Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител (его варианты) Советский патент 1984 года по МПК A61K39/38 

1

Изобретение относится к иммунохимии и фармакологии, преимущественно к применению эритроцитарных диагностикумов, и может быть использовано для выявления в биологических средах антител к низкомолекулярным биологически активным соединениям.

Известны способы получения эритроцитарных диагностикумов с детерминантами различных антигенов и гаптенов, оснобанные на ковалентном связывании детерминанты с эритроцитами tl 3.

Однако известные способы получения эритроцитарных диагностикумов не позволяют получить диагностикум с гаптенной детерминантой атропина.

Целью изобретения является выявление антител к атропину.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения эритроцитарного диагностикума для выявления специ(1)ических антител по первому варианту в качестве гаптенной детерминанты используют гемисукционат атропина в концентрации 0,120, ммоль/мл и ковалентное связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотношении 1:0,8-3,0, осуществляют водным раствором карбодиимида в концентрации 0,12О, ммоль/мл при рН 518-6,0 и темпе ратуре 16-20 С в течение 12-15 ч.

-ociH-cJH-6H20H

По второму варианту в качестве гаптенной детерминанты используют п-(атропин-азо)-бензойную кислоту в концентрации 0,01-0,012 ммоль/мл 5 и ковалентное связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотношении 1:Si - 3,5 осуществляют водным раствором карбодиимида в концентрации 0,08-0,1 ммпль/мл при to рН 5,8-6,0 и температуре 16-20 0 в течение 12-18 ч.

Первый вариант выполнения способа,

А. Получение формалинизированных t5 эритроцитов барана.

1.Воздействуют 6 объемами 3j мас. раствора формальдегида в фосфатном буферном растворе с

рМ 7,2 на 1 объем мас.%-ной 2Q суспензии от белков сыворотки эритроцитов барана в течение 2-3 ч при 16-20 С, дополнительно воздействием 2-2,5 объемами масДного раствора формальдегида в тече25 ние 20-2 ч при t-бс.

2.Формалинизированные таким образом эритроциты многократно отмывают в 50-100-кратном избытке физиологического раствора с рН 6,8-7,

3Q и ресуспензируют до концентрации

40-60 мас. в физиологическом растворе.

Б. Синтез гемисукцината атропина согласно Fasthetal (8)по реакции

o

cigHg

1. Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления специЬических антител путем ковалентного связывания гаптеиной детерминанты с формалинизированными эритроцитами барана, о т ., и ч а ю 1Д. и и с я тем, что, с целью выявления антител к атропину,в качестве гаптенной детерминанты используют гемисукцинат атропина в концентрации 0,12-0,1 ммоль/мл и ковалентное связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотношении 1:0,83,0, осу1цествля1от водным раствором карбодиимида в концентрации 0,120,1 ммоль/мл при рН ,0 и темпе ратуре 1б-2Пс в течение 12-15 ч. 2. Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител путем ковалентного связывания гаптенной детерминанты с формалинизировлнными эритроцитами барана, отличающийс я тем, что, с целью выявления антител к атропину, в качестве гаптенной детерминанты используют пв -(антропин-азо)-бензойную кислоту в концентрации 0,01-0,12 ммоль/мл и ковалентное связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотношении 1:5,,5, осуществляют водным раствором карбодиимида в концентрации 0,08-0,1 ммоль/мл при рН 5,86,0 и температуре 1б-20 С в течение 1 12-18 ч. ю 4 vJ

)F- dH3 -oCo-CH-cJH20-do-(dHgVeooH

в. Конъюгирование гемисукционата атропина с формалинизированными эритроцитами барана.

К одному объему П-60 мас.% суспензии формалинизированных эритроцитов барана п.Л. на физиологическом растворе (0,15 М раствор NaCl) при перемешивании добавляют 0,83,0 объема водного раствора гемисукцината атропина при концентрации 0,1 - 0,12 ммоль/мл и рН 5,8 - 6,0 (используют только свежеприготовленный раствор гемисукцината атропина, см П.Б).

К смеси эритроцитов и гемисукцината атропина прикапывают Л,О -k,Q объема водного раствора водорастворимого карбодиимида при йонцентрации 0,12-0,1 ммоль/мл. При добавлении раствора карбодиимида смесь перемешивают и поддерживают рН 5,8 - 6,0 с помощью 0,5 Н.НС1.

Реакционную смесь инкубируют в течение 12-15 ч при 1б-20°С и рН 5,8-6,0 без перемешивания.

Эритроцитарный осадок отмывают многократно физиологическим раствором фосфатного буфера, рН 7,0 - 7, с центрифугированием.

Второй вариант выполнения способа

А. Получение формалинизированных Б. Синтез п-(втропин йзо)-бензойэритроцитов барана проводится так ной кислоты, Согласно Wurzburger же, как по первому варианту. et.al. по реакции:

Hood -

ап,роп.н .HOOd/pV N - к 3. Конъюгирование п-(атропин азо -бензойной кислоты с формалинизированными эритроцитами барана. К одному объему мас.-ной суспензии формалинизированных эритроцитов барана (п.А) на физиологи ческом растворе (О,15М раствор NaCI при перемешивании добавляют 5,13 объемов буферного раствора п-(атропин азо)-бензойной кислоты с кон- . центрацией 0,61-0,012 ммоль/мл ш (состав буфера ; N,N-димeтилфopмaми 0,1 М боратный буфер, соотношение объемов ингредиентов 1:1, рН 8,8 9,0), рН реакционной смеси доводят до 5,8 - 6,0, добавляя по каплям при перемешивании 1 н.НС1. К смеси эритроцитов барана и п-(атропин азо)-бензойной кислоты при перемешивании добавляют по каплям 0,,75 объемов водного раство ра водорастворимого карбодиимида с концентрацией 0,08-0,1 ммоль/мл при рН 5,8-6,0. Смесь инкубируют при комнатной температуре 1б-20°С в течение 12-18 ч, рН 5,8-6,2. Эритроцитарный осадок отмывают многократно в избытке физиологического раствора фосфатного буфера, рН ,) с центрифугированием. Способ по первому варианту поясняется следующими примерами. Пример 1 . Синтез гемисукци ната атропина. 150 мг атропина основания растворили в 2 мл сухого хлороформа при комнатной температуре. К раствору добавили 115 мг янта ного ангидрида и смесь перемешивали в течение 2 ч на магнитной мешалке. Затем хлороформ удалили фильтрацией и выпариванием осадка в вакууме.

CJH-бНгОН

N Оставшуюся маслянистую жидкость растворили в 3 мл дистиллированной воды и установили рН 5,8i прибавляя 2 H.NaOH. Пример 2. Синтез гемисукцината атропина вели в условиях примера 1, только раствор гемисукцината атропина имел рН 6,0. Установка рН 5,8 - 6,0 является необходимым условием получения высокочувствительного эритроцитарного диагностикума. При несоблюдении атого условия диагностикум имел чувствительность выявления в реакциях агглютинации антител к атропину ниже в А - 8 раз. Далее гемисукцинат атропина для конъюгирования с эритроцитами готовили как в примере 1. Пример 3- Получение формалинизированных эритроцитов барана. Эритроциты барана отмывали забуференным физиологическим раствором при центрифугировании,отделяли эритроцитарный осадок, готовили 60%-ную эритроцитарную суспензию на физиологическом растворе фосфатного буфера. К одному объему эритроцитарной суспензии добавляли 6 объемов 3%-ного раствора формальдегида в фосфатном буферном растворе с рН 7,2. Смесь инкубировали в течение 3 ч и затем.дополнительно прибавляли к смеси 2 объема kQ%-Horo раствора Формальдегида и инкубировали смесь при i С в течение 20 ч. Полученный эритроцитарный осадок 8 раз отмывали в 100-кратном избытке физиологического раствора фосфатного буфера при центрифугировании, рН 7, и ресус- . пензировали до концентрации 50 мас.) в физиологическом растворе фосфатного буфера с рН 7,2. П р и м е-р k. Эритроциты барана отмывали за)уференным физиологическим раствором, отделяли осадок эритроцитов, готовили 40 мас.-ную эритроцитарную суспензию на физиологическом растворе фосфатного буфера. К одному объему эритроцитарной суспензии добавляли 6 объемов « -ного раствора формальдегида в фосфатном буферном растворе с рН 7,2. Смесь инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре и затем дополнительно прибавляли к смеси 2,5 объема раствора формалина и инкубировали смесь при в течение 2 ч. Полученный эритроцитарный осадок 8 раз отмывали в 50-кратном избытке физиологического раствора фосфатного буфера при центрифугировании, рН 7,0 и ресуспензировали до концентрации kQ% в физиологическом растворе фосфатного буфера, рН 7,2. Пример 5. Эритроциты барана формалинизировали в условиях примера 3, только полученный эритроцитарный осадок отмывали 10-кратно в 50кратном избытке физиологического раствора фосфатного буфера с рН 6,8 и ресуспензировали до концентрации 60% в физиологическом растворе фосфатного буфера с рН 7,2. Варьирование в условиях формалинизирования эритроцитов (примеры 3-5) не оказывало существенного влия ния на чувствительность и сохранность эритроцитарных диагностикумов которые бв1ли приготовлены на основе этих эритроцитов. Пример 6, Конъюгирование гемисукцината атропина с формалини зированными эритроцитами барана с помощью водорастворимого карбодиим да М-циклогексил-М- /1 (М-метилморфо лиино)-этилJ карбодиимид-п-толуол сульфоната. 0,15 ммоль гемисукцината атропин растворяли в 0,75 мл дистиллированн воды, устанавливали рН 5,8, прибавляя по каплям 2,0 н.МаОН, и при пер мешивании полученный раствор добавляли к р,5 мл суспензии фор малинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе. К смес гемисукционата атропина и формалини зированных эритроцитов по каплям прикапывали раствор 0,Н ммоль N-ци 1 7 логексил-N- Г/ (N-метилморфолиино) -этил карбодиимид-п-то/1уол сульфоната в 1 мл дистиллированной воды, при этом смесь перемешивали и поддерживали рН 5,8 добавлением в реакционную смесь 0,5 Н.НС1. Затем реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 12 ч без перемешивания. Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали восьмикратно 50-кратным избытком физиологического раствора фосфатного буфера срН 7,2. Пример 7. 0,31 ммоль гемисукцината атропина растворяли в 1,5 мл дистиллированной воды, устанавливали рН 6,0, прибавляя по каплям 2,0 H.NaOH, и при перемешивании полученный раствор добавляли к 0,5 мл суспензии формалинизированных эритроцитов барана на физиологи-ческом растворе, 0,28 ммоль N-циклогексил-N-ffi (N-метилморфолиино) -этил 1 карбодиимид-п-толуол сульфоната раст воряли в 2,0 мл дистиллированной воды и по каплям добавляли к смеси гемисукцината атропина и формалинизированных эритроцитов барана, перемешивая смесь и поддерживая рН 6,0 добавлением 0,5 н.НС1. Затем реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 15 ч. Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали пятикратно 100-кратным избытком физиологического раствора фосфатного буфера, рН 7,2. Пример 8. 0,075 ммоль гемисукцината атропина растворяли в 0,35 мл дистиллированной воды, устанавливали рН 5,8, добавляя в раствор по каплям 2H.NaOH, и при перемешивании полученный раствор прибавляли к 0,5 мл суспензии формали-, низированных эритроцитов баранана физиологическом растворе. К смеси гемисукцината атропина и эритроцитов по каплям при перемешивании добавляли 0,07 ммоль М-циклогексил-М-(М-метилморфолиино)-этилJкарбодиимид-; -п-толуол сульфоната в 0,5 мл дистиллированной воды, при этом рН 5,8 реакционно смеси поддерживали добавлением 0,5 н.НС1. После этого реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 12 ч. Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали семикратно 50-кратным избытком физи 71 ологического раствора фосЛатного бу фера, рН 7,2. Пример 9. Получение эритро цитарного диагностикума проводили в условиях примера 6, только к смеси гемисукцината атропина и формалинизи рованных эритроцитов прибавляли раст вор 0,14 ммоль солянокислого 1-этил 3-(ЗДиметиламинопропил) карбодиими да в 1 мл дистиллированной воды. Далее синтез эритроцитарного диагности кума вели в условиях примера 6. Пример 10. Получение эритро цитарного диагностикума проводили в условиях примера 8, только к смеси гемисукционата атропина и формалинизированных эритроцитов прибавляли 0,08 ммоль солянокислого 1-этил-З(3 диметиламинопропил} карбодиимида в 0,5 мл дистиллированной воды, при этом рН 6 реакционной смеси поддерживали прибавлением по каплям 0,5 н.раствора НС 1. Далее синтез эритроцитарного диагностикума проводили в условиях примера 8. Пример 11.0,62 ммоль гемисукцината атропина растворяли в 3 мл дистиллированной воды, устанавливали рН , прибавляя по каплям 2,0 H.NaOH, и при перемешивании полученный раствор добавляли к 0,5 мл суспензии формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе. 0,5б ммоль М-циклогексил-М-(3(-метилморфолиино)-этил j карбодиимид-п-толуол сульфоната растворяли в ,0 мл дистиллированной воды и .по каплям добавляли к смеси гемисукцината атропина и Форм,алинизированных эритроцитов барана, перемешивая смесь и поддерживая рН 5,8 прибавлением по каплям 0,5 Н.НС1. Затем реакционную смесь инкубировали без перемешивания в течение 12ч. Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали пятикратно 100-кратным избытком физиологического раствора фосфатного буфера, рН 7,2. Пример 12. 0,ОЦ ммоль гемисукцината атропина растворяли в 0,2 мл дистиллированной воды, усТанавливлли рН 5,8 и при перемешивании этот раствор прибавляли к 0,5 мл суспензии формалинизированны

эритроцитов барана на физиологическом растворе. Далее к смеси гемисукцината атропина и эритроцитов добав-J

|эитроцитарные диагностикумы, получение которых описано в примерах 6-12, тестировали в РИГА со специ7ляли при перемешивании 0,035 ммоль N-циклoгeкcил-N р(М-метилморфолиино)-этилЗ карбодиимид-п-толуол сульфоната в 0,3 мл дистиллированной воды, рН реакционной смеси 5,8. Затем реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 12ч. Эритроцитарный осадок отмывали пятикратно в ЮО-кратнрм избытке физиологического раствора фосфатного буфера, рН 7,2. Примеры . Подготовка эритроцитарного диагностикума к ис.пользованию в РИГА (реакция непрямой агглютинации) или к длительному сохранению. Эритроцитарные диагностикумы, получение которых описано в примерах 6-12, после отмывки физиологическим раствором фосфатного буфера ресуспензировали до концентрации 1% в 1%-ной прогретой кроличьей сыворотке, адсорбированной нативными эритроцитами барана (+5б°С, 30 мин), в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина, 1%-ного раствора полиглюкина, которые готовили на физиологическом растворе фосфатного буфера, рН 7,2. Эритроцитарные диагностикумы готовили для длительного хранения путем быстрого замораживания 5%-ной суспензии сенсибилизированных эритроцитов в . 5%-ной инактивированной от комплемента и адсорбированной эритроцитами барана кроличьей сыворотке в смеси сухйго льда и ацетона (ампулы с диагностикумом предварительно запаивали) и сохраняли до использования при -30 С. Дальнейшее испытание диагностикумов не выявило преимуществ ни одного из использованных растворов высокомолекулярных соединений, поэтому в сводной табл. 1 представлены результаты определения в РИГА специфичных к атропину антител, которые были получены с диагностикумами, полученными согласно примеров 6-12, в виде 1%-ной суспензии на 1%-ной кроличьей сыворотке. Пример 16. Испытание эритроцитарных диагностикумов,приготовленных в условиях примеров 6-12 в РИГА со специфичными к атропину референс (тест) - сыворотками. 91 фичными к атропину донорскими тестсыворотками, которые получали от экспериментальных ЖИВОТНЫХ при иммунизации последних искусственнымиU конъюгированными антигенами с атропином в качестве гаптена. На основании результатов определения чувствительности приготовленных диагностикумов по выявлению специфичных к атропину антител в тест-сыворотках делали вывод об эффективности процедуры их синтеза (примеры 6-12). Реакцию непрямой гемагглютинации ставили в модификации по микрометоду по стандартной методике. Полученные результаты представлены в , табл. 1. Анализ полученных результатов позволил заключить,что наивысшейчув ствительностью при определении специфичных к атропину антител в РИГА, обладают эритроцитарнне диагностикумы, которые приготовлены в условиях примеров 6-11, однако диагностикум, приготовленный согласно условиям примера 11,неспецифически агглютинировал в присутствии неимунной (контФольной) кроличьей сыворотки, что делает невозможным его помощью определение специфичных антител. Таким образом, условия примеров 6-10 явля ются оптимальными при синтезе эритроцитарных диагностикумов с гаптенной детерминантой - химически модифицированным атропином. Пример 17. Испытание эритроцитарных диагностикумов, приготовленных в условиях примеров 6-10, после длительного хранения в виде консерванта. Эритроцитарные диагностикумы, полученные в условиях примеров 6-10 хранили до 6 мес в замороженном со тоянии в виде суспензии на 5%-ной инактивиробанной от комплемента прогреванием кроличьей сыворотке, предварительно адсорбирован ной нативными эритроцитам14 барана. Показали, что сенсибилизированные эритроциты до / мес. сохраняют спе-. цифичную чувствительность при определении в РИГА антител к атропину. После оттаивания их физико-химическ свойства и чувствительность практически не меняются. Пример 18. Испытание чувствительности определения в РИГА специфичных к атропину антител. 7 Для доказательства специфичности определения в РИГА антител к атропину с помощью эритроцитарных диагностикумов, приготовленных в условиях примеров 6-10, с этими диагностикумами и тест-сыворотками ставили реакцию торможения непрямой гемагглютинации атропином. РИГА тормозили атропином в концентрации 0,5-5,0 мг/ /мл. Примеры некоторых экспериментов с соответствующими результатами сведены в табл.2. Таким образом, РИГА между эритроцитами с гаптенной детерминантой - химически модифицированном атропином и специфичными к атропину антителами тормозится атропином, добавляемым в реакционную фазу что свидетельствует о специфичности эритроцитарного диагностикума по отношению к выявлению с его помощью антител к атропину. Как видно из приме юв конкретного выполнения и данных таблиц .предлагаемый способ решает создание эритроцитарного диагностикума,. специфич-. но определяющего в . РИГА антитела к атропину. Эритроцитарный диагностикум с,гаптенной детерминантой - химически модифицированньгм атропином (гемисукцинат атропина, ковалентно связанный с эритроцитарной оболочкой имидной связью), приготовленный по предлагаемому методу, позволяет с высокой чувствительностью определять в реакциях гамагг-лютинации антитела к атропину (отдельные референс-сывоворотки имели значение обратного титра к атропину 2560 и выше), определение антител специфично, что доказано торможением РИГА свободным атропином. Использование в качестве гаптенной детерминанты эритроцитарного диагностикума гемисукцината атропина позволило сохранить обе детерминанты антигенной специфичности атропина: тропиновую часть и ароматическое коль-цо - удаляет их от оболочки эритроцитов, что способствует выявлению с помощью такого диагиостикума всей популяции антител, высоко специфичных к атропину. Этой же цели служит и использование в качестве агентов, формирующих ковалентное связывание, гептенной детерминанты - химически модифицированного атропина, водорастворимых карбодиими-; дов, соединений лишь активирующих формирование имидной связи, но не входящих в окончательный продукт реакции - э|эитроцитарный диагностикум, а следовательно, не влияющих на специфичность последнего при распознавании с его помощью антител к атропину в РИГА. Эритроцитарный диагностикум, приготовленный в условиях примеров 6-10, 13-15 не теряет специфичной чувствительности при хранении в течение 2 мес. без консерванта, а в присутствии консерygyOl. ванта при замораживании и хранении при (-30) - () - в течение k-6 мес. Способ по второму варианту поясняется следующими примерами. Пример 1. Синтез п-(атропин азо)-бензойной кислоты (химичесгкая модификация атропина азосочетанием с п-аминобензойной кислотой) по реакции (

бНгОН (JH-dO

О л

й

п-Аминобензойную кислоту 10,3 мг (0,075 ммоль) растворяли в 1,5 мл 0,25-0,2 М Н.С1 и раствор охлаждали до на ледяной бане, К этому раствору по каплям при перемешива-. НИИ на ледяной бане добавляли охлажденный водный раствор нитрита натрия (6,9 мг в 0,6 мл воды). Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при перемешивании на ледяной бане. После окончания срока инкубации в реакционной смеси добавляли 0,025 ммоль сульфамйновой кислоты (2,5 мг в 0,3 мл охлажденной воды), 58 мг атропина сульфата (0,1 ммоль) растворяли N N-диметилформамидном боратном буфере; соотношение M N-диметилформамид, 0,1 М боратный буфер 1:1, рН . Раствор охлаждали до и при перемешивании к этому раствору прибавляли весь объем полученной реакционной смеси, Реакционную смесь инкубировали в тем ноте в течение k ч при t-6 С, перемешивая, после чего рН реакционной смеси доводили до 5i8, добавляя по каплям 1,0 Н.НС1.

Пример 2, п-(Атропин-азо)-б1ензойную кислоту получали в условиях примера 1, только после окончания срока инкубации реакционной смеси рН доводили до 6,0, добавляя 1 H.HCl,

Пример 3- Получение форма линизированных эритроцитов барана.

Эритроциты барана отмывали забуференным физиологическим раствором при центрифугировании, отделяли Эритроцитарный осадок, готовили 50 мас,-ную суспензию эритроцитов на физиологическом растворе фосфатного буфера, К одному объему эритроцитарной суспензии добавляли 6 объемов 3 мас.-ного раствора формальдегида в фосфатном буферном растворе с рН . Смесь инкубировали в течение 3 ч и затем дополнительно прибавляли к смеси 2 объема Q мас,-но го раствора формальдегида и инкубировали j:Mecb при k°C в течение 20 ч. Полученный Эритроцитарный осадок 8 раз отмывали в 100-кратнрм избытке физиологического раствора фосфатного буфера при центрифугировании, -рН 7, и ресуспензировали до концентрации 50 мас.% в физиологическом Грастворе фосфатного буфера, рН 7,2.

Пример k. Эритроциты барана формалинизировали в условиях примера 3, только для фopмaлинизиix вйния готовили бОмас.-ную суспензию эритроцитов барана.

Пример S Эритроциты барана отмывали забуференным физиологическим раствором, отделяли осадок эритроцитов, готовили АО мас.%-ную эритроцитарную суспензию на физиологическом растворе фосфатного буфера. К однойу объему эритроцитарной суспензии добавляли 6 об-ьемов k масД- юго раст вора формальдегида в фосфатном буферном растворе, рН . Смесь инку бировали в течение 2 м при комнатной температуре и затем дополнитель но прибавляли к смеси 2,5 объема 35 мае.%;::,ного раствора формалина и инкубировали смесь при в течение 24 ч. Полученный эритроцитарный осадок 8 раз отмывали в 50-кратном избытке физиологического раствора фосфатного буфера при центрифугировании, рН и ресуспен.зировали до концентрации kQ мас. в физиологическом растворе фосфатного буфера,рН . Варьирование щ условиях формалинизирования эритроцитов (примеры ) не оказывало существенного влияния на чувствительность и сохранность эритроцитарных диагностикумов, приготовленных на основе этих эритроцитов. Пример 6, Конъюгирование п(атропин азо)-бензойной кислоты с формалинизированными эритроцитами барана в присутствии инициатора типа водорастворимых карбодиимидов-Ы-циклогексил-М р(М-мёгилморфоли-. ино)-этил карбодиимид-п-толуол сульфоната. К 0,5 мл kQ%-HOM суспензии формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе при перемешивании добавляли мл буфер ного раствора п-(атропин-азо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,01 ммоль/мл, а затем по каплям 1,75 мл водного раствора N-циклогексил-М-(Ь (N-мeтилмopфoлиинoli -эти карбодиимид-п-толуол сульфоната с концентрацией 0,08 ммоль/мл. Смесь инкубировали при 16 С в течение 12 ч, рН . Осадок инкубированны эритроцитов многократно отмывали в 100-кратном избытке физиологичес кого раствора фосфатного буфера (0,15 М NaCl, 0,075 М фосфатов, рН 7,2). Пример 7. ; 0,5 мл суспензии формалинйзированнм эрит цитов барана на физиологическом ра воре при перемешивании добавляли 6,75 мл б уферного раствора п-(атро пин-азо)-бензойной кислоты с конце рацией 0,01 ммоль/мл, а затем по к лям 0,87 мл водного раствора N-цик гексил-N-f|Ь(Ы-Метилморфолиино)-эт карбодиимид-п-толуол сульфоната с концентрацией 0,08 Ммоль/мл. Далее синтез продолжали в условиях примера 6. Пример 8. КО,5 мл суспензии формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе при перемешивании дйбавляЛи t.n мл буферного раствора п-(атропин-азо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,01 ммоль/мл, а затем по каплям 0,52 мл водного раствора Ч-циклогексил-Н-ГР(М-метилморФолиино)-этил карбодиимид-п-толуол сульфоната с концентрацией 0,08 ммоль/мл. Смесь инкубировали при 16 С без перемешивания в течение 12 ч, рН 5,8. Осадок инкубированных эритроцитов много кратно отмывали в 50-кратном избытке физиологического pacTBopia фосфатного буфера. Пример 9. К 0,5 мл суспензии формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе при перемешивании добавляли ,0 мл буферного раствора п-(атропин-азо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,12 ммоль/мл, а затем по каплям 0,52 мл водного раствора N-циклoгeкcил-N- p(N-мeтилмop()oлиино)-этил карбодиимид-п-толуол сульфоната с концентрацией 0,1 ммоль /мл. Смесь инкубировали при 20С без перемешивания в течение 16 ч, рН 6,0. Осадок инкубированных эритроцитов многократно отмывали в 100кратном избытке физиологического раствора фосфатного буфера при центрифугировании. Конъюгирование п-(атропин-азо)-бензойной кислоты с формалинизированными эритроцитами барана в присутствии инициатора типа водорастворимых карбодиимидов - солянокислого 1-этил-З(3-диметиламинопропил) карбодиимида. Пример 13. КО,5 мл суспензии формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе фосфатного буфера при перемешивании добавляли «,0 мл буферного раствора п-(атропин-азо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,01 ммоль/ /мл, а затем по каплям 0,52 мл водного раствора солянокислого 1-этил-З-(3-Диметиламинопропил) карбодиимида с концентрацией 0,08 ммоль/мл. Смесь инкубировали при без перемешивания в течение 16 ч, рН 5,8. Осадок инкубированных эритроцитов многокра но отмывали в 100-кратном избытке физиологического раствора фосфатног буфера. Пример 14. К 0,5 мл суспензии формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе фосфатного буфера при перемешивании добавляли 2,7 мл буферного раствора п-(атропин-азо)-бе зойной кислоты с концентрацией 0,01 ммоль/мл, а затем по каплям 0,35 мл водного раствора солянокислого 1-этил-3(ЗДиметиламинопоопил карбодиимида с концентрацией 0,08 ммоль/мл. Смесь инкубировали при 18 С без перемешивания в течение 18 ч, рН 6,0. Осадок инкубированных эритроцитов многократно отмывали в 100-кратном избытке физиологического раствора фосфатного буфера. Эритроцитарные диагностикумы, по лучение которых описано в примерах 6-14, в реакциях гемагглютинации использовали в виде 1,3,5%ных суспензий. Суспензии готовили на 1%ной прогретой при 5б С в течение 30 мин и абсорбированной нативными эритроцитами барана нормальной (неимунной ) кроличьей сыворотке, 1%-но растворе человеческого или бычьего сывороточного альбумина, на 1%-ном растворе полиглюкина, которые, в свою очередь, готоеили на физиологическом растворе фосфатного буфера рН 7,4. Эритроцитарные диагностикум для цлительного хранения получали путем быстрого замораживания суспензии гаптенированных эритроцитов на инактивированной от KOMnjjgMeHTa прогреванием и абсорбированной нативными эритроцитами барана нормальной кроличьей сыворотке в смеси сухого льда и ацетона (диагностикум предварительно ампули ровался). Замороженный диагностикум хранили при (-30) - {-40)°С. Существенных различий в.чувствитель ности диагностикумов, приготовленных на сыворотке, растворах альбумина, раствор :полиглюкина, не выявили. Чувствител ность при определении специфичных к атропину антител зависела от соот ношения ингредиентов реакции на ста дии конъюгирования п-(атропин-азо)-бензойной кислоты с эритроцитами. 7 Наибольшую чувствительность имели диагностикумы в виде 1%-иой суспензии гаптенированных эритроцитов, поэтому в табл.1 представлены результаты, полученные при тестировании эритроцитарных диагностикумов, приготовленных в условиях примеров 6-14 при условии, что испытовались гаптенированные диагностикумы в виде суспензии на нормальной кроличьей сыворотке. Эритроцитарные диагностикумы, получение которых описано в примерах 6-14, тестировали в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) На чувствительность выявления антител к атропину. Для определения чувствительности диагностикумов по выявлению специфичных к атропину антител использоваит референс (тест)-сыворотки от животных доноров, которых иммунизировали белковыми антиге-нами с гаптенной детерминантой атропина. Референс-сыворотки получали по общепринятой методике, инактивировали комплемент прогреванием и абсорбировали нативными эритроцитами барана. РИГА ставили в модификации по микрометоду на планшетах микротитратора Такачи общепринятым способом. В качестве контрольной использовали нормальную кроличью сы воротку - тест на неспецифичную агглютинацию диагностикумов в присутствии сывороточных белков. Результаты оценки и чувствительности эритроцитарных диагностикумов по выявлению в РИГА специфичных к атропину антител сведены в табл.1. Из представленных данных видно, что Эритроцитарные диагностикумы с гаптенными детерминантами п-(атропин-азо)-бензойной кислоты, приготовленные в условиях примеров , 13 и 14, пригодны для выявления в РИГА специфичных к атропину антител. Оптимальными условиями получения диагностикума являются условия примеров и 13, диагностикумы, полученные в этих условиях, имеют наибольшую чувствительность. Диагности кум, полученный в условиях примера 6, непригоден из-за его неспецифической агглютинации в присутствии нормальной кроличьей сыворотки.Диагностикум, полученный в условиях примера 12.малопригоден из-за его низкой чувствительности.

17

Диагностикумы, приготовление которых описано в примерах , 13 и k, испытывали на сохранность при хранении без замораживания и при замораживании. Оказалось, что 1Эти диагностикумы стабильны при С в течение месяца и не теряли специфичной к атропину чувствительности. При замораживании в присутствии консерванта (5%-ная инактивированная от комплемента кроличья сыворотка, абсорбированная нативными эритро цитами барана) в виде суспензии с последующим оттаиванием перед использованием чувствительность эритроцитарных диагностикумов не снижалась в течение 4-6 мес. Диагностикумы, получение которых описано в примерах 7-9 и 13 испытывали в реакции торможения гемагглютинации (РТНГА) на специфичность выявления антител к атропину и к структурному аналогу атропина - тропацину, содержащему тропиновую группировку. Испытывали также специфичность диагности- 25

кума по выявлению влияния других холинолитиков, имеющих отдаленное химическое сходство с молекулой атропина (циклозил, трибутам). Оказалось, что диагностикум имеет высокую специфичность при выявлении антител к атропину, причем хорошо выявляет антитела, специфичные к тропиновой части молекулы атропина. Другие холинолитики практически не тормозят РИГА между гаптенированным диагностикумом и специфичными к атропину сыворотками. Полученные результаты, представлены в табл.2.

Таким образом, эритроцитарный диагностикум с гаптенными детерминантами химически модифицированного атропина (п-(атропин-азо)-бензойная кислота, ковалентно связанная с эрит роцитами барана), приготовленный по предлагаемому методу, позволяет с высокой чувствительностью определять в реакциях гемагглютинации антитела к атропину {отдельные рефере,нс-сыворотки имели значение обратного титра к атропину 1280 и выше), определение антител специфично, что доказано торможением РИГА свободным антропином. В то же время диагностикум избирательно выявляет антитела, специфичные к токсофорнойтропиновой части молекулы атропина,

10792i 7

18

что доказано способностью структурного и фармакологического аналога атропина - тропацина также тормозить РИГА однако значительно хуже, чем атропин. Использование в качестве гаптенной детерминанты зритроцитарного диагностикума - п-(атропин-азо)-бензойной кислоты не изменяет тропиновой части молекулы атропина и обеспечивает введение в его молекулу химической группировки, необходимой для последующего ковалентного связывания модифицированного атропина с оболочкой эритроцитов. Согласно изобретению ковалентное связывание модифицированного атропина с ооболочкой эритроцитов достигается путем использования инициаторов типа водорастворимых карбодиимидов, которые не входят в окончательный продукт реакции - гаптен-эритроцит барана, а следовательно, не оказывают влияния на специфичность эритроцитарного диагностикума в процессе распоцентра антител к атропину при их выявлениях в реакциях гемагглютинации; с другой стороны, присутствие в п- тропин-азо)-бензойной кислоте, ковалентно связанной с формалинизированными эритроцитами барана имидной связью, молекулярной вставки между тропиновой частью и оболочкой эритроцитов удаляет эту детерминанту иммунохимической специфичности от эритроцитарной оболочки, что способствует выявлению в реакциях гемагглютинации антител,специфичных к токсофорной тропиновой части атропина с высокой чувствительностью. В итоге, изобретением решена задача создания эритроцитарно го диагностикума, специфично определяющего в реакциях гемагглютина- ции антитела к атропину и избиратель но к тропиновой группировке. Эритроцитарный диагностикум с гаптенными детерминантами химически модифицированного атропина может быть использован в лабораторной исследовательской практике для определения антительной продукции к антропину, исследования специфичности антител к атропину, а также в клинической практике для определения в простых и распространенных реакциях гемагглютинации антител к атропину у пациентов, поинимаюших атропин. знавания с его помощью активного

Чувствительность и специфичность эритроцитарных диагностикумов с гаптенной детерминантой остатка гемисукционата атропина при определении в референс-сыворотках специфичных к.атрЪпину антител Примечание:

,Таблица (+} - неспецифическая агглютинация в ИКС ( контроль); (-) - отсутствие агглютинации в контроле

2110792 722

Специфичность эритроцитарного диагностикума с гаптенной детерминантой остатка гемисукцината атропина при выявлении антител, специфичных к атропину, в РИГА и РТНГА с атропином и друг11ми холинолитиками I Титр тест-сыворотки при Титр тест- исследуемых

сыворотки в контроле ()fi3.p-pe

Примечание; В реакционную фазу для торможения

вносили растворы исследуемых веществ в объеме и-25 -10 л

Таблица 2 добавлении для РИГА р-ров веществ

2310792 72i

Чувствительность и специфичность эритроцитариых диагностйкумов с гаптенной детерминантом остатка п-(атропин-азо)-бензойной кислоты при определении в референс-сыворотках специфичных к атропину антител

Т a б л и ц a 3