. К нейтральному раствору прибавляют 50 мл этанола и полученный осадок собирают путем центрифугирования. Осадок промывают 120 мл 80 -ного этанола и сушат при пониженном давлении. Получают 1,3 г кальциевой соли СМТАКПротивоопухолевую активность трех видов СМТАК, полученного из ТАК-М, и обработанного в автоклаве СМТАК исследовали на мышах.

ООразцы растворяли в дистиллированной воде для инъекции (рН А/7,0), Один из этих образцов стерилизовали в автоклаве , 25 мин) перед введением. Шесть миллионов клеток S l80 трансплантировали подкожно в правую паховую зону мышам 1CP-}CL, вес тела которых составлял г. Узлы опухолей удалили на 35-й день после трансплантации и взвесили.

Средний вес опухоли обработанной группы Т, включающей 5 мышей, сравнивался с контрольной группой С, включающей 10 мышей, и рассчитывалась степень подавления опухоли (% подавления (С-Т) (СхЮО) . На 35-й день были также подсчитаны результаты по нескольким животным с удаленной опухолью (полная регрессия).

Результаты испытаний представлены в табл.2.

Как показано в таблице 2, все образцы СМТАК при уровне дозы 10 мг/кг существенно подавляют рост опухоли. Это подавление роста СМТАК наблюдалось при уровнях дозы от 1 до kQ мг/кг.

Эти результаты показывч1ют, что СМТАК можно стерилизовать без потери его противоопухолевой активности и можно использовать в форме, пригодной для инъекции, для лечения рака.

Исследовали противоопухолевое i действие TAK-N, ТАК-0 и СМТАК при различных способах введения.

TAK-N (степень полимеризации ), ТАК-0 (степень полимеризации 50), ТАК-0 (степень полимеризации 16) и СМТАК по примеру 1 вводили по 5 мг/кг внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно в течение 10 дней ежедневно мышам TCP-ICL «оторым трансплантировали 40 клеток за 2k ч до первой инъекции; Степень подавления роста опухоли рассчитывали так же, как описано выше.

Результаты испытаний представлены в табл.3.

Как видно из табл.3 в каждом случае наблюдалось существенное подавление роста опухоли. При внутривенном введении TAK-N, СМТАК почти полностью подавляли рост опухоли, причем степень подавления составляал свыше 85% при полной регрессии опухоли у или 5 мышей из 5 обработанных мьпией.

Таким образом, TAK-N, СМТАК и .TAK-D эффективны для подавления опухоли при любом способе введения.

11

12 Таблица 2

Продолжение табл. 3

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОК МЕТИЛИРОВАННЫХ ,3-Г.П10КАНОВ фо мулы I где хотя бы один из R представляет собой CHjCOOH, a остальные - водород, со средней степенью полимеризации (п + 2) от 2 до 1000, где п - О или целое число, или их солей, отличающийся тем, что ,3-глюкан формулы П X он Jn л он где средняя степень полимеризации (п + 2) и п имеют вышеуказанные значения, подвергают взаимодействию с монохлоруксусной кислотой или ее солью щелочного металла в присутствии щелочи с последующим выделением целевого продукта в свободном виде или в виде соли.