Способ получения диагностикума для выявления антидигоксиновых антител Советский патент 1983 года по МПК G01N33/531 

00

САЭ

00

х : Изобретение относится к способу получения диагностикума, который может найти применение в медидине и биологии для выявления иммунного ответа на дигоксин и рефрактерности застойной недостаточности кровообра-. щения при ишемической болезни сердца в кардиологии. Известен способ получения диагноС тйкума для выявления антидигоксиновы антител, заключающийся в том, что , дигоксин окисляют периодатом лития я подвергают взаимодействию с эритроцитами барана при рН 7,0-7,4 и соотношении окисленноепроизводно дигоксина: эритроцйты(0,5-0,б)1б моль: (1,8-2,0) . : С помощью диагностикума, полученного этим способом, удается выявить ; антидигоксиновые антитела у 65% болБных с застойной недостаточностью кровообращения, длительное время леченных сердеч ьщи глюкозидами, в том числе и дивоксином, причем тизгры антител колебались от 1:4 до 1564. Недостатком этого способа являетс невысокая чувствительность диагности :кума. ... Целью изобретения является увеличение чувствительности диагностикум Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения диагностикума для выявления антидигоксиновых антител заключающемуся dHj dHj tiHj Ivj/Nl i jj ОЛГП О он ол он во взаимодействии реакционкрспособного производного лигоксина с эритроцитами барана ОБ), в качестве реакционно способного ПРОИЗВО|ДИО % ; используют ЭПРКСИД ДИГОКСИНа в КОЛИ честве. (2,0-2.5) на . 1,8-2,0) 10°эритроцитов и процесс ведут при рН 7,,0. Используемый в качестве реакционно способного проиавсдного эпоксид дигоксина получают эпоксцдированием дйгоксинам-хлорнадбензойной кислотой. Полученный эпоксид дигоксина без выделения инкубируют с эритроцитами при 2О-25°С и рН 7,5-8,0. Слабощелочная среда необходима для лучшего протекания реакции эпоксида дигоксина с белковыми компонентами мембраны эритроцита. Повышение рН приводит к лизису и гибели эритроцитов. В этих условиях в реакцию вводят (2,0-2,5)х зпоксвда дигоксина на (1,8-2,0) 10 эритроцитов, что в четыре раза превьваает соотношение исходных компонентов в известном способе получения диагностикума периодатньм окислением. Введение более 2, эпоксида дигоксина приводит к лизису, агглютинации и гибели эритроцитов. Ковалёнтное связывание эпоксида дигоксина с белковыми компонентами мембран эритроцитрв протекает по схеме 0 н-хлорладбкнзойг ал XvcAomcr

dHj dHj ; dHj

OH OHОЛ .-. ri p и м в p I. к раствору 8мг ,) дигоксина в 1,5 мл .диоксина и 0/03 мл атиленгликоля добавляют раствор 2 мг w-хлорнадбен зойной кислоты в 0,5 мл диоксана, вьиерживают 1 сут в темноте при 2Q . и добавляют по каплям и при перемешивании к 4 мл 100%-ных { упаксванньах) ЭВ,/. суспендирован ных в 40 мл эабуфервнного трис-буфе ром фиэиологическогопраствора при рН . Реакхдаонную массу выдержива 1 ч при 20-25 С и трижды отмывают эритроциты физиологическим растворсй до получения прозрачного супернатан та. . . . я р и м е р 2. Проводят опыт, KgiK в примере I, но используя 6,4 м (8-10 моль) дйгоксина и 1,6 мг «-хлорнадбензойной кислоты. При мер 3. Повторяют пример 1, но берут 7f2 мг (Э ) дигоксина и 1,8 МГЛА- хлорнадбензойной кислоты. , . Пример 4. Титры антидигоксиновых антител определяют реакцией пассивной гемагглютинации. Для этого в каждую лунку микротитратора вводят по 0,025 мл физиологического раствора. Затем в первую лунку вносят 0,025 мл анализируемой сыворотк крови больных, которую предваритель но декс шлемёнтируют при в течение 40 мин. Раститрование сыворотки проводят последовательным переносом из каждой предыдущей в каждую последующую ho капле раствора. Затем в каждую лунку добавляют . по капле 1%-ной суспензии ЭБ, ковалентно связанных с дигоксином (диа,гностикум полученный в примере 1) :И пластины инкубируют 2 ч в термо;Титр антидигоксиновых антител при использовании диагностикума, полученного способом

известным

предлагаемым

1:16

1:32

1:4

1:4

1:15

1:16

1:64

1:3

1:16

1:4

1:16

1:4

1:16

Титр антидигоксииовых антител при использовании диагностику ма, полученного способом

известным

предлагаемг м

1:8

1:8

1:4

1:16

1:8

1:16 ста те при 37с.В качестве контрольных опытов проводят аналогичнью peaif ции исследуемых сывороток с нормаль- ыми ЭВ. Кроме того, излучают возможность неспещ1фической агглютинации, сыворотки сенсибилизированных дигоксином эритроцй-гбВ. Агглютинацию эритроцитов оценивают визуально по . характеру осадка в лунках. Последнее разведение сыворотки, при котором наблюдается агглютинация, принимают за титр антител при отсутствии агглютинации в контрольных опытах. По этой методике в клинических условиях выяёляют титры антидироксиновых антител в сыворотке крови 64 больных с 3;астойной недостаточностью кровообращения, длительное время леченных сердечными гликозидами, в том числе дигоксином. Полученные данные представлены в таблице. Таким образом, с помсжцью диагностикума, полученного предлагаемым :cnocoj6oM, по сравнению с диагнояти:к вдом,пблученньм известным способом I уд&ется существенно увеличить (на 17,5%) количество больньвс, у которых выявлены антидигоксиновые антитела. Кроме того, увеличивается чувствительность определения титра антидигоксиновых антител на 1-2 раз ведения. Предлагаемый способ получения диагностикума прост в исполнении, ре требует применения дорогостоящегб оборудования и реактивов.Поэтому он может найти широкое применение в клиниках страны для выявления рефрактерности застойной недостаточности кровообращения при шаемической болезни сердца.

Продолжение таблицы

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИДИГОКСИНОВЫХ , АНТИТЕЛ путем взаимодействия реакци- онноспособного производного дигоксина с эритроцитами барана, о т л и чающийся тем, что, с целью увеличения чувствительности диагностикума, в качестве реакционноспособного производного используют дигоксина в количестве